CN110772468A - 一种燕麦银耳发酵产物滤液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种燕麦银耳发酵产物滤液及其制备方法。本发明以燕麦和银耳为底物，以酵母菌为菌种进行发酵；发酵液经离心、过滤除菌得一种燕麦银耳发酵产物滤液。所述方法制备的燕麦银耳发酵产物滤液富含黄酮、多酚、多肽及各种氨基酸等成分，具良好的有抗氧化、抗衰老及美白功效，且生物安全性高，可广泛应用到各类化妆品中。本发明的制备方法反应条件温和，制备工艺简单，无添加任何化学成分。

Description

一种燕麦银耳发酵产物滤液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种燕麦银耳发酵产物滤液及其制备方法。
背景技术
燕麦是一种多用途的谷物，可用于食品、饲料、医药、化妆品和工业原料等方面，这些利用主要和燕麦的化学组成有关。作为一种功能性原料，燕麦具有含量相对较高的蛋白质、不饱和脂类、维生素、抗氧化物质和酚类，以及不同类型的膳食纤维，如β-葡聚糖，阿拉巴木聚糖和纤维素等。亚油酸是世界上公认的降血脂药物的有效成分，其具有降血压、降甘油三酯的作用，可以软化毛细血管，预防血管硬化，延缓人体衰老。β-葡聚糖具有预防糖尿病、降血脂、提高免疫力、改善肠道菌群等功效。多酚类物质、植物甾醇和维生素等具有抗氧化、降血脂、抗癌、消炎等功效。
银耳又称白木耳、雪耳，是产于中国的一种经济价值高且非常珍贵的胶质食用菌。它不仅如其他山珍海味一样是餐桌上的珍品，也是我国医药学中一种久负盛名的良药。自古以来，我国医药学家都认为，银耳有“滋阴补肾，润肺止咳，和胃润肠，益气和血，补脑提神，壮体强精，嫩肤美容，年延益寿”之功效。近年来发现，银耳的主要成分是银耳多糖，其具有抗氧化、抗衰老，抗凝血、血栓，抗病毒等作用。
微生物发酵技术可将植物的养分切换成为肌肤可吸收的小分子，从而起到护肤的作用。该技术反应条件温和，设备运行操作也比较简单、安全，一般不造成环境污染。目前微生物发酵技术在护肤品应用中已得到了一定的推广，如SK-||神仙水的专利成分是Pitera即覆膜酵母发酵产物滤液，雅诗兰黛的Advanced Night Repairti添加了双歧杆菌发酵产物，倩碧的舒缓泛红防晒粉底液添加了乳酸杆菌发酵产物等等。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种燕麦银耳发酵产物滤液及其制备方法。本发明以燕麦和银耳为底物，以酵母菌为菌种进行发酵；发酵液经离心、过滤除菌得一种燕麦银耳发酵产物滤液。所述方法制备的燕麦银耳发酵产物滤液富含黄酮、多酚、多肽及各种氨基酸等成分，具良好的有抗氧化、抗衰老及美白功效，且生物安全性高(温和、天然、无刺激)，可广泛应用到各类化妆品中。
本发明的技术方案是：一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将燕麦、银耳分别粉碎、过筛，得燕麦粉和银耳粉；
(2)酵母菌菌种活化培养，得到酵母菌种子液：
(3)将培养好的酵母菌种子液接种于含有燕麦、银耳的液体发酵培养基中发酵，得到发酵液；
(4)将发酵液离心、过滤除菌即得燕麦银耳发酵产物滤液。
进一步的，所述步骤(1)的过筛为：过80目筛。
进一步的，所述步骤(2)中酵母菌菌种活化培养，其步骤如下：将酵母菌接种于装有种子培养基的三角瓶中，28～30℃，180～220r/min摇床震荡培养16-32h，得酵母菌种子液；种子培养基组分及含量：葡萄糖10～30g/l，酵母提取物5～15g/L，蛋白胨10～30g/L，115℃灭菌30min。
进一步的，所述步骤(3)中酵母菌种子液接种量(体积比)为：5％～10％。
进一步的，所述步骤(3)中发酵培养基组分及含量为：燕麦5～10g/L，银耳5～10g/L，碳源10～30g/L，115℃，灭菌30min；所述碳源优选自蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露醇或麦芽糖醇中任一种或以上混合物，优选葡萄糖。发酵培养条件为：28～30℃，180～220r/min摇床震荡培养18-38h。
进一步的，所述步骤(3)中，发酵终点为碳源含量为0。
进一步的，所述步骤(4)中，离心功率为4000～8000r/min，离心10～30min。
进一步的，所述步骤(4)中，过滤、除菌为：发酵液先后经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯进行过滤除菌。
上述方法制备的燕麦银耳发酵产物滤液，其主要功效成分及含量为：蛋白质≥600mg/100ml；粗多糖≥700mg/100ml；总氨基酸≥250mg/100ml；黄酮(芦丁计)≥320mg/100ml；总酚≥100mg/100ml。
上述方法制备的燕麦银耳发酵产物滤液具良好的有抗氧化、抗衰老(皮肤修复再生能力好、紧致抗皱)及美白功效，可以以它为有效成分制备化妆品。
本发明的有益效果是：
1、本发明利用微生物发酵技术，在同一发酵条件下对燕麦、银耳同时进行生物转化，大大提高了燕麦、银耳的资源利用率和营养附加值。相较于直提法，避免了有机溶剂和酶的添加，既安全环保，又能节约成本。
2、本发明所制备的燕麦银耳发酵产物滤液富含黄酮、多酚、多肽及各种氨基酸，能有效的促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)的分裂增殖，并促进其对Ⅰ型胶原蛋白的合成；有较好的自由基清除能力以及抑制黑色素生成的能力，因而能很好的起到抗衰老、抗氧化及美白的功效，可广泛应用到各类化妆品中。
3、本发明通过实验发现：
1)本发明制备的燕麦银耳发酵产物滤液具有清除ABTS自由基的能力，随着样品浓度的增加，其清除自由基的能越强，且20％(v/v)的燕麦银耳发酵产物滤液可清除50.14±1.30％的ABTS自由基，说明样品具有较好的抗氧化活性；
2)本发明的燕麦银耳发酵产物滤液有促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)增殖的能力，随着样品浓度的增加，NHDFs细胞的增殖能力越强，当样品浓度达到10％时，可促进NHDFs增殖能力提升至阴性对照的4.06±0.28倍；说明样品具有较好的体外皮肤修复与再生能力；
3)本发明的燕麦银耳发酵产物滤液具有一定的紧致抗皱功效，浓度为10％(V/V)的样品可促进I型胶原蛋白合成能力提升至阴性对照的6.25±0.60倍；
4)本发明的燕麦银耳发酵产物滤液具有较好的美白效果，浓度为10％(V/V)的样品可抑制40.01±2.78％的黑色素生成。
附图说明
图1：燕麦银耳发酵产物滤液对ABTS自由基的清除作用；
图2：燕麦银耳发酵产物滤液对NHDFs细胞相对增殖能力的影响；
图3：燕麦银耳发酵产物滤液对I型胶原蛋白相对含量的影响；
图4：燕麦银耳发酵产物滤液对B16-F10细胞黑素相对含量的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。下述实施例中所使用的酵母菌为酿酒酵母，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
实施例中蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖检测方法参照GB5009.8-2008；总黄酮(以芦丁计)检测方法参照DB13T385-1988；多酚检测方法参照GB/T 8313-2008；氨基酸检测方法参照GB/T 5009.124-2003。
实施例1：燕麦银耳发酵产物滤液制备
采用如下方法制备得到燕麦银耳发酵产物滤液：
(1)粉碎过筛：将燕麦和银耳分别粉碎，过80目筛，得燕麦粉和银耳粉；
(2)酵母菌菌种活化培养：将酵母菌菌种接种于装有种子培养基的三角瓶中，30℃，200r/min摇床震荡培养18h，得酵母菌种子液；
种子培养基组分及含量：葡萄糖20g/l，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，115℃灭菌30min；
(3)将培养好的酵母菌种子液以体积百分比10％的接种量，接种于发酵培养基中，30℃，220r/min摇床震荡培养20-24h；待葡萄糖含量为0，发酵结束。
发酵培养基组分及含量为：燕麦10g/L，银耳5g/L，葡萄糖20g/L，115℃，灭菌30min；
(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心，8000r/min，离心20min，除残渣收集上清；然后经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即得燕麦银耳发酵产物滤液。
对上述燕麦银耳发酵产物滤液中的主要功效成分及含量进行检测，其结果如表1所示。
表1主要功效成分及含量
名称 含量(mg/100ml)
蛋白质 625
粗多糖 713
总氨基酸 289
黄酮(芦丁计) 350
总酚 127
实施例2：燕麦银耳发酵产物滤液制备
采用如下方法制备得到燕麦银耳发酵产物滤液：
(1)粉碎过筛：将燕麦和银耳分别粉碎，过80目筛，得燕麦粉和银耳粉；
(2)酵母菌菌种活化培养：将酵母菌菌种接种于装有种子培养基的三角瓶中，30℃，180r/min摇床震荡培养18h，得酵母菌种子液；
种子培养基组分及含量：葡萄糖25g/l，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，115℃灭菌30min；
(3)将培养好的酵母菌种子液以体积百分比8％的接种量，接种于发酵培养基中，30℃，200r/min摇床震荡培养24-28h；待葡萄糖含量为0，发酵结束。
发酵培养基组分及含量为：燕麦5g/L，银耳5g/L，葡萄糖20g/L，115℃，灭菌30min；
(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心，5000r/min，离心30min，除残渣收集上清；然后经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即得燕麦银耳发酵产物滤液。
实施例3：燕麦银耳发酵产物滤液制备
采用如下方法制备得到燕麦银耳发酵产物滤液：
(1)粉碎过筛：将燕麦和银耳分别粉碎，过80目筛，得燕麦粉和银耳粉；
(2)酵母菌菌种活化培养：将酵母菌菌种接种于装有种子培养基的三角瓶中，30℃，220r/min摇床震荡培养20h，得酵母菌种子液；
种子培养基组分及含量：葡萄糖20g/l，酵母提取物10g/L，蛋白胨18g/L，115℃灭菌30min；
(3)将培养好的酵母菌种子液以体积百分比10％的接种量，接种于发酵培养基中，30℃，220r/min摇床震荡培养26-30h；待葡萄糖含量为0，发酵结束。
发酵培养基组分及含量为：燕麦10g/L，银耳5g/L，葡萄糖25g/L，115℃，灭菌30min；
(4)将步骤(3)中得到的发酵液离心，6000r/min，离心25min，除残渣收集上清；然后经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即得燕麦银耳发酵产物滤液。
试验例1：燕麦银耳发酵产物滤液抗氧化功效评价
本实施例旨在对实施例1中制备的燕麦银耳发酵产物滤液进行抗氧化功效评价。
总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)检测样品对各种活性氧(羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢等)的清除能力。
将样品(燕麦银耳发酵产物滤液)配制成相应浓度(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00％(v/v))的待测液，在96孔板中按照表2中各试剂添加量配制反应体系，混匀，每个浓度设置3个复孔，1个背景对照孔。
表2 ABTS自由基清除试验反应体系
室温孵育2-6min后，于734nm下读取吸光度OD值，计算样品对ABTS自由基的清除率。
清除率计算方法：
Figure BDA0002314530770000052
式中：C1——空白有ABTS体系吸光度值；
C2——空白无ABTS体系吸光度值；
T1——样品组有ABTS体系吸光度值；
T2——样品组无ABTS体系吸光度值。
检测结果如表3所示，样品(燕麦银耳发酵产物滤液)具有清除ABTS自由基的能力，随着样品浓度的增加，其清除自由基的能越强，且20％(v/v)的燕麦银耳发酵产物滤液可清除50.14±1.30％的ABTS自由基，说明样品具有较好的抗氧化活性(见附图1)。
表3 ABTS自由基清除试验结果分析(Mean±SD)
试验例2：燕麦银耳发酵产物滤液抗衰老功效评价
本实施例旨在对实施例1中制备的燕麦银耳发酵产物滤液进行抗衰老功效评价。
1、体外皮肤修复与再生功效评估(NHDFs细胞增殖能力)
BrdU法检测人皮肤成纤维细胞(NHDFs)相对增殖能力。
收集对数生长期细胞，按照细胞密度为6×103个/孔接种至96孔板，每孔含培养液100μl。在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，样品由低到高分别设定0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00％(v/v)7个给药浓度，以1％FBS作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，每组设置4个重复孔。
加药后在培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养48h，然后进行BrdU试验，以不做BrdU处理作为背景对照，每个浓度设置1个背景对照，以BrdU处理不含细胞的微孔作为空白对照，于450/690nm下读取吸光度OD值，空白对照平均OD值应小于0.1。按照以下公式计算细胞相对增殖能力。
Figure BDA0002314530770000062
检测结果如表4所示，样品具有促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)增殖的能力。与阴性对照比较，当样品浓度在0.3％左右时，就能明显促进NHDFs细胞的增殖，随着样品浓度的增加，NHDFs细胞的增殖能力越强，当样品浓度达到10％时，可促进NHDFs增殖能力提升至阴性对照的4.06±0.28倍(见附图2)。
表4细胞增殖检测结果分析(作用48h)
Figure BDA0002314530770000063
Figure BDA0002314530770000071
2、体外紧致抗皱功效评估(胶原蛋白I含量)
ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白含量。
收集对数生长期人皮肤成纤维细胞(NHDFs)，按照细胞密度为6×104个/孔接种至12孔板。在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，根据细胞毒性结果，按照10％(v/v)浓度加入样品，以50μg/ml抗坏血酸(VC)作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，以反应体系试剂及溶剂作为溶剂对照，每组设置4个重复孔。
加药后在培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养48h，收集培养液。采用Col I ELISA试剂盒进行培养液中Ⅰ型胶原蛋白含量的检测，计算Ⅰ型胶原蛋白相对溶剂对照的相对含量。
检测结果如表5所示，基于促人皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白合成试验结果，样品具有一定的紧致抗皱功效，浓度为10％(V/V)的样品可促进I型胶原蛋白合成能力提升至阴性对照的6.25±0.60倍，明显高于阳性对照组(见附图3)。
表5 I型胶原蛋白相对含量结果分析(Mean±SD)
浓度(％，V/V) I型胶原蛋白相对含量
阴性对照 1.00±0.11
阳性对照 2.96±0.20
10 6.25±0.60
试验例3：燕麦银耳发酵产物滤液美白功效评价
本实施例旨在对实施例1中制备的燕麦银耳发酵产物滤液进行美白功效评价。
收集对数生长期小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)，按照细胞密度为8×105个/瓶接种至T25细胞培养瓶。在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，根据细胞毒性结果，加入浓度10％(v/v)的样品，1％抗坏血酸葡糖苷(AA2G)作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，每组设置3个平行。
加药后在培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养48h，用0.25％胰酶消化收集细胞并计数，取相等数量的细胞离心后，弃去上清，加入0.5ml含10％DMSO的1M NaOH，放入80℃水浴30min，离心后取上清液加入96孔板，以含10％DMSO的1M NaOH作为空白对照，于475nm下读取吸光度值并计算细胞黑素相对含量。
Figure BDA0002314530770000081
检测结果如表6所示，基于黑色素合成抑制实验结果，样品具有较好的美白效果，浓度为10％(V/V)的样品可抑制40.01±2.78％的黑色素生成(见附图4)。
表6相对黑色素含量结果分析(Mean±SD)
浓度(％，V/V) 黑色素相对抑制率％
阴性对照 0.00±1.95
阳性对照 45.71±0.14
10 40.01±2.78

Claims (10)

1.一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将燕麦、银耳分别粉碎、过筛，得燕麦粉和银耳粉；
(2)酵母菌菌种活化培养，得到酵母菌种子液：
(3)将培养好的酵母菌种子液接种于含有燕麦、银耳的液体发酵培养基中发酵，得到发酵液；
(4)将发酵液离心、过滤除菌，即得燕麦银耳发酵产物滤液。
2.如权利要求1所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，
所述步骤(3)中发酵培养基组分及含量为：燕麦5～10g/L，银耳5～10g/L，碳源10～30g/L；
所述碳源优选自蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露醇或麦芽糖醇中任一种或以上混合物；
发酵培养条件为：28～30℃，震荡培养18-38h。
3.如权利要求1所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，所述步骤(2)中酵母菌菌种活化培养，其步骤如下：将酵母菌接种于种子培养基中，28～30℃，180～220r/min摇床震荡培养16-32h，得酵母菌种子液。
4.如权利要求3所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，所述步骤(2)种子培养基组分及含量：葡萄糖10～30g/l，酵母提取物5～15g/L，蛋白胨10～30g/L。
5.如权利要求1所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，所述步骤(3)中酵母菌种子液接种量，按体积比计为：5％～10％。
6.如权利要求1所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的过筛为：过80目筛。
7.如权利要求1所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，所述步骤(4)中离心，离心功率为4000～8000r/min，离心10～30min。
8.如权利要求1所述的一种燕麦银耳发酵产物滤液的制备方法，其特征是，所述步骤(4)中，过滤、除菌为：发酵液先后经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯进行过滤除菌。
9.权利要求1-8中任意一项所述方法制备的燕麦银耳发酵产物滤液。
10.权利要求9所述的燕麦银耳发酵产物滤液在制备具有抗氧化、抗衰老及美白功效的化妆品中的应用。
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