CN113015432B - 包含硫酸化半乳糖的组合物及其实施方式 - Google Patents
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Abstract
本文公开了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖。本文还公开了至少一种硫酸化半乳糖相对于总糖含量的重量百分比在15‑90％的范围内。此外，本文公开了所述组合物用于保护/处理植物免受感染的用途。还提供了所述组合物用于保护/处理动物免受感染的用途。本文公开了硫酸化半乳糖用于保护/处理植物免受感染的用途。还提供了硫酸化半乳糖用于保护/处理动物免受感染的用途。本文还公开了用于制备如本文所述的组合物的方法。
Description
发明领域
本公开广泛地涉及组合物领域，并且具体地涉及包含硫酸化半乳糖的组合物、它们的配制方法以及它们作为植物和动物对生物和非生物胁迫的防御和补救的用途。
发明背景
活生物体，无论是植物还是动物，总是受到生物和非生物胁迫的持续威胁。生物胁迫是由另一种活生物体(例如病毒、细菌、真菌、寄生虫、昆虫、杂草、其它植物或动物)对活生物体进行的任何损害所引起的不利影响。非生物胁迫包括非生命因素(例如温度、湿度、盐、阳光等)对特定环境中的活生物体的任何负面影响。对于植物，估计全球农业生产力的约20％至40％的直接产量损失是由各种生物胁迫引起的(Savary等人，Food Sec.2012；4:519)。动物也受到生物和非生物胁迫的持续威胁。例如，在养殖的虾中白斑病毒病的流行在其发病后在全球造成了数十亿美元的损失(Lightner,D.V.2003)。
在病原体(例如细菌、病毒和真菌)和改变影响农业生计(在土地耕作以及植物和动物繁殖方面)的环境条件方面，存在日益发展的威胁。然而，使用直接控制或使用合成化学品或通过繁殖和转基因方法开发植物和动物耐病原体/抗病原体品种来保护和处理作物和牲畜的常规方法，随着具有增加的对抗能力的病原体的演化而面临着更复杂和更具挑战性的问题。
此外，尽管合成化学品的使用已经使所生产的食物的量发生了革命，但是需要用于抵抗抗性的增加的量导致最终食物产品(不管是基于植物还是基于动物的)中化学品的高残留水平。整个食物链和生态系统正在受到影响而没有适当的，可持续的对策。
或，转基因作物和动物在许多发展中国家仍将被采用来实践，而新繁殖的抗性品种由于上述快速发展的病原体范围而在短时间内变成易感。
因此，出现了潜在的机会，这是为了解决开发用于作物和牲畜保护和康复的新的天然解决方案的这种迫切需要。这种新的替代解决方案还可以补充现有的作物和生计复壮和保护的方法。此外，这样的天然组合物在环保，一致有效和更容易复制更广泛和更可接受的世界范围内使用的成功方面是有利的。
Patier等人，Plant Science 110-(1995)27-35公开了通过酶促水解制备的卡拉胶(carrageenan)寡糖，其中寡聚物由D-3,6-脱水-α+-D-吡喃半乳糖基(1-3)-O-8-D-吡喃半乳糖基-4-硫酸盐的重复单元(新角叉藻二糖)组成，其聚合度(DP＝n)范围为DP2(四糖)至更高高达DP7，其通过卡拉胶的酶促水解得到，并且显示出它们在欧洲黑莓(RubusFruticosus)中引起植物防御酶的活性。通过阅读本公开并参考图2和3(第30页，第2栏)和图4(第31页，第1页)，似乎较高分子量的己糖(DP3)比较低分子量的四糖(DP2)更具活性。
Vera等人，Physiological and Molecular Plant Pathology(2011)12(5)437-447公开了8,500Da的寡聚硫酸化半乳聚糖(Poly-Ga)诱导了烟草植物中针对烟草花叶病毒(TMV)的剂量依赖性、处理数依赖性和长期的保护，这模拟了疫苗接种效果。此外，Vera等人，Physiological and Molecular Plant Pathology 79(2012)31-39描述了对应于约20个单位的硫酸化半乳糖的10,000Da的寡聚卡拉胶κ2、λ和ι诱导了对烟草植物(var.Xanthi)中病原体的长期和宽范围的保护。
Kalitnik等人，J Appl Phycol(2013)25:65–72公开了不同类型的卡拉胶的低分子衍生物及其抗病毒活性。Kalitnik等人描述了可以通过不同的方法获得分子量在1200Da至4300Da范围内的卡拉胶衍生物。此外，Kalitnik等人教导了较高分子量的卡拉胶寡糖对TMV的抗病毒活性高于其低分子量衍生物的抗病毒活性(第70页第1栏第2整段&第70页第2栏最后一段)。
在动物的情况下，Chen等人(Aquaculture 2008)报道了，当用各种类型的卡拉胶聚合物注射虾时，与未处理的虾相比，观察到对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)(细菌)感染的抗性增加。另一篇出版物，Chen等人(Fish&Shellfish Immunol,2014)报道了，当测试所述攻击时，在饲喂食白对虾，即凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的饮食中包含细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata)的热水提取物(硫酸化多聚糖)改善了对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)细菌以及对白斑综合征病毒的抗性。由Cheng等人(FishShellfish Immunol 2007)完成的工作表明了，与未处理的鱼相比，当腹膜内注射到鱼中，接着用溶藻弧菌(细菌)进行攻击试验时，ι-卡拉胶显示出更高的存活率。此外，尽管抗生素对细菌感染是有效的，但是当以非常低的剂量给予时，抗生素已经被用作生长促进剂。由于牲畜、鸟类和其它水生动物的集约化培养，抗生素生长促进剂的猖獗使用正在导致新的抗生素抗性细菌菌株的出现(M K Chattopadhayay等人，Front Microbiol.2014；5:334,YMehdi等人，Anim Nutrition 2018)。这是另一个需要用能够以自然的方式改善动物健康并且环保且消费者友好的替代产品来解决的问题。
鉴于前面段落中提到的现有技术，显然迫切需要找到环保，有效且同时可以液体或固体形式分配的天然产物和组合物，以用于植物以及动物保护和针对生物和非生物胁迫的治疗。这样的组合物将在农业实践中为作物和牲畜提供期望的可持续的，且还有生态意识的保护以用于长期使用。
发明概述
在本公开的一个方面，提供了包含至少一种硫酸化半乳糖的组合物。
在本公开的第二方面，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖。
在本公开的第三方面，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:5至50:1的范围内。
在本公开的第四方面，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)至少一种糖衍生物如HMF，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖衍生物组分的重量比在9:1至2:1的范围内。
在本公开的第五方面，提供了用于制备组合物的方法，所述方法包括：(a)使具有多糖混合物的物质与水接触以获得浆料；和和(b)通过水解使浆料解聚，得到所述组合物。
在本公开的第六方面，提供了组合物用于处理和/或保护植物的用途。
在本公开的第七方面，提供了组合物用于处理和/或保护动物的用途。
在本公开的第八方面，提供了用于处理植物的方法，所述方法包括：(a)获得所述组合物；和(b)使所述组合物与植物或植物的一部分接触。
在本公开的第九方面，提供了用于处理动物的方法，所述方法包括：(a)获得所述组合物；和(b)将所述组合物施用于动物或动物的一部分。
在本公开的第十方面，提供了用于医治植物的方法，所述方法包括：(a)获得所述组合物；和(b)使所述组合物与植物或植物的一部分接触。
在本公开的第十一方面，提供了用于医治动物的方法，所述方法包括：(a)获得所述组合物；和(b)使所述组合物与动物或动物的一部分接触。
在本公开的第十二方面，提供了硫酸化半乳糖用于保护植物免受感染的用途。
在本公开的第十三方面，提供了硫酸化半乳糖用于活化植物防御途径的用途。
在本公开的第十四方面，提供了硫酸化半乳糖用于保护动物免受感染或非生物胁迫的用途。
在本公开的第十五方面，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染植物的用途。
在本公开的第十六方面，提供了硫酸化半乳糖用于治疗感染动物的用途。
在本公开的第十七方面，提供了硫酸化半乳糖用于刺激动物免疫和胁迫耐受性的用途。
参考以下描述和所附权利要求，将更好地理解本主题的这些和其它特征、方面和优点。提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择。本概述不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
附图的简要说明
以下附图形成本说明书的一部分并被包括以进一步说明本公开的方面。通过结合本文所呈现的具体实施方案的详细描述参考附图，可以更好地理解本公开。
图1示出了根据本公开的实施方案，与未处理的植物相比，在用含有2、3、4mL/L稀释液的Gal-S(称为制剂Gal-S-L1)的液体制剂进行叶喷施后，对拟南芥的基于核盘菌感染损伤的测定。
图2示出了根据本公开的实施方案，与未处理的植物相比，在用含有Gal-S的液体制剂进行叶喷施后，对番茄植物的茄链格孢菌(Alternaria solani)感染严重程度评分测定。
图3示出了根据本公开的实施方案，与未处理的植物相比，在用Gal-S-L1的液体制剂和含有23％嘧菌酯SC的市售化学杀真菌剂喷施后，对番茄作物的比较田间试验，其表示为番茄枯萎病发病率的降低百分比。
图4示出了根据本公开的实施方案，在用含有不同水平的Gal-S的液体制剂Gal-S-L1和Gal-S-L12进行叶喷施后，定量木瓜(papaya)中的木瓜环斑病毒(PRSV)负荷降低的基于qPCR的测定，其中Gal-S-L12用水稀释至1.5mL/L的浓度，并且Gal-S-L1用水稀释至4ml/L的浓度，并与未处理的植物进行比较。
图5示出了根据本公开的实施方案，与未处理的植物相比，向含有Gal-S(作为总糖组分的主要组分(89％))的制剂中添加添加剂例如金属离子或水杨酸或β-氨基丁酸(BABA)的产品功效的改善。
图6示出了根据本公开的实施方案，在饮食中包含Gal-S-L1时，在户外田间条件下，凡纳滨对虾(L.vannamei)的存活增加，表明含有Gal-S的制剂可以减轻动物体内的非生物胁迫。
图7示出了根据本公开的实施方案，用含有Gal-S的制剂处理，然后用茄链格孢菌感染的离体番茄叶中真菌诱导的损伤/损害的大小随着液体制剂中Gal-S含量的增加而降低，其显示Gal-S对植物健康的保护作用。
图8示出了根据本公开的实施方案，Gal-S和HMF自身保护植物免受真菌侵袭的特性。
图9示出了根据本公开的实施方案，富含Gal-S的组合物和它们的组成组分都不直接作用于植物病原体，并且它们的植物保护作用是通过它们对植物先天防御途径的间接作用而产生的。
图10示出了根据本公开的实施方案，在田间条件下，富含Gal-S的组合物如何可用于控制番茄(A)和辣椒植物(B)中的病毒性疾病。
图11示出了根据本公开的实施方案，含有Gal-S的制剂与具有不同作用模式的现有抗真菌化合物(例如嘧菌酯和烯酰吗啉)的组合仍可为植物提供增强的对病原体侵袭的保护，因为其能够上调植物防御途径。
图12示出了根据本公开的实施方案，含有Gal-S的制剂可如何上调植物中已知在植物防御中起作用的某些基因途径。
图13显示了根据本公开的实施方案，相对于对照，用Gal-S-L1处理后罗非鱼鱼苗的存活增加(*表示p值<0.05，ANOVA)，从而显示了含有Gal-S的制剂在动物中减轻非生物胁迫的能力。
图14示出了根据本公开的实施方案，在哈氏弧菌(V.harveyi)细菌性疾病攻击后，相对于对照，Gal-S-L1处理的虾中斑节对虾(P.monodon)后期幼体(PL)的存活增加，从而显示了含有Gal-S的制剂保护动物免受疾病的能力。
图15示出了根据本公开的实施方案，在用含有Gal-S-L1的制剂处理时，斑节对虾(后期幼体)中免疫系统基因和抗微生物肽的上调。
图16显示了根据本公开的实施方案，与对照相比，在肉鸡饲料中包含Gal-S-L1的粉末制剂时，HI滴度(针对新城疫病毒的血清抗体)的增加(*表示p值<0.05,ANOVA)，这说明了含有Gal-S的制剂的动物保护作用。
图17显示了与对照相比，在肉鸡饲料中包含Gal-S-L1的粉末制剂时，血清谷胱甘肽还原酶活性的增加(*表示p值<0.05,ANOVA)。谷胱甘肽还原酶是抗氧化活性的标志物，并且改善的抗氧化状态可以保护动物免受非生物胁迫，从而显示根据本公开的实施方案的含有Gal-S的制剂的效果。
图18显示了根据本公开的实施方案，分别用2ml/L和8mg/L的Gal-S-L1制剂和Gal-S处理时，拟南芥属植物中免疫基因标志物PDF1.2和VSP2的相对基因表达水平，并且在最终应用中需要阈值浓度的Gal-S以触发免疫基因表达。
发明的详细描述
本领域技术人员将了解，本公开可经受除具体描述的那些以外的变化和修改。应当理解，本公开包括所有这样的变化和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同提及或指示的所有这样的步骤、特征、组合物和化合物，以及任何或更多个这样的步骤或特征的任何和所有组合。
本公开中使用的序列
SEQ ID NO：1描述了扩增PRSV NiB基因的正向引物序列AGTCGGCCCGAAGCAATTTT
SEQ ID NO：2描述了扩增PRSV NiB基因的反向引物序列CTCATCACTCAAGATAGTTCCTGAA
SEQ ID NO:3描述了扩增PDF 1.2基因的正向引物序列。TCACCCTTATCTTCGCTGCTC
SEQ ID NO:4描述了扩增PDF 1.2基因的反向引物序列。ATGTCCCACTTGGCTTCTCG
SEQ ID NO:5描述了扩增VSP基因的正向引物序列。TGTGAACAGGCAGATGAACC
SEQ ID NO:6描述了扩增VSP基因的反向引物序列。GCGATACCGATCTCGTCAA
SEQ ID NO:7描述了扩增PR1基因的正向引物序列。AATGCTCAAGATAGCCCACAAG
SEQ ID NO:8描述了扩增PR1基因的反向引物序列。AATAAGTCACCGCTACCCCAG
定义
为方便起见，在本公开的进一步描述之前，本说明书和实施例中使用的某些术语在本文中被描绘。这些定义应根据本公开的其余部分来阅读并且如本领域技术人员所理解。本文所用的术语具有本领域技术人员所公认和已知的含义，然而，为了方便和完整起见，下文阐述特定术语及其含义。
冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))该冠词的语法对象。
术语“包含(comprise)”和“包含(comprising)”以包括的开放意义使用，意味着可以包括另外的元件。其不旨在被解释为“仅由…组成”。
在本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变型将被理解为意指包括所陈述的元件或步骤或元件或步骤组，但不排除任何其它元件或步骤或元件或步骤组。
术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
为了本公开的目的，术语“至少一种糖组分”旨在涵盖本领域已知的任何糖组分及其糖的任何盐或衍生物。盐包括现有技术中通常已知的糖的盐。糖的衍生物包括在水解过程中形成的衍生物如羟甲基糠醛(HMF)。“总糖含量”旨在涵盖如本公开中所公开的组合物的硫酸化半乳糖和至少一种糖组分以及糖组分的衍生物。“总糖含量”通常是指组合物中的所有可溶性碳水化合物或糖，其可以使用标准测试如本公开中提及的蒽酮硫酸测试来检测。术语“至少一种硫酸化半乳糖”旨在涵盖单糖组分和半乳糖部分上所有可能的磺酰化，其可以在半乳糖部分上的一个位置、两个位置或三个位置。另外，其旨在涵盖在不同位置被磺酰化的硫酸化半乳糖的混合物。术语“多糖”旨在涵盖各种聚合度(DP)的单糖的排列和组合。术语“动物饲料”旨在涵盖所有可能的饲料，其可以被给予在圈养下饲养的动物用于家庭目的。术语动物包括但不限于家禽、鱼、虾、牛、其它水生动物、牲畜、昆虫、哺乳动物、爬行动物和啮齿动物。术语“硫酸化半乳糖”和“半乳糖硫酸”应可互换地理解。术语“植物”旨在包括本公开的组合物和硫酸化半乳糖可以与之接触的本领域通常已知的所有类型的植物。与本公开的组合物有关的术语“干燥形式”涉及不具有超过10％w/w水平的水分的组合物。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文所提及的所有出版物均通过引用并入本文中。
比率、浓度、量和其它数值数据可以以范围形式呈现在本文中。应当理解，这样的范围形式仅为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括作为范围的限制明确列举的数值，而且包括包含在该范围内的所有单独的数值或子范围，就好像每个数值和子范围被明确列举一样。
考虑到背景技术部分中提到的现有技术，很明显，对于植物或动物的保护和治疗效果，现有技术中没有一种曾经测试过富含单糖半乳糖硫酸的制剂。
此外，通过阅读所有上述文献，本领域技术人员可以得出结论，较高分子量的卡拉胶寡糖在其植物保护效果中是最有效的，从而缺乏任何寻找替代物，特别是基于糖层次结构缩合中最低的替代物，即单糖的动机。此外，上述文献中没有一篇提供关于单独的单糖半乳糖硫酸或主要包含所述单糖的组合物能够具有植物或动物保护和/或治疗效果的任何指示。鉴于本领域已知的与常规方法或转基因方法保护和医治作物和牲畜免受面临不断发展和变化的胁迫景观的生物和非生物胁迫相关的缺点，本公开提供了包含主要富含单糖半乳糖硫酸的制剂的天然成分的独特组合，其在以预定重量浓度组合时提供了保护性和医治性组合物，所述组合物提供了导致保护系统(例如植物和动物中的免疫反应途径)活化以对抗抗生物和非生物胁迫的预料不到和令人惊讶的结果。此外，通过添加诸如某些金属离子的微量元素，产生了对这种胁迫的进一步有效的防御。当将本公开的基于单糖半乳糖硫酸的组合物与天然植物防御活化剂如水杨酸和/或氨基酸如β氨基丁酸组合时，进一步观察到组合效果。此外，显示有时由于水解条件而形成的糖的衍生物，如HMF本身可以提供额外的保护作用。因此，本公开提供了一种有效的，环保的解决方案，以解决本领域中对防御植物和动物免受生物和非生物胁迫物的天然制剂的需要。此外，本领域已知的制剂，甚至具有硫酸化半乳糖的寡糖的制剂，教导了随着所述糖的寡聚化或复杂性增加，针对胁迫物的保护性防御，例如抗病毒反应的效力的提高。相比之下，通过预料不到地证明基于单糖半乳糖硫酸的组合物在活生物体(其可以是植物或动物)中增加对生物和非生物胁迫物的强防御中的作用，本公开的组合物和制剂解决该问题。
此外，本公开具有提供独特的，良好表征的，高度可再现的，均匀的和可扩展的组合物的优点，所述组合物以适于管理批准的液体或固体形式使用。本公开还提供了易于使用的组合物，其具有可接受成为市售产品的固体的均匀性，以及可容易鉴定的，但独特且新颖的活性成分(单糖半乳糖硫酸)，这对生物和非生物胁迫具有预料不到和令人惊讶的效果。
背景技术部分中提到的现有技术都没有专门测试富含单糖半乳糖硫酸的制剂的植物保护效果。此外，其中研究者使用的一些制备卡拉胶寡糖的方法可能不会导致半乳糖硫酸的形成或去除或降低极低分子量化合物，半乳糖-4-硫酸(MW 282CAS编号125113-68-0)或半乳糖6-硫酸(MW282 CAS编号125455-62-1)或半乳糖-2,6-二硫酸(MW340)的浓度。例如，Patier等人使用酶促方法来解聚κ卡拉胶，其主要已知产生多个重复二糖单元(β-卡拉胶二糖)的寡糖，并且不知道产生单糖。事实上，Patier等人在其出版物中报导的最小单元是四糖(在这里称为DP2)，其由β-卡拉胶二糖的两个重复单元组成。
Vera等人使用等人(2006)的方法(通过来自Schyzimenia binderi(Gigartinales，Rodophyta)的硫酸化半乳聚糖的自由基解聚制备低分子量部分及其抗凝血剂活性Carbohydr.Polym.66,208–215)。/>等人的方法(2006)涉及使解聚的卡拉胶广泛地通过3,500MW截止值的透析膜(其将去除低于3,500的所有分子量)透析，然后使用剩余的材料用于进一步的目的。Vera等人(2012)使用相对温和的酸水解条件，其使用0.1N的HCl在60℃下45分钟，这可能没有导致广泛形成单糖。事实上，Vera等人具体分析它们的制备并确定分子量平均为10,000道尔顿。类似地，Kalitnik等人(2013)使用Yu等人的方法(2002-Structural studies onκ-carrageenan derived oligosaccharides.CarbohydrRes 337:433–440)，其使用酸水解，这使用0.1N HCl，在60℃下4小时。有趣的是注意到在这些条件下，按照Yu等人(2002)的图1，产生的最低分子量大于或等于2660道尔顿。这也与Vera等人(2012)一致，其使用相对温和的酸水解条件，使用0.1N的HCl在60℃下45分钟。事实上，Vera等人具体分析它们的制备并确定分子量平均为10,000道尔顿，这与其中使用的相对温和的条件一致。
因此，上述研究者可能都没有制备和测试卡拉胶水解产物，其中总糖的主要组分按分子量计小于400Da。
在动物的情况下，Chen等人(Aquaculture 2008)报道，当用各种类型的卡拉胶聚合物注射虾时，与未处理的虾相比，观察到对哈氏弧菌(细菌)感染的抗性增加。另一篇出版物，Chen等人(Fish&Shellfish Immunol,2014)报道了当测试所述攻击时，在饲喂白对虾，即凡纳滨对虾的饮食中包含细基江蓠繁枝变种的热水提取物(硫酸化多聚糖)改善了对溶藻弧菌细菌以及对白斑综合征病毒的抗性。由Cheng等人(Fish Shellfish Immunol 2007)完成的工作表明了，与未处理的鱼相比，当腹膜内注射到鱼中，接着用溶藻弧菌(细菌)进行攻击试验时，ι-卡拉胶显示出更高的存活率。在所有这些情况下，不进行多糖的解聚。因此，这些多糖的分子量远大于400Da。
在所有这些研究中，没有单糖半乳糖硫酸单独或与其它寡糖硫酸酯组合可实现类似效果的迹象，并且如果有什么的话，较高层次结构的糖的思想与更好的保护相关。
本公开在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案旨在仅用于示例的目的。如本文所述，功能等同的产品，组合物和方法明显地在本公开的范围内。
本公开中公开的组合物包含硫酸化半乳糖。在另一方面，所述组合物包含硫酸化半乳糖和至少一种糖组分或糖的衍生物。在一个单独的方面，所述至少一种糖组分选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐及其组合。所述至少一种糖组分选自二糖、三糖、四糖、戊糖的硫酸盐及其组合。本公开的组合物公开了富含硫酸化半乳糖的组合物。
在本公开的一实施方案中，提供了包含至少一种硫酸化半乳糖的组合物。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖。在本公开的另一个实施方案中，所述至少一种糖组分选自卡拉胶二糖、卡拉胶三糖及其组合。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖包括半乳糖-4-硫酸。可以预期半乳糖磺酰化的所有其它可能的组合也包括在本公开的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐，或糖的衍生物的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖包含D-半乳糖-4-O-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐，或糖的衍生物的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖包括D-半乳糖-4-O-硫酸、D-半乳糖-2-O-硫酸和D-半乳糖-6-O-硫酸。在本公开的另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖包含重量比在1-100:1-100:1-100范围内的D-半乳糖-4-O-硫酸、D-半乳糖-2-O-硫酸和D-半乳糖-6-O-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐，或糖的衍生物的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖包括D-半乳糖-2-O-硫酸和D-半乳糖-2,6-二硫酸。在本公开的另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖包含重量比在100:1至1:100范围内的D-半乳糖-2-O-硫酸和D-半乳糖-2,6-二硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，并且其中所述组合物还包含选自羟甲基糠醛(HMF)、乙酰丙酸、甲酸及其组合的至少一种糖的衍生物。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖具有相对于总糖含量在15-90％范围内的重量百分比。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖具有相对于总糖含量在18-88％范围内的重量百分比。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖具有相对于总糖含量在20-75％范围内的重量百分比。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述至少一种糖选自：κ-卡拉胶二糖、κ-卡拉胶三糖、κ-卡拉胶四糖、ι-卡拉胶二糖、ι-卡拉胶三糖、ι-卡拉胶四糖、λ-卡拉胶二糖、λ-卡拉胶三糖、λ-卡拉胶四糖及其盐或糖的衍生物如HMF。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物具有25-120g/l范围内的总糖含量。在另一个实施方案中，所述组合物具有30-110g/l范围内的总糖含量。在另一个实施方案中，所述组合物具有35-100g/l范围内的总糖含量。在另一个实施方案中，所述组合物具有40-100g/l范围内的总糖含量。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的粉末组合物，其中所述组合物具有100-500g/kg范围内的总糖含量。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，其中所述组合物为总糖含量在100-600g/kg范围内的粉末形式。在另一个实施方案中，所述组合物为总糖含量在150-500g/kg范围内的粉末形式。在另一个实施方案中，所述组合物为总糖含量在150-450g/kg范围内的粉末形式。在一个可供选择的实施方案中，所述组合物为总糖含量在200-450g/kg范围内的粉末形式。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物还包含选自溶剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂、动物饲料及其组合的至少一种物质。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖或至少一种糖，其重量百分比在所述组合物的总固体含量(不包括水分)的5-90％范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖的重量百分比在所述组合物的总固体含量的5-90％的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖的重量百分比在所述组合物的总固体含量的10-85％的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖的重量百分比在所述组合物的总固体含量的20-85％的范围内。在一个可供选择的实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖的重量百分比在所述组合物的总固体含量的30-85％的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:5至50:1的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:5至50:1的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:1至45:1的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:1至40:1的范围内。在可供选择的实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在5:1至35:1的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:5至50:1的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖组分的重量比在1:5至40:1、或1:2至35:1、或1:1至30:1、或2:1至28:1、或5:1至25:1、或7:1至22:1、或10:1至20:1、或11:1至17:1的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；和(b)至少一种糖的衍生物如HMF，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖衍生物组分如HMF的重量比在9:1至2:1的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)至少一种硫酸化半乳糖；(b)选自二糖、三糖、四糖、戊糖及其盐的至少一种糖；和(c)选自羟甲基糠醛(HMF)、乙酰丙酸、甲酸及其组合的至少一种糖的衍生物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与至少一种糖的衍生物的重量比在9:1至2:1的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖与至少一种糖的衍生物的重量比在7:1至1:1的范围内。在另一个实施方案中，所述至少一种硫酸化半乳糖与至少一种糖的衍生物的重量比在6:1至1:1的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物还包含选自微量元素、天然植物防御活化剂及其组合的至少一种添加剂。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物还包含选自以下的至少一种添加剂：微量元素、天然植物防御活化剂及其组合，并且其中所述微量元素选自硼、锌、铁、锰、镁、钼、钙、钾、硒、铜、以上的组合以及以上的盐。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物还包含选自以下的至少一种添加剂：微量元素、天然植物防御活化剂及其组合，并且其中所述天然植物防御活化剂选自水杨酸、β氨基丁酸、它们的盐及其组合。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物通过加工卡拉胶或加工的麒麟菜(Eucheuma)或半精制卡拉胶获得。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物通过加工含有卡拉胶的红藻获得。在本公开的另一个实施方案中，含有卡拉胶的海藻选自：异枝卡帕藻(Kappaphycus striatus)、耳突麒麟菜(Eucheuma cottonii)、细齿麒麟菜(刺麒麟菜)(Eucheuma denticulatum(spinosum))、杜氏海膜(Halymenia durvillaea)、长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、皱波角叉菜(Chondrus crispus)、Solieria chordalis、紫红紫菜(Porphyra purpurea)、异丝福美麒麟菜(Euchuema isiforme)、钩沙菜(Hypneamusciformis)、丝状红翎菜(Solieria filiformis)、宽果藻(Mastocarpus stellatus)、Mastocarpus papillatus、南非紫菜(Porphyra capensis)、Furcerllaria spp.、杉藻(Gigartina spp)、江蓠藻(Gracilaria spp.)、Iridea spp.、Anatheca spp.、鸡冠菜(Meristotheca spp.)、伊谷藻(Ahnfeltia spp.)、Gynmogongrus spp.、育叶藻(Phyllophora spp.)及其组合。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物为植物提供了对抗生物胁迫的保护。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用作植物防御途径活化剂。
在本公开的一实施方案中，提供了用于制备包含至少一种硫酸化半乳糖的组合物的方法，所述方法包括：(a)使具有多糖的混合物的物质与水接触以获得浆料；和(b)通过水解使浆料解聚以获得组合物。在本公开的另一个实施方案中，所述物质是固体生物质。
在本公开的一实施方案中，提供了用于制备包含至少一种硫酸化半乳糖的组合物的方法，所述方法包括：(a)使具有多糖的混合物的物质与水接触以获得浆料；和(b)通过水解使浆料解聚以获得组合物，其中解聚通过在至少一种酶的存在下使用酶促水解进行，所述酶选自纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、硫酸酯酶、脱水半乳糖脱氢酶、α淀粉酶、卡拉胶酶、水解酶、硫酸化酶及其组合。
在本公开的一实施方案中，提供了用于制备如本文所述的组合物的方法，所述方法包括：(a)使红藻与水接触以获得总固体含量在5-20％范围内的浆料；(b)在pH范围为1.0-4.0，温度范围为50-180℃，压力范围为0.5-10大气压下，使所述浆料解聚10分钟-5小时的时间范围，以获得水解产物；(c)任选地浓缩水解产物以获得白利糖度值在18-35范围内的糖浓度，以获得组合物，或d)任选地干燥它以获得粉末组合物。
在本公开的一实施方案中，提供了用于制备如本文所述的组合物的方法，所述方法包括：(a)使卡拉胶与水接触以获得总固体含量在5-20％范围内的浆料；(b)在pH范围为1.0-4.0，温度范围为50-180℃，压力范围为0.5-10大气压下，使所述浆料解聚10分钟-5小时的时间范围，以获得水解产物；(c)浓缩水解产物以获得具有18-35的白利糖度值的糖浓度，以获得液体形式的组合物，或d)任选地干燥液体形式以获得粉末形式的组合物。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物用于植物保护处理的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了用于处理植物的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；和(b)使所述组合物与植物或植物的一部分接触。在本公开的另一个实施方案中，通过选自叶施用、土壤施用、种子处理、植物组织上的注射及其组合的方法使组合物与植物接触。
在本公开的一实施方案中，提供了用于处理植物的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；和(b)使所述组合物与植物或植物的一部分接触，其中接触的组合物包含相对于所述组合物具有至少10mg/L的浓度的至少一种硫酸化半乳糖。在另一个实施方案中，所述组合物包含相对于接触的组合物具有10mg/L至500mg/L范围内的浓度的至少一种硫酸化半乳糖。在另一个实施方案中，接触的组合物包含相对于接触的组合物具有20mg/L至170mg/L范围内的浓度的至少一种硫酸化半乳糖。在可供选择的实施方案中，接触的组合物包含相对于接触的组合物具有30mg/L至150mg/L范围内的浓度的至少一种硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了用于处理植物的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；和(b)使所述组合物与植物或植物的一部分接触，其中所述方法包括通过叶施用使所述组合物与所述植物接触，所述叶施用包括以50-1000ml/英亩作物的比率接触所述组合物。在本公开的另一个实施方案中，叶施用在植物的营养状态下进行，并且施用在移植后10-15天进行，随后的施用以10-15天的间隔进行，直到开花和结果开始。在本公开的另一个实施方案中，所述组合物将被稀释并通过滴施施用在植物的根区。
在本公开的一实施方案中，提供了医治植物的方法，所述方法包括用如本文所述的方法处理植物。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的处理植物的方法，其中处理与至少一种渗透剂组合。在本公开的另一个实施方案中，所述至少一种渗透剂选自阴离子表面活性剂、离子表面活性剂、非离子表面活性剂及其组合。在本公开的另一个实施方案中，所述至少一种渗透剂选自聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、月桂基二甲基氧化胺、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇、辛苯聚醇、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide)、聚乙二醇10十二烷基醚、Brij 721、胆汁盐、聚乙二醇蓖麻油、壬基酚乙氧基化物、环糊精、卵磷脂、甲基苄索氯铵及其组合。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的处理植物的方法，其中处理与至少一种生物增强剂组合，所述生物增强剂选自海藻提取物、蛋白质水解产物、腐殖酸、黄腐酸、微生物提取物、生物肥料等。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的处理植物的方法，其中处理与至少一种植物保护剂组合，所述植物保护剂选自杀真菌剂、杀虫剂、微生物提取物、微生物(包括细菌、真菌、病毒、噬菌体等)。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于动物健康保护。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用作植物防御途径活化剂。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于医治动物。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于处理动物。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于保护植物免受生物胁迫。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于保护植物免受生物胁迫，并且其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于与植物或植物的一部分接触的组合物具有至少10mg/L的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于保护植物免受非生物胁迫。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于保护植物免受非生物胁迫，并且其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于与植物或植物的一部分接触的组合物具有至少10mg/L的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于保护植物免受感染。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物用于保护植物免受感染，并且其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于接触的组合物具有至少10mg/L的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了用如本文所述的组合物处理动物的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；和(b)将所述组合物施用于动物。在本公开的另一个实施方案中，施用包括饲料输注、添加到动物使用的水中、局部施用和注射组合物。
在本公开的一实施方案中，提供了用如本文所述的组合物处理动物的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；和(b)将所述组合物施用于动物，其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于给予所述动物的饲料具有至少10mg/kg的浓度。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于给予动物的饲料具有10mg/kg至400mg/kg范围内的浓度。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于给予动物的饲料具有30mg/kg至300mg/kg范围内的浓度。在可供选择的实施方案中，所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于给予动物的饲料具有50mg/kg至200mg/kg范围内的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了用如本文所述的组合物处理动物的方法，所述方法包括：(a)获得如本文所述的组合物；和(b)将所述组合物施用于动物，其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于所述动物生长的培养水具有至少30mg/公吨的浓度。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于动物生长的培养水具有30mg/公吨至400mg/公吨范围内的浓度。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于动物生长的培养水具有40mg/公吨至300mg/公吨范围内的浓度。在可供选择的实施方案中，所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于动物生长的培养水具有50mg/公吨至200mg/公吨范围内的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了如本文所述的组合物，其中所述组合物还包含选自以下的至少一种组分：增稠剂、乳化剂(emulsifying agent)、乳化剂(emulsifier)、稳定剂、悬浮剂及其组合。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护植物免受感染的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护植物免受感染的用途，其中硫酸化半乳糖是指如本文所述的任何形式的硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护植物免受感染的用途，其中硫酸化半乳糖是半乳糖-4-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护植物免受感染的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/L的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有10mg/L-500mg/L的浓度。在又一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/L-400mg/L的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/L-300mg/L的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护植物免受感染的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/L的浓度。可以预期，高于10mg/L的所有范围的Gal-S旨在被认为是如本文所述的用途的公开内容，Gal-S的浓度在10mg/L至200mg/L、或20mg/L至180mg/L、或30mg/L至150mg/L、或40mg/L至140mg/L、或45mg/L至125mg/L、或75mg/L至120mg/L的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于活化植物防御途径的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于活化植物防御途径的用途，其中硫酸化半乳糖是指如本文所述的任何形式的硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于活化植物防御途径的用途，其中硫酸化半乳糖是半乳糖-4-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于活化植物防御途径的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/L的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为10mg/L-500mg/L的浓度。在又一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/L-400mg/L的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/L-300mg/L的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于活化植物防御途径的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/L的浓度。可以预期，高于10mg/L的所有范围的Gal-S旨在被认为是如本文所述的用途的公开内容，Gal-S的浓度在10mg/L至200mg/L、或20mg/L至180mg/L、或30mg/L至150mg/L、或40mg/L至140mg/L、或45mg/L至125mg/L、或75mg/L至120mg/L的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护动物免受感染或非生物胁迫的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护动物免受感染或非生物胁迫的用途，其中硫酸化半乳糖是指如本文所述的任何形式的硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护动物免受感染或非生物胁迫的用途，其中硫酸化半乳糖是半乳糖-4-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护动物免受感染或非生物胁迫的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/kg给予动物的饲料的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为10mg/kg-500mg/kg的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-400mg/kg的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-300mg/kg的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于保护动物免受感染或非生物胁迫的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/kg给予动物的饲料的浓度。可以预期，高于10mg/kg的所有范围的Gal-S旨在被认为是如本文所述用途的公开内容，Gal-S的浓度可以在10mg/kg至500mg/kg、或20mg/kg至450mg/kg、或30mg/kg至420mg/kg、或40mg/kg至350mg/kg、或50mg/kg至255mg/kg、或75mg/kg至215mg/kg、或100mg/kg至200mg/kg、或120mg/kg至200mg/kg的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染植物的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染植物的用途，其中硫酸化半乳糖是指如本文所述的任何形式的硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染植物的用途，其中硫酸化半乳糖是半乳糖-4-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染植物的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/kg给予动物的饲料的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为10mg/kg-500mg/kg的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-400mg/kg的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-300mg/kg的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染植物的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/kg给予动物的饲料的浓度。可以预期，高于10mg/kg的所有范围的Gal-S旨在被认为是如本文所述用途的公开内容，Gal-S的浓度在10mg/kg至200mg/kg、或20mg/kg至180mg/kg、或30mg/kg至150mg/kg、或40mg/kg至140mg/kg、或45mg/kg至125mg/kg、或75mg/kg至120mg/kg的范围内。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染动物的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染动物的用途，其中硫酸化半乳糖是指如本文所述的任何形式的硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染动物的用途，其中硫酸化半乳糖是半乳糖-4-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染动物的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/kg动物饲料的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为10mg/kg-500mg/kg的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-400mg/kg的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-300mg/kg的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于处理受感染动物的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少30mg/公吨动物生长的培养水的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为30mg/公吨-500mg/公吨的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/公吨-400mg/公吨的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为100mg/公吨-300mg/公吨的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于刺激动物免疫和胁迫耐受性的用途。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于刺激动物免疫和胁迫耐受性的用途，其中硫酸化半乳糖是指如本文所述的任何形式的硫酸化半乳糖。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于刺激动物免疫和胁迫耐受性的用途，其中硫酸化半乳糖是半乳糖-4-硫酸。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于刺激动物免疫和胁迫耐受性的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少10mg/kg动物饲料的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为10mg/kg-500mg/kg的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-400mg/kg的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/kg-300mg/kg的浓度。
在本公开的一实施方案中，提供了硫酸化半乳糖用于刺激动物免疫和胁迫耐受性的用途，其中硫酸化半乳糖具有至少30mg/公吨动物生长的培养水的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为30mg/公吨-500mg/公吨的浓度。在另一个实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为50mg/公吨-400mg/公吨的浓度。在可供选择的实施方案中，硫酸化半乳糖具有范围为100mg/公吨-300mg/公吨的浓度。
尽管已经参考某些实施例及其实施方式相当详细地描述了本主题，但是其他实施方式也是可能的。
实施例
现在将用工作实施例来说明本公开，其旨在说明本公开的工作，而不旨在限制性地暗示对本公开的范围的任何限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施所公开的方法和组合物，但本文描述了示例性方法、装置和材料。应当理解，本公开不限于所述的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以适用。
工作实施例
实施例1：拟南芥的核盘菌感染
本实验用四种处理进行。所用的产物是液体制剂，其含有作为总糖组分的20％的硫酸化半乳糖(Gal-S，单糖)，其被称为制剂Gal-S-L1。将Gal-S-L1用水稀释以达到2、3和4mL/L的最终浓度，用作叶喷剂。在四组(处理和对照)的每一组中测试六株植物。模型植物拟南芥生长在泥炭丸粒上，并在用病原体感染之前24小时用上述稀释产物(或水作为对照)进行叶喷施。处理后24小时，在两个单独的叶上用真菌核盘菌(Sclerotinia sp.)等量地感染每株植物。感染后48小时用游标卡尺测量感染点周围的损伤区域。本公开的图1在处理组中与未处理的对照组相比说明，当与未处理的对照相比时，由病原体引起的损伤少约44％(参见图1)。因此，本公开公开了一种基于单糖硫酸化半乳糖的制剂，当施加到植物上时，用该制剂进行的处理可以有效地控制真菌病原体的扩散。
实施例2：番茄植物中茄链格孢菌感染评分测定
本实验用两种处理进行。所用的产物是含有Gal-S的液体制剂，称为制剂Gal-S-L1。将Gal-S-L1用水稀释(终浓度为4mL/L)以用作叶喷剂。将稀释的产物(4mL/L)和对照(水)用于每组6株番茄植株上。在感染前24小时，用稀释的Gal-S-L1制剂(或对照用水)喷施生长在盆中的番茄植物。在此之后，每株植株在整个叶上用茄链格孢菌孢子(2X10^3/mL)等量地感染。为了保持环境湿度，将所有植物覆盖在透明聚乙烯覆盖物中并使其生长一周。使用0-5评级量表(Pandey等人,(2003),364-371)对感染的严重程度进行评分。显然，当与未处理组的植物相比时，Gal-S-L1处理组中症状的严重程度低约50％(参见图2)。因此，证明Gal-S-L1制剂可以控制真菌病原体的生长并为植物提供保护。
实施例3：用杀真菌剂对番茄作物的对比田间试验
本实验证明了在番茄作物上进行的田间试验实验。在该实验中，以2mL/L稀释液喷施Gal-S-L1，而为了比较，以1.0mL/L稀释液使用含有23％嘧菌酯SC的市售化学杀真菌剂，并与其中喷施水进行比较的对照组进行比较。所有处理均以叶喷施给予，在田间种植番茄幼苗后约15天进行第一次喷施，然后再喷施两次，每次喷施间隔15天。通过施用农家肥(FYM)，确保每组番茄植物具有相等的水和常规养分供应。在所有喷施完成时记录真菌性疾病发病率(番茄枯萎病)。图3中的结果清楚地显示Gal-S-L1在控制疾病发病率方面是非常有效的。这清楚地表明，Gal-S-L1的植物保护效果在与市售杀真菌剂的效果相当的范围内。
实施例4：显示木瓜作物中木瓜环斑病毒(PRSV)的病毒负荷降低的基于qPCR的测定
本实验使用含有不同水平的Gal-S的液体制剂，称为制剂Gal-S-L1和Gal-S-L12。对于一组植物，制剂Gal-S-L12(含有总糖的89％的Gal-S)以1.5ml/L的剂量使用，占约128mg/L的Gal-S浓度，而另一组用含有总糖20％的Gal-S的制剂Gal-S-L1处理，占约56mg/L的Gal-S浓度。仅用水处理第三组植物。实验包括3组植物；即，用PRSV感染并用Gal-S-L1处理的植物、用PRSV感染并用Gal-S-L12处理的植物和用PRSV感染并未处理的第三组植物，每组中有6株木瓜植物(木瓜植物的年龄为约60天)。a)在PRSV汁液(Bau等人,(2003),112-120)接种之前，b)在汁液接种后24小时，和c)在汁液接种后1周，经处理的植物组接受产物处理(Gal-S-L12或Gal-S-L1)，而未经处理的组接受水。在汁液接种前和汁液接种后10天从每组收集叶样品。将所有叶样品在-80℃下储存直至进一步分析。在该实验中，将一组特异性扩增PRSV NiB基因的引物用于基于SYBR绿的定量聚合酶链式反应(qPCR)中。5’AGTCGGCCCGAAGCAATTTT3’(SEQ ID NO:1)和5’CTCATCACACTCAAGATAGTTCCTGAA 3’(SEQ IDNO:2)引物序列分别用作正向和反向引物以特异性扩增PRSV NiB基因。从叶样品中分离总RNA，用逆转录酶反应制备cDNA，然后用qPCR分析。基于Ct值，计算病毒NiB基因的倍数变化。与未处理组相比，Gal-S-L1和Gal-S-L12处理组均显示PRSV负荷降低(参见图4)，其中Gal-S-L12比Gal-S-L1表现更好，这意味着用产物处理确实抑制了宿主植物细胞中的PRSV增殖。结果还清楚地表明，随着液体制剂中Gal-S含量的增加，病毒负荷低得更多，因此显示Gal-S浓度在植物保护作用中的重要性。
实施例5：具有添加剂的基于单糖硫酸化半乳糖的组合物的改善的功效
本实验如实施例4进行，但产物(Gal-S-L12)用金属离子(硼(0.1％)和锌(0.1％))或用水杨酸(0.5mM)和CaCl2(3mM)或用β氨基丁酸(0.25mg/ml)配制，然后在植物上处理。对于这些改进的制剂，可观察到病原体-PRSV相对病毒负荷的明显降低(参见图5)。
因此，已经确定富含半乳糖硫酸单糖以及金属离子和水杨酸或氨基酸如β-氨基丁酸的制剂的组合比它们单独的任何一种都大大改善了反应。
实施例6：用于制备Gal-S制剂的含有卡拉胶的原料的制备
从红藻异枝卡帕藻制备
1kg新鲜的异枝卡帕藻(sacol)海藻来源于印度尼西亚的巴厘岛，并通过装配有旋转螺旋压榨机和多孔碗的厨房榨汁机加工。使整个海藻与旋转螺杆接触，旋转螺杆将其分成小块。螺旋压榨机紧靠多孔碗挤压海藻块，并立即分离成汁液和汁提取浆，而不形成中间浆料。从设备的两个不同出口以连续方式分别收集海藻汁提取浆和海藻汁液。收集的汁提取浆的量为350g，收集的汁液的量为650g。汁提取浆的含水量为80％，汁液的白利糖度为5％。这样获得的汁提取浆在热风炉中进一步干燥，得到干燥的海藻薄片(含水量约10％)。汁提取浆(80％)水分或干燥的海藻薄片可用作制备硫酸化半乳糖(Gal-S)制剂的起始材料。
可选地，干燥的海藻薄片也可以通过以下制备：取新鲜的异枝卡帕藻海藻，并将其直接在阳光下或在热风炉中干燥至(约10％)的含水量。然后将干燥的海藻切成较小的碎片，以获得干燥的海藻薄片，用作制备Gal-S制剂的原料。
实施例7：由干燥的海藻薄片制备Gal-S制剂
用于制备如本文所述的组合物的方法包括以下步骤：
a.将如上所述获得的干燥的海藻薄片(10％含水量)用水浆化至10％重量比(w/w)的最终悬浮浓度。使用酸催化剂将悬浮液的pH调节至约pH2.4。将该悬浮液的等分试样离心并作为“零小时样品”放置在一边。
b.在恒定的搅拌条件下，将上述反应混合物加热并保持在119-123℃的温度范围和1巴的压力下。
c.使反应进行2.5小时。在1小时和2.5小时取出样品用于分析目的。在2.5小时结束时，将混合物冷却至室温以停止反应。
d.离心一部分样品，浓缩上清液以获得液体Gal-S制剂。在离心之前或之后干燥样品的另一部分以获得粉末Gal-S制剂。使用蒽酮硫酸方法(如以下实施例中所概述)分析液体Gal-S制剂以定量总糖，并在减去“零小时”样品的相应值后通过HPLC-MS(如以下实施例中所概述)分析Gal-S的浓度。
e.使用上述值计算作为总糖的比例的Gal-S的百分比。结果示于下表1中。总的来说，实施例部分提供了关于本发明组合物中使用的成分的工作和非工作实施例。此外，如本部分中所述的方法仅是用于制备组合物的一种方法，也可考虑用于制备该组合物的其它方法。
表1：水解后随时间(hr)的糖组成百分比
实施例8：通过HPLC-MS分析Gal-S制剂的Gal-S浓度的程序
在配备有电喷施电离源和在线UPLC系统(Agilent 1290 Infinity)的Agilent6460三重四极仪器上进行样品的质谱分析。以负离子模式分析糖，而以正离子模式分析HMF。对于糖分析，使用XBridge酰胺HPLC柱以及乙腈和水梯度。对于HMF分析，使用AgilentEclipse C18柱以及甲醇和水(含有0.1％甲酸)梯度。在注射前将样品稀释在MQ水中。以MRM(多反应监测)模式进行质量分析，得到前体和子离子光谱。所有化合物的标准曲线构建在5至200ppb之间。糖标准，即，卡拉胶二糖钠盐、κ卡拉胶三糖钠盐、D-半乳糖-4-O-硫酸钠盐)购自Carbosyth,UK。HMF购自Sigma Aldrich。
实施例9：使用蒽酮硫酸方法测量Gal-S制剂中总糖的方法
用于测量总糖的方法，其中使用蒽酮硫酸方法分析从如上述实施例7步骤(d)中所述的水解方法获得的样品的总糖含量。在粉末样品的情况下，将产物溶于水中并离心，并将上清液用于分析。在该方法中，将0.1g蒽酮(Himedia Cat编号GRM314)溶于100ml浓硫酸溶液中。制备0.25g/l的葡萄糖标准溶液。通过添加所需量的水制备一系列葡萄糖标准溶液0、0.05、0.1、0.15、0.2和0.25g/l。将0.4ml标准溶液或样品加入到0.8ml蒽酮溶液中，并将反应混合物在4℃孵育10分钟，然后在95℃孵育20分钟。将反应混合物冷却至室温达10-15分钟，并使用分光光度计在620nm下测量溶液的吸光度。
实施例10：用于获得本公开的组合物和可以获得的硫酸化半乳糖的可能混合物的另外的方法
富含半乳糖硫酸(Gal-S)的制剂可以由诸如卡拉胶或含有卡拉胶的材料(如红藻)的起始材料制备。这种海藻的实例为异枝卡帕藻(Kappaphycus striatus)、耳突麒麟菜(Eucheuma cottonii)、细齿麒麟菜(刺麒麟菜)(Eucheuma denticulatum(spinosum))、杜氏海膜(Halymenia durvillaea)、长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、皱波角叉菜(Chondrus crispus)、Solieria chordalis、紫红紫菜(Porphyra purpurea)、异丝福美麒麟菜(Euchuema isiforme)、钩沙菜(Hypnea musciformis)、丝状红翎菜(Solieriafiliformis)、宽果藻(Mastocarpus stellatus)、Mastocarpus papillatus、南非紫菜(Porphyra capensis)、Furcerllaria spp.、杉藻(Gigartina spp)、江蓠藻(Gracilariaspp.)、Iridea spp.、Anatheca spp.、鸡冠菜(Meristotheca spp.)、伊谷藻(Ahnfeltiaspp.)、Gynmogongrus spp.、育叶藻(Phyllophora spp.)及其组合。
使起始材料经受受控水解(例如在120-150℃的温度下用酸水解15分钟至5小时的时间段)以使多糖主链分解至所需的程度。水解可以通过改变水解温度和时间条件以及水解剂(酸，过氧化物，碱等)的浓度来小心地控制，以允许发生足够的分解。同时，非常过量的水解可导致与糖连接的硫酸去除，从而仅产生半乳糖。水解的程度可以使用与质谱(MS)连接的HPLC来测量。此外，可以通过使用连续水解设备来实现对水解的精确控制。卡拉胶可以是任何卡拉胶，如κ卡拉胶，ι卡拉胶或λ或杂化卡拉胶。根据所用的卡拉胶，这样获得的半乳糖硫酸可以在半乳糖部分的一个以上的位置被硫酸化。例如，富含由λ卡拉胶制备的半乳糖硫酸(Gal-S)的制剂将产生单糖半乳糖硫酸的混合物，其在半乳糖部分上的一个位置以及两个位置被硫酸化。
在Nori等人的US10,358,391B1(也是本公开的作者)所公开的本发明的海藻生物质水解条件范围内，发现当根据Nori等人的教导使用时，尽管在这些条件下产生的大部分水解产物可充当植物生物刺激剂，但令人惊讶的是，仅在极端水解条件(例如，较高的温度，如95℃，保持时间为4至12小时，或在120℃至150℃下，保持时间为5小时至15分钟)产生的水解产物的某些子集，产生如本公开中所公开的能够具有强植物和动物保护效果的水解产物混合物。
在使用HPLC-质谱技术分析这种保护性水解产物混合物时，发现水解产物的显著部分(即，大于总糖的15％)以硫酸化半乳糖(例如，单硫酸化半乳糖和二硫酸化半乳糖)存在，所有这些都小于400Da的分子量。在水解过程中这一分子量范围的形成以前在Nori等人的发明中没有提及。
当比较不同硫酸化半乳糖含量的两种这样的水解产物混合物时，还令人惊奇地发现，混合物中硫酸化半乳糖的含量越高，保护作用越强。硫酸化半乳糖含量的浓度与含有半乳糖硫酸的混合物的植物和动物保护作用之间的这种关系是本公开的非显而易见的特征。
还发现，特别是在使用极端条件水解的情况下，形成了显著量的羟甲基糠醛(超过制剂中糖总量的2％)。羟甲基糠醛是单糖的衍生物，并且在温度和酸性条件下容易由糖，脱水半乳糖形成(尽管它也由其它糖形成)。糖，脱水半乳糖是卡拉胶的成分。因此，羟甲基糠醛也可以被认为是使用某些制备方法生产的独特水解产物混合物的另外的标志物，所述混合物也导致具有植物和动物保护作用的硫酸化半乳糖的水平升高。如实施例14所示，还发现羟甲基糠醛可独立地对植物具有保护作用。这是令人惊讶且新的发现，以前没有报道过，因此独立地具有植物保护作用的半乳糖硫酸和糖的水解产物混合物可以通过形成羟甲基糠醛来增强，所述羟甲基糠醛是使用某些制备方法形成的。在这里可以注意到，当使用利用酶促水解或过氧化物水解的其它制备方法时，可以不总是形成羟甲基糠醛，而是可以在使用离子液体作为水解介质的过程中形成羟甲基糠醛。
制备富含半乳糖硫酸的组合物的其它方法是使用离子液体，过氧化物，其能够在合适的条件下将含有卡拉胶的材料分解成糖和半乳糖硫酸。
根据所用的卡拉胶，半乳糖硫酸可以在半乳糖部分上的一个以上的位置被硫酸化。例如，由λ卡拉胶制备的富含半乳糖硫酸(Gal-S)的制剂将产生单糖半乳糖-2-O-硫酸和半乳糖-2,6-二硫酸(其分别在一个位置以及两个位置被硫酸化)的混合物。另一方面，如果制剂由κ或ι卡拉胶制成，则主要的单糖部分是半乳糖-4-O-硫酸。如果起始原料是卡拉胶的混合物，则水解时的主要单糖将是半乳糖-2-O-硫酸，半乳糖-4-O-硫酸和半乳糖-6-O-硫酸的混合物。
可以解释为本公开的一部分的可能的原料：κ-卡拉胶(重复单元β-D-半乳糖-4-O-硫酸-α-3,6-脱水-D-半乳糖的聚合物)、κ-卡拉胶的前体(重复单元β-D-半乳糖-4-O-硫酸-α-D-半乳糖-6-O-硫酸的聚合物)、ι-卡拉胶(重复单元β-D-半乳糖-4-O-硫酸-α-3,6-脱水-D-半乳糖-2-O-硫酸的聚合物)、ι-卡拉胶的前体(重复单元β-D-半乳糖-4-O-硫酸-α-D-半乳糖-2,6-二硫酸的聚合物)、λ卡拉胶(重复单元β-D-半乳糖-2-O-硫酸-α-D-半乳糖-2,6-O-二硫酸的聚合物)，以及λ和κ-卡拉胶的混合物在一些海藻中也是可能的。
硫酸化半乳糖的一些代表性结构如下所示：
1.D-半乳糖-4-O-硫酸(钠盐的CAS ID：125113-68-0)
2.D-半乳糖-6-O-硫酸(钠盐的CAS ID：125455-62-1)
制备富含半乳糖硫酸的制剂的其它方法包括使用可将卡拉胶分解成半乳糖硫酸，任选地随后进行酸水解的酶。根据含有卡拉胶的原料单独或组合使用的这种酶的实例是纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、硫酸酯酶、脱水半乳糖脱氢酶、α-淀粉酶，卡拉胶酶、水解酶、硫酸化酶(参见Seaweed Hydrocolloid Production:An Update on Enzyme AssistedExtraction and Modification Technologies)。
实施例11：富含半乳糖硫酸的制剂也可以通过化学合成它们来获得
富含半乳糖硫酸的制剂也可以通过化学合成它们来获得，如Peat S等人,1960.(Sulfates of monosaccharides and their derivatives.Part 1.Preparation.J.Chem.Soc.4761-4766)或Turvey等人,1962(407.Sulphates of monosaccharides and derivatives.PartIV.Galactose 4-sulphate.Journal of the Chemical Society(Resumed),2119)所描述的。
通过以下步骤从甲基α-D-吡喃半乳糖苷开始进行半乳糖-4-O-硫酸的化学合成
a.将1.4g的甲基α-D-吡喃半乳糖苷溶解在无水吡啶(45mL)中并且将混合物冷却至-40℃。使用注射器向该预冷却的混合物中逐滴添加3.39ml的苯甲酰氯。在-40℃下进行反应2小时，之后将反应混合物在冰浴中放置过夜。将吡啶蒸发并将反应混合物溶解在氯仿(25-30ml)中。有机层用1)稀HCl，2)5％NaHCO3水溶液，最后用水洗涤。收集有机层，在无水MgSO4上干燥。蒸发有机层，通过用乙醇结晶获得产物(2,3,6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖苷甲酯)
b.将1g 2,3,6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖苷甲酯溶解在无水吡啶(12mL)中，并将混合物在室温下搅拌。向该混合物中加入960mg的Pyr.SO3，并将反应混合物在回流条件下在65℃保持3小时。将反应混合物冷却至室温，并去除残余的吡啶。将25ml二氯甲烷加入到混合物中，有机层用稀NaHCO3(5％w/w溶液)洗涤。收集有机层并在无水MgSO4上干燥。将滤液真空蒸发，得到浅黄色油状物，将其使用快速色谱法纯化，得到2,3,6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖苷-4-硫酸甲酯
c.将0.9g的2,3,6-三-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖苷-4-硫酸甲酯溶解在无水甲醇(30mL)中，并将混合物在室温下搅拌。向其中加入7.5ml NaOMe，并将反应在室温下搅拌过夜，监测反应。将反应混合物pH中和并蒸发以去除溶剂。粗产物(半乳糖-4-O-硫酸甲酯)在柱上用30％甲醇的DCM溶液、100％甲醇洗涤液纯化
d.在氮气氛下，将700mg半乳糖-4-O-硫酸甲酯加入到3ml无水二氯甲烷和840mg四氟硼酸三苯甲酯中。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并用过量的碳酸氢钠淬灭。用水洗涤有机相，然而，产物与NaHCO3一起移至水层。收集水层，并在真空下浓缩，加入甲醇以沉淀碳酸氢钠。在甲醇级分中沉淀出Gal-S，并将粗固体级分与乙酸混合。将混合物用100％甲醇溶剂流动相进行柱纯化，并收集含有Gal-S的级分并在真空下浓缩以获得干粉。
通过进行HPLC-MS(如实施例8所述)评价干粉的组成，并确认了半乳糖-4-O-硫酸的存在。
实施例12：组合物用于保护和医治动物免受疾病的作用
本公开的组合物还可以用于保护和医治动物免受各种疾病如细菌性和病毒性疾病。
本公开的组合物也可用于保护动物免受各种非生物胁迫如温度和盐度。
本公开的组合物还可以直接施用于水体，水生动物在其中生长(育苗期)以刺激防御途径。
任选地，可以将组合物饲喂给卤虫(虾的甲壳类饲料)，并且可以将富集的卤虫作为饲料饲喂给虾。
该组合物可以在水中稀释以形成均匀的溶液，然后在饲料中混合，然后饲喂给水生动物(鱼和虾)以刺激防御途径。该应用以预防方式应用，但也可在疾病发作后应用。
富含半乳糖硫酸的制剂也可转化成粉末制剂，并可与饲料以适当的稀释度混合，并饲喂给牲畜，鸟类和其它动物。
使用组合物的一个实施例如下所示：
A)实施例12A：将虾，凡纳滨对虾的后期幼体(PL11)以60只虾/sq.m的密度储存在四个塑料衬里的室外池塘中，每个塑料衬里的户外池塘为300sq.m。水的盐度为36-39ppt。水的pH在7.6-8.2的范围内。使用桨轮通风装置提供通风以保持足够的溶解氧水平。每天饲喂4次，培养进行约110天的时间段。在整个期间给对照池塘(2个重复)中的虾饲喂市售饮食。在培养的第二个月期间，用与Gal-S-L1以5g/kg饲料的有效剂量预混合的市售饮食饲喂处理过的池塘中的虾(2个重复)，持续交替的两周。对于培养期的其余部分，处理过的池塘接受与对照类似的市售饮食。所有池塘中的虾的最终平均体重为约20g。收获并称重虾，并从对照和处理池塘中估计存活的虾的数目。图6显示，与对照相比，包括Gal-S-L1预混合饲料的两周饮食的池塘的完全生长的虾的存活更高。在本实施例中，饲喂给虾的Gal-S-L1具有60mg/kg的Gal-S的有效剂量，这表明提高了虾的存活。
下面给出使用Gal-S组合物的另一个实施例：
B)实施例12B：Gal-S-L1处理提高了斑节对虾后期幼体(PL)虾的存活和对细菌感染的耐受性
将虾幼体培养物在孵化场的100L罐中建立，在每个罐中储存10000只幼体(无节幼体1或N1)。从N1到PL10阶段进行实验，并用卤虫藻(Artemia salina)饲喂虾。在处理罐中以每天0.003ml/L水的剂量施用Gal-S-L1，而对照罐没有接受任何Gal-S-L1。收集来自对照和处理罐的50只PL10虾，分成两个重复，每个重复具有25只PL。将对照和处理过的PL10用水中的哈氏弧菌(LB3)以1x10^6cfu/mL的剂量感染，并且在感染后每天记录存活百分比直至4天。图14显示当用Gal-S-L1处理虾时，在细菌性疾病存在下的存活仍然较高。在本实施例中，0.003ml/L的Gal-S-L1的施用剂量具有有效剂量的Gal-S，因为30mg Gal-S/公吨培养水显示出改善了虾后期幼体的存活。
实施例13-用含有较高百分比的Gal-S的组合物，在番茄作物上的分离的番茄叶测定显示出改善的功效，而总糖浓度相似
茄链格孢菌真菌孢子的制备：将茄链格孢菌在PDA板上培养，并使其在30℃生长约一周。使用无菌刷子去除完全生长的面菌丝体，并将生长在琼脂表面上的真菌垫切成小片，并置于含有蔗糖-琼脂孢子形成培养基的板上。将板在30℃在黑暗中进一步孵育3-4天，在此期间通过添加0.1％吐温20收集孢子，并在显微镜下计数孢子数目。
分离的番茄叶抗真菌测定：在该测定中，通过测量由于真菌接种在分离的番茄叶上引起的损伤/损害大小来比较Gal-S-L1和Gal-S-L12的抗真菌功效。简言之，首先用适当稀释的产物制剂(即2ml/L的Gal-S-L1制剂提供约140mg/ml的总糖浓度，其中Gal-S浓度为约28mg/L，并且1.5ml/L的Gal-S-L12提供约140mg/L的总糖浓度，其中Gal-S浓度为128mg/L的Gal-S)喷施约30-40日龄的番茄幼苗，而未处理的对照和健康的植物组仅用水处理。处理48小时后，将来自每株植物的4片叶(通常是从顶部起第2和3层)分离，并通过在1％次氯酸钠溶液中洗涤，然后通过70％乙醇并在无菌水中洗涤1分钟进行表面消毒。将所有叶的叶柄用湿棉塞覆盖并置于无菌滤纸上，所述滤纸保持在无菌陪替氏平板中。此外，通过在无菌叶片的中间点样含有茄链格孢菌孢子(通常浓度为10^4个孢子/mL)的5μL孢子悬浮液，随后在室温下在黑暗中孵育2周，来接种番茄叶。接种12天后，用WinFOLIATM软件扫描所有的叶以记录真菌损伤大小。结果(图7)表明，在用1.5ml/L的Gal-S-L12处理的叶中，真菌诱导的损害/损伤的大小比在用2ml/L的Gal-S-L1处理的叶中小。由于两种处理都具有相似的总糖浓度，但是用Gal-S-L12处理具有更高的Gal-S浓度，显然，Gal-S在活化植物保护作用中起重要作用，导致真菌损伤的大小减小。
实施例14:Gal-S和HMF的植物保护作用
该实验如实施例13中所述进行，但是测试的处理是纯的化学合成的Gal-S(80mg/L和8mg/L)和羟甲基糠醛(HMF)(80mg/L)以及市售的杀真菌剂23％嘧菌酯SC(1ml/L)。从图8可以注意到，80mg/L浓度的Gal-S和HMF均显示与未处理的对照组相比，真菌诱导的损害的大小显著减小。然而，8mg/L的Gal-S未显示真菌损伤大小的显著降低。该实验连同实施例13中给出的数据清楚地表明，在最终应用中仅含有高于8mg/L的阈值浓度的Gal-S的制剂可以赋予植物保护活性。这一发现是完全新颖的，并且以前没有报道过。类似地，HMF保护植物免受病原体攻击的性质也是新颖的，并且以前没有报道过。市售杀真菌剂嘧菌酯作为参照化合物包含在本实验中。
实施例15：显示Gal-S-L1和Gal-S-L12本身不含有任何直接对真菌病原体有活性的组分，并且它们的植物保护作用是通过对植物本身的间接作用
为了回答Gal-S-L1和Gal-S-L12本身是否可以具有任何导致其观察到的植物保护作用的抗真菌化合物的问题，设计了以下实验。在本实验中，将灭菌的马铃薯-右旋糖琼脂培养基分别与Gal-S-L1(4mL/L)、Gal-S-L12(1.5mL/L)和23％嘧菌酯SC(1.0mL/L)结合。将该培养基铺展在微生物板上进行固化。未处理的对照板仅含有马铃薯-右旋糖-琼脂培养基。在第-1天，将所有上述板用相等大小的茄链格孢菌真菌塞接种，并将板在24℃下进一步孵育一周。孵育一周后，通过测量各板上真菌斑块的直径记录真菌生长(参见图9，(A)和(B))。从这些图中的数据可以看出，包含Gal-S-L1的液体制剂或Gal-S-L12液体制剂对真菌生长没有任何抑制作用，而化学杀真菌剂嘧菌酯显著降低了真菌斑块的大小。本实施例清楚地表明，混合物Gal-S-L1和Gal-S-L12或通过推断，它们的组成组分如Gal-S、HMF和其它寡糖在作用上都不是直接杀真菌的。当与前两个实验(实施例13和实施例14)的结果结合在一起时，可以从该实验得出的进一步的结论提供了这样的原因，即相信这些混合物的植物保护作用是因为它们诱导植物内的天然防御系统，其进而可以避开或减轻植物病原体的攻击。
实施例16：田间试验数据，其显示在番茄和辣椒作物上预防性喷施Gal-S-L1和Gal-S-L12制剂后病毒性疾病发病率的降低
在这些试验中，番茄和辣椒植物按照常规农业实践在倾向于天然病毒性疾病发病率的区域中培养。Gal-S-L1和Gal-S-L12的液体制剂以预防性的方式进行叶喷施。将Gal-S-L1(含有总糖浓度20％的Gal-S)稀释至4mL/L水，而将Gal-S-L12(含有总糖浓度89％的Gal-S)稀释至1.5mL/L水，然后施用于植物上。对照组中的植物仅用水喷施。包括三次预防性喷施，间隔15天，从移植到实验田后两周开始。通过记录每组中有症状的植物相对于总植物的总数目来计算疾病发病率的百分比。从数据(图10)可以理解，未处理组显示出较高的疾病发病率百分比，而Gal-S-L1处理组或Gal-S-L12处理组中的植物显示出显著较低的病毒性疾病发病率。因此，含有Gal-S的组合物可用于在田间条件下控制病毒性疾病。还有趣的是注意到在Gal-S-L1和Gal-S-L12处理组中，在含有较高百分比的Gal-S(总糖浓度的89％)的Gal-S-L12处理组中，疾病发病率显著更低。
实施例17：用Gal-S-L1联合化学杀真菌剂进行预防性处理显著降低了番茄枯萎病的发病率
在本研究中，探讨了Gal-S-L1处理联合化学杀真菌剂嘧菌酯和烯酰吗啉对番茄枯萎病易感区的番茄作物的效果。番茄植物按照常规农业实践在田间生长。在移植20天后对番茄植物进行处理。以15天的间隔安排三次叶喷施。含有总糖浓度20％的Gal-S的Gal-S-L1以2ml/L使用，而23％嘧菌酯SC以1mL/L使用。对于联合试验，将Gal-S-L1和嘧菌酯分别以2mL/L和1mL/L在喷雾器罐中混合。通过记录每组中有症状的植物相对于总植物的总数目来计算疾病发病率的百分比。从数据(图11A)中非常明显的是，用嘧菌酯和Gal-S-L1的罐混合物组合处理的组中的植物显示出最小的疾病发病率。这可归因于嘧菌酯和Gal-S-L1的联合作用，其通过互补机制起作用以提供植物保护作用。类似地，用2克/升剂量的烯酰吗啉50％WP、2毫升/升剂量的Gal-S-L1或作为罐混合物的2克/升烯酰吗啉和2ml/L Gal-S-L1的组合处理番茄植物。同样，如图11B中的数据所示，烯酰吗啉和Gal-S-LI的组合比单独的烯酰吗啉表现得更好。在本上下文中，Gal-S-L1制剂可用作与各种化学杀真菌剂一起使用以增强其功效的合适添加剂。当化学杀真菌剂直接作用于植物病原体时，Gal-S-L1活化植物防御系统，向植物保护过程添加独特的附加作用模式，该模式不与对真菌病原体的直接作用相关。
由于含有Gal-S的制剂的独特作用模式，我们预期这些制剂联合其它植物保护剂如杀虫剂、微生物提取物、微生物(包括细菌、真菌、病毒、噬菌体)也将产生具有增强的植物保护特性的组合物。
实施例18：显示用含有Gal-S的制剂处理后拟南芥植物中植物防御途径上调的数据
拟南芥是一种可用于研究各种产物对植物作用机制的模式植物系统。在该基于qPCR的测定中，定量拟南芥免疫系统响应于Gal-S液体制剂喷施的某些防御标志物基因。引物对TCACCCTTATCTTCGCTGCTC(SEQ ID NO:3)和ATGTCCCACTTGGCTTCTCG(SEQ ID NO:4)用于监测PDF1.2基因，而引物对TGTGAACAGGCAGATGAACC(SEQ ID NO:5)和GCGATACCGATCTCGTCAA(SEQ ID NO:6)用于监测VSP2基因，并且AATGCTCAAGATAGCCCACAAG(SEQ ID NO:7)和AATAAGTCACCGCTACCCCAG(SEQ ID NO:8)引物用于测定PR1基因。在该测定中，在播种后使健康的拟南芥col-0植物在实验室生长室中生长15天。用含有总糖含量20％的Gal-S的液体制剂喷施这些植物中的一组，而对照(未处理的植物)仅用水喷施。处理后48小时，收集叶样品进行RNA和cDNA制备，用于qPCR反应。将图12中所示的数据相对于未处理组进行归一化。发现PR1、PDF1.2和VSP2基因显著上调。该数据提供了对Gal-S-L1制剂的作用机制的洞察，其中Gal-S-L1制剂可以通过植物防御基因的上调起作用。有趣的是，PDF1.2基因已被注释为与茉莉酸途径有关的抗真菌基因，而PR1基因已知与植物中的全身获得性抗性途径有关。据报道，VSP2基因具有抗昆虫活性。因此，该数据还证实了与本文提供的Gal-S制剂的制剂(例如抗病毒和抗真菌)功效的植物保护作用有关的实验观察结果。
实施例19-通过在饲料中包含Gal-S-L1来提高罗非鱼鱼苗在户外苗圃中的存活
将重量为0.1-0.2gm的罗非鱼鱼苗(Oreochromis niloticus(GIFT-GeneticallyModified Farmed Tilapia))在遮光网条件下以1个鱼苗/升的密度一式三份地储存到150升体积的户外水泥罐中。鱼苗饲喂具有34％蛋白质含量的漂浮饲料，饲喂水平为体重的10％，一天三次。在实验过程中没有提供人工通风。在3-4天内进行一次换水。处理后的罐接受用Gal-S-L1液体以1g/kg饲料的剂量预混合的饲料，而对照罐接受没有Gal-S-L1的饲料。实验进行28天，该阶段结束时鱼苗的存活示于图13中。观察到在饮食中包含Gal-S-L1后鱼苗的存活增加。在本实施例中，包含Gal-S-L1的预混合饲料具有10mg/kg饲料的有效剂量的Gal-S，这表明提高了鱼苗的存活。
实施例20-在单次剂量的Gal-S-L1之后，斑节对虾(后期幼体)中免疫系统基因和抗微生物肽的上调
在两个罐(对照和处理)中驯化斑节对虾的后期幼体(PL-20)48小时。每个罐的体积为35升。PL-20的储存密度为每罐1000个PL。每个罐的盐度保持在15ppt。以0.03ml/L的剂量将Gal-S-L1添加至处理罐，而对照罐不接受任何Gal-S-L1。
将六只虾(大约60mg)收集在1.5ml微离心管(MCT)中，与600μl TRI试剂混合，并保持在冰上。用组织浸渍器将虾组织完全匀浆。将样品储存在-80℃。在加入Gal-S-L1后从两个罐中收集不同时间间隔的虾样品，直到48小时。通过标准方案对这些进行RNA提取和纯化，并使用内部方案通过qPCR对对虾抗菌肽3、对虾抗菌肽5、超氧化物歧化酶、NF-kB、HSP70、溶菌酶、酚氧化酶原(Prophenloxidase)、抗菌肽1、抗菌肽4、抗菌肽5、EF-1α(管家基因)基因的基因上调进行定量。与对照相比，Gal-S-L1处理的虾中这些免疫相关基因和抗微生物肽基因的上调显示在图15中。从图中可以看出，与对照相比，Gal-S-L1处理中免疫相关基因和抗微生物肽基因被高度上调。
实施例21：通过在饲料中包含Gal-S-L1的粉末制剂来改善市售肉鸡的体液免疫
将总共420只(日龄)肉鸡(Vencobb-400)随机分进84个围栏中，每个围栏含有5只鸡(在3层的电池孵化器中)。在实验中，将16个重复围栏分配给每个处理。所有的鸡以相同的基础饮食分阶段提供。这里描述了两种处理(即对照和处理的)的结果。在处理中，将具有相当于Gal-S-L1的组成的粉末制剂以1g/kg家禽饲料的剂量包含在市售肉鸡的饮食中，而对照仅具有基础饮食。
鸡被翅膀标记，称重并在到达时用MD疫苗接种，并在合适的供料器和饮水器中随意提供饲料和水。在白炽灯泡的帮助下进行长达21天的育雏。在第5天和第28天用NDLasota疫苗接种鸡，在第10天和第16天用IBD疫苗接种鸡。饲喂实验进行5周。
对在第5周龄内收集的血清样品进行HI试验。通过稀释调节新城疫病毒(NDV)抗原(LaSota病毒储备液)的血细胞凝集滴度以含有4单位的血细胞凝集活性。血细胞凝集抑制滴度被确定为抑制鸡RBC的NDV凝集的血清样品的最高稀释度。与对照相比，在肉鸡饮食中包含Gal-S-L1的粉末制剂后HI滴度的增加显示在图16中，并且显示当包含在饮食中时，含有Gal-S的制剂显示出动物保护作用。
下表显示了用浓度为1.5g/kg饲料的Gal-S-L1的粉末制剂饲喂的鸡的死亡率的变化。
表2：饲喂Gal-S-L1的粉末制剂的肉鸡的死亡率
当以1.5g/kg饲料添加时，该制剂改善了死亡率，表明在肉鸡的情况下该制剂的动物保护作用。
实施例22：通过在饲料中包含Gal-S-L1的粉末制剂来改善市售肉鸡的抗氧化状态
如上述实施例21所述进行实验。谷胱甘肽还原酶将谷胱甘肽二硫化物(GSSG)还原为谷胱甘肽(GSH)。血清中GSH水平改善了抗氧化状态，并促进了对氧化胁迫的耐受性。血清谷胱甘肽还原酶活性的增加表明血清中的GSH水平可以更快地恢复，从而增加对氧化胁迫的耐受性。血清谷胱甘肽还原酶根据标准方案进行评估。图17显示了在包含Gal-S-L1的粉末制剂后，血清谷胱甘肽还原酶活性相比对照增加。在该测定中，一个单位的谷胱甘肽还原酶相当于可以每分钟氧化1微摩尔NADPH的酶。因此，含有Gal-S的制剂可以通过改善动物的抗氧化状态而具有动物保护作用。
实施例23：仅在高于Gal-S的阈值浓度时触发Gal-S制剂对拟南芥的防御途径的上调
定量拟南芥植物中响应于Gal-S-L1喷施(2ml/L)和Gal-S喷施(8mg/L)的防御基因标志物，例如PDF 1.2和VSP2。当以2ml/L施用于植物上时，Gal-S-L1制剂将导致与植物接触的28mg/L的Gal-S浓度。按照实施例18中所述的方案进行实验。图18中给出的数据清楚地表明，与Gal-S-L1制剂相比，Gal-S 8mg/L处理中免疫基因PDF1.2和VSP2的相对表达显著降低。该发现以及实验14中给出的数据清楚地表明，含有Gal-S的制剂的植物保护作用在最终应用中仅在8mg/L的阈值浓度以上被触发。
本公开的优点：
本公开涉及包含至少一种硫酸化半乳糖的组合物。本公开提出了预料不到且令人惊讶的发现，其与已经公开的文献相反，描述了富含单糖半乳糖硫酸的组合物，所述半乳糖硫酸赋予了刺激生物体内的保护系统如免疫反应途径的特性，这提供了对各种植物和动物病原体以及非生物胁迫的显著保护。
另外，本公开提供了令人惊讶的发现，即通过添加微量元素如某些金属离子，显著增强了刺激植物和动物免疫系统的上述保护和医治活性。
此外，半乳糖硫酸与金属离子和/或与天然植物防御活化剂如水杨酸和/或氨基酸如β-氨基丁酸的组合也并且有时进一步改善防御反应，这远远大于任何前述物质单独实现的防御反应。
此外，含有半乳糖硫酸的组合物与抗真菌剂的组合也增强了这种组合提供植物保护效果的有效性。
Claims (28)
1.组合物，其包含：
a)至少一种分子量小于400道尔顿的硫酸化半乳糖；
b)选自κ卡拉胶二糖、κ卡拉胶三糖、κ卡拉胶四糖、ι-卡拉胶二糖、ι-卡拉胶三糖、ι-卡拉胶四糖、λ卡拉胶二糖、λ卡拉胶三糖、λ卡拉胶四糖、戊糖及其盐的至少一种糖；和
c)添加剂，其选自β-氨基丁酸、硼和锌的组合、或者氯化钙和水杨酸的组合。
2.如权利要求1所述的组合物，其还包含选自5-羟甲基糠醛(HMF)、乙酰丙酸、甲酸及其组合的至少一种糖衍生物。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的总糖含量在25-150g/l范围内。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖相对于总糖含量的重量百分比在15-90％的范围内。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的总糖含量以干形式在100-600g/kg的范围内。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含选自溶剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂、动物饲料及其组合的至少一种物质。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖具有所述组合物的总固体含量的5-90％范围内的重量百分比。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖的重量比在1:5至50:1的范围内。
9.如权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种硫酸化半乳糖与所述至少一种糖衍生物的重量比在9:1至2:1的范围内。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物通过加工卡拉胶或加工的麒麟菜(Eucheuma)或半精制卡拉胶获得。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物通过加工含有卡拉胶的红藻获得。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为植物提供对抗生物胁迫的保护。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物为动物提供对抗生物和非生物胁迫的保护。
14.制备权利要求1所述的组合物的方法，所述方法包括：
a)使具有多糖的混合物的选自红藻和卡拉胶的物质与水接触以获得总固体含量在5-20％范围内的浆料；
b)通过在pH值为1.0-4.0范围，温度为50-180℃范围，且压力为0.5-10个大气压范围下水解10分钟-5小时范围内的时间，使所述浆料解聚，得到水解产物；
c)浓缩所述水解产物以获得具有18-35范围内的白利糖度值的糖浓度，从而获得液体形式的所述组合物，或任选地干燥所述水解产物以获得粉末形式的所述组合物；以及
d)向步骤c)获得的组合物添加添加剂，其选自β-氨基丁酸、硼和锌的组合、或者氯化钙和水杨酸的组合。
15.用于处理植物的方法，所述方法包括：
a)获得权利要求1-13中任一项所述的组合物；和
b)使所述组合物与植物或植物的一部分接触，以处理所述植物。
16.如权利要求15所述的方法，其中接触组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于所述组合物具有至少10mg/L的浓度。
17.如权利要求15所述的方法，其中通过选自叶施用、土壤施用、种子处理、注射到植物组织上及其组合的方法使所述组合物与所述植物接触。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述方法包括通过叶施用使所述组合物与所述植物接触，所述叶施用包括以50-1000ml/英亩作物的比率接触所述组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述叶施用在植物的营养状态下进行，并且所述施用在移植后10-15天进行，随后的施用以10-15天的间隔进行，直到开花和结果开始。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述接触与至少一种渗透剂组合，所述渗透剂选自聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、月桂基二甲基氧化胺、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇、辛苯聚醇、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide)、聚乙二醇10十二烷基醚、Brij 721、胆汁盐、聚乙二醇蓖麻油、壬基酚乙氧基化物、环糊精、卵磷脂、甲基苄索氯铵及其组合。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述接触与至少一种生物增强剂组合，所述生物增强剂选自海藻提取物、蛋白质水解产物、腐植酸、黄腐酸、微生物提取物和生物肥料。
22.如权利要求15所述的方法，其中所述接触与至少一种植物保护剂组合，所述植物保护剂选自杀真菌剂、杀虫剂、微生物提取物、微生物，所述微生物包括细菌、真菌、病毒和噬菌体。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述接触与至少一种渗透剂组合，所述渗透剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂及其组合。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述接触与至少一种渗透剂组合，所述渗透剂选自离子表面活性剂、非离子表面活性剂及其组合。
25.如权利要求1所述的组合物，其用作植物防御途径活化剂。
26.如权利要求1所述的组合物，用于保护植物免受感染和生物胁迫。
27.如权利要求25或26中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种硫酸化半乳糖，所述硫酸化半乳糖相对于与所述植物或所述植物的一部分接触的所述组合物具有至少10mg/L的浓度。
28.权利要求1-13中任一项所述的组合物在制备用于处理动物的药剂中的用途。
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