CN112545928A - 一种银耳复合提取物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银耳复合提取物及其制备方法与应用。该方法是以银耳粉和水为原料，通过高温提取、H2O2氧化降解、微生物发酵和醇沉降，得到银耳复合提取物，再将该银耳复合提取物复溶制作成银耳多糖面膜液。所述的微生物为酵母菌和乳杆菌混合得到的菌种。本发明制备的银耳复合提取物面膜液可以用作面膜基液，所有原料均为化妆品允许添加产品，且不仅改善了单独高、低分子量银耳多糖补水保湿功效的弱点，且可以有效刺激皮肤细胞分泌透明质酸，增强谷胱甘肽在皮肤细胞中的抗氧化能力，保证谷胱甘肽活性的稳定，更有利于维持人体皮肤的正常功能。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及一种银耳复合提取物及其制备方法与应用。
背景技术
银耳多糖是一种酸性杂多糖，一般都以α-1,3-甘露聚糖为主链，侧链多为岩藻糖、甘露糖以及糖醛酸组成。银耳多糖的粘度较高，相对分子质量较大，而且具有良好的吸水性。具有抗氧化、提高免疫力、降低血糖血脂等多种生物活性。
现在市售保湿类化妆品中多数都添加银耳多糖作为功能成分，但银耳多糖的高分子量和高粘度特征使得其不能在化妆品中添加量不能过高，限制其使用。近些年，很多企业和学者也研究了将银耳多糖降低分子量的方法，如申请号为201610693617.5(名称为：一种低分子量银耳多糖及其制备方法与应用)的发明专利申请公开了利用酶法降解得到了一种分子量在10kDa以下的银耳多糖，提高了透皮性；申请号为201710760049.0(名称为一种低分子量银耳多糖的生产方法)的发明专利申请公开了利用盐酸水解制备得到了低于100kDa的银耳多糖；王昌涛等人利用多菌种一步发酵法制备小分子量的银耳多糖提取物，等等。银耳多糖的分子量变小，透皮性能增强。但是，降解得到的小分子量的多糖也存在一些弊端，由于空间结构被破坏，保湿性能会随之下降。所以，单独使用低分子量的银耳多糖效果依旧差强人意。
另外，多糖类物质在化妆品中虽然作为成膜剂和保湿剂使用，也具有一定的抗氧化效果，根据文献及专利报道，随着高分子量银耳多糖被降解，抗氧化效果会有提升，但银耳多糖与其他天然抗氧化剂相比效果不佳。天然抗氧化剂又有化学性质不稳定的情况，因此可以研究利用多糖增效其他抗氧化成分效果或者维持其抗氧化成分稳定性。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种银耳复合提取物的制备方法。以银耳为原料，通过水提、H2O2降解、透析、发酵和乙醇沉降步骤得到银耳复合提取物(主要成分为银耳多糖)。
本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种银耳复合提取物。
本发明的再一目的在于提供上述一种银耳复合提取物在化妆品和/或护肤品中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种银耳复合提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将银耳加入水中，80～100℃加热提取3～6h，然后浓缩至含多糖的质量分数为0.8～1.2％，得到银耳提取液；
(2)往步骤(1)的银耳提取液中加入H2O2，其中H2O2与银耳提取液的比例为1.5～2.0ml：100g，在45～65℃下反应60～90min，调节pH至中性以终止反应，透析，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅰ，其中含银耳粗多糖Ⅰ；
(3)降温至25～37℃，往步骤(2)的银耳复合提取物浓缩液Ⅰ中加入碳源和菌种，发酵12～18h，离心，取上清液，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅱ，其中菌种为酵母菌和乳杆菌混合得到的菌种，碳源为葡萄糖和/或蔗糖；
(4)往步骤(3)的银耳复合提取物浓缩液Ⅱ中加入乙醇，静置沉降18～24h，过滤，取沉降物，干燥，得到银耳粗多糖Ⅱ，即为银耳复合提取物。
步骤(1)所述银耳为80～100目的银耳粉末。
步骤(1)所述银耳与水的料液比为1：(50～100)，优选为1：75。
步骤(1)所述加热提取的温度为100℃，时间为4h。
步骤(2)所述H2O2以H2O2水溶液的形式加入，其体积浓度为20～40％。
步骤(2)所述反应温度为45～60℃。
步骤(2)所述调节pH所用的pH调节剂为NaOH溶液，其浓度为0.01～0.1mol/L。
步骤(2)所述透析所用的透析液为水，透析袋的截留分子量为2～4kDa，透析时间为12～36h。
步骤(2)所述银耳粗多糖Ⅰ的分子量为2000～2200kDa。
步骤(3)所述碳源的加入量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.3～1％。
步骤(3)所述菌种的接种量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.1～1.0％，优选为0.5％。
步骤(3)所述酵母菌为酿酒酵母GIM2.207，乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种GIM1.380和干酪乳杆菌GIM1.410中的至少一种。
步骤(3)所述菌种为酵母菌和乳杆菌按照质量比为1：2混合得到的菌种；优选为酿酒酵母GIM2.207、植物乳杆菌植物亚种GIM1.380和干酪乳杆菌GIM1.410按照质量比1：1：1混合得到的菌种。
步骤(3)所述发酵的温度为30℃，时间为12h。
步骤(3)所述离心的条件为：在4000～6000r/min下离心20～30min。
步骤(4)所述银耳复合提取物浓缩液Ⅱ和乙醇的体积比为1：(3～4)。
步骤(4)所述干燥的温度不高于45℃，干燥的时间为1.5～3h。
步骤(4)所述银耳粗多糖Ⅱ的分子量为24.1～60.2kDa。
一种银耳复合提取物，通过上述方法制备得到。
所述银耳复合提取物的分子量为24.1～60.2kDa。
上述一种银耳复合提取物在化妆品和/或护肤品中的应用。
所述银耳复合提取物作为面膜液的基液在制备面膜中的应用。
通过上述方法制备的银耳复合提取物面膜液具有良好的补水保湿效果，增效谷胱甘肽的抗氧化性以及保持其稳定性，可以促进皮肤细胞分泌透明质酸。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明通过过氧化氢降解、微生物发酵制备出银耳复合提取物后，其中的银耳多糖分子量降低，同时增加其他功效成分。所用原料均符合化妆品原料的使用标准，通过发酵的方法使的银耳复合提取物补水保湿效果得到双重提升，解决了现有技术中降解小分子量银耳多糖导致化妆品补水保湿效果的不均衡的问题。
(2)本发明制得的银耳复合提取物能够更有效地刺激皮肤细胞产生透明质酸，同时增强谷胱甘肽对皮肤细胞抗氧化的能力，以及维持谷胱甘肽的性质稳定，更有利于维持人体皮肤的正常功能。
(4)本发明所述方法中，提取、纯化、发酵过程均无使用有毒有害的有机试剂和添加剂，避免了对人体的影响，且操作步骤简单，对设备要求低，便于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1～3和对比例1～2制得银耳多糖面膜液的吸湿性能。
图2为实施例1～3和对比例1～2制得银耳多糖面膜液的保湿性能。
图3为实施例1～3和对比例1～3制得银耳多糖面膜液对HFF-1透明质酸分泌的影响。
图4为实施例1～3和对比例1～3制得银耳多糖面膜液对HFF-1中SOD活性的影响。
图5为实施例1～3和对比例1～3制得银耳多糖面膜液对HFF-1中MDA含量的影响。
图6为实施例1～3和对比例1～3制得银耳多糖面膜液对谷胱甘肽生物活性稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例中GPC的测定条件为本实验采用美国Water公司的高效凝胶渗透色谱法测定银耳多糖的分子量分布，色谱条件为Ultrahydrigel 250column(7.8×300mm)、Ultrahydrigel 500column(7.8×300mm)和Ultrahydrigel 1000column(7.8×300mm)串联，流动相为0.02mol/L的KH2PO4缓冲溶液，流速为0.8mL/min，waters 2414示差检测器，柱温35℃，测量时间为60min。
本发明实施例中所涉及的酵母菌(即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)均购买自广东省菌种保藏中心，其编号分别为：酿酒酵母(GIM2.207)，植物乳杆菌植物亚种(GIM1.380)，干酪乳杆菌(GIM1.410)。
本申请实施例中所述稀碱液均指浓度为0.05mol/L的NaOH溶液，所述干燥的温度为40℃，时间为2h；所述过氧化氢溶液的体积浓度为30％，溶剂为水。
实施例1
将1000g水和20g银耳粉加入罐中，95℃加热提取4.5h，得到银耳提取液。浓缩银耳提取液至其中多糖质量含量为1％，加入过氧化氢溶液，其中过氧化氢溶液的加入量与浓缩后银耳提取液的比例为5ml：100g，升温至45℃，降解60min，加稀碱液中和至中性，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅰ，降温到30℃，加入葡萄糖，其中葡萄糖的加入量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.5％，接种0.5％(w/w)混合菌种(其中含有酵母菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，比例为1:1:1)发酵12h，4000r/min离心25min，除去沉淀和菌种，取上清液，得到银耳提复合取物浓缩液Ⅱ。向银耳复合提取物浓缩液Ⅱ中加入3倍体积的乙醇，静置沉降18h，过滤，得到的沉淀烘干后得到银耳粗多糖Ⅱ。将银耳粗多糖Ⅱ加水复溶成浓度为1mg/mL的银耳粗多糖Ⅱ水溶液，即制得银耳复合提取物面膜液1。
实施例2
将1000g水和15g银耳粉加入罐中，100℃加热提取6h，得到银耳提取液。浓缩银耳提取液至其中多糖质量分数为1％，加入过氧化氢溶液，其中过氧化氢溶液的加入量与浓缩后银耳提取液的比例为6.5ml：100g，升温至60℃，降解90min，加稀碱液中和至中性，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅰ，降温到30℃，加入葡萄糖，其中葡萄糖的加入量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.5％，接种0.5％(w/w)混合菌种(其中含有酵母菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，比例为1:1:1)发酵18h，5000r/min离心20min，除去沉淀和菌种，取上清液，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅱ。向银耳复合提取物浓缩液Ⅱ中加入3倍体积的乙醇，静置沉降18h，过滤，得到的沉淀烘干后得到银耳粗多糖Ⅱ。将银耳粗多糖Ⅱ加水复溶成浓度为1mg/mL的银耳粗多糖Ⅱ水溶液，即制得银耳复合提取物面膜液2。
实施例3
将1000g水和10g银耳粉加入罐中，100℃加热提取5h，得到银耳提取液。浓缩银耳提取液至其中多糖质量分数为1％，加入过氧化氢溶液，其中过氧化氢溶液的加入量与浓缩后银耳提取液的比例为6.5ml：100g，升温至50℃，降解75min，加稀碱液中和至中性，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅰ，降温到30℃，加入葡萄糖，其中葡萄糖的加入量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.5％，接种0.5％(w/w)混合菌种(其中含有酵母菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，比例为1:1:1)发酵15h，6000r/min离心20min，除去沉淀和菌种，取上清液，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅱ。向银耳复合提取物浓缩液Ⅱ中加入3倍体积的乙醇，静置沉降18h，过滤，得到的沉淀烘干后得到银耳粗多糖Ⅱ。将银耳粗多糖Ⅱ加水复溶成浓度为1mg/mL的银耳粗多糖Ⅱ水溶液，即制得银耳复合提取物面膜液3。
对比例1
将市售低分子量银耳多糖加水复溶成浓度为1mg/ml的水溶液，即制得银耳面膜液4。
对比例2
将市售高分子量银耳多糖加水复溶成浓度为1mg/ml的水溶液，即制得银耳面膜液5。
对比例3
参照专利(申请号为201811300284.0，一种银耳发酵提取物的被值方法及其在化妆品中的应用)中实施例1的制备方法(步骤1～4)，制得银耳多糖分子量为20kDa的银耳发酵提取液，加水稀释成浓度为1mg/ml的水溶液，即制得银耳面膜液6。
效果实施例
分别测试实施例1～3中制备得到的三种银耳复合提取物面膜液。在温度为25℃、RH＝43％(湿度为43％)条件下的吸湿性能和在温度为25℃、RH＝0％(绝对干燥)条件下的保湿性能，同时以对比例1～2中的面膜液作为对照。其中：
上述样品放置在恒温恒湿条件下，测定不同时间的吸湿率和保湿率，并记录。保湿率计算公式：保湿率＝100-(H0-Hn)/H0×100％，公式中H0为0h时样品的水分质量(g)、Hn为第nh时样品中的水分质量(g)，其中n＝8,16,24…。吸湿率计算公式(吸湿率＝(wn-w0)×100％/w0)，公式中w0为0h时样品的质量(g)、wn为第nh时样品的质量(g)，其中n＝8,16,24…。
本发明实施例1～3制备的面膜液以及对比例1～3的面膜液通过如下实验步骤测定对皮肤细胞透明质酸分泌量的影响：
将实施例1～3制备的面膜液以及对比例1～3的面膜液利用细胞培养基(DMEM培养基)稀释调整为两种银耳多糖含量的浓度，分别为400μg/mL和100μg/mL。
A、将人皮肤成纤维细胞(HFF-1)以20000个/孔的浓度接种在96孔板中，每孔加入100μL含银耳多糖浓度为400μg/mL或100ug/mL的面膜液，培养24h后，用ELISA试剂盒测定人皮肤成纤维细胞分泌透明质酸的含量，其中每个浓度的面膜液样品均设置5个平行实验组；同时测试人皮肤成纤维细胞(HFF-1)在DMEM培养基中培养24h后分泌透明质酸的含量作为空白组。
B、取对数生长期的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)以20000个/孔的浓度接种在96孔板中，实验组1：加入H2O2使每孔中H2O2的浓度为1mmol/L，培养8h后，弃掉上清，再在每孔加入100μL含银耳多糖浓度为400μg/mL的面膜液，培养24h后，用试剂盒测定SOD和MDA含量。实验组2：加入H2O2使每孔中H2O2的浓度为1mmol/L，培养8h后，弃掉上清，再在每孔中加入100μL含银耳多糖浓度为400μg/mL的面膜液和还原性谷胱甘肽，其中还原性谷胱甘肽与面膜液的比例为0.1g：100ml，培养24h后用试剂盒测定SOD和MDA含量。对照实验为：每孔加入100μL含浓度为0.1％(w/v)谷胱甘肽的培养基(DMEM培养基)，同样条件进行培养并用试剂盒测定SOD和MDA含量；空白实验为：每孔加入100μL培养基(DMEM培养基)，同样条件进行培养并用试剂盒测定SOD和MDA含量。所有的面膜液样品和空白对照组样品均设置5个平行实验。同时，将上述实验组和对照及空白组样品同时放置在37℃、75％RH条件下，每隔一定时间取样测定细胞抗氧化(SOD分泌量)能力。
根据GPC测定结果整理下表给出多糖分子量：
表1不同制备方法得到银耳多糖面膜液中多糖分子量
从测定的结果来看，图1中，三个实施例中制备的银耳多糖面膜液1,2,3的吸湿性能相差不大且最好，其次是市售的高分子量银耳多糖溶液，然后是市售低分子量银耳多糖。图2中，三个实施例制备的样品保湿性能明显高于对比例1～2的样品。综合考虑，按照本专利所述的方法降解、发酵后银耳复合提取物面膜液在保湿性能和吸湿性能上都有明显的改善。
图3是各个样品对于皮肤细胞分泌透明质酸的影响结果，从中可以看出，无论是实施例、对比例与空白组对比，都具有显著性差异，同时实施例三个样品对皮肤细胞刺激分泌的透明质酸的含量明显高于其他组，而市售银耳多糖的效果较差。因此，按照本专利中的方法制备得到分子量段为24.1～60.2kDa的银耳复合提取物具有较为明显的活性。
从图4和图5中可以看出，不同方法制备的多糖面膜液样品对皮肤细胞中的SOD(超氧化物歧化酶)的酶活和MDA(丙二醛)含量的影响没有明显的区别，但是与0.1％的GSH(还原性谷胱甘肽)共同作用时有明显的差别，按照本专利中所述的条件制备的银耳复合提取物面膜液可以促进GSH对细胞中SOD的酶活的增强和更加有效地抑制细胞中MDA的生成。对比例中的多糖溶液与0.1％的GSH共同作用时这种加成效果并不明显。且根据图6中可以看出，在3个月后被实施例1～3制得的银耳复合提取物保护的谷胱甘肽仍有较高的生物活性，而被对比例中样品保护和未保护的谷胱甘肽活性损失较大。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将银耳加入水中，80～100℃加热提取3～6h，然后浓缩至含多糖的质量分数为0.8～1.2％，得到银耳提取液；
(2)往步骤(1)的银耳提取液中加入H2O2，其中H2O2与银耳提取液的比例为1.5～2.0ml：100g，在45～65℃下反应60～90min，调节pH至中性以终止反应，透析，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅰ，其中含银耳粗多糖Ⅰ；
(3)降温至25～37℃，往步骤(2)的银耳复合提取物浓缩液Ⅰ中加入碳源和菌种，发酵12～18h，离心，取上清液，得到银耳复合提取物浓缩液Ⅱ，其中菌种为酵母菌和乳杆菌混合得到的菌种，碳源为葡萄糖和/或蔗糖；
(4)往步骤(3)银耳复合提取物浓缩液Ⅱ中加入乙醇，静置沉降18～24h，过滤，取沉降物，干燥，得到银耳粗多糖Ⅱ，即为银耳复合提取物。
2.根据权利要求1所述一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述碳源的加入量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.3～1％；所述菌种的接种量为银耳复合提取物浓缩液Ⅰ质量的0.1～1.0％。
3.根据权利要求1或2所述一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酵母菌为酿酒酵母GIM2.207，乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种GIM1.380和干酪乳杆菌GIM1.410中的至少一种。
4.根据权利要求3所述一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述菌种为酵母菌和乳杆菌按照质量比为1：2混合得到的菌种；步骤(3)所述菌种为酿酒酵母GIM2.207、植物乳杆菌植物亚种GIM1.380和干酪乳杆菌GIM1.410按照质量比1：1：1混合得到的菌种。
5.根据权利要求3所述一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述银耳与水的料液比为1：(50～100)；步骤(2)所述H2O2以H2O2水溶液的形式加入，其体积浓度为20～40％。
6.根据权利要求3所述一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述银耳为80～100目的银耳粉末；步骤(2)所述透析所用的透析液为水，透析袋的截留分子量为2～4kDa，透析时间为12～36h；步骤(4)所述银耳复合提取物浓缩液Ⅱ和乙醇的体积比为1：(3～4)。
7.根据权利要求3所述一种银耳复合提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述调节pH所用的pH调节剂为NaOH溶液，其浓度为0.01～0.1mol/L；步骤(3)所述离心的条件为：在4000～6000r/min下离心20～30min；步骤(4)所述干燥的温度不高于45℃，干燥的时间为1.5～3h。
8.权利要求1～7任一项所述方法制得的一种银耳复合提取物。
9.权利要求8所述一种银耳复合提取物在化妆品和/或护肤品中的应用。
10.根据权利要求9所述一种银耳复合提取物在化妆品和/或护肤品中的应用，其特征在于，所述银耳复合提取物作为面膜液的基液在制备面膜中的应用。
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