KR100738647B1 - 오배자 추출물 함유하는 식물바이러스 방제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다수의 식물바이러스 감염억제 활성을 나타내는 오배자 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 토마토모자이크바이러스(ToMV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스 Y(PVY), 순무모자이크 바이러스 (TuMV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크 바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV) 등 RNA를 유전자로 가진 식물바이러스에 대하여 우수한 항바이러스 활성을 나타내는 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 천연물 유래의 물질로써 독성이 없으며, 다양한 식물바이러스에 대하여 탁월한 효과를 나타내므로, 식물바이러스 감염방제제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

오배자 추출물 함유하는 식물바이러스 방제제 {Antiviral material for plant virus containing the extract from the gall of Rhus javanica}

도 1은 건조한 오배자의 메탄올 추출물로부터 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올추출물을 제조하는 방법을 도식화한 것이다.

도2(a)는 오배자 추출물 희석액을 처리하기 전의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 입자를 나타낸 사진이고,

도2(b)는 상기 바이러스에 오배자 추출물 희석액을 처리한 직후의 바이러스입자 변화를 나타낸 사진이고,

도 2(c)는 상기와 같이 처리 후 10분경과 후의 바이러스 입자 형태변화를 나타낸 사진이고,

도 2(d)는 상기와 같이 처리 후 20분경과 후의 바이러스 입자 형태변화를 나타낸 사진이다.

도 3은 오배자 추출물 희석액 및 대조구로서 멸균증류수를 담배 N. glutinosa의 반엽씩에 각각 처리 후 접종원으로 고추마일드모틀바이러스(PMMoV)의 RNA만을 추출하여 감염시키고, 3일 경과 후에 담배 N. glutinosa 잎에 발현된 병징 사진이다.

본 발명은 식물바이러스에 대한 방제활성을 나타내는 오배자 추출물을 포함하는 식물바이러스 방제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 RNA를 유전자로 가지는 식물바이러스에 대하여 우수한 항바이러스 활성을 나타내는 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스 방제제에 관한 것이다.

바이러스는 숙주세포를 감염시켜 증식하는 생명체로서 숙주와 별도로 그 존재를 생각할 수 없는 생명체이다. 바이러스에는 숙주에 따라 동물바이러스, 식물바이러스, 세균바이러스(bacteriophage), 곰팡이바이러스 등 여러 가지 가 존재한다. 그 중에서 식물바이러스는 식물 세포를 감염시키는 바이러스를 총칭한다. 전 세계적으로 식물 바이러스는 약 1,000여 종이 분리 보고되었으며, 국내에서 보고된 식물바이러스는 약 120여 종이다. 국내에서도 80년대 말부터 바이러스의 유전자원과 경제적인 측면의 중요성이 재평가되어 현재는 다양한 연구팀에서 식물 바이러스 연구가 활발히 진행되고 있다. 식물바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물과 화훼류의 생산량 및 품질저하와 품종퇴화 등 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다. 특히 최근에는 식량 및 각종 식물체 등의 국제 교역량이 증가되면서 국내에 존재하지 않던 외국의 병원성 식물 바이러스까지 유입되어 그로 인한 피해가 점차 심해지고 있는 추세이다. 이 때문에 재배식물에 대한 바이러스의 예방·치료·검역은 농업에서 중요한 과제이다.

식물바이러스는 각종 경제작물에 커다란 피해를 주고 있는 병원균으로서 우리나라의 경우 고추, 토마토, 감자 등 가지과 작물에 있어서 토마토모자이크바이러스(ToMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 오이모자이크바이러스(CMV), 감자바이러스 Y(PVY), 감자엽권바이러스(PLRV) 등이 가장 큰 수량 감소의 원인이 되고 있으며 또한 오이, 호박, 수박, 멜론 등 박과 작물에는 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 오이모자이크바이러스(CMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV) 등이, 나리에는 나리모자이크바이러스(LMoV), 백합무병징바이러스(LSV), 오이모자이크바이러스(CMV), 난에는 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV) 등이 큰 피해를 야기한다.

지금까지 식물바이러스병의 방제는 주로 식물재배시기의 조절, 무병 식물체 재배 등의 경종적 방법과 바이러스 매개체인 곤충을 구제하는 방법 등을 사용하였으나 이들은 간접적인 방제수단으로서 한계가 있다. 한편, 식물바이러스병에 직접적인 방제수단으로 소디움 알지닉 액시드와 표고버섯(Lentinus edodes) 균사체 추출물 그리고 우유 등이 개발되어 있으나 방제효과가 그다지 크지 못하였다. 또한, 미라빌리스 잘라파(Mirabilis jalapa, Kubo 등, 1990), 파이토라카 아메리카나, 보에라비아 디퓨사, 포메스 포멘타리우스 등이 생산하는 단백질과 당 단백질성분은 전신이행 효과를 갖는 항바이러스 물질로 보고되었으나 생산성과 독성 등의 문제로 상용화되지는 못하였다.

오배자는 오배자면충이 옻나무과의 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 기생하여 만든 벌레집으로 문합(文蛤), 백충창(白蟲倉)이라고도 한다. 옻나무과에 속하는 낙엽성 교목인 붉나무의 잎에 생긴 벌레집을 말려서 사용한다. 주요성분으로는 다량의 갈로탄닌(gallotannin), 수지, 지방, 전분 등이 함유되어 있다. 약리작용에서 오배자의 '갈로탄닌(gallotannin)' 성분은 수렴 작용이 있다. 또한, 이질균, 녹농균 등에 항미생물 작용이 있으며, 간 기능 보호 작용과 항산화 작용을 나타낸다. 임상 보고에서 소화기도 출혈에 이 약물 15그램을 가자(訶子)와 배합하여 복용하자 유효한 반응을 보였고, 궤양성 결장염, 방사성 직장염, 유정, 폐결핵으로 인한 도한, 각혈, 이질, 자한, 당뇨병, 식도암, 치질, 화상, 조루, 야제(夜啼), 소아설사, 가을철에 유행하는 장염 등에 치료효과가 보고되고 있다(원색한국본초도감, 안덕균저).

현재 우리나라에서 오배자에 대한 특허로는 흰가루병 방제 조성물 (등록특허 10-0480488-0000), 식물의 흰가루병 방제제 (등록특허 10-0505819-0000), 생약재를 이용한 살선충제 조성물 (등록특허 10-0493364-0000), 섬유의 천연 염색 방법 (특허공개 10-2003-0078283) 등이 보고된 바 있다. 그러나 오배자 추출물이 상기의 식물바이러스에 대하여 감염억제효과를 나타낸다는 보고는 전혀 없다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것 으로, 본 발명의 목적은 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스 방제제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 천연물 유래의 물질로써 독성이 없으며, 다양한 식물바이러스에 대하여 탁월한 효과를 나타내는, 실용적인 식물바이러스 감염 방제제의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스 방제제를 포함한다.

본 발명은 상기 식물바이러스가 RNA 바이러스로서, 예를 들어 토마토모자이크바이러스(ToMV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스 Y(PVY), 순무모자이크 바이러스 (TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크 바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV) 등 RNA를 유전자로 가진 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 오배자 추출물이 물 추출물, 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 부탄올 중에서 선택된 어느 하나 이상의 추출물임을 특징으로 하는 식물바이러스 방제제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 오배자 추출물이 조성물 총중량에 대하여 10~90중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물바이러스 방제제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연물 유래의 생약재를 대상으로 다양한 식물바이러스에 대한 항바이러스 활성을 연구하던 중, 본 발명의 오배자 추출물이 여러 식물바이러스에 대한 탁월한 항바이러스효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스 방제제를 포함한다.

본 발명은 여러 종의 식물바이러스에 대하여 광범위하게 항바이러스활성을 갖는 오배자 추출물을 함유하는 식물바이러스 감염억제제를 제공한다.

본 발명에서 식물바이러스의 감염 억제 및 치료를 위한 상기의 오배자 추출물은 하기와 같이 수득 될 수 있다.

본 발명의 오배자는 생약제제로 보증된 것을 구입하여 30~50메쉬로 분쇄한 후 시료 중량의 약 3~10배, 바람직하게는 약 4~7배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올 부탄올 등과 같은 탄소수가 1~4개인 저급 알코올의 극성용매 또는 이들의 약 1:0.1-1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로 실온에서 3시간~3일 동안 열수추출, 냉침추출, 환류냉각추출, 초음파추출 또는 초임계유체추출법 중에서 선택된 어느 하나의 방법에 의해 오배자로부터 추출물을 얻을 수 있다. 상기의 추출방법을 사용하여 추출한 후, 0.1~10㎛의 필터로 여과한 다음, 여과액을 감압, 농축하여 추출물을 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 비극성 용매 가용추출물은 상기추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 약 1~5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 2~5회 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한, 추가로 통상의 분획공정을 수행할 수도 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 통상적으로 농약 조제시 부재료로 이용할 수 있는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제 중에서 선택된 어느 하나 이상이 10~90중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 추출물의 고추마일드모틀바이러스 감염저해활성을 조사하기 위해, 감염시 국부병반을 형성하는 담배인 Nicotina glutinsa를 이용한다. 고추마일드모틀바이러스 접종원은 고추마일드모틀바이러스에 이병된 N. tabacum cv samsun의 잎을 건조한 후 무게의 200배 되는 0.01M인산 완충액을 첨가 후 멸균된 유발로 갈아 거름종이로 여과하여 최종 2,000배 되도록 희석 후 사용하는 것이 좋다. 오배자 메탄올 추출물의 감염저해활성은 고추마일드모틀바이러스 접종액과 추출물 희석액을 1:1로 혼합 후 처리하거나, 추출물 희석액을 먼저 담배잎(N. glutinosa) 반엽에 면봉으로 문질러 도말하고 24시간이 지난 후 고추마일드모틀바이러스를 접종하는 전 처리법을 이용할 수 있다. 대조구로는 멸균증류수를 사용하고, 접종 2~4일 후 추출물 처리구와 증류수 처리구의 국부 병반수를 비교하여 감염저해효과를 산출한다.

또한, 고추마일드모틀바이러스에 대해 전신에서 모자이크 병징을 보이는 담배품종인 삼선(samsun) 담배 유묘에서 오배자 추출물의 감염저해효과를 조사한다. 양성 대조구로는 현재 농가에서 항바이러스제로 사용 중인 탈지 분유(skim milk)와 소디움 알지네이트(sodium alginate)를 각각 10%, 1% 수용액으로 처리하고, 음성 대조구로는 10mM 인산완충액(pH 7.2)을 사용한다. 바이러스 접종 3주 후 모자이크 병징을 보이는 개체를 조사하고 음성 대조구와 비교하여 방제효과를 산출한다.

오배자 추출물의 오이모자이크바이러스 감염저해활성을 애호박(품종 각시애호박) 및 쥬키니호박(품종 서울쥬키니)에서 조사한다. 또한, 애호박(품종 각시애호박 )및 쥬키니호박(품종 남강쥬키니)에 대한 오배자 메탄올 추출물의 항바이러스활성성분 지속효과를 조사한다. 오배자 메탄올 추출물의 쥬키니황반모자이크바이러스 감염저해활성은 즙액 접종 방법으로 실시하였다. 바이러스 접종원은 각각 오이모자이크바이러스 이병 담뱃잎 추출액과 쥬키니황반모자이크바이러스에 이병된 쥬키니호박 건조엽 추출액을 사용한다.

오배자 추출물의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 입자 형태변화 및 RNA 감염성에 미치는 영향을 알아보기 위해 오배자 추출물을 바이러스 RNA에 직접 처리한 경우 감염력에 미치는 영향을 조사한다.

본 발명의 결과에 의하면 오배자 추출물은 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 오이모자이크바이러스, 쥬키니황반모자이크바이러스에 대하여 90~100%의 높은 방제효과를 나타내며, 본 추출물의 항바이러스 활성성분은 옆면살포 후 8~10일까지 유효하게 지속되고, 방제효과는 바이러스 접종 후 약 4주 후까지 유지된다.

따라서 본 발명에 의해 오배자 추출물이 여러 식물바이러스에 대한 탁월한 항바이러스효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 오배자 추출물은 고추마 일드모틀바이러스 입자에 직접적으로 작용하여 바이러스입자를 파괴하고, 오배자 추출물은 바이러스 RNA에 직접 영향을 주어 감염성을 상실시키는 것을 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 메탄올 추출물 조제 및 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 감염저해활성

추출방법은 건조된 오배자를 40메쉬로 분쇄한 후, 분말 1㎏에 6리터의 메탄올을 가한 다음, 40℃에서 3시간 동안 초음파 추출한 후, 액체성분을 완전 증발시킨 오배자 추출물을 수득하였다.

추출물의 고추마일드모틀바이러스 감염저해활성은 감염시 국부병반을 형성하는 담배인 Nicotina glutinsa를 이용하여 조사하였다. 고추마일드모틀바이러스 접종원은 고추마일드모틀바이러스에 이병된 N. tabacum cv samsun의 잎을 건조한 후 무게의 200배되는 0.01M인산 완충액을 첨가 후 멸균된 유발로 갈아 거름종이로 여과하여 최종 2,000배 되도록 희석 후 사용하였다. 바이러스 접종에 앞서 충분한 감염을 유도하기 위해 카보런덤(carborundum)을 뿌리고 바이러스 접종액을 면봉에 묻혀 담뱃잎에 문질러 감염시켰다. 접종 2~4일 후 고추마일드모틀바이러스 증식에 의하여 국부병반이 200~300개 형성되었다.

오배자 메탄올 추출물의 감염저해활성은 고추마일드모틀바이러스 접종액과 추출물 희석액을 1:1로 혼합 후 처리하거나, 추출물 희석액을 먼저 담배잎(N. glutinosa) 반엽에 면봉으로 문질러 도말하고 24시간이 지난 후 PMMoV를 접종하는 전 처리법을 이용하였다. 대조구로는 멸균증류수를 사용하였으며 접종 2~4일 후 추출물 처리구와 증류수 처리구의 국부 병반수를 비교하여 감염저해효과를 산출하여, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이 혼합처리와 전처리시 97.9% 이상의 고추마일드모틀바이러스 감염저해효과를 보였다.

<표 1> 오배자 메탄올추출물의 고추마일드모틀바이러스 감염저해활성

추출물 처리방법	추출물 희석농도(%)	감염저해활성(%)
혼합처리	1	99.4
	0.5	98.8
전처리	1	98.4
	0.5	97.9

<실시예2> 전신 감염 (systemic infection) 기주에서 오배자 메탄올 추출물의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 발병 억제효과

고추마일드모틀바이러스에 대해 전신에서 모자이크 병징을 보이는 담배품종인 삼선(samsun) 담배 유묘에서 오배자 추출물의 감염저해효과를 조사하였다. 즉 4~5 엽기의 유묘 1주당 10㎖(시험구당 20개 유묘)의 배양여액을 잎 전체에 고르게 살포하고 온실조건에서 24시간 방치한 후 카보런덤을 첨가한 바이러스액에 오염된 손으로 식물체의 이면을 감염시키거나 또는 면봉으로 바이러스액을 흡수시켜 잎 표면을 감염시켰다. 양성 대조구로는 현재 농가에서 항바이러스제로 사용 중인 탈지 분유(skim milk)와 소디움 알지네이트(sodium alginate)를 각각 10%, 1% 수용액으 로 처리하였으며, 음성 대조구로는 10mM 인산완충액(pH 7.2)을 사용하였다. 바이러스 접종 3주 후 모자이크 병징을 보이는 개체를 조사하고 음성 대조구와 비교하여 방제효과를 산출하였다. 그 결과 표 2와 같이 표면접종시 3주 후 100%의 감염예방효과를 보여, 대조구의 탈지 분유 및 소디움 알지네이트보다 월등한 방제효과를 보였다.

<표 2> 삼선(samsun) 담배에서의 오배자 메탄올 추출물의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 발병저해효과

처리액	접종 3주 후 발병 억제효과(%)
오배자 추출물 (1% 수용액)	100
탈지 분유(10% 수용액)	35.0
소디움 알지네이트(1% 수용액)	30.0
대조구	0

<실시예 3> 오배자 메탄올 추출물의 오이모자이크바이러스(CMV) 감염저해활성

오배자 메탄올 추출물의 오이모자이크바이러스 감염저해활성을 본엽 6~7매로 자란 애호박(품종 각시애호박) 및 쥬키니호박(품종 서울쥬키니)에서 조사하였다. 오배자 메탄올 추출물의 감염저해활성은 오이모자이크바이러스 접종액과 추출물 희석액을 1:1로 혼합 후 처리하거나, 추출물 희석액을 공시 식물체 잎 표면에 고르게 살포하고 24시간이 지난 후 오이모자이크바이러스를 엽 표면에 접종하는 전 처리법을 이용하였다. 한편, 추출물의 침투이행작용에 의한 오이모자이크바이러스 감염저해효과를 확인하기 위하여, 추출액을 1주당 40㎖씩 엽 표면에 살포하고 온실조건에서 24시간 지난 후 카보런덤을 첨가한 바이러스액을 면봉으로 엽 이면에 상처를 주 어 감염을 유도하였다. 접종 3주 후 오이모자이크바이러스 병징이 나타난 모종의 수를 대조구와 비교하여 조사하였다. 바이러스 접종원은 오이모자이크바이러스 이병 담뱃잎 추출액을 이용하였고, 무게의 5배 되는 완충액으로 추출하였다.

오배자 메탄올 추출물의 애호박에 대한 오이모자이크바이러스 감염저해활성은 표 3에서와 같이 오배자 메탄올 추출물과 바이러스액과 혼합처리 및 전처리시 감염예방효과는 85~100%로 우수하였으나, 이면처리시에는 감염억제율이 45~55%로 저조하나, 애호박 잎에서 상기 추출물의 약간의 침투이행효과가 인정되었다. 또한, 표 4에서와 같이 쥬키니호박에서는 오배자 메탄올 추출물과 바이러스액과 혼합처리 및 전처리를 하였을 때 감염예방효과는 90~100%로 우수하였으며, 이면처리시에는 45%~60%의 감염 억제율을 보였다.

<표 3> 애호박에서 오배자 메탄올 추출물의 오이모자이크바이러스(CMV) 감염 억제효과

처리	처리 농도(%)	발병주수		조사주수	감염억제율(%)
		2주 후	3주 후		2주 후	3주 후
추출물 혼합처리	1	0	0	20	100	100
	0.5	3	3	20	85	85
추출물 전처리	1	0	0	20	100	100
	0.5	3	3	20	85	85
추출물 이면처리	1	8	9	20	60	55
	0.5	11	11	20	45	45
대조구		20	20	20	0	0

<표 4> 쥬키니호박에서 오배자 메탄올 추출물의 오이모자이크바이러스(CMV) 감염예방효과

처리	처리 농도(%)	발병주수		조사주수	감염 억제율(%)
		2주 후	3주 후		2주 후	3주 후
추출물 혼합처리	1	0	0	20	100	100
	0.5	2	2	20	90	90
추출물 전처리	1	0	0	20	100	100
	0.5	2	2	20	90	90
추출물 이면처리	1	7	8	20	65	60
	0.5	11	11	20	45	45
대조구		20	20	20	0	0

<실시예 4> 오배자 메탄올 추출물의 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV) 감염저해활성

오배자 메탄올 추출물의 쥬키니황반모자이크바이러스 감염저해활성은 즙액 접종 방법으로 실시하였다. 먼저, 오배자 추출물을 쥬키니호박 (품종 서울쥬키니) 표면에 살포하고 24시간 후 바이러스를 잎 표면에 인공접종 하였다. 접종원은 쥬키니황반모자이크바이러스에 이병된 쥬키니호박 건조엽을 추출하여 사용하였으며 건조엽 5배의 완충액으로 추출하였다. 그 결과 표 5에서와 같이 배양여액 처리시 접종, 3주 후에도 100%의 감염예방효과를 나타내었다.

<표 5> 쥬키니호박에서 오배자 메탄올 추출물의 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV) 감염예방효과

처리	처리농도 (%)	발병주수		조사주수	3주후 감염억제율(%)
		2주 후	3주 후
추출물	0.7	0	0	20	100
대조구		20	20	20	0

<실시예 5> 오배자 메탄올 추출물의 항바이러스활성성분 지속효과시험

비닐하우스 포장에 애호박 (품종 각시애호박 )및 쥬키니호박(품종 남강쥬키 니)을 정식 후 오배자 메탄올 추출물 농축액을 물로 희석하여 0.7% 액으로 하고, 농약살포용 분무기로 주 전체의 잎 앞뒷면에 고르게 살포하였다. 그리고 바이러스(ZYMV) 인공접종은 약제 살포 후 즉시, 2일 후, 3일 후, 5일 후, 8일 후로 구분하여 각각 실시하였다. 각 시험구는 10주씩 3 반복으로 실시하였다. 효과검정은 각 처리 별 접종 2주, 3주 및 4주에 잎에 나타나는 바이러스 병징으로 판별하였다. 그 결과 표 6, 7에서 나타낸 것과 같이, 애호박 및 쥬키니호박의 모든 처리구에서 높은 바이러스 감염억제효과가 확인되었으며, 바이러스 인공접종 4주 후 조사에서, 특히 추출물 살포 8일 처리구도 93.3%의 높은 방제효과를 나타내어, 본 추출물의 항바이러스 활성성분은 옆면살포 후 8일간은 유효하게 지속됨을 확인하였다.

<표 6> 애호박(품종 각시)에서 오배자 메탄올 추출물의 항바이러스활성 지속효과

처리와 접종사이의 일수	방제효과(%)
	접종 2주 후	3주 후	4주 후
즉시	100	100	100
2	100	100	100
3	100	100	100
6	100	96.7	96.7
8	96.7	93.3	93.3
대조구	0	0	0

<표 7> 쥬키니호박(품종 남강)에서 오배자 메탄올 추출물의 항바이러스활성 지속효과

처리와 접종 사이의 일수	방제효과(%)
	접종 2주 후	3주 후	4주 후
즉시	100	100	100
2	100	100	100
3	100	100	100
6	100	96.7	96.7
8	0	96.7	93.3
대조구	0	0	0

<실시예 6> 에칠아세테이트 등 용매 추출물의 조제 및 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 감염저해활성

건조 시료 200g를 분쇄하고 메탄올로 추출하여 얻은 추출액을 감압 농축하였다. 얻어진 농축액을 80% 메탄올 800㎖에 가하여 충분히 용해시키고 800㎖의 헥산을 가하여 추출한 후 다시 감압, 농축하였다. (시료 1: 5.1g). 나머지 80% 메탄올 층에 800㎖의 에틸아세테이트로 추출한 후 이 추출액을 감압농축 하여 시료로 사용하였다(시료 2: 82.3g). 에틸아세테이트로 추출하고 남은 층에는 800㎖의 부탄올로 추출한 후 이 추출액을 감압 농축하여 4.8g(시료 3)을 얻었다. 나머지 물 층은 감압 농축하여 3.8g(시료 4)를 얻었다 (도 1, 표 8).

상기의 방법에 따라 추출한 4종의 시료는 각각 멸균증류수로 0.5%로 희석하여 시료를 준비하였다. 각각의 추출물 시료의 고추마일드모틀바이러스에 대한 감염저해활성은 감염시 국부병반을 형성하는 담배인 Nicotina glutinsa을 이용하여 조사하였다. 고추마일드모틀바이러스 접종원은 고추마일드모틀바이러스에 이병된 N. tabacum cv samsun의 잎을 건조한 후 무게의 200배 되는 0.01M인산 완충액을 첨가 후 멸균된 유발로 갈아 거름종이로 여과하여 최종 2,000배 되도록 희석 후 사용하였다. 바이러스 접종에 앞서 충분한 감염을 유도하기 위해 카보런덤(carborundum)을 뿌리고 바이러스 접종액을 면봉에 묻혀 담뱃잎에 문질러 감염시켰다. 접종 3일 후 고추마일드모틀바이러스 증식에 의하여 국부병반이 100~200개 형성되었다.

감염저해활성 검정은 미리 조제해둔 각각의 추출물 희석액을 먼저 담배잎(N. glutinosa) 반엽에 면봉으로 문질러 도말하고 24시간이 지난 후 고추마일드모틀바이러스를 접종하는 전 처리법을 이용하였다. 대조구로는 멸균증류수를 사용하였으며 접종 2~4일 후 추출물 처리구와 증류수 처리구의 국부 병반수를 비교하여 감염저해효과를 산출하였다. 표 8에 나타난 바와 같이 에틸아세테이트 분획분의 고추마일드모틀바이러스 감염저해효과가 98.6%로 가장 높았다.

<표 8> 오배자 메탄올추출물의 유기용매 분획물의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 감염저해효과

용매 추출물	병반수 (개)		감염저해율(%)
	무처리	처리
헥산 (시료 1)	140	54	61.4
에칠아세테이트 (시료 2)	147	2	98.6
부탄올 (시료 3)	119	25	79.0
물 층 (시료 4)	157	182	-15.9

<실시예 7> 오배자 추출물의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) 입자 형태변화 및 RNA 감염성에 미치는 영향

오배자 추출물이 고추마일드모틀바이러스 입자의 형태에 미치는 영향을 조사 하고 그 결과를 도 2에 나타내었고, 오배자 추출물을 바이러스 RNA에 직접 처리한 경우 감염력에 미치는 영향을 조사하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타난 결과와 같이 오배자 메탄올 추출물은 고추마일드모틀바이러스 입자를 잘게 분절시키는 것을 알 수 있었다. 도 2(a)는 오배자 메탄올 추출물을 처리하기 전의 고추마일드모틀바이러스 입자들을 나타낸 사진이고, 도 2(b)는 바이러스에 오배자 추출물을 처리 직 후의 입자 변화를 나타낸 사진으로 입자의 균열증상이 나타남을 알 수 있었다. 도 2(c)는 상기와 같이 처리 후 10분경과 후의 입자변화를 나타낸 사진으로 입자가 세절되어짐을 알 수 있었다. 도 2(d)는 상기와 같이 처리 후 20분경과 후의 입자변화를 나타낸 사진으로 거의 모든 바이러스입자가 잘게 세절, 파괴되어 버린 것을 알 수 있었다.

오배자 추출물에 의한 PMMoV입자의 파괴현상은 다음 실험을 통하여 구명하였다. 먼저, 순화 고추마일드모틀바이러스를 획득하기 위하여 담배 (품종 samsun)에서 증식한 고추마일드모틀바이러스 이병엽 100g을 고속원심분리(10,000×g) 및 초고속원심분리(32,000×g)를 2회 반복 실시하는 방법으로 바이러스를 정제한 후 농도가 10㎎/㎖가 되도록 0.1mM(pH 7.2) 인산완충액에 희석하였다. 그 다음, 오배자 메탄올 추출물을 8,000ppm농도가 되도록 증류수(pH 7.2)에 희석하여, 미리 정제해 둔 고추마일드모틀바이러스 순화액(10㎎/㎖)과 1:1로 혼합하고, 2% 인텅스텐산나트륨(sodium phosphotungstic acid, pH 6.8)으로 역염색하여, 투과전자현미경 하에서 바이러스입자를 관찰하였다.

한편, 오배자 추출물에 의한 고추마일드모틀바이러스 RNA의 감염력 상실현상 은 다음 실험을 통하여 구명하였다. 먼저, 추출물을 담뱃잎(N. glutinosa) 반엽에 면봉으로 문질러 도말하고 1시간이 지난 후 고추마일드모틀바이러스 RNA를 접종하였다. 대조구로는 멸균 증류수를 사용하였으며 접종 3일 후 추출물 처리구와 증류수 처리구의 국부 병반의 수를 비교한 결과, 추출물의 영향으로 고추마일드모틀바이러스 RNA의 감염성이 완전히 상실됨을 알 수 있었다(표 9, 도 3).

고추마일드모틀바이러스의 RNA 정제방법과 접종방법은 하기와 같다. 순화한 고추마일드모틀바이러스 (1㎎/㎖)액에 추출완충액(100mM Tris, pH7.4, 20mM EDTA, 100mM NaCl, 2mM DTT, 1% SDS) 및 proteinase K(100㎍/㎖)를 넣고 37℃의 반응조에 1시간 동안 반응 시킨 후, 2회의 유기용매 (페놀+크로로포름+이소아밀알코올) 처리법 및 에탄올 침전법으로 고추마일드모틀바이러스 RNA만을 회수하였다. 정제 RNA를 DEPC(diethyl pyrocarbamate) 처리한 증류수에 100㎍/㎖의 농도로 희석한 후 담배(N. glutinosa) 잎의 접종원으로 사용하였다. 접종방법은 잎에 약한 상처를 내기 위하여 200메쉬 카보랜덤을 뿌린 후, 담배(N. glutinosa)의 전개된 잎의 반엽 당 200㎕의 고추마일드모틀바이러스 RNA (100㎍/㎖)를 멸균 면봉으로 도말 접종하였다. 표 9에 나타난 바와 같이 오배자 추출물은 고추마일드모틀바이러스 RNA로 감염시킨 담배(N. glutinosa)에서 99.1%의 감염 억제를 보였다.

<표 9> 오배자 메탄올추출물의 고추마일드모틀바이러스(PMMoV) RNA 감염억제효과

추출물 농도 (%)	형성 국부병반 수 (개)		감염억제율(%)
	추출물처리 반엽	증류수처리 반엽
1	0	327	100
0.5	3	326	99.1

이상의 결과로부터 오배자 추출물은 고추마일드모틀바이러스 입자에 직접적으로 작용하여 바이러스입자를 파괴하고, 또한 오배자 추출물은 바이러스 RNA에 직접 영향을 주어 감염성을 상실시키는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 오배자 추출물 유효성분으로 함유하는 식물바이러스 방제제는 다양한 식물바이러스에 대하여 탁월한 항바이러스효과를 갖는다. 이러한 효과는 상기의 방제제를 농작물의 엽면 살포용 제제로서 제조하여 사용 시, 여러 식물바이러스에 대한 감염 억제효과가 우수하여 식물바이러스 예방이 가능함으로 산업화하는데 유용한 물질이 될 것이다.

Claims (5)

1. 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물바이러스 방제제.
2. 제1항에 있어서, 식물바이러스는 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 식물바이러스 방제제.
3. 제2항에 있어서,

   RNA 바이러스는 토마토모자이크바이러스(ToMV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스 Y(PVY), 순무모자이크바이러스 (TuMV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크 바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식물바이러스 방제제.
4. 제 1항에 있어서, 오배자 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 부탄올 중에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 오배자를 추출한 것임을 특징으로 하는 식물바이러스 방제제.
5. 제 1항에 있어서, 오배자 추출물은 10~90중량% 함유된 식물바이러스 방제제.

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