CN111718857B - 一种绣球菌的培养方法，绣球菌干燥粉末，及其溶媒提取物和应用 - Google Patents

一种绣球菌的培养方法，绣球菌干燥粉末，及其溶媒提取物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种绣球菌栽培技术领域，尤其涉及一种绣球菌的培养方法，绣球菌干燥粉末，及其溶媒提取物和应用。在本发明的绣球菌的培养方法中，将绣球菌MH‑3，第二代培养菌株的菌丝、子实体，以及第三代培养菌株的菌丝、子实体混合得到混合体以进行培养，可以稳定地获得包含高浓度(60重量％以上)且高纯度的β‑1,3‑D‑葡聚糖(6分歧)的绣球菌。采用本发明培养得到的绣球菌制备的绣球菌干燥粉末含有高浓度(60重量％以上)β‑1,3‑D‑葡聚糖(6分歧)，利用其生理活性，绣球菌干燥粉末可以应用于制备各种功能性食品、化妆品等。

Description

一种绣球菌的培养方法，绣球菌干燥粉末，及其溶媒提取物和 应用
技术领域
本发明涉及一种绣球菌栽培技术领域，尤其涉及一种绣球菌的培养方法，绣球菌干燥粉末，及其溶媒提取物和应用。
背景技术
绣球菌，又名绣球菇，拉丁学名为Sparassis crispa，是非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属。绣球菌是名贵的食药兼用菌，生长在诸如落叶松之类的针叶树上，被誉为“万菇之王”，因其具有超高的激活免疫能力，在日本有“梦幻神奇菇”之称。绣球菌含有大量的蛋白质、碳水化合物、多种维生素、多种氨基酸及膳食纤维和灰分、矿物质等。其中，绣球菌含有大量的β-葡聚糖，β-葡聚糖是一种生物活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝、提高造血功能等多种功能。
日本专利JP4183326B2公开了一种绣球菌提取物，其在对绣球菌的生理活性进行研究的过程中，发现该绣球菌提取物中所含的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)为绣球菌中主要的生理活性物质。
然而，绣球菌生长缓慢，过去难以工业化人工种植绣球菌，日本专利JP2002125460A发现，在相对较短的时间内可靠地人工种植绣球菌，并公开了一种无需复杂且昂贵的培养基料处理过程的培养方法。具体的，日本专利JP2002125460A公开了一种在主要由木屑组成的培养基上培养绣球菌MH-3(保藏编号FERM P-17221)的方法。虽然JP2002125460A公开的培养方法能够控制成本在短期内人工栽培绣球菌，但是其培养得到的绣球菌MH-3中，生理活性物质β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的含量较低。
因此，目前仍无法提供一种培养绣球菌MH-3的方法，能够稳定提高其活性成份β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的含量。
发明内容
为此，需要提供一种含有高浓度的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌粉末的高稳定性的制备方法。
为实现上述目的，本发明的第一方面，发明人提供了一种绣球菌的培养方法，包括以下步骤：
(1)第一培养工序：将绣球菌接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代培养菌株；
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在第一蘑菇栽培用瓶内，将所述第一代培养菌株接种至所述第一蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代培养菌株，所述培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营养素；
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第一真菌床袋内，将所述第二代培养菌株接种至所述第一真菌床袋内进行培养，得到第三代培养菌株；
(4)第四培养工序：将所述绣球菌，所述第二代培养菌株的菌丝、子实体，以及所述第三代培养菌株的菌丝、子实体的混合体，接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株；
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在第二蘑菇栽培用瓶内，将所述第一代配合菌接种至所述第二蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代配合菌株；
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，将所述第二代配合菌株接种至所述第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配合菌株；
其中，所述绣球菌为绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221)。
本发明第二方面，提供了一种绣球菌干燥粉末，所述绣球菌干燥粉末由本发明第一方面所述的培养方法培养得到的所述第三代配合菌株经过干燥处理得到。
优选的，所述绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量％的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
本发明第三方面，提供了一种溶媒提取物，其由本发明第二方面所述的绣球菌干燥粉末提取得到，且所述溶媒提取物中含有β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
优选的，本发明第三方面所述的溶媒提取物采用热水提取法，或热碱水提取法，或冷碱水提取法提取得到。
优选的，本发明第三方面所述的所述溶媒提取物采用热水提取法提取得到，且热水温度为80～125℃。
优选的，所述溶媒提取物采用冷碱水提取法提取得到，所述冷碱水提取法包括以下步骤：
取适量所述绣球菌干燥粉末，在所述绣球菌干燥粉末中加入适量乙醇，静置以进行脱脂处理，分离出第一沉淀组分；
在所述第一沉淀组分中加入适量热水，进行自动灭菌处理，分离出第二沉淀组分；
在所述第二沉淀组分中加入适量10％NaOH/5％尿素，并进行搅拌处理，得到所述溶媒提取物。
优选的，所述冷碱水提取法的步骤具体包括：
取50g所述绣球菌干燥粉末，在所述绣球菌干燥粉末中加入700mL乙醇，放置2天进行脱脂处理，分离出第一沉淀组分；
在所述第一沉淀组分中加入500mL 80～125℃的热水，进行自动灭菌处理，分离出第二沉淀组分；
在所述第二沉淀组分中加入500mL的10％NaOH/5％尿素，在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到所述溶媒提取物。
本发明的第四方面，提供了一种本发明第二方面所述的绣球菌干燥粉末在制备功能性食品、饮料的应用。
本发明的第五方面，提供了一种本发明第二方面所述的绣球菌干燥粉末在制备功能性化妆品的应用。
本发明的有益效果
区别于现有技术，上述技术方案包括以下有益效果：
1)根据本发明的绣球菌的培养方法，并采用绣球菌MH-3(保藏编号FERM P-17221)作为出发菌株，可以培养得到含有高浓度(60重量％以上)的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌；
2)采用本发明培养得到的绣球菌来制备绣球菌干燥粉末，可以稳定地得到含有高浓度(60重量％以上)的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌干燥粉末；
3)本发明提供的绣球菌干燥粉末因为含有高浓度(60重量％以上)β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)，利用其生理活性，可应用于制备各种功能性食品(饮料)、化妆品等；
4)本发明提供的绣球菌干燥粉末的溶媒提取物中含有高浓度的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
附图说明
图1为实施例3所述的绣球菌干燥粉末(MH-3-A)的溶媒提取方法的工艺流程图。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例中，使用的微生物——绣球菌MH-3菌株是属于绣球菌属的菌种，其已于1999年2月17日在日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所NIBH(现名称为独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NITE-IPOD))保藏，保藏登记号为FERM P-17221，并于2019年12月5日根据布达佩斯条约移送国际保藏，并给予国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221。当然，本发明提供的绣球菌的培养方法也可以应用于其它种类的绣球菌种的培养中，并不局限于绣球菌MH-3菌株。
本发明实施例中，绣球菌的培养方法，包括以下步骤：
(1)第一培养工序：将绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221)接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代培养菌株。
在第一培养工序中，添加至琼脂培养基中的营养成分可以为蛋白胨、爱表斯锭(EBIOS，啤酒酵母片，购自日本朝日集团食品株式会社)、香蕉粉、蜂蜜粉、小麦粉、氯化钙、琼脂粉、针叶树热水提取液等中的一种或多种。另外，还可以在琼脂培养基中添加小麦、麸皮、大麦和玉米麸皮等菌丝体活性营养素。
其中，针叶树热水提取液的实例包括：通过用40℃至80℃的热水对诸如落叶松和赤松之类的针叶树叶的碎片进行热水提取而获得的提取液。琼脂培养基优选斜面培养基，以增加菌丝体的培养基面积。此外，琼脂培养基的pH值的取值范围优选为6.0至7.0的范围。优选的，琼脂培养基在试管中以倾斜的方式放置、灭菌、形成斜面固体培养基后，再接种绣球菌MH-3并培养。
(2)第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在蘑菇栽培用瓶内，将第一代培养菌株接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代培养菌株，培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营养素。
在第二培养工序中，针叶树细粒状碎屑包括，例如，通过将针叶树(例如，落叶松、赤松)的原木粉碎而获得的碎屑，并且优选的具有约0.1mm至10mm的颗粒度。菌丝体活性营养素包括，例如，小麦、麸皮、大麦和玉米麸皮等。优选的，菌丝体活性营养素的含量为整个培养基材的20重量％以下。
蘑菇栽培用瓶的具体结构不作限制，可以使用市面上销售的可容纳400g～500g培养基材的耐热塑料瓶。在蘑菇栽培用瓶中，将针叶树细粒状碎屑(150g～450g)、水和菌丝体活性营养素装填形成培养基材，加热灭菌后，使用接种器将第一代培养菌株接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养。
培养条件可以在适合菌株生长的范围内适当地设定，例如温度18～25℃、湿度55％～75％。另外，培养室中的氧浓度优选为210,000ppm以上，并且培养室中的二氧化碳浓度优选为1,000ppm以下。此外，可以适当地设定培养时间，以菌丝体的产生为指标，例如，培养时间可以为60至90天。
(3)第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在真菌床袋内，将第二代培养菌株接种至真菌床袋内进行培养，得到第三代培养菌株。
在第三培养工序中，培养基材可以使用和第二培养工序中相同的针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素。真菌床袋的材料和形态没有特别限定，例如可以使用市面上销售的可容纳2000g～3000g培养基材的真菌床袋。将针叶树细粒状碎屑(例如1000～2000g)、水和菌丝体活性营养素装填到真菌床袋中，作为培养基材料；加热灭菌后，使用接种器将第二代培养菌株接种至真菌床袋中进行培养。
培养条件不作特别限定，可以在适合菌株生长的范围内适当地设定，例如温度18～25℃、湿度55％～75％。另外，培养室中的氧浓度优选为210,000ppm以上，并且培养室中的二氧化碳浓度优选为1,000ppm以下。此外，可以适当地设定培养时间，以菌丝体和子实体原基的产生为指标，例如，可以设定约60至130天的时间。
(4)第四培养工序：将绣球菌MH-3，第二代培养菌株的菌丝和/或子实体，以及第三代培养菌株的菌丝和/或子实体的混合体，接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株。
在第四培养工序中，琼脂培养基的营养成分可以采用第一培养工序中的相同，优选的，琼脂培养基是斜面琼脂培养基。在由绣球菌MH-3，第二代培养菌株的菌丝和/或子实体，以及第三代培养菌株的菌丝和/或子实体组成的混合体中，可以使用通过将子实体的内表面和外表面切割成2mm至10mm的正方形并分解组织而获得的子实体。培养条件不作特别限制，培养温度可以设为18～25℃，培养天数可设为约45至90天。
相比于绣球菌MH-3，上述各菌株的混合体中包含着更强大的突变菌株、进化菌株和优良菌株。通过使用这样的混合体，可以稳定地获得包含高浓度(60重量％以上)、高纯度的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌。
(5)第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在蘑菇栽培用瓶内，将第一代配合菌接种至蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代配合菌株。
在第五培养工序中，关于构成培养基材的针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素，可以使用与第二培养工序同样的方法制备。另外，蘑菇栽培用瓶也可以使用与第二培养工序相同类型的培用瓶。此外，可以采用与第二培养工序相同的方式设定培养条件和培养时间。
(6)第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，将第二代配合菌株接种至第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配合菌株。
在第六培养工序中，针叶树细粒状碎屑和菌丝体活性营养素，可以使用与第三培养工序同样的方法制备。另外，真菌床袋也可以使用与第三培养工序相同类型的真菌床袋。此外，可以采用与第三培养工序相同的方式设定培养条件和培养时间。
本发明实施例中，绣球菌干燥粉末的制备方法包括以下步骤：
干燥工序：将上述培养方法培养得到的第三代配合菌株干燥，得到绣球菌干燥粉末。
优选的，在干燥工序中，用于干燥的第三代配合菌株为第三代配合菌株的子实体。干燥方法和条件可以适当设定，例如可以采用在65℃～80℃的温度下干燥的方法，或者采用冷冻干燥的方法。通过这样的方法将干燥的绣球菌粉碎成期望的尺寸，即可获得干燥的绣球菌粉末。
本发明实施例制备的绣球菌干燥粉末含有60重量％以上的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、降血压、保肝、提高造血功能等多种功效。因此，通过将本发明实施例制备得到的绣球菌干燥粉末应用到功能性食品(饮料)中，能够赋予功能性食品以这些β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的功效。
本发明实施例的功能性食品中含有的绣球菌干燥粉末中包含60重量％以上的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。本发明实施例的功能性食品，可以配合如糖类、糖醇类、肉类和鱼类提取物、蛋白质、肽、氨基酸类、食物纤维、维生素类、淀粉类、糊精、油脂类、酒精类、盐类、调味料、香辛料、保存料、甜味料、着色料、品质改良剂、香料等成分。
另外，β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的美白效果、皱纹改善等效果也广为人知。因此，通过将本发明实施例的绣球菌干燥粉末配合到化妆品中，能够对化妆料赋予这些效果。
本发明实施例的化妆品中含有的绣球菌干燥粉末中包含60重量％以上的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。本发明实施例的功能性化妆品，可以配合如水(精制水、温泉水、深层水等)、油剂、表面活性剂、金属肥皂、保湿剂、凝胶化剂、酒精类、水溶性高分子、粉末、pH调整剂、皮膜形成剂、树脂、紫外线防御剂、包接化合物、抗菌剂、香料、除臭剂、盐类、清凉剂可配合动物、微生物提取物、植物提取物、血液循环促进剂、捕收剂、抗脂泄漏剂、活性氧消除剂、细胞赋活剂、角质溶解剂、酶、激素类、维生素类等成分。
本发明实施例中，绣球菌干燥粉末的溶媒提取物中含有β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
在对绣球菌干燥粉末进行提取时，所用的溶剂可以使用水性溶剂或非水性溶剂，优选的，使用水性溶剂。水性溶剂包括水或者通过向水中添加碱或其他碱性物质而获得的碱性水、通过添加与醇相容的有机溶剂而获得的水性溶剂、含有酸或酸性物质的酸性水等。另外，非水性溶剂的实例包括极性有机溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)。
当用水对绣球菌干燥粉末进行提取时，优选使用热水提取。这种情况下的热水温度优选控制在80～125℃的范围内。
本发明的绣球菌干燥粉末，溶媒提取物，其制备方法和应用不限于以上实施形态。接着，通过具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限定于以下的实施方式。
实施例1绣球菌干燥粉末的制备
(1)第一培养工序(试管培养)
主要器具采用了试管和斜面琼脂培养基(以下记载为“K-2”)。
具体来说，K-2的组成是纯净水1L，蛋白胨1.2g，爱表斯锭(EBIOS，啤酒酵母片)3.6g，氯化钙0.6g，粉末琼脂15g，针叶树热水提取液(10mL)，菌丝体活性营养素(KN-1)3.0g，斜面培养基的pH值为6.0～7.0。
将上述K-2保存在试管里。另外，K-2的灭菌条件设为110～115℃，压力2气压；灭菌30分钟后，放置冷却。在该K-2里接种并培养绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERMBP-17221)，得到了第一代试管培养菌株(以下记载为N-1)。
(2)第二培养工序(瓶装培养)
准备培养基的瓶容器和培养基材。瓶容器采用能容纳400g～500g培养基材的蘑菇栽培用的耐热塑料瓶(市面上销售的即可)。
作为培养基材的菌株培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片(装填重量为150g～450g)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(KN-2)20％以下构成(总装填重量为400g～500g)。
该菌株培养基经过灭菌温度120～121℃、压力2气压3小时处理后，置于18℃以下的环境12小时进行冷却。此后，在洁净室内使用接种器在菌株培养基上接种N-1。培养室的温度保持在18～25℃、湿度55％～75％之间。另外，培养室内的氧气浓度注意维持在210,000ppm以下，室内的二氧化碳浓度不超过1,000ppm。在培养室培养N-1，经过培养期间60日～90日，即可产生菌丝体。在下文中，第二培养工序得到的第二代培养菌株记为“MH-819”。
(3)第三培养工序(菌床培养)
为了培育绣球菌的菌体，准备了可以容纳2000g～3000g培养基材的菌床袋。
作为培养基材的菌床培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片(装填重量为1000g～2000g)，水65％，菌丝体活性营养素(KN-3)20％以下组成(总装填重量2000g～3000g)。该菌床培养基先经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3小时后，再在18℃以下的环境放置12小时进行冷却。
此后，在洁净室内使用接种器，将MH-819接种到菌床培养基。培养室维持在温度18～25℃，湿度55％～75％中。另外，培养室内的氧气浓度注意维持在210,000ppm以下，室内的二氧化氧浓度不超过1,000ppm。在培养室培养MH-819，经过培养期间60日～90日后，即可产生菌丝体，菌丝体产生后10日～40日内，产生子实体原基。在下文中，第三培养工序得到的第三代培养菌株记为“MH-835”。
(4)第四培养工序(试管培养)
准备斜面琼脂培养基K-2(试管)。斜面琼脂培养基由纯净水1L，蛋白胨1.2g，爱表斯锭3.6g，氯化钙0.6g，粉末琼脂15g，针叶树热水提取液(10mL)，菌丝体活性营养素(KN-1)3.0g。同时，试管的斜面琼脂培养基的pH值为6.0～7.0。斜面琼脂培养基的灭菌环境设为110～115℃，压力2气压；灭菌30分钟后，放置冷却。
将在第一培养工序中使用的绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221)、MH-819的菌丝体和子实体(组织分解)以及MH-835的菌丝体和子实体(组织分解)的混合体，在清洁室内，使用接种器接种至斜面琼脂培养基K-2(试管)中进行培养，得到第一代配合菌株。培养温度控制在18℃～25℃之间。经过培养天数45日～90日，即可产生菌丝体。在下文中，第四培养工序得到的第一代配合菌株记为“MH-78”。
(5)第五培养工序(瓶装培养)
准备培养基的瓶容器和培养基材。培养基的瓶容器使用蘑菇栽培用的耐热塑料瓶。
作为培养基材的菌株培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎屑(装填重量为420g～480g)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(KN-4)20％以下组成。该菌株培养基经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3小时后，置于18℃以下的环境12小时进行冷却。培养室温度保持在18～25℃、湿度55％～75％之间。同时，培养室内的氧气浓度注意保持在210,000ppm以下，二氧化碳的浓度不超过1,000ppm。
在清洁室里使用接种器，将MH-78接种到菌株培养基中进行培养，得到第二代配合菌株。经过培养期间60日～90日，即产生菌丝。在下文中，第五培养工序得到的第二代配合菌株记为“MH-78A”。
(6)第六培养工序(菌床培养)
准备用于培育绣球菌菌体的菌床袋。
作为培养基材的菌床培养基，由落叶松、赤松等针叶树的细粒形状碎片(装填重量为2.4kg～2.8kg)，纯净水65％，菌丝体活性营养素(KN-5)20％以下组成。该菌床培养基先经过温度120～121℃、压力2气压的灭菌处理3小时后，再在18℃以下的环境放置12小时进行冷却。培养室温度保持在18～25℃、湿度55％～75％之间。同时，培养室内的氧气浓度注意保持在210,000ppm以下，二氧化碳的浓度不超过1,000ppm。
此后，在洁净室内使用接种器，将MH-78A接种到菌床培养基中进行培养，得到第三代配合菌株。经过培养期间60日～90日后，即可产生菌丝体，菌丝体产生后10日～40日内，产生子实体原基。在下文中，第六培养工序得到的第三代配合菌株记为“MH-78B”。
(7)粉末化工序
把MH-78B置于65℃～80℃环境中12小时～18小时使之干燥，通过100目筛或200目筛，得到绣球菌干燥粉末，记载为MH-3-A。
实施例2绣球菌干燥粉末的成分分析
以实施例1中得到的绣球菌干燥粉末(MH-3-A)作为待测样品A、B，在财团法人日本食品分析中心进行了成分分析(每100g)。结果如表1所示。
表1绣球菌干燥粉末(MH-3-A)的成分分析表
分析试验项目 A(MH-3-A)结果数值 B(MH-3-A)结果数值
水分 4.9g 3.0g
蛋白质 3.1g 3.4g
脂质 1.4g 1.1g
灰分 1.1g 1.0g
碳水化合物 89.5g 91.5g
能量 192kcal 195kcal
钠 3.1mg 3.6mg
β-1,3-D-葡聚糖(6分歧) 61.9g 63.2g
如表1所示，在实施例1中得到的绣球菌干燥粉末(MH-3-A)中，每100g包含60g以上(60重量％以上)的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)。
实施例3绣球菌干燥粉末(MH-3-A)的溶媒提取
对绣球菌干燥粉末(MH-3-A)进行提取，并测定了糖蛋白比的成分量。
采用下述方法从绣球菌干燥粉末中提取溶媒提取物，并测定其成分量。
1、“热水提取1倍”法：从绣球菌子实体，用温风干燥制得的，过100目筛得到的干燥粉末50g。在50g干燥粉末中加入700mL EtOH(乙醇)，放置2天进行脱脂处理，得到提取物和残渣组分(或沉淀组分)。然后，在残渣组分中加入500mL热水(121℃)，自动高压灭菌处理2小时，得到提取物①和残渣组分②。接着，将提取物①和残渣组分②分开。在提取物①中加入4L乙醇，在4℃下，进行5分钟的3000rpm搅拌处理，在得到的沉淀组分中加入400mL 50％乙醇(200mL水+200mL乙醇)，进行3000rpm搅拌处理5分钟，再加入丙酮，放置1天得到了热水提取物③。
2、“热水提取4倍”法：在提取物①中加入4L乙醇，在4℃下，进行5分钟的3000rpm搅拌处理，在得到的沉淀组分中加入400mL 50％乙醇(200mL水+200mL乙醇)，进行3000rpm搅拌处理5分钟，在得到的上清液中加入800mL乙醇，并进行5分钟的3000rpm搅拌处理，接着加入丙酮放置1天，得到热水提取物4倍。
3、“冷碱提取(1)”法：在残渣组分②加入500mL的10％NaOH/5％尿素,在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到冷碱提取物(1)—④。
4、“冷碱提取(2)”法，在④的残渣组分加入500mL的10％NaOH/5％尿素，在4℃中放置2天，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到冷碱提取物(2)—⑤。
5、“热碱提取”法：在⑤的残渣组分加入500mL的10％NaOH/5％尿素，在65℃中处理1小时，再进行10分钟的3000rpm搅拌处理，得到热碱提取物—⑥。
图1示出了上述各提取法的工序。在图1中，将“热水提取1倍”的提取物记载为“SCHWE1V”，将“热水提取物4倍”的提取物记载为“SCHWE4V”，将“冷碱提取(1)”的提取物记载为“SCCA1”，将“冷碱提取(2)”的提取物记载为“SCCA2”，将“热碱提取”的提取物记载为“SCRE”。
各组提取物成份量的测定：
采用把葡萄糖作为标准物质的苯酚-硫酸法测定糖含量，并采用把牛血清白蛋白(BSA)作为标准物质的BCA法测定蛋白含量。同时，关于糖组成，用2N-三氯乙酸完全加水分解、还原、乙酰化后，采用气相色谱法分析。测定结果如表2所示。
表2各组提取物成份量的测定结果表
Figure BDA0002578250310000141
绣球菌干燥粉末(50g)，过100目筛
用糖蛋白比分析可知，采用实施例1制备得到的绣球菌干燥粉末是含糖量为90％的高纯度多糖体。其中，“热水提取4倍”法得到的提取物的纯度尤其的高，而在“冷碱提取(1)”法得到的提取物中β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的含量高达8.97g/50g绣球菌干燥粉末。然而，OHNO等人(OHNO大野尚仁,Naohito宿前利郎,MIURA中岛三博,等.Antitumor 1,3-β-Glucan from Cultured Fruit Body of Sparassis crispa[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin,2000,23(7):861-872.)对绣球菌干燥粉末进行提取，其得到的提取物中糖含量仅为64～70％，蛋白含量仅为0.8～3.0％，β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)含量仅为0～3.68g/25g绣球菌干燥粉末，远低于本实施例制备得到的绣球菌提取物的糖含量。
对比例绣球菌干燥粉末的制备和成分分析
1、绣球菌干燥粉末的制备
本对比例中采用的微生物为从山上采集而来的天然绣球菌(以下记载为“MH-1”)，通过下述两阶段的方法培养得到绣球菌的子实体。
(1)第1阶段，进行了MH-1的接种和培养。主要器具采用了试管和斜面琼脂培养基。
试管内使用的琼脂培养基，由纯净水1L，蛋白胨1.2g，EBIOS 3.6g，氯化钙0.6g，HYPONEX 0.6mL，香蕉粉末48g，蜂蜜粉末18g，琼脂粉末20g调制而成，pH值6.0～7.0。同时，琼脂培养基的灭菌条件为：在110～115℃、压力2气压下灭菌30分钟，之后冷却。在下文中，这种琼脂培养基记载为“K-1”。
在上述方法制作的斜面琼脂培养基K-1中接种MH-1，开始菌株的培养。MH-1在琼脂培养基中培育成长，在20℃中经过45日～90日的培养，若能产生菌丝体，则可确认绣球菌(MH-1)完成培养。此后每65日～120日反复进行MH-1接种。在下文中，这种试管培养菌株记载为“M-1”。
(2)第2阶段，准备制作绣球菌子实体培养基的瓶容器和培养基材。
主要器具使用市场上销售的蘑菇栽培用的耐热塑料瓶。其次，为了实现绣球菌子实体的生产，培养基材使用了锯末。
耐热塑料瓶内装填的培养基材，由落叶松锯末1kg、纯净水500mL、蛋白胨1.0g、EBIOS 45g、氯化钙0.6g、香蕉粉末6g、蜂蜜粉末2g、小麦粉100g、氯化镁0.5g制作而成。在下文中，这种瓶装培养基记载为“锯末培养基1”。该锯末培养基1的pH值调制为6.0～7.0，锯末培养基1的灭菌条件为：在120～121℃、压力2气压下灭菌30分钟，之后冷却。
接着，在放冷后的锯末培养基1上接种M-1。在下文中，在锯末培养基1上接种了M-1的培养基记载为“锯末培养基2”。
锯末培养基2的培养条件维持在温度18～25℃、湿度55％～75％，开始培养绣球菌丝、子实体。M-1经过60日～90日的培养，促进菌丝成长，从而绣球菌的子实体的原基逐渐产生。此后，通过在温度18～25℃、湿度75％～85％下20日～50日的培养，原基培养后产生了绣球菌子实体。在下文中，将该绣球菌子实体记载为“M-2”。
接着，将获得的M-2，通过80℃～100℃、12小时～18小时用温风进行干燥，得到绣球菌干燥体，过100目筛使之粉末化，获得绣球菌干燥粉末。在下文中，将这种绣球菌干燥粉末记载为“M-3”。
2、绣球菌干燥粉末M-3的成分分析
绣球菌干燥粉末M-3的成分分析
以上述方法制备得到的绣球菌干燥粉末(M-3)作为待测样品C，在财团法人日本食品分析中心进行了成分分析(每100g)。结果如表3所示。
表3绣球菌干燥粉末(M-3)的成分分析表
分析试验项目 C(M-3)结果数值
水分 8.8g
蛋白质 6.9g
脂质 0.8g
纤维 6.3g
灰分 3.1g
糖分 74.1g
β1,3-D-葡聚糖(6分歧) 43.6g
如表3所示，绣球菌干燥粉末(M-3)中含有43.6g/100g的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)，蛋白质和糖分含量较少。与实施例1中制备得到的绣球菌干燥粉末(MH-3-A)相比，绣球菌干燥粉末(M-3)的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的含量较少。
采用实施例1的绣球菌干燥粉末的制备方法，在第四培养工序中得到了由绣球菌MH-3(国际特许微生物保藏编号FERM BP-17221)、该绣球菌MH-3培育出的MH-819的菌丝体和子实体(组织分解)以及MH-835的菌丝体和子实体(组织分解)的混合体。该混合体中包含着更强大的变异株、进化株和优良株菌种。虽然绣球菌的菌株对环境的适应性较弱，仅靠菌类的种族系的保存和培养很难，但根据本发明的绣球菌干燥粉末的制备方法，可以稳定地获得包含高浓度(60重量％以上)、高纯度的β-1,3-D-葡聚糖(6分歧)的绣球菌干燥粉末。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (5)

1.一种绣球菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）第一培养工序：将绣球菌接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代培养菌株；
（2）第二培养工序：取400g～500g培养基材装填在第一蘑菇栽培用瓶内，将所述第一代培养菌株接种至所述第一蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代培养菌株，所述培养基材包括针叶树细粒状碎屑、水和菌丝体活性营养素；
（3）第三培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第一真菌床袋内，将所述第二代培养菌株接种至所述第一真菌床袋内进行培养，得到第三代培养菌株；
（4）第四培养工序：将所述绣球菌，所述第二代培养菌株的菌丝、子实体，以及所述第三代培养菌株的菌丝、子实体的混合体，接种到含有营养成分的琼脂培养基中进行培养，得到第一代配合菌株；
（5）第五培养工序：取400g～500g培养基材装填在第二蘑菇栽培用瓶内，将所述第一代配合菌接种至所述第二蘑菇栽培用瓶内进行培养，得到第二代配合菌株；
（6）第六培养工序：取2000g～3000g培养基材装填在第二真菌床袋内，将所述第二代配合菌株接种至所述第二真菌床袋内进行培养，得到第三代配合菌株；
其中，所述绣球菌为绣球菌MH-3，其保藏编号为FERM BP-17221。
2.一种绣球菌干燥粉末，其特征在于，所述绣球菌干燥粉末由权利要求1所述的培养方法培养得到的所述第三代配合菌株经过干燥处理得到。
3.根据权利要求2所述的绣球菌干燥粉末，其特征在于，所述绣球菌干燥粉末含有大于等于60重量%的6分歧β-1,3-D-葡聚糖。
4.一种权利要求2或3所述的绣球菌干燥粉末在制备功能性食品、饮料的应用。
5.一种权利要求2或3所述的绣球菌干燥粉末在制备功能性化妆品的应用。
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