CN102106464B - 苝醌化合物在制备防治猪病毒饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
苝醌化合物在制备防治猪病毒饲料中的应用，属于生物工程及农业技术领域。本发明涉及采用苝醌化合物添加到猪饲料中制备用于防治猪病毒饲料，如繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒等。苝醌化合物包括：竹红菌素、痂囊腔菌素、弗来菌素、枝孢素、卡弗他丁、尾孢素等，苝醌化合物具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。制备预防猪病毒饲料中的剂量为每天1-10μmol苝醌化合物/kg体重，制备治疗猪病毒饲料中的剂量为10μmol-100μmol苝醌化合物/kg体重，防治猪病毒的效果非常显著，同时苝醌化合物可通过现代生物技术生产得到，可产生良好的经济和社会效益。
Description
技术领域
苝醌化合物在猪用饲料中的应用，属于生物工程及农业技术领域。本发明涉及采用苝醌化合物添加到猪饲料中用于制备抗猪病毒饲料。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高，猪肉的消费也日益增加，进而带动国内养殖业的快速发展。然而猪病频繁爆发给我国养猪业造成了重大损失，猪场生物安全体系倍受养猪生产者的关注。猪在饲养过程中会感染多种病毒和细菌，从而影响猪的免疫功能，一些病能导致猪的直接死亡，也有一些慢性疾病虽然死亡率不高，但会造成生长速度减慢，饲料利用率降低，并发二次感染，增加药物和治疗费用等。
在猪病中，病毒性疾病尤其显得严重。例如，由猪流感病毒(Swine influenzavirus(SIV))，引起的猪流感一年四季都可以发生，可直接引起感染猪死亡，或感染猪恢复缓慢，生产性能下降，如引起其它病毒或细菌的并发或继发感染，会显著增加上述疾病的损害程度和病死率。同时猪流感病毒还被发现可以在种间传播，感染人并引致疾病乃至死亡。其它病毒如：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV))、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)等均严重阻碍着养猪业的健康发展。当前许多小规模养猪的农民由于怕猪得病毒病，不敢养猪。
当前研究人员采取了各种方法来防治猪病毒性疾病。专利CN200810052661.3公开了一种采用灰树花多糖防治猪病毒性疾病的方法；专利CN200810141133.5公开了一种采用金银花组合抗猪病毒的方法；专利CN200810160404.1公开了采用数十种中草药混合而成的饲料添加剂用于防治猪病毒性肠炎。以上这些方法均存在治疗效果较慢较差，同时成本过高的问题。金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦和扎那米韦等是常用抗病毒药，但病毒对这类药物已经产生一定的耐药性。猪γ干扰素也是一种有前景的抗病毒药，但其生产方法过程复杂，产量低、成本高。以莽草酸为主要成份的抗病毒药“达菲”虽然有一定的效果，但其价格高昂，很难被养殖户接受，同时可能会引起中枢神经系统的不良反应等毒副作用。另外疫苗可在一定时间内起到较好的效果，但病毒变异非常快，疫苗很难短时间内有效研究出来。
专利CN200610072935.6和CN200610156354.0公开了金丝桃素在防治病毒中的应用。金丝桃素是从中草药贯叶连翘中提取得到的一种菲并醌类(Phenanthroperylenequinone)化合物，其表现出了广谱的良好的病毒杀灭效果。然而金丝桃素化学性质不稳定，见光易分解，在实际应用中有相当一部分金丝桃素无法被有效利用。
我们研究发现苝醌(Perylenequinone)类化合物具有较好的广谱抗病毒的效果。苝醌化合物与金丝桃素相比，具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。因此本发明公开了一种苝醌化合物应用于猪饲料的方法，从而有效地进行猪病毒的防治。
发明内容
本发明的目的是将苝醌化合物应用于猪饲料中用于预防和治疗猪病毒感染病。
本发明涉及到的相关特征如下：
1、苝醌化合物说明
本发明所指苝醌化合物为如下所示的三种母核为基本结构，并以此三种母核结构进行基团修饰的化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修饰上各种化学基团，如CH3，OCH3，COCH3，CH(OH)CH3，CHO，OH，H等，这些化学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。
苝醌化合物母核
特别的如竹红菌素(竹红菌甲素Hypocrellin A、竹红菌乙素Hypocrellin B)、痂囊腔菌素(痂囊腔菌甲素Elsinochrome A、痂囊腔菌乙素Elsinochrome B、痂囊腔菌丙素Elsinochrome C、痂囊腔菌丁素Elsinochrome D)、弗来菌素(Phleichrome)、枝孢素(枝孢甲素Cladosporium A、枝孢乙素Cladosporium B、枝孢丙素Cladosporium C、枝孢丁素Cladosporium D)、卡弗他丁(Calphostin A、Calphostin B、Calphostin C、Calphostin D)、hypomycin A和hypomycin B、尾孢素(Cercosporin)、Scutiaquinone A和Scutiaquinone B等。它们的化学结构参见如下相关文献：
[1]Iida，T.，E.Kobayashi，M.Yoshida，and H.Sano(1989)Calphostins，novel and specific inhibitors of protein kinase C.II.Chemical structures.J.Antibiot.42：1475-1481.
[2]Lousberg，R.J.，C.A.Salemink，U.Weiss，and Batterha.Tj(1969)Pigmentsof Elsinoe species.Part II.Structure of elsinochromes A，B，and C.Journal of theChemicalSociety C-Organic.1219-1227.
[3]Lousberg，R.J.，C.A.Salemink，and U.Weiss(1970)Pigments ofElsinoespecies.Part V.The structure of elsinochrome D.Journal of the Chem icalSocietyC-Organic.2159-2162.
[4]Diwu，Z.J.，and J.W.Lown(1990)Hypocrellins and their use inphotosensitization.Photochem.Photobiol.52：609-616.
[5]Liu，W.Z.，Y. X.Shen，X.F.Liu，Y.T.Chen，and J.L. Xie(2001)A newperylenequinone from Hypomyces sp.Chinese Chemical Letters.12：431-432.
[6]Yoshihara，T.，T.Shimanuki，T.Araki，and S.Sakamura(1975)Phleichrome，a new phytotoxic compound produced by Cladosporium phlei.Agric.Biol.Chem.39：1683-1684.
[7]Ayers，S.，D.L.Zink，K.Mohn，J.S.Powell，C.M.Brown，T.Murphy，R.Brand，S.Pretorius，D.Stevenson，D.Thompson，and S.B.Singh(2007)Scutiaquinones A and B，perylenequinones from the roots of Scutia myrtina withanthelmintic activity.Journal of Natural Products.70：425-427.
[8]Lousberg，R.J.，U.Weiss，C.A.Salemink，A.Arnone，L.Merlini，andG.Nasini(1971)The structure of cercosporin，a naturally occurring quinone.Journalof the ChemicalSociety D-ChemicalCommunications.1463-&.
[9]Arnone，A.，G.Assante，V.Dimodugno，L.Merlini，and G.Nasini(1988)Perylenequinones from cucumber seedlings infected with Cladosporiumcucumerinum.Phytochemistry.27：1675-1678.
2、苝醌化合物的来源
竹红菌素来源有：(1)天然的长于竹子上的竹黄菌(Shiraiabambusicola)子实体和竹红菌(Hypocrella bambusae)子实体；(2)根据专利CN200710132510.4和CN 200910182255.3所述的方法采用竹黄菌进行液态发酵或固态发酵得到。竹黄菌株可为：Shiraia sp.SUPER-H168保藏号为CCTCC NO：M 207104或其它可从菌种保藏机构购买到的Shiraiabambusicola菌株。
痂囊腔菌素可用Elsinoe fawcettii ATCC 38162或其它可从菌种保藏机构购买到的Elsinoe fawcettii菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
枝孢素可用Cladosporium cucumerinum.ATCC 11279或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium cucumerinum菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
卡弗他丁可用Cladosporium cladosporioides CGMCC 34593或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium cladosporioides菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
尾孢素可用Cercospora kikuchii ATCC 42152或其它可从菌种保藏机构购买到的Cercospora kikuchiis菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
弗来菌素可用Cladosporium phlei ATCC 36193或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium phlei菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
Scutiaquinone可从对刺藤属植物Scutia myrtina的根部采用乙醇提取得到。
以上所有菌种的固态发酵条件均可为：采用粮食为主要原料，并将其粉碎至50-80目，另添加以主要原料计的0.5％-2％葡萄糖、0.1％-0.5％KH2PO4、0.01％-0.08％MgSO4·7H2O。加水拌料湿，料水比控制在1∶1-1∶0.7，121℃灭菌45-60min，冷却后接入5％-10％液体种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度24-32℃，发酵过程控制湿度80％-90％，5-15天发酵结束。粮食原料可为：大米、小米、玉米、小麦、荞麦、高粱、黑米、豆粕、大豆或赤豆。
以上所有菌种的液态发酵条件均可为：碳源5-50g/L，氮源5-50g/L，土豆100-200g/L，磷酸氢二铵1-2g/L，磷酸二氢钾1-2g/L，硫酸镁0.1-0.8g/L；121℃灭菌20min，灭菌冷却后接入菌种，接种量为5％-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为24-32℃，发酵周期为2-5天；碳源可为葡萄糖、果糖、蔗糖或可溶性淀粉。氮源可为无机铵盐(如NH4Cl)、无机硝酸盐(如NaNO3、NH4NO3)、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆或豆饼粉。
3、苝醌化合物在饲料中的添加方法
预防病毒的剂量为每天1-10μmol苝醌化合物/kg体重，将苝醌化合物拌入饲料中饲喂，猪的生长过程中始终添加。
对于感染病毒的猪的治疗剂量为每天10μmol-100μmol苝醌化合物/kg体重，疗程为2至7天
(1)对于天然竹黄菌或竹红菌子实体来源的苝醌化合物：根据猪的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的竹黄菌或竹红菌子实体粉碎至40-60目，然后均匀混入猪的日常饲料。
(2)对于固态发酵得到的苝醌化合物：待发酵结束后50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据猪的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入猪的日常饲料。
(3)对于液态发酵得到的苝醌化合物：待发酵结束后，离心去除液体得到菌丝体等固形物，50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据猪的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入猪的日常饲料。
(4)对于植物Scutia myrtina：Scutiaquinone主要存在于根部，根据猪的体和苝醌化合物需求量，取一定量的Scutia myrtina根，首先用乙醇将Scutiaquinone从根部萃取出来(乙醇∶根＝1∶0.5-1∶3，重量比)，过滤去除根茎，50-60℃真空浓缩去除酒精并烘干，再将其粉碎至40-60目，然后根据需求量均匀混入猪的日常饲料。
(5)这些苝醌化合物可以通过制备色谱纯化为单体，混入猪的日常饲料中。制备纯化的条件如先前发表的文献所述。Xiao-Hui Lianga，Yu-Jie Cai，Xiang-RuLiao，Kang Wu，Lei Wang，Da-Bing Zhang and Qiang Meng(2009).Isolation andidentification of a new hypocrellin A-producing strain Shiraia sp SUPER-H 168.Microbiological Research 164(1)：9-17.
(6)不同来源的苝醌化合物可以根据实际情况按任意比例混合使用。
本发明的有益效果：本发明涉及采用苝醌化合物添加到猪饲料中制备用于防治猪病毒饲料，如繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒等。苝醌化合物包括：竹红菌素、痂囊腔菌素、弗来菌素、枝孢素、卡弗他丁、尾孢素等，苝醌化合物具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。制备预防猪病毒饲料中的剂量为每天1-10μmol苝醌化合物/kg体重，制备治疗猪病毒饲料中的剂量为10μmol-100μmol苝醌化合物/kg体重，防治病毒的效果非常显著，同时苝醌化合物可通过现代生物技术生产得到，可产生良好的经济和社会效益。
具体实施方式
实施例1：苝醌化合物体外抗病毒实验
(1)体外抗病毒实验用细胞的准备
以Marc-145细胞(猴肾细胞)研究苝醌化合物对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用。生长培养基：DMEM(Dulbecco′s modified eaglemedium，含4500mg/L D-葡萄糖、300mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，5％胎牛血清，1％青霉素，1％链霉素)。将Marc-145细胞用0.25％的胰酶消化后，吹打使细胞分散，用DMEM生长培养基稀释成1×106细胞/mL，加至96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长成单层细胞后，进行体外抗病毒试验。
以PK-15细胞(猪肾细胞)研究苝醌化合物对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒(PCV)的作用。将PK-15细胞用0.25％的胰酶消化后，吹打使细胞分散，用含10％胎牛血清的RPMI 1640(Roswell Park MemorialInstitute 1640号)培养基稀释成1×106个细胞/mL，加至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。至细胞长成单层细胞后，进行体外抗病毒试验。
以MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney狗肾上皮细胞)研究苝醌化合物对H1N1亚型猪流感病毒的作用。DMEM培养液(含4500mg/L D-葡萄糖，300mg/LL-谷氨酰胺，200mg/LNaHCO3，5％胎牛血清，1％青霉素，1％链霉素)为细胞培养基。将MDCK细胞用0.25％的胰酶消化后，吹打使细胞分散，用DMEM培养基稀释成1×106个细胞/mL，加至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。至细胞长成单层细胞后，进行体外抗病毒试验。
(2)体外抗病毒实验用病毒半数组织培养感染剂量(Tissue culture infectivedose，TCID50)的测定
细胞长成单层后，接种10-2-10-1稀释度的病毒液(0.1mL/孔)，每个稀释度接种8孔，于5％CO2培养箱中37℃培养120h，每天观察细胞病变(CEP)情况，根据Reed-Muench公式计算病毒的TCID50(Reed，L.J.；Muench，H.(1938).A simplemethod of estimating fifty percent endpoints.The American Journal of Hygiene 27：493-497.)。
(3)MTT染色法计算细胞存活率
MTT法(四甲基偶氮唑盐比色法)进行细胞染色(终浓度0.5g/L)检测细胞存活和生长。用酶标仪测定490nm处的吸光度值(OD)，按下列公式计算细胞成活率：细胞存活率(％)＝[加苝醌组OD/正常细胞组OD]×100％。
(4)苝醌化合物对细胞的毒性试验
用DMSO将Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome分别配制成0.01、0.1、0.2、0.4mmol/mL，分别加入到长成的Marc-145、PK-15及MDCK细胞中，并以不含加苝醌化合物的Mac-145、PK-15及MDCK细胞作对照，每一个测试3瓶，在37℃，5％CO2培养箱培养120小时，这些培养在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，测定细胞存活率。
实验结果发现，所有测试细胞的存活率均在99.5％左右，因此在上述浓度下苝醌化合物对细胞无明显细胞毒作用。
(5)苝醌化合物对病毒的直接灭活作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome对病毒的直接灭活作用。100TCID50病毒液中加入苝醌化合物(溶解在DMSO[Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜]中)，使苝醌化合物在病毒液中浓度的分别达到0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L，在37℃，5％CO2培养箱中培养1h后，感染上述培养好的对应细胞。倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％、细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的光剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。
不加苝醌化合物的病毒对照组的细胞存活率为8.3％。加苝醌化合物的细胞存活率如表1所示。
表1：细胞存活率(％)
(6)苝醌化合物对病毒侵入细胞的阻断作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome对病毒侵入细胞的阻断作用。取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，将苝醌化合物以0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L浓度(溶解在DMSO中)，分别加到细胞培养板上，0.1mL/孔，每个尝试度重复3孔。37℃作用4h，弃去液体，每孔加入100TCID50病毒液0.1mL，另设细胞对照和病毒对照。5％CO2，培养箱37℃培养120h。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的光剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，用倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％、细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析，并计算出细胞存率。
不加苝醌化合物的病毒对照组的细胞存活率为9.3％。加苝醌化合物的细胞存活率如表2所示。
表2：细胞存活率(％)
(7)苝醌化合物对病毒增殖的抑制作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome对病毒增殖的抑制作用。取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100TCID50的病毒液，100μL/孔，置37℃，5％CO2培养箱中吸附4h。弃去病毒液，分别加入不同浓度为0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L的苝醌化合物(溶解在DMSO中)，0.1mL/孔，每个浓度重复3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。5％CO2培养箱37℃培养。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。
不加苝醌化合物的病毒对照组的细胞存活率为8.8％。加苝醌化合物的细胞存活率如表3所示。
表3：细胞存活率(％)
(8)结论
由以上实验可以知道，苝醌化合物对于测试用猪病毒均有杀灭作用，是广谱的抗病毒化合物。其中Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B及Elsinochrome A的效果最好，其它苝醌化合物稍弱。另外在光照条件下，抗病毒效果也优于无光的条件，这主要是由于苝醌化合物在光照下会产生超氧离子等产物，其光敏氧化产物可以增强抗病毒能力。
实施例2：固态发酵竹红菌素添加于饲料中的抗PRRSV病毒实验
实验中猪的基础日粮配方为：玉米65％，豆粕12％，次粉15％，菜籽饼3％，鱼粉1.8％，NaCl 0.3％，CaCO30.8％，CaHPO40.8％，赖氨酸0.3％，多维1％(可为每kg饲料提供维生素A 1200IU，维生素D 32500IU，维生素E 30IU，维生素K 3mg，维生索B 18μg，核黄素4mg，烟酸40mg，泛酸15mg，氯化胆碱400mg。叶酸700g，硫胺素VB 1.5mg，维生素B 3mg，生物素100g，Zn 80mg，Mn 20mg，Fe 83mg，Cu 25mg)。基础日粮料型为粉料，玉米、豆粕均为1.8mm筛片粉碎。
采用固态发酵法生产竹红菌素，玉米为主要原料，另添加以玉米重量计的2％葡萄糖、0.2％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O。加水拌料湿，料水比控制在1∶0.7，121℃灭菌45-60min，冷却后接10％液体竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵过程控制湿度90％，发酵10天结束。60℃烘干去除水份，测定其中竹红菌甲素占8.4％，竹红菌乙素占1.3％。其它苝醌化合物总量占0.4％。
25日龄断奶体况良好的仔猪(平均体重6.75kg)40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物36.5mg，这样使猪的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组3：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物182.5mg，这样使猪的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组4：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物365mg，这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有猪连续吃添加了含有竹红菌素的饲料7天后，用1mL的1×106TCID50/mL PRRSV病毒培养液对所有组的所有猪进行口服攻毒，然后每日测定每头猪体温变化，观察每头猪临床症状，记录死亡数，观察21天。观察结果如下：
试验组1：10头猪于攻毒后第2～4天以后体温开始升高至40.5℃～41.8℃，持续4～7天，并呈现精神食欲下降，咳嗽、喘等呼吸道症状，其中5头猪于攻毒后9天死亡、4头猪于攻毒后15天死、一头猪于第19天死亡。猪耳部和躯干后部暗紫色，呈典型繁殖与呼吸综合症症状。
试验组2：2头猪于攻毒后第3～5天以后体温开始升高40.5℃～41.8℃，持续4～7天，并呈现精神食欲下降，咳嗽、喘等呼吸道症状，其中1头猪于攻毒后14天死亡，猪耳部和躯干后部暗紫色，呈典型繁殖与呼吸综合症症状。其它猪观察21天仍健活。
试验组3：一头猪于攻毒后第6天体温40.3℃～40.8℃，持续4天后恢复。所有猪观察21天均健活。
试验组4：所有猪观察21天均健活。
由此实验看出竹红菌素对于猪起到了非常好的保护作用。
实施例3：液态发酵竹红菌素添加于饲料中的抗PCV病毒实验
实验基础日粮与实施例2相同。
采用液态发酵法生产竹红菌素，每升培养基组成为：葡萄糖20g，蛋白胨50g，土豆200g，(NH4)2HPO42g，KH2PO42g，MgSO40.5g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体竹黄菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵72h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中竹红菌甲素占8.1％，竹红菌乙素占1.3％，其它苝醌化合物总量占0.2％。
25日龄断奶体况良好的仔猪(平均体重6.75kg)40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的烘干液态发酵物38.4mg，这样使猪的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组3：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的烘干液态发酵物192.0mg，这样使猪的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组4：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的烘干液态发酵物384.0mg，这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有猪连续吃添加了竹红菌素的饲料7天后，用1mL的1×106TCID50/mL PCV病毒培养液对所有组的所有猪进行口服攻毒，然后每日测定每头猪体温变化，观察每头猪临床症状，记录死亡数，观察21天。观察结果如下：
试验组1：所有猪于2天后出现：精神食欲下降，咳嗽、喘等呼吸道症状，明显消瘦，皮肤发白。8头猪于攻毒后第7天体温升高到40.2℃～40.9℃，连续6天，并出现眼结膜炎，咳嗽等症状。所有猪观察21天无死亡。
试验组2：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
试验组3：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
试验组4：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
由此实验看出竹红菌素对于猪起到了非常好的保护作用。
实施例4：液态发酵卡弗他丁添加于饲料中的抗PRV病毒实验
实验基础日粮与实施例2相同。
采用液态发酵法生产卡弗他丁，每升培养基组成为：葡萄糖5g，酵母膏5g，土豆100g，(NH4)2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.1g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体Cladosporium cladosporioides CGMCC 34593菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度28℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，其中Calphostin A占0.029％，Calphostin B占0.025％，Calphostin C占0.85％，Calphostin D占0.02％，Calphostin I占0.01％。
25日龄断奶体况良好的仔猪(平均体重6.75kg)40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的液态发酵物573mg，这样使猪的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组3：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的液态发酵物2867mg，这样使猪的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组4：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入烘干粉碎的液态发酵物5734mg，这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有猪连续吃添加了卡弗他丁的饲料7天后，用1mL的1×106TCID50/mL PRV病毒培养液对所有组的所有猪进行口服攻毒，然后每日测定每头猪体温变化，观察每头猪临床症状，记录死亡数，观察21天。观察结果如下：
试验组1：攻毒2天后4头猪出现腹泻、喷嚏症状，体温上升至39.5℃～40.9℃，攻毒后第4天，另6头仔猪出现精神稍差，食欲减退，腹泻，喷嚏，后肢麻痹等不同症状。第5天3头猪死亡，第8天2头猪死亡，第15天另外5头猪全部死亡。
试验组2：攻毒5天后2头猪出现腹泻、喷嚏症状，体温上升至39.5℃～40.9℃，但7天后症状减轻，逐渐恢复正常。其它所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
试验组3：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
试验组4：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
由此实验看出卡弗他丁对于猪起到了非常好的保护作用。
实施例5：液态发酵痂囊腔菌素和尾孢素添加于饲料中的抗PPV病毒实验
实验基础日粮与实施例2相同。
采用液态发酵法生产痂囊腔菌素，每升培养基组成为：葡萄糖25g，牛肉膏25g，土豆100g，(NH4)2HPO41.5g，KH2PO41.5g，MgSO40.8g/L，121℃灭菌20min，冷却后接5％液体Elsinoe fawcettii ATCC 38162菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度24℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中Elsinochrome A占0.012％，Elsinochrome B占0.021％，Elsinochrome C占0.034％，Elsinochrome D占0。05％.
采用液态发酵法生产尾孢素，每升培养基组成为：葡萄糖25g，蛋白胨25g，土豆100g，(NH4)2HPO41.5g，KH2PO41.5g，MgSO40.1g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体Cercospora kikuchii ATCC 42152菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度31℃，发酵120h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中Cercosporin占0.25％。
体况良好的怀孕母猪(平均体重90kg，怀孕时间约30天)40头，根据体重相近、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：怀孕30天猪的一天食量大约是1.8Kg，根据其体重在其1.77Kg基础日粮中均匀混入烘干粉碎的含痂囊腔菌素液态发酵物21g和含尾孢素液态发酵物9.6g，这样使猪的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加发酵物混入量，整个实验过程均吃添加了痂囊腔菌素和尾孢素液态发酵物的饲料。痂囊腔菌素与尾孢素的摩尔比约为1∶1。
试验组3：怀孕30天猪的一天食量大约是1.8kg，根据其体重在其1.64kg基础日粮中均匀混入烘干粉碎的痂囊腔菌素液态发酵物105g和含尾孢素液态发酵物48g，这样使猪的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加发酵物混入量，整个实验过程均吃添加了痂囊腔菌素和尾孢素液态发酵物的饲料。痂囊腔菌素与尾孢素的摩尔比约为1。
试验组4：怀孕30天猪的一天食量大约是1.8kg，根据其体重在其1.5kg基础日粮中均匀混入痂囊腔菌素液态发酵物210g和含尾孢素液态发酵物96g，，这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加发酵物混入量，整个实验过程均吃添加了痂囊腔菌素和尾孢素液态发酵物的饲料。痂囊腔菌素与尾孢素的摩尔比约为1。
试验组2、3、4所有猪连续吃添加了痂囊腔菌素和尾孢素的饲料20天后，用1mL的1×106TCID50/ml PPV病毒培养液对所有组的所有猪进行注射攻毒，观察每头猪临床症状，观察至猪生分娩为止。观察结果如下：
试验组1：有7胎流产。死胎占8头，畸形胎为6头，木乃伊占3头，病弱为9头。
试验组2：所有母猪分娩正常，共产活仔95头，平均每窝产活仔9.5头，未见死仔
试验组3：所有母猪分娩正常，共产活仔96头，平均每窝产活仔9.6头，未见死仔
试验组4：所有母猪分娩正常，共产活仔93头，平均每窝产活仔9.3头，未见死仔
由此实验看出痂囊腔菌素和尾孢素对于猪起到了非常好的保护作用。
实施例6：Scutiaquinone添加于饲料中的抗H1N1病毒实验
取一定量的Scutia myrtina树根，首先用乙醇将Scutiaquinone从根部萃取出来(乙醇∶根＝1∶0.5，重量比)，过滤去除根茎，60℃真空浓缩去除酒精并烘干，粉碎至60目。测定其中Scutiaquinone A约为2.7％，Scutiaquinone约为2.5％。
25日龄断奶体况良好的仔猪(平均体重6.75kg)40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入Scutiaquinone粗提物66.3mg，这样使猪的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加固态发酵物混入量。
试验组3：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入Scutiaquinone粗提物331.7mg，这样使猪的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加固态发酵物混入量。
试验组4：25日龄的猪的一天食量大约是350g，根据其体重在其350g基础日粮中均匀混入Scutiaquinone粗提物663.3mg，这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据猪的食量和体重增加固态发酵物混入量。
试验组2、3、4所有猪连续吃添加了Scutiaquinone的饲料7天后，用1mL的1×106TCID50/ml H1N1病毒培养液对所有组的所有猪进行滴鼻攻毒，然后每日测定每头猪体温变化，观察每头猪临床症状，观察15天。观察结果如下：
试验组1：2天内集中全群发病，测试体温40.5-41.5℃。流清鼻液或稠鼻液，有时鼻液带有血色，眼分泌物增多，眼结膜潮红，咳嗽，呼吸加快。4-5天后所有猪症状消失，10天左右自然康复。
试验组2：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
试验组3：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
试验组4：所有猪体温和临床症状均无明显变化，观察21天均健活。
由此实验看出Scutiaquinone对于猪起到了非常好的保护作用。
实施例7：液态发酵的竹红菌素冶疗PPRSV和PCV混合感染。
25日龄断奶体况良好的仔猪(平均体重6.75kg)40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。
用1mL的1×106TCID50/ml PRRSV和1mL的1×106TCID50/ml PCV病毒培养液对所有组的所有猪注射攻毒，约2天左右，所有猪体温升高、有腹泻、咳嗽、身体局部皮肤呈蓝紫色等征状出现。然后采用竹红菌素进行治疗。由于猪被病毒感染后食欲变差，因此将竹红菌素与少量基础日粮混合后，当猪饥饿时首先喂食添加竹红菌素的饲料，若无进食能力则进行灌服。
实验用基础日粮及竹红菌素生产方法与实施例3相同。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：将干燥后的液态发酵物0.384g与50g基础日粮均匀混合，一次性灌服。这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。连续吃含有竹红菌素的饲料7天。
试验组3：将干燥后的液态发酵物1.92g与50g基础日粮均匀混合，一次性灌服。这样使猪的每日摄入量约为50μmol/kg。连续吃含有竹红菌素的饲料7天。
试验组4：将干燥后的液态发酵物3.84g与50g基础日粮均匀混合，这样使猪的每日摄入量约为100μmol/kg。连续吃含有竹红菌素的饲料7天。
观察每头猪临床症状，记录死亡数，观察21天。观察结果如下：
试验组1：10头猪未进行治疗的猪于9天后死亡4头，12天又用4头死亡，15天全部死亡。
试验组2：8头猪于治后2天后，体温逐渐降低，第3天5头猪体温恢复正常，3头猪地第6天体温恢复正常，观察21天健活。有2头猪症状略有减轻，但仍第12天死亡。
试验组3：所有猪于治疗2天后，体温逐渐降低，第3天有8头猪体温恢复正常，第5天有2头猪体温恢复学，观察21天所有猪健活。
试验组4：所有猪于治疗2天后，体温逐渐降低，第3天有所有猪体温恢复正常，观察21天所有猪健活。
由此实验看出竹红菌素对于猪感染病毒有非常好的治疗作用。
实施例8：液态发酵卡弗他丁的冶疗PRV+PPV混合感染。
体况良好的怀孕母猪(平均体重90kg，怀孕时间约30天)40头，根据体重相近、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。
用1mL的1×106TCID50/ml PRV和1mL的1×106TCID50/ml PPV病毒培养液对所有组的所有猪注射攻毒。2天后，采用卡弗他丁进行治疗7天。由于猪被病毒感染后食欲变差，因此将竹红菌素与少量基础日粮混合后，当猪饥饿时首先喂食添加竹红菌素的饲料，若无进食能力则进行灌服。实验用基础日粮与实施例3相同。卡弗他丁的生产方法与实施例4相同。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：将干燥后的液态发酵物5.7g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服。这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。连续吃含有卡弗他丁的饲料5天。
试验组3：将干燥后的液态发酵物28.5g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服。这样使猪的每日摄入量约为50μmol/kg。连续吃含有卡弗他丁的饲料5天。
试验组4：将干燥后的液态发酵物57.3g与50g基础日粮均匀混合，一次次性喂服，这样使猪的每日摄入量约为100μmol/kg。连续吃含有卡弗他丁的饲料5天。
观察至猪生分娩为止。观察结果如下：
试验组1：有8胎流产。死胎占7头，畸形胎为4头，木乃伊占5头，病弱为2头(出生后3天左右死亡)。
试验组2：所有母猪分娩正常，共产活仔92头，平均每窝产活仔9.2头，未见死仔
试验组3：所有母猪分娩正常，共产活仔95头，平均每窝产活仔9.5头，未见死仔
试验组4：所有母猪分娩正常，共产活仔96头，平均每窝产活仔9.6头，未见死仔
由此实验看出卡弗他丁对于猪感染病毒有非常好的治疗作用。
实施例9：液态发酵的弗来菌素冶疗H1N1感染。
25日龄断奶体况良好的仔猪(平均体重6.75kg)40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头猪。饲喂方式为自由采食及饮水。
采用液态发酵法生产弗来菌素，每升培养基组成为：果糖25g，NH4NO325g，土豆10g，(NH4)2HPO41.0g，KH2PO41.0g，MgSO40.3g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体Cladosporium phlei ATCC 36193菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中Phleichrome A占0.022％。
用1mL的1×106TCID50/ml H1N1病毒培养液对所有组的所有猪注射攻毒。2天内集中全群发病，测试体温40.5-41.5℃。流清鼻液或稠鼻液，有时鼻液带有血色，眼分泌物增多，眼结膜潮红，咳嗽，呼吸加快。将弗来菌素与少量基础日粮混合后，当猪饥饿时首先喂食添加弗来菌素的饲料，若无进食能力则进行灌服。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：将干燥后的液态发酵物1.7g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服。这样使猪的每日摄入量约为10μmol/kg。连续吃含有弗来菌素的饲料2天。
试验组3：将干燥后的液态发酵物8.4g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服。这样使猪的每日摄入量约为50μmol/kg。连续吃含有弗来菌素的饲料2天。
试验组4：将干燥后的液态发酵物16.9g与50g基础日粮均匀混合，一次次性喂服，这样使猪的每日摄入量约为100μmol/kg。连续吃含有弗来菌素的饲料2天。
观察每头猪临床症状，观察21天。观察结果如下：
试验组1：4-5天后所有猪症状消失，10天左右自然康复。
试验组2：2天左右症状消失，5天康复。
试验组3：2天左右症状消失，5天康复。
试验组4：2天左右症状消失，5天康复。
由此实验看出弗来菌素对于猪感染病毒有非常好的治疗作用。
上述实施例1-9只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明实质内容所作的等效变化变或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.苝醌化合物在制备防治猪病毒饲料中的应用，其特征在于所述的苝醌化合物选用：竹红菌甲素Hypocrellin A、竹红菌乙素Hypocrellin B、枝孢甲素Cladosporium A、痂囊腔菌甲素Elsinochrome A、Scutiaquinone A、尾孢素Cercosporin，弗来菌素Phleichrome之一种；
所述防治的猪病毒为猪细小病毒PPV、猪伪狂犬病病毒PRV和猪圆环病毒PCV。
2.根据权利要求1所述的苝醌化合物在制备防治猪病毒饲料中的应用，其特征在于在猪饲料中添加苝醌化合物用于制备防猪病毒的猪饲料，添加量为每天1-10μmol苝醌化合物/kg体重，生长期内用的猪饲料中始终添加。
3.根据权利要求1所述的苝醌化合物在制备防治猪病毒饲料中的应用，其特征在于在猪饲料中添加苝醌化合物用于制备治猪病毒的猪饲料，添加量为每天10-100μmol苝醌化合物/kg体重，该治猪病毒的猪饲料对感染猪病毒的猪用的时间为2-7天。
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