CN114099376A - 青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途 - Google Patents

青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途。实验结果证明，本发明制得的青钱柳水提物对多种细菌均有明显的杀伤作用，特别的，其对敏感菌株(比如大肠杆菌ATCC25922)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株(MRSA)同时具有优异的杀伤作用。因此，青钱柳叶或其提取物在制备抗菌(特别是抗敏感菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株)的食品、日用品或化妆品中具有非常好的应用前景。

Description

青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中 的用途
技术领域
本发明涉及抗菌食品或化妆品领域，具体涉及青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途。
背景技术
青钱柳，Cyclocarya paliurus(Batal.)ljinskaja，又名青钱李、摇钱树、甜茶树等，系胡桃科青钱柳属植物特有单种属，为我国所特有，属濒危树种。青钱柳是一种高大速生阔叶乔木，因其树形似柳，果实圆形似铜钱，色青而下垂，故名“青钱柳”。据《中国中药资源志要》记载，其树皮、叶具有清热消肿、止痛的功能，可用于治疗顽癣。长期以来，民间用其叶片做茶，因其味甜且具有清热解暑、降血糖、降血压和延年益寿的作用。青钱柳为我国特有的降糖药用植物资源，近年来的青钱柳研究也多集中在降糖药理、药效物质基础等方面。
比如，中国专利CN201210271132.9公开了“一种祛痰止咳组合物及其制备方法”，CN201310462576.5公开了“一种青钱柳提取物在制备预防和治疗白血病药物中的应用”，中国专利CN106236828A公开了青钱柳叶或其提取物在制备调理阴虚体质的保健食品或治疗未病的药物中的应用，中国专利CN106377572A公开了青钱柳叶或其提取物在制备预防和/或缓解胃热证的保健食品或药物中的应用。
文献“青钱柳抗菌作用的实验研究，黄贝贝等”还公开了由江西农业大学提供的青钱柳提取物在体外的抗菌作用具有选择性，其对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用，但是对大肠埃希氏菌(E.coli ATCC25922)、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显，对黄曲霉、烟曲霉等霉菌的抗菌作用也不明显。而且，该文献没有记载青钱柳提取物的具体制备方法。
此外，众所周知，细菌耐药已成为全球范围的重大公共健康问题，抗生素的滥用是造成细菌耐药的重要原因。耐药菌的出现使人们认识到，细菌耐药性产生的速度远远超出了新药研发的速度，如果继续发展下去，终有一天会因为耐药性而导致现有所有抗生素无效。因此，针对细菌耐药日趋严重的情况，开发具有抗耐药菌活性的药物、食品、化妆品刻不容缓。
目前，尚未见青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的报道，更未见青钱柳叶或其提取物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的的食品、日用品或化妆品中的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途。
本发明提供了青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途。
进一步地，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
进一步地，所述细菌为敏感菌株，所述敏感菌株优选为对β-内酰胺类抗生素敏感的菌株，更优选为大肠杆菌ATCC25922；
和/或，所述细菌为耐药性革兰氏阳性菌，优选为耐药性金黄色葡萄球菌，更优选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
进一步地，所述细菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC8099、肺炎链球菌ATCC6303、嗜酸乳杆菌ATCC4356、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌CMCC44155、腐生葡萄球菌、甲型溶血性链球菌钟的一种或多种。
进一步地，所述抗菌的食品、日用品或化妆品能够杀灭细菌和/或抑制细菌的生长和繁殖。
进一步地，所述青钱柳叶提取物为青钱柳叶水提物或有机溶剂提取物。
进一步地，所述青钱柳叶水提物的制备方法为：取青钱柳叶，加水，加热提取，保留提取液，浓缩或干燥，即得。
进一步地，所述水的重量为青钱柳叶的5-30倍；所述加热温度为70-110℃；所述提取时间为每次0.5-3小时；所述提取次数为1-4次；
优选地，所述水的重量为青钱柳叶的10-20倍；所述加热温度为90℃C； 所述提取时间为每次1.5-2.0小时；所述提取次数为2次。
本发明还提供了一种抗菌的食品、日用品或化妆品，所述抗菌的食品或化妆品是由青钱柳叶或其提取物为活性成分，加上食品、日用品或化妆品领域常用的辅料制备而成；优选的，所述青钱柳叶提取物如上所述。
进一步地，所述食品为粮食及其制品、食用油、肉及其制品、乳制品、饮料、酒、调味品、豆制品或糕点；
和/或，所述日用品为纸品，所述纸品优选为卷纸、抽纸、手帕纸、厨房用纸、洁面巾、抹布纸或擦手纸；
和/或，所述化妆品为面膜、洗面奶、护肤水、乳、日霜、晚霜、眼霜或精华。
通过试验证明，本发明制得的青钱柳水提物对多种细菌均有明显的杀伤作用。特别的，其对敏感菌株(比如大肠杆菌ATCC25922)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株(MRSA)同时具有优异的杀伤作用。因此，青钱柳叶或其提取物在制备抗菌(特别是抗敏感菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株)的食品、日用品或化妆品中具有非常好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1制得的青钱柳叶水提物、普洱茶叶水提物对大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌CMCC44155、金黄色葡萄球菌ATCC25923的杀菌效果曲线；其中，相对浓度表示稀释后提取物与稀释前提取去的浓度之比。
图2为实施例1制得的青钱柳叶水提物、普洱茶叶水提物对表皮葡萄球菌ATCC8099、腐生葡萄球菌、嗜酸乳杆菌ATCC4356的杀菌效果曲线；其中，相对浓度表示稀释后提取物与稀释前提取去的浓度之比。
图3为实施例1制得的青钱柳叶水提物、普洱茶叶水提物对甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌ATCC6303的杀菌效果曲线；其中，相对浓度表示稀释后提取物与稀释前提取去的浓度之比。
图4为16S RNA和mecA基因的检测结果。
图5为实施例2制得的青钱柳叶提取物对各菌株的杀菌作用曲线。
具体实施方式
本发明所用原料与仪器均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、青钱柳叶水提物的制备
取50g青钱柳叶(来源于四川南江县光雾山种植基地，经清洗后室温干燥保存)，加水加热至90゜C提取2次，每次1.5h，每次加的水为青钱柳叶质量的15倍。提取完成后，水提物趁热抽滤，冷却，测定体积为1450ml，即得青钱柳叶水提物。
取250mL上述青钱柳叶水提物于80℃，65r/min进行减压浓缩，浓缩定容至60mL，得浓度为488mg/ml的浓缩液备用(下述实验例1中使用)。
采用紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版通则0401)，以芦丁为对照，测得上述浓缩液中总黄酮浓度为1.25％(w/v，g/mL)；以无水葡萄糖为对照，测得浓缩液中总多糖浓度为10.64％(w/v，g/mL)。
实施例2、青钱柳叶提取物的制备
称取500g青钱柳叶(来源于四川南江县光雾山种植基地，经清洗后室温干燥保存)，粉碎后加20倍重量的水，90℃下提取2小时，过滤，在滤渣中再加入20倍重量的水，再次在90℃下提取2小时。合并两次提取后的滤液，经浓缩后得青钱柳叶提取物溶液100ml。
取10ml青钱柳叶提取物溶液真空干燥后，得到4.88g青钱柳叶提取物粉末。所以该青钱柳叶提取物溶液中，青钱柳叶提取物的浓度为0.488g/ml。4℃保存。
采用紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版通则0401)，分别以D-葡萄糖、芦丁、薯蓣皂素和熊果酸为对照，测得每毫升上述青钱柳叶提取物溶液中分别含有多糖51.9mg，黄酮6.1mg，皂苷25.25mg，三萜2.7mg。所以本发明制得的青钱柳叶提取物粉末中，多糖含量为10.64wt.％，黄酮含量为1.25wt.％，皂苷含量为5.17wt.％，三萜含量为0.55wt.％。
对照例1、普洱茶叶水提物的制备
按照实施例1中相同的方法，将原料青钱柳叶替换为普洱茶叶(购买的商品用普洱茶成品)，得到备用普洱茶叶水提物(下述实验例1中使用)。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、青钱柳叶水提物的杀菌作用测试
1、细菌的培养
培养基：大肠杆菌ATCC25922(一种对β-内酰胺类抗生素敏感的菌株)、大肠杆菌CMCC44155、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC8099、腐生葡萄球菌的培养采用MH培养基；肺炎链球菌ATCC6303、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌的培养采用含5％血清的MH培养基；嗜酸乳杆菌ATCC4356的培养采用MRS培养基。
培养条件：各菌在37℃液体摇床培养4小时；肺炎链球菌、嗜酸乳杆菌、腐生葡萄球菌过夜培养。
2、实验方法
提取物的稀释：提取物(分别取实施例1所得备用青钱柳叶水提物、对照例1所得备用普洱茶叶水提物)对倍稀释在96孔板中进行。稀释液用各菌相应的培养基(MH培养基或加血清的MH培养基，嗜酸乳杆菌的培养基为MRS液体培养基)。第1、2孔分别加备用水提物100μl，从第2孔开始加100μl培养基做对倍稀释至第9孔，第10孔为只加培养基的生长对照孔。以备用水提物为基准，从第1孔到第9孔，各孔对应的提取物的浓度分别为244mg/ml、122mg/ml、61mg/ml、30.5mg/ml、15.25mg/ml、7.625mg/ml、3.8125mg/ml、1.90625mg/ml、0.953125mg/ml。
菌液的稀释：各菌接种于3ml MH培养基中，37℃摇床培养4小时，麦氏比浊0.5个麦氏单位，再将菌液稀释1000倍备用，菌浓度约5×105个/ml。
杀菌测试：在含各浓度提取物的孔中分别加入稀释菌液100μl；在一组稀释提取物孔中加入100μl培养基作为空白对照。经充分混匀后，培养板置湿盒中37℃孵育过夜。取各菌液30μl，用生理盐水10倍稀释，100μl涂布于培养平板，置37℃孵育过夜，计数菌落数。
杀菌率＝(1-细菌数量/生长对照细菌数量)×100
MBC50和MBC90由GraphPad Prism(Version7.04)采用非线性回归分析方式计算，其中MBC50：到达50％杀菌效果的最低浓度；MBC90：到达90％杀菌效果的最低浓度。
3、实验结果
表1 青钱柳、普洱茶叶水提物对细菌的MBC50和MBC90
Figure BDA0002649270240000041
Figure BDA0002649270240000051
从图1～3可以看出，本发明的青钱柳叶水提物对受试菌均有不同程度的杀伤作用，且杀伤能力随浓度递增。青钱柳叶水提物对细菌的杀伤作用大小依次为：金黄色葡萄球菌ATCC25923≈表皮葡萄球菌ATCC8099≈肺炎链球菌ATCC6303＞嗜酸乳杆菌ATCC4356＞乙型溶血性链球菌＞大肠杆菌CMCC44155＞腐生葡萄球菌＞大肠杆菌ATCC25922＞甲型溶血性链球菌。
此外，与对照普洱茶叶水提物相比，除对肺炎链球菌外，青钱柳水提物的杀菌作用均强于对照普洱茶叶水提物。
进一步计算得出青钱柳叶和普洱茶叶水提物杀菌作用的MBC50和MBC90，结果如表1所示。可以看出，除肺炎链球菌外，青钱柳水提物达到50％和90％杀菌效果所需的最低浓度均比普洱茶叶水提物低。并且，在杀灭金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌上，两者的差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。说明青钱柳叶水提物的杀菌效果明显强于对照产品普洱茶叶水提物。
上述实验结果表明，本发明的青钱柳叶水提物能够有效抑制包括敏感菌株在内的多种细菌。
实验例2、青钱柳叶提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌作用测试
1、菌株和药物
菌株：普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)购自美国模式培养物研究所(AmericanType Culture Collection,ATCC)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus，MRSA)均分离自四川大学华西医院，由临床微生物室提供：MRSA-1(临床编号：1911101191)、MRSA-2(临床编号：1911081137)、MRSA-3(临床编号：1911051296)、MRSA-4(临床编号：1911051125)、MRSA-5(临床编号：1911081165)。
药物：实施例2制得的青钱柳叶提取物溶液，青霉素钠、苯唑西林钠和盐酸万古霉素(购买市售产品)。
2、细菌的培养
培养基：普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、MRSA-1、MRSA-2、MRSA-3、MRSA-4和MRSA-5的培养基均为MHB(Mueller-Hinton Broth)培养基。
培养条件：37℃，150rpm摇床培养。
3、实验方法
3.1mecA基因的鉴定
mecA基因是MRSA特有的耐药基因，对MRSA的耐药性起决定性的作用。本实验采用PCR法验证各菌株中是否存在mecA基因，具体方法如下：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各菌株的基因组DNA。提取步骤详见试剂盒说明。分别以各菌株的基因组DNA为模板，采用多重PCR技术扩增16S RNA和mecA基因449bp片段。采用的引物序列为：16S RNA上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.1)和下游引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.2)；mecA上游引物5'-CTCAGGTACTGCTATCCACC-3'(SEQ ID NO.3)和下游引物5'-CACTTGGTATATCTTCACC-3'(SEQID NO.4)。PCR扩增程序为：94℃3min，94℃45s，50℃45s，72℃1min30s，30循环，72℃5min。
3.2各菌株对青霉素钠、苯唑西林钠和青钱柳叶提取物的敏感性测试
参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)有关抗菌药物敏感性试验的方法和标准，验证各菌株对药物的耐药性。本测试所采用的MHB培养基均含2％NaCl(w/v)。
实验菌液的制备：分别接种各菌于5ml MHB培养基中，37℃摇床培养过夜，调整菌液麦氏比浊至0.5个麦氏单位后，再将菌液稀释100倍备用。最终菌液浓度为5×105cfu/ml。
青霉素钠、苯唑西林钠和盐酸万古霉素应用液的配制：精确称取100mg青霉素钠、苯唑西林钠或盐酸万古霉素溶于1ml去离子水中，经0.22μm滤过除菌，得青霉素钠、苯唑西林或盐酸万古霉素母液。吸取10.24μl青霉素钠、苯唑西林或盐酸万古霉素母液加入3.98976ml MHB培养基中，得256μg/ml的青霉素钠、苯唑西林钠或盐酸万古霉素应用液。
青钱柳叶提取物浓度梯度的配制：取实施例2制得青钱柳叶提取物溶液(0.488g/mL)100μl加入96孔板中第1和2孔。从第2孔起，加入培养基100μl连续对倍稀释至第9孔。设第10孔为培养基对照。从第1到第9孔，青钱柳叶提取物的浓度分别为244mg/ml、122mg/ml、61mg/ml、30.5mg/ml、15.25mg/ml、7.625mg/ml、3.8125mg/ml、1.90625mg/ml，0.953125mg/ml。
青霉素钠、和盐酸万古霉素苯唑西林钠浓度梯度的配置：取青霉素钠、苯唑西林钠或盐酸万古霉素应用液100μl加入96孔板中第1和2孔。从第2孔起，加入培养基100μl连续对倍稀释至第9孔。设第10孔为培养基对照。从第1到第9孔，青霉素钠、苯唑西林钠和万古霉素的浓度分别为：128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml。
敏感性测试：在各浓度的药物孔和培养基对照孔中分别加入上述制备的菌液100μl。置培养孔板于湿盒中34℃孵育24h。取各菌液20μl，用培养基做50倍稀释后，取100μl涂布于培养平板，置37℃孵育过夜。将无菌落生长的最低药物浓度判定为最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)。
3.3青钱柳叶提取物的杀菌作用测试
本测试所用MHB培养基均无NaCl添加。
实验菌液的制备：同3.2所述。
青钱柳叶提取物浓度梯度的配制：同3.2所述。
杀菌作用的测试：在各浓度青钱柳叶提取物孔和培养基对照孔中加入上述制备的菌液100μl。经充分混匀后，置湿盒中37℃孵育过夜。取各孔中菌液20μl，用MHB培养基10倍稀释，100μl涂布于培养平板，置37℃孵育过夜，计数菌落数。
杀菌率＝(1-药物组菌落数/培养基对照组菌落数)×100％
药物最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)由GraphPadPrism(Version7.04)采用非线性回归分析方式计算。MBC50为到达50％杀菌效果的最低浓度。
4、实验结果
4.1mecA基因的检测
从图4可以看出，在各MRSA菌株(MRSA-1、MRSA-2、MRSA-3、MRSA-4和MRSA-5)中均能检测到16S rRNA和mecA的表达；而在普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)中仅能检测到16SrRNA的表达。上述结果证实本实验所用MRSA临床分离株均为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株，而普通金黄色葡萄球菌(ATCC25923)为β-内酰胺类药物敏感株。
4.2各菌株对青霉素钠、苯唑西林钠、盐酸万古霉素和青钱柳叶提取物的敏感性比较
从表2可以看出，各MRSA菌株对青霉素钠和苯唑西林钠的敏感性均较普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)低，MRSA菌株的MIC是普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)的4～32倍，甚至更高。
各MRSA菌株对盐酸万古霉素的敏感性与普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)一致，这是因为盐酸万古霉素是一种对耐药金黄色葡萄球菌敏感的阳性药物，MRSA对盐酸万古霉素的抗菌作用无耐药性。
而各MRSA菌株对本发明青钱柳叶提取物的敏感性与普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)一致或更敏感。说明MRSA对本发明青钱柳叶提取物的抗菌作用无耐药性，本发明制得的青钱柳叶提取物能够有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。
表2 青霉素钠、苯唑西林钠和青钱柳叶提取物对各菌株的MIC
Figure BDA0002649270240000081
4.3青钱柳叶提取物的杀菌作用
表3 青钱柳叶提取物对各菌株的MBC50
Figure BDA0002649270240000082
从图5和表3可以看出，本发明制得的青钱柳叶提取物不仅对普通金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)有杀伤作用，对MRSA也有明显的杀伤作用，对MRSA的MBC50为1.682～3.135mg/ml。
所以，本发明制得的青钱柳叶提取物能够有效杀灭MRSA。
综上，本发明提供了青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品或化妆品中的用途。通过实验证明，本发明制得的青钱柳水提物对多种细菌均有明显的杀伤作用，特别的，其对敏感菌株(比如大肠杆菌ATCC25922)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株(MRSA)同时具有优异的杀伤作用。因此，青钱柳叶或其提取物在制备抗菌(特别是抗敏感菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株)的食品、日用品或化妆品中具有非常好的应用前景。

Claims (10)

1.青钱柳叶或其提取物在制备抗菌的食品、日用品或化妆品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述细菌为敏感菌株，所述敏感菌株优选为对β-内酰胺类抗生素敏感的菌株，更优选为大肠杆菌ATCC25922；
和/或，所述细菌为耐药性革兰氏阳性菌，优选为耐药性金黄色葡萄球菌，更优选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述细菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC8099、肺炎链球菌ATCC6303、嗜酸乳杆菌ATCC4356、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌CMCC44155、腐生葡萄球菌、甲型溶血性链球菌钟的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗菌的食品、日用品或化妆品能够杀灭细菌和/或抑制细菌的生长和繁殖。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于：所述青钱柳叶提取物为青钱柳叶水提物或有机溶剂提取物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述青钱柳叶水提物的制备方法为：取青钱柳叶，加水，加热提取，保留提取液，浓缩或干燥，即得。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述水的重量为青钱柳叶的5-30倍；所述加热温度为70-110゜C；所述提取时间为每次0.5-3小时；所述提取次数为1-4次；
优选地，所述水的重量为青钱柳叶的10-20倍；所述加热温度为90゜C；所述提取时间为每次1.5-2.0小时；所述提取次数为2次。
9.一种抗菌的食品、日用品或化妆品，其特征在于：所述抗菌的食品或化妆品是由青钱柳叶或其提取物为活性成分，加上食品、日用品或化妆品领域常用的辅料制备而成；优选的，所述青钱柳叶提取物如权利要求6-8任一项所述。
10.根据权利要求9所述抗菌的食品或化妆品，其特征在于：所述食品为粮食及其制品、食用油、肉及其制品、乳制品、饮料、酒、调味品、豆制品或糕点；
和/或，所述日用品为纸品，所述纸品优选为卷纸、抽纸、手帕纸、厨房用纸、洁面巾、抹布纸或擦手纸；
和/或，所述化妆品为面膜、洗面奶、护肤水、乳、日霜、晚霜、眼霜或精华。
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