CN109260047B - 银耳牛奶发酵原浆及其制备方法和应用 - Google Patents

银耳牛奶发酵原浆及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及银耳牛奶发酵原浆及其制备方法和应用，其中发酵原浆含有银耳多糖以质量比计500‑5000ppm和多肽。其制备方法包括如下步骤：将银耳、牛奶、无机氮源、蔗糖、水和酵母菌混合，并进行发酵培养，得到银耳牛奶发酵原浆。该发酵原浆制作过程中没有额外添加酶或其他加工助剂，生产成本较低，生产步骤简单。原浆中含有丰富的银耳多糖、氨基酸及小分子多肽等物质，有助于肌肤保湿和抗衰老。本发明的发酵原浆可以直接涂抹，也可作为功能性配料添加至面膜、精华液、爽肤水、乳液、膏霜类护肤品中使用，产品天然不刺激。

Description

银耳牛奶发酵原浆及其制备方法和应用
技术领域
本发明生物发酵领域，具体涉及一种用微生物发酵的银耳牛奶发酵原浆，其制备方法以及在护肤领域的应用。
背景技术
银耳俗称白木耳或雪耳，在中医药学古书(太平经惠方)里有记载，唐朝时银耳就已经被用来做浴疗，具有润泽滑爽肌肤的功效。外观长得像透明花瓣的银耳，可萃取出含有丰富葡萄糖、海藻糖、多酸戊糖和甘露糖醇等成分的多糖，银耳多糖分子结构和玻尿酸非常类似，保湿力极佳。而且银耳多糖体比玻尿酸的分子更小，因此涂在肌肤上吸收渗透速度更快，也不容易出现粘胶感，是更天然的植物型优质保湿成分。
在目前许多大牌的护肤品牌中，十分流行发酵护肤品，比如SK-Ⅱ，雅诗兰黛及兰蔻等。也有不少中草药发酵产品用于美容护肤方面的专利报道，但银耳提取物发酵用于美容护肤方面的报道却不多。
专利文献CN 105002254 A公开了一种银耳发酵提取物的制备方法及其应用，主要包括如下步骤：用菌种或其培养液或其悬浮液发酵培养银耳，得到发酵产物。先将菌种活化、纯化及扩大培养后接种至银耳粉和水的混合体系中发酵，再离心取上清即为所需产品。
发明内容
目前现有技术中存在的技术问题是，银耳多糖在目前的提取制备工艺中，经过传统方法提取的银耳提取物中多糖含量有限，未充分利用原料。另外目前尚无关于美容用银耳牛奶发酵原浆的技术。
本发明人为解决上述技术问题发现，银耳经过微生物分解发酵后，能释放出比提取更多的多糖及其他有益于皮肤的成分，同时加入牛奶进行发酵，使得牛奶蛋白分解为小分子活性多肽，更容易被皮肤吸收。
专利文献CN 105002254 A将扩大培养后的酵母菌液直接加入银耳粉和水的混合体系，而该混合体系中微生物能够直接利用的碳源仅发酵菌菌液中残留的葡萄糖，酵母难以充分生长和发酵，因此酵母的生长及发酵效果有待改善。因此本发明在发酵过程中特别添加了碳源、氮源，以保证发酵过程中发酵菌的营养充足，获得更好的发酵效果。
具体来说，本发明提出了如下技术方案：
本发明提供了银耳牛奶发酵原浆，含有银耳多糖以质量比例计500-5000ppm和多肽。
上述原浆优选的是，其中，分子量在2000以下的多肽占原浆中多肽的90wt％以上，优选分子量在1000以下的多肽占原浆中多肽的85wt％以上。
上述任一原浆优选的是，其中，分子量在400以下的多肽占原浆中多肽的40wt％～60wt％。
上述任一原浆优选的是，其中，其中，含有可溶性固形物0.1-5wt％，优选1-3wt％。
另一方面，本发明还提供了银耳牛奶发酵原浆的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)菌种活化、纯化、扩大培养；
步骤(2)银耳提取；
步骤(3)原料混合,其中，原料含有步骤(2)得到的银耳提取物、牛奶、碳源和氮源；
步骤(4)接种发酵；
步骤(5)澄清处理；
和步骤(6)灭菌。
上述方法优选的是，其中，所述步骤(1)所用菌种选自鲁氏结合酵母、巴氏酵母、酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、木醋杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和乳酸乳球菌的一种。
上述任一方法优选的是，其中，所述步骤(2)银耳提取的工序包括：将银耳粉碎至20～50目，加入水混合，
优选其中银耳占水的0.1～2wt％，加热至80℃～100℃，
进一步优选地以转速20～50rpm/min搅拌，优选提取80～120min。
上述任一方法优选的是，其中，所述步骤(3)原料混合的工序包括：以质量份计，在所述步骤(2)得到的100份银耳提取液中，加入1～15份牛奶，1～5份碳源及1～5份氮源，灭菌；
优选地，碳源选自蔗糖、糖蜜、葡萄糖和果糖中的一种或两种以上和/或氮源选自硫酸铵、蛋白胨、酵母浸膏、尿素和硝酸铵中的一种或两种以上。
上述任一方法优选的是，其中，所述步骤(4)接种发酵的工序包括：将5～50质量份所述步骤(1)中扩大培养后的菌液，加入到800～1000质量份所述步骤(3)得到的冷却后的原料混合液中进行培养，优选地，培养温度为25℃～35℃，和/或摇床培养24～96h，和/或摇床转速160～200rpm/min。
上述任一方法优选的是，其中，所述步骤(5)澄清处理的工序包括：将所述步骤(4)发酵结束后的发酵体系进行高压灭菌，将灭菌后的发酵产物进行过滤或离心。
上述方法优选的是，其中，所述过滤用硅藻土进行精滤或者用纱布滤去残渣后用膜进行精滤。
上述任一方法优选的是，其中，所述步骤(6)灭菌的工序包括：将所述步骤(5)得到的银耳牛奶发酵原浆进行UHT闪蒸灭菌，优选灭菌3～5s。
本发明还提供了银耳牛奶发酵原浆，通过上述任一方法制备得到。
另一方面，本发明还提供了银耳护肤品，含有本发明的发酵原浆。
本发明还提供了上述任一发酵原浆在护肤领域中的应用。
本发明的有益效果包括：
本发明中，不涉及不涉及重金属、激素等有害物质，保证了来源天然健康。
本发明中，牛奶经过酵母菌发酵后，在保留有益成分的同时，将大分子蛋白分解为小分子活性多肽，分子量降低后，更易于被皮肤吸收；
本发明中，银耳经过发酵后，银耳中的多糖、氨基酸及矿物质等有益于皮肤的成分均充分释放出来，比传统的银耳提取物能更大程度萃取出营养成分。
本发明所带来的产品在更大限度利用原料的同时，能够有效地起到抗氧化及保湿的作用，且银耳牛奶经发酵后具有独特迷人的发酵清香。原液可直接涂抹，也可作为功能性配料添加至其他乳液、膏霜类护肤品中，天然不刺激，安全无负担。
本发明的制备方法简单，生产成本低，可规模化生产。
菌株保藏信息及出售信息
本发明所用的菌种酿酒酵母Z2.2(Saccharomyces cerevisiae Z2.2)来自安琪酵母股份有限公司出售的型号为NY005的酿酒酵母，于2005年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M205128，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。且在专利文献CN103907767A中已记载。
本发明所用的菌种酿酒酵母Z2.4(Saccharomyces cerevisiae Z2.4)来自安琪酵母股份有限公司出售的型号为BV818的酿酒酵母，于2005年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M205130，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。且在专利文献CN101756151A中已记载。
下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：
附图说明
图1是实施例5产品制备的组方和基质样使用后，水分含量随时间变化。
图2是实施例5产品制备的组方和基质样使用后，失水率随时间变化。
图3是实施例2产品制备的组方和基质样使用后，黑色素随时间变化。
图4是实施例2制备的组方和基质样使用后，相对于涂抹前的黑色素减少率。
图5是实施例2制备的组方和基质样使用后，血红素随时间变化。
图6是实施例2制备的组方和基质样使用后，相对于涂抹前的红色素减少率。
具体实施方式
如上所述，本发明的目的是为了提供一种美容用银耳牛奶发酵原浆，生产过程中特别添加了蔗糖、硫酸铵和牛奶作为发酵菌的营养物质，且经过发酵后，皮肤所需营养成分易吸收，产品具有好闻的发酵清香，具有良好的保湿功效。与发酵前的水提液相比，发酵后体系中主要功效成分银耳多糖的含量大大增加了，且清除自由基效果加强，保湿功效也有一定提升。
本发明的另一目的是提供一种生产上述产品的方法，优选的具体步骤如下：
步骤(1)菌种活化、纯化、扩大培养：
菌种活化：挑取菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
其中，YPD培养基的组成为：酵母提取物1wt％，胰蛋白胨2wt％，葡萄糖2wt％，剩余为水，PH值为7.0。
菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)。
步骤(2)银耳提取：
将银耳粉碎至20～50目，与水混合后(二者质量分数比为0.1～2％)，加热至80℃～100℃后搅拌(搅拌转速20～50rpm/min)提取80～120min。
银耳占水的比例如果超过2％，在本文中的提取条件下，会在发酵过程中由于黏度太大而产生接近凝固的现象。
步骤(3)原料混合：
在100份步骤(2)得到的银耳提取液中，加入1～5份蔗糖，1～15份牛奶及1～5份硫酸铵，115℃高压灭菌20min。
其中，蔗糖和硫酸铵是发酵的碳源和氮源，其他碳源包括糖蜜，葡萄糖和果糖等；其他氮源包括蛋白胨、酵母浸膏、尿素和硝酸铵等。
步骤(4)接种发酵：
将5～50份步骤(1)中扩大培养后的菌液加入至800～1000份步骤(3)得到的冷却后的原料混合液中，25℃～35℃摇床培养24～96h(摇床转速160～200rpm/min)。
其中，菌液可以用一种菌的菌液也可以用多种菌的菌液，加入不同菌种经过发酵银耳多糖的含量或者结构不会发生太大变化，而发酵液中的有机成分，例如乳酸、乙醇、乙酸的含量会有所不同。比如有乳酸菌参与发酵时，最终产品中乳酸含量会比较高，更有助于皮肤保湿，还有助于皮肤角质脱落。
摇床培养的转速是最有利于酵母菌或乳酸菌生长繁殖的速度。如果培养时间太短，微生物没有能充分利用营养物质发酵，说发酵不充分；而如果时间太长，容易增加其他杂菌污染的风险导致体系变臭。
步骤(5)澄清处理：
结束发酵后将发酵体系在115℃高压灭菌20min，使菌失活。将灭菌后的发酵产物用硅藻土细土精滤得到清液即为银耳牛奶发酵原浆。或者离心取上清，或者纱布滤去残渣后膜分离精滤。
灭菌：上述银耳牛奶发酵原浆UHT闪蒸灭菌3～5s。
其中，制备过程所用摇床、平板、灭菌仪器等为本领域技术人员常规的设备或工具，凡是常用的所述设备或工具均可以用于本发明中，具体菌种培养、银耳提取等条件均是本领域技术人员能够常规确定的条件。所用银耳、牛奶、蔗糖、硫酸铵都可通过正规渠道购买获得。
下面通过具体实施例来说明本发明的银耳牛奶发酵原浆，利用本发明银耳牛奶发酵原浆制备的护肤品在护肤方面的效果进行说明。
下面实施例中所用到各试剂和仪器来源如下：
表1实施例所用试剂和仪器
Figure BDA0001353313740000061
Figure BDA0001353313740000071
实验组一 银耳牛奶发酵液制备
实施例1
菌种活化：挑取安琪酵母股份有限公司出售的型号为BV818的酿酒酵母Z2.4(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为CCTCC NO:M205130菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
银耳提取：将10g银耳粉碎至50目，与500ml水混合,加热至80℃后搅拌(搅拌转速20pm/min)提取120min。
原料混合：在500g上述提取液中，加入15g蔗糖，75g牛奶及5g硫酸铵，115℃高压灭菌20min。
接种发酵：取5ml扩大培养后的菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养24h(摇床转速160rpm/min)。
澄清处理：结束发酵后将发酵体系115℃高压灭菌20min，使菌失活。将灭菌后的发酵产物先用硅藻土粗土滤去残渣，然后用硅藻土细土精滤得到清液即为银耳牛奶发酵原浆。
灭菌：上述银耳牛奶发酵原浆UHT闪蒸灭菌5s。
实施例2
菌种活化：挑取安琪酵母股份有限公司出售的型号为NY005的酿酒酵母Z2.2(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为CCTCC NO:M205128菌落一环放入MRS液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至MRS液体培养基中，35℃摇床培养，当OD值＝0.75时，得到发酵菌菌液。
银耳提取：将5g银耳粉碎至20目，与800ml水混合,加热至90℃后搅拌(搅拌转速40pm/min)提取90min。
原材料混合：在800g上述提取液中，加入20g蔗糖，200g牛奶及20g硫酸铵，115℃高压灭菌20min。
接种发酵：取20ml扩大培养后的菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，35℃摇床培养48h(摇床转速160rpm/min)。
澄清处理：结束发酵后将发酵体系115℃高压灭菌20min，使菌失活。将灭菌后的发酵产物离心得到上清即为银耳牛奶发酵原浆。
灭菌：上述银耳牛奶发酵原浆UHT闪蒸灭菌5s。
实施例3
菌种活化：挑取安琪酵母股份有限公司出售的型号为BV818的酿酒酵母Z2.4(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为CCTCC NO:M205130菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1×108CFU/ml)。
银耳提取：取1g银耳粉碎至20目，与1000ml水混合，加热至100℃搅拌(搅拌转速50rpm/min)提取80min。
原材料混合：在1000g上述银耳提取液中，加入50g蔗糖，10g牛奶及50g硫酸铵，115℃高压灭菌20min。
接种发酵：将50ml扩大培养后的菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，28℃摇床培养96h(摇床转速200rpm/min)。
澄清处理：结束发酵后将发酵体系115℃高压灭菌20min，使菌失活。将灭菌后的发酵产物用纱布滤去残渣后膜分离精滤得到银耳牛奶发酵原浆。
灭菌：上述银耳牛奶发酵原浆UHT闪蒸灭菌3s。
实施例4
菌种活化：挑取酿酒酵母Z2.2(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为CCTCCNO:M205128菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
银耳提取：将10g银耳粉碎至50目，与500ml水混合,加热至80℃后搅拌(搅拌转速20pm/min)提取120min。
原料混合：在500g上述提取液中，加入5g蔗糖，5g牛奶及5g硫酸铵，115℃高压灭菌20min。
接种发酵：取5ml扩大培养后的菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养24h(摇床转速160rpm/min)。
澄清处理：结束发酵后将发酵体系115℃高压灭菌20min，使菌失活。将灭菌后的发酵产物先用硅藻土粗土滤去残渣，然后用硅藻土细土精滤得到清液即为银耳牛奶发酵原浆。
灭菌：上述银耳牛奶发酵原浆UHT闪蒸灭菌5s。
实施例5
菌种活化：挑取安琪酵母股份有限公司出售的型号为BV818的酿酒酵母Z2.4(Saccharomyces cerevisiae),保藏编号为CCTCC NO:M205130菌落一环放入YPD液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
菌种纯化：将上步活化后的菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至YPD液体培养基中，28℃摇床培养，当OD值＝1.0时，得到发酵菌菌液。
银耳提取：将10g银耳粉碎至40目，与500ml水混合,加热至80℃后搅拌(搅拌转速20pm/min)提取120min。
原料混合：在500g上述提取液中，加入25g蔗糖，75g牛奶及5g硫酸铵，115℃高压灭菌20min。
接种发酵：取5ml扩大培养后的菌液加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养24h(摇床转速160rpm/min)。
澄清处理：结束发酵后将发酵体系115℃高压灭菌20min，使菌失活。将灭菌后的发酵产物先用硅藻土粗土滤去残渣，然后用硅藻土细土精滤得到清液即为银耳牛奶发酵原浆。
灭菌：上述银耳牛奶发酵原浆UHT闪蒸灭菌5s。
实验组二 理化检测
将实施例中发酵前的银耳水提取液和加入牛奶发酵后的发酵原浆按照NYT1676-2008检测其中多糖含量，经双缩脲法检测其中多肽含量，经液相法检测多肽分子量分布。测试，发酵前后主要功效成分质量含量如表2所示，发酵前后肽分子量分布质量百分比如表3所示。发酵前后的感官性状如表4所示。
表2发酵前后主要功效成分含量
编号 可溶性固形物 银耳多糖 多肽含量
实施例1银耳水提液(发酵前) 0.2％ 396ppm 0
实施例1(发酵后) 1.5％ 3800ppm 0.3％
实施例2(发酵后) 1.4％ 3750ppm 0.4％
实施例3(发酵后) 1.6％ 3800ppm 0.5％
实施例4(发酵后) 1.5％ 4000ppm 0.3％
实施例5(发酵后) 1.5％ 4200ppm 0.5％
如表2所示，经过发酵，可溶性固形物、银耳多糖和多肽均有较大程度的提高，因此发酵使得银耳中的营养成分充分释放出来。
其中可溶性固形物是指原浆浓缩干燥后得到的固形物，其主要成分是银耳多糖。可溶性固形物和功效相关，一定程度上，可溶性固形物和功效成分是正相关关系，举个例子，可溶性固形物少，功效成分不可能太高，而可溶性固形物越多，与产品功效相关的成分含量可能也越多。
表3发酵前后肽分子量分布百分比
Figure BDA0001353313740000111
如表3所示，发酵前肽分子量基本大于2000，而发酵后分子量在1000以下的多肽占原浆中多肽的90％以上，且分子量在400以下的多肽占原浆中多肽的55％以上。因此牛奶中的大分子蛋白被分解为小分子活性多肽。
表4发酵前后感官性状
实施例1银耳水提液(发酵前) 淡黄色水样液体，银耳特有气味
实施例1-5发酵液 淡黄色粘稠液体，发酵清香
如表4所示，经过发酵后的银耳牛奶发酵原浆有独特的发酵清香，给人美好的感官体验。
实验组三银耳牛奶发酵原浆在护肤中的应用-保湿功效评价
一、实验原理
人体实验，由特定实验人群组成受试群体，测试受试者使用护肤品(或者功效成分)前后皮肤水分以及水分散失的变化，从而确定护肤品(或功效成分)的保湿功效。
二、实验仪器及样品
实验仪器：皮肤水份含量测试
Figure BDA0001353313740000121
CM825、皮肤水份流失测试
Figure BDA0001353313740000122
TM300。
样品：按照表5中的组方制备样品
银耳提取液组(以下简称样品1组)；
发酵银耳牛奶发酵物组(以下简称样品2组)；
以及基质样。
表5组方
Figure BDA0001353313740000123
三、实验人群和测试时间
受试者共计25人。具体性别构成和年龄构成随机确定。期间若有2人出现不良反应，则终止测试：结果未发现不良反应。
测试时间为：2016年9月。
四、实验方法
选择受试者左、右手臂依次循环标记：受试区域样品组和空白对照区域；
技术人员使用皮肤水份含量(MMV)测试仪
Figure BDA0001353313740000131
CM825、皮肤水份流失(TEWL)测试仪
Figure BDA0001353313740000132
TM300测量空白对照区域5次，取平均值，记为空白值。
在受试者实验部位涂抹样品，分别使用：样品1组、样品2组，基质样。
受试者在连续使用护肤品一小时、两小时、四小时后，由技术人员使用皮肤水份含量测试、皮肤水份流失测试测量5次，取平均值。
统计测得的数值，分析其皮肤水分变化规律和水分散失变化规律。
五、结果分析
在测试周期内，本次测试项目共筛选25人纳入研究，组间脱落2人，且受试人群中未出现明显的全身不良反应或3级以上的皮肤刺激，故本次测试的有效志愿者人数为23人。
(一)水分含量变化
水分含量变化反映的是在测试周期内，实验区域水分含量随时间变化规律。其值越大，水分含量越大；反之，水分含量越小。应用SPSS20软件对样品1组、样品2组和基质样的水分含量数据组进行统计学分析，其结果符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行研究显著性分析，统计结果如图1和表6所示。
表6样品使用前后皮肤水分MMV值的统计结果(n＝23)
Figure BDA0001353313740000133
由表6可看出，在测试周期内，各时间段使用样品后与相对起始值水分含量相比较均存在显著性差异(p<0.05)；受试者使用样品1组和样品2组后，皮肤水分MMV值比使用基质样有较大提高，且使用4h后与使用基质样相比较存在显著性差异(p<0.05)；因此使用本发明组方的产品均具有良好的保湿效果。
同时，由图1和表6所示，通过样品1组和样品2组以及基质样组水分含量随时间变化的均值可以看出，使用样品2组的水分含量高于使用样品1组水分含量，因此添加了银耳牛奶发酵原浆的组方相比于添加了银耳提取液的组方，具有更好的保湿效果。
(二)水分流失情况
水分散失变化反映在测试周期内，实验区域水分散失随时间变化规律。其值越小，水分散失越少，锁水能力越强；反之，锁水能力越弱。应用SPSS20软件对对样品1组、样品2组和基质样的水分散失数据组进行统计学分析，其结果符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行研究显著性分析，结果如图2和表7所示。
表7样品全使用前后经皮水分流失TEWL值的统计结果(n＝23)
Figure BDA0001353313740000141
由图2与表7可看出，在测试周期内，受试者使用样品后，经皮水分流失TEWL值呈下降趋势，各时间段样品组与基质样经皮水分流失量相比较均存在显著性差异(p<0.05)；
各样品组在使用后的各时间段与基质样相比较，样品1组、样品2组的TEWL值存在明显地差异性(p<0.05)，经皮水分流失量显著降低，样品1组与样品2组即时锁水能力明显，且持续性佳。
(三)结论
综合水分含量和水分散失情况，在测试周期4小时内，受试者使用样品后：
各样品组受试者皮肤水分呈升高趋势，且明显高于使用前；实验组皮肤水分明显高于基质组，说明测试样品的即时补水能力明显，且4小时内持续补水能力好。
在样品使用后，样品1组、样品2组的即时锁水能力明显优于基质样，且4小时内持续补水能力好。
综合说明：本次测试样品1组、样品2组可有效增强产品保湿功能，达到增强皮肤屏障、补充肌肤水分效果。
实验组四银耳牛奶发酵原浆在护肤中的应用-美白功效评价
一、实验原理
人体实验，由特定实验人群组成受试群体，测试受试者使用护肤品(或功效成分)前后皮肤黑色素以及红斑的变化，从而确定护肤品(或功效成分)的美白功效。
二、实验仪器及样品
实验仪器：皮肤黑色素和血红素测试仪
Figure BDA0001353313740000152
MX18。
样品：按照表8中的组方制备样品，银耳提取液组(以下简称样品1组)；
发酵银耳牛奶发酵物组(以下简称样品2组)；以及基质样。
表8组方
Figure BDA0001353313740000151
三、实验人群和测试时间
受试者共计25人。具体性别构成和年龄构成随机确定。期间若有2人出现不良反应，则终止测试：结果未发现不良反应。
测试时间为：2016年9～10月。
四、实验方法
选择受试者左、右手臂依次循环标记：受试区域样品组和空白对照区域；
技术人员使用皮肤黑色素和血红素测试仪
Figure BDA0001353313740000161
MX18测量空白对照区域5次，取平均值，记为空白值。
在受试者实验部位涂抹样品，分别使用：样品1组、样品2组、基质样。
受试者在连续使用护肤品一周、两周、四周后，由技术人员使用皮肤黑色素和血红素测试仪
Figure BDA0001353313740000162
MX18测量5次，取平均值。
统计测得的数值，分析其黑色素及血红素变化规律。
五、结果分析
在测试周期内，本次测试项目共筛选25人纳入研究，组间脱落2人，且受试人群中未出现明显的全身不良反应或3级以上的皮肤刺激，故本次测试的有效志愿者人数为23人。
(一)黑色素变化
黑色素变化反映在测试周期内，实验区域黑色素随时间变化规律。其值越小，黑色素越小，反之，黑色素越大。应用SPSS20软件对样品1组、样品2组和基质样的结果数据组进行统计学分析，其结果符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行研究显著性分析，统计如图3和表9所示。
表9样品使用前后皮肤黑色素值的统计结果(n＝23)
Figure BDA0001353313740000163
由图3与表9可看出，在测试周期内，受试者使用样品后，皮肤黑色素值呈下降趋势，各时间段样品1组、样品2组和基质样组与相对起始值黑色互值相比较均存在显著性差异(p<0.05)；
样品1组、样品2组在使用后的各时间段与基质样相比较，使用2周后黑色素值存在明显地差异性(p<0.05)；
在使用后的各时间段相比较，如图3和表9所示，使用后各时间段样品2组黑色素值低于样品1组。
(二)相对黑色素减少率
黑色素相对减少率，即相对减少率＝(涂抹前黑色素数值—空白/样品组黑色素数值)/涂抹前黑色素数值；此值越大，说明试验样品相对未处理皮肤的美白效果越明显。
如图4所示，样品使用后，相对涂抹前黑色素的变化曲线说明从1周开始到4周结束，使用样品1组和样品2组后相对涂抹前或使用基质样后黑色素减少效果明显，且使用样品2组的黑色素减少比样品1组的黑色素减少有很大提高，因此使用添加银耳牛奶发酵原浆的护肤品比使用添加银耳提取液的护肤品在黑色素减少方面功效更为明显。
(三)血红素(红斑)变化
血红素变化反映在测试周期内，实验区域血红素随时间变化规律。其值越小，血红素越小，反之，血红素越大。应用SPSS20软件对样品1组、样品2组和基质样的结果数据组进行统计学分析，其结果符合正态分布，采用单因素方差分析对数据进行研究显著性分析，结果统计如图5和表10所示。
表10样品使用前后皮肤血红素(红斑)值的统计结果(n＝23)
Figure BDA0001353313740000171
由图5与表10可看出，在测试周期内，受试者使用样品后，皮肤血红素(红斑)值呈下降趋势；
各样品组在使用后的2周时间段与基质样相比较，样品1组、样品2组的血红素(红斑)值差异性(p>0.05)不明显，但使用4周后，血红素(红斑)值差异性(p<0.05)明显，血红素(红斑)值显著降低，样品1组与样品2组的消炎效果明显；且各时间段样品2组血红素值低于样品1组血红素值。
(四)相对血红素减少率
血红素相对减少率，即相对减少率＝(涂抹前血红素值—空白/样品组血红素数值)/涂抹前血红素数值；此值越大，说明试验样品相对未处理皮肤的消炎效果越明显。
如图6所示，样品使用后，相对涂抹前血红素的变化曲线说明从1周开始到4周结束，使用样品1组和样品2组后相对涂抹前或基质样血红素(红斑)减少数值明显，且样品2组红血素相对减少率明显高于样品1组的相对减少率，样品2组的消炎效果更加明显。
(五)结论
综合黑色素及血红素(红斑)测试数据情况，在测试周期4周内，受试者使用样品后：
各样品组受试者皮肤黑色素呈下降趋势，且明显低于使用前；样品1组和样品2组皮肤黑色素明显低于基质组，说明测试样品消除黑色素能力明显，且4周内持续消除黑色素能力好。
在样品使用后，样品1组、样品2组的消炎作用明显优于基质样，且4周内持续补水能力好。
综合说明：本次测试样品1组、样品2组可有效增强产品的美白及消炎功效，达到降低皮肤黑色素及皮肤红斑的美白效果。
通过实验组三和实验组四可以看出，经本发明银耳牛奶发酵原浆制备的护肤品，能明显提高皮肤水分，具有很好的补水能力和即时锁水能力，同时，含发酵原浆的护肤品能够显著降低皮肤黑色素值和血红素值，具有很好的美白和消炎功效。本发明的发酵原浆能够有效提高护肤品的保湿功能和美白功效，能够作为功能性配料制备各类护肤品。

Claims (31)

1.银耳牛奶发酵原浆，其特征在于，含有银耳多糖以质量比例计500～5000ppm和多肽，其中，分子量在2000以下的多肽占原浆中多肽的90wt％以上；
其中，所述银耳牛奶发酵原浆通过包括以下步骤的方法制备：
步骤(1)菌种活化、纯化、扩大培养；
步骤(2)银耳提取；
步骤(3)原料混合，其中，原料含有步骤(2)得到的银耳提取物、牛奶、碳源和氮源；
步骤(4)接种发酵；
步骤(5)澄清处理；
和步骤(6)灭菌；
其中，所述步骤(4)接种发酵的工序包括：将5～50质量份所述步骤(1)中扩大培养后的菌液，加入到800～1000质量份所述步骤(3)得到的冷却后的原料混合液中进行培养；
其中，所述步骤(1)所用菌种选自鲁氏结合酵母、巴氏酵母、酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、木醋杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和乳酸乳球菌的一种；
其中，所述步骤(2)银耳提取的工序包括：将银耳粉碎至20～50目，加入水混合；
其中，所述步骤(3)原料混合的工序包括：以质量份计，在所述步骤(2)得到的100份银耳提取液中，加入1～15份牛奶，1～5份碳源及1～5份氮源，灭菌；
其中，碳源选自蔗糖、糖蜜、葡萄糖和果糖中的一种或两种以上和/或氮源选自硫酸铵、蛋白胨、酵母浸膏、尿素和硝酸铵中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的原浆，其中，分子量在1000以下的多肽占原浆中多肽的85wt％以上。
3.根据权利要求1所述的原浆，其中，分子量在400以下的多肽占原浆中多肽的40wt％～60wt％。
4.根据权利要求2所述的原浆，其中，分子量在400以下的多肽占原浆中多肽的40wt％～60wt％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的原浆，其中，含有可溶性固形物0.1～5wt％。
6.根据权利要求1-4任一项所述的原浆，其中，含有可溶性固形物1～3wt％。
7.制备权利要求1-6任一项所述原浆的方法，包括以下步骤：
步骤(1)菌种活化、纯化、扩大培养；
步骤(2)银耳提取；
步骤(3)原料混合，其中，原料含有步骤(2)得到的银耳提取物、牛奶、碳源和氮源；
步骤(4)接种发酵；
步骤(5)澄清处理；
和步骤(6)灭菌；
其中，所述步骤(4)接种发酵的工序包括：将5～50质量份所述步骤(1)中扩大培养后的菌液，加入到800～1000质量份所述步骤(3)得到的冷却后的原料混合液中进行培养；
其中，所述步骤(1)所用菌种选自鲁氏结合酵母、巴氏酵母、酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、木醋杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和乳酸乳球菌的一种；
其中，所述步骤(2)银耳提取的工序包括：将银耳粉碎至20～50目，加入水混合；
其中，所述步骤(3)原料混合的工序包括：以质量份计，在所述步骤(2)得到的100份银耳提取液中，加入1～15份牛奶，1～5份碳源及1～5份氮源，灭菌；
其中，碳源选自蔗糖、糖蜜、葡萄糖和果糖中的一种或两种以上和/或氮源选自硫酸铵、蛋白胨、酵母浸膏、尿素和硝酸铵中的一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳占水的0.1～2wt％，加热至80℃～100℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳与水混合后的转速20～50r/min。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳与水混合后的转速20～50r/min。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳与水混合后提取的时间为80～120min。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳与水混合后提取的时间为80～120min。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳与水混合后提取的时间为80～120min。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，银耳与水混合后提取的时间为80～120min。
15.根据权利要求7所述的方法，步骤(4)中，培养温度为25℃～35℃。
16.根据权利要求7所述的方法，步骤(4)中，摇床培养24～96h。
17.根据权利要求15所述的方法，摇床培养24～96h。
18.根据权利要求7所述的方法，步骤(4)中，摇床转速160～200r/min。
19.根据权利要求15所述的方法，摇床转速160～200r/min。
20.根据权利要求16所述的方法，摇床转速160～200r/min。
21.根据权利要求17所述的方法，摇床转速160～200r/min。
22.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤(5)澄清处理的工序包括：将所述步骤(4)发酵结束后的发酵体系进行高压灭菌，将灭菌后的发酵产物进行过滤或离心。
23.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤(5)澄清处理的工序包括：将所述步骤(4)发酵结束后的发酵体系进行高压灭菌，将灭菌后的发酵产物进行过滤或离心。
24.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(5)澄清处理的工序包括：将所述步骤(4)发酵结束后的发酵体系进行高压灭菌，将灭菌后的发酵产物进行过滤或离心。
25.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤(5)澄清处理的工序包括：将所述步骤(4)发酵结束后的发酵体系进行高压灭菌，将灭菌后的发酵产物进行过滤或离心。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中，所述过滤用硅藻土进行精滤或者用纱布滤去残渣后用膜进行精滤。
27.根据权利要求7-25中任一项所述的方法，其中，所述步骤(6)灭菌的工序包括：将所述步骤(5)得到的银耳牛奶发酵原浆进行UHT闪蒸灭菌。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述灭菌时间为3～5s。
29.银耳护肤品，含有权利要求1-6任一项所述的发酵原浆或权利要求7-28任一项所述制备方法制备得到的发酵原浆。
30.根据权利要求29所述的银耳护肤品，其中，所述护肤品是指面膜、洗面奶、面膜、精华液、爽肤水、乳液或膏霜。
31.根据权利要求1-6任一项所述的发酵原浆或权利要求7-28任一项所述制备方法制备得到发酵原浆在护肤领域中的应用。
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