CN109528768B - 一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂及其制备方法 - Google Patents

一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂及其制备方法。所述制备方法步骤包括：将蔺花香茅叶片进行超声微波辅助水提，再加入乙醇继续提取，再将提取液进行抽滤、离心，得到上清液即蔺花香茅叶片提取液；将AgNO3溶液和蔺花香茅叶片提取液混合反应，得到生物合成的纳米抑菌制剂。本发明的产品制备方法简便，价格低廉，环境友好。产品对马子宫内膜炎致病菌具有显著杀灭作用，不易产生耐药性，适用于马子宫内膜炎的治疗，治疗效果好，无毒副作用，不易复发。

Description

一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
马子宫内膜炎是一种由病原菌引起的具有高度传染性的生殖系统疾病，临床上可分为急性临床型、慢性临床型和亚临床型等类型。该病主要由好氧菌和条件致病菌引起，也有部分真菌参与，可导致母马的生殖道、子宫感染，严重影响母马的生殖效率，直接影响马产业的发展。
目前，对马子宫内膜炎防治采取的措施主要有子宫冲洗和药物灌注子宫治疗。子宫冲洗主要利用新洁尔灭、雷夫奴尔、高锰酸钾溶液等消毒剂或盐水反复冲洗母马子宫，操作麻烦，存在清除感染不彻底、易复发等问题。药物治疗主要采用中药和抗生素，中药治疗主要采用具有清热除湿、活血化瘀、行气止痛、抗菌消炎功效的中药组方，但该方法起效慢，疗效不够理想，易复发；抗生素治疗普遍采用青霉素、庆大霉素、链霉素等抗生素，该方法是目前采用较多的治疗方式，虽然有一定的疗效，但长期反复给药无疑会增加养殖成本，更为严重的是，抗生素的长期使用能引起病原菌产生耐药性，甚至会出现多重耐药菌和超级耐药菌。兽医工作者发现很多动物感染性疾病的久治不愈和反复发作都是与耐药病原菌的产生有关。开发新型抑菌剂防控耐药菌已成为马子宫内膜炎防治工作亟待解决的迫切问题。
近年来，随着纳米技术的迅猛发展，纳米材料不断涌现，纳米银(Silvernanoparticles,AgNPs)在抑菌领域的突出表现受到人们的普遍关注，具有良好的应用前景。研究表明，纳米银可作用于细菌的细胞膜，破坏细胞膜的渗透性；与蛋白质的巯基结合，破坏相关酶活性；与致病微生物中的DNA结合，抑制DNA复制。并且纳米银可以破坏多数病原菌为抵制抗菌药物渗透而形成的生物膜，从而降低细菌耐药性的发生。独特、多角度的杀菌作用机制，使得纳米银在低浓度下就可产生强大的杀菌作用，在短时间内杀死数百种病原菌，且不易产生耐药性。因此，纳米银被誉为是最新一代的抗菌剂。
传统制备纳米银材料的制备主要通过物理、化学等方法，但这些方法这些面临着诸如纳米粒子团聚失活、尺寸大小难以控制、高能耗、仪器要求高、反应条件苛刻、难于规模化生产等问题。此外，合成中大量使用的肼、硼氢化钠、二甲基苯酰胺等有毒有害化学试剂也会对环境造成严重危害。随着人们环保意识的提升，纳米材料的合成方法也向清洁高效、无毒、环保的方向发展。由此，“绿色”生物还原法制备纳米银的技术应运而生。
生物还原法制备纳米银是利用细菌、真菌、藻类和植物等生物体内蕴含的活性物质作为还原剂和稳定剂一步法制备纳米银。与传统的合成技术相比，生物合成纳米技术具有价格低廉、反应条件温和、合成操作简便、合成效率高、清洁无毒、环境友好等优点。研究表明，由于在其表面结合有生物大分子，可有效地缓解纳米粒子团聚，因此，生物合成的纳米银具有较高的稳定性和分散性。并且纳米银表面结合的生物分子可以通过改变纳米粒子和目标微生物之间的相互作用赋予了生物合成纳米银优异的抗菌活性。目前，生物合成法现已成为纳米抑菌剂合成领域的研究热点，科研工作者已利用多种生物提取物制备出各种纳米银产品。然而，研究发现不同的生物合成纳米银产品对不同病原菌的抑制效果存在较大差别。目前，生物合成纳米银制剂尚未在畜牧业病害防控中推广应用。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂及其制备方法。本发明的产品制备方法简便，对马子宫内膜炎致病菌具有显著杀灭作用。
本发明提供一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤包括：
(1)将蔺花香茅叶片进行超声微波辅助水提，得到水提液；再加入乙醇继续提取，再将提取液进行抽滤、离心，得到上清液即蔺花香茅叶片提取液；
(2)将AgNO3溶液和蔺花香茅叶片提取液混合反应，得到生物合成的纳米抑菌制剂。
进一步的，所述步骤(1)中超声微波辅助水提为：取蔺花香茅叶片，加入双蒸水，在40kHz、100W参数下60℃超声处理10min；所述蔺花香茅叶片和所述双蒸水的比例为1.0g︰10mL。
进一步的，所述步骤(1)中乙醇继续提取为：在水提液中加入100％乙醇，60℃加热30min，回流结束后得到蔺花香茅叶片提液；所述水提液和所述100％乙醇的比例为1︰4。
进一步的，所述步骤(2)中混合反应条件为：将AgNO3溶液和蔺花香茅叶片提取液混合，80℃水浴加热回流1h，待溶液变为金黄色，反应结束即得纳米抑菌制剂。
本发明还提供一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂，所述纳米抑菌制剂采用上述的制备方法制备得到。
本发明还提供一种纳米抑菌制剂在治疗马子宫内膜炎中的应用。
有益效果：
本发明针对马子宫内膜炎耐药病原菌，开发了一种利用蔺花香茅叶提取液生物合成的新型纳米抑菌剂，用于马子宫内膜炎的治疗。本发明的产品制备方法简便，价格低廉，环境友好。产品对马子宫内膜炎致病菌具有显著杀灭作用，不易产生耐药性，适用于马子宫内膜炎的治疗，治疗效果好，无毒副作用，不易复发。
附图说明
图1为本发明实施例1中治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂的制备方法流程图。
图2为本发明实施例1中纳米抑菌制剂的可见-紫外吸收光谱图。
图3为本发明实施例1中纳米抑菌制剂对马生殖道嗜血杆菌的抑菌圈实验。
图4为本发明实施例1中纳米抑菌制剂对马生殖道嗜血杆菌的抑菌动力学曲线。
具体实施方式
实施例1
一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂的制备方法，如图1所示，所述制备方法步骤包括：
S1：将蔺花香茅叶片进行超声微波辅助水提，得到水提液；再加入乙醇继续提取，再将提取液进行抽滤、离心，得到上清液即蔺花香茅叶片提取液；
S2：将AgNO3溶液和蔺花香茅叶片提取液混合反应，得到生物合成的纳米抑菌制剂。
S1具体为：采集蔺花香茅叶片，先用自来水冲洗干净，再用双蒸水洗涤3次，60℃烘干；称取1.0g蔺花香茅叶片，将叶片剪碎，加入10mL双蒸水，在40kHz 100W参数下60℃超声处理10min后；加入40mL100％乙醇，60℃加热30min，回流结束后将制得的溶液进行抽滤，12000rpm离心10分钟，取上清即得到蔺花香茅叶片提取液，4℃保存备用。
S2具体为：取18.8mL超纯水，加入0.2mL 0.1M的AgNO3溶液(终浓度为1mM)，再加入1mL上述提取液，混合后，80℃水浴加热回流1h，注意观察溶液颜色的变化，待溶液变为金黄色，反应结束即得到生物合成的纳米抑菌制剂，4℃避光保存。
3)纳米抑菌制剂的表征
采用紫外-可见分光光度计(UV-255，岛津，日本)对合成的抑菌剂进行表征，以蔺花香茅叶片提取液为对照，200～800nm全波长扫描。纳米银的合成可通过可见-紫外吸收光谱图中强烈的可见区吸收峰进行表征，纳米银在400～500之间有特征吸收峰。通过紫外-可见分光光度计对抑菌剂溶液进行检测，吸光谱如图2所示，提取液样品在300～800区间内没有吸收，而抑菌剂在波长为418nm左右有明显的纳米银的特征吸收峰，证明了蔺花香茅叶片提取物能够介导纳米银的合成。
4)马子宫内膜炎致病菌的分离及耐药性分析
对有重复生育史的母马通过病理观察、血样和子宫洗液样本检查、超声波等多手段检查，最终确定子宫内膜炎患病母马，利用双向导尿管收集子宫积液，接种到分离平板上培养，通过纯种培养、理化鉴定、分子鉴定，最终确定出马生殖道嗜血杆菌(Haemophilusequigenitalis)为主要致病菌，能引发高度接触传染性马子宫内膜炎。
5)抑菌实验
采用杯碟法检测本发明实施例1制备的纳米抑菌制剂的抗菌活性。以分离到的马生殖道嗜血杆菌为供试病原菌，接种于脑心浸液体培养基(脑心浸液干粉200g，琼脂粉15g，鲜牛肉浸液500mL，蒸馏水定容至1000ml，调节pH值至7.6)中，37℃200/min震荡培养至对数增长期(OD600＝1.0)，稀释至106CFU/mL，取100μL均匀涂布于脑心浸液体固体培养基(脑心浸液干粉200g，琼脂粉25g，鲜牛肉浸液500mL，蒸馏水定容至1000ml，调节pH值至7.6)平皿上，在培养基上放置牛津杯(杯外径8mm)，在牛津杯中加入20μL合成的纳米银溶液，并用生理盐水和蔺花香茅叶片提取液做为对照。将培养平皿置于37℃恒温培养箱中培养过夜，观察牛津杯周围抑菌圈的产生。由图3可以看出生理盐水对供试病原菌不产生抑菌圈(图3c)；蔺花香茅叶片提取液对马生殖道嗜血杆菌具有一定的抑菌活性(图3b)；而本发明实施例1所制备的以蔺花香茅叶片提取液生物合成的纳米抑菌制剂对供试病原菌能够产生显著的抑菌效果(图3a)。纳米银颗粒具有很强的渗透性，可迅速透过细菌细胞膜而发挥良好的杀菌作用。
6)最小抑菌浓度与最小杀菌浓度实验
选取马生殖道嗜血杆菌作为指示菌，采用二倍稀释法测定所制备的纳米银抑菌剂的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimumbactericidal concentration,MBC)。将培养至对数增长期的马生殖道嗜血杆菌菌悬液稀释到1×106CFU/mL，将制备的纳米银溶液(328.0μg/mL)二倍稀释法梯度稀释成8个浓度梯度，分装到8支试管中，分别与稀释至106CFU/mL的马生殖道嗜血杆菌菌悬液等体积混合，37℃，150r/min培养24h，观察菌液的生长情况，以稀释倍数最大且澄清的试管对应的纳米抑菌制剂浓度为该纳米银抑菌剂MIC；将上述各澄清试管中的培养物分别涂布于脑心浸液体固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养24h，菌落数小于5个的培养平皿所对应的纳米抑菌制剂的浓度即为该活性物质的MBC。由表1可以看出，该纳米抑菌制剂对马生殖道嗜血杆菌的MIC为10.2μg/mL，MBC为20.5μg/mL。
表1纳米抑菌制剂对马生殖道嗜血杆菌的抑菌浓度与杀菌浓度表
Figure BDA0001928636160000071
注：“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长
7)抑菌动力学实验：
以马生殖道嗜血杆菌为指示菌，将其接种于脑心浸液体培养基中37℃下200r/min震荡培养至对数增长期，将培养好的菌液稀释到1×106CFU/mL。将稀释好的菌液分别装入三支试管中，其中两支试管分别加入终浓度为10μg/mL和20μg/mL的纳米抑菌制剂，另一支试管加入生理盐水作为对照，置于37℃恒温摇床中200r/min培养，每间隔0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36hr取样，用分光光度计分别测定培养液在600nm下的吸光度值(OD600)，绘制细菌生长动力学曲线。实验结果如图4所示，对比生理盐水对照组，10μg/mL的纳米抑菌制剂能够抑制马生殖道嗜血杆菌的增殖，其菌体在培养液中增长十分缓慢；而20μg/mL的纳米抑菌制剂处理组对马生殖道嗜血杆菌的生长产生了强烈的阻滞作用，随着培养时间的延长，培养液的浊度无显著变化，说明培养液中的细菌几乎没有任何生长现象。
上述体外抑菌实验表明本发明选用的蔺花香茅是制备马子宫内膜炎抑菌剂的理想材料，由其制备的新型纳米银抑菌剂能对马生殖道嗜血杆菌产生显著抑制和杀灭作用，可用于马子宫内膜炎的防治。
8)耐药性实验：
以马生殖道嗜血杆菌为供试菌，分别以氨苄青霉素和本发明制备的纳米银抑菌剂的MIC剂量(分别为15.6μg/ml和10.2μg/ml)处理该菌，每培养24hr后，分别取培养菌液以1％的接种量转代接种到下一代。再分别检测氨苄青霉素和本发明制备的抑菌剂对各代病原菌的MIC值，每一代的MIC值为下一代的诱导浓度连续处理马生殖道嗜血杆菌。当病原菌传代到第28代时，氨苄青霉素对其的MIC由15.6μg/ml上升到124.8μg/ml，而本发明抑菌剂的MIC值仅从10.2μg/ml上升到了20.5μg/ml。以上实验说明相较于氨苄青霉素，本品不易对马子宫内膜炎病原菌产生耐药性。
纳米银属于非抗生素抗菌剂，其杀菌原理与抗生素不同。纳米银可作用于病原菌细胞膜的膜蛋白，直接破坏细胞膜破坏进入菌体内部，并与氧代谢酶的巯基结合，破坏微生物细胞的呼吸系统、抑制DNA复制，使病原菌呼吸代谢被阻断，并丧失繁殖能力，因此，纳米银抑菌剂能有效治疗因病原菌耐药性而导致的反复感染，被誉为新一代的抗菌剂。
9)临床治疗效果检测
为检测本发明制备的马子宫内膜炎抑菌剂的临床效果，通过人工授精管向患病母马子宫内注入制剂，每次治疗所用制剂的浓度为20μg/mL，注入总量为100—300mL，次日重复向子宫内注入，3～4d后再注入一次。通过治疗可使母马阴道及宫颈炎症消失，阴门无粘性或粘脓性分泌物排出，可使母马受孕率大幅提高，临床治愈率达到95％以上。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明采用纳米生物技术的制备的纳米银抑菌剂为新型抑菌剂，对马子宫内膜炎病原菌具有显著拮抗作用，且能防止耐药性的发生，可以代替临床防治马子宫内膜炎病的青霉素、链霉素等抗生素类药物，临床治疗效果更加突出。
本发明通过对大量植物材料的筛选，针对马子宫内膜炎生物合成出特效的纳米银抑菌剂，以在实际应用中发挥作用。蔺花香茅(Cymbopogon schoenanthus)，为禾本科，香茅属，多年生的芳香性草本植物。具有健胃、消肿、利尿、抗菌等功效，可用于治疗霍乱、急性胃肠炎、腹痛、腹泻、发烧头痛、感冒等。蔺花香茅中含有大量的维生素C、甲基酮、香叶醇、香茅醇、柠檬醇,橄榄醇、香叶油、芳樟醇、樟脑萜等活性物质，丰富的还原性物质为生物合成纳米银奠定了基础。本发明首次发现利用蔺花香茅提取液制备的纳米银抑菌剂对马子宫内膜炎致病菌具有显著的抑制作用，并且经过重复使用，不会产生耐药性。该制剂的发明为马子宫内膜炎的防治提供新的、切实可行的技术方案，具有重要的意义。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

Claims (4)

1.一种治疗马子宫内膜炎的纳米抑菌制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤包括：
(1)将蔺花香茅叶片进行超声微波辅助水提，得到水提液；再加入乙醇继续提取，再将提取液进行抽滤、离心，得到上清液即蔺花香茅叶片提取液；
(2)将AgNO3溶液和蔺花香茅叶片提取液混合反应，80℃水浴加热回流1h，待溶液变为金黄色，反应结束即得到生物合成的纳米抑菌制剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声微波辅助水提为：取蔺花香茅叶片，加入双蒸水，在40kHz、100W参数下60℃超声处理10min；
所述蔺花香茅叶片和所述双蒸水的比例为1.0g︰10mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中乙醇继续提取为：在水提液中加入100％乙醇，60℃加热30min，回流结束后得到蔺花香茅叶片提液；
所述水提液和所述100％乙醇的比例为1︰4。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合反应条件为：将0.1～10mM AgNO3溶液和0.5～10mL蔺花香茅叶片提取液混合。
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