CN112094359A - 一种羊肚菌多糖的提取方法、羊肚菌多糖饮液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食用菌加工技术领域，具体涉及一种羊肚菌多糖的提取方法、羊肚菌多糖饮液及其制备方法，该提取方法是将羊肚菌子实体烘干粉碎后，依次经过酶解、超声、灭酶、离心后取上清液，再将沉淀物重复上述步骤得到上清液，合并两次的上清液后，利用复合酶进行酶解，再经过脱色脱蛋白等处理后获得羊肚菌多糖溶液。该提取工艺步骤简单，易于控制，可有效保护羊肚菌多糖提取物的生物活性，生产周期短，降低了成本，可实现工业扩大化生产，而且提取率可达6％‑8.2％，纯度高，可用于制备具有提高机体免疫力等保健功效的羊肚菌多糖饮液。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌加工技术领域，具体涉及一种羊肚菌多糖的提取方法和羊肚菌多糖饮液及其制备方法。
背景技术
羊肚菌多糖是羊肚菌主要的活性成分，具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒、减血脂、减动脉粥样硬化等众多功效，具有很高的营养和药用价值。常规羊肚菌多糖提取方法有热水浸提法、碱提法、酸提法、微波辅助提取法和超声波提取法等多种方法。其中，热水浸提法虽能很好的保证提前多糖的活性，实验操作简易，能节约成本，但是对细胞的破坏程度小、耗能高、对细胞壁的破坏存有一定困难，只能提取到壁外多糖，而且多糖提取率较低，耗时长，乙醇用量大；碱提法虽然提取率比热水浸提法较高，但只能提取碱溶性多糖，提取范围小，而且提取出的多糖杂质较多，导致后续操作程序复杂；酸提法与碱提法优缺点相似，不同的是，酸对多糖聚合体的破坏明显，提取出的多糖粘度低，而且酸水解，容易产生酸性废液，且进行废水，废物的处理的过程中，将提高整个多糖的提取成本；超声波以及微波辅助提取法提取的多糖会由于长时间的超声波放射促使了羊肚菌多糖分解，同时微波辐射导致体系温度升高，可能会破坏多糖结构而导致多糖含量降低。
国内开展羊肚菌多糖饮料的相关研究比较早。例如，张广伦(1993年)等对羊肚菌子实体采用酸提酶解工艺处理，制备了羊肚菌保健饮料，但在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，所以羊肚菌多糖提取率不高。北京市食品研究所(1995年)以羊肚菌发酵液制备了得宝口服液，具有增强免疫功能、抑制癌肿、抗疲劳、降血脂和抗诱变等多种保健作用，但是现在市场上看不到这些产品。因为目前羊肚菌多糖饮料生产主要存在两个问题：(1)产品纯度低、品质低，而羊肚菌多糖的功效与纯度密切相关，只有高纯度的多糖产品才具有提高免疫力、抗疲劳等功效。(2)提取工艺技术经济性差、工艺复杂、成本高。羊肚菌提取液中含有蛋白质、色素以及结构相似的单糖、二糖等杂质，需要经过脱蛋白、低聚糖和单糖分离、精制等多个分离纯化的步骤。现有单一的膜分离、吸附、离子交换、结晶等分离方法难以得到高纯度产品，同时分离纯化过程收率很低，导致目前的提取工艺技术经济性差，提取工艺繁琐。
因此，亟需对现有的羊肚菌多糖提取工艺进行改进，以解决目前的提取工艺提取率低、经济性差、提取步骤繁琐等问题，并开发出具有保健功效的羊肚菌多糖饮料产品，更好地满足市场需求。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术中的不足，而提供一种提取率高、工艺流程简单、可以进行工业扩大化处理的羊肚菌多糖的提取方法及采用该方法得到的羊肚菌多糖提取物。
本发明的目的之二在于针对现有技术中的不足，而提供一种提高免疫力的羊肚菌多糖饮液及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
提供一种羊肚菌多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)取羊肚菌子实体250～400重量份，在烘干设备中55℃干燥4h，用粉碎机进行粉碎处理后过80目筛；
(2)按照液料比为(18～25)：1加入蒸馏水，然后依次经过酶解、超声、灭酶、离心后取上清液，得到上清液1，备用；沉淀物依次用蒸馏水溶解、酶解、超声、灭酶、离心后取上清液，得到上清液2；将上清液2与上清夜1混合、浓缩后，用4倍体积的无水乙醇醇沉过夜，离心，取沉淀物溶解于蒸馏水，得到羊肚菌粗多糖溶液；所述酶解采用的是复合酶；
(3)将羊肚菌粗多糖溶液脱色后，加入木瓜蛋白酶进行脱蛋白、离心处理，取上清液后即得到羊肚菌多糖溶液；
(4)使用苯酚-硫酸法检测所述羊肚菌多糖溶液的羊肚菌多糖含量，使用可见分光光度计测量所述羊肚菌多糖溶液的吸光度。
上述技术方案中，所述步骤(2)具体为：在容器中按(18～25)：1的料液比加入蒸馏水，然后添加质量百分比为1.0％～1.6％的复合酶，调pH为6～7，接着置于50～55℃的恒温水浴中提取1.5～2h，将酶解后的溶液转移至超声设备，超声提取10～20min，再将超声提取、灭酶后的溶液离心，取上清液，得到上清液1；将沉淀溶解，重新加入蒸馏水溶解，再加入质量百分比为1.0％～1.4％的复合酶进行酶解，调pH为6～6.5，置于50～55℃恒温水浴提取2～3h，然后转移到超声设备，超声提取20～30min，离心，取上清液，得到上清液2；将上清液1和上清液2混合，减压浓缩，加4倍无水乙醇醇沉过夜，离心，取沉淀溶于蒸馏水，得到羊肚菌粗多糖溶液。
上述技术方案中，所述复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，且所述纤维素酶和木瓜蛋白酶的质量比为2：1。
上述技术方案中，步骤(2)中，得到上清液1的处理过程中，超声提取的功率为150～250w，得到上清液2的处理过程中，超声提取的功率为200～250w；
上清液1和上清液2的处理过程中，所述灭酶步骤的条件均为95℃处理15min，所述离心步骤的转速为4500r/min，离心时间12min；
所述无水乙醇醇沉过夜的条件为-18℃，pH为6.5。
上述技术方案中，步骤(3)中，添加木瓜蛋白酶的质量百分比为0.8％～1.2％，pH为5.5～6.5，脱蛋白的时间为1～2h，离心步骤的转速为4500r/min，离心时间12min。
与现有技术相比，本发明的提取方法中，采用超声辅助酶提法，这种方法完全解决了传统方法(热水浸提法、碱提法、酸提法、单纯超声提取法)存在的缺点。超声波是一种频率不低于20kHz的声波，它在介质传播的过程中，会出现正负压强的改变，使介质被挤压或离散，从而发生空化作用来破坏细胞壁；同时，酶的存在也会破坏细胞壁及细胞结构，有利于高效率地提取羊肚菌多糖。本发明中所用的复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶复合酶，优选质量比为2：1。加入复合酶后50～55℃水浴酶解1～2h，当酶解时间低于1h时，酶解不完全，大部分羊肚菌多糖不能被水解出，当时间高于2h时，酶解时间过长，而提取速率上升缓慢，几乎不变。控制温度为50～55℃，低于50℃时，酶活性低，当温度高于55℃时，大部分酶失活，导致酶解速率变慢。55℃酶解后，进行超声10～20min。超声时间低于10min，细胞壁破坏程度不完全，检测出的羊肚菌多糖提取率低。当时间高于20min时，由于超声波的声波能量在传递的过程中会被介质吸收，导致介质温度升高，加上超声波的震动作用，羊肚菌多糖结构成分的破坏程度增大，分光光度计检测出的多糖含量反而较低。经过多次多组单因素实验，采用择优的选择方法，得出55℃下酶解1.5～2h，进行15～20min超声处理，再95℃水浴灭酶，离心取得第一次的上清液，并将沉淀重新溶解、酶解提取、超声波提取，将残留的羊肚菌多糖再重新提取一次，得到第二次的上清液，两次上清液混合、浓缩，这样可将第一次残留的羊肚菌多糖重新提取出来，通过提取工艺各步骤之间的协同作用，这样羊肚菌多糖的提取率升高，由提取一次的4％～7％提升到6％～8.2％
现有技术中对羊肚菌多糖的检测方法有传统的化学测定方法有苯酚–硫酸法、蒽酮–硫酸法等，仪器分析法有气相色谱法，液相色谱法，层析法等多种方法。本发明采用苯酚-硫酸法，其中苯酚作为检测的显色剂，硫酸为消化剂。向产品中加入1ml 6％的苯酚，以及5ml 95％～98％的浓硫酸，严格控制浓硫酸的浓度和用量，使羊肚菌多糖的结果可以准确无误。该苯酚-硫酸法较蒽酮-硫酸法稳定，节约时间，减少了制作成本，同时苯酚-硫酸法可以检测大量的样品，这种方法生成的有色化合物存在时间较长，检测时也不会受到蛋白质的干扰，检测结果比较准确。而蒽酮–硫酸法中使用的蒽酮稳定性差，必须现配现用，且测不了戊糖和己糖。
本发明还提供一种羊肚菌多糖提取物，所述羊肚菌多糖提取物是采用权利要求上述提取方法制成的。
本发明还提供一种羊肚菌多糖饮液，所述羊肚菌多糖饮液是由以下重量份的原料制成：
羊肚菌多糖提取物20～32份
低聚果糖40～55份
三氯蔗糖1～2份
维生素C 2～4份；
其中，所述羊肚菌多糖提取物是采用上述提取方法制成的。
本发明还提供上述羊肚菌多糖饮液的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、制备羊肚菌多糖提取物：
采用上述提取方法得到的所述羊肚菌多糖提取物；
步骤b、按重量份计，将步骤a得到的羊肚菌多糖提取物20～32份与低聚果糖40～55份、三氯蔗糖1～2份和维生素C 2～4份混合均匀制成混合液；
步骤c、将步骤b得到的混合液装瓶后灭菌，即获得所述的羊肚菌多糖饮液。
上述技术方案中，步骤c中，灭菌条件为90℃处理20min。
上述技术方案中，所述羊肚菌多糖饮液的pH为3.4±0.05，所述羊肚菌多糖饮液中羊肚菌多糖提取物的含量为2～3.2g/L。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明的羊肚菌多糖的提取方法具有以下优点：
(1)与传统的多糖提取工艺相比，本发明的提取工艺简单，仅涉及物理破碎、酶解、超声萃取等过程，各个过程条件容易把控，不涉及各种剧烈的变化，可以有效保护羊肚菌多糖的分子结构和特性，保证了羊肚菌多糖提取物的生物活性，而且大大简化了工艺步骤，生产周期有效缩短，降低了成本，可实现工业扩大化生产；
(2)提取过程中除了利用超声波进行破壁以外，同时还使用了复合酶进行高效酶解，可以有效降低羊肚菌多糖的提取成本，而且提取率可达6％-8.2％，纯度高，扩大了不同羊肚菌多糖的提取范围，有效地改善了乙醇提取的溶解性，使得本发明的提取方法可以有效地应用在真菌甚至于醇提的产品中，应用范围广；
(3)本发明的提取方法更好地保留了羊肚菌多糖提取物的生物活性，故所制备的羊肚菌多糖饮液具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒、减血脂、减动脉粥样硬化等保健功效，具有很高的营养和药用价值。经试验测试该饮液清除羟自由基的清除率为67.18％，DPPH自由基的清除率为95.01％，还原力相当于0.5mg/ml的Vc溶液。此外，该饮液澄清透明，无不溶物，口感清爽微甜，适用于各个年龄段饮用，故具有非常好的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
实施例1：
本实施例的一种羊肚菌多糖饮液的制备方法如下：
1、干燥：以云南丽江羊肚菌为原材料，在烘箱中55℃，干燥4h。
2、粉碎：使用20000r/min的粉碎机粉碎羊肚菌子实体30s，停留1min，再重复粉碎两次，整个过程为3min30s，得到羊肚菌粉末。
3、过筛：将粉碎后的羊肚菌粉末过80目筛进行筛选。
4、酶解：取过筛后的羊肚菌粉末350重量份，加20倍量蒸馏水，加入复合酶质量百分比为1.6％，pH＝6.5，53℃下酶解1.5h。
5、超声波处理：对酶解后的溶液超声波处理15min，超声波功率为200w。
6、灭酶：将超声波处理后的溶液，在95℃中水浴加热15min。
7、离心：灭酶后的溶液，以4500r/min进行离心12min，取离心后的上清液，得到上清液1，备用；
8、二次酶解：将离心后的沉淀物用25倍蒸馏水溶解，添加质量百分比为1.4％的复合酶，pH为6.5，53℃下酶解3h。
9、二次超声波处理：将酶解后的溶液转移到超声设备，超声波功率为250w，超声波提取25min。
10、灭酶、离心：将超声波处理后的溶液在95℃中水浴加热15min，灭酶后的溶液以4500r/min离心12min，取上清夜，得到上清液2。
11、混合处理：将上清液1和上清液2混合，减压浓缩，加4倍无水乙醇醇沉过夜，无水乙醇醇沉过夜的条件为-18℃，pH为6.5。
12、离心：将醇沉过夜的悬浊液以4500r/min离心12min，离心后取沉淀溶于蒸馏水，即为羊肚菌粗多糖溶液。
13、脱色脱蛋白处理：先加入10重量份的活性炭进行脱色处理，摇匀，静置20min后抽滤，得到羊肚菌多糖脱色溶液；然后加入质量百分比为1.0％的木瓜蛋白酶进行脱蛋白，pH为6.5，脱蛋白时间为1.5h，4500r/min离心12min，取上清夜，即得到羊肚菌多糖提取物。
14、取28重量份的羊肚菌多糖提取物，向其中加入2重量份的三氯蔗糖、3重量份的维生素C和50重量份的低聚果糖，混合均匀制成混合液，备用；
15、将混合液装瓶后灭菌，灭菌条件是90℃，20min，即得到羊肚菌多糖饮液。
16、将该羊肚菌多糖饮液进行检测，测得pH＝3.4±0.05，羊肚菌多糖提取物的含量为3.2g/L，计算提取率为8.17％。
本实施例中，复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，其质量比为2：1。
实施例2：
本实施例的一种羊肚菌多糖饮液的制备方法如下：
1、干燥：以云南丽江羊肚菌为原材料，在烘箱中55℃，干燥4h。
2、粉碎：使用20000r/min的粉碎机粉碎羊肚菌子实体30s，停留1min，再重复粉碎两次，整个过程为3min30s，得到羊肚菌粉末。
3、过筛：将粉碎后的羊肚菌粉末过80目筛进行筛选。
4、酶解：取过筛后的羊肚菌粉末400重量份，加25倍量蒸馏水，加入复合酶质量百分比为1.4％，pH为6，55℃下酶解2h。
5、超声波处理：对酶解后的溶液超声波处理10min，超声波功率为250w。
6、灭酶：将超声波处理后的溶液，在95℃中水浴加热15min。
7、离心：灭酶后的溶液，以4500r/min进行离心12min，取离心后的上清液，得到上清液1，备用；
8、二次酶解：将离心后的沉淀物用22倍蒸馏水溶解，添加质量百分比为1.2％的复合酶，pH为6，55℃下酶解。
9、二次超声波处理：将酶解后的溶液转移到超声设备，超声波功率为250w，超声波提取20min。
10、灭酶、离心：将超声波处理后的溶液在95℃中水浴加热15min，灭酶后的溶液以4500r/min离心12min，取上清夜，得到上清液2。
11、混合处理：将上清液1和上清液2混合，减压浓缩，加4倍无水乙醇醇沉过夜，无水乙醇醇沉过夜的条件为-18℃，pH为6.5。
12、离心：将醇沉过夜的悬浊液以4500r/min离心12min，离心后取沉淀溶于蒸馏水，即为羊肚菌粗多糖溶液。13、脱色脱蛋白处理：先加入10重量份的活性炭进行脱色处理，摇匀，静置20min后抽滤，得到羊肚菌多糖脱色溶液；然后加入质量百分比为1.2％的木瓜蛋白酶进行脱蛋白，pH为5.5，脱蛋白时间为1h，4500r/min离心12min，取上清夜，即得到羊肚菌多糖提取物。
14、取32重量份的羊肚菌多糖提取物，向其中加入1重量份的三氯蔗糖、4重量份的维生素C和55重量份的低聚果糖，混合均匀制成混合液，备用；
15、将混合液装瓶后灭菌，灭菌条件是90℃，20min，即得到羊肚菌多糖饮液。
16、将该羊肚菌多糖饮液进行检测，测得pH＝3.4±0.05,羊肚菌多糖提取物的含量为2.8g/L，计算提取率为8.07％。
本实施例中，复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，其质量比为2：1。
实施例3：
本实施例的一种羊肚菌多糖饮液的制备方法如下：
1、干燥：以云南丽江羊肚菌为原材料，在烘箱中55℃，干燥4h。
2、粉碎：使用20000r/min的粉碎机粉碎羊肚菌子实体30s，停留1min，再重复粉碎两次，整个过程为3min30s，得到羊肚菌粉末。
3、过筛：将粉碎后的羊肚菌粉末过80目筛进行筛选。
4、酶解：取过筛后的羊肚菌粉末250重量份，加18倍量蒸馏水，加入复合酶质量百分比为1.0％，pH为7，50℃下酶解1.8h。
5、超声波处理：对酶解后的溶液超声波处理20min，超声波功率为150w。
6、灭酶：将超声波处理后的溶液，在95℃中水浴加热15min。
7、离心：灭酶后的溶液，以4500r/min进行离心12min，取离心后的上清液，得到上清液1，备用；
8、二次酶解：将离心后的沉淀物用20倍蒸馏水溶解，添加质量百分比为1.0％的复合酶，pH为6.5，50℃下酶解2.5h。
9、二次超声波处理：将酶解后的溶液转移到超声设备，超声波功率为200w，超声波提取30min。
10、灭酶、离心：将超声波处理后的溶液在95℃中水浴加热15min，灭酶后的溶液以4500r/min离心12min，取上清夜，得到上清液2。
11、混合处理：将上清液1和上清液2混合，减压浓缩，加4倍无水乙醇醇沉过夜，无水乙醇醇沉过夜的条件为-18℃，pH为6.5。
12、离心：将醇沉过夜的悬浊液以4500r/min离心12min，离心后取沉淀溶于蒸馏水，即为羊肚菌粗多糖溶液。
13、脱色脱蛋白处理：先加入10重量份的活性炭进行脱色处理，摇匀，静置20min后抽滤，得到羊肚菌多糖脱色溶液；然后加入质量百分比为0.8％的木瓜蛋白酶进行脱蛋白，pH为6.5，脱蛋白时间为2h，4500r/min离心12min，取上清夜，即得到羊肚菌多糖提取物。
14、取20重量份的羊肚菌多糖提取物，向其中加入1重量份的三氯蔗糖、2重量份的维生素C和40重量份的低聚果糖，混合均匀制成混合液，备用；
15、将混合液装瓶后灭菌，灭菌条件是90℃，20min，即得到羊肚菌多糖饮液。
16、将该羊肚菌多糖饮液进行检测，测得pH＝3.4±0.05,羊肚菌多糖提取物的含量为2g/L，计算提取率为7.23％。
本实施例中，复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，其质量比为2：1。
实施例4：
本实施例的一种羊肚菌多糖饮液的制备方法如下：
1、干燥：以云南丽江羊肚菌为原材料，在烘箱中55℃，干燥4h。
2、粉碎：使用20000r/min的粉碎机粉碎羊肚菌子实体30s，停留1min，再重复粉碎两次，整个过程为3min30s，得到羊肚菌粉末。
3、过筛：将粉碎后的羊肚菌粉末过80目筛进行筛选。
4、酶解：取过筛后的羊肚菌粉末300重量份，加20倍量蒸馏水，加入复合酶质量百分比为1.2％，pH为6.5，52℃下酶解2h。
5、超声波处理：对酶解后的溶液超声波处理18min，超声波功率为180w。
6、灭酶：将超声波处理后的溶液，在95℃中水浴加热15min。
7、离心：灭酶后的溶液，以4500r/min进行离心12min，取离心后的上清液，得到上清液1，备用；
8、二次酶解：将离心后的沉淀物用20倍蒸馏水溶解，添加质量百分比为1.4％的复合酶，pH为6，54℃下酶解2h。
9、二次超声波处理：将酶解后的溶液转移到超声设备，超声波功率为220w，超声波提取28min。
10、灭酶、离心：将超声波处理后的溶液在95℃中水浴加热15min，灭酶后的溶液以4500r/min离心12min，取上清夜，得到上清液2。
11、混合处理：将上清液1和上清液2混合，减压浓缩，加4倍无水乙醇醇沉过夜，无水乙醇醇沉过夜的条件为-18℃，pH为6.5。
12、离心：将醇沉过夜的悬浊液以4500r/min离心12min，离心后取沉淀溶于蒸馏水，即为羊肚菌粗多糖溶液。
13、脱色脱蛋白处理：先加入10重量份的活性炭进行脱色处理，摇匀，静置20min后抽滤，得到羊肚菌多糖脱色溶液；然后加入质量百分比为1.0％的木瓜蛋白酶进行脱蛋白，pH为6，脱蛋白时间为1.5h，4500r/min离心12min，取上清夜，即得到羊肚菌多糖提取物。
14、取24重量份的羊肚菌多糖提取物，向其中加入2重量份的三氯蔗糖、3重量份的维生素C和46重量份的低聚果糖，混合均匀制成混合液，备用；
15、将混合液装瓶后灭菌，灭菌条件是90℃，20min，即得到羊肚菌多糖饮液。
16、将该羊肚菌多糖饮液进行检测，测得pH＝3.4±0.05,羊肚菌多糖提取物的含量为2.6g/L，计算提取率为7.64％。
本实施例中，复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，其质量比为2：1。
采用实施例1的羊肚菌多糖饮液进行以下功效试验：
1、检测羊肚菌多糖饮液清除羟自由基的能力：
精确配制10mmol/L的水杨酸溶液、10mmol/L硫酸亚铁溶液、12mmol/L的过氧化氢溶液；
精确配制0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml的羊肚菌多糖饮液，分别移取2ml不同浓度的羊肚菌多糖饮液于试管中，依次添加硫酸亚铁溶液、过氧化氢溶液、水杨酸溶液各2ml，测定样品吸光值不加过氧化氢溶液，空白组以蒸馏水代替样品，每个实验平行三次，移号溶液后全部转移到水浴锅中37℃水浴30min，在510nm波长下、用蒸馏水调零，测吸光值，羟自由基清除率的计算公式如下：
清除率％＝[1-(Ax-Axo)/Ao]*100
Ax——样品清除自由基后的吸光值
Axo——样品不加过氧化氢溶液的吸光值
Ao——空白组吸光值
实验结果如表1所示：
表1.羊肚菌多糖饮液对羟自由基的清除率
| 浓度(mg/ml) | 清除率1(％) | 清除率2(％) | 清除率3(％) | 平均清除率(％) |
| 0.2 | 18.31 | 18.08 | 18.15 | 18.18 |
| 0.5 | 21.92 | 20.77 | 20.38 | 21.02 |
| 1 | 33.08 | 27.31 | 28.62 | 29.67 |
| 1.5 | 54.35 | 55.38 | 56.92 | 55.55 |
| 2 | 69.24 | 65.38 | 66.92 | 67.18 |
由表1可知，当羊肚菌多糖饮液浓度为2mg/ml时，即实施例1的羊肚菌多糖饮液的浓度，其羟自由基的清除率为67.18％。
2、检测羊肚菌多糖饮液清除DPPH自由基的能力：
精确配制0.05mg/ml的DPPH溶液；
精确配制0.02mg/ml、0.08mg/ml、0.16mg/ml、0.32mg/ml、0.64mg/ml、2mg/ml的羊肚菌多糖饮液，准确移取不同浓度的样品溶液2ml，分别加入到4ml 0.05mg/ml的DPPH溶液中，室温避光反应30min，每个样品做三组平行实验。以蒸馏水调零，在517nm下测定其吸光度，DPPH自由基清除率的计算公式如下：
清除率％＝[1–(Ai–Aj)/A0]×100
Ai——加入样品后的吸光度值
Aj——为样品本身的吸光度值
Ao——为空白对照的吸光度值
实验结果如表2所示：
表2.羊肚菌多糖饮液对DPPH自由基的清除率
| 浓度(mg/ml) | 清除率1(％) | 清除率2(％) | 清除率3(％) | 平均清除率(％) |
| 0.02 | 5.90 | 6.46 | 9.07 | 7.14 |
| 0.08 | 6.80 | 12.59 | 11.45 | 10.27 |
| 0.16 | 17.46 | 18.14 | 17.12 | 17.57 |
| 0.32 | 29.02 | 30.50 | 29.02 | 29.52 |
| 0.64 | 51.13 | 48.30 | 48.98 | 49.47 |
| 2 | 94.78 | 90.70 | 99.55 | 95.01 |
由表1可知，当羊肚菌多糖饮液浓度为2mg/ml时，即为饮液的浓度，故饮液DPPH自由基的清除率为95.01％。
3、检测羊肚菌多糖饮液的还原力：
精确配制0.2mol/L、pH＝6.6的磷酸溶液、1％的铁氰化钾溶液、10％三氯乙酸溶液、0.1％的氯化铁溶液；
精确配制0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml的羊肚菌多糖饮液和Vc溶液，分别移取1ml不同浓度的多糖饮液和Vc溶液置于具塞试管中，各加入2.5ml的磷酸溶液、铁氰化钾溶液，摇匀，置于50℃中水浴30min,取出后快速冷却，随即加入三氯乙酸溶液2.5ml，混匀，加入8.5ml蒸馏水、1.7ml的氯化铁溶液，充分摇匀、以空白对照调零，反应10分钟后在700nm波长测吸光度，吸光度越大，还原力越强，每个样品做三组平行实验。实验结果如表3和表4所示：
表3.不同浓度的羊肚菌多糖饮液的吸光度
表4.不同浓度的Vc溶液的吸光度
通过表3和表4，对比不同浓度的羊肚菌多糖饮液和Vc溶液的平均吸光值可知，实施例1的羊肚菌多糖饮液的还原力相当于0.5mg/ml的Vc溶液。
本发明的提取方法更好地保留了羊肚菌多糖提取物的生物活性，故所制备的羊肚菌多糖饮液具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒、减血脂、减动脉粥样硬化等保健功效，具有很高的营养和药用价值。经试验测试该饮液清除羟自由基的清除率为67.18％，DPPH自由基的清除率为95.01％，还原力相当于0.5mg/ml的Vc溶液。此外，该饮液澄清透明，无不溶物，口感清爽微甜，适用于各个年龄段饮用，故具有非常好的市场应用前景。
以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。
Claims (10)
1.一种羊肚菌多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取羊肚菌子实体250～400重量份，在烘干设备中55℃干燥4h，用粉碎机进行粉碎处理后过80目筛；
(2)按照液料比为(18～25)：1加入蒸馏水，然后依次经过酶解、超声、灭酶、离心后取上清液，得到上清液1，备用；沉淀物依次用蒸馏水溶解、酶解、超声、灭酶、离心后取上清液，得到上清液2；将上清液2与上清夜1混合、浓缩后，用4倍体积的无水乙醇醇沉过夜、离心，取沉淀物溶解于蒸馏水，得到羊肚菌粗多糖溶液；所述酶解采用的是复合酶；
(3)将羊肚菌粗多糖溶液脱色后，加入木瓜蛋白酶进行脱蛋白、离心处理，取上清液后即得到羊肚菌多糖溶液；
(4)使用苯酚-硫酸法检测所述羊肚菌多糖溶液的羊肚菌多糖含量，使用可见分光光度计测量所述羊肚菌多糖溶液的吸光度。
2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：在容器中按(18～25)：1的料液比加入蒸馏水，然后添加质量百分比为1.0％～1.6％的复合酶，调pH为6～7，接着置于50～55℃的恒温水浴中提取1.5～2h，将酶解后的溶液转移至超声设备，超声提取10～20min，再将超声提取、灭酶后的溶液离心，取上清液，得到上清液1；将沉淀溶解，重新加入蒸馏水溶解，再加入质量百分比为1.0％～1.4％的复合酶进行酶解，调pH为6～6.5，置于50～55℃恒温水浴提取2～3h，然后转移到超声设备，超声提取20～30min，离心，取上清液，得到上清液2；将上清液1和上清液2混合，减压浓缩，加4倍无水乙醇醇沉过夜，离心，取沉淀溶于蒸馏水，得到羊肚菌粗多糖溶液。
3.根据权利要求2所述的一种羊肚菌多糖的提取方法，其特征在于：所述复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，且所述纤维素酶和木瓜蛋白酶的质量比为2：1。
4.根据权利要求2所述的一种羊肚菌多糖的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，得到上清液1的处理过程中，超声提取的功率为150～250w，得到上清液2的处理过程中，超声提取的功率为200～250w；
上清液1和上清液2的处理过程中，所述灭酶步骤的条件均为95℃处理15min，所述离心步骤的转速为4500r/min，离心时间12min；
所述无水乙醇醇沉过夜的条件为-18℃，pH为6.5。
5.根据权利要求1所述的一种羊肚菌多糖的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，添加木瓜蛋白酶的质量百分比为0.8％～1.2％，pH为5.5～6.5，脱蛋白的时间为1～2h，离心步骤的转速为4500r/min，离心时间12min。
6.一种羊肚菌多糖提取物，其特征在于：所述羊肚菌多糖提取物是采用权利要求1至5任意一项所述的提取方法制成的。
7.一种羊肚菌多糖饮液，其特征在于：所述羊肚菌多糖饮液是由以下重量份的原料制成：
羊肚菌多糖提取物20～32份
低聚果糖40～55份
三氯蔗糖1～2份
维生素C 2～4份；
所述羊肚菌多糖提取物是采用权利要求1至5任意一项所述的提取方法制成的。
8.一种羊肚菌多糖饮液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤a、制备羊肚菌多糖提取物：
采用权利要求1至5任意一项所述的提取方法得到所述羊肚菌多糖提取物；
步骤b、按重量份计，将步骤a得到的羊肚菌多糖提取物20～32份与低聚果糖40～55份、三氯蔗糖1～2份和维生素C 2～4份混合均匀制成混合液；
步骤c、将步骤b得到的混合液装瓶后灭菌，即获得所述的羊肚菌多糖饮液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤c中，灭菌条件为90℃处理20min。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述羊肚菌多糖饮液的pH为3.4±0.05，所述羊肚菌多糖饮液中羊肚菌多糖提取物的含量为2～3.2g/L。
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