CN113813303B - 青钱柳叶提取物在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种青钱柳叶提取物及其在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌剂中的用途。实验证明，本发明提供的青钱柳叶提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株具有明显的杀灭作用，克服了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株对绝大多数抗菌药物耐药的问题。本发明提供的青钱柳叶提取物可以制备成针对耐药细菌的抗菌药物或抗菌剂，在解决耐药细菌感染这一世界性难题上有优良的应用前景。

Description

青钱柳叶提取物在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌 剂中的用途
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及青钱柳叶提取物及其在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌剂中的用途。
背景技术
众所周知，细菌耐药已成为全球范围的重大公共健康问题，抗生素的滥用是造成细菌耐药的重要原因。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin- resistantStaphylococcus aureus，简称“MRSA”)具有多重耐药性并伴有高发病率和高死亡率，是导致坏死性肺炎、严重败血症、坏死性筋膜炎等疾病的重要致病菌，是医院感染和社区感染的重要病原菌之一，给临床治疗带来了极大的困难。MRSA对绝大多数的抗菌药物或制剂耐药，甚至对目前临床抗耐药菌最为有效的万古霉素也开始出现耐药，一旦MRSA发展到对万古霉素普遍耐药的程度，感染MRSA的患者将面临无药可治的危险境地。因此，针对细菌耐药日趋严重的情况，开发具有抗耐药菌活性、对抗生素具有增敏作用的药物，刻不容缓。
青钱柳，Cyclocarya paliurus(Batal.)ljinskaja，又名青钱李、摇钱树、甜茶树等，系胡桃科青钱柳属植物特有单种属，为我国所特有，广泛分布于江西、广西等地。青钱柳是一种高大速生阔叶乔木，因其树形似柳，果实圆形似铜钱，色青而下垂，故名“青钱柳”。近年来，国内外学者对青钱柳的理化成分及保健功能在动物水平及临床试验初步研究，表明青钱柳及相关保健产品具有多种有益的药理作用和保健效果，包括降压、降血糖、减肥、抗肿瘤、抗过敏、增强机体免疫等作用。
中国专利申请CN105106300A公开了青钱柳提取物能有效降低高脂饮食引起的大鼠肝脏脂质堆积程度、甘油三酯水平，改善肝组织学、肝功能，说明青钱柳能对非酒精性脂肪肝起到显著的改善作用，可用于制备防治非酒精性脂肪肝药物及保健品。中国专利申请CN109430472A公开了一种青钱柳茯苓茶具有降压降脂、抗氧化的作用。
但是，目前还未见将青钱柳提取物作为抗耐药细菌的药物或制剂的报道，更未见将青钱柳提取物作为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物或制剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青钱柳叶提取物及其在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌剂中的新用途。
本发明提供了一种青钱柳叶提取物，所述青钱柳叶提取物中，多糖含量为9.00wt.％～12.00wt.％，黄酮含量为0.80wt.％～1.80wt.％，皂苷含量为 4.50wt.％～6.00wt.％，三萜含量为0.30wt.％～0.80wt.％。
进一步地，所述青钱柳叶提取物中，多糖含量为10.00wt.％～ 11.00wt.％，黄酮含量为1.00wt.％～1.50wt.％，皂苷含量为5.00 wt.％～5.50wt.％，三萜含量为0.50wt.％～0.60wt.％。
进一步地，所述青钱柳叶提取物中，多糖含量为10.64wt.％，黄酮含量为1.25wt.％，皂苷含量为5.17wt.％，三萜含量为0.55wt.％。
进一步地，所述青钱柳叶提取物是通过以下方法制得的：取青钱柳叶，加溶剂提取，保留提取液，浓缩或干燥，即得。
进一步地，所述青钱柳叶为干燥的青钱柳叶粉末；和/或，所述溶剂为水，溶剂与青钱柳叶的质量比为(10～30)：1，优选为20：1。
进一步地，所述提取温度为70～110℃，提取次数为1～5次，提取时间为每次1～3小时，优选的，所述提取温度为90℃，提取次数为2次，提取时间为每次2小时。
本发明还提供了上述青钱柳叶提取物在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和 /或抗菌剂中的用途。
进一步地，所述耐药细菌为耐药性革兰氏阳性菌，优选为耐药性金黄色葡萄球菌，更优选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明还提供了一种抗菌药物，所述抗菌药物是以上述青钱柳叶提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的。
本发明还提供了一种抗菌剂，所述抗菌剂是以上述青钱柳叶提取物为活性成分，加上制剂领域常用的辅料制得的。
实验结果表明，本发明提供的青钱柳叶提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株具有明显的杀灭作用，克服了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株对绝大多数抗菌药物耐药的问题。本发明提供的青钱柳叶提取物可以制备成针对耐药细菌的抗菌药物或抗菌剂，在解决耐药细菌感染这一世界性难题上有优良的应用前景。
抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的药物。
抗菌剂是指具有杀菌或抑菌活性的制剂，一般不能用于治疗疾病。
多糖是由2个或者2个以上分子单糖脱水聚合，以糖苷键连接而成的一类碳水化合物。
黄酮是具有2-苯基色原酮(flavone)结构的一类化合物。
皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷类化合物。
三萜是基本母核由30个碳原子所组成的萜类化合物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为16S RNA和mecA基因的检测结果。
图2为青钱柳叶提取物对各菌株的杀菌作用曲线。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明青钱柳叶提取物的制备
称取室温阴干的青钱柳叶500g，粉碎后加20倍重量的水，90℃下提取 2小时，过滤，在滤渣中再加入20倍重量的水，再次在90℃下提取2小时。合并两次提取后的滤液，经浓缩后得青钱柳叶提取物溶液100ml。
取10ml青钱柳叶提取物溶液真空干燥后，得到4.88g青钱柳叶提取物粉末。所以该青钱柳叶提取物溶液中，青钱柳叶提取物的浓度为 0.488g/ml。4℃保存。
采用紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版通则0401)，分别以D-葡萄糖、芦丁、薯蓣皂素和熊果酸为对照，测得每毫升上述青钱柳叶提取物溶液中分别含有多糖51.9mg，黄酮6.1mg，皂苷25.25mg，三萜 2.7mg。所以本发明制得的青钱柳叶提取物粉末中，多糖含量为 10.64wt.％，黄酮含量为1.25wt.％，皂苷含量为5.17wt.％，三萜含量为0.55wt.％。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、青钱柳叶提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌作用测试
1、菌株和药物
菌株：普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)购自美国模式培养物研究所(AmericanType Culture Collection,ATCC)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus，MRSA)均分离自四川大学华西医院，由临床微生物室提供：MRSA-1(临床编号：1911101191)、 MRSA-2(临床编号：1911081137)、MRSA-3(临床编号： 1911051296)、MRSA-4(临床编号：1911051125)、MRSA-5(临床编号：1911081165)。
药物：实施例1制得的青钱柳叶提取物溶液，青霉素钠、苯唑西林钠和盐酸万古霉素(购买市售产品)。
2、细菌的培养
培养基：普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、MRSA-1、MRSA- 2、MRSA-3、MRSA-4和MRSA-5的培养基均为MHB(Mueller-Hinton Broth)培养基。
培养条件：37℃，150rpm摇床培养。
3、实验方法
3.1 mecA基因的鉴定
mecA基因是MRSA特有的耐药基因，对MRSA的耐药性起决定性的作用。本实验采用PCR法验证各菌株中是否存在mecA基因，具体方法如下：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各菌株的基因组DNA。提取步骤详见试剂盒说明。分别以各菌株的基因组DNA为模板，采用多重PCR技术扩增16S RNA和mecA基因449bp片段。采用的引物序列为：16S RNA上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.1)和下游引物5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.2)；mecA上游引物5'-CTCAGGTACTGCTATCCACC-3'(SEQ ID NO.3)和下游引物5'- CACTTGGTATATCTTCACC-3'(SEQID NO.4)。PCR扩增程序为：94℃3min， 94℃45s，50℃45s，72℃1min30s，30循环，72℃5min。
3.2各菌株对青霉素钠、苯唑西林钠和青钱柳叶提取物的敏感性测试
参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)有关抗菌药物敏感性试验的方法和标准，验证各菌株对药物的耐药性。本测试所采用的MHB培养基均含2％NaCl(w/v)。
实验菌液的制备：分别接种各菌于5ml MHB培养基中，37℃摇床培养过夜，调整菌液麦氏比浊至0.5个麦氏单位后，再将菌液稀释100倍备用。最终菌液浓度为5×105cfu/ml。
青霉素钠、苯唑西林钠和盐酸万古霉素应用液的配制：精确称取 100mg青霉素钠、苯唑西林钠或盐酸万古霉素溶于1ml去离子水中，经 0.22μm滤过除菌，得青霉素钠、苯唑西林或盐酸万古霉素母液。吸取 10.24μl青霉素钠、苯唑西林或盐酸万古霉素母液加入3.98976ml MHB培养基中，得256μg/ml的青霉素钠、苯唑西林钠或盐酸万古霉素应用液。
青钱柳叶提取物浓度梯度的配制：取实施例1制得青钱柳叶提取物溶液 (0.488g/mL)100μl加入96孔板中第1和2孔。从第2孔起，加入培养基 100μl连续对倍稀释至第9孔。设第10孔为培养基对照。从第1到第9 孔，青钱柳叶提取物的浓度分别为244mg/ml、122mg/ml、61mg/ml、 30.5mg/ml、15.25mg/ml、7.625mg/ml、3.8125mg/ml、1.90625mg/ml，0.953125mg/ml。
青霉素钠、和盐酸万古霉素苯唑西林钠浓度梯度的配置：取青霉素钠、苯唑西林钠或盐酸万古霉素应用液100μl加入96孔板中第1和2孔。从第 2孔起，加入培养基100μl连续对倍稀释至第9孔。设第10孔为培养基对照。从第1到第9孔，青霉素钠、苯唑西林钠和万古霉素的浓度分别为： 128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml， 1μg/ml，0.5μg/ml。
敏感性测试：在各浓度的药物孔和培养基对照孔中分别加入上述制备的菌液100μl。置培养孔板于湿盒中34℃孵育24h。取各菌液20μl，用培养基做50倍稀释后，取100μl涂布于培养平板，置37℃孵育过夜。将无菌落生长的最低药物浓度判定为最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration， MIC)。
3.3青钱柳叶提取物的杀菌作用测试
本测试所用MHB培养基均无NaCl添加。
实验菌液的制备：同3.2所述。
青钱柳叶提取物浓度梯度的配制：同3.2所述。
杀菌作用的测试：在各浓度青钱柳叶提取物孔和培养基对照孔中加入上述制备的菌液100μl。经充分混匀后，置湿盒中37℃孵育过夜。取各孔中菌液20μl，用MHB培养基10倍稀释，100μl涂布于培养平板，置37℃孵育过夜，计数菌落数。
杀菌率＝(1-药物组菌落数/培养基对照组菌落数)×100％
药物最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)由 GraphPadPrism(Version7.04)采用非线性回归分析方式计算。MBC50为到达50％杀菌效果的最低浓度。
4、实验结果
4.1 mecA基因的检测
从图1可以看出，在各MRSA菌株(MRSA-1、MRSA-2、MRSA-3、 MRSA-4和MRSA-5)中均能检测到16S rRNA和mecA的表达；而在普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)中仅能检测到16SrRNA的表达。上述结果证实本实验所用MRSA临床分离株均为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株，而普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)为β-内酰胺类药物敏感株。
4.2各菌株对青霉素钠、苯唑西林钠、盐酸万古霉素和青钱柳叶提取物的敏感性比较
从表1可以看出，各MRSA菌株对青霉素钠和苯唑西林钠的敏感性均较普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)低，MRSA菌株的MIC是普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)的4～32倍，甚至更高。
各MRSA菌株对盐酸万古霉素的敏感性与普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)一致，这是因为盐酸万古霉素是一种对耐药金黄色葡萄球菌敏感的阳性药物，MRSA对盐酸万古霉素的抗菌作用无耐药性。
而各MRSA菌株对本发明青钱柳叶提取物的敏感性与普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)一致或更敏感。说明MRSA对本发明青钱柳叶提取物的抗菌作用无耐药性，本发明制得的青钱柳叶提取物能够有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。
表1青霉素钠、苯唑西林钠和青钱柳叶提取物对各菌株的MIC
Figure BDA0002548052460000051
Figure BDA0002548052460000061
4.3青钱柳叶提取物的杀菌作用
从图2和表2可以看出，本发明制得的青钱柳叶提取物不仅对普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)有杀伤作用，对MRSA也有明显的杀伤作用，对MRSA的MBC50为1.682～3.135mg/ml。
所以，本发明制得的青钱柳叶提取物能够有效杀灭MRSA。
表2青钱柳叶提取物对各菌株的MBC50
Figure BDA0002548052460000062
综上所述，本发明提供了一种青钱柳叶提取物，该青钱柳叶提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株具有明显的杀灭作用，克服了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株对绝大多数抗菌药物耐药的问题。本发明提供的青钱柳叶提取物可以制备成针对耐药细菌的抗菌药物或抗菌剂，在解决耐药细菌感染这一世界性难题上有优良的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
四川万格农业科技有限公司
<120> 青钱柳叶提取物及其在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌剂中的用途
<130> GYKH1248-2020P0110201CC
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence)
<400> 3
ctcaggtact gctatccacc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence)
<400> 4
cacttggtat atcttcacc 19

Claims (2)

1.青钱柳叶提取物在制备抑制耐药细菌的抗菌药物和/或抗菌剂中的用途，所述耐药细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；
所述青钱柳叶提取物中，多糖含量为10.64wt.%，黄酮含量为1.25wt.%，皂苷含量为5.17wt.%，三萜含量为0.55wt.%；
所述青钱柳叶提取物是通过以下方法制得的：取青钱柳叶，加溶剂提取，保留提取液，浓缩或干燥，即得；所述溶剂为水，溶剂与青钱柳叶的质量比为20：1，所述提取温度为90℃，提取次数为2次，提取时间为每次2小时。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述青钱柳叶为干燥的青钱柳叶粉末。
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