CN105002254A

CN105002254A - 一种银耳发酵提取物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN105002254A
Application number: CN201510388359.5A
Authority: CN
Inventors: 王昌涛; 李萌; 段超; 赵丹; 张佳婵
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: SHANGHAI BIOTRULY BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: CN105002254B

Abstract

本发明公开了一种银耳发酵提取物的制备方法及其应用。本发明银耳发酵提取物的制备方法，包括如下步骤：用菌种或其培养液或其悬浮液发酵培养银耳，得到发酵产物，即为银耳发酵提取物。所述菌种为如下至少一种：鲁氏结合酵母、巴氏酵母、酿酒酵母、葡萄酒酵母、木醋杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、乳酸乳球菌和粪肠球菌。通过实验证明：本发明制备的银耳发酵提取物不含任何化学成分，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；而且比普通提取方法获得更小的成分，更易让皮肤充分吸收。

Description

一种银耳发酵提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种银耳发酵提取物的制备方法及其应用。

背景技术

银耳，又名白木耳、雪耳，营养丰富，食味鲜美，不但是营养价值很高食用菌，也是药用价值较高药用菌，是世界公认保健品。银耳内含有碳水化合物、蛋白质、多糖、维生素和多种氨基酸等，是滋补强壮、扶正固本的良药。我国银耳资源丰富，为开发应用银耳提供有利条件。随着银耳栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对银耳营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。对银耳活性物质的提取工艺也不断完善，但是提取方法主要以浸提法为主。

银耳提取物在美容护肤中的应用已经有了很多，银耳对于皮肤的功效主要是抗衰老、保湿补水等方面。但由于银耳提取物的成本限制，在护肤品中的添加量很低，仅为0.2﹪～2﹪，因此在护肤品中能起到的作用微乎其微，而主要依靠其它成分的原料起主导作用，使得这种产品的生产成本比较高，效果并不尽然，没有充分发挥银耳提取液所起到的作用。究其原因，除了制作工艺复杂、生产成本的因素外，主要是还没有对银耳发酵物提取液在护理人体肌肤上所产生的作用和机理具有充分的认识。

发酵技术在护肤品中应用已有大量报道，最著名的例子就是SKII的神仙水，专利成分Pitera(覆膜酵母菌发酵产物滤液)，利用一种特殊的天然酵母“Saccharomycopsis”发酵后提炼出的成分，含有健康皮肤不可或缺的氨基酸、矿物质、有机酸、无机酸等自然成分。即使是SKII的神仙水，专利成分Pitera在产品中也只是作为一种功效性成分加入其中，产品中还含有其它大量化学成分。化妆品中一般添加的化学成分有：硅油、增稠剂、pH调节剂、乳化剂、香精、抗氧化剂、色素等，这些成分对皮肤并没有实际功效，反而会增加潜在的皮肤刺激性。

目前较为常用的提取方法为热水浸提法、酸提取法、碱提取法、酶提取法，而使用微生物发酵法提取银耳活性物还未见报道。微生物法又可称为发酵法，是以细菌、霉菌等微生物为体系对外源底物进行结构修饰的化学反应，微生物转化不需要添加其它的催化剂，只需先培养出大量的微生物菌种，然后加入底物进行能实现的反应，所以微生物法比化学试剂的反应法更专一、更有效；反应条件温和，微生物发酵一般都是在常温和pH为7左右的条件下进行催化反应，不需要高温、高压等苛刻的条件；设备的运行操作也比较简单、安全，产生的公害较少，一般不会造成环境污染，后处理也相对简单；筛选不同的菌种与优化反应条件可提高转化率，对同一底物进行微生物转化的菌种可能有多种，通过筛选选出最佳菌种，可以保证较高的转化率。当今国内外许多研究者采用生物法生产多糖，即微生物法、酶法、植物细胞组织培养等多种生物转化法结合，已经呈现出明显优势。因为绝大多数的发酵过程所需条件非常温和，而且反应产物单纯和能耗少，是一个与环境友善的绿色化学过程。随着基因工程、细胞工程、酶工程技术的不断发展和完善，微生物发酵技术有了突飞猛进的发展，在天然活性物质的研究开发中发挥着越来越重要的作用。

现有的银耳活性物提取最常采用的是水提法：银耳干品粉碎后加去离子水，调pH后搅拌浸提一段时间，离心后取上清液浓缩，最后使用乙醇沉淀，干燥后粉碎得到产物。但是该方法在提取过程中引入有机物，不仅破坏环境，且在应用的过程中存在潜在的安全隐患。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种银耳发酵提取物的制备方法。

本发明提供的银耳发酵提取物的制备方法包括如下步骤：用菌种或其培养液或其悬浮液发酵培养银耳，得到发酵产物，即为银耳发酵提取物；

所述菌种为如下至少一种：鲁氏结合酵母Zygosaccharomyces rouxii、巴氏酵母Saccharomyces pastorianus、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、葡萄酒酵母Saccharomyces ellipsoideus、木醋杆菌Acetobacter xylinus、德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii bulgaricus、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、乳酸乳球菌Lactococus lactis和粪肠球菌Enterococcusfaecalis。

上述方法中，所述菌种培养液中的菌种总量和银耳的配比为10⁶-10⁹CFU：5-10g。

上述方法中，所述菌种培养液为如下1)-3)中任一种：

1)含有酿酒酵母和嗜热链球菌的培养液；

2)含有德氏乳杆菌和鲁氏结合酵母的培养液；

3)含有两歧双歧杆菌和乳酸乳球菌的培养液。

上述方法中，所述酿酒酵母和所述嗜热链球菌的菌落形成单位比为1：1；

所述德氏乳杆菌和所述鲁氏结合酵母的菌落形成单位比为1：1；

所述两歧双歧杆菌和所述乳酸乳球菌的菌落形成单位比为1：1。

上述方法中，所述发酵培养的时间为24-72h；所述发酵培养的温度35-45℃；所述菌种培养液的PH值为6.5-7.5。

上述方法中，所述方法中在得到发酵产物后还包括如下步骤：将所述发酵液离心，取上清液，为银耳发酵提取物。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的银耳发酵提取物。

本发明的最后一个目的是提供一种用于保湿的产品。

本发明提供的用于保湿的产品的活性成分为上述银耳发酵提取物。

上述产品中，所述产品为化妆品，具体为面膜或精华液或爽肤水。

上述方法或上述银耳发酵提取物或上述产品在提高皮肤含水量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述方法或上述银耳发酵提取物或上述产品在制备提高皮肤含水量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述方法或上述银耳发酵提取物或上述产品在皮肤保湿中的应用也属于本发明的保护范围。

上述方法或上述银耳发酵提取物或上述产品在制备具有皮肤保湿功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述方法或上述银耳发酵提取物或上述产品在作为化妆品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述化妆品具体为面膜或精华液或爽肤水。

本发明提供了一种银耳发酵物的提取方法，该方法选择更加合适的菌种，使产品更加天然，且不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。通过实验证明：本发明制备的银耳发酵提取物不含任何化学成分，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；而且比普通提取方法获得更小的成分，更易让皮肤充分吸收。

附图说明

图1为实施例1的实验组1得到的银耳发酵提取物的保湿补水检测结果。

图2为实施例2的实验组2得到的银耳发酵提取物的保湿补水检测结果。

图3为实施例3的实验组3得到的银耳发酵提取物的保湿补水检测结果。

图4为实施例1的实验组1得到的银耳发酵提取物的活性多肽分子量分布HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH值为7.0。

下述实施例中的YPD培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：酵母提取物1％(质量分数)，胰蛋白胨2％(质量分数)，葡萄糖2％(质量分数)，PH值为7.0。

下述实施例中的银耳是中国同仁堂有限责任公司的产品，下述实施例中的银耳粉是将银耳粉碎成粉得到的。

下述实施例中的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的ATCC编号为26603，公众可从北京工商大学获得，也可从ATCC获得。

下述实施例中的嗜热链球菌Streptococcus thermophilus的ATCC编号为19258，公众可从北京工商大学获得，也可从ATCC获得。

下述实施例中的德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii bulgaricus的ATCC编号为11842，公众可从北京工商大学获得，也可从ATCC获得。

下述实施例中的鲁氏结合酵母Zygosaccharomyces rouxii的ATCC编号为13356，公众可从北京工商大学获得，也可从ATCC获得。

下述实施例中的两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum的ATCC编号为29521，公众可从北京工商大学获得，也可从ATCC获得。

下述实施例中的乳酸乳球菌Lactococus lactis的ATCC编号为19435，公众可从北京工商大学获得，也可从ATCC获得。

实施例1、一种银耳发酵提取物的制备方法

一、实验组1

1、菌种的活化

挑取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌落各一环分别放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，分别得到活化后的酿酒酵母和活化后的嗜热链球菌，将活化后的酿酒酵母和活化后的嗜热链球菌混匀，得到活化后的2种菌液。

2、菌种的纯化

将步骤1得到的活化后的2种菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后的2种菌种。

3、菌种的扩大培养

将步骤2得到的纯化后的2种菌种接种到YPD培养基(PH值为7.0)中，在25℃的摇床中培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为1×10⁸CFU/ml)，发酵菌菌液含有酿酒酵母与嗜热链球菌(酿酒酵母的浓度为1×10⁶CFU/ml；嗜热链球菌的浓度为1×10⁶CFU/ml)。

4、银耳发酵提取物的获得

将20mL步骤3得到的发酵菌菌液接种到50目10g的银耳粉和500g的水中，得到发酵体系(发酵体系中菌种总量和银耳的配比为1×10⁸CFU：10g)；将发酵体系在35℃摇床中发酵24小时，得到发酵产物；将发酵产物115℃高压灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在4000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即为银耳发酵提取物。

下述实施例进一步研究银耳发酵提取物在直接作为面膜或精华液或爽肤水中的应用。

二、实验组2

1、菌种的活化

挑取德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)与鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)菌落各一环分别放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，分别得到活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和活化后的鲁氏结合酵母，将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和活化后的鲁氏结合酵母混匀，得到活化后的2种菌种。

2、菌种的纯化

将步骤1得到的活化后的2种菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后的2种菌种。

3、菌种的扩大培养

将步骤2得到的纯化后的2种菌种接种到YPD培养基(PH值为7.0)中，在32℃的摇床中培养，当OD值＝0.5时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为1×10⁸CFU/ml)；发酵菌菌液含有德氏乳杆菌与鲁氏结合酵母(德氏乳杆菌的浓度为1×10⁶CFU/ml；鲁氏结合酵母的浓度为1×10⁶CFU/ml)。

4、银耳发酵提取物的获得

将20mL步骤3得到的发酵菌菌液接种到50目10g的银耳粉和500g的水中，得到发酵体系(发酵体系中菌种总量和银耳的配比为1×10⁸CFU：10g)；将发酵体系在40℃摇床中发酵48小时，得到发酵产物；将发酵产物115℃高压灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在4000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即为银耳发酵提取物。

三、实验组3

1、菌种的活化

挑取两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)与乳酸乳球菌(Lactococus lactis)菌落各一环分别放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，分别得到活化后的两歧双歧杆菌和活化后的乳酸乳球菌，将活化后的两歧双歧杆菌和活化后的乳酸乳球菌混匀，得到活化后的2种菌种。

2、菌种的纯化

将步骤1得到的活化后的2种菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后的菌种。

3、菌种的扩大培养

将步骤2得到的纯化后的2种菌种接种到YPD培养基(PH值为7.0)中，在28℃的摇床中培养，当OD值＝0.75时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为1×10⁸CFU/ml)；发酵菌菌液含有两歧双歧杆菌与乳酸乳球菌(两歧双歧杆菌的浓度为1×10⁶CFU/ml；乳酸乳球菌的浓度为1×10⁶CFU/ml)。

4、银耳发酵提取物的获得

将20mL步骤3得到的发酵菌菌液接种到50目10g的银耳粉和500g的水中，得到发酵体系(发酵体系中菌种总量和银耳的配比为1×10⁸CFU：10g)；将发酵体系在45℃摇床中发酵72小时，得到发酵产物；将发酵产物115℃高压灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在4000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即为银耳发酵提取物。

实施例2、银耳发酵提取物在作为化妆品中的应用

一、银耳发酵提取物的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1中三个实验组获得的银耳发酵提取物进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法

称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

3、试验结果

斑贴试验结果如表1-表3所示：*"-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。从表中可以看出：实施例1的实验组1得到的银耳发酵提取物均未产生可疑反应，实施例1的实验组2和实验组3得到的银耳发酵提取物在试验中均仅产生1例可疑反应。说明本发明提供的三种银耳发酵物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。

表1、实施例1获得的银耳发酵提取物的斑贴试验结果

表2、实施例2获得的银耳发酵提取物的斑贴试验结果

表3、实施例3获得的银耳发酵提取物的斑贴试验结果

二、银耳发酵提取物的分子量大小检测

分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(HPLC)测定实施例1制备的银耳发酵提取物的分子量大小。具体步骤如下：

1、试验的试剂和溶液的制备

(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝30：70：0.1(v/v/v)。

(2)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样。

(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(Mr 67000)、B12(Mr 1335)、氧化型谷胱甘肽(Mr 614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/ml。

2、试验方法

将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(Mw67000)，维生素B₁₂(Mw1335)和氧化型谷胱甘肽(Mw614)通过高效液相色谱仪(Waters公司)参照文献“王成忠等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012:37(2)”中的方法进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中的实验组1、实验组2、和实验组3制备的银耳发酵提取物进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的银耳发酵提取物的分子量大小。

色谱条件：色谱柱：TsK gel 2000SWXL 300mm×7.8mm；检测波长：UV 280nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。

3、试验结果

标准物质的分子量与洗脱时间的如表4所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图得到标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，R²＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。

表4、标准物质的分子量与洗脱时间

实验组1制备的银耳发酵提取物的HPLC图谱如图4所示：从图中可以看出，银耳发酵提取物的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11.51min，将洗脱时间代入标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，计算出峰的分子量为304.53Da，并且根据峰面积计算银耳发酵提取物占100％。一般认为分子量500Da左右活性肽成分更易被皮肤吸收，所以银耳发酵物中存在容易被吸收的活性多肽。

实验组2和实验组3制备的银耳发酵提取物的HPLC结果和实验组1制备的银耳发酵提取物的HPLC结果无显著性差异。

三、银耳发酵提取物的保湿性能检测

将实施例1制备的银耳发酵提取物作为面膜或精华液或爽肤水等化妆品直接对皮肤进行涂抹，并通过皮肤含水量测试试验对其保湿性能进行检测，具体步骤如下：

1、试验对象

随机选取24名健康的志愿受试者，所有受试者均无任何皮肤和系统性疾患史。且受试部位(前臂内侧)的皮肤无异常，也不涂抹任何外用药物和化妆品等其他外用制剂。

2、试验方法

将测试物(实施例1的实验组、实验组2和实验组3获得的银耳发酵提取物)对受试者的前臂内侧的皮肤进行涂抹(涂抹的量为0.08-0.1ml)，并以蒸馏水为对照。

在涂抹后的0h、0.5h、1h后使用仪器为Corneometer CM-825测量受试部位的皮肤含水量，测量结果通过设定的湿度测量值(Moisture Measurement Val ue，MMV)来表示，MMV为0～150的数值。整个研究是在室内温度为22℃～24℃，湿度为50％～60％的良好皮肤非创伤性检查实验室内进行。

3、试验结果

测量结果如图1-图3所示：图1中的案例1银耳发酵物为实施例1的实验组1制备得到的银耳发酵提取物，图2中的案例2银耳发酵物为实施例1的实验组2制备得到的银耳发酵提取物，图3中的案例3银耳发酵物为实施例1的实验组3制备得到的银耳发酵提取物。从图中可以看出，和对照相比，受试者在涂抹实施例1的实验组1、实验组2和实验组3获得的银耳发酵提取物后，皮肤含水量均明显提高，且在涂抹1小时后仍有很高的保湿功能。说明本发明的银耳发酵提取物具有很好的保湿功能，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水等化妆品用于提高皮肤的含水量。

Claims

1.一种银耳发酵提取物的制备方法，包括如下步骤：用菌种或其培养液或其悬浮液发酵培养银耳，得到发酵产物，即为银耳发酵提取物；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌种培养液中的菌种总量和银耳的配比为10⁶-10⁹CFU：5-10g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述菌种培养液为如下1)-3)中任一种：

1)含有酿酒酵母和嗜热链球菌的培养液；

2)含有德氏乳杆菌和鲁氏结合酵母的培养液；

3)含有两歧双歧杆菌和乳酸乳球菌的培养液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酿酒酵母和所述嗜热链球菌的菌落形成单位比为1：1；

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的时间为24-72h；所述发酵培养的温度35-45℃；所述菌种培养液的PH值为6.5-7.5。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中在得到发酵产物后还包括如下步骤：将所述发酵产物离心，取上清液，得到银耳发酵提取物。

7.权利要求1-6中任一所述的方法制备得到的银耳发酵提取物。

8.一种用于保湿的产品，其活性成分为权利要求7所述的银耳发酵提取物。

9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述产品为化妆品，具体为面膜或精华液或爽肤水。

10.权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7所述的银耳发酵提取物或权利要求8或9所述的产品在提高皮肤含水量中的应用；

或权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7所述的银耳发酵提取物或权利要求8或9所述的产品在制备提高皮肤含水量的产品中的应用；

或权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7所述的银耳发酵提取物或权利要求8或9所述的产品在皮肤保湿中的应用；

或权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7所述的银耳发酵提取物或权利要求8或9所述的产品在制备具有皮肤保湿功能的产品中的应用；

或权利要求7所述的银耳发酵提取物或权利要求8或9所述的产品在作为化妆品中的应用；所述化妆品具体为面膜或精华液或爽肤水。