JP2022509922A - 硫酸化ガラクトースを含む組成物、及びその実施 - Google Patents
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Abstract
本開示は、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物を開示する。本開示はさらに、全糖含有量に対して１５～９０％の範囲である、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースの重量パーセントを開示する。さらに、本開示は、植物を感染から保護／処置するための組成物の使用を開示する。動物を感染から保護／処置するための組成物の使用も提供される。本開示は、植物を感染から保護／処置するための硫酸化ガラクトースの使用を開示する。動物を感染から保護／処置するための硫酸化ガラクトースの使用も提供される。本開示はまた、本明細書に記載されるような組成物を調製するための方法を開示する。
Description
発明の分野
[001] 本開示は、組成物の分野に広く関連し、特に、硫酸化ガラクトースを含む組成物、それらの製剤のための方法、並びに生物的及び非生物的ストレスに対する植物及び動物の防御及び治療としての使用に関する。
[001] 本開示は、組成物の分野に広く関連し、特に、硫酸化ガラクトースを含む組成物、それらの製剤のための方法、並びに生物的及び非生物的ストレスに対する植物及び動物の防御及び治療としての使用に関する。
発明の背景
[002] 植物であれ動物であれ、生物は常に生物的ストレス及び非生物的ストレスの両方から絶えず脅威にさらされている。生物的ストレスは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、昆虫、雑草、他の植物又は動物などの別の生物によって生物に与えられた何らかの損傷から生じる有害作用である。非生物的ストレスには、温度、湿度、塩分、日光などの非生物的要因による特定の環境における生物への悪影響が含まれる。植物の場合、世界の農業生産性の約２０～４０％の直接的な収量損失は、様々な生物的ストレスによって引き起こされると推定されている（Savary et al., Food Sec. 2012; 4:519）。動物はまた、生物的ストレスと非生物的ストレスの両方から絶えず脅威にさらされている。たとえば、養殖エビにおけるホワイトスポット病（white spot virus disease）の蔓延は、その発生後、世界で数十億ドルの損失を引き起こした（Lightner, D. V.2003）。
[002] 植物であれ動物であれ、生物は常に生物的ストレス及び非生物的ストレスの両方から絶えず脅威にさらされている。生物的ストレスは、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、昆虫、雑草、他の植物又は動物などの別の生物によって生物に与えられた何らかの損傷から生じる有害作用である。非生物的ストレスには、温度、湿度、塩分、日光などの非生物的要因による特定の環境における生物への悪影響が含まれる。植物の場合、世界の農業生産性の約２０～４０％の直接的な収量損失は、様々な生物的ストレスによって引き起こされると推定されている（Savary et al., Food Sec. 2012; 4:519）。動物はまた、生物的ストレスと非生物的ストレスの両方から絶えず脅威にさらされている。たとえば、養殖エビにおけるホワイトスポット病（white spot virus disease）の蔓延は、その発生後、世界で数十億ドルの損失を引き起こした（Lightner, D. V.2003）。
[003] 病原菌（細菌、ウイルス、真菌）に関して、並びに土地の耕作及び動植物の繁殖という点で農業生活に影響を与える環境条件の変化に関して、ますます進化する脅威がある。しかし、合成化学物質の使用の直接的な制御か、育種及びトランスジェニックアプローチによって植物及び動物の病原体耐性／抵抗性品種を開発することを使用した、作物及び家畜の保護及び処置の従来の方法は、それらに対抗する能力が高まっている病原体の進化による、より複雑で困難な問題に直面している。
[004] さらに、合成化学物質の使用は生産される食品の量に革命をもたらしたが、耐性に対抗するために使用する必要のある量が増加すると、植物ベースであろうと動物ベースであろうと、最終食品において、化学物質の残留レベルが高くなる。全体的な食物連鎖及び生態系は、適切で持続可能な対策なしに影響を受けている。
[005] 或いは、トランスジェニック作物及び動物は未だ多くの発展途上国で採用されていない一方、前述の急速に進化する病原体の範囲により、新しく育種された抵抗性品種は、短期間で感受性になる。
[006] こうして、作物及び家畜の保護及びリハビリテーションのための新規な天然の解決策を開発するというこの切実なニーズに対処するという、根本的な機会が生じた。そのような新規な代替的解決策は、作物及び生計の活性化及び保護への既存のアプローチを追加的に補完し得る。さらに、そのような天然組成物は、環境に優しく、一貫して有効であり、世界中でのより広く、より受け入れられる使用につき成功を再現するのがより容易であることにおいて、有利である。
[007] Patier et. al., Plant Science 110-(1995) 27-35は、酵素加水分解によって調製されたカラギーナンオリゴ糖を開示しており、ここで、オリゴマーは、ＤＰ２（四糖）からＤＰ７までの範囲の重合度（ＤＰ＝ｎ）を有する、Ｄ－３，６－アンヒドロ－α＋－Ｄ－ガラクトピラノシル（１－３）－Ｏ－８－Ｄ－ガラクトピラノシル－４－硫酸塩、（ネオカラビオース）の繰り返し単位からなり、これは、カラギーナンの酵素加水分解によって得られ、セイヨウヤブイチゴ（Rubus Fruticosus）の植物防御酵素の活性を誘発することを示した。この開示を読み、図２及び３（３０ページ、２列目）及び図４（３１ページ、１列目）を参照すると、高分子量の六糖類（ＤＰ３）は、低分子量の四糖類（ＤＰ２）よりも活性が高いように見えるだろう。
[008] Vera et. al., Physiological and Molecular Plant Pathology (2011) 12(5) 437-447は、８，５００Ｄａのオリゴ硫酸化ガラクタン（Poly-Ga）が、ワクチン接種効果を模倣して、タバコ植物のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に対して、用量依存的、処置数依存的、及び長期的な防御を誘導することを開示している。さらに、Vera et. al., Physiological and Molecular Plant Pathology 79 (2012) 31-39は、約２０単位の硫酸化ガラクトースに対応する１０，０００Ｄａのオリゴカラギーナンカッパ２、ラムダ及びイオタが、タバコ植物（var.Xanthi）の病原体に対する長期的且つ広範囲な保護を誘導すると説明している。
[009] Kalitnik et. al., J Appl Phycol (2013) 25:65-72は、異なるカラギーナンタイプの低分子誘導体及びそれらの抗ウイルス活性を開示している。Kalitnik et. al.には、分子量が１２００Ｄａ～４３００Ｄａの範囲のカラギーナンの誘導体を異なる方法で得ることができると記載されている。さらに、Kalitnik et. al.は、ＴＭＶに対する高分子量カラギーナンオリゴ糖の抗ウイルス活性がそれらの低分子量誘導体の抗ウイルス活性よりも高かったことを教示している（７０ページ、１列目、第２段落全体、及び７０ページ、２列目、最終段落）。
[0010] 動物の場合では、Chen et. al.（Aquaculture 2008）は、エビに様々なタイプのカラギーナンポリマーを注入すると、未処置のエビと比較して、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）感染に対する耐性の増加が観察されたと報告した。別の刊行物、Chen et. al.(Fish & Shellfish Immunol, 2014)は、バナメイエビ（Litopenaeus vannamei）に与える飼料に、Gracilaria tenuistipitataの熱水抽出物（硫酸化多糖）を含めることで、前記チャレンジ試験を行った場合、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）及び白点病ウイルスに対する抵抗性が改善することを報告した。Cheng et. al.の研究（Fish Shellfish Immunol 2007）によると、イオタカラギーナンを魚に腹腔内注射した後、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）（細菌）を用いたチャレンジ試験を行った場合、未処置の魚と比較して高い生存率を示すことを示した。さらに、抗生物質は細菌感染に対して効果的である一方、抗生物質は非常に低用量で投与される場合、成長促進剤として使用されてきた。家畜、鳥、その他の水生動物の集約養殖による抗生物質成長促進剤の使用横行により、新しい抗生物質耐性菌株が出現している（M K Chattopadhayay et. al., Front Microbiol.2014; 5:334, Y Mehdi et. al., Anim Nutrition 2018）。これは、自然な方法で動物の健康を改善することができ、環境及び消費者に優しい代替製品で対処する必要がある、別の問題である。
[0011] これまでの段落で述べた先行技術を考慮すると、環境に優しく、効果的であると同時に、生物的及び非生物的ストレスに対する植物及び動物の保護及び治療に役立つよう液体又は固体の形態で調剤できる天然物及び組成物を見出すことが切実に求められていることは明らかである。このような組成物は、長期使用のための農業実務において、作物及び家畜のための、望ましい持続可能でありながら生態学的に配慮した保護を提供する。
発明の概要
[0012] 本開示の一態様では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物が提供される。
[0012] 本開示の一態様では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物が提供される。
[0013] 本開示の第２の態様では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供される。
[0014] 本開示の第３の態様では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：５～５０：１の範囲の重量比を有する。
[0015] 本開示の第４の態様では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）HMFのような少なくとも１つの糖の誘導体を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖誘導体成分は、９：１～２：１の範囲の重量比を有する。
[0016] 本開示の第５の態様では、（ａ）多糖の混合物を有する物質を水と接触させてスラリーを得ること；及び（ｂ）加水分解によりスラリーを解重合して組成物を得ることを含む組成物を調製するためのプロセスが提供される。
[0017] 本開示の第６の態様では、植物の処置及び／又は保護のための組成物の使用が提供される。
[0018] 本開示の第７の態様では、動物の処置及び／又は保護のための組成物の使用が提供される。
[0019] 本開示の第８の態様では、植物を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を植物又は植物の一部と接触させることを含む。
[0020] 本開示の第９の態様では、動物を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を動物又は動物の部分に投与することを含む。
[0021] 本開示の第１０の態様では、植物を治療するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を植物又は植物の一部と接触させることを含む。
[0022] 本開示の第１１の態様では、動物を治療するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を動物又は動物の部分と接触させることを含む。
[0023] 本開示の第１２の態様では、植物を感染から保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[0024] 本開示の第１３の態様では、植物防御経路を活性化させるための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[0025] 本開示の第１４の態様では、感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[0026] 本開示の第１５の態様では、感染した植物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[0027] 本開示の第１６の態様では、感染した動物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[0028] 本開示の第１７の態様では、動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[0029] 本主題のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲を参照することにより、よりよく理解されるであろう。この概要は、簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供される。この概要は、特許請求された主題の主要な特徴又は本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、特許請求された主題の範囲を限定するために使用することを意図したものでもない。
添付図面の簡単な説明
[0030] 以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の態様をさらに説明するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによって、よりよく理解され得る。
[0030] 以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の態様をさらに説明するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによって、よりよく理解され得る。
発明の詳細な説明
[0049] 当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外に、変形及び修正に供されることを認識するであろう。本開示は、そのような全ての変形及び修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書において個別に又は集合的に言及又は示される、そのような全てのステップ、特徴、組成物、及び化合物、並びにそのようなステップ又は特徴のいずれか又は複数の任意及び全ての組み合わせを含む。
[0049] 当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外に、変形及び修正に供されることを認識するであろう。本開示は、そのような全ての変形及び修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書において個別に又は集合的に言及又は示される、そのような全てのステップ、特徴、組成物、及び化合物、並びにそのようなステップ又は特徴のいずれか又は複数の任意及び全ての組み合わせを含む。
[0050] 本開示で使用される配列
[0051] 配列番号１は、ＰＲＳＶ ＮｉＢ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー配列を示す。
ＡＧＴＣＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴ
ＡＧＴＣＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴ
[0052] 配列番号２は、ＰＲＳＶ ＮｉＢ遺伝子を増幅するためのリバースプライマー配列を示す。
ＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡ
ＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡ
[0053] 配列番号３は、ＰＤＦ１．２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー配列を示す。
ＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣ
ＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣ
[0054] 配列番号４は、ＰＤＦ１．２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー配列を示す。
ＡＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧ
ＡＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧ
[0055] 配列番号５は、ＶＳＰ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー配列を示す。
ＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣ
ＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣ
[0056] 配列番号６は、ＶＳＰ遺伝子を増幅するためのリバースプライマー配列を示す。
ＧＣＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡ
ＧＣＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡ
[0057] 配列番号７は、ＰＲ １遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー配列を示す。
ＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧ
ＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧ
[0058] 配列番号８は、ＰＲ １遺伝子を増幅するためのリバースプライマー配列を示す。
ＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧ
ＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧ
定義
[0059] 便宜上、本開示のさらなる説明の前に、本明細書で使用される特定の用語、及び例をここに詳述する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読み、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜上及び完全を期すために、特定の用語及びそれらの意味を以下に記載する。
[0059] 便宜上、本開示のさらなる説明の前に、本明細書で使用される特定の用語、及び例をここに詳述する。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読み、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜上及び完全を期すために、特定の用語及びそれらの意味を以下に記載する。
[0060] 冠詞「a」、「an」、及び「the」は、冠詞の文法的目的語の１つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
[0061] 「含む（comprise）」及び「含んでいる（comprising）」という用語は、包括的でオープンな意味で使用され、追加の要素が含まれ得ることを意味する。これは、「のみからなる」と解釈されることを意図したものではない。
[0062] 本明細書全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「含む（comprise）」という語、並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載された要素若しくはステップ又は要素若しくはステップの群を含むことを意味するが、他の要素若しくはステップ又は要素若しくはステップの群を除外しないことを意味すると理解される。
[0063] 「含む（including）」という用語は、「含むがこれに限定されない」を意味するために使用される。「含む」と「含むがこれに限定されない」は互換的に使用される。
[0064] 本開示の目的のために、「少なくとも１つの糖成分」という用語は、一般技術で知られている任意の糖成分及びそれらの糖の任意の塩又は誘導体を包含することを意図している。塩には、既存の技術において一般的に知られている糖の塩が含まれる。糖の誘導体には、加水分解のプロセスで形成されるヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）のような誘導体が含まれる。「全糖含有量」は、硫酸化ガラクトース、並びに本開示に開示されるように組成物の少なくとも１つの糖成分及び糖成分の誘導体を包含することを意図している。「全糖含有量」は、一般に、本開示で言及されるアントロン硫酸試験などの標準試験を使用して検出することができる、組成物中の全ての可溶性炭水化物又は糖を指す。「少なくとも１つの硫酸化ガラクトース」という用語は、単糖成分及びガラクトース部分の全ての可能なスルホニル化を包含することを意図しており、これはガラクトース部分の１か所、２か所、又は３か所であり得る。さらに、これは、異なる位置でスルホン化された硫酸化ガラクトースの混合物を包含することを意図している。「多糖」という用語は、様々な重合度（ＤＰ）における単糖の順列及び組み合わせを包含することを意図している。「動物飼料」という用語は、家畜として飼育下で繁殖される動物に与えることができる全ての可能な飼料を包含することを意図している。動物という用語には、家禽、魚、エビ、牛、その他の水生動物、家畜、昆虫、哺乳動物、爬虫類、及びげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。「硫酸化ガラクトース」及び「ガラクトース硫酸塩」という用語は、互換的に理解されるべきである。「植物」という用語は、本開示の組成物及び硫酸化ガラクトースと接触させることができる、当技術分野で一般的に知られている全てのタイプの植物を含むことを意図している。本開示の組成物に関連する「乾燥形態」という用語は、１０％ｗ／ｗを超えるレベルの水分を有しない組成物に関する。
[0065] 特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本開示の実施又は試験において使用することができるが、ここで、好ましい方法及び材料を記載する。本明細書において言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0066] 比率、濃度、量、及び他の数値データは、範囲形式で本明細書に提示され得る。このような範囲形式は、単に便宜上及び簡潔にするために使用され、範囲の限界として明示的に記載されている数値を含むだけでなく、各数値及び部分範囲が明示的に記載されているかのように、その範囲内に含まれる全ての個々の数値又は部分範囲も含むように柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。
[0067] 背景のセクションで言及された先行技術に照らすと、植物又は動物の保護及び治療効果について単糖ガラクトース硫酸塩が豊富な製剤をこれまでに試験した先行技術はないことは明らかである。
[0068] さらに、上記の全ての文献を読むと、当業者は、高分子量のカラギーナンオリゴ糖がそれらの植物保護効果において最も効果的であり、したがって、代替物、特に糖ヒエラルキーの凝縮おいて最も低いにもの、即ち単糖に基づくものを探索するいかなる動機にも欠けると結論づけるであろう。さらに、上記の文献はいずれも、単糖ガラクトース硫酸塩単独又は前記単糖を主に含む組成物が、植物又は動物の保護及び／又は治療効果を有し得ることを示唆するものではない。絶えず進化し変化するストレス状況に直面する生物的及び非生物的ストレスから作物及び家畜を保護及び治療するための当技術分野で知られている従来の方法又はトランスジェニックアプローチに関連する欠点に照らし、本開示は、単糖ガラクトース硫酸塩が主に豊富な製剤を含む天然成分のユニークな組み合わせを提供し、これは、所定の重量濃度で組み合わせると、生物的及び非生物的ストレスと戦うための植物及び動物の免疫応答経路などの保護システムの活性化につながる予想外の驚くべき結果を提供する、保護及び治療組成物を提供する。さらに、このようなストレスに対するさらに効果的な防御は、特定の金属イオンなどの微量元素の添加によって生じる。本開示の単糖ガラクトース硫酸塩ベースの組成物を、サリチル酸などの天然の植物防御活性化剤及び／又はベータアミノ酪酸などのアミノ酸と組み合わせると、組み合わせ効果がさらに観察される。さらに、ＨＭＦのような加水分解条件の結果として時々形成される糖の誘導体は、それ自体で追加の保護効果を提供し得ることが示される。したがって、本開示は、生物的及び非生物的ストレッサーから植物及び動物を防御するための天然製剤の当技術分野におけるニーズに対処するための、効果的で環境に優しい解決策を提供する。さらに、当技術分野で知られている製剤は、硫酸化ガラクトースのオリゴ糖を含むものであっても、前記糖のオリゴマー化又は複雑性の増加に伴う、ストレッサーに対する保護的防御、例えば、抗ウイルス応答の有効性の増加を教示している。対照的に、本開示の組成物及び製剤は、植物であれ動物であれ、生物の生物的及び非生物的ストレッサーに対する強力な防御を実装する際の単糖ガラクトース硫酸塩ベースの組成物の効果を予想外に実証することによって課題を解決する。
[0069] さらに、本開示は、規制当局の承認を受けやすい液体又は固体のいずれかの形態での使用のための、ユニークで、十分に特徴付けられ、再現性が高く、均一でスケーラブルな組成物を提供するという利点を有する。本開示はまた、生物的及び非生物的ストレスに対して予想外の驚くべき効果を有する、容易に同定できるがユニークで新規の有効成分（単糖ガラクトース硫酸塩）とともに、市販製品として販売するのに許容できる均一性を備えた使いやすさを持つ組成物を提供する。
[0070] 背景のセクションで言及された先行技術はいずれも、それらの植物保護効果について単糖ガラクトース硫酸塩が豊富な製剤を具体的に試験したことはない。また、カラギーナンオリゴ糖を調製するために先行技術の研究者らによって使用された方法のいくつかは、ガラクトース硫酸塩の形成をもたらさなかったか、又は非常に低分子量の化合物、ガラクトース－４－硫酸塩（ＭＷ２８２ ＣＡＳ番号１２５１１３－６８－０）又はガラクトース６－硫酸塩（ＭＷ２８２ ＣＡＳ番号１２５４５５－６２－１）又はガラクトース－２，６－二硫酸塩（ＭＷ３４０）の濃度を除去又は低減した可能性がある。例えば、Patier et. al.は、繰り返し二糖単位（κ－カラビオース）の倍数でオリゴ糖を生成することが主に知られており、単糖を生成することは知られていない、カッパカラギーナンを解重合するために、酵素的方法を使用している。実際、Patier et.Al.がその刊行物で報告した最小単位は、κ－カラビオースの２つの繰り返し単位で構成される四糖（ＤＰ２と呼ばれる）であった。
[0071] Vera et. al.は、Zuniga et. al.(2006)(Preparation of a low molecular weight fraction by free radical depolymerization of the sulphated galactan from Schyzimenia binderi (Gigartinales, Rodophyta) and its anticoagulant activity.Carbohydr.Polym.66, 208-215.)の方法を使用している。Zuniga et. al.(2006)の方法は、解重合されたカラギーナンを、３，５００ＭＷカットオフの透析膜（３，５００未満の全ての分子量を除去する）を通して広範囲に透析し、その後、残りの材料をさらなる目的に使用することを含んでいた。Vera et. al.(2012)は、単糖の広範な形成を生じなかった可能性のある、６０℃で４５分間、０．１ＮのＨＣｌを使用した、比較的穏やかな酸加水分解条件を使用した。実際、Vera et. al.は、その調製物を具体的に分析し、分子量が平均して１０，０００ダルトンであると決定した。同様に、Kalitnik et. al.(2013)は、Yu et. al.(2002 - Structural studies on κ-carrageenan derived oligosaccharides.Carbohydr Res 337:433-440)の方法を使用しており、これは、６０℃で４時間、０．１Ｎ ＨＣｌを使用した、酸加水分解を使用するものであった。Yu et. al.(2002)の図１のとおり、これらの条件下で生成された最低分子量が２６６０ダルトン以上であったことは興味深い。これは、６０℃で４５分間、０．１ＮのＨＣｌを使用した、比較的穏やかな酸加水分解条件を使用した、Vera et. al.(2012)とも一致している。実際、Vera et. al.は、その調製物を具体的に分析し、分子量が平均して１０，０００ダルトンであると決定しており、これは、そこで使用されている比較的穏やかな条件と一致する。
[0072] したがって、上記の研究者はいずれも、全糖の主成分が分子量で４００Ｄａ未満であるカラギーナン加水分解物を調製及び試験していなかった可能性がある。
[0073] 動物の場合では、Chen et. al.（Aquaculture 2008）は、エビに様々なタイプのカラギーナンポリマーを注入すると、未処置のエビと比較して、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（細菌性）感染に対する耐性の増加が観察されたと報告した。別の刊行物、Chen et. al.（Fish & Shellfish Immunol, 2014）は、バナメイエビ（Litopenaeus vannamei）に与える飼料に、Gracilaria tenuistipitata（硫酸化多糖）の熱水抽出物を含めることで、前記チャレンジ試験を行った場合、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）及び白点病ウイルスに対する抵抗性が改善することを報告した。Cheng et. al.の研究（Fish Shellfish Immunol 2007）によると、イオタカラギーナンを魚に腹腔内注射した後、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）（細菌）を用いたチャレンジ試験を行った場合、未処置の魚と比較して高い生存率を示すことを示した。これら全ての場合において、多糖の解重合は行われなかった。したがって、これらの多糖の分子量は４００Ｄａよりはるかに大きくなる。
[0074] これら全ての研究において、単糖ガラクトース硫酸塩を単独で、又は他のオリゴ糖硫酸塩と組み合わせて、同様の効果を達成できるという示唆はなく、たとえあったとしても、より高いヒエラルキーの糖というアイデアがより良い保護に関連付けられている。
[0075] 本開示は、例示のみを目的とする、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。機能的に同等の製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されているように、明らかに本開示の範囲内にある。
[0076] 本開示に開示される組成物は、硫酸化ガラクトースを含む。別の態様では、組成物は、硫酸化ガラクトース及び少なくとも１つの糖成分又は糖の誘導体を含む。別個の態様では、少なくとも１つの糖成分は、二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。少なくとも１つの糖成分は、二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの組み合わせの硫酸化塩からなる群から選択される。本開示の組成物は、硫酸化ガラクトースが豊富な組成物を開示する。
[0077] 本開示の一実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物が提供される。
[0078] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供される。本開示の別の実施形態では、少なくとも１つの糖成分は、カラビオース、カラトリオース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[0079] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩を含む。ガラクトースのスルホニル化の他の全ての可能な組み合わせもまた、本開示の範囲に含まれることが企図され得る。
[0080] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖、又は糖の誘導体、を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩を含む。
[0081] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖、又は糖の誘導体、を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩、Ｄ－ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩、及びＤ－ガラクトース－６－Ｏ－硫酸塩を含む。本開示の別の実施形態において、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩、Ｄ－ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩、及びＤ－ガラクトース－６－Ｏ－硫酸塩を、１～１００：１～１００：１～１００の重量比で含む。
[0082] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖、又は糖の誘導体、を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、Ｄ－ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩、及びＤ－ガラクトース－２，６－二硫酸塩を含む。本開示の別の実施形態において、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、Ｄ－ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩、及びＤ－ガラクトース－２，６－二硫酸塩を、１００：１～１：１００の重量比で含む。
[0083] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、組成物は、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、レブリン酸、ギ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される糖類の少なくとも１つの誘導体をさらに含む。
[0084] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、全糖含有量に対して１５～９０％の範囲の重量パーセントを有する。別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、全糖含有量に対して１８～８８％の範囲の重量パーセントを有する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、全糖含有量に対して２０～７５％の範囲の重量パーセントを有する。
[0085] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、少なくとも１つの糖は、カッパ－カラビオース、カッパ－カラトリオース、カッパ－カラテトラオース、イオタ－カラビオース、イオタ－カラトリオース、イオタ－カラテトラオース、ラムダ－カラビオース、ラムダ－カラトリオース、ラムダ－カラテトラオース及びそれらの塩又はＨＭＦのような糖の誘導体からなる群から選択される。
[0086] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、２５～１２０ｇ／ｌの範囲の全糖含有量を有する。別の実施形態では、組成物は、３０～１１０ｇ／ｌの範囲の全糖含有量を有する。さらに別の実施形態では、組成物は、３５～１００ｇ／ｌの範囲の全糖含有量を有する。代替の実施形態では、組成物は、４０～１００ｇ／ｌの範囲の全糖含有量を有する。
[0087] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、粉末組成物は、１００～５００ｇ／ｋｇの範囲の全糖含有量を有する。
[0088] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、組成物は、１００～６００ｇ／ｋｇの範囲の全糖含有量を有する粉末形態である。別の実施形態では、組成物は、１５０～５００ｇ／ｋｇの範囲の全糖含有量を有する粉末形態である。さらに別の実施形態では、組成物は、１５０～４５０ｇ／ｋｇの範囲の全糖含有量を有する粉末形態である。代替の実施形態では、組成物は、２００～４５０ｇ／ｋｇの範囲の全糖含有量を有する粉末形態である。
[0089] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、溶媒、希釈剤、乳化剤、安定化剤、動物飼料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに含む。
[0090] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、組成物の全固形分（水分を除く）の５～９０％の範囲の重量パーセントを有する少なくとも１つの硫酸化ガラクトース又は少なくとも１つの糖を含む。
[0091] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、組成物の全固形分の５～９０％の範囲の重量パーセントを有する。別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、組成物の全固形分の１０～８５％の範囲の重量パーセントを有する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、組成物の全固形分の２０～８５％の範囲の重量パーセントを有する。代替の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、組成物の全固形分の３０～８５％の範囲の重量パーセントを有する。
[0092] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：５～５０：１の範囲の重量比を有する。
[0093] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：５～５０：１の範囲の重量比を有する。別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：１～４５：１の範囲の重量比を有する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：１～４０：１の範囲の重量比を有する。代替の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、５：１～３５：１の範囲の重量比を有する。
[0094] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：５～５０：１の範囲の重量比を有する。別の実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対少なくとも１つの糖成分は、１：５～４０：１、又は１：２～３５：１、又は１：１～３０：１、又は２：１～２８：１、又は５：１～２５：１、又は７：１～２２：１、又は１０：１～２０：１、又は１１：１～１７：１の範囲の重量比を有する。
[0095] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び（ｂ）ＨＭＦのような少なくとも１つの糖の誘導体を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対ＨＭＦのような少なくとも１つの糖誘導体成分は、９：１～２：１の範囲の重量比を有する。
[0096] 本開示の一実施形態では、（ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；（ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖；及び（ｃ）ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、レブリン酸、ギ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される糖類の少なくとも１つの誘導体、を含む組成物が提供され、ここで、少なくとも１つの糖の誘導体対少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、９：１～２：１の範囲の重量比を有する。別の実施形態では、少なくとも１つの糖の誘導体対少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、７：１～１：１の範囲の重量比を有する。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの糖の誘導体対少なくとも１つの硫酸化ガラクトースは、６：１～１：１の範囲の重量比を有する。
[0097] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、微量元素、天然植物防御活性化因子、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む。
[0098] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、微量元素、天然植物防御活性化因子、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含み、ここで、微量元素は、ホウ素、亜鉛、鉄、マンガン、マグネシウム、モリブデン、カルシウム、カリウム、セレン、銅の組み合わせ及びそれらの塩からなる群から選択される。
[0099] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、微量元素、天然植物防御活性化因子、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含み、ここで、天然植物防御活性化因子は、サリチル酸、ベータアミノ酪酸、それらの塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[00100] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、カラギーナン又は処理されたキリンサイ（Eucheuma）又は半精製カラギーナンを処理することによって得られる。
[00101] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、カラギーナンを含有する紅藻を処理することによって得られる。本開示の別の実施形態では、カラギーナンを含有する海藻は、オオキリンサイ（Kappaphycus striatus）、キリンサイ属コットーニィ種（Eucheuma cottonii）、キリンサイ（Eucheuma denticulatum）（スピノサム）、ハリメニア・デュルビレア（Halymenia durvillaea）、ネッタイキリンサイ（Kappaphycus alvarezii）、ヤハズツノマタ（Chondrus crispus）、ソリエリア・コーダリス（Solieria chordalis）、ポルフィラ・プルプレア（Porphyra purpurea）、ユーチェエマ・イシフォルミス（Euchuema isiforme）、ヒプネア・ムシフォルミス（Hypnea musciformis）、ソリエリア・フィリフォルミス（Solieria filiformis）、マストカルプス・ステラタス（Mastocarpus stellatus）、マストカルプス・パピラートゥス（Mastocarpus papillatus）、ポルセラ・カペンシス（Porphyra capensis）、フルセラリア属（Furcerllaria spp）、スギノリ属（Gigartina）、オゴノリ属（Gracillaria）、イリデア属（Iridea spp）、アネセカ属（Anatheca spp）、トサカノリ属（Meristotheca spp）、アンフェルティア属（Ahnfeltia spp）、オキツノリ属（Gynmogongrus spp）、フィロフォラ属（Phyllophora spp）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[00102] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、生物的ストレスに対する植物の保護を提供する。
[00103] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物防御経路活性化因子としての使用のためのものである。
[00104] 本開示の一実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物を調製するためのプロセスが提供され、前記プロセスは、（ａ）多糖の混合物を有する物質を水と接触させてスラリーを得ること；及び（ｂ）加水分解によりスラリーを解重合して組成物を得ることを含む。本開示の別の実施形態では、物質は固体バイオマスである。
[00105] 本開示の一実施形態では、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物を調製するためのプロセスが提供され、前記プロセスは、（ａ）多糖の混合物を有する物質を水と接触させてスラリーを得ること；及び（ｂ）加水分解によりスラリーを解重合して組成物を得ることを含み、ここで、解重合は、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、スルファターゼ、アンヒドロガラクトースデヒドロゲナーゼ、α－アミラーゼ、カラギナーゼ、ヒドロラーゼ、スルフリラーゼ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の存在下で酵素加水分解を使用することによって行われる。
[00106] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物を調製するためのプロセスが提供され、前記プロセスは、（ａ）紅藻を水と接触させて、全固形分が５～２０％の範囲のスラリーを得ること；（ｂ）スラリーを、１．０～４．０の範囲のｐＨ、５０～１８０℃の範囲の温度、０．５～１０気圧の範囲の圧力で、１０分～５時間の範囲の時間で解重合して、加水分解物を得ること；（ｃ）任意選択により、加水分解物を濃縮して、１８～３５の範囲のブリックス値を有する糖濃度を達成して、組成物を得ること、又はｄ）任意選択により、それを乾燥させて、粉末組成物を得ることを含む。
[00107] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物を調製するためのプロセスが提供され、前記プロセスは、（ａ）カラギーナンを水と接触させて、全固形分が５～２０％の範囲のスラリーを得ること；（ｂ）スラリーを、１．０～４．０の範囲のｐＨ、５０～１８０℃の範囲の温度、０．５～１０気圧の範囲の圧力で、１０分～５時間の範囲の時間で解重合して、加水分解物を得ること；（ｃ）加水分解物を濃縮して、１８～３５の範囲のブリックス値を有する糖濃度を達成して、液体形態の組成物を得ること、又はｄ）任意選択により、液体形態を乾燥させて、粉末形態で組成物を得ることを含む。
[00108] 本開示の一実施形態では、植物の保護の処置のための、本明細書に記載されるような組成物の使用が提供される。
[00109] 本開示の一実施形態では、植物を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載されるような組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を植物又は植物の一部と接触させることを含む。本開示の別の実施形態では、組成物は、葉面散布、土壌散布、種子処置、植物組織への注入、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって植物と接触させる。
[00110] 本開示の一実施形態では、植物を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載されるような組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を植物又は植物の一部と接触させることを含み、ここで、接触させる組成物は、組成物に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。別の実施形態では、組成物は、接触させる組成物に対して１０ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。さらに別の実施形態では、接触させる組成物は、接触させる組成物に対して２０ｍｇ／Ｌ～１７０ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。代替の実施形態では、接触させる組成物は、接触させる組成物に対して３０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。
[00111] 本開示の一実施形態では、植物を処置するための方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載されるような組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を植物又は植物の一部と接触させることを含み、ここで、方法は、葉面散布によって組成物を植物と接触させることを含み、前記葉面散布は、５０～１０００ｍｌ／エーカーの作物の割合で組成物に接触させることを含む。本開示の別の実施形態では、葉面散布は植物の成長段階で行われ、散布は移植後１０～１５日で行われ、その後の散布は開花及び結実の開始まで１０～１５日の間隔で行われる。本開示の別の実施形態では、組成物は希釈され、植物の根域での滴下施用によって施用されるであろう。
[00112] 本開示の一実施形態では、植物を治療する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載されるような方法で植物を処置することを含む。
[00113] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような植物の処置方法が提供され、ここで、処置は、少なくとも１つの浸透剤と組み合わせて行われる。本開示の別の実施形態では、少なくとも１つの浸透剤は、陰イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本開示のさらに別の実施形態では、少なくとも１つの浸透剤は、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Brij 721、胆汁酸塩、ポリオキシルヒマシ油、ノニルフェノールエトキシレート、シクロデキストリン、レシチン、塩化メチルベンゼトニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
[00114] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような植物を処置するための方法が提供され、ここで、処置は、海藻抽出物、タンパク質加水分解物、フミン酸、フルボ酸、微生物抽出物、バイオ肥料などからなる群から選択される少なくとも１つのバイオエンハンサーと組み合わせて行われる。
[00115] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような植物を処置するための方法が提供され、ここで、処置は、殺真菌剤、殺虫剤、微生物抽出物、及びバクテリア、真菌、ウイルス、バクテリオファージなどを含む微生物からなる群から選択される少なくとも１つの植物保護剤と組み合わせて行われる。
[00116] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、動物の健康保護のために使用される。
[00117] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物防御経路活性化因子として使用される。
[00118] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、動物を治療するために使用される。
[00119] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、動物を処置するために使用される。
[00120] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物を生物的ストレスから保護するために使用される。
[00121] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物を生物的ストレスから保護するために使用され、ここで、組成物は、植物又は植物の部分と接触させる組成物に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。
[00122] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物を非生物的ストレスから保護するために使用される。
[00123] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物を非生物的ストレスから保護するために使用され、ここで、組成物は、植物又は植物の部分と接触させる組成物に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。
[00124] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物を感染から保護するために使用される。
[00125] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、植物を感染から保護するために使用され、ここで、組成物は、接触させる組成物に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。
[00126] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物で動物を処置するための方法が提供され、前記プロセスは、（ａ）本明細書に記載されるような組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を動物に投与することを含む。本開示の別の実施形態では、投与は、飼料注入、動物によって使用される水への添加、局所適用、及び組成物の注射を含む。
[00127] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物で動物を処置するための方法が提供され、前記プロセスは、（ａ）本明細書に記載されるような組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を動物に投与することを含み、ここで、組成物は、動物に与えられる飼料に対して少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。別の実施形態では、組成物は、動物に与えられる飼料に対して１０ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。さらに別の実施形態では、組成物は、動物に与えられる飼料に対して３０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。代替の実施形態では、組成物は、動物に与えられる飼料に対して５０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。
[00128] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物で動物を処置するための方法が提供され、前記プロセスは、（ａ）本明細書に記載されるような組成物を得ること；及び（ｂ）組成物を動物に投与することを含み、ここで、組成物は、動物を生育する養殖用水に対して少なくとも３０ｍｇ／メートルトンの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。別の実施形態では、組成物は、動物を生育する養殖用水に対して３０ｍｇ／メートルトン～４００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。さらに別の実施形態では、組成物は、動物を生育する養殖用水に対して４０ｍｇ／メートルトン～３００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。代替の実施形態では、組成物は、動物を生育する養殖用水に対して５０ｍｇ／メートルトン～２００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む。
[00129] 本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるような組成物が提供され、ここで、組成物は、増粘剤、乳化剤（emulsifying agent）、乳化剤（emulsifier）、安定化剤、懸濁剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む。
[00130] 本開示の一実施形態では、植物を感染から保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[00131] 本開示の一実施形態では、植物を感染から保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、本明細書に記載されるような任意の形態の硫酸化ガラクトースを指す。
[00132] 本開示の一実施形態では、植物を感染から保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩である。
[00133] 本開示の一実施形態では、植物を感染から保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１０ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／Ｌ～４００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する。
[00134] 本開示の一実施形態では、植物を感染から保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する。１０ｍｇ／ＬのＧａｌ－Ｓを超える全ての範囲は、本明細書に記載されるような使用のための開示と見なされることが意図され得、Ｇａｌ－Ｓの濃度は、１０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌ、又は２０ｍｇ／Ｌ～１８０ｍｇ／Ｌ、又は３０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌ、又は４０ｍｇ／Ｌ～１４０ｍｇ／Ｌ、又は４５ｍｇ／Ｌ～１２５ｍｇ／Ｌ、又は７５ｍｇ／Ｌ～１２０ｍｇ／Ｌの範囲である。
[00135] 本開示の一実施形態では、植物防御経路を活性化させるための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[00136] 本開示の一実施形態では、植物防御経路を活性化させるための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、本明細書に記載されるような任意の形態の硫酸化ガラクトースを指す。
[00137] 本開示の一実施形態では、植物防御経路を活性化させるための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩である。
[00138] 本開示の一実施形態では、植物防御経路を活性化させるための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１０ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／Ｌ～４００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度を有する。
[00139] 本開示の一実施形態では、植物防御経路を活性化させるための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する。１０ｍｇ／ＬのＧａｌ－Ｓを超える全ての範囲は、本明細書に記載されるような使用のための開示と見なされ得ることが意図され、Ｇａｌ－Ｓの濃度は、１０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌ、又は２０ｍｇ／Ｌ～１８０ｍｇ／Ｌ、又は３０ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌ、又は４０ｍｇ／Ｌ～１４０ｍｇ／Ｌ、又は４５ｍｇ／Ｌ～１２５ｍｇ／Ｌ、又は７５ｍｇ／Ｌ～１２０ｍｇ／Ｌの範囲である。
[00140] 本開示の一実施形態では、感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[00141] 本開示の一実施形態では、感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、本明細書に記載されるような任意の形態の硫酸化ガラクトースを指す。
[00142] 本開示の一実施形態では、感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩である。
[00143] 本開示の一実施形態では、感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物に与えられる飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。
[00144] 本開示の一実施形態では、感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物に与えられる飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する。１０ｍｇ／ｋｇのＧａｌ－Ｓを超える全ての範囲は、本明細書に記載されるような使用のための開示と見なされることが意図され、Ｇａｌ－Ｓの濃度は、１０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇ～４５０ｍｇ／ｋｇ、又は３０ｍｇ／ｋｇ～４２０ｍｇ／ｋｇ、又は４０ｍｇ／ｋｇ～３５０ｍｇ／ｋｇ、又は、５０ｍｇ／ｋｇ～２５５ｍｇ／ｋｇ、又は７５ｍｇ／ｋｇ～２１５ｍｇ／ｋｇ、又は１００ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、又は１２０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
[00145] 本開示の一実施形態では、感染した植物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[00146] 本開示の一実施形態では、感染した植物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、本明細書に記載されるような任意の形態の硫酸化ガラクトースを指す。
[00147] 本開示の一実施形態では、感染した植物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩である。
[00148] 本開示の一実施形態では、感染した植物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物に与えられる飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。
[00149] 本開示の一実施形態では、感染した植物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物に与えられる飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する。１０ｍｇ／ｋｇのＧａｌ－Ｓを超える全ての範囲は、本明細書に記載されるような使用のための開示と見なされることが意図され、Ｇａｌ－Ｓの濃度は、１０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇ～１８０ｍｇ／ｋｇ、又は３０ｍｇ／ｋｇ～１５０ｍｇ／ｋｇ、又は４０ｍｇ／ｋｇ～１４０ｍｇ／ｋｇ、又は４５ｍｇ／ｋｇ～１２５ｍｇ／ｋｇ、又は７５ｍｇ／ｋｇ～１２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
[00150] 本開示の一実施形態では、感染した動物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[00151] 本開示の一実施形態では、感染した動物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、本明細書に記載されるような任意の形態の硫酸化ガラクトースを指す。
[00152] 本開示の一実施形態では、感染した動物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩である。
[00153] 本開示の一実施形態では、感染した動物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。
[00154] 本開示の一実施形態では、感染した動物を処置するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物を生育する養殖用水の少なくとも３０ｍｇ／メートルトンの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、３０ｍｇ／メートルトン～５００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／メートルトン～４００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１００ｍｇ／メートルトン～３００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する。
[00155] 本開示の一実施形態では、動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための硫酸化ガラクトースの使用が提供される。
[00156] 本開示の一実施形態では、動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、本明細書に記載されるような任意の形態の硫酸化ガラクトースを指す。
[00157] 本開示の一実施形態では、動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、ガラクトース－４－硫酸塩である。
[00158] 本開示の一実施形態では、動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度を有する。
[00159] 本開示の一実施形態では、動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための硫酸化ガラクトースの使用が提供され、ここで、硫酸化ガラクトースは、動物を生育する養殖用水の少なくとも３０ｍｇ／メートルトンの濃度を有する。別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、３０ｍｇ／メートルトン～５００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する。さらに別の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、５０ｍｇ／メートルトン～４００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する。代替の実施形態では、硫酸化ガラクトースは、１００ｍｇ／メートルトン～３００ｍｇ／メートルトンの範囲の濃度を有する。
[00160] 主題は、特定の例及びその実施を参照して相当詳細に説明されてきたが、他の実施も可能である。
実施例
[00161] ここで、本開示は、実施例を用いて説明され、これは、開示の実施を説明することを意図したものであり、本開示の範囲に何らかの制限を暗示することを限定的に意図するものではない。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、開示される方法及び組成物の実施に際して使用することができるが、例示的な方法、機器及び材料は、本明細書に記載される。本開示は、特定の方法、及び記載された実験条件に限定されず、そのような方法及び条件が適用され得ることを理解されたい。
[00161] ここで、本開示は、実施例を用いて説明され、これは、開示の実施を説明することを意図したものであり、本開示の範囲に何らかの制限を暗示することを限定的に意図するものではない。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、開示される方法及び組成物の実施に際して使用することができるが、例示的な方法、機器及び材料は、本明細書に記載される。本開示は、特定の方法、及び記載された実験条件に限定されず、そのような方法及び条件が適用され得ることを理解されたい。
作動中の実施例
実施例１：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のスクレロティニア（Sclerotinia）感染症
[00162] 本実験は４つの処置で実施された。使用した製品は、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と呼ばれる全糖成分の２０％として硫酸化ガラクトース（Ｇａｌ－Ｓ、単糖）を含有する液体製剤であった。葉面散布として使用するために、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を、最終濃度を２、３、及び４ｍＬ／Ｌにするために、水で希釈した。４つの群（処置及び対照）のそれぞれで６つの植物を試験した。モデル植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は、泥炭ペレット上で成長させ、病原体感染の２４時間前に、前述の希釈製品（又は、対照として水）を葉面散布した。処置の２４時間後、各植物は、２つの別々の葉に真菌スクレロティニア（Sclerotinia）spに均等に感染させた。感染の４８時間後に、感染部位周囲の病変の面積を、ノギスを使用して測定した。本開示の図１は、未処置対照群と比較した処置群において、病原体により引き起こされた病変が、未処置対照と比較した場合、４４％減少したことを示す（図１参照）。したがって、本開示は、単糖硫酸化ガラクトースベース製剤を開示し、この製剤での処置は、植物に適用した場合、真菌病原体の拡散を効果的に制御することができる。
実施例１：シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のスクレロティニア（Sclerotinia）感染症
[00162] 本実験は４つの処置で実施された。使用した製品は、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と呼ばれる全糖成分の２０％として硫酸化ガラクトース（Ｇａｌ－Ｓ、単糖）を含有する液体製剤であった。葉面散布として使用するために、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を、最終濃度を２、３、及び４ｍＬ／Ｌにするために、水で希釈した。４つの群（処置及び対照）のそれぞれで６つの植物を試験した。モデル植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は、泥炭ペレット上で成長させ、病原体感染の２４時間前に、前述の希釈製品（又は、対照として水）を葉面散布した。処置の２４時間後、各植物は、２つの別々の葉に真菌スクレロティニア（Sclerotinia）spに均等に感染させた。感染の４８時間後に、感染部位周囲の病変の面積を、ノギスを使用して測定した。本開示の図１は、未処置対照群と比較した処置群において、病原体により引き起こされた病変が、未処置対照と比較した場合、４４％減少したことを示す（図１参照）。したがって、本開示は、単糖硫酸化ガラクトースベース製剤を開示し、この製剤での処置は、植物に適用した場合、真菌病原体の拡散を効果的に制御することができる。
実施例２：トマト株におけるトマト輪紋病菌（Alternaria solani）感染スコアリングアッセイ
[00163] 本実験は２つの処置で実施された。使用した製品は、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と呼ばれるＧａｌ－Ｓを含有する液体製剤であった。葉面散布として使用するために、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を（最終濃度を４ｍＬ／Ｌ）水で希釈した。希釈した製品（４ｍＬ／Ｌ）及び対照（水）を、群あたり６つのトマト株に使用した。ポットで育ったトマト株に、感染の２４時間前に希釈したＧａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤（又は対照として水）を散布した。その上で、各植物は、葉全体に夏疫病菌（A.solani）胞子（１ｍＬあたり２Ｘ１０＾３）を均等に感染させた。周囲の湿度を維持するために、全ての植物を透明なポリエチレンカバーで覆い、１週間成長させた。感染の重症度を、０～５の評価尺度を使用して採点した（Pandey et al.,(2003),364-371）。明らかに、症状の重症度は、未処置群の植物と比較した場合、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１治療群で約５０％低かった（図２を参照）。したがって、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤が真菌病原体の成長を抑制し、植物を保護できることが実証された。
[00163] 本実験は２つの処置で実施された。使用した製品は、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と呼ばれるＧａｌ－Ｓを含有する液体製剤であった。葉面散布として使用するために、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を（最終濃度を４ｍＬ／Ｌ）水で希釈した。希釈した製品（４ｍＬ／Ｌ）及び対照（水）を、群あたり６つのトマト株に使用した。ポットで育ったトマト株に、感染の２４時間前に希釈したＧａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤（又は対照として水）を散布した。その上で、各植物は、葉全体に夏疫病菌（A.solani）胞子（１ｍＬあたり２Ｘ１０＾３）を均等に感染させた。周囲の湿度を維持するために、全ての植物を透明なポリエチレンカバーで覆い、１週間成長させた。感染の重症度を、０～５の評価尺度を使用して採点した（Pandey et al.,(2003),364-371）。明らかに、症状の重症度は、未処置群の植物と比較した場合、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１治療群で約５０％低かった（図２を参照）。したがって、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤が真菌病原体の成長を抑制し、植物を保護できることが実証された。
実施例３：トマト作物に対する殺真菌剤を用いた比較圃場試験
[00164] 本実験は、トマト作物で実施された実地圃場試験を示す。今回の実験では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を２ｍＬ／Ｌの希釈液で散布し、比較のためにアゾキシストロビン２３％ＳＣを含有する市販の化学殺真菌剤を１．０ｍＬ／Ｌ希釈液で使用し、水を散布した対照群と比較した。全ての処置は葉面散布として行われ、最初の散布はトマトの苗を圃場に植えてから約１５日後に実施し、その後、各散布を１５日間隔としてさらに２回散布した。各群のトマト株は、自家肥料（ＦＹＭ）の用途を通じて、水及び通常の栄養分の均等な供給を確保した。真菌病の病害発生率（トマト枯病（Tomato blight））は、全ての散布の完了時に記録された。図３の結果は、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１がこの病害発生率の抑制に非常に効果的であることを明確に示す。これは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の植物保護効果が、市販の殺真菌剤の効果に匹敵する範囲にあることを明確に示した。
[00164] 本実験は、トマト作物で実施された実地圃場試験を示す。今回の実験では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を２ｍＬ／Ｌの希釈液で散布し、比較のためにアゾキシストロビン２３％ＳＣを含有する市販の化学殺真菌剤を１．０ｍＬ／Ｌ希釈液で使用し、水を散布した対照群と比較した。全ての処置は葉面散布として行われ、最初の散布はトマトの苗を圃場に植えてから約１５日後に実施し、その後、各散布を１５日間隔としてさらに２回散布した。各群のトマト株は、自家肥料（ＦＹＭ）の用途を通じて、水及び通常の栄養分の均等な供給を確保した。真菌病の病害発生率（トマト枯病（Tomato blight））は、全ての散布の完了時に記録された。図３の結果は、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１がこの病害発生率の抑制に非常に効果的であることを明確に示す。これは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の植物保護効果が、市販の殺真菌剤の効果に匹敵する範囲にあることを明確に示した。
実施例４：パパイヤ作物におけるパパイヤ輪点ウイルス（ＰＲＳＶ）のウイルス負荷の減少を示すｑＰＣＲベースのアッセイ
[00165] 本実験では、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２と呼ばれる、異なるレベルのＧａｌ－Ｓを含有する液体製剤を使用した。植物の１つの群は、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２（全糖類の８９％のＧａｌ－Ｓ含有）を１．５ｍｌ／Ｌの用量で使用し、Ｇａｌ－Ｓ濃度は約１２８ｍｇ／Ｌとなり、別の群は、全糖類の２０％のＧａｌ－Ｓ含有Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置し、Ｇａｌ－Ｓ濃度は約５６ｍｇ／Ｌとなった。植物の３つ目の群は水だけで処置された。実験は３つの群の植物、即ち、ＰＲＳＶに感染してＧａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置された植物、ＰＲＳＶに感染してＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２で処置された植物、及び３つめの群は、ＰＲＳＶに感染して未処置で放置された植物で、各群に６つのパパイヤ株（パパイヤ株の年齢は約６０日であった）で構成された。処置された植物群は、生成物処置（Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１のいずれか）を受け、未処置群は、ａ）ＰＲＳＶ樹液（Bau et al.,(2003),112-120）接種の前、ｂ）樹液接種の２４時間後、及びｃ）樹液接種の１週間後に水を与えられた。葉のサンプルを、樹液接種前及び樹液接種の１０日後に各群から収集した。全ての葉のサンプルは、さらに分析するまで－８０℃で保存した。この実験では、ＰＲＳＶ ＮｉＢ遺伝子を増幅するために特異的プライマーのセットをＳＹＢＲグリーンに基づいた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に使用した。５’ＡＧＴＣＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴ ３’（配列番号１）及び５’ＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡ３’（配列番号２）プライマー配列を、ＰＲＳＶ ＮｉＢ遺伝子を特異的に増幅するためのフォワード及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。全ＲＮＡを葉のサンプルから分離し、ｑＰＣＲで分析する前に逆転写酵素反応を使用してｃＤＮＡを調製した。Ｃｔ値に基づいて、ウイルスＮｉＢ遺伝子の倍率変化を計算した。未処置群と比較して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群の両方がＰＲＳＶ負荷の減少（図４参照）を示し、生成物による処置が、実際に宿主植物細胞におけるＰＲＳＶ増殖を阻害するという意味を含むＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２がＧａｌ－Ｓ－Ｌ１より優れた性質を示した。結果はまた、液体製剤中のＧａｌ－Ｓ含有量の増加に伴いウイルス負荷がはるかに低いことを明確に示しており、したがって、植物保護効果におけるＧａｌ－Ｓ濃度の重要性を示す。
[00165] 本実験では、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２と呼ばれる、異なるレベルのＧａｌ－Ｓを含有する液体製剤を使用した。植物の１つの群は、製剤Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２（全糖類の８９％のＧａｌ－Ｓ含有）を１．５ｍｌ／Ｌの用量で使用し、Ｇａｌ－Ｓ濃度は約１２８ｍｇ／Ｌとなり、別の群は、全糖類の２０％のＧａｌ－Ｓ含有Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置し、Ｇａｌ－Ｓ濃度は約５６ｍｇ／Ｌとなった。植物の３つ目の群は水だけで処置された。実験は３つの群の植物、即ち、ＰＲＳＶに感染してＧａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置された植物、ＰＲＳＶに感染してＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２で処置された植物、及び３つめの群は、ＰＲＳＶに感染して未処置で放置された植物で、各群に６つのパパイヤ株（パパイヤ株の年齢は約６０日であった）で構成された。処置された植物群は、生成物処置（Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１のいずれか）を受け、未処置群は、ａ）ＰＲＳＶ樹液（Bau et al.,(2003),112-120）接種の前、ｂ）樹液接種の２４時間後、及びｃ）樹液接種の１週間後に水を与えられた。葉のサンプルを、樹液接種前及び樹液接種の１０日後に各群から収集した。全ての葉のサンプルは、さらに分析するまで－８０℃で保存した。この実験では、ＰＲＳＶ ＮｉＢ遺伝子を増幅するために特異的プライマーのセットをＳＹＢＲグリーンに基づいた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に使用した。５’ＡＧＴＣＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴ ３’（配列番号１）及び５’ＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡ３’（配列番号２）プライマー配列を、ＰＲＳＶ ＮｉＢ遺伝子を特異的に増幅するためのフォワード及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。全ＲＮＡを葉のサンプルから分離し、ｑＰＣＲで分析する前に逆転写酵素反応を使用してｃＤＮＡを調製した。Ｃｔ値に基づいて、ウイルスＮｉＢ遺伝子の倍率変化を計算した。未処置群と比較して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群の両方がＰＲＳＶ負荷の減少（図４参照）を示し、生成物による処置が、実際に宿主植物細胞におけるＰＲＳＶ増殖を阻害するという意味を含むＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２がＧａｌ－Ｓ－Ｌ１より優れた性質を示した。結果はまた、液体製剤中のＧａｌ－Ｓ含有量の増加に伴いウイルス負荷がはるかに低いことを明確に示しており、したがって、植物保護効果におけるＧａｌ－Ｓ濃度の重要性を示す。
実施例５：添加剤を含む単糖硫酸化ガラクトースベースの組成物の向上した有効性
[00166] 本実験は実施例４と同様に実施したが、生成物（Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２）は、植物で処置する前に、金属イオン（ホウ素（０．１％）及び亜鉛（０．１％））又はサリチル酸（０．５ｍＭ）及び塩化カルシウム（３ｍＭ）又はベータアミノ酪酸（０．２５ｍｇ／ｍｌ）で製剤化した。これらの改良された製剤では、病原体ＰＲＳＶの相対的なウイルス負荷の明らかな減少（図５参照）が認められた。
[00166] 本実験は実施例４と同様に実施したが、生成物（Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２）は、植物で処置する前に、金属イオン（ホウ素（０．１％）及び亜鉛（０．１％））又はサリチル酸（０．５ｍＭ）及び塩化カルシウム（３ｍＭ）又はベータアミノ酪酸（０．２５ｍｇ／ｍｌ）で製剤化した。これらの改良された製剤では、病原体ＰＲＳＶの相対的なウイルス負荷の明らかな減少（図５参照）が認められた。
[00167] したがって、ガラクトース硫酸塩単糖と金属イオン及びサリチル酸又はベータアミノ酪酸などのアミノ酸が豊富な製剤の組み合わせは、それらのいずれか単独よりもはるかに応答を改善することが確立された。
実施例６：Ｇａｌ－Ｓ製剤の製造のための原料を含有するカラギーナンの調製
紅藻オオキリンサイ（Kappaphycus striatus）からの調製
[00168] １ｋｇの新鮮なオオキリンサイ（Kappaphycus striatus）（sacol）海藻は、インドネシアのバリ島から調達され、回転スクリュープレス及び穴のあいたボウルを備えたキッチンジューサーで処理された。海藻全体を回転スクリューに接触させて細かく砕いた。スクリュープレスは紅藻片を穴のあいたボウルで圧搾し、中間スラリーを形成することなく直ちに果汁及び果汁抽出果肉に分離した。紅藻果汁抽出果肉及び紅藻果汁は、装置の２つの異なる出口から連続的に別々に収集された。果汁抽出果肉の回収量は３５０ｇ及び果汁回収量は６５０ｇであった。果汁抽出果肉の含水率は８０％及び果汁のブリックスは５％であった。このようにして得られた果汁抽出果肉をさらに熱風炉で乾燥させて、乾燥した紅藻薄片（水分含有量約１０％）を得た。果汁抽出果肉（８０％）水分又は乾燥紅藻薄片は、硫酸化ガラクトース（Ｇａｌ－Ｓ）製剤の製造の出発原料として使用してもよい。
紅藻オオキリンサイ（Kappaphycus striatus）からの調製
[00168] １ｋｇの新鮮なオオキリンサイ（Kappaphycus striatus）（sacol）海藻は、インドネシアのバリ島から調達され、回転スクリュープレス及び穴のあいたボウルを備えたキッチンジューサーで処理された。海藻全体を回転スクリューに接触させて細かく砕いた。スクリュープレスは紅藻片を穴のあいたボウルで圧搾し、中間スラリーを形成することなく直ちに果汁及び果汁抽出果肉に分離した。紅藻果汁抽出果肉及び紅藻果汁は、装置の２つの異なる出口から連続的に別々に収集された。果汁抽出果肉の回収量は３５０ｇ及び果汁回収量は６５０ｇであった。果汁抽出果肉の含水率は８０％及び果汁のブリックスは５％であった。このようにして得られた果汁抽出果肉をさらに熱風炉で乾燥させて、乾燥した紅藻薄片（水分含有量約１０％）を得た。果汁抽出果肉（８０％）水分又は乾燥紅藻薄片は、硫酸化ガラクトース（Ｇａｌ－Ｓ）製剤の製造の出発原料として使用してもよい。
[00169] 或いは、乾燥紅藻薄片は、新鮮なオオキリンサイ（Kappaphycus striatus）紅藻を取り、それを日光の下又は熱風炉のいずれかで水分含有量（約１０％）まで直接乾燥させることによって調製することもできる。次に、乾燥紅藻を細かく砕いて乾燥紅藻薄片を得て、Ｇａｌ－Ｓ製剤の製造原料とする。
実施例７：乾燥紅藻薄片からのＧａｌ－Ｓ製剤の調製
[00170] 本明細書に記載の組成物を調製するためのプロセスは、以下のステップを含む：
ａ．上記のようにして得られた乾燥紅藻薄片（水分含有量１０％）を、水でスラリー化して、最終懸濁濃度を１０重量％（ｗ／ｗ）にした。懸濁液のｐＨは、酸触媒を使用して約ｐＨ２．４に調整された。この懸濁液のアリコートを遠心分離し、「ゼロ時サンプル」として取っておいた。
ｂ．上記の反応混合物を、一定の攪拌条件下で、１１９～１２３℃の温度範囲及び１バールの圧力で加熱及び保持した。
ｃ．この反応を２．５時間進行させた。分析目的で、１時間及び２．５時間にサンプルを採取した。２．５時間の終わりに、この混合物を室温に冷却して反応を停止させた。
ｄ．サンプルの一部を遠心分離し、上清を濃縮して液体Ｇａｌ－Ｓ製剤を得た。サンプルの別の部分を遠心分離の前又は後に乾燥させて、粉末のＧａｌ－Ｓ製剤を得た。液体Ｇａｌ－Ｓ製剤を、アントロン硫酸法を使用して、「ゼロ時」サンプルの対応する値を差し引いた後に、全糖類の定量（以下の実施例で概説）及び、ＨＰＬＣ－ＭＳによるＧａｌ－Ｓの濃度（以下の実施例で説明）について分析した。
ｅ．全糖に対しての割合としてＧａｌ－Ｓの比率は、上記の値を使用して計算された。結果を以下の表１に示す。全体として、実施例のセクションは、本組成物で使用される成分に関する実施例及び非実施例を提供する。また、本項に記載のプロセスは、組成物を調製するための１つの方法に過ぎず、同じものを調製するための他の方法を考えることができる。
[00170] 本明細書に記載の組成物を調製するためのプロセスは、以下のステップを含む：
ａ．上記のようにして得られた乾燥紅藻薄片（水分含有量１０％）を、水でスラリー化して、最終懸濁濃度を１０重量％（ｗ／ｗ）にした。懸濁液のｐＨは、酸触媒を使用して約ｐＨ２．４に調整された。この懸濁液のアリコートを遠心分離し、「ゼロ時サンプル」として取っておいた。
ｂ．上記の反応混合物を、一定の攪拌条件下で、１１９～１２３℃の温度範囲及び１バールの圧力で加熱及び保持した。
ｃ．この反応を２．５時間進行させた。分析目的で、１時間及び２．５時間にサンプルを採取した。２．５時間の終わりに、この混合物を室温に冷却して反応を停止させた。
ｄ．サンプルの一部を遠心分離し、上清を濃縮して液体Ｇａｌ－Ｓ製剤を得た。サンプルの別の部分を遠心分離の前又は後に乾燥させて、粉末のＧａｌ－Ｓ製剤を得た。液体Ｇａｌ－Ｓ製剤を、アントロン硫酸法を使用して、「ゼロ時」サンプルの対応する値を差し引いた後に、全糖類の定量（以下の実施例で概説）及び、ＨＰＬＣ－ＭＳによるＧａｌ－Ｓの濃度（以下の実施例で説明）について分析した。
ｅ．全糖に対しての割合としてＧａｌ－Ｓの比率は、上記の値を使用して計算された。結果を以下の表１に示す。全体として、実施例のセクションは、本組成物で使用される成分に関する実施例及び非実施例を提供する。また、本項に記載のプロセスは、組成物を調製するための１つの方法に過ぎず、同じものを調製するための他の方法を考えることができる。
実施例８：Ｇａｌ－Ｓ濃度についてＨＰＬＣ－ＭＳによるＧａｌ－Ｓ製剤の分析手順
[00171] サンプルの質量分光分析は、エレクトロスプレーイオン化源及びオンラインUPLCシステム（Agilent 1290 Infinity）を備えたAgilent6460トリプル四重極装置で実施した。糖は負イオンモードで分析され、ＨＭＦは正イオンモードで分析された。糖分析には、XBridgeアミドＨＰＬＣカラムをアセトニトリル及び水勾配とともに使用した。ＨＭＦ分析では、Agilent Eclipse C18カラムをメタノール及び水（０．１％ギ酸含有）勾配で使用した。注射前にサンプルをＭＱ水で希釈した。質量分析はＭＲＭ（多重反応モニタリング）モードで実施され、前駆体及び娘イオンスペクトルが得られた。全ての化合物の標準曲線を５～２００ｐｐｂで作成した。糖の基準。即ち、カラビオースナトリウム塩、カッパカラトリオースナトリウム塩、Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸ナトリウム塩）は、英国のCarbosythから購入した。ＨＭＦは、Sigma Aldrichから購入した。
[00171] サンプルの質量分光分析は、エレクトロスプレーイオン化源及びオンラインUPLCシステム（Agilent 1290 Infinity）を備えたAgilent6460トリプル四重極装置で実施した。糖は負イオンモードで分析され、ＨＭＦは正イオンモードで分析された。糖分析には、XBridgeアミドＨＰＬＣカラムをアセトニトリル及び水勾配とともに使用した。ＨＭＦ分析では、Agilent Eclipse C18カラムをメタノール及び水（０．１％ギ酸含有）勾配で使用した。注射前にサンプルをＭＱ水で希釈した。質量分析はＭＲＭ（多重反応モニタリング）モードで実施され、前駆体及び娘イオンスペクトルが得られた。全ての化合物の標準曲線を５～２００ｐｐｂで作成した。糖の基準。即ち、カラビオースナトリウム塩、カッパカラトリオースナトリウム塩、Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸ナトリウム塩）は、英国のCarbosythから購入した。ＨＭＦは、Sigma Aldrichから購入した。
実施例９：アントロン硫酸法を使用したＧａｌ－Ｓ製剤中の全糖の測定方法
[00172] 上記の実施例７のステップ（ｄ）に記載の加水分解プロセスから得られたサンプルを、アントロン硫酸法を使用して全糖含有量について分析した、全糖の測定プロセス。粉末サンプルの場合、生成物を水に溶解して遠心分離し、上澄みを分析に使用する。この方法では、０．１ｇのアントロン（Himediaカタログ番号GRM314）を１００ｍｌの濃硫酸溶液に溶解する。０．２５ｇ／ｌのグルコース標準液を調製した。必要な量の水を加えることにより、一連のグルコース標準溶液０、０．０５、０．１、０．１５、０．２、及び０．２５ｇ／ｌを調製した。０．４ｍｌの標準溶液又はサンプルを０．８ｍｌのアントロン溶液に加え、反応混合物を４℃で１０分間、続いて９５℃で２０分間インキュベートした。反応混合物を１０～１５分間冷却し室温とし、分光光度計を使用して溶液の吸光度を６２０ｎｍで測定した。
[00172] 上記の実施例７のステップ（ｄ）に記載の加水分解プロセスから得られたサンプルを、アントロン硫酸法を使用して全糖含有量について分析した、全糖の測定プロセス。粉末サンプルの場合、生成物を水に溶解して遠心分離し、上澄みを分析に使用する。この方法では、０．１ｇのアントロン（Himediaカタログ番号GRM314）を１００ｍｌの濃硫酸溶液に溶解する。０．２５ｇ／ｌのグルコース標準液を調製した。必要な量の水を加えることにより、一連のグルコース標準溶液０、０．０５、０．１、０．１５、０．２、及び０．２５ｇ／ｌを調製した。０．４ｍｌの標準溶液又はサンプルを０．８ｍｌのアントロン溶液に加え、反応混合物を４℃で１０分間、続いて９５℃で２０分間インキュベートした。反応混合物を１０～１５分間冷却し室温とし、分光光度計を使用して溶液の吸光度を６２０ｎｍで測定した。
実施例１０：本開示の組成物及び得ることができる硫酸化ガラクトースの可能な混合物を得るための追加の方法
[00173] ガラクトース硫酸塩（Ｇａｌ－Ｓ）が豊富な調製物は、カラギーナン又は紅藻などのカラギーナン含有材料などの出発材料から製造してもよい。そのような紅藻の例は、オオキリンサイ（Kappaphycus striatus）、キリンサイ属コットーニィ種Eucheum（a cottonii）、キリンサイ（Eucheuma denticulatum）（スピノサム）、ハリメニア・デュルビレア（Halymenia durvillaea）、ネッタイキリンサイ（Kappaphycus alvarezii）、ヤハズツノマタ（Chondrus crispus）、ソリエリア・コーダリス（Solieria chordalis）、ポルフィラ・プルプレア（Porphyra purpurea）、ユーチェエマ・イシフォルミス（Euchuema isiforme）、ヒプネア・ムシフォルミス（Hypnea musciformis）、ソリエリア・フィリフォルミス（Solieria filiformis）、マストカルプス・ステラタス（Mastocarpus stellatus）、マストカルプス・パピラートゥス（Mastocarpus papillatus）、ポルセラ・カペンシス（Porphyra capensis）、フルセラリア属（Furcerllaria spp）、スギノリ属（Gigartina）、オゴノリ属（Gracillaria）、イリデア属（Iridea spp）、アネセカ属（Anatheca spp）、トサカノリ属（Meristotheca spp）、アンフェルティア属（Ahnfeltia spp）、オキツノリ属（Gynmogongrus spp）、フィロフォラ属（Phyllophora spp）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
[00173] ガラクトース硫酸塩（Ｇａｌ－Ｓ）が豊富な調製物は、カラギーナン又は紅藻などのカラギーナン含有材料などの出発材料から製造してもよい。そのような紅藻の例は、オオキリンサイ（Kappaphycus striatus）、キリンサイ属コットーニィ種Eucheum（a cottonii）、キリンサイ（Eucheuma denticulatum）（スピノサム）、ハリメニア・デュルビレア（Halymenia durvillaea）、ネッタイキリンサイ（Kappaphycus alvarezii）、ヤハズツノマタ（Chondrus crispus）、ソリエリア・コーダリス（Solieria chordalis）、ポルフィラ・プルプレア（Porphyra purpurea）、ユーチェエマ・イシフォルミス（Euchuema isiforme）、ヒプネア・ムシフォルミス（Hypnea musciformis）、ソリエリア・フィリフォルミス（Solieria filiformis）、マストカルプス・ステラタス（Mastocarpus stellatus）、マストカルプス・パピラートゥス（Mastocarpus papillatus）、ポルセラ・カペンシス（Porphyra capensis）、フルセラリア属（Furcerllaria spp）、スギノリ属（Gigartina）、オゴノリ属（Gracillaria）、イリデア属（Iridea spp）、アネセカ属（Anatheca spp）、トサカノリ属（Meristotheca spp）、アンフェルティア属（Ahnfeltia spp）、オキツノリ属（Gynmogongrus spp）、フィロフォラ属（Phyllophora spp）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
[00174] この出発物質を管理された加水分解（１５分～５時間の間に１２０～１５０℃の温度で酸を使用した実施例）に供し、望ましい範囲まで多糖骨格の分解を引き起こす。加水分解は、加水分解温度及び時間条件、並びに加水分解剤（酸、過酸化物、アルカリなど）の濃度を注意深く変化させて、十分な分解が起こるようにすることによって管理することができる。同時に、非常に過剰な加水分解は、糖に結合している硫酸塩の除去をもたらし、ガラクトースのみを生じ得る。加水分解の程度は、質量分析（ＭＳ）に連結したＨＰＬＣを使用して測定してもよい。さらに、加水分解の正確な管理は、連続加水分解装置を使用することによって達成してもよい。カラギーナンは、カッパカラギーナン、イオタカラギーナン又はラムダ或いはハイブリッドカラギーナンのような任意のカラギーナンであり得る。使用されるカラギーナンに応じて、そのようにして得られたガラクトース硫酸塩は、ガラクトース部分の複数の位置で硫酸化され得る。例えば、ラムダカラギーナンから作成されたガラクトース硫酸塩（Ｇａｌ－Ｓ）が豊富な調製物は、ガラクトース部分の２か所だけでなく１か所で硫酸化された単糖ガラクトース硫酸塩の混合物を生成するだろう。
[00175] Nori et al 米国特許１０，３５８，３９１ Ｂ１号（本即時開示の著者でもある）によって、本発明に開示される紅藻バイオマスの加水分解条件の範囲内では、Nori et alの学説に従って使用した場合、これらの条件下で生成された加水分解物のほとんどが、植物バイオスティミュラントとして作用することができる一方で、驚くべきことに、過度の加水分解条件（例えば、９５℃のような高温で４～１２時間の保持時間、又は１２０℃～１５０℃で５時間～１５分の保持時間で生成された加水分解物の特定のサブセットのみが、本開示で開示されるように強い植物及び動物保護効果が可能な加水分解物混合物を生成することが判明した。
[00176] ＨＰＬＣ－質量分析技術を使用してそのような保護加水分解物混合物を分析すると、加水分解物のかなりの割合（即ち、全糖の１５％超）が硫酸化ガラクトース（例えば、一硫酸化ガラクトース及び二硫酸化ガラクトース）として存在し、これらは全て分子量４００Ｄａ未満であることが判明した。加水分解プロセスで、この範囲の分子量の形成は、Nori et alにより本発明において、以前に言及されていなかった。
[00177] 異なる硫酸化ガラクトース含有量の２つのそのような加水分解物混合物を比較した場合、驚くべきことに混合物中の硫酸化ガラクトースの含有量が高いほど保護効果が強力なことが判明した。硫酸化ガラクトース含有量の濃度と、ガラクトース硫酸塩含有混合物の植物及び動物の保護効果との間のこの関係は、本開示の明白でない特徴である。
[00178] また、特に過度の条件を使用した加水分解の場合、かなりの量のヒドロキシメチルフルフラールが形成された（製剤中の全糖量の２％を超える）ことも判明した。ヒドロキシメチルフルフラールは単糖の誘導体であり、温度と酸性の条件下で糖、アンヒドロガラクトースから容易に形成される（他の糖からも形成されるが）。糖質であるアンヒドロガラクトースはカラギーナンの成分である。したがって、ヒドロキシメチルフルフラールは、特定の製造プロセスを使用して、製造された独特の加水分解物混合物の追加のマーカーとして見なしてもよく、植物及び動物の保護効果を有する硫酸化ガラクトースのレベルの上昇ももたらす。実施例１４に示すように、ヒドロキシメチルフルフラールは、植物に対して独立して保護効果を有する可能性があることも判明した。これは、これまでに報告されていない驚くべき新しい発見であり、したがって、独立して植物を保護するガラクトース硫酸塩及び糖類の加水分解物混合物は、特定の製造プロセスを使用して形成されるヒドロキシメチルフルフラールの形成によって強化され得る。ここで、ヒドロキシメチルフルフラールは、酵素的加水分解又は過酸化物加水分解を使用する他の製造方法を使用する場合、常に形成されないかもしれないが、加水分解物媒体としてイオン液体を使用するプロセスで形成され得ることに留意されたい。
[00179] ガラクトース硫酸塩が豊富な組成物を調製するさらに他の方法は、適切な条件下で、カラギーナン含有原材料を糖及びガラクトース硫酸塩に分解することができるイオン液体、過酸化物を使用することである。
[00180] 使用されるカラギーナンに応じて、ガラクトース硫酸塩は、ガラクトース部分の複数の位置で硫酸化され得る。例えば、ラムダカラギーナンから作成されたガラクトース硫酸塩（Ｇａｌ－Ｓ）が豊富な調製物は、ガラクトース部分の２か所だけでなく１か所で硫酸化された単糖ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩及びガラクトース－２，６－二硫酸塩の混合物を生成するだろう。その一方で、調製物がカッパ又はイオタカラギーナンから作成される場合、主な単糖部分はガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩であろう。出発原料がカラギーナンの混合物である場合、加水分解時の主な単糖は、ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩、ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩及びガラクトース－６－Ｏ－硫酸塩の混合物であろう。
[00181] 本開示の一部として解釈することができる可能性のある原料；カッパ－カラギーナン（β－Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸－α－３，６－アンヒドロ－Ｄ－ガラクトースの繰り返し単位のポリマー）、カッパ－カラギーナンの前駆体（β－Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸－α－Ｄ－ガラクトース－６－Ｏ－硫酸塩の繰り返し単位のポリマー）、イオタ－カラギーナン（β－Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸－α－３，６－アンヒドロ－Ｄ－ガラクトース－２－Ｏ－硫酸塩の繰り返し単位のポリマー）、イオタ－カラギーナンの前駆体（β－Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸－α－Ｄ－ガラクトース－２，６－Ｏ－二硫酸塩の繰り返し単位のポリマー）、ラムダ カラギーナン（β－Ｄ－ガラクトース－２－Ｏ－硫酸－α－Ｄ－ガラクトース－２，６－Ｏ－二硫酸塩の繰り返し単位のポリマー）、及びラムダ及びカッパ－カラギーナンの混合物が一部の紅藻も可能である。
[00182] 硫酸化ガラクトースの代表的な構造のいくつかを以下に示す。
１．Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩（ナトリウム塩の場合はＣＡＳ ＩＤ：１２５１１３－６８－０）
２．Ｄ－ガラクトース－６－Ｏ－硫酸塩（ナトリウム塩の場合はＣＡＳ ＩＤ：１２５４５５－６２－１）
１．Ｄ－ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩（ナトリウム塩の場合はＣＡＳ ＩＤ：１２５１１３－６８－０）
２．Ｄ－ガラクトース－６－Ｏ－硫酸塩（ナトリウム塩の場合はＣＡＳ ＩＤ：１２５４５５－６２－１）
[00183] ガラクトース硫酸塩が豊富な調製物を作成する他の方法には、カラギーナンをガラクトース硫酸塩に分解し、任意にその後酸加水分解することができる酵素の使用が含まれる。カラギーナン含有原料に応じて、単独又は組み合わせて使用されるそのような酵素の例は、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、スルファターゼ、アンヒドロガラクトースデヒドロゲナーゼ、α－アミラーゼ、カラギナーゼ、ヒドロラーゼ、スルフリラーゼ（海藻親水コロイド生産：酵素支援抽出及び修飾技術の最新情報を参照）。
実施例１１：ガラクトース硫酸塩が豊富な調製物は、それらを化学的に合成することによっても得ることができる
[00184] ガラクトース硫酸塩が豊富な調製物は、１９６０年にPeat Sらによって（Sulfates of monosaccharides and their derivatives.Part 1.Preparation.J. Chem.Soc.4761-4766)、又は１９６２年にTurveyらによって（407.Sulphates of monosaccharides and derivatives.Part IV.Galactose 4-sulphate.Journal of the Chemical Society (Resumed), 2119）記載されているように、それらを化学的に合成することによっても得てもよい。
[00184] ガラクトース硫酸塩が豊富な調製物は、１９６０年にPeat Sらによって（Sulfates of monosaccharides and their derivatives.Part 1.Preparation.J. Chem.Soc.4761-4766)、又は１９６２年にTurveyらによって（407.Sulphates of monosaccharides and derivatives.Part IV.Galactose 4-sulphate.Journal of the Chemical Society (Resumed), 2119）記載されているように、それらを化学的に合成することによっても得てもよい。
[00185] ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩の化学合成は、メチルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを出発点として以下のステップで実施された。
ａ．１．４ｇのメチルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを乾燥ピリジン（４５ｍＬ）に溶解し、混合物を－４０℃に冷却した。この予冷した混合物に、シリンジを使用して３．３９ｍｌの塩化ベンゾイルを滴下した。この反応は－４０℃で２時間実施し、反応混合物を氷浴に一晩置いた。ピリジンを蒸発させ、この反応混合物をクロロホルム（２５～３０ｍｌ）に溶解した。有機層を１）希ＨＣｌ、２）５％ＮａＨＣＯ３水溶液及び最後に水で洗浄した。有機層を収集し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。有機層を蒸発させ、エタノールで結晶化することにより生成物（メチル２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド）を得た。
ｂ．１ｇのメチル２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドを乾燥ピリジン（１２ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で攪拌した。この混合物に、９６０ｍｇのＰｙｒ．ＳＯ３を添加し、反応混合物を６５℃で、３時間還流条件下で維持した。反応混合物を室温まで冷却し、残留ピリジンを除去した。２５ｍｌのジクロロメタンを混合物に加え、有機層を希ＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｗ溶液）で洗浄した。有機層を収集し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾液を真空で蒸発させて淡黄色油状物を得て、これを、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド－４－硫酸メチルを得た。
ｃ．０．９ｇの２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド－４－硫酸メチルを乾燥メタノール（３０ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で攪拌した。これに７．５ｍｌのＮａＯＭｅを加え、反応を室温で一晩撹拌し、反応をモニターした。反応混合物をｐＨ中和し、蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物（ガラクトース（Galacotse）－４－Ｏ－硫酸メチル）を、ＤＣＭ中の３０％メタノール、１００％メタノール洗浄を用いたカラムで精製した。
ｄ．７００ｍｇのガラクトース（Galacotse）－４－Ｏ－硫酸メチルを３ｍｌの乾燥ジクロロメタン及び８４０ｍｇのテトラフルホウ酸トリチルに窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、過剰の炭酸水素ナトリウムでクエンチした。有機相を水で洗浄したが、生成物はＮａＨＣＯ３と共に水層に移動した。水層を収集し、真空下で濃縮し、メタノールを加えて炭酸水素ナトリウムを沈殿させた。メタノール画分中に沈殿したＧａｌ－Ｓ及び粗固体画分を酢酸と混合した。混合物を１００％メタノール溶媒流相でカラム精製し、Ｇａｌ－Ｓ含有画分を収集し、真空下で濃縮して、乾燥粉末を得た。
乾燥粉末の組成は、ＨＰＬＣ－ＭＳ（実施例８に記載のように）を実施することによって評価され、ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩の存在が確認された。
ａ．１．４ｇのメチルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを乾燥ピリジン（４５ｍＬ）に溶解し、混合物を－４０℃に冷却した。この予冷した混合物に、シリンジを使用して３．３９ｍｌの塩化ベンゾイルを滴下した。この反応は－４０℃で２時間実施し、反応混合物を氷浴に一晩置いた。ピリジンを蒸発させ、この反応混合物をクロロホルム（２５～３０ｍｌ）に溶解した。有機層を１）希ＨＣｌ、２）５％ＮａＨＣＯ３水溶液及び最後に水で洗浄した。有機層を収集し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。有機層を蒸発させ、エタノールで結晶化することにより生成物（メチル２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド）を得た。
ｂ．１ｇのメチル２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドを乾燥ピリジン（１２ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で攪拌した。この混合物に、９６０ｍｇのＰｙｒ．ＳＯ３を添加し、反応混合物を６５℃で、３時間還流条件下で維持した。反応混合物を室温まで冷却し、残留ピリジンを除去した。２５ｍｌのジクロロメタンを混合物に加え、有機層を希ＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｗ溶液）で洗浄した。有機層を収集し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾液を真空で蒸発させて淡黄色油状物を得て、これを、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド－４－硫酸メチルを得た。
ｃ．０．９ｇの２，３，６－トリ－０－ベンゾイル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド－４－硫酸メチルを乾燥メタノール（３０ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で攪拌した。これに７．５ｍｌのＮａＯＭｅを加え、反応を室温で一晩撹拌し、反応をモニターした。反応混合物をｐＨ中和し、蒸発させて溶媒を除去した。粗生成物（ガラクトース（Galacotse）－４－Ｏ－硫酸メチル）を、ＤＣＭ中の３０％メタノール、１００％メタノール洗浄を用いたカラムで精製した。
ｄ．７００ｍｇのガラクトース（Galacotse）－４－Ｏ－硫酸メチルを３ｍｌの乾燥ジクロロメタン及び８４０ｍｇのテトラフルホウ酸トリチルに窒素雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、過剰の炭酸水素ナトリウムでクエンチした。有機相を水で洗浄したが、生成物はＮａＨＣＯ３と共に水層に移動した。水層を収集し、真空下で濃縮し、メタノールを加えて炭酸水素ナトリウムを沈殿させた。メタノール画分中に沈殿したＧａｌ－Ｓ及び粗固体画分を酢酸と混合した。混合物を１００％メタノール溶媒流相でカラム精製し、Ｇａｌ－Ｓ含有画分を収集し、真空下で濃縮して、乾燥粉末を得た。
乾燥粉末の組成は、ＨＰＬＣ－ＭＳ（実施例８に記載のように）を実施することによって評価され、ガラクトース－４－Ｏ－硫酸塩の存在が確認された。
実施例１２：疾患から動物を保護し治癒するための組成物の効果
[00186] 本開示の組成物はまた、細菌性及びウイルス性疾患のような様々な疾患から動物を保護及び治癒するために使用することもできる。
[00186] 本開示の組成物はまた、細菌性及びウイルス性疾患のような様々な疾患から動物を保護及び治癒するために使用することもできる。
[00187] 本開示の組成物はまた、温度及び塩分などの様々な非生物的ストレスから動物を保護するために使用することもできる。
[00188] 本開示の組成物はまた、防御経路を刺激するために、水生動物が成長する（発育段階）水域に直接適用することもできる。
[00189] 必要に応じて、組成物をアルテミア(Artemia)（エビの甲殻類飼料）に給餌することができ、富化されたアルテミア(Artemia)を飼料としてエビに給餌することができる。
[00190] この組成物を水で希釈して均質な溶液を形成し、次に飼料に混合し、次いで水生動物（魚及びエビ）に給餌して防御経路を刺激することができる。この用途は予防的な方法で適用されるが、病気の発症後に適用することもできる。
[00191] ガラクトース硫酸塩が豊富な調製物は、粉末製剤に変換することもでき、適切な希釈率で飼料と混合して、家畜、鳥、その他の動物に給餌することができる。
[00192] 組成物の使用例の１つを以下に示す：
Ａ）実施例１２Ａ：バナメイエビ（Shrimp L.vannamei）の後期仔魚（ＰＬ１１）は、６０エビ／平方メートルの密度で、それぞれ３００平方メートルの４つのプラスチックで裏打ちされた屋外の池で飼育されていた。水の塩分は３６～３９ｐｐｔであった。水のｐＨは７．６～８．２の範囲であった。十分な溶存酸素レベルを維持するために、パドルホイールエアレーターを使用して通気を行った。給餌は１日４回、養殖は約１１０日間実施した。対照池のエビ（２回反復）には、全期間にわたって市販の餌を給餌した。処置池のエビ（２回反復）には、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と事前に混合された市販の飼料を５ｇ／ｋｇ飼料の有効量で、養殖の２か月目に隔週で２週間与えられた。残りの養殖期間中、処置池は対照と類似の市販の飼料を与えられた。全ての池でのエビの最終的な平均体重は約２０ｇであった。エビを収穫して計量し、生き残ったエビの数を対照池と処置池から推定した。図６は、十分に成長したエビの生存率が、対照と比較して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と事前に混合された飼料を２週間給餌した池の方が高かったことを示す。本実施例では、エビに給餌したＧａｌ－Ｓ－Ｌ１は、エビの生存を改善することが示されたＧａｌ－Ｓの有効投与量、６０ｍｇ／ｋｇを有していた。
Ａ）実施例１２Ａ：バナメイエビ（Shrimp L.vannamei）の後期仔魚（ＰＬ１１）は、６０エビ／平方メートルの密度で、それぞれ３００平方メートルの４つのプラスチックで裏打ちされた屋外の池で飼育されていた。水の塩分は３６～３９ｐｐｔであった。水のｐＨは７．６～８．２の範囲であった。十分な溶存酸素レベルを維持するために、パドルホイールエアレーターを使用して通気を行った。給餌は１日４回、養殖は約１１０日間実施した。対照池のエビ（２回反復）には、全期間にわたって市販の餌を給餌した。処置池のエビ（２回反復）には、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と事前に混合された市販の飼料を５ｇ／ｋｇ飼料の有効量で、養殖の２か月目に隔週で２週間与えられた。残りの養殖期間中、処置池は対照と類似の市販の飼料を与えられた。全ての池でのエビの最終的な平均体重は約２０ｇであった。エビを収穫して計量し、生き残ったエビの数を対照池と処置池から推定した。図６は、十分に成長したエビの生存率が、対照と比較して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と事前に混合された飼料を２週間給餌した池の方が高かったことを示す。本実施例では、エビに給餌したＧａｌ－Ｓ－Ｌ１は、エビの生存を改善することが示されたＧａｌ－Ｓの有効投与量、６０ｍｇ／ｋｇを有していた。
[00193] Ｇａｌ－Ｓ組成物の使用の別の実施例を以下に示す：
Ｂ）実施例１２Ｂ：Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置は、ウシエビ（P.monodon）の後期仔魚（ＰＬ）エビの生存率及び細菌感染に対する耐性を高める
エビの仔魚の養殖は、１００Ｌ水槽のふ化場で行われ、各水槽に１００００匹の仔魚（ノープリウス１又はＮ１）を飼育した。この実験は、Ｎ１からＰＬ１０の段階で実施され、エビにはアルテミアサリーナ（Artemia salina）が与えられた。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１は、処置水槽に１日あたり０．００３ｍｌ／Ｌの水の投与量で投与する一方で、対照水槽はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を投与しなかった。対照水槽及び処置水槽からそれぞれ５０ＰＬ１０のエビを収集し、それぞれ２５ＰＬずつ有する２つの反復に分けた。対照及び処置されたＰＬ１０を、１ｘ１０＾６ｃｆｕ／ｍＬの用量で水中のＶ．ハーベイ（V. harveyi）（ＬＢ３）に感染させ、感染後４日目までの生存率を毎日記録した。図１４は、エビをＧａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置した場合、細菌感染症の存在下での生存率が高いままであることを示している。本実施例では、３０ｍｇのＧａｌ－Ｓ／メートルトンの養殖用水がエビの後期仔魚の生存率を改善することが示されたので、０．００３ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の投与量は、Ｇａｌ－Ｓの有効投与量を有した。
Ｂ）実施例１２Ｂ：Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置は、ウシエビ（P.monodon）の後期仔魚（ＰＬ）エビの生存率及び細菌感染に対する耐性を高める
エビの仔魚の養殖は、１００Ｌ水槽のふ化場で行われ、各水槽に１００００匹の仔魚（ノープリウス１又はＮ１）を飼育した。この実験は、Ｎ１からＰＬ１０の段階で実施され、エビにはアルテミアサリーナ（Artemia salina）が与えられた。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１は、処置水槽に１日あたり０．００３ｍｌ／Ｌの水の投与量で投与する一方で、対照水槽はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を投与しなかった。対照水槽及び処置水槽からそれぞれ５０ＰＬ１０のエビを収集し、それぞれ２５ＰＬずつ有する２つの反復に分けた。対照及び処置されたＰＬ１０を、１ｘ１０＾６ｃｆｕ／ｍＬの用量で水中のＶ．ハーベイ（V. harveyi）（ＬＢ３）に感染させ、感染後４日目までの生存率を毎日記録した。図１４は、エビをＧａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置した場合、細菌感染症の存在下での生存率が高いままであることを示している。本実施例では、３０ｍｇのＧａｌ－Ｓ／メートルトンの養殖用水がエビの後期仔魚の生存率を改善することが示されたので、０．００３ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の投与量は、Ｇａｌ－Ｓの有効投与量を有した。
実施例１３－トマト作物の分離トマト葉アッセイは、より高い割合でＧａｌ－Ｓを含有する組成物で改善された有効性を示す一方で、全糖濃度は類似であった
[00194] トマト輪紋病菌（Alternaria solani）真菌胞子の調製：トマト輪紋病菌（Alternaria solani）をＰＤＡプレートで培養し、３０℃で約１週間増殖させた。十分に増殖した気中菌糸体を、滅菌ブラシを使用して除去し、寒天の表面で増殖した真菌マットを小片に切断し、ショ糖寒天胞子形成培地を含むプレート上に置いた。プレートをさらに３０℃、暗所で３～４日間インキュベートし、０．１％トゥイーン２０を添加することで胞子を収集し、胞子の数を顕微鏡下で計測した。
[00194] トマト輪紋病菌（Alternaria solani）真菌胞子の調製：トマト輪紋病菌（Alternaria solani）をＰＤＡプレートで培養し、３０℃で約１週間増殖させた。十分に増殖した気中菌糸体を、滅菌ブラシを使用して除去し、寒天の表面で増殖した真菌マットを小片に切断し、ショ糖寒天胞子形成培地を含むプレート上に置いた。プレートをさらに３０℃、暗所で３～４日間インキュベートし、０．１％トゥイーン２０を添加することで胞子を収集し、胞子の数を顕微鏡下で計測した。
[00195] 分離トマト葉の抗真菌アッセイ：このアッセイでは、分離トマト葉への真菌接種による損傷／病変範囲を測定することにより、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２の抗真菌効果を比較した。簡単に説明すると、約３０～４０日齢のトマト苗にまず生成物製剤の適切な希釈液（即ち、約１４０ｍｇ／ｍｌの全糖濃度を提供する２ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤のうち、Ｇａｌ－Ｓ濃度は約２８ｍｇ／Ｌであり、約１４０ｍｇ／Ｌの全糖濃度を提供する１．５ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２は、そのうちＧａｌ－Ｓ濃度は１２８ｍｇ／ＬのＧａｌ－Ｓであった）を散布し、一方で未処理対照及び健康な植物群を水のみで処置した。処置の４８時間後、各植物の葉４枚（通常は上から２段目と３段目）を切り取り、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液、続いて７０％エタノール及び滅菌水で１分間洗浄して表面を滅菌した。全ての葉の葉柄を湿った綿栓で覆い、滅菌ペトリ皿に保持した滅菌濾紙上に置いた。さらに、無菌の葉の薄層の中央にトマト輪紋病菌（Alternaria solani）胞子（通常は１ｍＬあたり１０＾４胞子の濃度）を含有する５μＬの胞子懸濁液を配置することによりトマト葉を播種し、続いて暗所で、室温で２週間インキュベートした。播種から１２日後、全ての葉をWinFOLIA（商標）ソフトウェアを使用しスキャンし、真菌病変のサイズを記録した。結果（図７）は、真菌によって誘発された病変／損傷のサイズが、２ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１で処置した葉よりも１．５ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２で処理した葉の方が小さかったことを示した。両方の処置は、類似した全糖濃度を有していたが、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２による処置の方が高いＧａｌ－Ｓ濃度を有していたため、Ｇａｌ－Ｓは、植物保護効果を活性化し、真菌病変サイズを減少するのに重要な役割を果たしていることは明らかである。
実施例１４：Ｇａｌ－Ｓ及びＨＭＦの植物保護効果
[00196] この実験は、実施例１３に記載されているように実施されたが、試験された処置剤は、８０ｍｇ／Ｌ及び８ｍｇ／Ｌの純粋な化学合成Ｇａｌ－Ｓ、及び市販の殺真菌剤である１ｍｌ／Ｌアゾキシストロビン２３％ＳＣと併せて８０ｍｇ／Ｌのヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）とした。図８から、８０ｍｇ／Ｌ濃度のＧａｌ－Ｓ及びＨＭＦの両方が、未処理の対照群と比較して、真菌によって誘発された損傷のサイズが顕著な減少を示していることがわかる。ただし、８ｍｇ／ＬのＧａｌ－Ｓは、真菌病変サイズの顕著な減少を示していない。実施例１３に提示されたデータに加えて、この実験は、最終用途において８ｍｇ／Ｌの閾値濃度を超えるＧａｌ－Ｓ含有製剤のみが植物保護活性を与えることができることを明確に示す。この発見は完全に新しいもので、これまでに報告されていない。病原体攻撃に対する植物を保護するためのHMFの特性も新規であり、これまでに報告されていない。市販の殺真菌剤アゾキシストロビンは、参照化合物としてこの実践に含まれていた。
[00196] この実験は、実施例１３に記載されているように実施されたが、試験された処置剤は、８０ｍｇ／Ｌ及び８ｍｇ／Ｌの純粋な化学合成Ｇａｌ－Ｓ、及び市販の殺真菌剤である１ｍｌ／Ｌアゾキシストロビン２３％ＳＣと併せて８０ｍｇ／Ｌのヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）とした。図８から、８０ｍｇ／Ｌ濃度のＧａｌ－Ｓ及びＨＭＦの両方が、未処理の対照群と比較して、真菌によって誘発された損傷のサイズが顕著な減少を示していることがわかる。ただし、８ｍｇ／ＬのＧａｌ－Ｓは、真菌病変サイズの顕著な減少を示していない。実施例１３に提示されたデータに加えて、この実験は、最終用途において８ｍｇ／Ｌの閾値濃度を超えるＧａｌ－Ｓ含有製剤のみが植物保護活性を与えることができることを明確に示す。この発見は完全に新しいもので、これまでに報告されていない。病原体攻撃に対する植物を保護するためのHMFの特性も新規であり、これまでに報告されていない。市販の殺真菌剤アゾキシストロビンは、参照化合物としてこの実践に含まれていた。
実施例１５：Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２自体には、真菌病原体に対して直接活性のある成分は含まれておらず、それらの植物保護効果は、植物自体に対する間接的な作用によるものであることを示した。
[00197] Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２には、それ自体に抗真菌性化合物が含まれており、それが観察された植物保護効果をもたらすのではないかという疑問に答えるために、次のような実験を行った。この実験では、滅菌ポテト－デキストロース－寒天培地に、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１（４ｍＬ／Ｌ）、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２（１．５ｍＬ／Ｌ）、及びアゾキシストロビン２３％ＳＣ（１．０ｍＬ／Ｌ）を別々に組み込まれた。この培地を凝固のために微生物プレートに広げた。未処置対照プレートは、ポテト－デキストロース－寒天培地のみを含んでいた。１日目に、上記の全てのプレートに同じサイズのトマト輪紋病菌（Alternaria solani）真菌プラグを接種し、プレートをさらに２４℃で１週間インキュベートした。インキュベーションの１週間後、各プレート上の真菌プラークの直径を測定することにより、真菌の増殖を記録した（図９、（Ａ）及び（Ｂ）参照）。これらの図のデータから、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１液体製剤又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２液体製剤の配合は、真菌の増殖を阻害する効果はなかったが、化学殺真菌剤であるアゾキシストロビンは、真菌のプラークサイズを大幅に減少させたことがわかる。この実施例は、混合物Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２或いは推論によって、Ｇａｌ－Ｓ、ＨＭＦ、及び他のオリゴ糖などのそれらの構成成分が、直接殺真菌作用を有することを明確に示した。前の２つの実験（実施例１３と実施例１４）の結果と合わせて、この実験から導き出せるさらなる結論は、これらの混合物の植物保護効果は、植物が植物内の固有の防御システムを誘導するために、植物病原体による攻撃を阻止し、又は軽減することができると考えられていることが理由である。
[00197] Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２には、それ自体に抗真菌性化合物が含まれており、それが観察された植物保護効果をもたらすのではないかという疑問に答えるために、次のような実験を行った。この実験では、滅菌ポテト－デキストロース－寒天培地に、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１（４ｍＬ／Ｌ）、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２（１．５ｍＬ／Ｌ）、及びアゾキシストロビン２３％ＳＣ（１．０ｍＬ／Ｌ）を別々に組み込まれた。この培地を凝固のために微生物プレートに広げた。未処置対照プレートは、ポテト－デキストロース－寒天培地のみを含んでいた。１日目に、上記の全てのプレートに同じサイズのトマト輪紋病菌（Alternaria solani）真菌プラグを接種し、プレートをさらに２４℃で１週間インキュベートした。インキュベーションの１週間後、各プレート上の真菌プラークの直径を測定することにより、真菌の増殖を記録した（図９、（Ａ）及び（Ｂ）参照）。これらの図のデータから、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１液体製剤又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２液体製剤の配合は、真菌の増殖を阻害する効果はなかったが、化学殺真菌剤であるアゾキシストロビンは、真菌のプラークサイズを大幅に減少させたことがわかる。この実施例は、混合物Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２或いは推論によって、Ｇａｌ－Ｓ、ＨＭＦ、及び他のオリゴ糖などのそれらの構成成分が、直接殺真菌作用を有することを明確に示した。前の２つの実験（実施例１３と実施例１４）の結果と合わせて、この実験から導き出せるさらなる結論は、これらの混合物の植物保護効果は、植物が植物内の固有の防御システムを誘導するために、植物病原体による攻撃を阻止し、又は軽減することができると考えられていることが理由である。
実施例１６：トマト及びチリ作物へのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２製剤の予防散布によるウイルス性病害発生率の低下を示す圃場試験データ
[00198] これらの試験では、トマト及びチリ株を、自然のウイルス病害発生率が発生しやすい地域で通常の農業実務に従って栽培した。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２の液体製剤は、予防的な方法で葉面散布された。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１（全糖濃度の２０％のＧａｌ－Ｓ含有）を４ｍＬ／Ｌの水で希釈し、植物上に適用するために、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２（全糖濃度の８９％のＧａｌ－Ｓを含有）を１．５ｍＬ／Ｌの水で希釈した。対照群のこの植物は、水のみを散布した。試験圃場への移植後２週間から始まり、１５日間隔で３回の予防散布を取り入れた。病害発生率は、各群の総植物数に対する症候性植物数の合計を記録することによって計算した。データ（図１０）から、未処置群は病害発生率が高いのに対し、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置群又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群の植物は、ウイルス病害発生率が著しく低いことを示していることが理解できる。したがって、Ｇａｌ－Ｓを含有する組成物は、圃場条件でウイルス病害を抑制するために使用することができる。また、興味深く留意することに、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群のうち、Ｇａｌ－Ｓの割合を高く含有する（８９％の全糖濃度）Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群では、病害発生率が顕著に低かった。
[00198] これらの試験では、トマト及びチリ株を、自然のウイルス病害発生率が発生しやすい地域で通常の農業実務に従って栽培した。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２の液体製剤は、予防的な方法で葉面散布された。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１（全糖濃度の２０％のＧａｌ－Ｓ含有）を４ｍＬ／Ｌの水で希釈し、植物上に適用するために、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２（全糖濃度の８９％のＧａｌ－Ｓを含有）を１．５ｍＬ／Ｌの水で希釈した。対照群のこの植物は、水のみを散布した。試験圃場への移植後２週間から始まり、１５日間隔で３回の予防散布を取り入れた。病害発生率は、各群の総植物数に対する症候性植物数の合計を記録することによって計算した。データ（図１０）から、未処置群は病害発生率が高いのに対し、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置群又はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群の植物は、ウイルス病害発生率が著しく低いことを示していることが理解できる。したがって、Ｇａｌ－Ｓを含有する組成物は、圃場条件でウイルス病害を抑制するために使用することができる。また、興味深く留意することに、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群のうち、Ｇａｌ－Ｓの割合を高く含有する（８９％の全糖濃度）Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１２処置群では、病害発生率が顕著に低かった。
実施例１７：化学殺真菌剤と組み合わせたＧａｌ－Ｓ－Ｌ１による予防処置は、トマト枯病の発生率を大幅に減らす。
[00199] この研究では、化学殺真菌剤のアゾキシストロビン及びジメトモルフを組み合わせたＧａｌ－Ｓ－Ｌ１処置の効果が、トマト枯病の被害を受けやすい地域のトマト作物で調査された。トマト株は、通常の農業実務に従い圃場で栽培された。移植から２０日後にトマト株に処置を施した。１５日間隔で３回の葉面散布が予定された。全糖濃度の２０％のＧａｌ－Ｓを含有するＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を２ｍｌ／Ｌで使用し、アゾキシストロビン２３％ＳＣを１ｍＬ／Ｌで使用した。組み合わせ試験では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びアゾキシストロビンの両方を散布水槽内でそれぞれ２ｍＬ／Ｌ及び１ｍＬ／Ｌで混合した。病害発生率は、各群の総植物数に対する症候性植物数の合計を記録することによって計算した。データ（図１１Ａ）から、アゾキシストロビン及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の混合組み合わせの水槽で処置された群の植物が最も少ない病害発生率を示したことは非常に明白である。これは、植物保護効果を提供するために補完的な機序を介して作用するアゾキシストロビン及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の複合効果に起因する可能性がある。同様に、トマト株は、２ｇｍ／リットルの用量のジメトモルフ５０％ＷＰ、２ｍｌ／Ｌの用量のＧａｌ－Ｓ－Ｌ１、又は水槽混合として、２ｇｍ／ｌｉｔのジメトモルフ及び２ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の組み合わせで処置された。もう一度、図１１Ｂのデータに示すように、ジメトモルフ及びＧａｌ－Ｓ－ＬＩの組み合わせは、ジメトモルフ単独よりも優れた性質を示した。これに関連して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤は、様々な化学殺真菌剤とともに使用して、その有効性を増強するために適した添加剤として役立つかもしれない。化学殺真菌剤は、植物病原体に直接作用する一方で、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１は、植物防御システムを活性化し、真菌病原体への直接作用とは関係のない植物保護プロセスに対する固有の追加の作用機序を追加する。
[00199] この研究では、化学殺真菌剤のアゾキシストロビン及びジメトモルフを組み合わせたＧａｌ－Ｓ－Ｌ１処置の効果が、トマト枯病の被害を受けやすい地域のトマト作物で調査された。トマト株は、通常の農業実務に従い圃場で栽培された。移植から２０日後にトマト株に処置を施した。１５日間隔で３回の葉面散布が予定された。全糖濃度の２０％のＧａｌ－Ｓを含有するＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を２ｍｌ／Ｌで使用し、アゾキシストロビン２３％ＳＣを１ｍＬ／Ｌで使用した。組み合わせ試験では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１及びアゾキシストロビンの両方を散布水槽内でそれぞれ２ｍＬ／Ｌ及び１ｍＬ／Ｌで混合した。病害発生率は、各群の総植物数に対する症候性植物数の合計を記録することによって計算した。データ（図１１Ａ）から、アゾキシストロビン及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の混合組み合わせの水槽で処置された群の植物が最も少ない病害発生率を示したことは非常に明白である。これは、植物保護効果を提供するために補完的な機序を介して作用するアゾキシストロビン及びＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の複合効果に起因する可能性がある。同様に、トマト株は、２ｇｍ／リットルの用量のジメトモルフ５０％ＷＰ、２ｍｌ／Ｌの用量のＧａｌ－Ｓ－Ｌ１、又は水槽混合として、２ｇｍ／ｌｉｔのジメトモルフ及び２ｍｌ／ＬのＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の組み合わせで処置された。もう一度、図１１Ｂのデータに示すように、ジメトモルフ及びＧａｌ－Ｓ－ＬＩの組み合わせは、ジメトモルフ単独よりも優れた性質を示した。これに関連して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤は、様々な化学殺真菌剤とともに使用して、その有効性を増強するために適した添加剤として役立つかもしれない。化学殺真菌剤は、植物病原体に直接作用する一方で、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１は、植物防御システムを活性化し、真菌病原体への直接作用とは関係のない植物保護プロセスに対する固有の追加の作用機序を追加する。
[00200] Ｇａｌ－Ｓ含有製剤の固有な作用機序により、これらの製剤と殺虫剤、微生物抽出物、バクテリア、真菌、ウイルス、バクテリオファージなどを含む微生物などの他の植物保護剤との組み合わせにより、植物保護特性が強化された組成物を得られることも期待している。
実施例１８：Ｇａｌ－Ｓ含有製剤で処置したシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物における植物防御経路のアップレギュレーションを示すデータ。
[00201] シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は、植物に対する様々な製品の作用機序を研究するために使用することができるモデル植物システムである。このｑＰＣＲベースのアッセイでは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）免疫系の特定の防御マーカー遺伝子を、Ｇａｌ－Ｓ液体製剤散布に応答して定量化した。プライマーペアＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号３）及びＡＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧ（配列番号４）を、ＰＤＦ１．２遺伝子をモニターするために使用し、プライマーペアＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣ（配列番号５）及びＧＣＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡ（配列番号６）をモニタリングＶＳＰ２遺伝子のために使用し、ＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧ（配列番号７）及びＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧ（配列番号８）プライマーをＰＲ１遺伝子のアッセイに使用した。このアッセイでは、健康なＡ．タリアーナ（A.thaliana）ｃｏｌ－０植物を、播種後１５日間実験室成長チャンバー内で成長させた。これらの植物の１つの群には、全糖含有量の２０％のＧａｌ－Ｓ含有液体製剤を散布し、対照（未処置植物）には水のみを散布した。処置の４８時間後、ｑＰＣＲ反応用のＲＮＡ及びｃＤＮＡ調製のために葉のサンプルを収集した。図１２に示すデータは、処置群に対して正規化された。ＰＲ１、ＰＤＦ１．２及びＶＳＰ２遺伝子は、大幅にアップレギュレートされていることがわかった。このデータは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤の作用機序の見識を提供し、植物の防御遺伝子のアップレギュレーションにより機能してもよい。興味深いことに、ＰＤＦ１．２遺伝子は、ジャスモン酸経路に関連する抗真菌遺伝子として注釈が付けられているが、ＰＲ１遺伝子は、植物内の全身性獲得抵抗性経路が関連していることが知られている。ＶＳＰ２遺伝子は、防虫活性を有していると報告されている。したがって、このデータはまた、本明細書に提示されるＧａｌ－Ｓ製剤の植物保護効果（例えば、抗ウイルス性及び抗真菌性）に関する実験的観察を裏付けている。
[00201] シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は、植物に対する様々な製品の作用機序を研究するために使用することができるモデル植物システムである。このｑＰＣＲベースのアッセイでは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）免疫系の特定の防御マーカー遺伝子を、Ｇａｌ－Ｓ液体製剤散布に応答して定量化した。プライマーペアＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号３）及びＡＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧ（配列番号４）を、ＰＤＦ１．２遺伝子をモニターするために使用し、プライマーペアＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣ（配列番号５）及びＧＣＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡ（配列番号６）をモニタリングＶＳＰ２遺伝子のために使用し、ＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧ（配列番号７）及びＡＡＴＡＡＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧ（配列番号８）プライマーをＰＲ１遺伝子のアッセイに使用した。このアッセイでは、健康なＡ．タリアーナ（A.thaliana）ｃｏｌ－０植物を、播種後１５日間実験室成長チャンバー内で成長させた。これらの植物の１つの群には、全糖含有量の２０％のＧａｌ－Ｓ含有液体製剤を散布し、対照（未処置植物）には水のみを散布した。処置の４８時間後、ｑＰＣＲ反応用のＲＮＡ及びｃＤＮＡ調製のために葉のサンプルを収集した。図１２に示すデータは、処置群に対して正規化された。ＰＲ１、ＰＤＦ１．２及びＶＳＰ２遺伝子は、大幅にアップレギュレートされていることがわかった。このデータは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤の作用機序の見識を提供し、植物の防御遺伝子のアップレギュレーションにより機能してもよい。興味深いことに、ＰＤＦ１．２遺伝子は、ジャスモン酸経路に関連する抗真菌遺伝子として注釈が付けられているが、ＰＲ１遺伝子は、植物内の全身性獲得抵抗性経路が関連していることが知られている。ＶＳＰ２遺伝子は、防虫活性を有していると報告されている。したがって、このデータはまた、本明細書に提示されるＧａｌ－Ｓ製剤の植物保護効果（例えば、抗ウイルス性及び抗真菌性）に関する実験的観察を裏付けている。
実施例１９－飼料にＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を配合することにより屋外の飼育所でティラピア稚魚の生存率の向上
[00202] 体重０．１～０．２ｇｍのティラピア稚魚（Oreochromis niloticus（ＧＩＦＴ－遺伝子組み換え養殖ティラピア））を１５０リットルの屋外セメント水槽に１稚魚／リットルの密度で、遮光ネット条件下で３回に分けて飼育した。魚の稚魚には、体重の１０％の給餌レベルで３４％のタンパク質含有量の浮遊飼料を１日３回給餌した。実験中、人工通気は行われなかった。水交換は３～４日に１回実施した。処置水槽に、１ｇ／ｋｇの飼料の投与量でＧａｌ－Ｓ－Ｌ１液体と事前に混合された飼料を与え、対照水槽には、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１なしの飼料を与えた。この実験は、２８日間実施され、この期間が終了した時点の稚魚の生存は、図１３に示された。飼料にＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を配合すると、魚の稚魚の生存率が高まることが観察されている。本実施例では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を含有のあらかじめ混合された飼料は、稚魚の改善することが示されたＧａｌ－Ｓ飼料の有効投与量、１０ｍｇ／ｋｇを有していた。
[00202] 体重０．１～０．２ｇｍのティラピア稚魚（Oreochromis niloticus（ＧＩＦＴ－遺伝子組み換え養殖ティラピア））を１５０リットルの屋外セメント水槽に１稚魚／リットルの密度で、遮光ネット条件下で３回に分けて飼育した。魚の稚魚には、体重の１０％の給餌レベルで３４％のタンパク質含有量の浮遊飼料を１日３回給餌した。実験中、人工通気は行われなかった。水交換は３～４日に１回実施した。処置水槽に、１ｇ／ｋｇの飼料の投与量でＧａｌ－Ｓ－Ｌ１液体と事前に混合された飼料を与え、対照水槽には、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１なしの飼料を与えた。この実験は、２８日間実施され、この期間が終了した時点の稚魚の生存は、図１３に示された。飼料にＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を配合すると、魚の稚魚の生存率が高まることが観察されている。本実施例では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１を含有のあらかじめ混合された飼料は、稚魚の改善することが示されたＧａｌ－Ｓ飼料の有効投与量、１０ｍｇ／ｋｇを有していた。
実施例２０－Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の単回投与後のウシエビ（P.monodon）エビ（後期仔魚）における免疫系遺伝子及び抗菌ペプチドのアップレギュレーション
[00203] ウシエビ（P.monodon）の後期仔魚（ＰＬ－２０）を２つの水槽（対照及び処置）で４８時間順化させた。各水槽の容量は、３５ｌｉｔであった。ＰＬ－２０の飼育密度は、水槽あたり１０００ＰＬであった。各水槽の塩分濃度は、１５ｐｐｔに維持された。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１は、処置水槽に０．０３ｍｌ／Ｌの投与量で追加する一方で、対照水槽はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を与えなかった。
６匹のエビ（約６０ｍｇ）を１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ（ＭＣＴ）に集め、６００μｌのＴＲＩ試薬と混合して氷上に置いた。エビの組織を、組織マセレーターを使用して完全に均質化した。サンプルを－８０℃で保存した。エビのサンプルは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の添加後、最大４８時間後まで、異なる時間間隔で両方の水槽から収集された。これらは、標準プロトコルによるＲＮＡ抽出及び精製に供され、ペナイジン３、ペナイジン５、スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＦ－ｋＢ、ＨＳＰ７０、リゾチーム、プロフェノールオキシダーゼ、クラスチン１、クラスチン４、クラスチン５、ＥＦ－１アルファ（ハウスキーピング遺伝子）遺伝子の遺伝子アップレギュレーションは、社内プロトコルを使用したｑＰＣＲによって定量化された。対照と比較した、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置エビにおけるこれらの免疫関連及び抗菌ペプチド遺伝子のアップレギュレーションを図１５に示す。免疫関連及び抗菌ペプチド遺伝子が、対照と比較して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置において高度にアップレギュレートされたことが、グラフから分かる。
[00203] ウシエビ（P.monodon）の後期仔魚（ＰＬ－２０）を２つの水槽（対照及び処置）で４８時間順化させた。各水槽の容量は、３５ｌｉｔであった。ＰＬ－２０の飼育密度は、水槽あたり１０００ＰＬであった。各水槽の塩分濃度は、１５ｐｐｔに維持された。Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１は、処置水槽に０．０３ｍｌ／Ｌの投与量で追加する一方で、対照水槽はＧａｌ－Ｓ－Ｌ１を与えなかった。
６匹のエビ（約６０ｍｇ）を１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ（ＭＣＴ）に集め、６００μｌのＴＲＩ試薬と混合して氷上に置いた。エビの組織を、組織マセレーターを使用して完全に均質化した。サンプルを－８０℃で保存した。エビのサンプルは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の添加後、最大４８時間後まで、異なる時間間隔で両方の水槽から収集された。これらは、標準プロトコルによるＲＮＡ抽出及び精製に供され、ペナイジン３、ペナイジン５、スーパーオキシドジスムターゼ、ＮＦ－ｋＢ、ＨＳＰ７０、リゾチーム、プロフェノールオキシダーゼ、クラスチン１、クラスチン４、クラスチン５、ＥＦ－１アルファ（ハウスキーピング遺伝子）遺伝子の遺伝子アップレギュレーションは、社内プロトコルを使用したｑＰＣＲによって定量化された。対照と比較した、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置エビにおけるこれらの免疫関連及び抗菌ペプチド遺伝子のアップレギュレーションを図１５に示す。免疫関連及び抗菌ペプチド遺伝子が、対照と比較して、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１処置において高度にアップレギュレートされたことが、グラフから分かる。
実施例２１：Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の粉末製剤を飼料に配合することによる商業ブロイラーの体液性免疫の向上
[00204] 合計４２０羽（１日齢）のブロイラー（Vencobb-400）を、それぞれ５羽の鶏を含む８４の囲い（３段の電池飼育器）に無作為に分割した。この実験では、１６個の反復の囲いが各処置に割り当てられた。全ての鶏に、同じ基礎飼料を段階的に与えた。ここでは、２つの処置、例えば、対照及び処置の結果について説明する。処置では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と同等の組成を有する粉末製剤を、市販のブロイラーの養鶏飼料に１ｇ／ｋｇの用量で配合し、対照は基礎飼料のみとした。
鳥は、到着時に翼にタグ付けされ、体重を計測し、ＭＤワクチンを接種し、適切な給餌器及び給水器で食餌及び水を任意に与えた。飼育は２１日まで白熱電球の助けを借りて行われた。鳥に、５日目及び２８日目にＮＤラソタワクチン（ND Lasota vaccine）を、１０日目及び１６日目にＩＢＤワクチンを接種した。給餌実験は、５週間にわたり実施された。
ＨＩ試験は、５週齢で採取された血清サンプルで実施された。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原（ラソタ（LaSota）ウイルスストック）の血球凝集力価を、４単位の血球凝集活性を含むように希釈によって調整した。血球凝集阻害力価を、ニワトリＲＢＣのＮＤＶ凝集を阻害した血清サンプルの最高希釈度として決定した。対照と比較したブロイラー飼料にＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の粉末製剤を含めた場合のＨＩ力価の増加を図１６に示し、Ｇａｌ－Ｓ含有製剤が飼料に配合することで、動物保護効果を示すことを示している。
下の表は、１．５ｇ／ｋｇ飼料の濃度でＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の粉末製剤を給餌された鳥の死亡率の変化を示す。
[00204] 合計４２０羽（１日齢）のブロイラー（Vencobb-400）を、それぞれ５羽の鶏を含む８４の囲い（３段の電池飼育器）に無作為に分割した。この実験では、１６個の反復の囲いが各処置に割り当てられた。全ての鶏に、同じ基礎飼料を段階的に与えた。ここでは、２つの処置、例えば、対照及び処置の結果について説明する。処置では、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１と同等の組成を有する粉末製剤を、市販のブロイラーの養鶏飼料に１ｇ／ｋｇの用量で配合し、対照は基礎飼料のみとした。
鳥は、到着時に翼にタグ付けされ、体重を計測し、ＭＤワクチンを接種し、適切な給餌器及び給水器で食餌及び水を任意に与えた。飼育は２１日まで白熱電球の助けを借りて行われた。鳥に、５日目及び２８日目にＮＤラソタワクチン（ND Lasota vaccine）を、１０日目及び１６日目にＩＢＤワクチンを接種した。給餌実験は、５週間にわたり実施された。
ＨＩ試験は、５週齢で採取された血清サンプルで実施された。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗原（ラソタ（LaSota）ウイルスストック）の血球凝集力価を、４単位の血球凝集活性を含むように希釈によって調整した。血球凝集阻害力価を、ニワトリＲＢＣのＮＤＶ凝集を阻害した血清サンプルの最高希釈度として決定した。対照と比較したブロイラー飼料にＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の粉末製剤を含めた場合のＨＩ力価の増加を図１６に示し、Ｇａｌ－Ｓ含有製剤が飼料に配合することで、動物保護効果を示すことを示している。
下の表は、１．５ｇ／ｋｇ飼料の濃度でＧａｌ－Ｓ－Ｌ１の粉末製剤を給餌された鳥の死亡率の変化を示す。
製剤は、飼料の１．５ｇ／ｋｇで添加された場合に死亡率を改善し、ブロイラーの場合の配合物の動物保護効果を示している。
実施例２２：Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１の粉末製剤を飼料に配合することによる商業ブロイラーの抗酸化状態の向上
[00205] この実験は、上記の実施例２１で説明したように実施された。グルタチオンレダクターゼは、グルタチオンジスルフィド（GSSG）をグルタチオン（GSH）に還元する。血清中のＧＳＨレベルは抗酸化状態を改善し、酸化ストレスに対する耐性を促進する。血清グルタチオンレダクターゼの活性の増加は、血清中のＧＳＨレベルがより速く回復し、それによって酸化ストレスに対する耐性が増加することを示す。血清グルタチオンレダクターゼを、標準的なプロトコルに従って推定した。図１７は、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１ｗ．ｒ．ｔ対照の粉末製剤を配合した場合の血清グルタチオンレダクターゼ活性の増加を示す。このアッセイでは、１ユニットのグルタチオンレダクターゼ酵素は、１分あたり１マイクロモルのＮＡＤＰＨを酸化できるものと等価である。したがって、Ｇａｌ－Ｓ含有製剤は、動物の抗酸化状態を改善することにより、動物保護効果を有することができる。
[00205] この実験は、上記の実施例２１で説明したように実施された。グルタチオンレダクターゼは、グルタチオンジスルフィド（GSSG）をグルタチオン（GSH）に還元する。血清中のＧＳＨレベルは抗酸化状態を改善し、酸化ストレスに対する耐性を促進する。血清グルタチオンレダクターゼの活性の増加は、血清中のＧＳＨレベルがより速く回復し、それによって酸化ストレスに対する耐性が増加することを示す。血清グルタチオンレダクターゼを、標準的なプロトコルに従って推定した。図１７は、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１ｗ．ｒ．ｔ対照の粉末製剤を配合した場合の血清グルタチオンレダクターゼ活性の増加を示す。このアッセイでは、１ユニットのグルタチオンレダクターゼ酵素は、１分あたり１マイクロモルのＮＡＤＰＨを酸化できるものと等価である。したがって、Ｇａｌ－Ｓ含有製剤は、動物の抗酸化状態を改善することにより、動物保護効果を有することができる。
実施例２３：Ｇａｌ－Ｓ製剤によるシロイヌナズナ（Arabidopsis）の防御経路のアップレギュレーションは、Ｇａｌ－Ｓの閾値濃度を超えてのみ引き起こされる。
[00206] ＰＤＦ１．２及びＶＳＰ２などの防御遺伝子マーカーは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１スプレー＠２ｍｌ／Ｌ及びＧａｌ－Ｓスプレー＠８ｍｇ／Ｌに応答して、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物で定量化された。植物に２ｍｌ／Ｌで適用した場合のＧａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤は、植物に接触してＧａｌ－Ｓ濃度が２８ｍｇ／Ｌになる。この実験は、実施例１８に記載されたプロトコルに従って実施された。図１８に示されているデータは、免疫遺伝子ＰＤＦ１．２及びＶＳＰ２の相対的な発現が、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤と比較してＧａｌ－Ｓ ８ｍｇ／Ｌ処置では、顕著に低いことを明確に示す。実施例１４に提示されたデータに加えてこの発見は、Ｇａｌ－Ｓ含有製剤の植物保護効果は、最終用途において８ｍｇ／Ｌの閾値濃度を超えてのみ引き起こされることを明確に示す。
[00206] ＰＤＦ１．２及びＶＳＰ２などの防御遺伝子マーカーは、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１スプレー＠２ｍｌ／Ｌ及びＧａｌ－Ｓスプレー＠８ｍｇ／Ｌに応答して、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物で定量化された。植物に２ｍｌ／Ｌで適用した場合のＧａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤は、植物に接触してＧａｌ－Ｓ濃度が２８ｍｇ／Ｌになる。この実験は、実施例１８に記載されたプロトコルに従って実施された。図１８に示されているデータは、免疫遺伝子ＰＤＦ１．２及びＶＳＰ２の相対的な発現が、Ｇａｌ－Ｓ－Ｌ１製剤と比較してＧａｌ－Ｓ ８ｍｇ／Ｌ処置では、顕著に低いことを明確に示す。実施例１４に提示されたデータに加えてこの発見は、Ｇａｌ－Ｓ含有製剤の植物保護効果は、最終用途において８ｍｇ／Ｌの閾値濃度を超えてのみ引き起こされることを明確に示す。
本開示の利点：
[00207] 本開示は、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物に関する。本開示は、予想外で驚くべき発見であり、公表された文献に反して、単糖類のガラクトース硫酸塩を豊富に含む組成物が、生物の免疫応答経路などの保護システムを刺激する特性を与え、様々な植物及び動物の病原体及び非生物的ストレスに対して顕著な保護を供給することが記述されている。
[00207] 本開示は、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む組成物に関する。本開示は、予想外で驚くべき発見であり、公表された文献に反して、単糖類のガラクトース硫酸塩を豊富に含む組成物が、生物の免疫応答経路などの保護システムを刺激する特性を与え、様々な植物及び動物の病原体及び非生物的ストレスに対して顕著な保護を供給することが記述されている。
[00208] さらに、本開示は、植物及び動物の免疫系を刺激する前述の保護及び治療活性が、特定の金属イオンなどの微量元素の添加によって、かなり増強されるという驚くべき発見を提供する。
[00209] さらに、ガラクトース硫酸塩と金属イオン及び／又はサリチル酸などの天然植物防御活性剤及び／又はベータアミノ酪酸などのアミノ酸の組み合わせも、前の物質のいずれかによって単独で達成されるよりも、時にははるかに防御応答をさらに改善する。
[00210] さらに、ガラクトース硫酸塩含有組成物と抗真菌剤との組み合わせもまた、植物保護効果を提供するために、そのような組み合わせの有効性を増強する。
Claims (44)
- ａ）少なくとも１つの硫酸化ガラクトース；及び
ｂ）二糖、三糖、四糖、五糖、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの糖
を含む、組成物。 - ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、レブリン酸、ギ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される糖類の少なくとも１つの誘導体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの硫酸化ガラクトースが、全糖含有量に対して１５～９０％の範囲の重量パーセントを有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの糖が、カッパ－カラビオース、カッパ－カラトリオース、カッパ－カラテトラオース、イオタ－カラビオース、イオタ－カラトリオース、イオタ－カラテトラオース、ラムダ－カラビオース、ラムダ－カラトリオース、ラムダ－カラテトラオース及びそれらの塩からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、２５～１５０ｇ／ｌの範囲の全糖含有量を有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、乾燥形態で１００～６００ｇ／ｋｇの範囲の全糖含有量を有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、溶媒、希釈剤、乳化剤、安定化剤、動物飼料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの硫酸化ガラクトースが、前記組成物の全固形分の５～９０％の範囲の重量パーセントを有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの硫酸化ガラクトース対前記少なくとも１つの糖成分が、１：５から５０：１の範囲の重量比を有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記少なくとも１つの糖の誘導体対前記少なくとも１つの硫酸化ガラクトースが、９：１から２：１の範囲の重量比を有する、請求項２に記載の組成物。
- 前記組成物が、微量元素、天然植物防御活性化因子、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記微量元素が、ホウ素、亜鉛、鉄、マンガン、マグネシウム、モリブデン、カルシウム、カリウム、セレン、銅の組み合わせ及びそれらの塩からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
- 前記天然植物防御活性化因子が、サリチル酸、ベータアミノ酪酸、それらの組み合わせ及びそれらの塩からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
- 前記組成物が、カラギーナン又は処理されたキリンサイ（Eucheuma）又は半精製カラギーナンを処理することによって得られる、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、カラギーナンを含有する紅藻を処理することによって得られる、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、生物的ストレスに対する植物の保護を提供する、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、生物的及び非生物的ストレスに対する動物の保護を提供する、請求項１に記載の組成物。
- 請求項１に記載の組成物を調製するための方法であって、前記プロセスが、
ａ）多糖の混合物を有する物質を水と接触させてスラリーを得ること；
ｂ）加水分解により前記スラリーを解重合して加水分解物を得ること；
ｃ）前記加水分解物を濃縮して、１８～３５の範囲のブリックス値を有する糖濃度を達成して、液体形態で前記組成物を得ること、又は任意選択により、前記加水分解物を乾燥させて、粉末形態で前記組成物を得ること
を含む、方法。 - 請求項１８に記載のプロセスであって、前記プロセスが、
ａ）紅藻を水と接触させて、全固形分が５～２０％の範囲のスラリーを得ること；
ｂ）前記スラリーを、１．０～４．０の範囲のｐＨ、５０～１８０℃の範囲の温度、０．５～１０気圧の範囲の圧力で、１０分～５時間の範囲の時間で解重合して、加水分解物を得ること；
ｃ）前記加水分解物を濃縮して、１８～３５の範囲のブリックス値を有する糖濃度を達成して、液体形態で前記組成物を得ること；
ｄ）任意選択により、前記加水分解物を乾燥させて、粉末形態で前記組成物を得ること
を含む、プロセス。 - 請求項１８に記載のプロセスであって、前記プロセスが、
ａ）カラギーナンを水と接触させて、全固形分が５～２０％の範囲のスラリーを得ること；
ｂ）前記スラリーを、１．０～４．０の範囲のｐＨ、５０～１８０℃の範囲の温度、０．５～１０気圧の範囲の圧力で、１０分～５時間の範囲の時間で解重合して、加水分解物を得ること；
ｃ）前記加水分解物を濃縮して、１８～３５の範囲のブリックス値を有する糖濃度を達成して、前記組成物を得ること；
ｄ）任意選択により、前記加水分解物を乾燥させて、粉末形態で前記組成物を得ること
を含む、プロセス。 - 植物を処置するための方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物を得ること；
ｂ）前記植物を処置するために、前記組成物を前記植物又は前記植物の一部と接触させること
を含む、方法。 - 前記接触させる組成物が、前記組成物に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む、請求項２１に記載の方法。
- 葉面散布、土壌散布、種子処置、植物組織への注入、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって前記組成物を前記植物と接触させる、請求項２１に記載の方法。
- 前記方法が、葉面散布によって前記組成物を植物と接触させることを含み、前記葉面散布は、５０～１０００ｍｌ／エーカーの作物の割合で前記組成物に接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記葉面散布は植物の成長段階で行われ、前記散布は移植後１０～１５日で行われ、その後の散布は開花及び結実の開始まで１０～１５日の間隔で行われる、請求項２１に記載の方法。
- 接触が、陰イオン性、イオン性、非イオン性界面活性剤、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Brij 721、胆汁酸塩、ポリオキシルヒマシ油、ノニルフェノールエトキシレート、シクロデキストリン、レシチン、塩化メチルベンゼトニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの浸透剤と組み合わせて行われる、請求項２１に記載の方法。
- 接触が、海藻抽出物、タンパク質加水分解物、フミン酸、フルボ酸、微生物抽出物、及びバイオ肥料からなる群から選択される少なくとも１つのバイオエンハンサーと組み合わせて行われる、請求項２１に記載の方法。
- 接触が、殺真菌剤、殺虫剤、微生物抽出物、及びバクテリア、真菌、ウイルス、バクテリオファージなどを含む微生物からなる群から選択される少なくとも１つの植物保護剤と組み合わせて行われる、請求項２１に記載の方法。
- 植物防御経路活性化因子としての使用のための、請求項１に記載の組成物。
- 植物を感染及び生物的ストレスから保護することにおける使用のための、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記植物又は前記植物の部分と接触させる前記組成物に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む、請求項２９又は３０のいずれか一項に記載の組成物。
- 動物を処置するための方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物を得ること；
ｂ）前記動物を処置するために、前記組成物を前記動物又は前記動物の部分に投与すること
を含む、方法。 - 前記方法が、ａ）前記動物が使用する水への、又はｂ）飼料注入による、又はｃ）局所適用による、又はｄ）前記組成物を動物組織に注入する、及び／又はそれらの組み合わせの、組成物の添加を含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記組成物が、前記動物に与えられる飼料に対して少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記組成物が、前記動物を生育する養殖用水に対して少なくとも３０ｍｇ／メートルトンの濃度を有する、少なくとも１つの硫酸化ガラクトースを含む、請求項３２に記載の方法。
- 植物を感染から保護するための、硫酸化ガラクトースの使用。
- 植物防御経路を活性化させるための、硫酸化ガラクトースの使用。
- 感染症又は非生物的ストレスから動物を保護するための、硫酸化ガラクトースの使用。
- 感染した植物を処置するための、硫酸化ガラクトースの使用。
- 感染した動物を処置するための、硫酸化ガラクトースの使用。
- 動物の免疫及びストレス耐性を刺激するための、硫酸化ガラクトースの使用。
- 硫酸化ガラクトースが、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度を有する、請求項３６、３７又は３９のいずれか一項に記載の使用。
- 硫酸化ガラクトースが、動物飼料の少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの濃度を有する、請求項３８、４０又は４１のいずれか一項に記載の使用。
- 硫酸化ガラクトースが、動物を生育する養殖用水の少なくとも３０ｍｇ／メートルトンの濃度を有する、請求項３８、４０又は４１のいずれか一項に記載の使用。
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