CN118120924A - 一种岩藻多糖钙螯合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种岩藻多糖钙螯合物及其制备方法与应用。包括以下步骤：采用UV/H2O2体系对岩藻多糖溶液进行辐照降解，反应液经透析、浓缩和干燥后得到降解岩藻多糖；上述降解多糖与氯化钙的混合溶液在恒温条件下螯合后经透析、醇沉和干燥，即得到岩藻多糖钙螯合物。所得螯合物的岩藻多糖分子量为0.8～40kDa、羧基含量为0.5～3％、羰基含量为5～25％；钙螯合量为40～130mg/g。本发明所采用的制备方法简单高效、绿色温和，所得的多糖钙螯合物无细胞毒副作用，且可显著促进Caco‑2细胞对钙的吸收。本发明有助于钙补充剂或相关功能食品的开发。
Description
技术领域
本发明属于多糖与金属离子螯合物制备领域，具体涉及一种岩藻多糖钙螯合物及其制备方法与应用。
背景技术
钙是人体必需的重要营养素之一，它参与人体的整个生命过程：从骨骼形成、肌肉收缩、心脏跳动、酶激活因子、神经以及大脑的思维活动。人体内钙元素总质量约占体重的1.5～2.2％，且其中大部分钙元素以磷酸盐的形式存在于人体骨骼和牙齿中。长期钙摄入不足会导致一系列钙缺乏症，儿童生长发育迟缓、老人骨质疏松等。通过口服钙强化剂是有效便捷的钙补充途径，市场上常见的钙强化剂包括无机钙、有机钙和氨基酸螯合钙等。但这些钙强化剂存在肠道副作用、生物利用率不足和产品味感不适等局限。目前我国补钙品行业市场饱和度较低、发展潜力较大。
针对目前市场上钙强化剂产品存在的不足，已有一些发明公开了不同来源多糖钙螯合产品的制备方法。CN115336757B公开了一种大豆多糖钙螯合物的制备方法，最终螯合物的钙含量为80mg/g。CN113424963B公开了一种大豆多糖钙咀嚼片的制备方法，最终咀嚼片的钙含量为67.5mg/g。然而目前这些多糖钙螯合产品尚存在钙螯合率有限、吸收性差等局限。由于多糖大分子链中存在丰富的羟基，适当修饰或改性可显著提升多糖螯合金属离子的能力。多糖修饰或改性的方法包括化学法、物理法和酶法等。UV/H2O2降解体系属于一种新型的化学氧化法，具有高效、经济、绿色环保等优点。H2O2分子在UV辐照的催化下裂解产生的大量自由基，这些自由基的反应活性极强，极易与有机分子发生氧化反应，在光化学反应中起着重要作用。因此，本发明采用UV/H2O2体系降解岩藻多糖，增加其螯合位点以提高其钙螯合量，最终制备出钙含量高的岩藻多糖钙螯合物。本发明在开发补钙产品领域具有较好的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种岩藻多糖钙螯合物及其制备方法与应用，本发明采用UV/H2O2体系降解岩藻多糖，降解方法简单高效、能耗低、无污染，且螯合物的钙含量高，具有良好的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的第一目的在于提供一种岩藻多糖钙螯合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将岩藻多糖溶液与H2O2溶液混合，混合液置于紫外灯管下降解，将降解液进行透析、浓缩和干燥，得到降解岩藻多糖；
(2)将步骤(1)所得的降解岩藻多糖溶于水，加入钙源溶液后调节pH值，恒温反应，经冷却、醇沉、离心后收集沉淀，纯化、干燥后，即得所述岩藻多糖钙螯合物。
优选地，步骤(1)中所采用的岩藻多糖分子量为200～500kDa。
优选地，步骤(1)中所述岩藻多糖溶液浓度为2～12mg/mL，H2O2浓度为20～400mM，岩藻多糖溶液与H2O2溶液体积比为1：1；紫外灯功率为900～2000μW/cm2，所述透析为用分子量为0.3～0.5kDa的透析袋透析。
优选地，步骤(1)中所述降解时间为5～150min，更优选为30～120min，最优选为120min。
优选地，步骤(1)中所得降解岩藻多糖的羧基含量为0.5～3％，羰基含量为5～25％；分子量为0.8～40kDa，更优选为8～30kDa，最优选为8～10kDa。
优选地，步骤(2)中降解盐藻多糖浓度为5～15mg/mL；所述钙源溶液为氯化钙溶液，氯化钙浓度为5～10mg/mL；降解岩藻多糖溶液与钙源溶液体积比为1：1；所述pH值为7.8～9.6，反应温度为30～45℃，反应时间为0.5～5h。
优选地，步骤(2)中所述醇沉为添加6-8倍反应液体积的乙醇进行醇沉；所述离心的转速为6000～12000r/min，所述纯化是指将沉淀加水复溶，用透析袋纯化，透析袋分子量为0.3～0.5kDa。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制得的岩藻多糖钙螯合物。
优选地，所述岩藻多糖钙螯合物的钙含量为40～130mg/g。
本发明的另一目的在于提供一种上述岩藻多糖钙螯合物在制备具有促钙吸收作用的补钙剂、功能食品或保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明提供的方法中，紫外光促进H2O2分子的裂解，产生大量的高反应性的自由基，自由基攻击多糖链中的糖环和糖苷键，发生亲核取代反应并导致糖环和糖苷键的断裂，多糖链断裂位点在自由基的进一步作用下生成羧基。反应持续进行，使得多糖的分子量逐渐降低且携带上丰富的羧基，有利于金属离子的螯合，从而提高多糖的螯合效率。
(2)本发明制得的岩藻多糖钙螯合物安全无毒，且细胞对岩藻多糖钙螯合物的吸收比小分子钙更好，适用于制备钙补充剂。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1制备的不同岩藻多糖钙螯合物的钙螯合量，不同字母(a-e)代表显著性差异P＜0.05。
图2为本发明实施例2制备的不同岩藻多糖钙螯合物的钙螯合量。
图3为本发明实施例1制备的不同降解岩藻多糖的Caco-2细胞毒性结果。
图4为本发明实施例1和对比例1制备的岩藻多糖钙螯合物在Caco-2细胞中的吸收情况结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例1
(1)制备降解岩藻多糖：将20mL 5mg/mL岩藻多糖溶液(分子量500kDa)与20mL300mM H2O2溶液混合，混合液置于辐照强度为1830μW/cm2的紫外辐照仪中分别降解30、60、90、120和150min；反应完成后用分子量为0.5kDa的透析袋将降解液透析48h，蒸发浓缩后置于真空冻干机中干燥48h，得到降解岩藻多糖。
(2)制备岩藻多糖钙螯合物：将10mL 6mg/mL降解岩藻多糖溶液与10mL10mg/mL氯化钙溶液混合，用HCl溶液调节pH值至8.0；混合液置于30℃恒温水浴锅中搅拌反应4h；反应结束后加入6倍体积乙醇醇沉，利用漩涡搅拌器充分搅拌破碎，离心机8000r/min离心10min，收集沉淀，加水复溶，用分子量为0.5kDa的透析袋将溶液透析48h，透析液用真空冻干机干燥48h，得到岩藻多糖钙螯合物，分别命名为样品A、B、C、D和E。
实施例2
(1)制备降解岩藻多糖：将20mL 5mg/mL岩藻多糖溶液(分子量500kDa)与20mL300mM H2O2溶液等体积混合，混合液置于辐照强度为1830μW/cm2的紫外线辐照仪中辐照降解120min；反应完成后用分子量为0.5kDa的透析袋将降解液透析48h，蒸发浓缩后置于真空冻干机中干燥48h，得到降解岩藻多糖。
(2)制备岩藻多糖钙螯合物：将10mL 6mg/mL降解岩藻多糖溶液与10mL10mg/mL氯化钙溶液混合，用HCl溶液调节pH值至8.0；混合液置于30℃恒温水浴锅中搅拌反应1、2、3、4和5h；反应结束后加入6倍体积乙醇醇沉，利用漩涡搅拌器充分搅拌破碎，离心机8000r/min离心10min，收集沉淀，加水复溶，用分子量为0.5kDa的透析袋将溶液透析48h，透析液用真空冻干机干燥48h，得到岩藻多糖钙螯合物，分别命名为样品F、G、H、I和J。
对比例1
将实施例1步骤(2)中的降解岩藻多糖替换为未经降解的岩藻多糖(分子量500kDa)，制备岩藻多糖钙螯合物，命名为对比样A。其他步骤和实施例1中的步骤相同。
效果验证
(1)羰基含量测定：用去离子水将1mL 8.8M的乙二醛溶液梯度稀释至1mM，分别取0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0mL的1mM乙二醛稀释液于离心管，每管用去离子水补加至4.0mL；分别取1mL不同浓度的乙二醛稀释液于离心管，加入1mL 20mg/mL乙酸钠溶液和1mL5mg/mL盐酸羟胺溶液，用旋涡混合器混匀，置于50℃水浴中反应20min；反应完成冷却至室温，反应液定容至10mL，在233nm波长下测定其吸光值，并以标样的羰基含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。降解岩藻多糖样品配制成2mg/mL溶液，取1mL样品溶液按上述标曲测定方案测定。
(2)羧基含量测定：准确称取10mg干燥的降解岩藻多糖，充分溶解于10mL水中，用标定后的0.01M NaOH标准溶液滴定样品溶液至pH值为8.2为止，通过NaOH标准溶液的消耗量计算样品中的羧基含量。
(3)分子量测定：采用凝胶渗透色谱法测定分子量。用流动相配制2mg/mL岩藻多糖溶液和不同分子量的葡聚糖标准品溶液，用0.22μm无菌水系滤膜过滤后备用；液相检测器为Waters 2414示差折光检测器，色谱柱为TSK G-5000PWXL和TSKG-3000PWXL色谱柱串联使用，柱温35℃，流动相为0.02MKH2PO4缓冲液，流速为0.5mL/min，进样量为25μL。
(4)钙含量测定：配制浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和10.0mg/L的系列钙标准溶液，分别加入10mL硝酸和0.5mL高氯酸后电磁炉上进行湿法消解，直至消化液呈无色透明或略带黄色，结束消解，在常温下冷却至室温，用超纯水定容至25mL，采用火焰原子吸收光谱仪测定其吸光值，通过标准溶液的钙含量和对应的吸光度值绘制标准曲线；取10mg干燥样品，以相同条件进行湿法消解并定容至25mL，采用火焰原子吸收光谱仪测定其吸光值，代入标准曲线中计算其钙含量。
(5)降解岩藻多糖Caco-2细胞毒性测定：所得的岩藻多糖钙螯合物粉末均用含有10％胎牛血清的完全培养基配制成浓度为250μg/mL的样品溶液；Caco-2细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔细胞培养板后，置于含有5％ CO2的37℃恒温培养箱中，用含有10％胎牛血清的完全培养基培养24h后，吸除培养基；每孔加入100μg/mL样品溶液，每个样品设置7个复孔，再次培养24h后吸除培养基，每孔加入50μL MTT溶液，在37℃孵育4h后，每孔加入150μLDMSO溶液，通过酶标仪测定每孔在570nm波长下的吸光度，并计算不同浓度与对照组吸光度的比值，得到细胞存活率。
(6)多糖钙螯合物Caco-2细胞吸收速率测定：所得的岩藻多糖钙螯合物粉末均用不含有钙离子的完全培养基配制成浓度为100μg/mL的样品溶液；将Caco-2细胞消化至悬浮，接种于直径20mm的细胞培养小皿中，培养24h至细胞完全贴壁后，每个培养小皿加入2.5μM Fluo-4/AM钙离子荧光探针，置于37℃培养30min后，用不含钙离子的PBS洗去多余的荧光染料；然后将小皿放置于ZEISS LSM 900激光共聚焦扫描显微镜下计时并观察，在第2min时加入各组样品溶液，100μg/mL氯化钙溶液作为对照组，利用荧光图像采集技术计算细胞内钙含量。
如图1所示，未经UV/H2O2体系降解的岩藻多糖的钙螯合量仅为18.9mg/g(对比样A)，岩藻多糖经UV/H2O2体系降解后的的钙螯合量显著提高，降解120min的岩藻多糖的钙螯合量提高至123.4mg/g(样品D)。结果证明，UV/H2O2体系处理是一种提高岩藻多糖钙螯合量的高效方法。
图2表示UV/H2O2体系处理120min制备的降解岩藻多糖与氯化钙螯合不同时间后的钙螯合量。可知，随着螯合时间的延长，降解岩藻多糖的钙螯合量逐渐提高。螯合反应至4h后，岩藻多糖的钙螯合量几乎不再提高，表明其钙螯合量达到饱和。
如图3所示，Caco-2细胞经对比样A和样品A～D处理后的细胞存活率都在80％以上，表明岩藻多糖经UV/H2O2体系降解120min内的产物不存在细胞毒性。样品E的细胞存活率已降至74％，表明岩藻多糖经UV/H2O2体系降解150min的产物存在一定的细胞毒性，已不适用于制备钙补充剂。
如图4所示，氯化钙作为无机小分子，能够快速被Caco-2细胞摄取吸收，使得细胞内钙信号产生强吸收信号，但无机钙盐易于在胃肠道中形成沉淀、不利于机体持续稳定的摄取钙离子。未经UV/H2O2体系降解的岩藻多糖钙螯合物，由于分子量太大难以被细胞摄取，进而无法引起Caco-2细胞内钙信号发生变化(对比样A)。当岩藻多糖被降解时间较短时，其钙螯合物也难以产生细胞钙吸收信号(样品A～C)，表明此时的多糖仍难以被吸收吸收，进而无法发挥促钙吸收作用。这同时表明，仅仅制备钙螯合量高的多糖钙螯合物仍不能保证其具有较好的钙补充效果。当岩藻多糖被降解120min后，其钙螯合物能够很好的被Caco-2细胞摄取，进而引起细胞内钙信号产生明显的持续信号(样品D)。这些结果证明，UV/H2O2体系处理不仅能大大提高岩藻多糖的钙离子能力，而且能显著促进多糖钙螯合物被小肠上皮细胞摄取吸收。表明经UV/H2O2体系辅助制备的岩藻多糖钙螯合物是一种钙螯合能力强、吸收特性好的钙补充剂。
如表1所示，岩藻多糖经UV/H2O2降解处理后分子量显著降低，羧基和羰基含量均显著提高。岩藻多糖分子量能被UV/H2O2体系从462.7kD迅速降低至10kD以下，这是因为高反应性的自由基攻击多糖链糖苷键使其断裂，造成岩藻多糖分子量降低，这有助于提高多糖螯合钙离子的能力。降解多糖的羧基和羰基含量与H2O2体系降解程度密切相关。经UV/H2O2体系降解120min后的降解产物的羰基含量高达20.4％、羧基含量高达2.99％，这是因为多糖的羟基会被自由基氧化成羰基，生成的羰基会进一步被氧化形成羧基。羧基具有良好的金属离子螯合能力，更高的羧基含量有利于钙离子的螯合，可以作为多糖降解条件的优化依据。因此，岩藻多糖经UV联用300mM H2O2辐照30～120min后的降解产物可作为后续制备多糖钙螯合物的原料。
表1为本发明实施例1和对比例1制备的不同岩藻多糖钙螯合物的分子量、羧基和羰基含量汇总。
表1
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种岩藻多糖钙螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将岩藻多糖溶液与H2O2溶液混合，混合液置于紫外灯管下降解，将降解液进行透析、浓缩和干燥，得到降解岩藻多糖；
(2)将步骤(1)所得的降解岩藻多糖溶于水，加入钙源溶液后调节pH值，恒温反应，经冷却、醇沉、离心后收集沉淀，纯化、干燥后，即得所述岩藻多糖钙螯合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所采用的岩藻多糖分子量为200～500kDa。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述岩藻多糖溶液浓度为2～12mg/mL，H2O2浓度为20～400mM，岩藻多糖溶液与H2O2溶液体积比为1：1；紫外灯功率为900～2000μW/cm2，降解时间为5～150min，所述透析为用分子量为0.3～0.5kDa的透析袋透析。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所得降解岩藻多糖的分子量为0.8～40kDa，羧基含量为0.5～3％，羰基含量为5～25％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述降解的时间为30～120min，所得降解岩藻多糖的分子量为8～40kDa。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中降解盐藻多糖浓度为5～15mg/mL；所述钙源溶液为氯化钙溶液，氯化钙浓度为5～10mg/mL；降解岩藻多糖溶液与钙源溶液体积比为1：1；所述pH值为7.8～9.6，反应温度为30～45℃，反应时间为0.5～5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述醇沉为添加6-8倍反应液体积的乙醇进行醇沉；所述离心的转速为6000～12000r/min，所述纯化是指将沉淀加水复溶，用透析袋纯化，透析袋分子量为0.3～0.5kDa。
8.一种由权利要求1-7任意一项制备方法制得的岩藻多糖钙螯合物。
9.根据权利要求8所述的岩藻多糖钙螯合物，其特征在于，所述岩藻多糖钙螯合物的钙含量为40～130mg/g。
10.一种权利要求8所述的岩藻多糖钙螯合物在制备具有促钙吸收作用的补钙剂、功能食品或保健品中的应用。
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