CN115141863B - 一种采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法。所述采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法为：将活化后的裂褶菌接种于所述复合全植物培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基包括胡萝卜、草莓、燕麦和溶剂。本发明所述方法仅采用含有植物的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物；且该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量高，最终制备得到的裂褶菌发酵产物抗氧化、美白、抗炎和抗皱的能力。

Description

一种采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。
背景技术
裂褶菌(学名：Schizophyllum commune Fr.)是裂褶菌科、裂褶菌属真菌。子实体小，覆瓦状散生或丛生，扇形或肾形，无柄或短柄，盖面密生绒毛、白色至浅灰色；盖缘内卷，有条纹、多瓣裂，菌褶狭窄，沿褶缘纵裂向外反卷。
裂褶菌多糖是裂褶菌发酵得到的水溶性多糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。目前，裂褶多糖的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终得到裂褶多糖。但发酵得到的裂褶多糖难于重新溶解、不利于生物吸收等特性，极大的限制了其应用。
CN113337545A公开了一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在裂褶菌培养基中培养裂褶菌，然后收集发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基中含有葛根。在培养基中加入葛根粉末培养裂褶菌，收集发酵产物。
CN108299045A公开了一种用于栽培裂褶菌的培养基，所述培养基由以下质量百分比的各组分组成：黄芪药渣70-90％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，麦麸8％-28％，各组分百分比之和为100％。本发明利用黄芪药渣为主要基料，对裂褶菌子实体进行栽培，可以顺利实现出菇，采收得到裂褶菌子实体，裂褶菌子实体是名贵的食药用真菌，具有很高的经济价值。
CN110305920A公开了一种活性发酵物及其制备方法和应用，该发明制备方法包括：S1取燕麦麸皮和水混合，然后进行酶处理，酶处理后进行灭菌，制得燕麦麸皮培养液；S2取所述燕麦麸皮培养液，转到发酵罐中，接种经三级培养的裂褶菌菌种进行发酵，获得裂褶菌多糖发酵液；S3取所述裂褶菌多糖发酵液，采用板框压滤机过滤，获得裂褶菌发酵胞外产物，然后采用陶瓷膜对裂褶菌发酵胞外产物进行微滤水洗，直至获得澄清透亮的活性发酵物。该发明采用特定的巯基蛋白酶进行处理，再用裂褶菌发酵燕麦麸皮培养液，且其目的是利用酶解产生的游离燕麦多肽以阻止β-葡聚糖被裂褶菌分解利用，裂褶菌大量繁殖的同时生成了裂褶菌多糖。
上述专利公开的方法均是在基础发酵培养基中添加功效物质，例如植物成分葛根、黄芪，且均需要添加入酵母浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖等碳源和氮源才能够促使裂褶菌进行发酵；或是需要将谷物进行较复杂的酶处理后才能作为发酵培养基使用。目前，仍未发现一种制备裂褶菌发酵产物的复合型全植物培养基，并能够使裂褶菌发酵高产裂褶多糖。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法。所述方法仅采用全植物的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，或进行任何酶处理或发酵处理，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：将活化后的裂褶菌接种于所述复合全植物培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物；
其中，所述裂褶菌培养基包括胡萝卜、草莓、燕麦和溶剂。
在本发明中，所述方法仅采用含有胡萝卜、草莓、燕麦的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，或进行任何酶处理或发酵处理，可以满足裂褶菌的生长，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物；且该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量高，最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有优异的抗氧化、美白、抗炎和抗皱的能力。
优选地，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为180-250rpm，例如可以是180rpm、190rpm、200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm等，发酵培养的温度为26-32℃，例如可以是26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等，发酵培养的时间72-96h，例如可以是72h、74h、76h、80h、82h、84h、86h、88h、90h、92h、94h、96h等。
优选地，所述活化后的裂褶菌在所述复合全植物培养基中的接种量为0.5-5vol％，例如可以是0.5vol％、1vol％、2vol％、3vol％、4vol％、5vol％等。
优选地，所述裂褶菌培养基按质量浓度计包括：胡萝卜5-20g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L等)、草莓5-20g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L等)、燕麦0.5-5g/L(例如可以是0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等)。
优选地，所述溶剂为无菌水。
优选地，所述裂褶菌培养基由以下方法配置得到：
(a)将胡萝卜和草莓先进行冻干处理后，分别进行粉碎过筛，得到胡萝卜粉和草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到燕麦粉；
(b)将胡萝卜粉、草莓粉、燕麦粉和溶剂混合，超声分散，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在进行灭菌。
优选地，所述冻干的温度为-30～-20℃，例如可以是-30℃、-28℃、-25℃、-22℃、-20℃等，冻干的时间为10-15h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h等。
优选地，所述胡萝卜粉、草莓粉和燕麦粉的粒径各自独立地为100-500目，例如可以是100目、200目、300目、400目、500目等。
优选地，所述超声分散的功率为100-500W，例如可以是100W、200W、300W、400W、500W等，超声分散的时间为15-20min，例如可以是15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
优选地，所述灭菌的温度为120℃以上，例如可以是120℃、121℃、122℃等，灭菌的时间为20-30min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min等等。
优选地，所述活化后的裂褶菌通过以下步骤活化得到：
将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃(如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，条件下培养5-7天(例如可以是5天、6天、7天等)直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天(例如可以是3天、3.5天、4天等)，得到活化后的裂褶菌种子液。
优选地，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
优选地，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％，余量为水。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述葡萄糖的含量为1-5％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述硫酸镁的含量为0.01-0.02％，例如可以是0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，酵母浸粉的含量为0.1-0.2％，例如可以是0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
第二方面，本发明提供一种裂褶菌发酵产物，所述裂褶菌发酵产物由如第一方面所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法制备得到。
优选地，所述裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量为3-15mg/mL，例如可以是3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL等。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述方法仅采用含有植物的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物；且该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量高，最终制备得到的裂褶菌发酵产物抗氧化、美白、抗炎和抗皱的能力；
(2)本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物裂褶多糖的含量在8.12mg/mL以上；裂褶多糖的分子量在8200kDa以下；
(3)本发明最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗氧化和清除DPPH自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在50.71％以上，对羟自由基清除率在35.16％以上，对于DPPH自由基抑制率在64.85％以上；裂褶菌发酵产物对酪氨酸酶的抑制率在64.93％以上，对黑色素合成抑制率在55.825％以上；制备得到的裂褶菌发酵产物组胺释放抑制率在49.98％以上，炎症因子TNF-α表达抑制率在44.32％以上；最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗皱的功能，使用1月后平均眼纹数减少率达到3.94％以上。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例
本制备例提供裂褶菌菌种，所述裂褶菌菌种通过以下方法活化的得到：
将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、酵母浸膏0.1％，余量为水)，扩大培养3天，得到活化后的裂褶菌种子液。
实施例1
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到200目的燕麦粉；再将12g胡萝卜粉、10g草莓粉、3g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散20min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例2
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到100目的胡萝卜粉和100目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到100目的燕麦粉；再将8g胡萝卜粉、15g草莓粉、2g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在300W的功率下超声分散18min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以1.5vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间84h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例3
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥15h后，分别进行粉碎过筛，得到300目的胡萝卜粉和300目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到300目的燕麦粉；再将6g胡萝卜粉、14g草莓粉、5g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在180W的功率下超声分散20min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌20min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以1vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为250rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间96h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例4
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到200目的燕麦粉；再将3g胡萝卜粉、2g草莓粉、20g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散20min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例5
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到200目的燕麦粉；再将16g胡萝卜粉、2g草莓粉、7g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散20min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例6
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到200目的燕麦粉；再将2g胡萝卜粉、16g草莓粉、7g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散20min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例7
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将植物在-20℃下冻干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的植物粉，再将15g的植物粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为160rpm，发酵培养的温度为25℃，发酵培养的时间100h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例8
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将植物在-20℃下冻干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的植物粉，再将15g的植物粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为300rpm，发酵培养的温度为25℃，发酵培养的时间70h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例1
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将葛根在-20℃下冻干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的葛根粉，再将15g的葛根粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为200rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例2
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将甘草在-20℃下冻干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的甘草粉，再将15g的甘草粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为200rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例3
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜先在-80℃下冷冻干燥12h后，进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉；将燕麦研磨后过筛，得到200目的燕麦粉；再将17g胡萝卜粉和8g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散20min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例4
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，进行粉碎过筛，得到200目的草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到200目的燕麦粉；再将15g草莓粉和10g的燕麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散30min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌20min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例5
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；再将15g胡萝卜粉和10g的草莓粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散30min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌20min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为220rpm，发酵培养的温度为27℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
试验例1
裂褶多糖含量含量测定
测试样品：实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物；
测试原理：裂褶多糖含量也可作为发酵产物的重要衡量指标，计算方法：裂褶多糖含量＝总糖含量-还原糖含量；
测试方法：
I.采用硫酸-苯酚法测定发酵产物总糖含量，多糖在浓硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收。以葡萄糖标准品，测定发酵产物总糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10.0mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入5％苯酚溶液1.0mL，再迅速垂直液面加入5.0mL浓硫酸，静置10min。使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将具塞试管放置于30℃水浴反应20min。
(3)以相应试剂进行空白调零，于490nm处测定吸光度。
计算公式：总糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
II.采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量，具体操作步骤如下：
II.采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入DNS溶液3.0mL，沸水浴5min后显色；待冷却后用水定容至25.0mL，充分摇匀；
(3)以相应试剂进行空白调零，于550nm处测定吸光度。
计算公式：还原糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
具体测试结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003795382210000141
Figure BDA0003795382210000151
由表1测试结果可知，本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物中总糖的含量在18.68mg/mL以上，还原糖的含量在3.21mg/mL以上，裂褶多糖的含量在8.12mg/mL以上。由此说明，本发明采用复合全植物培养基，无需添加其他成分，就能够满足裂褶菌的生长，实现进一步提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的目的。
试验例2
裂褶多糖的分子量和粘度测定
测试样品：实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：将上述发酵液浓缩至原来的体积的至1/4，再加入5倍体积的85vol％乙醇沉淀，以10000rpm的转速离心弃去上清液，收集沉淀用蒸馏水重新溶解，再采用分子量为5kDa的超滤膜过滤除蛋白质及其他小分子产物，得裂褶多糖溶液；将得到裂褶多糖溶液置于-80℃下冷冻干燥24h；采用高效凝胶渗透色谱对得到的裂褶多糖测分子量；
测试条件为：色谱柱：7.8×300mm(Ultrahydrogel TM 120，250，1000，由WatersCorporation提供)；柱温：35℃；流动相：高纯水；流速0.6mL/min；进样量：50μL；
具体测试结果如表2所示：
表2
Figure BDA0003795382210000152
Figure BDA0003795382210000161
由表2测试数据可知，本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物中，裂褶多糖的分子量在8200kDa以下。说明在本发明中，采用植物全植物培养不仅使得从菌丝体中大量制备裂褶多糖，而且还能获得分子量相对较低，水溶性更好的裂褶多糖，更加利于生物吸收入体内发挥生物活性，极大的扩展了裂褶多糖的应用。
试验例3
抗氧化能力测试
测试样品：实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
1、对超氧阴离子自由基清除能力评价
取0.05mol/LpH＝8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，于25℃水浴锅中预热20min。再加入1mL试样和0.4mL 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L的HCl 1.0mL终止反应。以Tris-HCl缓冲液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照用1mL试样的溶剂来替代样品。
超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(A2/A1)]×100％；式中A1为空白对照的吸光度值；A2为样品的吸光度值。
2、对羟自由基的清除能力评价
在25mL比色管中依次加入2mmol/LFeSO43 mL，1mmol/L H2O23 mL，摇匀，接着加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的待测液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度。下式为待测液对羟自由基(·OH)的清除率：
羟自由基清除率(％)＝[A1-A2-(A1-A3)]/A1×100％；式中A1为未加药品前反应体系的吸光度值；A2为样品清除·OH后体系的吸光度值；A3为空白对照清除·OH后体系的吸光度值；
3、对DPPH自由基的清除能力评价
试验参照Larrauri JA中规定的方法，配制20mmol/L的DPPH溶液；受试样品溶液：采用超纯水稀释实施例1-10提供的裂褶多糖组合物和对比例1-5提供的组合物，得到质量浓度为0.1％的溶液。取受试样品溶液2.0mL及20mmol/L的DPPH溶液2.0mL于试管之中，混匀后反应30min，于517nm下测定吸光度值，无水乙醇为空白对照，根据吸光度值计算DPPH抑制率。
DPPH自由基抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％；其中，A1为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL受试样品溶液的吸光度，A2为2.0mL受试样品溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，A3为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，平行测试三次取平均值；
具体测试结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003795382210000181
Figure BDA0003795382210000191
由表3测试数据可知，本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗氧化和清除DPPH自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在50.71％以上，对羟自由基清除率在35.16％以上，对于DPPH自由基抑制率在64.85％以上。说明采用复合全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物能进一步对于DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量。
试验例4
美白能力测试
测试样品：实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
(1)酪氨酸酶活性抑制试验
检测前，对实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物过0.45μm微孔滤膜；
向96孔板中依次加入磷酸盐缓冲液、不同供试液(磷酸缓冲液充当样品空白)、500U/mL酶液，最后加入底物1.5mmol/L L-酪氨酸，立即开始计时，测定反应20min时475nm波长下的吸光值。
Figure BDA0003795382210000192
式中：A1：添加样品，添加L-酪氨酸；A2：添加样品，没有添加L-酪氨酸；B1:没有添加样品，添加L-酪氨酸；B2：没有添加样品，没有添加L-酪氨酸，R'为对应样品对酪氨酸酶抑制率(％)。
(2)黑色素合成抑制实验
将B16黑色素瘤细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔90μL，CO2孵箱中孵育24小时后，每孔加入样品溶液。同时设立培养基和细胞的空白对照组。
将培养板置于孵箱中孵育72小时后，弃去上清液，PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤两遍，然后每孔加入0.5mL胰酶消化细胞3min，每孔加入2mL维持液终止消化。混匀后，每种浓度取出0.5mL做细胞计数。其余细胞悬液以2500r/min离心分离5min，弃去上清液，于沉淀中加入NaOH溶液，加热使黑色素溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪下测定吸光度值。
计算样品对黑色素合成抑制率(％)公式如下所示：
Figure BDA0003795382210000201
其中，A1为药物孔吸光度值，P1为药物孔细胞密度，A2为对照孔吸光度值；P2为对照孔细胞密度，I'为对应样品对黑色素合成抑制率(％)；
具体测试结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003795382210000202
/>
Figure BDA0003795382210000211
由表4测试结果可知，本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物对酪氨酸酶的抑制率在64.93％以上，对黑色素合成抑制率在55.825％以上，说明说明本发明所述复合全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，能够有效抑制黑色素转移至角质细胞，抑制黑色素沉着，促进肌肤的新陈代谢，进而减轻色素沉积，能够从多个方面实现美白效果，令皮肤健康白皙。
试验例5
抗炎抗过敏性能测试
测试样品：实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物；
试验方法：
测试原理：人外周血嗜碱性(KU812)细胞常被用作研究过敏反应的效应细胞，采用KU812细胞组胺释放模型，考查样品对KU812细胞组胺释放的影响；并采用KU812细胞组胺释放模型，考查样品对KU812细胞促炎细胞因子表达的影响。
测试方法：
(1)受试样品配制及处理：以DMSO配制实施例1-7和对比例1-3提供的含不同分子量裂褶多糖的组合物溶液，质量浓度为10％，10％胎牛血清培养基稀释至裂褶多糖的组合物浓度为0.3％。
细胞培养及模型建立：用含10％胎牛血清的IMDM培养基进行稀释细胞，将细胞密度调整为2.2×106个/mL，然后将得到的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种量为180μL。
分为模型对照组、裂褶多糖的组合物实验组、空白对照组、每组设3个平行，37℃、5％CO2培养箱培养静置10min，裂褶多糖的组合物实验组分别加入受试样品20μL，空白对照组和模型对照组分别加入20μL培养液，置培养箱中预温孵，2h后除细胞空白对照组外，各组细胞加入刺激剂40nM巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)、1μM钙离子载体A23187，PMA和A23187使用DMSO配制。空白对照组加入同体积含等浓度DMSO培养基。
指标检测：2h后离心分离细胞，收集细胞上清液，测定上清液中组胺含量，方法按组胺ELISA检测试剂盒说明书进行；组胺释放抑制率(％)＝(模型组组胺含量-实验组组胺含量)/模型组组胺含量×100％。
(2)受试样品配制及处理：以DMSO配制实施例1-7和对比例1-3提供的含不同分子量裂褶多糖的组合物溶液，质量浓度为10％，10％胎牛血清培养基稀释至裂褶多糖的组合物浓度为0.3％。
细胞培养及模型建立：用含10％胎牛血清的IMDM培养基进行稀释KU812细胞，将细胞密度调整为2.2×106个/mL，然后将得到的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种量为180μL。
分为模型对照组、裂褶多糖的组合物实验组、空白对照组、每组设3个平行，37℃、5％CO2培养箱培养静置10min，裂褶多糖的组合物实验组分别加入受试样品20μL，空白对照组和模型对照组分别加入20μL培养液，空白对照组和模型对照组分别加入20μL培养液，置培养箱中预温孵，2h后除细胞空白对照组外，各组细胞加入刺激剂40nM PMA、1μMA23187，PMA和A23187使用DMSO配制。空白对照组加入同体积含等浓度DMSO培养基；
指标检测：培养2h后离心分离细胞，收集细胞上清液，测定细胞上清液中TNF-α的含量，具体方法按R&D ELISAKit说明书步骤进行；TNF-α表达抑制率(％)＝(模型组TNF-α含量-实验组TNF-α含量)/模型组TNF-α含量×100％。
具体测试结果如表5所示：
表5
Figure BDA0003795382210000231
/>
Figure BDA0003795382210000241
由表5测试结果可知，本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物组胺释放抑制率在49.98％以上，炎症因子TNF-α表达抑制率在44.32％以上；说明本发明所述复合全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，还能进一步提高抑制组胺的能力，从而起到抑制炎症及过敏现象的发生；同时能够抑制炎症因子表达，即能够抑制炎性介质的释放。
试验例6
眼周部皮肤抗皱测试
测试样品：实施例1-8提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：(1)选取皮肤健康且类型相同人群，年龄在18-45岁，随机分成13组，每组5名，经专业人员培训后进行实验，受试者均无皮肤病史，受试部位正常，且受试期间不涂抹任何与实验无关的药物或者化妆品。测试环境温度控制在21±1℃℃，相对湿度为50±10％，测试前使用36℃左右的纯净水擦拭受试者眼周，让受试者在测试环境下静坐30min后进行测试；(2)分别在志愿者眼周涂抹实施例1-7提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-5提供的裂褶菌发酵产物，保证每天早晚各涂覆1次，每次0.2mL，持续使用四周后用面部皮肤图像分析仪(VISIA-CR)，测量肌肤纹理变化；具体如下表6所示：
表6
Figure BDA0003795382210000242
/>
Figure BDA0003795382210000251
由表6测试结果可知，本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗皱的功能，使用1月后平均眼纹数减少率达到3.94％以上；说明本发明所述复合全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，可有效改善眼周肌肤的衰老状态，淡化皱纹，提升肌肤弹性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将活化后的裂褶菌接种于所述复合全植物培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物；其中，所述复合全植物培养基由胡萝卜、草莓、燕麦和无菌水制成，其中按质量浓度计胡萝卜浓度为5-20 g/L，草莓浓度为5-20 g/L，燕麦浓度为0.5-5 g/L；
所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为180-250 rpm，发酵培养的温度为26~32℃，发酵培养的时间72-96 h；
所述活化后的裂褶菌在所述复合全植物培养基中的接种量为0.5-5 vol%；
所述复合全植物培养基由以下方法配置得到：
（a）将胡萝卜和草莓先进行冻干处理后，分别进行粉碎过筛，得到胡萝卜粉和草莓粉；将燕麦研磨后过筛，得到燕麦粉；
（b）将胡萝卜粉、草莓粉、燕麦粉和无菌水混合，超声分散，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在进行灭菌。
2.根据权利要求1所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述冻干的温度为-80℃，冻干的时间为10-15 h。
3.根据权利要求1所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述胡萝卜粉、草莓粉和燕麦粉的粒径各自独立地为100-500目。
4.根据权利要求1所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述超声分散的功率为100-500 W，超声分散的时间为15-20 min。
5.根据权利要求1所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述灭菌的温度为120℃以上，灭菌的时间为10-20 min。
6.根据权利要求1所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述活化后的裂褶菌通过以下步骤活化得到：
将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃条件下培养5-7天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天，得到活化后的裂褶菌种子液。
7.根据权利要求6所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
8.根据权利要求6所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5%、磷酸二氢钾0.05-0.2%、硫酸镁0.01-0.02%、酵母浸粉0.1-0.2%，余量为水。
9.一种裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物由如权利要求1-8中任一项所述的采用复合全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法制备得到。
10.根据权利要求8所述裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量为8.23-14.75 mg/mL。
11.一种根据权利要求9或10所述的裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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高分子量裂褶菌多糖发酵培养基的优化组合;张虽栓等;《赤峰学院学报(自然科学版)》;第29卷(第12期);第66-68页 *

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