KR101287490B1

KR101287490B1 - 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물

Info

Publication number: KR101287490B1
Application number: KR1020110083327A
Authority: KR
Inventors: 권순배; 신지은
Original assignee: 강원도
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2013-07-23
Also published as: KR20130025451A

Abstract

본 발명은 떡갈나무 충영 추출물(Quercus dentata gall extracts)을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 다양한 식물 바이러스에 대하여 탁월한 항바이러스 효과를 나타내어 식물 바이러스 예방 및/또는 치료가 가능하다.
한편, 본 발명의 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 천연물 유래의 떡갈나무 충영 추출물을 주요 재료로 하여 독성이 없어 식물 바이러스를 예방 및/또는 치료시 작업자의 안전을 확보하면서 식물 바이러스 감염 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물{Composition for controlling plant viruses containing Quercus dentata gall extracts}

본 발명은 떡갈나무 충영 추출물(Quercus dentata gall extracts)을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물에 관한 것이다.

바이러스병이 언제부터 발생하였는지 그 기원은 정확하게 알 수 없지만, 우리가 알고 있는 많은 종류의 바이러스병이 상당히 오래 전부터 사람을 비롯하여 동물과 식물에서 발생하고 있었다는 것은 여러 기록에서 발견된다. 오늘날 바이러스가 사람을 비롯하여 동물과 식물에 여러 가지 무서운 질병을 일으키는 중요한 병원체라는 것을 모르는 사람은 별로 없지만, 이러한 바이러스의 존재가 실제로 밝혀진 것은 19세기 말로서 불과 100여 년 전의 일이다.

과거 식물 바이러스병 중에서 일찍부터 기록된 것은 튤립의 모자이크병이다. 튤립이 이 병에 걸리면 꽃잎에 얼룩무늬가 생긴다는 것을 1576년 프랑스의 식물학자 Clusius가 처음으로 기재하였다. 그 원인으로는 약 300년이 지난 1926년에 이르러서야 꽃잎에 얼룩무늬는 바이러스병 때문에 나타나며, 병에 걸린 식물의 즙액과 진딧물의 매개로 병이 전염된다는 사실이 밝혀졌다.

1892년 담배모자이크병이 바이러스라고 하는 새로운 병원체(tobacco mosaic virus, TMV)로서 주목을 받으면서 동식물을 통하여 최초로 바이러스의 개념이 탄생되었다. 그 후 우리 주변의 생물들로부터 수많은 바이러스병이 알려지게 되었고 이러한 과정에서 바이러스가 생물학의 발전에 미친 영향은 대단히 크다.

바이러스는 그 스스로 완전한 생명체 단위를 가지는 세균세포와는 달리, 새로운 바이러스 개체를 번식하기 위해서 숙주세포를 이용한다. 바이러스들은 그들이 침입한 세포의 복제기관을 이용하여 증식하면서, 수많은 질병을 일으키기도 한다. 바이러스는 수많은 감염전략을 가지고 있다. 각 바이러스 계통(strain)은 각각 고유의 표면분자 구조를 가지고 있다. 이러한 표면분자들은 자물쇠중의 열쇠 역할을 하여, 바이러스로 하여금 target cell의 막에 대하여 정확히 바이러스 표면의 분자들이 맞춰져(fitting)서 숙주세포에 들어갈 수 있도록 한다.

바이러스의 진화는 다양한 유전적 변이, 유전의 다양성, 숙주세포 내에서 효율적인 복제, 그리고 숙주에서의 생존가능성에 의하여 이루어진다고 할 수 있다. 이러한 결과로 바이러스는 모든 형태의 생명체에 적응하여 왔으며, 인간, 가축 및 식물의 질병을 일으키는 수많은 생태학적인 지위(ecological niches)를 차지하게 되었다.

식물 바이러스병을 치료를 위해 화학물질을 이용한 치료연구는 50년 이상의 오랜 역사를 가지고 있어 지금까지 대사길항물질, 고등식물유래물질, 미생물유래물질 등 많은 물질의 항바이러스 작용이 조사되었지만 실용적인 항바이러스제로서 이용되고 있는 것은 거의 없다. 감염억제제로서 milk 또는 skim milk의 TMV병 예방을 위한 이용, 해초에서 유래된 알긴산(alginic acid)의 담배모자이크바이러스(tobacco mosaic virus : TMV) 방제약제로서의 이용, 광물유나 유지류의 진딧물전염성 바이러스 감염억제제의 이용 등이 현재까지 어느 정도 실용화되고 있을 뿐이다.

현재 일본에서는 담배에 병을 일으키는 담배모자이크바이러스(tobacco mosaic virus : TMV)의 감염저해제로서 아르긴산나트륨에 카세인을 혼합한 AC제가 농약으로 사용되고 있으며 같은 형태의 저해제로서 최근 표고균사체 추출물이 토마토, 피망의 TMV 병에 대한 농약으로 등록된 바 있다. 그럼에도 불구하고 실제 쓰이는 항바이러스제로는 Sodium alginate, Peptide glucan 등으로 손꼽힌다. 여러 종류의 화학제, 항생제, 효소 및 천연추출물질 등을 식물감염 바이러스에 in vivo나 in vitro로 처리하였을 때 바이러스 불활성화 정도는 처리 종류, 농도, 처리시간, 바이러스의 농도 등에 따라 반응하는 양상이 다르게 나타난다. 그래서 바이러스종별로 물리, 화학적인 조건, 다양한 식물체와 미생물에서 추출, 분리된 단백질류, 펩타이드류, 다당류를 이용한 바이러스 불활성화 및 감염, 증식억제 실험이 이루어져야한다.

지금까지 식물 바이러스병의 방제는 주로 식물재배시기의 조절, 무병 식물체 재배 등의 경종적 방법과 바이러스 매개체인 해충을 구제하는 방법 등을 사용하였으나 이들은 간접적인 방제수단으로서 한계가 있다.

식물바이러스병에 직접적인 방제수단으로 소디움 알지닉 액시드와 표고버섯(Lentinus edodes) 균사체 추출물 그리고 우유 등이 개발되어 있으나 방제효과가 그다지 크지 못하였다. 또한, 미라빌리스 잘라파(Mirabilis jalapa, Kubo 등, 1990), 파이토라카 아메리카나, 보에라비아 디퓨사, 포메스 포멘타리우스 등이 생산하는 단백질과 당 단백질성분은 전신이행 효과를 갖는 항바이러스 물질로 보고되었으나 생산성과 독성 등의 문제로 상용화되지는 못하였다.

본 발명에서 용어, "떡갈나무(Quercus dentata)"란 천연, 잡종 또는 변종의 떡갈나무를 모두 포함하고, 바람직하게는 한국에서 자생하는 천연 떡갈나무에 관한 것이다. 떡갈나무(Quercus dentata)는 전국의 표고 800m 이하의 해변가의 야산이나 섬에 분포하며 높이 20m, 지름 0.7m까지 자랄 수 있는 참나무과의 낙엽활엽교목이다. 견과의 열매인 도토리는 10월에 익으며, 긴 타원형으로 길이 10∼27mm이다. 목질이 단단하므로 용재와 신탄재로 사용하고, 나무 껍질은 타닌 함량이 많으므로 타닌 원료로 쓰이며, 잎은 떡을 싸는 데 쓰이기도 하였다.

이 떡갈나무에는 종종 어리상수리혹벌(Trichagalma Serratae)에 기생당하여 벌레혹이 생기는데 이를 충영(蟲??, gall)이라 한다. 그 주성분으로 펜타디갈로일글루코오스, 몰식자산, 엘라그산, 시클로갈리파르산, 디갈루스산 등이 보고되고 있다. 이는 산업적으로 물감, 잉크 등으로 이용되며, 의학적으로 수렴제 등으로 이용되고 있지만, 아직까지 떡갈나무 충영 추출물의 식물바이러스에 대한 항바이러스 활성을 살펴본 예는 없다.

본 발명의 목적은 식물 바이러스 방제 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 다양한 식물 바이러스에 대하여 탁월한 항바이러스 효과를 나타내어 식물 바이러스 예방 및/또는 치료가 가능하다.

한편, 본 발명의 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 천연물 유래의 떡갈나무 충영 추출물을 주요 재료로 하여 독성이 없어 식물 바이러스를 예방 및/또는 치료시 작업자의 안전을 확보하면서 식물 바이러스 감염 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1a은 잔티엔씨 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc)에 대해 KN0912 처리(사진 상부) 및 멸균 증류수의 처리(사진 하부)에 대한 각각의 PMMoV 감염억제 효과를 나타낸 사진이고, 도 1b는 명아주(Chenopodium amaranticolor)에 대해 KN0912 처리(사진 상부) 및 멸균 증류수의 처리(사진 하부)에 대한 각각의 CMV 감염억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 정상적인 PMMoV 입자를 나타낸 사진이고, 도 2b는 PMMoV 입자에 KN0912 첨가 후 파손된 PMMoV 입자를 나타낸 사진이다.

본 발명은 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물을 나타낸다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 식물 바이러스 방제 조성물 전체 중량 대비 0.5∼99.9％를 포함될 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 식물 바이러스 방제 조성물 전체 중량 대비 1∼99％를 포함될 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 식물 바이러스 방제 조성물 전체 중량 대비 10∼90％를 포함될 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 떡갈나무 충영을 떡갈나무 충영 중량 3∼10배량의 정제수에 첨가하고 50∼70℃에서 2∼4시간 동안 추출하고 여과한 다음 건조한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 떡갈나무 충영을 떡갈나무 충영 중량 7배량의 정제수에 첨가하고 60℃에서 3시간 동안 추출하고 여과한 다음 건조한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 떡갈나무 충영을 떡갈나무 충영 중량 3∼10배량의 유기용매에 첨가하고 35∼45℃에서 12∼48시간 동안 50∼300rpm으로 교반처리 또는 20∼100kHz 파장의 초음파 처리하에서 추출하고 여과한 다음 건조한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 떡갈나무 충영을 떡갈나무 충영 중량 6배량의 유기용매에 첨가하고 40℃에서 24시간 동안 100rpm으로 교반처리하에서 추출하고 여과한 다음 건조한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물은 떡갈나무 충영을 떡갈나무 충영 중량 6배량의 유기용매에 첨가하고 40℃에서 24시간 동안 60±5kHz 파장의 초음파 처리하에서 추출하고 여과한 다음 건조한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물을 얻을 때 사용하는 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물을 얻을 때 사용하는 용매는 메탄올(methanol)을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물을 얻을 때 사용하는 떡갈나무 충영은 천연, 잡종 또는 변종의 떡갈나무가 어리상수리혹벌(Trichagalma Serratae)에 기생당하여 생긴 벌레혹을 건조한 다음 분쇄된 것을 사용할 수 있다.

상기에서 떡갈나무 충영 추출물을 얻을 때 사용하는 떡갈나무 충영은 천연, 잡종 또는 변종의 떡갈나무가 어리상수리혹벌(Trichagalma Serratae)에 기생당하여 생긴 벌레혹을 건조한 다음 100∼300메쉬(mesh)의 크기로 분쇄된 것을 사용할 수 있다.

상기에서 식물 바이러스는 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 고추마일드모틀바이러스(Pepper mild mottle virus, PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(Watermelon mosaic virus, WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스 Y(Potato virus Y, PVY), 순무모자이크바이러스(Turnip Mosaic Virus, TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(Cucumber green mottle mosaic tobamovirus, CGMMV), 쥬키니녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(Potato Leafroll Virus, PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(Lily symptomless virus, LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(Cymbidium mosaic virus, CyMV), 잠두위축바이러스(Broad been wilt virus, BBWV), 토마토윤점바이러스(TomRSV), 담배윤점바이러스(TRSV), 토마토황화괴저저바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV), 딸기바이러스(strawberry mottle virus, SMoV), 선인장 X바이러스(Cactus Virus X, CVX) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 나타낸다.

상기에서 식물 바이러스 방제 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제, 도포제 중에서 선택된 어느 하나의 형태로 제형화 될 수 있다.

상기에서 식물 바이러스 방제 조성물은 주요 재료인 떡갈나무 충영 추출물 이외에 제형화를 위해 다양한 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 성분으로써 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 및 보조제 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기의 액체 담체의 일예로서 물(water), 식물유(vegetable oil), 에탄올(ethanol) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 상기 식물유의 일예로 대두유, 유채씨기름, 야자유, 팜핵유, 미강유, 옥수수유, 팜유, 올리브유 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기의 고체 담체의 일예로서 광물 분말, 젤라틴, 알긴산 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 상기 광물 분말의 일예로 양이온 점토(cation clay), 벤토나이트(bentonite), 카올린(kaolin), 탈크(Talc), 규조토(diatomaceous earth) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기의 계면활성제의 일예로서 에틸렌옥사이드(Ethyleneoxide)계, 다이에탄올아민(Diethanolamine)계, 솔비톨(Sorbitol)계, 글리세린(Glycerine)계 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기의 보조제의 일예로서 증량제, 부동액, 용제, 증점제, 전착제 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기에서 식물 바이러스 방제 조성물은 주요 재료인 떡갈나무 충영 추출물 이외에 제형화를 위해 다양한 성분에 대해서는 상기에서 언급한 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 및 보조제 중에서 선택된 어느 하나 이상을 당업자가 적의 선택하여 사용할 수 있으면 족하므로 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

본 발명의 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제 조성물을 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명은 식물 바이러스 방제방법을 포함한다.

본 발명은 상기에서 언급한 식물 바이러스 방제 조성물을 이용한 식물 바이러스 방제방법을 포함한다.

본 발명은 상기에서 언급한 식물 바이러스 방제 조성물을 원예작물의 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지절단 또는 농기구소독에 적용하여 식물 바이러스를 방제할 수 있는 방법을 포함한다.

이하 본 발명의 내용을 제조예, 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 떡갈나무 충영 메탄올 추출물 제조

참나무과(Fagaceae)의 떡갈나무(Quercus dentata Thunb)에서 어리상수리혹벌(Trichagalma Serratae)의 자극에 의하여 만들어진 떡갈나무 충영(gall)을 강원도 강릉 사천면에서 수집하고 이를 음건시킨 후 입자크기가 100메쉬가 되도록 마쇄하였다.

상기의 떡갈나무 충영 분말 시료 500g 및 메탄올(methanol, MeOH) 3리터(ℓ)를 5리터(ℓ) 플라스크(flask)에 넣고 40℃에서 24시간 동안 100rpm으로 교반처리하에서 진탕하여 3회 반복 추출하여 떡갈나무 충영 메탄올 추출물을 얻었다.

상기의 떡갈나무 충영 메탄올 추출물에 대해 회전진공증발기(rotary vacuum evaporator, EYELA autojack NAJ-160, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압농축 후 동결건조기로 동결 건조하여 분말화된 떡갈나무 충영 메탄올 추출물을 얻고 이를 KN0912로 명명하였다.

<제조예 2> 떡갈나무 충영 에탄올 추출물 제조

상기의 떡갈나무 충영 분말 시료 500g 및 에탄올(ethanol) 3리터(ℓ)를 5리터(ℓ) 플라스크(flask)에 넣고 40℃에서 24시간 동안 60±5kHz 파장의 초음파 처리하에서 진탕하여 3회 반복 추출하여 떡갈나무 충영 에탄올 추출물을 얻었다.

상기의 떡갈나무 충영 에탄올 추출물에 대해 회전진공증발기(rotary vacuum evaporator, EYELA autojack NAJ-160, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압농축 후 동결건조기로 동결 건조하여 분말화된 떡갈나무 충영 에탄올 추출물을 얻었다.

<제조예 3> 떡갈나무 충영 열수 추출물 제조

상기의 떡갈나무 충영 분말 시료 500g 및 정제수 3.5리터(ℓ)를 5리터(ℓ) 플라스크(flask)에 넣고 60℃에서 3시간 동안 진탕하여 3회 반복 추출하여 떡갈나무 충영 열수 추출물을 얻었다.

상기의 떡갈나무 충영 열수 추출물에 대해 회전진공증발기(rotary vacuum evaporator, EYELA autojack NAJ-160, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압농축 후 동결건조기로 동결 건조하여 분말화된 떡갈나무 충영 열수 추출물을 얻었다.

<실시예 1> 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(KN0912)의 담배마일드모틀바이러스(PMMoV)에 대한 항바이러스 효능 검정

(1)상기 제조예 1에서 얻은 분말화된 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(KN0912)을 증류수에 첨가하여 각각의 농도별 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.2％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물 시료, 0.1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 얻었다.

상기의 농도별 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.2％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물 시료, 0.1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 담배, 고추 및 오이의 유묘(본엽3∼5엽기)에 주당 50㎖씩 1회 관주 처리한 것을 실험구로 하고, 담배, 고추 및 오이의 유묘(본엽3∼5엽기)에 떡갈나무 충영 메탄올 추출물을 처리하지 않은 것(무처리)에 대해 14일 후 식물의 생육상태를 비교 관찰하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

하기의 표 1의 결과에서처럼 KN0912 처리한 실험구는 농도(희석배율)에 상관없이 담배, 고추 및 오이의 유묘의 생육에 전혀 장해를 주지 않는 것으로 확인되었다. 또한 무처리구도 예상과 같이 전혀 작물에 해를 나타내지 않았다.

KN0912의 3종 식물체에서의 약해시험

처리	작물 및 희석농도(％)
	담배			고추			오이
	0.5％	0.2％	0.1％	0.5％	0.2％	0.1％	0.5％	0.2％	0.1％
KN0912 처리	-	-	-	-	-	-	-	-	-
무처리	-	-	-	-	-	-	-	-	-

-: 생육장애 없음

(2)KN0912의 PMMoV(담배마일드모틀바이러스) 감염저해활성은 PMMoV 감염시 국부병반을 형성하는 담배인 잔티엔씨 담배(Nicotiana tabacum cv . xanthi nc)를 이용하여 조사하였다. 바이러스 접종원은 PMMoV에 감염된 삼선(Samsun) 담배 잎(0.1g)에 2㎖의 0.1M인산 완충액(pH 7.2)을 첨가, 마쇄하여 3겹 거즈로 찌거기를 걸러 그 여액을 상기 인산 완충액으로 최종농도 0.05중량％로 희석하여 사용하였다. 또한, 바이러스 인공접종 효율을 높이기 위하여 식물체의 상처 유도용 연마제인 200메쉬(mesh) 카보런덤(carborundum)을 건전한 식물 잎의 표면에 고루 뿌리고, 즉시 조제한 바이러스 접종원을 면봉 또는 붓으로 잎의 반엽에 문질러 접종하는 반엽 접종법(Mechanical inoculation method of half leaves)을 이용하였다. 이와 같은 방법으로 바이러스를 인공접종하면 약 25℃의 온실 환경조건에서 3∼4일이 경과되면 바이러스가 접종된 반엽에는 PMMoV 감염에 의한 식물체의 반응으로 갈색반점(국부병반)이 다수 형성된다.

상술한 실험법을 이용하여 농도별로 희석한 KN0912(1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.2％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물 시료, 0.1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 이용하여, 잔티엔씨 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc) 잎의 반엽(半葉)에 PMMoV 접종액과 혼합처리(Mix-inoculation)하여 KN0912의 바이러스 불활성화 효과를 평가하였다. 또한, 바이러스 감염억제(예방) 효과를 평가하기 위하여 KN0912액을 바이러스 접종보다 24시간 먼저 잔티엔씨 담배 잎의 반엽(半葉)에 분무한 후 그 부위에 PMMoV를 접종하는 전처리법(Pre-inoculation)을 실시하였다. 감염억제율의 산정은 KN0912액이 처리된 잎반엽과 반대쪽의 증류수만 처리한 반엽(대조)에 생성된 국부병반수를 비교하여 감염 억제율을 산출하였다. 이 실험은 5반복으로 수행하였다. 그 결과는 표 2와 같이 KN0912액의 처리농도에 따라 감염 억제율이 상이하였으며 혼합처리 시험에서 KN0912액의 가장 낮은 농도인 0.1％농도에서도 감염 억제율은 88.2±1.5％, 전처리 시험에서 75.1±0.5％로 우수하게 바이러스 감염을 억제하는 효과를 보여, 본 발명의 떡갈나무 충영 추출물은 식물 바이러스 감염억제제로 산업화 가치가 큼을 알 수 있었다.

한편 상기의 잔티엔씨 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc) 잎의 반엽(半葉)에 PMMoV 접종액과 KN0912 희석액(1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 혼합처리(Mix-inoculation)한 것과 잔티엔씨 담배의 반엽에 멸균 증류수 처리를 한 것을 도 1(a)에 나타내었다.

도 1(a)에서 잔티엔씨 담배의 반엽에 KN0912 희석액을 처리한 것(상부)에서는 갈색반점(국부병반)이 형성되지 않음에 비해 잔티엔씨 담배의 반엽에 멸균 증류수를 처리한 것(하부)에서는 갈색반점(국부병반)이 다수 형성되어 잔티엔씨 담배 잎에 KN0912을 처리시 PMMoV 발생 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.

떡갈나무 충영 추출물(KN0912)의 PMMoV 감염 억제율

추출물 처리방법	KN0912 희석농도(％)	감염 억제율(％)
혼합처리	1	100.0±0.0
	0.5	99.4±0.5
	0.2	93.8±1.1
	0.1	88.2±1.5
전처리	1	99.0±1.0
	0.5	93.0±1.2
	0.2	80.2±1.4
	0.1	75.1±0.5
무처리*	-	0.0

*무처리는 잔티엔씨 담배(Nicotiana tabacum cv . Xanthi nc) 잎의 반엽(半葉)에 아무런 처리를 하지 않은 것을 의미한다.

<실시예 2> KN0912의 오이모자이크바이러스(CMV)에 대한 항바이러스 효능검정

상기 제조예 1에서 얻은 분말화된 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(KN0912)의 오이모자이크바이러스(CMV) 감염억제 효과를 측정하였다.

떡갈나무 충영 메탄올 추출물(KN0912)의 오이모자이크바이러스(CMV) 감염억제 효과는 오이모자이크바이러스(CMV)에 감염시 국부병반을 형성하는 붉은명아주(Chenopodium amaranticolor)를 이용하여 조사하였다.

항바이러스 효능 검정방법은 상기 실시예 1의 (2)에서 언급한 동일한 방법을 이용하여 수행하고 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.

그 결과는 표 3과 같이 혼합처리 시험에서 KN0912액의 가장 낮은 농도인 0.1％떡갈나무 충영 메탄올 추출물 농도에서도 감염 억제율은 87.5±1.0％, 전처리 시험에서 70.6±2.2％로 바이러스 감염을 억제하는 효과를 보여, 본 발명의 떡갈나무 충영 추출물은 식물 바이러스 감염억제제로 이용가치가 있음을 알 수 있었다.

한편 상기의 붉은명아주(Chenopodium amaranticolor) 잎의 반엽(半葉)에 오이모자이크바이러스(CMV) 접종액과 KN0912 희석액(0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 혼합처리(Mix-inoculation)한 것과 붉은명아주 잎의 반엽에 멸균 증류수 처리를 한 것을 도 1(b)에 나타내었다.

도 1(b)에서 붉은명아주 잎의 반엽에 KN0912 희석액을 처리한 것(상부)에서는 국부병반이 형성되지 않음에 비해 붉은명아주 잎의 반엽에 멸균 증류수를 처리한 것(하부)에서는 국부병반이 다수 형성되어 붉은명아주 잎에 KN0912을 처리시 모자이크바이러스(CMV) 발생 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.

KN0912액의 CMV 감염 억제율

추출물 처리방법	KN0912 희석농도(％)	감염 억제율(％)
혼합처리	1	100.0±0.0
	0.5	100.0±0.0
	0.2	99.4±0.4
	0.1	87.5±1.0
전처리	1	99.0±1.0
	0.5	93.3±0.6
	0.2	84.0±0.5
	0.1	70.6±2.2
무처리*	-	0.0

*무처리는 붉은명아주(Chenopodium amaranticolor) 잎의 반엽(半葉)에 아무런 처리를 하지 않은 것을 의미한다.

<실시예 3> 고추마일드모틀바이러스(PMMoV)의 전신 감염(systemic infection) 기주식물에서 KN0912의 감염억제효과

고추마일드모틀바이러스에 대하여 전신 병징(모자이크, 위축 등 증상)을 보이는 담배품종인 샘슨(Samsun) 담배에 대해 상기 제조예 1에서 얻은 분말화된 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(KN0912)에 대한 고추마일드모틀바이러스(PMMoV)의 감염억제효과를 조사하였다.

4∼5엽기의 담배유묘에 1주당 10㎖의 KN0912 희석액(1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 잎 전체에 고르게 살포하고 24시간이 경과한 후 실시예 1의 (2)에서 언급한 바이러스 접종법과 동일하게 카보런덤을 첨가한 PMMoV 바이러스액을 면봉에 흡수시켜 잎 표면을 감염시켰다. 바이러스 접종 3주 후 모자이크 병징을 보이는 개체를 조사하고 KN0912 희석액을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 방제효과를 산출하였다. 그 결과 표 4와 같이 90∼100％의 감염억제효과를 보였다.

샘슨(Samsun) 담배에서 KN0912의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 감염억제효과

처리기간(주)	처리농도(％)	이병주/처리주(개)		발병억제효과 (％)
		KN0912	증류수
3	1	0/20	20/20	100
	0.5	2/20	20/20	90

<실시예 4> 오이모자이크바이러스(CMV)의 전신 감염 (systemic infection) 기주식물에서 KN0912의 감염억제효과

오이모자이크바이러스에 대하여 전신 병징(모자이크, 위축 등 증상)을 보이는 오이에 대해 상기 제조예 1에서 얻은 분말화된 떡갈나무 충영 메탄올 추출물(KN0912)에 대한 오이모자이크바이러스(CMV)의 감염억제 효과를 조사하였다.

4∼5엽기의 오이묘에 1주당 10㎖의 KN0912 희석액(1％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물, 0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 잎 전체에 고르게 살포하고 24시간이 경과한 후 실시예 1의 (2)에서 언급한 바이러스 접종법과 동일하게 카보런덤을 첨가한 CMV 바이러스액을 면봉에 흡수시켜 잎 표면을 감염시켰다. 바이러스 접종 3주 후 모자이크 병징을 보이는 개체를 조사하고 KN0912 희석액을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 방제효과를 산출하였다. 그 결과 표 5와 같이 80∼90％의 감염억제효과를 보였다.

오이에서 KN0912의 오이모자이크바이러스(CMV) 감염 억제효과

처리기간(주)	처리농도(％)	이병주/처리주(개)		발병억제효과 (％)
		KN0912	증류수
3	1	2/20	20/20	90
	0.5	4/20	20/20	80

<실시예 5> KN0912처리 오이에서 바이러스 감염억제의 지속효과

오이를 재배하는 비닐하우스 포장에서 KN0912 희석액(0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물)을 농약살포용 분무기로 오이에 경엽처리하였다. 그리고 쥬키니황화모자이크(ZYMV)의 인공접종은 KN0912 희석액(0.5％ 떡갈나무 충영 메탄올 추출물) 살포 후 1일, 3일, 5일 및 7일 후로 구분하여 각각 실시하였다. 각 시험구는 10주씩 3반복으로 실시하였다.

효과검정은 각 처리별 접종 3주(21일) 및 4주(28일)후에 오이잎에 나타나는 쥬키니황화모자이크(ZYMV) 바이러스 병징으로 판별하였다.

그 결과 표 6과 같이 모든 처리구에서 높은 바이러스 감염억제 효과가 확인되었으며, 바이러스 접종 4주 후 조사에서, 특히 KN0912 경엽살포를 한 7일후 까지도 83.3％의 높은 방제효과를 나타내어, KN0912를 경엽처리제로 사용시 최소 7일간은 약효가 지속됨이 확인되었다.

오이에서 KN0912의 ZYMV 감염억제 효과의 지속성

KN0912 경엽처리후 바이러스 인공접종 시기(일)	방제효과(％)
KN0912 경엽처리후 바이러스 인공접종 시기(일)	3주 후	4주 후
1	96.7	96.7
3	93.3	93.3
5	86.7	86.7
7	83.3	83.3
약제 무처리구(ZYMV만 접종)	0	0

<실시예 6> KN0912의 식물바이러스 감염력 상실에 미치는 요인 분석

KN0912이 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 입자의 형태변화에 미치는 영향조사 및 이 바이러스가 가지고 있는 유전물질인 핵산(ss RNA)에 직접적으로 미치는 영향을 조사하였다. 상기 실험을 위하여 PMMoV가 감염된 고추 잎으로부터 바이러스만을 순수하게 정제하였다. 바이러스 정제방법은 고속원심분리(10,000g) 및 초고속원심분리(32,000g)를 2회 반복 실시하는 방법으로 바이러스를 정제하였으며, 정제한 바이러스는 전자현미경(TEM) 및 자외선분광광도계(Uv-Vis Spectrophotometer, 200∼300nm)로 확인하였다.

정제바이러스의 농도가 1㎎/㎖가 되도록 0.1M (pH 7.0) 인산완충액로 희석한 바이러스액에 상기 제조예에서 얻은 KN0912 분말 5㎎을 혼합하여 전자현미경 검경용 샘플을 제조하여 바이러스 입자의 형태적 변화를 관찰하였다. 도 2(a) 및 도 2(b)에 나타난 결과와 같이 KN0912는 PMMoV 입자를 잘게 분절시키는 것을 알 수 있었다. 도 2(a)는 KN0912을 처리하기전의 정상적인 PMMoV 입자들을 나타낸 사진이고, 도 2(b)는 PMMoV 입자에 KN0912가 첨가 후 바이러스 입자의 사진으로 대부분의 바이러스 입자가 파괴된 것이 전자현미경상에서 관찰되었다.

한편, KN0912에 의한 PMMoV RNA에 미치는 영향의 조사를 위하여, RNA 정제를 다음의 방법으로 실시하였다. 순화한 PMMoV(농도1㎎/㎖)액에 추출완충액(100mM Tris, pH7.4, 20mM EDTA, 100mM NaCl, 2mM DTT, 1％ SDS) 및 proteinase K(100㎍/㎖)를 넣고 37℃의 반응조에 1시간 동안 바이러스 단백질을 분해시킨 후, 유기용매(페놀+클로로포름+이소아밀알코올)처리법 및 에탄올 침전법으로 PMMoV RNA를 정제, 자외선 분광광도계(Uv-Vis Spectrophotometer, 260nm)로 확인하였다. 이 RNA는 DEPC처리 증류수에 0.1㎎/㎖ 농도로 희석하여 상기 실시예 1의 (2)에서 언급한 방법으로 생물검정을 수행하였다. 먼저, 증류수로 희석한 KN0912(5㎎/㎖)를 잔티 담배잎의 반엽에 처리하고, 1시간이 경과한 후 PMMoV RNA를 반엽당 0.2㎖(농도 0.1㎎/㎖)씩 접종하였다. 나머지 반엽은 대조구로는 증류수 처리 1시간 후 PMMoV RNA를 반엽당 0.2㎖(농도 0.1㎎/㎖)씩 접종하였다.

감염억제율의 산정은 KN0912액이 처리된 잎반엽과 반대쪽의 증류수만 처리한 반엽(대조)에 생성된 국부병반수를 비교하여 감염저해율를 산출하였다. 이 실험은 3반복으로 수행하였다. 그 결과는 표 7과 같이 KN0912액의 처리농도에 따라 감염억제율이 상이하였으며 KN0912액의 가장 낮은 농도인 0.1％농도에서도 감염억제율은 87.6±1.2로 우수한 바이러스 감염억제 효과를 보여, KN0912는 바이러스 입자의 파손 뿐만 아니라 바이러스 RNA의 불활성화에 영향을 주는 것이 확인되었다.

KN0912의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) RNA 감염억제효과

처리 제제		접종원	감염억제율(％)
제제 명	처리 농도(％)	접종원	감염억제율(％)
KN0912	1	PMMoV RNA	100
	0.5	PMMoV RNA	99.3±0.6
	0.2	PMMoV RNA	95.0±0.5
	0.1	PMMoV RNA	87.6±1.2
증류수	-	PMMoV RNA	0.0

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 제조예, 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 떡갈나무 충영 추출물을 포함하는 식물 바이러스 방제용 조성물은 다양한 식물 바이러스에 대하여 탁월한 항바이러스 효과를 나타내어 식물 바이러스 예방 및/또는 치료가 가능하고, 천연물 유래의 떡갈나무 충영 추출물을 주요 재료로 하여 독성이 없어 식물 바이러스를 예방 및/또는 치료시 작업자의 안전을 확보하면서 식물 바이러스 감염 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

떡갈나무 충영을 떡갈나무 충영 중량 3∼10배량이며 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 어느 하나 이상의 용매에 첨가하고 35∼45℃에서 12∼48시간 동안 20∼100kHz 파장의 초음파 처리하에서 추출하고 여과한 다음 건조하여 얻은 떡갈나무 충영 추출물을 포함하도록 하여 담배모자이크바이러스(TMV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스 Y(PVY), 순무모자이크바이러스(TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 쥬키니 녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV), 잠두위축바이러스(BBWV), 담배윤점바이러스(TRSV), 딸기바이러스(SMoV), 선인장 X바이러스(CVX) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 식물 바이러스를 방제할 수 있는 식물 바이러스 방제 조성물.
제1항에 있어서,
떡갈나무 충영 추출물은 식물 바이러스 방제 조성물 전체 중량 대비 0.5∼99.9％를 포함되는 것을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
식물 바이러스 방제 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제, 도포제 중에서 선택된 어느 하나의 형태로 제형화 된 것 임을 특징으로 하는 식물 바이러스 방제 조성물.
청구항 제1항, 제2항 또는 제5항의 식물 바이러스 방제 조성물을 원예작물의 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지절단 또는 농기구소독에 적용하여 식물 바이러스 방제방법.