CN113678833B

CN113678833B - 褪黑素在制备植物抗真菌剂中的应用

Info

Publication number: CN113678833B
Application number: CN202110958672.3A
Authority: CN
Inventors: 李国田; 李任建; 毕睿清
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113678833A

Abstract

本发明属于农业科学技术领域，尤其涉及褪黑素在制备植物抗真菌剂中的应用。褪黑素可以防治不同植物的真菌病害，作为杀菌佐剂可以有效降低农药残留，并发挥协同杀菌的效果，同时褪黑素可作为植物免疫诱导剂，增强植物免疫力。褪黑素价格低廉，商业化成熟，应用方法操作简便，投入成本低，绿色环保，见效快，并且与农药组合具有协同作用，联合使用能够大幅度提高农药药效，减少农药的使用量，有利于绿色防控和实现农业生态文明的可持续发展，可应用农业生产、科研、环保等众多领域，更加经济环保地降低病害造成的粮食损失。

Description

褪黑素在制备植物抗真菌剂中的应用

技术领域

本发明属于农业科学技术领域，尤其涉及褪黑素在制备植物抗真菌剂中的应用。

背景技术

褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是一种天然存在的小分子吲哚类神经激素，在动植物、微生物中广泛分布，并参与各种生命活动。褪黑素在人类中的研究和应用较为成熟，目前已经实现商业化，用于保健品调节人类睡眠、视网膜生理、增强免疫和抗衰老等。在植物中，多项研究表明褪黑素也广泛存在参与植物的生长调节、逆境胁迫和生物胁迫等。褪黑素作为对人体有益并且已经实现商业化的化合物，在农业领域应用报道甚少。

褪黑素已被报道对部分细菌病害和病毒病害有抑制作用，如由革兰氏阴性细菌黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)引起的水稻白叶枯病(Chen X,Sun C,LabordaP,Zha o Y,Palmer I,Fu ZQ,Qiu J,Liu F.Melatonin Treatment Inhibits the Growthof Xantho monasoryzaepv.oryzae.Front Microbiol.2018，4；9:2280.)和由水稻矮缩病毒(Rice dwarfvirus)引起的水稻矮缩病(Lu R,Liu Z,Shao Y,Sun F,Zhang Y,Cui J,Zhou Y,Shen W,Zhou T.Melatonin is responsible for rice resistance to ricestripe virus infection throu gh a nitric oxide-dependent pathway.VirolJ.2019，21；16(1):141.)。褪黑素作为潜力巨大的杀菌小分子，在病害防治方面具有重大的应用前景。但由于目前对褪黑素的具体抑菌机理尚不明确，且褪黑素并不是对所有的病菌都表现为抑制作用。

真菌是植物病害的主要病原体之一。真菌感染会导致多种疾病症状，严重时会发生大规模流行病，造成毁灭性的产量损失。最近的例子是由亚洲大豆锈病引起的流行病和由巴西稻瘟病菌在几个亚洲国家引起的小麦瘟疫爆发，以及由致病疫霉引起的爱尔兰马铃薯大饥荒。水稻真菌病害是影响水稻品质和产量的首要因素，包括Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病，以及坏死型真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的水稻纹枯病，稻曲病菌Ustilaginoidea virens引起的水稻稻曲病。

目前对水稻病害的防治措施主要通过种植抗病品种和喷施化学农药，其中选用广谱持久抗病性材料是控制水稻病害的最有效的策略，PigmR和Bsr-d1均在田间应用最后表现出良好的稻瘟病广谱抗性。但由于病原菌效应物进化速度较快，而抗病基因的鉴定到应用是一个及其消耗时间的过程，化学农药的施用仍是目前主要的防治措施。SAR是诱导植物持续抵御病原微生物侵害的一种防御机制，如SA及其类似物可诱导宿主产生SAR抗性，提高宿主免疫力。SAR信号的传递非常的迅速，通过各种激素、代谢物和蛋白质之间的平衡和串扰将信号传递到远端组织并警示植物做好抵御未来侵染的准备。目前已鉴定到多种SAR的内源性化学诱导剂，二氢甜菜碱(Dihydroabetinal)、哌可酸(Pipecolic acid)、水杨酸、壬二酸(Azelaic acid)和3-磷酸甘油(Glycerol-3-phosphate)等。这些SAR内源性诱导剂可在病害高发期前通过喷施诱导植物系统获得性抗性(SAR)，使寄主保持持久的抗性。但内源性诱导剂具备植物特异性，如龙胆酸，添加外源龙胆酸于番茄叶片后能诱导P23、P32基因的表达，但是添加到龙胆酸到烟草叶片上不能诱导PR的合成(余朝阁,李天来,须晖.植物诱导抗病性及诱抗剂的研究[A].中国植物病理学会:中国植物病理学会,2004:5.)。

目前植物真菌病害的防治主要包括以下几种方式。(1)化学防治：也称为农药防治，是防治植物病害最常用的方法。容易增强病菌耐药性，污染环境，造成化学残留。(2)农业防治：采用水旱轮作、轮作等，改变耕作制度或耕作方式等，避免作物连作和减少土壤含菌量。(3)土壤消毒：采用化学药剂对土壤进行消毒，彻底杀死土壤病原菌。(4)生物防治：生物防治具有环境兼容性好、安全性高等特点，通常引入天敌、植物源农药等。目前使用化学农药仍然是使用比例最高的防治措施，对真菌病害的防治虽然一定的作用，但造成了化学残留和污染环境等生物安全隐患问题。因此，开发低毒、绿色、高效、广谱的生态农药具有重要意义。

褪黑素作为一种天然的、价格低廉、商品化成熟的小分子物质，结构简单。已被用于植物调节剂促进植物生长和细菌、卵菌的病害的防治，在水稻真菌、小麦、果树和大多数经济植物上的真菌防控作用应用甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供了褪黑素在制备抗真菌剂中的应用，所述的真菌包括：玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、梨树腐烂病菌(Valsa pyri)、桃褐腐菌(Monilinia fructicola)。

本发明的另一个目的在于提供了褪黑素在制备植物叶面剂中的应用。

为了达到以上目的，本发明采用以下技术措施：

本发明所述的褪黑素(Melatonin)，分子量为232.28，分子式为C₁₃H₁₆N₂O₂，化学式如下

本发明的保护内容包括：

褪黑素在制备抗真菌剂中的应用，包括以褪黑素为唯一有效成分或是有效成分之一制备成抗真菌剂；所述的真菌包括：玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、核盘菌(Scl erotinia sclerotiorum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeria bi globosa)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、梨树腐烂病菌(Valsa pyri)、桃褐腐菌(Moniliniafructicola)。

以上所述的应用中，优选的，是与稻瘟灵联合制备成抗真菌剂。

褪黑素在制备治疗或预防由真菌引起的疾病的药物中的应用；所述的真菌包括玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、梨树腐烂病菌(Valsa pyri)、桃褐腐菌(Monilinia fructicola)。

褪黑素在制备成植物叶面剂中的应用，以包括以褪黑素为唯一有效成分或是有效成分之一制备成植物叶面制剂，可抑制真菌的同时，提高植物的免疫力。

所述的真菌包括：玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、假禾谷镰孢菌(Fus arium pseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、梨树腐烂病菌(Valsa pyri)、桃褐腐菌(Moniliniafructicola)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、褪黑素可以直接作为真菌杀菌剂进行杀菌和防治；

2、褪黑素可以作为植物免疫诱导剂提高植物免疫力，预防降低病害的发生；

3、褪黑素可以作为农药佐剂，与其他化学农药进行联合使用，大幅度降低有毒农药的使用量，提高药剂的防治效率；

4、褪黑素在逆境胁迫下能稳定发挥抑菌功效；

5、褪黑素可以直接适用于包括作物、园艺蔬菜、果树等多数经济植物。

附图说明

图1为离体实验中不同浓度的褪黑素处理稻瘟菌和稻曲菌第7天结果以及不同浓度的褪黑素处理纹枯菌24h结果；

其中A为平板实验效果示意图，B为稻瘟菌和稻曲菌第7天以及纹枯菌24h时的抑制率结果。

图2为离体实验中不同浓度的褪黑素处理多种病原真菌的影响示意图；

其中：A为平板实验效果示意图，B为抑制率结果。

不同的病原菌为：玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、假禾谷镰孢菌(Fus arium pseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、梨树腐烂病菌(Valsa pyri)、桃褐腐菌(Moniliniafructicola)。

图3为离体实验中不同浓度的褪黑素处理黑粉菌结果示意图；

其中A为第2天平板实验效果示意图，B为摇菌第5天结果，C为第五天生物量统计结果。

图4为不同浓度组合的褪黑素和稻瘟灵联合使用来处理稻瘟菌的实验结果示意图；

其中：A为平板实验效果图，B为不同浓度组合处理的抑制率结果，C为协同作用曲线。图5为不同浓度的褪黑素单独处理接种稻瘟菌的水稻叶片和叶片病斑个数统计结果；

其中：TW(0.025％吐温水)为阴性对照，DMSO(即褪黑素浓度为0)为对照组，不同浓度褪黑素为处理组，A为水稻侵染图，B为叶片用不同浓度的褪黑素处理后病斑个数统计。

图6为褪黑素单独处理诱导水稻的先天免疫结果图：

其中A为5mM褪黑素喷施在2周龄的水稻叶片，诱导12h后的DAB染色，B为5mM褪黑素喷施在2周龄的水稻叶片，诱导的植物免疫相关基因的qRT-PCR检测。MT为褪黑素处理组，Mock为清水对照处理组。

具体实施方式

本发明实施例所用方法，如无特殊说明，均采用本领域的常规方法。所述的试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

本发明可能涉及到的培养基如下：

1、完全培养基(CM)：加入50ml 20X Nitrate salts，1ml 1000X Trace elements，1ml 1000X Vitamin solution，称取10g D-glucose，2g Peptone，1g Yeast extract，1gCasa mino acid，然后加水至900ml，调PH至6.5，定容到1000ml，最后加入15g Agar，高压灭菌115℃20min。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，加入20g D-glucos e，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，最后加15g Agar，高压灭菌115℃20mi n。

3、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，加入20gSucrose，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，最后加15g Agar，高压灭菌115℃20min。

4、液体发酵培养基(YEPS)：加入10g Yeast extract、4g Peptone、4g Sucrose，补至1000ml水，高压灭菌121℃20min。

实施例1：

褪黑素在制备真菌抑菌剂中的应用：

1)用褪黑素分别处理稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)P131(Xue M,Yang J,Li Z,HuS,Yao N,Dean RA,Zhao W,Shen M,Zhang H,Li C,Liu L,Cao L,Xu X,Xing Y,Hsia ng T,Zhang Z,Xu JR,Peng YL.Comparative analysis of the genomes of two field isolates of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.PLoS Genet.2012；8(8):e1002869.)、Gu y11(Zhang X,Bao Y,Shan D,Wang Z,Song X,Wang Z,Wang J,He L,Wu L,ZhangZ,Niu D,Jin H,Zhao H.Magnaporthe oryzae Induces the Expression of aMicroRNA to Suppress the Immune Response in Rice.Plant Physiol.2018May；177(1):352-368.)、70-15(Ellingboe,Chih Cheng T.Chao,Albert H.Selection for matingcompetence in Magn aporthe grisea pathogenic to rice.Canadian Journal ofBotany,1991,69(10):2130-2134.)，稻曲菌(Ustilaginoidea virens)JS60-2(Zhang N,Yang J,Fang A,Wang J,Li D,Li Y,Wang S,Cui F,Yu J,Liu Y,Peng YL,Sun W.Theessential effector SCRE1 inUstilagin oidea virens suppresses rice immunityvia a small peptide region.Mol Plant Pathol.2020 Apr；21(4):445-459.)，纹枯菌(Rhizoctonia solani)WH-1(李松鹏.两株水稻根际木霉菌株生物学特性及生防潜能研究[D].华中农业大学,2017.)

稻瘟菌：配置CM固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(0.1mM，1mM，5mM，10mM)，取3mm稻瘟菌(P131、Guy11、70-15)菌块放置于培养基中间，室温放置培养7天，每组3个重复；

稻曲菌：配置PSA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(0.1mM，1mM，5mM，10mM)，取3mm稻曲菌(JS60-2)菌块放置于培养基中间，室温放置培养7天，每组3个重复；

纹枯菌：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(0.1mM，1mM，5mM，10mM)，刮取7mm纹枯菌(WH-1)菌块上的菌丝放置于培养基中间，室温放置培养24h，每组3个重复。

观察病菌生长状况(如图1所示)可以发现，病菌生长的抑制效果随着褪黑素浓度的增加而增强。

2)用褪黑素分别处理玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、假禾谷镰刀菌(Fusar ium pseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,PH-1)(KingR,Urban M,Hammond-Kosack KE.Annotation of Fusarium graminearum(PH-1)Version5.0.Geno me Announc.2017,12；5(2):e01479-16.)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa)、苹果腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、梨树腐烂病菌(Valsapyri)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)。

玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温黑暗放置培养5天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养3天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养3天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小菌块上的菌丝放置于培养基中间，室温放置培养7天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养4天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养7天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

苹果腐烂病菌(Valsa mali)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养2天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养4天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

梨树腐烂病菌(Valsa pyri)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养2天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)：配置PDA固体培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为(5mM，10mM)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温黑暗放置培养5天，用十字交叉法测量菌落直径，拍照，计算抑菌率(处理组-对照组)/对照组，每组3个重复。

观察病菌生长状况(如图2所示)可以发现，褪黑素对以上真菌均有抑制效果。

3)用褪黑素处理玉米黑粉菌(Ustilago maydis)SG200(Teertstra WR,Krijgsheld P,

en HA.Absence of repellents in Ustilagomaydis induces genesencoding small secreted proteins.Antonie Van Leeuwenhoek.2011,100(2):219-29.)

配置PDA培养基，然后培养基中加入褪黑素，加入的褪黑素终浓度为0，5mM，10mM，刮取少量培养基上的玉米黑粉菌菌丝至YEPS液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养，吸取1ml菌液，12000rpm离心5min，用ddH₂O冲洗三次，浓度分别调至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³个/ml，在PDA培养上打点，每个点5μl，每个浓度三个重复，2天后拍照观察结果。

在YEPS培养基中加入不同浓度的褪黑素(0，5mM，10mM)，而后加入100μl上述过夜摇的玉米黑粉菌菌液(OD₆₀₀达到1.0左右)，28℃,200rpm下摇5天，而后风干，观察不同处理下的生物量有无差别。

观察PDA培养基中的病菌生长状况(如图3中A所示)可以发现，病菌生长状况基本无变化。观察病菌摇菌状况(如图3中B和C所示)可以发现，不同褪黑素处理下，病菌的生物量基本无变化，这两个结果都说明了褪黑素对玉米黑粉菌的生长无影响。

实施例2：

褪黑素与稻瘟灵的协同作用：

配置CM固体培养基，然后培养基中加入褪黑素(1mM，5mM)，设置DMSO组为对照组，稻瘟灵(0mg/ml，0.7mg/ml，7mg/ml)、褪黑素+稻瘟灵组(5mM+7mg/L,5mM+0.7mg/L，1mM+0.7mg/L)，取相同大小的菌块放置于培养基中间，室温放置培养5天，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率(处理组-对照组)/对照组，拍照，每组3个重复。

观察病菌生长状况(如图4)可以发现，随着褪黑素+稻瘟灵组合用药浓度的增加。病菌生长受到的抑制越来越明显。同时根据CompuSyn软件计算得到褪黑素+稻瘟灵两种药物组合具有协同效应，在图4中的协同作用曲线中，CI<1表示具有协同作用，CI＝1表示不具有协同作用，CI>1表示具有拮抗作用。

实施例3：

褪黑素抑制稻瘟菌活体实验：

用褪黑素处理稻瘟菌孢子悬浮液后侵染水稻叶片，然后统计水稻叶片的发病个数：

用0.025％吐温水洗下培养基上的稻瘟菌(P131)分生孢子，制备浓度为1x10⁵个/ml的孢子悬浮液，以只喷施TW(0.025％吐温水)为阴性对照，以不加褪黑素，只加1％DMSO的孢子悬浮液为对照组(即为褪黑素浓度为0的组别)，处理组为加入不同终浓度的褪黑素(0.1mM，1mM，5mM，10mM)，每六株生长状况一致的三周龄水稻苗为一个处理，每个处理用10ml孢子悬浮液或0.025％吐温水均匀地喷洒在水稻叶片表面，室温黑暗保湿36h后，在温室昼夜交替12h培养，7天统计发病情况。

根据统计的病斑个数(图5所示)可以发现，与对照组相比，处理组的水稻病斑数目显著减少，褪黑素浓度为5mM的时候，病斑个数明显减少且病斑面积小，褪黑素浓度为10mM时，几乎无病斑，说明在这种浓度下，病菌几乎失去了侵染能力。

实施例4：

褪黑素作为SAR内源性诱导剂提高水稻的免疫力：

使用生长2周的水稻幼苗Kittake，将5mM褪黑素喷施在水稻叶片上，12h后收集叶片。用1mg/ml DAB溶液(PH 3.8)染色8h，然后用无水乙醇：冰醋酸(24：1)脱色8h。随后使用显微镜进行观察和拍照(Nikon Ni90，日本)。检测发现，褪黑素处理的水稻叶片在12h时叶片有明显的ROS积累，表明褪黑素激活了水稻的先天免疫反应(图6中A)。ROS在植物免疫反应中具有重要作用。

将褪黑素喷施12h的水稻叶片进行液氮储存，随后使用液氮将样品研磨至白色粉末状，使用Trizol(Invitrogen)法进行RNA提取，并通过DNase I(ThermoScientific)去除植物基因组DNA。使用琼脂糖凝胶(1.5％)电泳检测RNA的完整性，并在纳米分光光度计上测量其浓度。使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme)进行互补DNA(cDNA)合成。qRT-PCR在Bio-Rad CFX96实时系统上进行，该系统与使用SYBR Green Mix(TransGen)的C1000热循环仪(Bio-Rad)耦合。使用2^-ΔΔCT方法计算目标基因的表达水平。检测发现植物免疫相关基因PR8(Hong MJ,Lee Ym,Son YS,Im CH,Yi YB,Rim YG,Bahk JD,Heo JB.RiceRab11 is required for JA-mediated defense signaling.BiochemBio phys ResCommun.2013，17；434(4):797-802.)，PR9(窦世娟,关明俐,李莉云,刘国振.水稻的病程相关基因[J].科学通报,2014,59(03):245-258.)，PR10(Takeuchi K,Gyohda A,Tomi nagaM,Koshiba T.RSOsPR10 expression in response to environmental stresses isregulated antagonistically by jasmonate/ethylene and salicylic acid signalingpathways in rice root s.Plant Cell Physiol.2011,52(9):1686-96.)，WRKY45(Tao Z,Kou Y,Liu H,Li X,Xi ao J,Wang S.OsWRKY45 alleles play different roles inabscisic acid signalling and salt stress tolerance but similar roles indrought and cold tolerance in rice.J Exp Bot.2011,62(14):4863-74.),AOS2(HagaK,Iino M.Phytochrome-mediated transcriptional up-regulation of ALLENE OXIDESYNTHASE in rice seedlings.Plant Cell Physiol.2004,45(2):119-28.),和Rac1(DangTT,Shimatani Z,Kawano Y,Terada R,Shimamoto K.Gene editing a constitutivelyactive OsRac1 by homologous recombination-based gene targeting induces immuneresponses in rice.Plant Cell Physiol.2013，54(12):2058-70.)等基因表达水平显著提升(图6中B)，表明褪黑素直接喷施可以增强水稻的抗性。

Claims

1.褪黑素在制备成真菌抑制剂中的应用，所述的真菌为：玉米小斑病菌（Cochliobolusheterostrophus）、假禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）、禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、油菜黑胫病菌（Leptosphaeriabiglobosa）、苹果树腐烂病菌（Valsa mali）、苹果炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、梨树腐烂病菌（Valsa pyri）或桃褐腐菌（Monilinia fructicola）。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的抑制剂中含有稻瘟灵。