CN116120482B - 一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖及其制备方法与应用，属于褐藻精深加工领域。该方法具体包括以下步骤：将褐藻粗多糖置于介质阻挡放电等离子体反应器中进行等离子体降解，反应完成后经透析得到褐藻降解多糖。本发明方法操作简单、安全高效，绿色环保。所得褐藻多糖分子量为12‑230kDa，总糖含量为53‑88％，脱色率为51.62‑96.43％，脱蛋白率为69.14‑85.49％，能显著提高其NO和IL‑6的分泌水平，具有较强的免疫调节活性，可用于免疫调节相关药物或功能食品的开发，提高相关藻类精深加工水平，推动蓝色海洋经济的发展。

Description

一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于褐藻精深加工领域，具体涉及一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖及其制备方法与应用。
背景技术
褐藻是一种兼具食用与药用价值的藻类植物，广泛分布于我国沿海地区。我国常见的褐藻包括海带、裙带菜、巨藻、水云、索藻、酸藻、萱藻、囊藻、绳藻、鹅肠菜、网地藻、团扇藻、马尾藻、鹿角菜、海蒿子、海黍子、羊栖菜等。多糖是褐藻中重要的活性成分之一，已被报道具有多种健康功效。然而，褐藻多糖存在着分子量大、颜色深、水溶性差和生物利用率低等不足，从而大大限制其在食品、农业、医药等领域的应用。因此，寻找一种能够有效降解褐藻多糖并提高其生物活性的方法，对于褐藻资源的开发利用具有重要意义。
目前多糖的降解方法主要有化学方法、物理方法和生物方法三大类，但均存在一定的局限性。化学方法(如酸、碱等)法会导致严重的安全和环境问题；物理方法(如超声波、微波、脉冲电场等)对设备的要求较高，且降解效果较差；生物方法(酶水解、微生物发酵等)由于多糖结构的复杂性，往往需要针对特定多糖筛选有效的酶和微生物种类，成本较高。近年来，自由基降解法因其具有操作简单、高效省时和环保经济的特点被越来越多的研究者关注并用于多糖降解研究领域。介质阻挡放电等离子体降解法作为一种新型自由基降解技术，具有安全、绿色、环保、高效和便捷等特点，具有较好的应用前景。此外，目前常采用的脱色方法如活性炭法、过氧化氢法和大孔树脂法，以及脱蛋白方法如Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法和盐酸法，存在重复次数多、操作繁琐、多糖成分损失较大、纯度不高、或用到酸和有机溶剂等不足。近年来，自由基降解法作为一种多糖的高级氧化降解手段，因具有操作简单、省时高效、绿色环保、成本低廉等优点越来越受到研究人员的关注。低温等离子体处理作为一种新型自由基降解技术，具有绿色、安全、快速和便捷等特点，具有较大应用前景。低温等离子体包括了介质阻挡放电等离子体和脉冲放电等离子体等，但目前均尚未应用于海藻多糖的降解领域。
现有技术中，专利CN112063766A公开了一种液相脉冲放电等离子体多糖降解方法，将加入金属离子的多糖溶液进行液相脉冲放电等离子体降解处理，该方法降解效果显著，与传统降解技术需要加热处理相比，能耗降低。但是该方法引入了金属离子，后续需进一步除去，步骤繁琐，且引入的金属离子有可能会对多糖本身结构和功能产生影响。专利CN115040556A公开了一种低温等离子体辅助提取人参皂苷和多糖的方法，该方法具有操作工艺简单、易行、安全等优点，可提高人参皂苷和多糖的提取效率。但该方法是用于人参皂苷和多糖提取的预处理阶段，并不能有效解决多糖分子量大、生物利用率低等问题。专利CN106834552B公开了一种多糖降解为寡糖的低温等离子体降解方法，其利用低温等离子技术将多糖降解为寡糖，以纯水或盐水为溶剂制备等离子体并降解多糖，具有良好的降解效果，且未引入其他化学助剂，安全性更高，但是该方法无法获得具有较高免疫活性的多糖。
目前尚未见文献报道采用低温等离子体技术来降解褐藻多糖，并提高其生物活性。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种显著提高褐藻多糖免疫调节活性的制备方法与应用。
本发明首次采用介质阻挡放电等离子体降解褐藻多糖，该制备方法操作简单、安全高效，绿色环保。所得褐藻多糖能显著提高RAW264.7细胞NO和IL-6的分泌水平，具有较强的免疫调节活性，可用于免疫调节相关药物或功能食品的开发。该方法能提高褐藻的精深加工技术，拓宽褐藻的应用范围，具有良好的市场应用前景。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种介质阻挡放电等离子体降解褐藻多糖的方法，包括以下步骤：
将褐藻粗多糖溶液进行介质阻挡放电等离子体降解，浓缩，干燥，即得所述褐藻多糖；所述介质阻挡放电等离子体降解的条件为：电压60～120V，时间5～120min。
优选地，所述介质阻挡放电等离子体降解的条件为：电压100V，时间45-90min。
优选地，所述褐藻为羊栖菜、海带、裙带菜、巨藻、水云、索藻、酸藻、萱藻、囊藻、绳藻、鹅肠菜、网地藻、团扇藻、鹿角菜、海蒿子和海黍子中的一种以上。
优选地，所述褐藻粗多糖通过热水提取、酸法提取、酶法提取、超声波提取、微波提取、脉冲电场提取和碱法提取中的一种以上方法获得；所述褐藻粗多糖的分子量为150-800kDa。
优选地，所述褐藻粗多糖溶液的浓度为1-5mg/mL。
优选地，所述褐藻粗多糖溶液置于介质阻挡放电等离子体反应器中，反应釜直径为8-12cm，多糖液面高度为0.5-1.5cm，液面距离绝缘介质高度为0.3-0.8cm。
优选地，干燥前还包括透析步骤，所述透析步骤的截留分子量为500-3000Da，透析时间为24-72h。
本发明提供一种由上述方法制得的一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖。
优选地，所述褐藻多糖的分子量为10-230kDa，总糖含量为50-90％。
本发明提供一种上述褐藻多糖在制备免疫调节相关药物和/或功能食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明采用介质阻挡放电等离子体法降解褐藻多糖，该制备方法操作简单、安全高效，绿色环保，过程不使用化学试剂，既有效保护了褐藻多糖的结构和活性，又避免了环境中化学污染物的排放，绿色环保。
(2)本发明所采用的制备方法能显著降低褐藻多糖的分子量，有效去除褐藻多糖中的色素和蛋白质，提高多糖纯度。所得褐藻多糖分子量为12-230kDa，脱色率为51.62-96.43％，脱蛋白率为69.14-85.49％，可用于褐藻功能食品的开发，对海藻的精深加工有重要的意义。
(3)本发明所采用的制备方法能显著提高褐藻多糖的免疫调节活性，所得褐藻多糖能显著提高RAW 264.7细胞NO和IL-6的分泌水平，具有较强的免疫调节活性，可用于免疫调节相关药物或功能食品的开发，提高相关藻类精深加工水平，推动蓝色海洋经济的发展。
附图说明
图1为本发明所采用的反应装置示意图，其中，1代表高压电源，2代表高压电极，3代表绝缘介质，4代表反应釜(多糖溶液)，5代表接地电极。
图2为实施例1羊栖菜多糖的脱色率。
图3为实施例1羊栖菜多糖的脱蛋白率。
图4为实施例2海带多糖的脱色率。
图5为实施例2海带多糖的脱蛋白率。
图6为实施例3裙带菜多糖的脱色率。
图7为实施例3裙带菜多糖的脱蛋白率。
图8为本发明实施例4制备的羊栖菜多糖对RAW264.7细胞活力的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图9为本发明实施例4制备的羊栖菜多糖对RAW264.7细胞NO释放量的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图10为本发明实施例4制备的羊栖菜多糖对RAW264.7细胞IL-6释放量的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图11为本发明实施例5～7制备的海带多糖对RAW264.7细胞活力的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图12为本发明实施例5～7制备的海带多糖对RAW264.7细胞NO释放量的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图13为本发明实施例5～7制备的海带多糖对RAW264.7细胞IL-6释放量的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图14为本发明实施例8～10制备的裙带菜多糖对RAW264.7细胞活力的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图15为本发明实施例8～10制备的裙带菜多糖对RAW264.7细胞NO释放量的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
图16为本发明实施例8～10和制备的裙带菜多糖对RAW264.7细胞IL-6释放量的影响结果图。标有不同字母(a、b、c等)表示组之间有显著性差异。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种羊栖菜多糖提取物，其制备方法如下：
(1)羊栖菜预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行粉碎，过40目筛，取筛下粉末备用，得到羊栖菜粉末；采用低温振动式细胞级超微粉碎机将羊栖菜粉末超微粉碎10min，温度设置为-19℃，得到羊栖菜超微粉；取100g羊栖菜超微粉与400mL体积百分比浓度为95％乙醇溶液混合，升温进行回流反应，回流反应的温度为100℃，回流反应的时间为5h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜脱色粉。
(2)羊栖菜多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:50g/mL加入纯水中，得到羊栖菜溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为100℃，提取时间为4h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇按照体积比为1:5混合均匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，真空冷冻干燥，得到羊栖菜粗多糖(记为羊栖菜粗多糖A0)。
(3)等离子体降解：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖加入纯水中，使得羊栖菜粗多糖溶液的浓度为2mg/mL，pH值为6.5；将100mL羊栖菜粗多糖溶液置于介质阻挡放电等离子体反应器中分别进行等离子体降解0、5、10、20、30、45、60、75和90min，所述等离子体降解的电压为60、80、100和120V；反应完成后取反应液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与反应液的体积比为1:10；真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜多糖。
实施例2
一种海带多糖提取物，其制备方法如下：
预处理和提取步骤与实施例1相同，区别仅在于将实施例1中的羊栖菜替换成海带，得到海带粗多糖(标记为海带粗多糖B0)
等离子体降解：将海带粗多糖B0加入纯水中，使得海带粗多糖溶液的浓度为5mg/mL，pH值为6.6；将80mL海带粗多糖溶液置于介质阻挡放电等离子体反应器中分别进行等离子体降解0、5、10、20、30、45、60、75和90min，所述等离子体降解的电压为60、80、100和120V；反应完成后取反应液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与反应液的体积比为1:4；真空冷冻干燥，即得所述海带多糖。
实施例3
一种裙带菜多糖提取物，其制备方法如下：
预处理和提取步骤与实施例1相同，区别仅在于将实施例1中的羊栖菜替换成裙带菜，得到裙带菜粗多糖(标记为裙带菜粗多糖C0)。
等离子体降解：将裙带菜粗多糖C0加入纯水中，使得裙带菜粗多糖溶液的浓度为10mg/mL，pH值为7.5；将120mL裙带菜粗多糖溶液置于介质阻挡放电等离子体反应器中分别进行等离子体降解0、5、10、20、30、45、60、75和90min，所述等离子体降解的电压为60、80、100和120V；反应完成后取反应液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与反应液的体积比为1:15；即得所述裙带菜多糖。
实施例4
一种羊栖菜多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例1所述羊栖菜粗多糖(即羊栖菜粗多糖A0)溶于纯水中，使得羊栖菜粗多糖溶液的浓度为2mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为10cm，液面高度为1cm；进行等离子体降解5、10、20、30、45、60、75和90min，降解电压为100V；反应完成后取反应液置于3000Da透析袋中进行透析，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜降解多糖(标记为羊栖菜降解多糖A1～A8)。
实施例5
一种海带多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例2所述海带粗多糖(即海带粗多糖B0)溶于纯水中，使得海带粗多糖溶液的浓度为3mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为10cm，高度为1cm；进行等离子体降解50min，降解电压为85V；反应完成后取反应液置于500Da透析袋中进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述海带降解多糖(标记为海带降解多糖B1)。
实施例6
一种海带多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例2所述海带粗多糖(即海带粗多糖B0)溶于纯水中，使得海带粗多糖溶液的浓度为2mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为12cm，高度为1.5cm；进行等离子体降解110min，降解电压为70V；反应完成后取反应液置于1000Da透析袋中进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述海带降解多糖(标记为海带降解多糖B2)。
实施例7
一种海带多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例2所述海带粗多糖(即海带粗多糖B0)溶于纯水中，使得海带粗多糖溶液的浓度为4mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为8cm，高度为0.5cm；进行等离子体降解20min，降解电压为100V；反应完成后取反应液置于3000Da透析袋中进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述海带降解多糖(标记为海带降解多糖B3)。
实施例8
一种裙带菜多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例3所述裙带菜粗多糖(即裙带菜粗多糖C0)溶于纯水中，使得裙带菜粗多糖溶液的浓度为2.5mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为12cm，高度为1cm；进行等离子体降解90min，降解电压为95V；反应完成后取反应液置于500Da透析袋中进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述裙带菜降解多糖(标记为裙带菜降解多糖C1)。
实施例9
一种裙带菜多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例3所述裙带菜粗多糖(即裙带菜粗多糖C0)溶于纯水中，使得裙带菜粗多糖溶液的浓度为1.5mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为8cm，高度为1.5cm；进行等离子体降解120min，降解电压为65V；反应完成后取反应液置于1000Da透析袋中进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述裙带菜降解多糖(标记为裙带菜降解多糖C2)。
实施例10
一种裙带菜多糖降解产物，其制备方法如下：
将实施例3所述裙带菜粗多糖(即裙带菜粗多糖C0)加入纯水中，使得裙带菜粗多糖溶液的浓度为4.5mg/mL；将其置于介质阻挡放电等离子体反应器中，其溶液直径为10cm，高度为0.5cm；进行等离子体降解30min，降解电压为115V；反应完成后取反应液置于3000Da透析袋中进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述裙带菜降解多糖(标记为裙带菜降解多糖C3)。
对比例1
一种羊栖菜多糖提取物，其制备方法如下：
H2O2脱色处理：取适量羊栖菜粗多糖A0，溶解于含有H2O2的纯水中，使得羊栖菜粗多糖溶液的浓度为2mg/mL，H2O2终浓度为150mmol/L，处理0、5、10、20、30、45、60、75和90min，取反应液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与反应液的体积比为1:15，真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜多糖。
对比例2
一种羊栖菜多糖提取物，其制备方法如下：
Sevag法脱蛋白处理：按照氯仿与正丁醇体积比4:1配制Sevag试剂；将羊栖菜粗多糖A0加入纯水中，使得羊栖菜粗多糖溶液的浓度为2mg/mL；加入1/3倍体积的Sevag试剂，室温下振荡0、5、10、20、30、45、60、75和90min，反应结束后离心，取上层清液，与95％乙醇按照体积比为1:5混合均匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜多糖。
效果验证
本发明选择实施例1、2和3方法制得的羊栖菜多糖、海带多糖和裙带菜多糖对比了羊栖菜粗多糖A0、海带粗多糖B0和裙带菜粗多糖C0的分子量、脱色率和脱蛋白率。此外，为了进一步评价介质阻挡放电等离子体降解对海藻多糖的脱色脱蛋白效果，本实施例对比了对比例1(H2O2处理)和对比例2(Sevag法处理)方法制得的海藻多糖的脱色率和脱蛋白率。
选择实施例4方法制得的羊栖菜降解多糖A1～A8、实施例5～7方法制得海带降解多糖B1～B3和实施例8～10方法制得的裙带菜降解多糖C1～C3，分别对比了无降解处理制得的羊栖菜粗多糖A0、海带粗多糖B0和裙带菜粗多糖C0的分子量、总糖含量、细胞毒性和免疫调节活性。
(1)海藻多糖分子量的测定
多糖分子量采用凝胶渗透色谱法(GPC)进行测定，具体实验步骤如下：称取4mg海藻多糖充分溶解于0.02mol/L的KH2PO4溶液中，用0.22μm无菌水相滤膜过膜，滤液备用。色谱条件：色谱柱：TSK G-5000PWXL(7.8×300mm)和TSK G-3000PWXL(7.8×300mm)串联使用，柱温为35℃；检测器：Waters 2414示差折光检测器；流动相为0.02mol/L的KH2PO4缓冲液，流速为0.5mL/min，进样量为25μL。以不同分子量的葡聚糖(4.66、12.6、63.3、126和556kDa)绘制标准曲线。多糖样品的平均分子量根据其洗脱体积对照标准曲线计算得到。
(2)多糖总糖含量的测定
多糖总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定，具体实验步骤如下：以岩藻糖为标准品，取0.1mg/mL的岩藻糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以去离子水补足至1mL，依次加入5％(w/v)苯酚溶液1mL和浓硫酸5mL，摇匀，反应20min，于490nm处测定反应液的吸光值。以去离子水作为空白，平行测定3次，取平均值。以岩藻糖浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。准确吸取0.1mg/mL的褐藻多糖溶液1mL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光值，将其代入上述标准曲线，计算多糖样品的总糖含量。
(3)海藻多糖脱色率的测定
波长420nm常用于多糖的脱色率研究；取不同处理条件下多糖加入纯水中，使得多糖溶液浓度为2mg/mL，测定其420nm下的吸光度，脱色率按下列公式进行计算：
脱色率(％)＝(降解前吸光度值A0－降解后测定的吸光度值At)/(降解前的吸光度值A0)×100％
(4)海藻多糖脱蛋白率的测定
通过考马斯亮蓝法对蛋白含量进行测定。取不同处理条件下多糖加入纯水中，使得多糖溶液浓度为2mg/mL；以牛血清白蛋白为标准品，分别配制为0，10，20，40，60，80，100μg/mL牛血清白蛋白溶液；以纯水作为空白对照；取1mL多糖溶液/牛血清白蛋白溶液/纯水，加入考马斯亮蓝溶液5mL，混匀后室温静置5min，于595nm处测定反应液的吸光值。将多糖组吸光值代入上述标准曲线，计算多糖样品的蛋白质含量。
脱蛋白率(％)＝(降解前蛋白质含量－降解后测定的蛋白质含量)/(降解前蛋白质含量)×100％
(5)多糖对RAW 264.7细胞的毒性
RAW 264.7细胞以1×104个/孔接种于96孔细胞培养板后，置于37℃，含有5％ CO2的恒温培养箱中，用含有10％胎牛血清的完全培养基培养24h。吸弃培养基，空白组和对照组加入完全培养基0.1mL，阳性对照组加入用完全培养基配制的脂多糖溶液(1μg/mL LPS)0.1mL，实验组加入用完全培养基配制的褐藻多糖溶液(50、100、200和400μg/mL)0.1mL。培养24h后，吸弃培养基，每孔加入0.05mL 1×MTT溶液，在37℃孵育4h，使MTT还原为甲臜。吸弃培养基，每孔加入0.15mL DMSO使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。采用酶标仪在570nm波长处检测每孔的吸光度，计算不同浓度与对照组吸光度的比值，根据细胞活力值来判断多糖对RAW 264.7细胞的毒性。
(6)RAW 264.7细胞NO和IL-6含量的测定
RAW 264.7细胞以1.5×105个/孔接种于12孔细胞培养板后，置于37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中，用含有10％胎牛血清的完全培养基培养24h。吸弃培养基，空白组和对照组加入完全培养基1mL，阳性对照组加入用完全培养基配制的脂多糖溶液(1μg/mL LPS)1mL，实验组加入用完全培养基配制的褐藻多糖溶液(400μg/mL)1mL。培养24h后，收集上清液测定NO和IL-6含量。NO的测定采用一氧化氮检测试剂盒，IL-6的测定采用ELISA试剂盒。
如表1所示，介质阻挡放电等离子体处理可显著降低海藻多糖的分子量。
表1介质阻挡放电等离子体处理对羊栖菜多糖分子量的影响
如图2和图3所示，与无处理羊栖菜多糖溶液相比，Sevag法处理后，多糖溶液颜色没有明显变化，蛋白质含量有一定程度降低；H2O2法处理后，多糖溶液颜色变浅，对羊栖菜多糖溶液具有一定脱色作用，但其蛋白质含量没有明显变化；60V、80V、100V和120V等离子体处理后，多糖溶液脱色率及脱蛋白率均大幅度增加，且处理时间越长，处理电压越高，多糖溶液的脱色率和脱脱蛋白率逐渐升高，表明介质阻挡放电等离子体降解对羊栖菜多糖有更好的脱色脱蛋白效果。
如图4和图5所示，与无处理海带多糖溶液相比，60V、80V、100V和120V等离子体处理后，多糖溶液脱色率及脱蛋白率均大幅度增加，且随着处理电压的增加，脱色脱蛋白效果更好，表明介质阻挡放电等离子体降解对海带多糖具有较好的脱色脱蛋白效果。
如图6和图7所示，与无处理裙带菜多糖溶液相比，60V、80V、100V和120V等离子体处理后，多糖溶液脱色率及脱蛋白率均大幅度增加，且随着处理电压的增加，脱色脱蛋白效果更好，表明介质阻挡放电等离子体降解对裙带菜多糖具有较好的脱色脱蛋白效果。
表2介质阻挡放电等离子体处理对褐藻多糖分子量和总糖含量的影响
由表2可知，介质阻挡放电等离子体处理可显著降低褐藻多糖的分子量，并提高其总糖含量。结合表2和图8～16可知，分子量为27-213kDa，总糖含量为53-88％的褐藻多糖具有显著免疫调节活性。
如图8所示，以正常生长的RAW 264.7细胞为对照，阳性对照(LPS)以及羊栖菜降解多糖A1～A8处理后，细胞活力均无显著变化，表明羊栖菜降解多糖A1～A8对该细胞无明显毒性；50、100μg/mL羊栖菜粗多糖A0处理后，细胞活力无显著变化，200μg/mL羊栖菜粗多糖A0处理后，细胞活力略有下降，400μg/mL羊栖菜粗多糖A0处理后，细胞活力显著降低，表明羊栖菜粗多糖A0在低浓度下对该细胞无明显毒性，但在高浓度下对该细胞表现出轻微毒性，说明介质阻挡放电等离子体处理能够提高羊栖菜多糖的安全性。
如图9所示，以正常生长的RAW 264.7细胞为对照，阳性对照(LPS)以及海带降解多糖B1、B2、B3处理后，细胞活力均无显著变化，表明海带降解多糖B1、B2、B3对该细胞无明显毒性；50、100μg/mL海带粗多糖B0处理后，细胞活力无显著变化，200μg/mL海带粗多糖B0处理后，细胞活力略有下降，400μg/mL海带粗多糖B0处理后，细胞活力显著降低，表明海带粗多糖B0在低浓度下对该细胞无明显毒性，但在高浓度下对该细胞表现出轻微毒性，说明介质阻挡放电等离子体处理能够提高海带多糖的安全性。
如图10所示，以正常生长的RAW 264.7细胞为对照，阳性对照(LPS)以及裙带菜降解多糖C1、C2、C3处理后，细胞活力均无显著变化，表明裙带菜降解多糖C1、C2、C3对该细胞无明显毒性；50、100μg/mL裙带菜粗多糖C0处理后，细胞活力无显著变化，200μg/mL裙带菜粗多糖C0处理后，细胞活力略有下降，400μg/mL裙带菜粗多糖C0处理后，细胞活力显著降低，表明裙带菜粗多糖C0在低浓度下对该细胞无明显毒性，但在高浓度下对该细胞表现出轻微毒性，说明介质阻挡放电等离子体处理能够提高裙带菜多糖的安全性。
一氧化氮(NO)是免疫调节系统中关键的调节因子，NO的释放量通常是巨噬细胞免疫水平的一个重要评价依据。如图11所示，与对照组相比，阳性对照(LPS)及羊栖菜多糖A0～A8均能显著提高NO释放量；但与羊栖菜粗多糖A0相比，经羊栖菜降解多糖A1～A8处理后，细胞NO释放量显著更高，约为羊栖菜粗多糖A0的2倍，表明经介质阻挡放电等离子体处理后的羊栖菜多糖A1～A8的效果优于未经处理的羊栖菜多糖A0。
如图12所示，与对照组相比，阳性对照(LPS)及海带多糖B0、B1、B2、B3均能显著提高NO释放量；但与海带粗多糖B0相比，经海带降解多糖B1、B2、B3处理后，细胞NO释放量显著更高，约为海带粗多糖B0的2.5倍，表明经介质阻挡放电等离子体处理后的海带多糖B1、B2、B3的效果优于未经处理的海带多糖B0。
如图13所示，与对照组相比，阳性对照(LPS)及裙带菜多糖C0、C1、C2、C3均能显著提高NO释放量；但与裙带菜粗多糖C0相比，经裙带菜降解多糖C1、C2、C3处理后，细胞NO释放量显著更高，约为裙带菜粗多糖C0的3倍，表明经介质阻挡放电等离子体处理后的裙带菜多糖C1、C2、C3的效果优于未经处理的裙带菜多糖C0。
白细胞介素IL-6可由活化的成纤维细胞或T淋巴细胞产生，具有刺激免疫细胞增殖、分化的作用，促使免疫细胞发挥免疫功能。如图14所示，与对照组相比，阳性对照(LPS)及羊栖菜多糖A0～A8均能显著提高IL-6释放量；但与羊栖菜粗多糖A0相比，经羊栖菜降解多糖A1～A8处理后，细胞IL-6释放量显著更高，约为羊栖菜粗多糖A0的1.2～2.5倍，表明经介质阻挡放电等离子体处理后的羊栖菜多糖A1～A8的效果优于未经处理的羊栖菜多糖A0，其中，羊栖菜降解多糖A6的效果优于羊栖菜降解多糖A1～A5和A7～A8。
如图15所示，与对照组相比，阳性对照(LPS)及海带多糖B0、B1、B2、B3均能显著提高IL-6释放量；但与海带粗多糖B0相比，经海带降解多糖B1、B2、B3处理后，细胞IL-6释放量显著更高，约为海带粗多糖B0的1.5倍，表明经介质阻挡放电等离子体处理后的海带多糖B1、B2、B3的效果优于未经处理的海带多糖B0。
如图16所示，与对照组相比，阳性对照(LPS)及裙带菜多糖C0、C1、C2、C3均能显著提高IL-6释放量；但与裙带菜粗多糖C0相比，经裙带菜降解多糖C1、C2、C3处理后，细胞IL-6释放量显著更高，约为裙带菜粗多糖C0的3倍，表明经介质阻挡放电等离子体处理后的裙带菜多糖C1、C2、C3的效果优于未经处理的裙带菜多糖C0。
与褐藻粗多糖相比，经介质阻挡放电等离子体处理后的褐藻多糖能显著提高RAW264.7细胞活力、NO释放量及IL-6释放量，表明介质阻挡放电等离子体处理能够提高产物多糖的免疫调节活性及安全性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种介质阻挡放电等离子体降解的褐藻多糖在制备免疫调节相关药物中的应用，其特征在于，所述褐藻多糖的制备方法包括以下步骤：
将褐藻粗多糖溶液进行介质阻挡放电等离子体降解，浓缩，干燥，即得所述褐藻多糖；所述介质阻挡放电等离子体降解的条件为：电压60~120V，时间5~120min；所述褐藻多糖的总糖含量为50-90%；
所述的褐藻为羊栖菜、海带、裙带菜中的一种；
当所述的褐藻为羊栖菜时，褐藻多糖的分子量为20-181kDa；当所述的褐藻为海带时，褐藻多糖的分子量为62-213kDa；当所述的褐藻为裙带菜时，褐藻多糖的分子量为27-125kDa。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述介质阻挡放电等离子体降解的条件为：电压100V，时间45-90min。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褐藻粗多糖通过热水提取、酸法提取、酶法提取、超声波提取、微波提取、脉冲电场提取和碱法提取中的一种方法获得；所述褐藻粗多糖的分子量为150-800kDa。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褐藻粗多糖溶液的浓度为1-5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述褐藻粗多糖溶液置于介质阻挡放电等离子体反应器中，反应釜直径为8-12cm，多糖液面高度为0.5-1.5cm，液面距离绝缘介质高度为0.3-0.8cm。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，干燥前还包括透析步骤，所述透析步骤的截留分子量为500-3000Da，透析时间为24-72h。
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