CN102138640B - 苝醌化合物在制备防治禽类病毒饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
苝醌化合物在制备防治禽类病毒饲料中的应用，属于生物工程及农业技术领域。本发明涉及采用苝醌化合物添加到禽类饲料中制备用于防治禽类病毒饲料，如马立克氏病病毒、禽J亚群白血病病毒、鸡传染性贫血病病毒、禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、鹅细小病毒，鸭瘟病毒和禽流感病毒等。苝醌化合物包括：竹红菌素、痂囊腔菌素、弗来菌素、枝孢素、卡弗他丁、尾孢素等，苝醌化合物具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。制备预防禽类病毒饲料中的剂量为每天1-50μmol苝醌化合物/kg体重，制备治疗禽类病毒饲料中的剂量为50μmol-200μmol苝醌化合物/kg体重，防治禽类病毒的效果非常显著，同时苝醌化合物可通过现代生物技术生产得到，可产生良好的经济和社会效益。
Description
技术领域
苝醌化合物在禽类饲料中的应用，属于生物工程及农业技术领域。本发明涉及采用苝醌化合物添加到禽类饲料中用于防治禽类病毒。
背景技术
近年来，传染病的发生与流行已成为阻碍我国畜业快速发展的重要因素。尤其是病毒性疾病，多种病毒感染都可能引起禽类的免疫抑制。如马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)、禽网状内皮增生病病毒(Reticuloendotheliosisvirus，REV)、禽J亚群白血病病毒(Avian Leukosis virus subgroup J，ALV-J)、鸡传染性贫血病病毒(Chicken infectious anemia virus，CAV)、禽呼肠孤病毒(AvianReovirus virus，ARV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)，鸭瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV)和禽流感H5N1病毒等。禽类一旦感染，如扑救不及时，就有全军覆没的危险。
目前国内外应用于禽类病毒病的化学药物主要是金刚烷胺和利巴韦林等制剂，其药物疗效并不确切，而且存在如残留、影响蛋禽产蛋率恢复等毒副作用。同时，许多病毒血清型复杂，病毒变异快，很难用疫苗控制，无法避免损失。
专利CN200610013713.7，CN200810054140.1，CN200810052188.9，CN200710053839.1公开中草药作为饲料添加剂用于防治禽类病毒病的方法，但存在治疗效果较慢较差，同时成本过高的问题。
专利CN200610072935.6公开了金丝桃素在防治禽类病毒中的应用。金丝桃素是从中草药贯叶连翘中提取得到的一种菲并醌类(Phenanthroperylenequinone)化合物，其表现出了广谱的良好的病毒杀灭效果。然而金丝桃素化学性质不稳定，见光易分解，在实际应用中有相当一部分金丝桃素无法被有效利用。
我们研究发现苝醌(Perylenequinone)类化合物具有较好的广谱抗病毒的效果。苝醌化合物与金丝桃素相比，具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。因此本发明公开了一种苝醌化合物应用于禽类饲料的方法，从而有效地进行禽类病毒的防治。
发明内容
本发明的目的是将苝醌化合物应用于禽类饲料中用于预防和治疗禽类病毒感染病。
本发明涉及到的相关特征如下：
1.苝醌化合物说明
本发明所指苝醌化合物为如下所示的三种母核为基本结构，并以此三种母核结构进行基团修饰的化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修饰上各种化学基团，如CH3，OCH3，COCH3，CH(OH)CH3，CHO，OH，H等，这些化学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。
苝醌化合物母核
特别的如竹红菌素(竹红菌甲素Hypocrellin A、竹红菌乙素Hypocrellin B)、痂囊腔菌素(痂囊腔菌甲素Elsinochrome A、痂囊腔菌乙素Elsinochrome B、痂囊腔菌丙素Elsinochrome C、痂囊腔菌丁素Elsinochrome D)、弗来菌素(Phleichrome)、枝孢素(枝孢甲素Cladosporium A、枝孢乙素Cladosporium B、枝孢丙素Cladosporium C、枝孢丁素Cladosporium D)、卡弗他丁(Calphostin A、Calphostin B、Calphostin C、Calphostin D)、hypomycin A和hypomycin B、尾孢素(Cercosporin)、Scutiaquinone A和Scutiaquinone B等。它们的化学结构参见如下相关文献：
[1]Iida，T.，E.Kobayashi，M.Yoshida，and H.Sano(1989)Calphostins，novel and specific inhibitors of protein kinase C.II.Chemical structures.J.Antibiot.42：1475-1481.
[2]Lousberg，R.J.，C.A.Salemink，U.Weiss，and Batterha.Tj(1969)Pigmentsof Elsinoe species.Part II.Structure of elsinochromes A，B，and C.Journal of theChemical Society C-Organic.1219-1227.
[3]Lousberg，R.J.，C.A.Salemink，and U.Weiss(1970)Pigments ofElsinoespecies.Part V.The structure of elsinochrome D.Journal ofthe Chem ical SocietyC-Organic.2159-2162.
[4]Diwu，Z.J.，and J.W.Lown(1990)Hypocrellins and their use inphotosensitization.Photochem.Photobiol.52：609-616.
[5]Liu，W.Z.，Y.X.Shen，X.F.Liu，Y.T.Chen，and J.L.Xie(2001)A newperylenequinone from Hypomyces sp.Chmese Chemical Letters.12：431-432.
[6]Yoshihara，T.，T.Shimanuki，T.Araki，and S.Sakamura(1975) Phleichrome，a new phytotoxic compound produced by Cladosporium phlei.Agric.Biol.Chem.39：1683-1684.
[7]Ayers，S.，D.L.Zink，K.Mohn，J.S.Powell，C.M.Brown，T.Murphy，R.Brand，S.Pretorius，D.Stevenson，D.Thompson，and S.B.Singh(2007)Scutiaquinones A and B，perylenequinones from the roots of Scutia myrtina withanthelmintic activity.Journal of Natural Products.70：425-427.
[8]Lousberg，R.J.，U.Weiss，C.A.Salemink，A.Arnone，L.Merlini，andG.Nasini(1971)The structure of cercosporin，a naturally occurring quinone.Journalof the Chemical Society D-Chemical Communications.1463-&.
[9]Arnone，A.，G.Assante，V.Dimodugno，L.Merlini，and G.Nasini(1988)Perylenequinones from cucumber seedlings infected with Cladosporiumcucumerinum.Phytochemistry.27：1675-1678.
2、苝醌化合物的来源
竹红菌素来源有：(1)天然的长于竹子上的竹黄菌(Shiraia bambusicola)子实体和竹红菌(Hypocrella bambusae)子实体；(2)根据专利CN200710132510.4和CN 200910182255.3所述的方法采用竹黄菌进行液态发酵或固态发酵得到。竹黄菌株可为：Shiraia sp.SUPER-H168保藏号为CCTCC NO：M 207104或其它可从菌种保藏机构购买到的Shiraia bambusicola菌株。
痂囊腔菌素可用Elsinoe fawcettii ATCC 38162或其它可从菌种保藏机构购买到的Elsinoe fawcettii菌株通过固态发酵或液发酵方法制得。
枝孢素可用Cladosporium cucumerinum.ATCC 11279或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium cucumerinum菌株通过固态发酵或液发酵方法制得。
卡弗他丁可用Cladosporium cladosporioides CGMCC 34593或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium cladosporioides菌株通过固态发酵或液发酵方法制得。
尾孢素可用Cercospora kikuchii ATCC 42152或其它可从菌种保藏机构购买到的Cercospora kikuchiis菌株通过固态发酵或液发酵方法制得。
弗来菌素可用Cladosporium phlei ATCC 36193或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium phlei菌株通过固态发酵或液发酵方法制得。
Scutiaquinone可从对刺藤属植物Scutia myrtina的根部采用乙醇提取得到。
以上所有菌种的固态发酵条件均可为：采用粮食为主要原料，并将其粉碎至50-80目，另添加以主要原料计的0.5％-2％葡萄糖、0.1％-0.5％KH2PO4、0.01％-0.08％MgSO47H2O。加水拌料湿，料水比控制在1∶1-1∶0.7，121℃灭菌45-60min，冷却后接入5％-10％液体种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度24-32℃，发酵过程控制湿度80％-90％，5-15天发酵结束。粮食原料可为：大米、小米、玉米、小麦、荞麦、高粱、黑米、豆粕、大豆或赤豆。
以上所有菌种的液态发酵条件均可为：碳源5-50g/L，氮源5-50g/L，土豆 100-200g/L，磷酸氢二铵1-2g/L，磷酸二氢钾1-2g/L，硫酸镁0.1-0.8g/L；121℃灭菌20min，灭菌冷却后接入菌种，接种量为5％-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为24-32℃，发酵周期为2-5天；碳源可为葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶性淀粉。氮源可为无机铵盐(如NH4Cl)、无机硝酸盐(如NaNO3、NH4NO3)、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆或豆饼粉。
3、苝醌化合物在饲料中的添加方法
鸡、鸭、鹅等禽类预防病毒的剂量为每天1-50μmol苝醌化合物/kg体重，将苝醌化合物拌入饲料中饲喂，禽从出生起的生长过程中始终添加。
对于感染病毒的禽类的治疗剂量为每天50μmol-200μmol苝醌化合物/kg体重，疗程为2至4天
(1)对于天然竹黄菌或竹红菌子实体来源的苝醌化合物：根据禽的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的竹黄菌或竹红菌子实体粉碎至40-60目，然后均匀混入禽类的日常饲料。
(2)对于固态发酵得到的苝醌化合物：待发酵结束后50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据禽类的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入禽类的日常饲料。
(3)对于液态发酵得到的苝醌化合物：待发酵结束后，离心去除液体得到菌丝体等固形物，50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据禽类的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入禽类的日常饲料。
(4)对于植物Scutia myrtina：Scutiaquinone主要存在于根部，根据禽类的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的Scutia myrtina根，首先用乙醇将Scutiaquinone从根部萃取出来(乙醇∶根＝1∶0.5-1∶3，重量比)，过滤去除根茎，50-60℃真空浓缩去除酒精并烘干，再将其粉碎至40-60目，然后根据需求量均匀混入禽类的日常饲料。
(5)这些苝醌化合物可以通过制备色谱纯化为单体，混入禽类的日常饲料中。制备纯化的条件如先前发表的文献所述。Xiao-Hui Lianga，Yu-Jie Cai，Xiang-Ru Liao，Kang Wu，Lei Wang，Da-Bing Zhang and Qiang Meng(2009).Isolation and identification of a new hypocrellin A-producing strain Shiraia spSUPER-H168.Microbiological Research 164(1)：9-17.
(6)不同来源的苝醌化合物可以根据实际情况按任意比例混合使用。
本发明的有益效果：本发明涉及采用苝醌化合物添加到禽类饲料中制备用于防治禽类病毒饲料，如马立克氏病病毒、禽J亚群白血病病毒、鸡传染性贫血病病毒、禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、鹅细小病毒，鸭瘟病毒和禽流感病毒等。苝醌化合物包括：竹红菌素、痂囊腔菌素、弗来菌素、枝孢素、卡弗他丁、尾孢素等，苝醌化合物具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。制备预防禽类病毒饲料中的剂量为每天1-50μmol苝醌化合物/kg体重，制备治疗禽类病毒饲料中的剂量为50μmol-100μmol苝醌化合物/kg体重，防治禽类病毒的效果非常显著，同时苝醌 化合物可通过现代生物技术生产得到，可产生良好的经济和社会效益。
具体实施方式
实施例1：苝醌化合物体外抗病毒实验
(1)体外抗毒实验用鸡胚长成的胚成纤维细胞的准备
取11日龄左右的鸡胚，置于卵架上，气室朝上，碘酒消毒5min，用酒精脱碘后除去气室部蛋壳；用无菌弯头小镊子取出鸡胚置于无菌平皿中，去头、爪、内脏；将鸡胚转移到无菌小烧杯中，用Hank’s液洗涤3次，用无菌小剪刀将其剪成约0.5-1mm3小块；用Hank’s液洗涤3次，加入适量的0.25％胰酶，置37℃水浴中消化10min左右；加入生长液或血清中止反应，用吸管轻轻吹打，加生长液重悬；细胞计数，按400万～500万个/瓶分装细胞瓶。37℃，5％CO2培养箱，定时观察，直至细胞长成单层，进行体外抗病毒实验。
(2)体外抗毒实验用病毒半数组织培养感染剂量(Tissue culture infectivedose，TCID50)的测定
细胞长成单层后，接种10-2-10-1稀释度的病毒液(0.1mL/孔)，每个稀释度接种8孔，于5％CO2培养箱中37℃培养120h，每天观察细胞病变(CEP)情况，根据Reed-Muench公式计算病毒的TCID50(Reed，L.J.；Muench，H.(1938).A simplemethod of estimating fifty percent endpoints.The American Journal of Hygiene 27：493-497.)。实验中所用病毒为：新城疫病毒(NDV)、马立克氏病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)、禽流感H5N1病毒和鹅细小病毒(GPV)。
(3)MTT染色法计算细胞存活率
MTT法(四甲基偶氮唑盐比色法)进行细胞染色(终浓度0.5g/L)检测细胞存活和生长.用酶标仪测定490nm处的吸光度值(OD)，按下列公式计算细胞成活率：细胞存活率(％)＝[加苝醌组OD/正常细胞组OD]×100％，
(4)苝醌化合物对细胞的毒性试验。
用DMSO将Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium B、Elsinochrome A、Scutiaquinone B、Cercosporin和Phleichrome分别配置成0.01、0.1、0.2、0.4mmol/ml，分别加入到长成的胚成纤维细胞中，并以不含加苝醌化合物的胚成纤维细胞作对照，每一个测试3瓶，在37℃，5％CO2培养箱培养120小时，这些培养在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，测定细胞存活率。
实验结果发现，所有测试细胞的存活率均在99.7％左右，因此在上述浓度下苝醌化合物对细胞无明显细胞毒作用
(5)苝醌化合物对病毒的直接灭活作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium B、Elsinochrome A、Scutiaquinone B、Cercosporin和Phleichrome对病毒的直接灭活作用。100TCID50病毒液中加入苝醌化合物(溶解在DMSO[Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜]中)，使苝醌化合物在病毒液中浓度的分别达到0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L，在37℃，5％CO2培养箱中培养1h后，感染上述培养好的对应细胞。倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％、细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。这些实验分别在暗室(无光照)和有光 照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的光剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。
不加苝醌化合物的病毒对照组的细胞存活率为7.9％。加苝醌化合物的细胞存活率如表1所示。
表1：细胞存活率(％)
(6)苝醌化合物对病毒侵入细胞的阻断作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium B、 Elsinochrome A、Scutiaquinone B、Cercosporin和Phleichrome对病毒侵入细胞的阻断作用。取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，将苝醌化合物以0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L浓度(溶解在DMSO中)，分别加到细胞培养板上，0.1mL/孔，每个尝试度重复3孔。37℃作用4h，弃去液体，每孔加入100TCID50病毒液0.1mL，另设细胞对照和病毒对照。5％CO2，培养箱37℃培养120h。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的光剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，用倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％、细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析，并计算出细胞存率。
不加苝醌化合物的病毒对照组的细胞存活率为8.9％。加苝醌化合物的细胞存活率如表2所示。
表2：细胞存活率(％)
(7)苝醌化合物对病毒增殖的抑制作用。
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium B、Elsinochrome A、Scutiaquinone B、Cercosporin和Phleichrome对病毒增殖的抑制作用。取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100TCID50的病毒液，100μL/孔，置37℃，5％CO2培养箱中吸附4h。弃去病毒液，分别加入不同浓度为0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L的苝醌化合物(溶解在DMSO中)，0.1mL/孔，每个浓度重复3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。5％CO2培养箱37℃培养。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。
不加苝醌化合物的病毒对照组的细胞存活率为8.5％。加苝醌化合物的细胞存活率如表3所示。
表3：细胞存活率(％)
(8)结论
由以上实验可以知道，苝醌化合物对于测试用禽类病毒均有杀灭作，是广谱的抗病毒化合物。其中Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B和Elsinochrome A的效果最好，其它苝醌化合物稍弱。另外在光照条件下，抗病毒效果也优于无光的条件，这主要是由于苝醌化合物在光照下会产生超氧离子等产物，其光敏氧化产物可以增强抗病毒能力。
实施例2：固态发酵竹红菌素添加于鸡饲料中的抗H5N1病毒实验
实验中鸡的基础日粮配方为：玉米60％，小米5％，高粱4.2％，麦麸5％，豆饼8％，鱼粉8％，肉骨粉3％，血粉5％，石粉1.5％，食盐0.3％。基础日粮料型为粉料，均为1.8mm筛片粉碎。
采用固态发酵法生产竹红菌素，玉米为主要原料，另添加以玉米重量计的2％葡萄糖、0.2％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O。加水拌料湿，料水比控制在1∶0.7，121℃灭菌45-60min，冷却后接10％液体竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵过程控制湿度90％，发酵10天结束。60℃烘干去除水份，测定其中竹红菌甲素占8.4％，竹红菌乙素占1.3％。其它苝醌化合物总量占0.4％。
挑选80只体况基本一致的1日龄肉鸡(平均体重为36g)，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组20个重复，每个重复1只肉鸡。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物0.03mg，这样使鸡的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组3：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物0.75mg，这样使鸡的每日摄入量约为25μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组4：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮 中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物1.5mg，这样使鸡的每日摄入量约为50μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有鸡连续吃添加了含有竹红菌素的饲料5天后，用0.01mL的1×106TCID50/mL H5N1病毒培养液对所有组的所有鸡进行肌肉注射攻毒，然后观察10天。观察结果如下：
试验组1：2天左右有12只鸡死。其它鸡绿色稀便在第5天所有鸡死亡
试验组2：2天左右有5只鸡精神不振，拉绿色稀便，但观察10天未死亡。其它鸡体症正常。
试验组3：所有鸡体症正常，没有死亡
试验组4：所有鸡体症正常，没有死亡
由此实验看出竹红菌素对于肉鸡起到了非常好的保护作用。
实施例3液态发酵竹红菌素添加于鸡饲料中的抗NDV病毒实验
实验基础日粮与实施例2相同。
采用液态发酵法生产竹红菌素，每升培养基组成为：葡萄糖20g，蛋白胨50g，土豆200g，(NH4)2HPO42g，KH2PO42g，MgSO40.5g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体竹黄菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵72h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中竹红菌甲素占8.1％，竹红菌乙素占1.3％，其它苝醌化合物总量占0.2％。
挑选80只体况基本一致的1日龄肉鸡(平均体重为36g)，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组20个重复，每个重复1只肉鸡。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素液态发酵物0.02mg，这样使鸡的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组3：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素液态发酵物0.49mg，这样使鸡的每日摄入量约为25μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组4：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素液态发酵物0.98mg，这样使鸡的每日摄入量约为50μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有鸡连续吃添加了含有竹红菌素的饲料15天后，用0.01mL的1×106TCID50/mL NDV病毒培养液对所有组的所有鸡进行肌肉注射攻毒，然后观察10天。观察结果如下：
试验组1：所有鸡1天后出现羽毛凌乱，精神沉郁症状。第3天出现呼吸困难和站立不稳症状。5天左右所有鸡死亡。
试验组2：所有鸡体症正常，没有死亡。
试验组3：所有鸡体症正常，没有死亡。
试验组4：所有鸡体症正常，没有死亡。
由此实验看出竹红菌素对于肉鸡起到了非常好的保护作用。
实施例4液态发酵卡弗他丁添加于饲料中的抗MDV病毒实验
实验基础日粮与实施例2相同。
采用液态发酵法生产卡弗他丁，每升培养基组成为：葡萄糖5g，酵母膏5g，土豆100g，(NH4)2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.1g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体Cladosporium cladosporioides CGMCC 34593菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度28℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，其中Calphostin A占0.029％，Calphostin B占0.025％，Calphostin C占0.85％，Calphostin D占0.02％，Calphostin I占0.01％。
挑选80只体况基本一致的1日龄肉鸡(平均体重为36g)，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组20个重复，每个重复1只肉鸡。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的卡弗他丁液态发酵物0.03mg，这样使鸡的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组3：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的卡弗他丁液态发酵物0.68mg，这样使鸡的每日摄入量约为25μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组4：1日龄的肉鸡的一天食量大约是6g，根据其体重在其6g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的卡弗他丁液态发酵物1.35mg，这样使鸡的每日摄入量约为50μmol/kg。以后逐日根据肉鸡的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有鸡连续吃添加了含有卡弗他丁的饲料30天后，用0.1mL的1×106TCID50/mL MDV病毒培养液对所有组的所有鸡进行肌肉注射攻毒，然 后观察30天。观察结果如下：
试验组1：所鸡在攻毒2天后出现精神不振，生长速度减慢的症状，攻毒第10天后有8只鸡死亡，攻毒第15天又有7只鸡死亡，攻毒第20天所有鸡均死亡。
试验组2：所有鸡体症正常，没有死亡。
试验组3：所有鸡体症正常，没有死亡。
试验组4：所有鸡体症正常，没有死亡。
由此实验看出卡弗他丁对于鸡起到了非常好的保护作用。
实施例5液态发酵痂囊腔菌素治疗DPV感染。
基础日粮为：玉米60％，小麦10.84％，大豆粕22.5％，植物油1.67％，鱼粉2％，石粉0.4％，磷酸氢钙1.26％，赖氨酸0.1％，蛋白酸0.1％，食盐0.12％，预混料1％(可为每千克日粮提供：维生素A 5000IU.维生素D 800IU，维生素E 20IU，维生素K 2mg，维生素B511mg，维生素B62.5mg，维生素B24.0mg，维生素H 0.2mg，维生素M 0.6mg，维生素B12mg，Cu2+8mg，Fe3+80mg，Mn2+50mg，Zn2+60mg)
采用液态发酵法生产痂囊腔菌素，每升培养基组成为：葡萄糖25g，牛肉膏25g，土豆100g，(NH4)2HPO41.5g，KH2PO41.5g，MgSO40.8g/L，121℃灭菌20min，冷却后接5％液体Elsinoe fawcettii ATCC 38162菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度24℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中Elsinochrome A占0.012％，Elsinochrome B占0.021％，Elsinochrome C占0.034％，Elsinochrome D占0.05％。用1倍重量的酒精将痂囊腔菌素从烘干菌丝体中提出来，并60℃烘干，粉碎至60目，痂囊腔菌素含量为20.3％。
挑选80只体况基本一致的50日龄樱桃谷鸭(平均体重为3.5Kg)，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组20个重复，每个重复1只樱桃谷鸭。饲喂方式为自由采食及饮水。
用0.1mL的1×106TCID50/ml DPV病毒培养液对所有组的所有樱桃谷鸭注射攻毒，约1天左右，所有樱桃谷鸭出现精神萎靡，食欲减退，口渴喜饮水，两脚发软，羽毛松乱，翅膀下垂，行动迟缓症状。然后采用痂囊腔菌素进行治疗。由于樱桃谷鸭感染后食欲变差，因此将竹红菌素与少量基础日粮混合后，当樱桃谷鸭饥饿时首先喂食添加痂囊腔菌素的饲料，若无进食能力则直接灌服痂囊腔菌素发酵物。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：将干燥后的酒精提取物0.5g与10g基础日粮均匀混合，一次性灌服。这样使樱桃谷鸭的每日摄入量约为50μmol/kg。连续吃含有痂囊腔菌素的饲料4天。
试验组3：将干燥后的酒精提取物1.4g与10g基础日粮均匀混合，一次性灌服。 这样使樱桃谷鸭的每日摄入量约为150μmol/kg。连续吃含有痂囊腔菌素的饲料4天。
试验组4：将干燥后的酒精提取物1.9g与10g基础日粮均匀混合，这样使樱桃谷鸭的每日摄入量约为200μmol/kg。连续吃含有痂囊腔菌素的饲料4天。
观察每只樱桃谷鸭临床症状，记录死亡数，观察10天。观察结果如下：
试验组1：第3天死亡8只，第4天所有鸭死亡。
试验组2：8只樱桃谷鸭于治疗2天后，体症逐渐恢复正常，第3天又有8只樱桃谷鸭恢复正常，第4天所有樱桃谷鸭恢复正常，观察10天健活。
试验组3：所有樱桃谷鸭于治疗2天后，体症逐渐恢复正常，观察10天健活。
试验组4：所有樱桃谷鸭于治疗2天后，体症逐渐恢复正常，观察10天健活。
由此实验看出痂囊腔菌素对于樱桃谷鸭感染病毒有非常好的治疗作用。
实施例6：Scutiaquinone治疗GPV感染
基础日粮为：秕谷50％，谷壳20％，米糠15％，碎米15％
取一定量的Scutia myrtina树根，首先用乙醇将Scutiaquinone从根部萃取出来(乙醇∶根＝1∶0.5，重量比)，过滤去除根茎，60℃真空浓缩去除酒精并烘干，粉碎至60目。测定其中Scutiaquinone A约为2.7％，Scutiaquinone约为2.5％。
挑选80只体况基本一致的15日龄太湖鹅(平均体重为0.5Kg)，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组20个重复，每个重复1只太湖鹅。饲喂方式为自由采食及饮水。
用0.1mL的1×106TCID50/ml GPV病毒培养液对所有组的所有太湖鹅注射攻毒，约1天左右，所有太湖鹅出现全身委顿、食欲减退、排灰白色或青绿色稀粪症状。然后采用Scutiaquinone进行治疗。由于太湖鹅感染后食欲变差，因此将Scutiaquinone与少量基础日粮混合后，当太湖鹅饥饿时首先喂食添加Scutiaquinone的饲料，若无进食能力则直接灌服Scutiaquinone发酵物。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：将干燥后的液态发酵物2.5g与10g基础日粮均匀混合，一次性灌服。这样使太湖鹅的每日摄入量约为50μmol/kg。连续吃含有Scutiaquinone的饲料3天。
试验组3：将干燥后的液态发酵物4.9g与10g基础日粮均匀混合，一次性灌服。这样使太湖鹅的每日摄入量约为100μmol/kg。连续吃含有Scutiaquinone的饲料3天。
试验组4：将干燥后的液态发酵物9.8g与10g基础日粮均匀混合，这样使太湖鹅的每日摄入量约为200μmol/kg。连续吃含有Scutiaquinone的饲料3天。
观察每只太湖鹅临床症状，记录死亡数，观察10天。观察结果如下：
试验组1：第3天死亡15只，第5天所有太湖鹅死亡。
试验组2：10只太湖鹅于治疗2天后，体症逐渐恢复正常，第3天又有7只太湖鹅恢复正常，第4天所有太湖鹅恢复正常，观察10天健活。
试验组3：所有太湖鹅于治疗2天后，体症逐渐恢复正常，观察10天健活。
试验组4：所有太湖鹅于治疗2天后，体症逐渐恢复正常，观察10天健活。
由此实验看出Scutiaquinone对于太湖鹅感染病毒有非常好的治疗作用。
上述实施例1-6只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明实质内容所作的等效变化变或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.苝醌化合物在制备防治禽类病毒饲料中的应用，其特征在于所述的苝醌化合物选用：竹红菌甲素Hypocrellin A、竹红菌乙素Hypocrellin B、枝孢乙素Cladosporium B、痂囊腔菌甲素Elsinochrome A、Scutiaquinone B、尾孢素Cercosporin、弗来菌素Phleichrome之一种；
所述防治的禽类病毒为H5N1、MDV、DPV、GPV；
在禽类饲料中添加苝醌化合物用于制备防禽类病毒的饲料，添加量为每天1-50μmol苝醌化合物/kg体重，生长期内用的禽类饲料中始终添加；
在禽类饲料中添加苝醌化合物用于制备治禽类病毒的饲料，添加量为每天50-200μmol苝醌化合物/kg体重，该治禽类病毒的饲料对感染禽类病毒的禽类用的时间为2-4天。
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