KR101825675B1 - 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 n-, s-, p- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 상황버섯(Phellinus species) 추출물 또는 베타글루칸(β-glucan)은 간에서 FMO 유전자군 중에서 특히 FMO3의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질(xenobiotics) 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 조성물{A composition comprising the Phellinus species extracts or β-glucan for detoxification of N-, S-, P- containing xenobiotics}

본 발명은 상황버섯(Phellinus species) 추출물 또는 베타글루칸(β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질(xenobiotics) 분해 촉진용 조성물에 관한 것이다.

버섯류는 세계적으로 약 20,000여 종이 알려져 있으며 그 중 식용으로 개발 가능한 것은 약 2,000여 종이다. 국내 분포하는 버섯류는 약 992종이 기록되어 있고 이중 식용 버섯이 100여 종, 독버섯이 50여 종이며, 특히 맹독성을 가진 버섯이 20여 종으로 확인되어있다. 약 20여 종 이상의 버섯이 국내에서 재배가능하며 항암, 콜레스테롤 저하, 혈당강하 등이 입증된 바 있다. 전 세계적으로 상황버섯은 약 280여 종류가 존재한다. 대부분의 상황버섯은 노란색을 띠며 나이테 무늬를 형성하며 성장하는데, 현재 가장 널리 인공 재배되는 버섯 품종 중의 하나이다. 버섯은 유용한 생리 활성 대사 산물의 생산 및 의약품으로의 많은 재료로 큰 잠재력을 가지고있음이 알려져있다.

상황버섯(Phellinus species) 중 대표적인 것은 목질진흙버섯으로 Phellinus linteus라는 학명으로 알려져 있다. 그러나, 한국의 경우 대표적인 재배종은 상황버섯 바우미(Phellinus baumii)로 전체 상황 배재 농가의 98% 이상을 차지하고 있다. 특이하게 상황버섯 바우미가 식용으로 허용되고 건강증진 식품으로 활용되는 곳은 한국이 유일한 것으로 알려져 있으며, 현재까지 상황버섯으로부터 다양한 생리활성물질들의 분리 연구가 지속적으로 진행되고 있으며, 추출방법에 따른 상황버섯 추출물의 효능변화 및 평가가 검토되고 있다. 자실체 이외에 균사체에서도, 상황버섯 자실체와 유사한 혈액 항응고 활성, 항산화 효과, 항암작용, 위궤양 완화효과 및 항염증작용, 알츠하이머(Alzheimer) 질환 치료를 위한 베타 시크리타제(β-secretase) 저해활성 등의 다양한 생리활성이 보고되면서 상황버섯의 균사체 배양에 많은 연구가 집중되고 있으나, 상황버섯 또는 이로부터 분리된 물질의 니코틴 또는 농약 등의 생체외래물질(xenobiotics)의 분해 촉진 효과는 알려진바 없다.

베타글루칸(β-glucan)은 세균, 버섯, 효모 및 곡물 소스로부터 얻어지는 면역 조절자(immune modulators)로 알려져있고, 다당류를 발생시키고, 이러한 글루코스(glucose) 중합체(polymers)는 특정 병원성 세균 및 균류(fungi) 세포벽의 성분이다. 베타글루칸은 베타-1,6-연계된 곁사슬(side chain)에 상관없이 베타-1,3-연계된 베타-D-글루코피래노실(glucopyranosyl) 유니트(units)로 이루어져있고, 균류 세포벽 성분을 보존하고, 주요 PAMPs 중 하나로 인식되는 것으로 알려져있다(Brown, 2006).

오래전부터 담자균류의 고등균류는 일반적인 의약품으로 사용되었다. 버섯의 면역 강화작용 및 항종양 활성과 같은 의약적 효과는 베타글루칸에 의한 것이라고 본다. 왜냐하면 알파글루칸은 진핵 영양분 요소이고, 포유류의 효소에 쉽게 분해되고, 면역자극 활성이 없으나, 베타글루칸은 다양한 균류에서 유래되고, 경구 투여하였을 때 인간 효소에 의해 분해되지않으나, 대신 소장에서 점막 및 전신 면역을 자극하여 흡수된다(Vos et al., 2007). 흡수된 베타글루칸은 항종양 활성뿐만 아니라, 동물과 인간에 균류 및 세균에 의한 감염이 있을 때 숙주를 보호하는 능력을 활발하게 한다. 베타글루칸은 높은 분자량임에도 불구하고, 경구투여시 장에서 흡수되고, 선천적 및 후천적 면역력을 활성화시킨다.

베타글루칸은 글루코스 중합체이고, 백본(backbone)으로 선형 베타(1,3)-연계된 D-글루코스 분자와 다양한 크기의 베타(1,6)-연계된 곁사슬이 백본과 다른 간격으로 존재한다. 다양한 베타(1,3), 베타(1,4) 및 베타(1,6) 베타글루칸-연계 가운데 오직 베타(1,3)만 면역력을 활발하게 하고, 항종양 활성을 보인다. 처음 알려진 베타글루칸의 기능은 항종양 활성(Chihara et al., 1970)이고, 그 이후 항균(antifungal), 항감염(anti-infection)(Onderdonk et al., 1992), 방사선방호(radioprotective)(Gu et al., 2005), 콜레스테롤 감소(cholesterol reduction)(Wolever et al., 2011) 및 식후 당 대사 활성(postprandial glucose metabolic activities)(Battilana et al., 2001)을 포함하는 다른 많은 생물학적 활성이 보고되었다. 베타글루칸은 동물에서의 아스페르길루스(Aspergillus)(Torosantucci et al., 2005) 및 칸디다성 질염(Candida vaginal)(Pietrella et al., 2010) 감염 및 바다 물고기에서의 비브리오(Vibrio) 감염(Zhu et al., 2006)에서 면역강화 활성의 백신 또는 보조제 후보로 예방을 위해 사용되어졌다. 오트 및 보리와 같은 식물의 베타글루칸은 주로 베타(1,4) 연계된 것이고, 버섯 및 균류의 베타글루칸은 베타(1,3) 백본에 짧은 베타(1,6)-연계된 사이드체인으로 가지가 있다(Yan et al., 2005). 이러한 글루칸의 구조, 형태 및 소스의 차이는 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있음이 알려져있다(Brown and Gordon, 2001).

FMO(Flavin-containing monooxygenase)는 보조인자(cofactor) 플라빈(flavin)을 통해 주로 친핵체로써 기질의 산화를 촉진시키는 효소의 그룹이다. 사이토크롬(cytochrome) P450 효소와는 대조적으로 FMO는 일반적으로 생체외래물질(xenobiotic substance)에 의해 유도되거나 억제되지않는다. 인간 FMO는 조직 특성을 보이는데, FMO1은 인간 태아 간 및 성인 신장에 존재하고, FMO2는 폐에 존재하며, FMO3은 성인 간에 존재한다.

FMO는 폭넓고 중복된 특이도(specificity)를 가진 미세소체(microsomal) 산화(oxidative) 효소의 두번째 군이다. FMO의 주요 반응은 헤테로 원자(hetero-atom)의 유형이 각각 N-옥시드(oxide), S-옥시드 또는 P-옥시드인 질소(nitrogen), 황(sulfur) 또는 인(phosphorus) 헤테로 원자 화합물의 친핵성을 촉진시킨다. 사이토크롬 P450과 기능적인 부분이 중복되지만, 작용기전은 다르다. FMO는 효소에 기질이 결합하기 전에 분자 산소에 결합하고, 활성화한다. 또한, 보조인자로 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드(flavin adenosine dinucleotide, FAD)를 필요로 한다. 사이토크롬 P450 효소와는 달리 FMO는 열에 민감하고, 신진대사를 연구하는 연구자들이 효소 시스템을 구별하는데 유용하게 사용할 수 있다.

FMO3는 체내에서 N-, S- 및 P-를 함유하는 다양한 생체외래물질(xenobiotics)를 대사시켜 분해함이 알려져있고, 이러한 생체외래물질로는 니코틴, 농약 및 비스테로이드계 항염증제 등이 있다.

구체적으로, 흡연자에 있어서 니코틴(Nicotine)은 흡수된 뒤에 뇌(투여 5분 후 투여량의 8%까지 축적), 신장(투여량의 14% 이상 축적), 위점막, 부신수질, 코 점막 및 침샘에 농축된다. 또한, 체내에 축적된 니코틴은 암 질환, 고혈압, 구강질환 초래, 위산과다분비 촉진에 따른 각종 위장질환과 동맥경화증을 비롯한 각종 순환계 질환을 일으킬 수 있으며, 노화촉진 등에 중요한 요인으로 작용하여 심하면 발작, 경련 및 호흡마비, 근육경련 및 불필요한 혈압상승 등을 유발한다. 이러한 니코틴은 FMO3에 의해 니코틴-1-N-옥사이드(Nicotine-1-N-oxide)로 분해되며, 이것의 대부분은 그대로 소변으로 배출된다고 알려져있다.

또한, 농약은 농작물에 해로운 벌레, 병균, 잡초 따위를 없애거나 농작물이 잘 자라게하는 약품으로, 살충제, 살균제, 발아제 및 생장 촉진제 등이 있다. 농작물에 뿌린 농약은 그 농작물을 섭취한 사람 또는 동물에 흡수되어 체내 축적되기 쉽다. 농약은 아트라진, 알라클로, 카벤다짐 외에 수많은 종류가 있다.

아트라진(Atrazine)은 하기 화학식 1의 구조를 가진 s-트리아진계의 이행형 비호르몬성 제초제로 이 물질이 힐반응을 저해한다는 점에서 주요한 제초작용기구는 광합성의 저해작용이라 보고 있으며 일반적으로 토양 처리용으로 사용한다. 아트라진에 내성이 있는 옥수수에서는 아트라진 2위의 염소를 S-글루타티온(glutathione)으로 치환하여 불활성화하는 기구가 알려져 있다. 또한 내성을 획득한 식물 혹은 내성변이체의 대부분은 아트라진의 표적단백질인 엽록체의 D-1 단백질이 변이되어 있어, 이러한 변이형 유전자를 도입하여 아트라진 내성의 식물을 만들어내고 있다.

알라클로(Alachlor)는 하기 화학식 2의 구조로 옥수수, 콩, 감자 등의 경작에 사용되는 제초제로서 토양에 방출되면 광분해와 미생물에 의한 분해가 빨리 진행되나, 인체에 축적될 경우 염색체 이상 및 위장, 갑상선, 비장 등에서 암을 유발한다고 알려져있다.

카벤다짐(Carbendazim)은 이의 잔류에 관해 1973년에 평가되었고, 다시 1994년(잔류(residues)) 및 1995년(독성학 및 환경)에 평가되었다. CCPR(잔류농약분과)은 위험성 평가가 요구되고, UK에 의해 규정된 정보에 기초하여 잔류의 정의를 재고할 것을 권장하였다(ALINORM 97/24, para 51). UK는 카벤다짐으로 발현되는 티오파네이트-메틸(thiophanate-methyl), 베노밀(benomyl) 및 카벤다짐의 합을 잔류 정의로 표현했다. 최대 잔류 한계(MRLs, maximum residue limits)는 직접적인 사용 또는 대사 산물로 발생되는 카벤다짐 잔류를 포함한다. 데이터는 주요 제조업체 및 네덜란드 정부에 의해 제공되었다. 카벤다짐은 하기 화학식 1의 구조를 갖고, ISO에서는 카벤다짐으로 부르고, 화학적으로 IUPAC는 Methyl benzimidazol-2-ylcarbamate로 부르며, CA는 Methyl 1H-benzimidazol-2-ylcarbamate로 부르고, CAS 등록번호는 10605-21-7이다.

비스테로이드성 소염진통제(non-steroidal anti-inflammatorydrugs, NSAIDs)는 소염, 진통 및 해열효과를 가진 비마약성, 비스테로이성 제제이다. 쉽고 간편하게 이용하는 이러한 비스테로이드성 소염진통제의 투약 및 축적에 의한 부작용으로 간, 신장, 청력 등에 손상을 준다고 많이 알려지고있다.

벤지다민(Benzydamine)은 하기 화학식 4의 구조로 국소적으로 작용하는 비스테로이드성 소염진통제로, 입과 목구멍에서 국소 마취, 통증 경감을 위한 진통제 및 염증상태에서 항염증 치료에 사용할 수 있다.

상기 벤지다민과 비슷한 비스테로이드성 소염진통제로 하기 화학식 5의 메틸 p-토릴 설파이드(methyl p-tolyl sulfide, MTS) 및 하기 화학식 6의 수린닥 설파이드(sulindac sulfide) 등이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과, FMO3 유전자 발현이 증가하면 체내 니코틴 또는 농약과 같은 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질의 분해가 촉진됨을 확인하였고, 상황버섯 추출물 및 상황버섯에서 분리한 베타글루칸을 동물 모델에 경구투여할 경우, 간에서 FMO3의 발현이 현저히 증가하며, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상황버섯 추출물 및 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상황버섯(Phellinus species) 추출물 또는 베타글루칸(β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질(xenobiotics) 분해 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상황버섯(Phellinus species) 추출물을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질(xenobiotics) 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 베타글루칸(β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 상황버섯(Phellinus species) 추출물 또는 베타글루칸(β-glucan)은 간에서 FMO 유전자군 중에서 특히 FMO3의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질(xenobiotics) 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 상황버섯(Phellinus species) 열수추출물(PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 히스토그램(histogram)으로 나타낸 도이다.
도 1b는 상황버섯 열수추출물(PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상자그림(box plot)으로 나타낸 도이다.
도 1c는 상황버섯 열수추출물(PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 MA plot으로 나타낸 도이다.
도 1d는 상황버섯 열수추출물(PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상관분석 산점도(correlation scatter plot)로 나타낸 도이다.
도 2a는 상황버섯 열수추출물(PBE) 단일투여군에서의 계층적 클러스터링 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 상황버섯 열수추출물(PBE) 단일투여군에서의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도이다.
도 3a는 상황버섯 열수추출물(PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 히스토그램으로 나타낸 도이다.
도 3b는 상황버섯 열수추출물(PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상자그림으로 나타낸 도이다.
도 3c는 상황버섯 열수추출물(PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 MA plot으로 나타낸 도이다.
도 3d는 상황버섯 열수추출물(PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상관분석 산점도로 나타낸 도이다.
도 4a는 상황버섯 열수추출물(PBE) 다중투여군에서의 계층적 클러스터링 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 상황버섯 열수추출물(PBE) 다중투여군에서의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도이다.
도 5는 상황버섯 열수추출물(PBE) 투여군에서의 RNA 품질(quality)를 확인한 도이다:
Cont: 대조군; 및
PBE: 상황버섯 열수추출물 처리군.
도 6은 마우스 조직에 따른 FMO(Flavin-containing monooxygenase) 유전자의 발현을 확인한 도이다:
Tissues: 조직 종류;
Liver: 간 조직;
Lung: 폐 조직; 및
Kidney; 신장 조직.
도 7은 마우스 조직별 추출물 처리에 따른 FMO 유전자의 발현 변화를 확인한 도이다:
Tissues: 조직 종류;
Liver: 간 조직;
Lung: 폐 조직;
Kidney; 신장 조직;
Cont: 대조군;
PBE: 상황버섯 열수추출물 처리군;
PBW: 상황버섯 수층분획물 처리군;
PBG: 상황버섯 베타글루칸 처리군;
20: 20 ㎎/㎏; 및
100: 100 ㎎/㎏.
도 8a 내지 도 8b는 카벤다짐 1 ㎎/㎖을 경구 투여한 후 고속액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC) 분석한 결과를 나타낸 도이며, (A)는 카벤다짐의 기준을 나타낸 결과이고, (B)는 경구투여 30분 후 결과이며, (C)는 경구투여 1시간 후 결과이고, (D)는 경구투여 1.5시간 후 결과이며, (E)는 경구투여 2시간 후 결과이고, (F)는 경구투여 6시간 후 결과이며, (G)는 경구투여 12시간 후 결과이다.
도 9a 내지 도 9b는 상황버섯 열수추출물(PBE) 20 ㎎/㎏을 하루에 한번 7일 동안 투여한 후, 카벤다짐 500 ㎎/㎏을 경구 투여한 후 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도이며, (A)는 카벤다짐 경구투여 30분 후 결과이고, (B)는 카벤다짐 경구투여 1시간 후 결과이며, (C)는 카벤다짐 경구투여 1.5시간 후 결과이고, (D)는 카벤다짐 경구투여 2시간 후 결과이며, (E)는 카벤다짐 경구투여 6시간 후 결과이고, (F)는 카벤다짐 경구투여 12시간 후 결과이다.
도 10a 내지 도 10b는 상황버섯 열수추출물(PBE) 100 ㎎/㎏을 하루에 한번 7일 동안 투여한 후, 카벤다짐 500 ㎎/㎏을 경구 투여한 후 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도이며, (A)는 카벤다짐 경구투여 30분 후 결과이고, (B)는 카벤다짐 경구투여 1시간 후 결과이며, (C)는 카벤다짐 경구투여 1.5시간 후 결과이고, (D)는 카벤다짐 경구투여 2시간 후 결과이며, (E)는 카벤다짐 경구투여 6시간 후 결과이고, (F)는 카벤다짐 경구투여 12시간 후 결과이다.
도 11은 HPLC로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상황버섯(Phellinus species) 추출물 또는 베타글루칸(β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질(xenobiotics) 분해 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 상황버섯 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

1) 상황버섯에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매는 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출용매는 건조된 상황버섯에 10 내지 100배로 하는 것이 바람직하고, 20 내지 50배 첨가하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출온도는 70 내지 140℃인 것이 바람직하고, 85 내지 110℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출시간은 1 내지 36시간인 것이 바람직하고, 9 내지 24시간인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 상황버섯은 상황버섯 바우미(Phellinus baumii) 또는 상황버섯 린테우스(Phellinus linteus)인 것이 바람직하고, 상황버섯 바우미인 것이 더욱 바람직하다.

상기 베타글루칸은 담자균류, 식물 및 진균류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것이 바람직하고, 상황버섯, 영지버섯(Ganoderma lucidum), 동충하초(vegetable worms)와 같은 담자균류, 보리와 같은 식물 및 효모를 비롯한 진균류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 FMO3(Flavin-containing monooxygenase3) 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 N-, S-, P- 함유 생체외래물질은 체내에 축적되는 니코틴, 농약 및 비스테로이드계 항염증제로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 니코틴 또는 농약인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 농약은 살충제, 살균제 및 제초제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 FMO3 유전자는 서열번호: 13(GenBank 등록번호: NM_008030)으로 나타내는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상황버섯 열수추출물, 상황버섯 수층분획물 및 상황버섯 베타글루칸을 제조하였고, 이를 단일투여(24시간)와 다중투여(7일)로 나눠 각각 하루에 한번 경구투여한 후, 단일투여군과 다중투여군에서의 간 유전자의 발현 변화를 확인하였고(도 1a 내지 도 4b 참조), 상황버섯 열수추출물(PBE)을 투여한 마우스에서의 FMO 유전자의 발현 변화를 확인한 결과, 단일투여와 다중투여 모두에서 FMO3 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(표 4 참조), 조직에서의 RNA 품질(quality)를 시각화하여 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 마우스 조직에 따라 FMO 유전자의 발현을 확인한 결과, 같은 FMO 유전자군(gene family)이더라도 조직에 따라 발현량의 차이가 나는 것을 확인하였고(도 6 참조), 상황버섯 열수추출물(PBE), 상황버섯 수층분획물(PBW) 및 상황버섯 베타글루칸(PBG)을 처리함에 따라 조직에서의 FMO 유전자의 발현 변화를 확인한 결과, 간에서의 FMO3와 신장에서의 FMO4에서 처리 농도에 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 7 참조).

또한, 본 발명자들은 고속액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC) 분석을 통해 상황버섯 열수추출물을 전투여한 후, 카벤다짐을 투여하여 농약의 분해를 확인한 결과, 상황버섯 열수추출물을 투여하지 않았을 때보다, 상황버섯 열수추출물을 투여했을 때 마우스 체내 남아있는 카벤다짐의 양이 투여한 상황버섯 열수추출물 농도에 비례하게 감소하는 것을 확인하였다(도 8a 내지 도 11 참조).

따라서, 본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FMO 유전자군 중에서 특히 FMO3의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진제를 제공한다.

본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FMO 유전자군 중에서 특히 FMO3의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법을 제공한다.

상기 인간을 제외한 개체는 인간만을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 소, 닭, 오리, 개, 고양이 등의 동물을 의미한다.

상기 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법은 비록 인간을 제외한 동물을 대상으로 하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 N-, S-, P- 함유 생체외래물질 분해 촉진 방법에 의해 생체외래물질 분해 촉진에 충분히 사용되어 질 수 있다.

본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FMO 유전자군 중에서 특히 FMO3의 발현을 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질 분해 촉진 방법으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

통계처리

실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 모든 측정은 최소 3번씩 수행하였다. 평균값의 집단 간 비교는 InStat 3.06(GraphPad software Inc., 미국)을 이용하여 ANOVA 단방향 분석으로 수행하였다. 유의성 있는 p값은 ≤0.05로 표기하였다.

< 실시예 1> 상황버섯( Phellinus baumii ) 추출물의 제조

<1-1> 상황버섯 열수추출물( Phellinus baumii extract, PBE)의 제조

본 발명자들은 상황버섯 추출물을 제조함에 있어서, 추출 수율은 온도, 정제수의 양, pH, 추출시간 및 상황버섯 조각 등의 추출 상태에 따라 달라지게 되는 것을 확인하였다. 보통 추출 온도는 85℃, 90℃, 95℃, 100℃, 105℃ 및 110℃이고, 추출 시간은 9시간, 18시간 및 24시간이다. 이에, 상황버섯을 건조시켜 조각을 낸 후, 상황버섯 조각 4 g 또는 10 g에 정제수 200 ㎖(20배 또는 50배)를 넣고, 현탁액을 여과한 후, 추출 수율을 측정하였다.

또한, 상기 방법을 이용하여 추출물을 대량생산 하였다. 200 ℓ 추출기에 잘게 썬 상황버섯 조각과 20 ℓ 정제수를 넣고, 24시간 동안 110℃에서 20번 추출하였고, 여과장치로 여과한 후, 여과액을 농축하였다. 이를 각각 감압하에 동결건조하였다. 추출 수율은 하기 표 1에 나타내었다.

샘플	규모	버섯 용량	추출	동결건조 분말	추출 수율(%)
상황버섯	400 ℓ	20 ㎏	350±10 ℓ	1050 g	5.3

본 연구에서 상황버섯 열수추출물은 국내에서 재배한 상황버섯 자실체를 구입하여 제조하였다.

구체적으로, 상황버섯 자실체 100 g 을 2000 ㎖의 증류수를 넣고 100℃의 중탕으로 24시간 추출하였다. 추출액을 여과하여 보관한 후 잔사에 다시 2000 ㎖의 증류수를 넣고 100℃의 중탕으로 24시간 추출하여 총 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 100 ㎖로 감압농축한 후에 동결건조시켜 상황버섯 열수추출물(Phellinus baumii extract, PBE)을 얻었다.

<1-2> 상황버섯 수층분획물( Phellinus baumii water fraction, PBW) 및 상황버섯 베타글루칸( Phellinus baumii β-Glucan, PBG)의 제조

국내에서 재배한 상황버섯 자실체를 구입하여 공지된 방법을 이용하여 베타글루칸을 정제하였다.

구체적으로, 상황버섯 자실체 100 g 을 2000 ㎖의 증류수를 넣고 100℃의 중탕으로 24시간 추출하였다. 추출액을 여과하여 보관한 후 잔사에 다시 2000 ㎖의 증류수를 넣고 100℃의 중탕으로 24시간 추출하여 총 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 100 ㎖로 감압농축한 후에 4℃로 만든 다음 감압농축액에 -20℃로 빙냉시킨 300 ㎖ 에탄올(약 3배)을 넣고 4시간 동안 4℃에 두었다. 4시간 후, 침전물이 베타글루칸이고, 상기 분리한 베타글루칸을 Beta-glucan assay kit(Megazyme.co)를 이용하여 확인하였으며, 이를 동결 건조하여 상황버섯 베타글루칸(Phellinus baumii β-Glucan, PBG)이라 칭하였다. 한편, 상황버섯 열수추출물 중에서 에탄올에 침전하지 않는 상등액은 여과지로 여과한 후에 농축한 후에 동결건조하여 상황버섯 수층분획물(Phellinus baumii water fraction, PBW)이라 칭하였다.

< 실시예 2> 세포 배양 및 동물 모델 디자인

<2-1> 세포 배양

마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포(ATCC, Rockville, MD)를 페니실린(penicillin)(10,000 units/㎖)-스트렙토마이신(streptomycin)(10,000 units/㎖) 및 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco-BRL, 미국)을 첨가한 DMEM 배지로 계대배양하였고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. T-25 플라스크(flask)에 배양하여, 계대배양 할 때는 10X 트립신(Trypsin)-EDTA 용액을 DMEM을 이용하여 10배 희석하여 사용하였다. 조직배양 플라스크에 배양된 Raw 264.7 세포에 1X 트립신-EDTA 용액을 넣고 37℃에 10분간 혼합시킨 후, 트립신 반응에 의해 단일세포로 만들어주고, 이러한 반응을 종결하기위해 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 첨가한 후, 2번 세척하였다. 이 후 낮은 온도에서 원심분리한 후 계대배양 하였다.

<2-2> 동물 모델 디자인

체중 25 내지 30 g의 5주령 수컷 MPF(murine pathogen free, outbred-mouse) ICR 마우스를 샘타코(Samtako Bio Korea)에서 구입하여 경구투여 실험동물로 사용하였다. 마우스는 물과 식이는 자유롭게 먹을 수 있도록 하였고, 조명 사이클을 12시간은 밝게, 12시간은 어둡게 설정하였다. 방은 22.5℃ 온도에, 42.5% 습도로 유지하였다.

상황버섯 열수추출물은 동결건조시킨 분말을 사용하여, 증류수에 용해시켜 경구투여하였다. 실험 그룹은 대조군(control, n=2), 100 ㎎/㎏의 수용성 상황버섯 열수추출물 처리군(PBE-100, n=2)으로 나누었고, 단일투여(24시간)와 다중투여(7일)로 나눠 하루에 한번 경구 투여하였다.

또한, 상황버섯 열수추출물(PBE), 상황버섯 수층분획물(PBW) 및 상황버섯 베타글루칸(PBG)은 동결건조시킨 분말을 사용하여, 증류수에 용해시켜 경구투여하였으며, 실험 그룹은 대조군(control, n=3), 20 ㎎/㎏의 상황버섯 열수추출물 처리군(PBE-20, n=3), 100 ㎎/㎏의 상황버섯 열수추출물 처리군(PBE-100, n=3), 20 ㎎/㎏의 상황버섯 수층분획물 처리군(PBW-20, n=3), 100 ㎎/㎏의 상황버섯 수층분획물 처리군(PBW-100, n=3), 20 ㎎/㎏의 상황버섯 베타글루칸 처리군(PBG-20, n=3) 및 100 ㎎/㎏의 상황버섯 베타글루칸 처리군(PBG-100, n=3)으로 나누었고, 7일간 하루에 한번 경구 투여하였다.

<2-3> 농약(pesticide) 경구투여 동물 모델

상황버섯 추출물(PBE) 또는 베타글루칸 20 및 100 ㎎/㎏을 7일간 하루에 한번 경구 투여한 후, 올리브오일에 현탁한(suspended) 카벤다짐(carbendazim)(Methyl benzimidazol-2ylcarbamate BCM, Methyl 2benzimidazolecarbamate C9H9N3O2, FW 191.19)(Sigma Aldrich Chemical) 500 ㎎/㎏을 투여하였고, 대조군으로 단일 위관 영양법(gavage)을 투여한 마우스에 카벤다짐 500 ㎎/㎏을 투여하였다.

< 실시예 3> 단일투여군에서의 간 유전자의 발현 변화 분석

상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델을 가지고 간에서 샘플을 얻어 마이크로어레이(microarray) 방법을 통해 간 유전자의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델 중 단일투여군 마우스를 디클로로메탄(dichloromethan, CH₂Cl₂)으로 안락사시킨 후, 2 ㎖ 튜브에 150 ㎎ 조직을 얻고, RNA를 얻기 위해 -20℃ 이하로 샘플을 보관하였다. Mouse Gene 1.0 ST array(Affymetrix Inc)를 사용하여 마이크로어레이를 수행하여, OD 260/280 비로 확인하였다. 이렇게 확인한 결과를 히스토그램(histogram), 상자그림(box plot), MA plot 및 상관분석 산점도(correlation scatter plot)을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 1a 내지 도 1d에 나타내 바와 같이, 간 유전자 발현 양상을 확인하였다(도 1a 내지 1d).

또한, 상기 결과를 토대로 주요 유전자를 분석하여 대조군과 비교하여 상황버섯 열수추출물(PBE)을 100 mg/kg의 농도로 단회 경구투여한 실험군에서의 발현양상 변화를 하기 표 2에 나타내었다.

분석 디자인	cutoff	조절	주요 유전자의 수	유전자 온톨로지 정보의 수	경로 정보의 수
대조군 vs PBE-100	1.3	다운	1264	901	282
		업	1184	925	349
	1.5	다운	292	184	75
		업	328	226	93
	2	다운	61	31	14
		업	45	36	18
	3	다운	22	1	0
		업	9	8	7

또한, 상기 <표 2>를 바탕으로 cutoff 2.0으로 설정하여, 계층적 클러스터링(clustering)을 이용하여 특정 유전자 클러스터링을 수행하였다.

그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 상황버섯 열수추출물 처리군의 계층적 클러스터링 결과를 확인하였고, 이의 유전자 발현 패턴을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).

< 실시예 4> 다중투여군에서의 간 유전자의 발현 변화 분석

상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델을 가지고 간에서 샘플을 얻어 마이크로어레이(microarray) 방법을 통해 간 유전자의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델 중 다중투여군 마우스를 가지고, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 분석하였다.

그 결과 도 3a 내지 도 3d에 나타내 바와 같이, 간 유전자 발현 양상을 확인하였다(도 3a 내지 3d).

또한, 상기 결과를 토대로 주요 유전자를 분석하여 대조군과 비교하여 상황버섯 열수추출물(PBE)을 100 mg/kg의 농도로 7일간 다중 경구투여한 실험군에서의 발현양상 변화를 하기 표 3에 나타내었다.

분석 디자인	cutoff	조절	주요 유전자의 수	유전자 온톨로지 정보의 수	경로 정보의 수
대조군 vs PBE-100	1.3	다운	1153	864	300
		업	1358	1092	349
	1.5	다운	304	219	86
		업	368	300	93
	2	다운	51	38	17
		업	87	81	26
	3	다운	19	13	5
		업	24	22	8

또한, 상기 <표 3>를 바탕으로 cutoff 2.0으로 설정하여, 계층적 클러스터링(clustering)을 이용하여 특정 유전자 클러스터링을 수행하였다.

그 결과 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 상황버섯 열수추출물 처리군의 계층적 클러스터링 결과를 확인하였고, 이의 유전자 발현 패턴을 확인하였다(도 4a 및 도 4b).

< 실시예 5> FMO ( Flavin - containing monooxygenase ) 유전자의 발현 변화 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법을 사용하여 얻은 상황버섯 열수추출물(PBE)을 경구투여한 ICR 마우스의 간조직(liver tissue)에서의 FMO 유전자의 발현 변화를 확인하였다.

FMO 종류	상황버섯 열수추출물 경구투여 후 간조직에서의 유전자 발현
	단일투여	다중투여
FMO1	변화없음	변화없음
FMO2	변화없음	3.8배 증가
FMO3	5.13배 증가	17.6배 증가
FMO4	변화없음	3.14배 증가
FMO5	변화없음	변화없음

그 결과 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 단일투여의 경우에는 FMO3 유전자만 5.13배 증가하였고, 다중투여의 경우에는 FMO2는 3.8배, FMO3는 17.6배 및 FMO4는 3.14배 증가하는 것을 확인하였다(표 4).

< 실시예 6> RNA 품질( quality ) 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 얻은 조직에서 RNA를 얻어 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 이용하여 18S 리보솜 RNA(rRNA) 및 28S rRNA를 시각화하여 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 단일투여의 경우 rRNA의 integrity가 1.6 및 1.7로 나타났고, 다중투여의 경우 rRNA의 integrity가 2.4 및 2.4로 나타남을 확인하였다(도 5).

< 실시예 7> 마우스 조직에 따른 FMO 유전자의 발현 확인

마우스 간, 폐 및 신장 조직에서의 FMO 유전자 발현을 확인하였다.

구체적으로, 마우스를 디클로로메탄(dichloromethan, CH₂Cl₂)으로 안락사시킨 후, 간, 폐 및 신장 조직을 얻고, 실험 전 얼려서 보관해둔다. 냉동된 조직을 절단하고, 트리졸(Trizol) 시약 1 ㎖을 넣어서 균질화(homogenized)한 후, 샘플을 5분 동안 실온에 보관한다. 이에 0.2 ㎖ 클로로포름(chloroform)을 넣고, 튜브를 15초 동안 강하게 볼텍스(vortex)하고, 2 내지 3분 동안 보관한다. 이 후, 샘플을 4℃에서 15분 동안 12000 rpm으로 원심분리하면 혼합물은 빨간색으로 보이는 아래쪽에 페놀(phenol)-클로로포름 층과 색이 없는 위쪽의 물층으로 나뉜다. 물층을 새로운 튜브로 옮기고, 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 0.5 ㎖을 넣고, 균질화한 후, 실온에서 10분간 보관한 후, 4℃에서 15분 동안 12000 rpm으로 원심분리한다. 상층액을 제거하고, 침전된 RNA 펠렛(pellet)을 75% 에탄올(ethanol)(100% EtOH 35 ㎖+DEPC water 15 ㎖) 1 ㎖로 한 번 세척한 후, 샘플을 볼텍스로 섞어주고, 4℃에서 5분 동안 7500 rpm으로 원심분리하였다. RNA 펠렛은 건조시킨 후, 50 ㎕ RNase-free water를 첨가하고, 56℃에서 10분간 보관하였다. 이렇게 얻은 RNA의 농도는 NanoDrop 2000 UV 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다. 얻은 RNA를 M-MLV 역전사효소(Moloney Murine Leukemia Virus reverse Transcriptase)(Promega, 미국)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. RNA/프라이머 혼합물은 멸균된 PCR 튜브에 5 ㎍ RNA, 올리고(dT)(0.5 ㎍/㎕) 1 ㎕, DEPC 처리한 물을 10 ㎕까지 넣어주고, 70℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 얼음에 최소 5분간 놓아둔다. 반응 혼합물은 5 X 반응 완충용액 4 ㎕, 10 mM dNTP 혼합물 2 ㎕, 증류수 2.4 ㎕, RNase 억제제(inhibitor) 0.1 ㎕로 혼합하여 각 RNA/프라이머 혼합물과 부드럽게 섞어주고, 간단히 원심분리하여 모아준다. 이를 42℃에 3분간 놓아둔 후, 1 ㎕ M-MLV 역전사효소를 넣고, 섞어준 후 42℃에 60분 동안 놓아둔다. 반응 종결은 70℃에 5분간 놓아두고, 얼음에 놓아 식혀준 후, 간단히 원심분리하여 반응물을 얻는다. 이렇게 얻은 반응물은 바로 PCR 하거나, 실험 전까지 -20℃에 보관한다.

RT-PCR은 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR 튜브에 주행 RNA 1 ㎍와 역방향 프라이머를 섞어주고, 5분간 70℃에서 반응시킨 후 얼음에 놓아둔다. 이에 정방향 프라이머를 넣어주고, 반응 볼륨이 20 ㎕가 되도록 DEPC 물로 채워준다. 이를 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 PCR 조건으로 수행하였다. PCR 결과물은 1.0% 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동으로 확인하였고, 이미지는 LAS-3000으로 확인하였다.

목적 유전자	프라이머
	이름	서열	방향	사용된 조직	서열번호
FMO1	FMO1_F	CAT TCC AAC TAC AAG GAC TCG	정방향	신장	서열번호: 1
	FMO1_R	TGT CTC TGG ACA GTG GGA AGT	역방향		서열번호: 2
FMO2	FMO2_F	CCG GGT CTT TAA GGG TTT CAG G	정방향	폐	서열번호: 3
	FMO2_R	AGG CTC CAT CTT CCC AAC CGT A	역방향		서열번호: 4
FMO3	FMO3_F	CAG CAT TTA CCA ATC GGT CTT C	정방향	간	서열번호: 5
	FMO3_R	TTG CTG TGA TGC ATG AAG TTG	역방향		서열번호: 6
FMO4	FMO4_F	TCC TGA GCC CAC ATT TAC CTC	정방향	신장	서열번호: 7
	FMO4_R	CCA GTG TTT CCA AGA CCA ACC	역방향		서열번호: 8
FMO5	FMO5_F	GCT TGC CTA CAC GGT TCA AG	정방향	간	서열번호: 9
	FMO5_R	ATC ACA CGG ATG CTC ACC TG	역방향		서열번호: 10
GAPDH	GAPDH_F	AGC CTC GTC CCG TAG ACA AA	정방향		서열번호: 11
	GAPDH_R	CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC	역방향		서열번호: 12

PCR cycle		온도	시간
1 cycle	initial denaturation	95℃	2분
30cycle	denaturation	95℃	30초
	annealing	55℃	30초
	elongation	72℃	1분
1cycle	final elongation	72℃	5분

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 같은 FMO 유전자군(gene family) 이더라도 조직에 따라 발현량의 차이가 나타나는 것을 확인하였다(도 6).

< 실시예 8> 마우스 조직별 추출물 처리에 따른 FMO 유전자의 발현 변화 확인

마우스 간, 폐 및 신장 조직에서의 추출물 처리에 따른 FMO 유전자 발현변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 추출물을 경구투여한 동물 모델을 가지고, 상기 <실시예 7>과 동일한 실험 방법으로 RT-PCR을 통해 확인하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 5>와 비슷한 결과로 간에서의 FMO3 및 신장에서의 FMO4에서 상황버섯 열수추출물(PBE), 상황버섯 수층분획물(PBW) 및 상황버섯 베타글루칸(PBG)을 처리한 군에서 처리하지않았을 때보다 농도 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였고, 상황버섯 열수추출물이나 상황버섯 수층분획물보다 상황버섯 베타글루칸을 처리한 군에서의 FMO3의 발현 변화가 더욱 확실하게 나타남을 확인하였다(도 7).

< 실시예 9> 고속액체크로마토그래피( High - performance liquid chromatography , HPLC)를 이용한 농약 분해 확인

<9-1> HPLC 를 위한 준비

상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 농약 경구투여한 동물 모델을 가지고 상황버섯 추출물의 농약 분해를 HPLC 방법을 이용하여 확인하기 위해 샘플 준비를 하였다.

구체적으로, 심장 천자(cardiac puncture)를 이용하여 혈액 샘플을 채취하였다. 마우스를 눕혀 놓고, 칼돌기연골(xiphoid cartilage) 뒤쪽으로 중간에서 약간 왼쪽에 25 내지 30 게이지(gauge) 바늘을 부착한 1 ㎖ 주사기를 삽입한다. 바늘이 심장에 들어가기 위해서는 흉골의 수평축에서 10 내지 30°로 삽입해야한다. 또한, 최대 심장 박동 시점에 즉시 심장 옆으로 접근하여 바늘이 1 ㎝ 정도 들어갔을 때 주사기를 당겨 혈액을 채취한다. 샘플은 7일간 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 투여한 후, 카벤다짐을 투여하고나서 0.5, 1, 1.5, 2, 6 및 12시간 마다 채취하였다. 이렇게 얻은 샘플은 혈액의 2배 용량의 메탄올(MeOH)을 넣고 30분 동안 흔들어 섞어준다(shaking). 이 후, 1700 g에서 15분 동안 원심분리하고, 유기용제(organic solvent) 층을 제거하고, HPLC 분석에 사용한다.

<9-2> HPLC 를 이용한 농약 분해 확인

상기 실시예 <9-1>의 방법을 이용하여 얻은 샘플을 가지고 HPLC 분석을 통해 농약 분해를 확인하였다.

구체적으로, HPLC는 Dionex(독일)를 사용하였다. 칼럼은 reverse phase column(C18, 250×4.6, 5 μm)을 이용하였다. 파장은 245 nm로 하였고, 샘플의 주입양은 20 μL로 하였다. 이동상으로는 메탄올:물(50:50)을 사용하였고, 유량(flow rate)은 1 ㎖/분으로 설정하였다.

그 결과 도 8a 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸을 투여하지않았을 때보다, 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸을 투여했을 때 마우스 체내 남아있는 카벤다짐의 양이 투여한 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸 농도에 비례하게 감소하는 것을 확인하였다(도 8a 내지 도 11).

지금까지의 결과를 토대로 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 경구투여 함으로써 간에서 FMO 유전자군 중에서 특히 FMO3의 발현을 크게 증가시키고, 카벤다짐의 분해를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 이용하여 FMO3의 발현을 증가시킴으로써 체내 니코틴 또는 농약과 같은 N-, S-, P-를 함유하는 생체외래물질의 분해가 촉진됨을 확인함으로써, 생체외래물질 분해 촉진용 조성물로 사용할 수 있다.

<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> A composition comprising the Phellinus species extracts or beta-glucan for detoxification of N-, S-, P- containing xenobiotics <130> 2014P-10-070 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO1_F <400> 1 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO1_R <400> 2 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO2_F <400> 3 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO2_R <400> 4 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO3_F <400> 5 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO3_R <400> 6 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO4_F <400> 7 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO4_R <400> 8 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO5_F <400> 9 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMO5_R <400> 10 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 11 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 12 cattccaact acaaggactc g 21 <210> 13 <211> 2020 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 attcggcacg agaaaggaag acaaagaaaa ggcacccatg aagaagaaag tggccatcat 60 tggagctggt gtcagtggcc tggctgccat caggagctgt ctggaggagg ggctggagcc 120 cacatgcttt gagaggagtg atgatgttgg gggcctgtgg aaattctcag accatataga 180 agagggcagg gccagcattt accaatcggt cttcaccaac tcttccaaag agatgatgtg 240 ttttccagac ttcccctatc ccgatgactt tcccaacttc atgcatcaca gcaagctcca 300 agaatacatc acttcatttg ccaaggaaaa gaacctcctg aaatacatac agtttgagac 360 acctgtaacc agtataaata aatgtcctaa tttctcaact actggcaaat gggaagtcac 420 cactgaaaag cacggtaaaa aagaaacagc tgtctttgat gctacaatga tttgttctgg 480 gcatcacata tttccccatg taccaaaaga ctcctttcca ggactgaacc gttttaaagg 540 caaatgcttc cacagcaggg actataagga accaggaata tggaagggaa aacgagtcct 600 ggtgattggc ctggggaact caggctgtga cattgctgca gaactcagcc atgtagctca 660 gaaggtcacc atcagctcta gaagtggttc ttgggtgatg agtcgagtct gggacgatgg 720 ctacccttgg gacatggtgg tgctcacacg gtttcaaact ttcctcaaaa acaacttacc 780 caccgccatc tctgactggt ggtacacaag gcagatgaat gccagattca agcacgaaaa 840 ctatggtttg gtgcctttaa acagaacact caggaaagag cccgtgttca atgatgagct 900 cccagcccgc atcctgtgtg gcatggtgac catcaagcct aatgtaaagg agttcacaga 960 gacgtccgct gtgtttgagg atgggaccat gtttgaggcc attgactgtg tcatctttgc 1020 cacaggctat ggttatgcct accccttcct ggatgactct attatcaaaa gcagaaataa 1080 tgaggtcact ttgtacaaag gtgtcttccc tcctcaacta gagaaaccaa ccatggcagt 1140 gattggcctg gtccagtccc tgggtgccac catccccata actgacctgc aggcacgctg 1200 ggcagcacaa gtaataaaag gaacttgcac tttgccttct gtaaacgaca tgatggatga 1260 cattgatgag aaaatggggg aaaagttcaa atggtatggc aatagcacca ccatccagac 1320 agattacatt gtttatatgg atgaactggc ctccttcatt ggtgcaaagc ccaatctcct 1380 atggctgttt ctcaaggatc ccaggttggc tgtagaagtg ttctttggcc cttgcagccc 1440 ctaccagttc cggctggtag gcccaggaaa gtggtcagga gcccggaacg ccatcctaac 1500 acagtgggac cgatcactga agcctatgaa gacgcgtgtc gtcagtaaag ttcagaagtc 1560 ttgctctcac ttctattccc gtttgctcag gctcctggct gttcccgttc tgctcattgc 1620 tttgttcctt gtgttgatct gatcgtgagt ccctctagaa tttctgagag tcactgacaa 1680 caaccagaca agaactttgc tatttaaaaa ttaagatttt tcacacctct ccctttcctg 1740 ttcaagatct tttgccagaa ctctagacgt taattagtaa gcaagacaat gttttgttct 1800 ggctttgtaa ctaagcccct ttcagaatca tgttgatctg cagtgggcat aagtcccttt 1860 ctctttaagt tccaccaaca atttgtaagg agaatggtat ttttatggac aacttgtatc 1920 atctcttgga acagttggac atgattcctt ttctctttta aacaatgctt gaaagatata 1980 cttcagattc agacagtgaa taaaatagag tatttagaat 2020

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 상황버섯 추출물로부터 분리된 베타글루칸(β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 농약 중독 예방 또는 치료용 약학적 조성물로;
   상기 농약은 카벤다짐(Carbendazim)인, 농약 중독 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 삭제
6. 제 4항에 있어서, 상기 베타글루칸은 FMO3(Flavin-containing monooxygenase3) 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 농약 중독 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 4항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 농약 중독 억제 방법.
    

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