KR101601833B1 - 항선충 미생물 대량배양 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항선충 미생물 대량배양 복합체에 관한 것으로 보다 상세하게는 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10ml/L, 키틴 0.1 내지 2g/L, 젤라틴 0.01 내지 1g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체 및 이를 이용한 항선충 미생물 대량 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 복합체는 항선충 효능이 우수한 미생물을 농가가 쉽게 효과적으로 배양할 수 있으며, 농작기 전 및 농작기 중에도 선충 방재용으로 사용할 수 있어 선충 피해로 인한 수확량 감소를 최소화 할 수 있고, 화학농약의 과도한 사용에 따른 환경파괴 및 생태계 변화 등의 부작용을 최소화 할 수 있다.

Description

항선충 미생물 대량배양 복합체{Agent for mass cultivation of microorganism for control of Nematode}

본 발명은 항선충 미생물 대량배양 복합체에 관한 것으로 보다 상세하게는 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체 및 이를 이용한 항선충 미생물 대량 배양 방법에 관한 것이다.

토양선충은 선형동물에 속하는 동물 중 토양에서 자유생활을 하면서 식물에 기생하는 선충으로써, 선충강에 속하는 0.2 ~ 0.5mm 크기의 매우 작은 생물로 육안으로 확인하기가 어려우며, 현미경으로 관찰이 가능하다. 대부분의 선충 형태는 실 모양으로 가늘거나 방주형으로 좌우대칭형이며, 몸에는 마디가 없고 체표에 주름을 가지고있다. 식물에 기생하는 토양선충으로 수백 종이 알려져 있으며 농작물에 기생할 경우, 토마토·당근·고구마·담배·사과나무 등의 뿌리를 혹투성이로 만들고 무·우엉·감자·국화·복숭아나무 등의 뿌리를 썩게 한다.

토양선충 중 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)은 작물의 뿌리 생장점 부근으로 침입하여 식물의 뿌리내에서 양분을 흡즙하면서 성장하는데 이 과정에서 선충이 분비하는 호르몬의 작용으로 작물의 뿌리가 혹 모양으로 변하게 된다. 이러한 기생으로 인해 다른 병원성 미생물에 감염되거나 뿌리 생육을 방해하여 작물의 정상적인 생육을 방해하여 결국엔 작물이 고사하게 된다. 뿌리썩이선충(Pratylenchus sp.)은 이동성내부기생성선충으로 유충 및 선충이 뿌리조직내외를 자유롭게 이동하면서 가해하고 뿌리조직내에서 산란한다. 따라서, 이 선충에 의해 지상부가 위축, 왜화되며 황화현상이 나타나고 뿌리가 짧아지며 잔뿌리의 발육이 억제되고 신초생성이 중지되어 결국에는 고사, 부패하게 된다.

우리나라에서는 선충 피해를 막고자 작물을 심기 전 농가에서 무분별한 합성농약을 사용하고 있다. 하지만 농약의 효과가 거의 없을 뿐 아니라 이마저도 농작기 중에는 선충을 방제하기 위해 사용할 수 없는 실정이다.

현재 토양선충이 곡류, 콩과작물 등의 식용작물에 일으키는 손실은 전세계적으로 매년 약 11 %로 추정되고, 이외에 주요 채소, 과일 등의 주요 경제작물에 일으키는 손실은 매년 약 14 %에 이르러 세계적으로 매년 800 억 달러 이상의 손실을 가져오는 것으로 확인된 바 있다.

식물에 기생하는 토양선충을 방제하기 위한 방법으로 현재 토양개량, 침수, 태양열소독 등의 물리적 방제, 윤작이나 저항성품종 등 작부체계에 따른 경종적방제 및 천적인 곰팡이나 세균을 이용한 생물학적 방제, 그리고 살선충제를 이용하는 화학적 방제 등이 있다.

할로겐화 탄화수소(halogenated hydrocarbons)(예를 들면, 에틸린 디브로마이드(ethylene dibromide), 메틸 브로마이드(methyl bromide))는 세계에서 가장 많이 사용된 살선충제였다. 그들의 높은 인체 유독성 및 성층권(stratospheric) 오존층에 해로운 영향으로 인해 이러한 화합물은 몬트리올 의정서(Montreal Protocol)에서 사용이 금지되었지만 선충 및 식물 병원체 조절에서 메틸 브로마이드의 사용은 대체물 생산의 부족으로 인해 미국 내에서 확장되었다. 카바메이트(carbamates)는 가장 효과적인 비-훈증(non-fumigant) 살선충제이다. 그러나 알디카브(aldicarb) 및 옥사밀(oxamyl)과 같은 대부분의 카마베이트 또한 독성이 높다. 2010년 8월부터, 알디카브의 생산 회사인, Bayer는, 미국 내에서 감자 및 감귤류 과일(citrus)에 모든 생산 등록을 취소하는 것에 대해 합의하였으며, 알디카브는 2018년 8월을 끝으로 완전히 폐지될 것이다.

현재는 이러한 화학적방제와 물리적방제를 선호하고 있으나, 물리적방제는 매 3 년마다 방제를 해야하는 번거로움과 고비용이 소요되는 단점이 있으며, 화학적방제는 에토프 입제(etoprophos), 카두사포스 입제(cadusafos), 카보입제(carbofuran), 포스치아제트 입제(fosthiazate), 메탐소디움 액제(metam-sodium)와 같은 화학 살선충제를 경작기간 동안 여러 차례 처리해야 하므로 토양 및 수질을 오염시킬 수 있는 단점이 있다.

따라서, 이를 개선하기 위한 방안으로 미생물이나 천연물을 이용한 뿌리혹선충의 방제방법이 연구되고 있으며, 미생물로는 파스테리아속의 세균, 바실러스속의 세균, 페실로마이세스속의 곰팡이 등과 천연물로는 만수국, 천수국, 다닥냉이, 감, 아선약 등이 알려져 있다.

한국등록특허공보 제10-0518362호(선충 방제용 조성물)에는, 율피, 감, 호프, 솔잎, 아선약, 암마륵, 커피, 가자, 소목, 지유, 호장, 대황, 조 등을 유효성분으로 하여 이들 추출물의 1 종 또는 2 종 이상의 혼합물에 관한 것이 공개되어 있다. 그런데, 위와 같은 기술들은 첨가되는 구성요소가 너무 많아 준비가 어렵고 제조하기 힘들며, 처리농도가 높아 실제 농가 적용 시 경제적 어려움이 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-0518362호(2005.09.23. 등록) 대한민국 등록특허공보 제10-0347388호(2002.07.23. 등록) 대한민국 등록특허공보 제10-0494375호(2005.05.31. 등록)

본 발명의 발명자들은 항선충 활성을 보이는 미생물을 농가에서 손쉽게 배양하여 사용할 수 있는 방법에 관하여 연구하던 중 본 발명의 조성에 따라 보조 영양원, 키틴 및 젤라틴을 리소박터 캡시시 YS1215와 혼합하여 사용하는 경우 사용이 간편하고, 항선충 효과가 우수하게 발현되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다

따라서 본 발명의 목적은 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양배지 및 제1항의 항선충 미생물 복합체를 혼합하여 배양하는 단계를 포함하는 항선충 미생물대량 배양 방법을 제공하는데 있다.

상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체를 제공한다.

상술한 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양배지 및 제1항의 항선충 미생물 복합체를 혼합하여 배양하는 단계를 포함하는 항선충 미생물대량 배양 방법을 제공한다.

상기와 같이, 본 발명은 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체 및 이를 이용한 항선충 미생물 대량 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 복합체는 항선충 효능이 우수한 미생물을 농가가 쉽게 효과적으로 배양할 수 있으며, 농작기 전 및 농작기 중에도 선충 방재용으로 사용할 수 있어 선충 피해로 인한 수확량 감소를 최소화 할 수 있고, 화학농약의 과도한 사용에 따른 환경파괴 및 생태계 변화 등의 부작용을 최소화 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 대량배양복합체를 배양한 배양물의 뿌리혹선충 유충 방제효과를 실험한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 대량배양복합체를 배양한 배양물의 알 부화 억제율 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 대량배양복합체를 배양한 배양물의 미생물(L. capsici YS1215) 개체 수를 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 대량배양복합체를 배양한 배양물의 키틴 분해 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 대량배양복합체를 배양한 배양물의 젤라틴 분해 활성을 측정한 결과그래프이다.
도 6은 본 발명의 대량배양복합체의 배양 온도에 따른 유충 치사율 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 대량배양복합체의 배양 온도에 따른 알 부화 억제율 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 대량배양복합체의 배양 온도에 따른 배양 미생물 개체수변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 대량배양복합체의 배양 온도에 따른 키틴 분해 활성 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 대량배양복합체의 배양 온도에 따른 젤라틴 분해 활성 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 첨가에 따른 유충 치사율 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 첨가에 따른 알 부화 억제율 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 첨가에 따른 배양 미생물 개체수 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 첨가에 따른 키틴 분해 활성 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 15는 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 첨가에 따른 젤라틴 분해 활성 변화를 측정한 결과 그래프이다.
도 16은 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 물질을 조합하여 첨가하는 경우 유충 치사율 변화를 측정한 결과 그래프이다(SDW : 대조군, 물 첨가군, 1: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃, 2: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄, 3: Na₂HPO₄ + H₃BO₃, 4: Na₂MoO₄ + H₃BO₃).
도 17은 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 물질을 조합하여 첨가하는 경우 알 부화 억제율 변화를 측정한 결과 그래프이다(SDW : 대조군, 물 첨가군, 1: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃, 2: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄, 3: Na₂HPO₄ + H₃BO₃, 4: Na₂MoO₄ + H₃BO₃).
도 18은 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 물질을 조합하여 첨가하는 경우 배양 미생물 개체수 변화를 측정한 결과 그래프이다(1: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃, 2: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄, 3: Na₂HPO₄ + H₃BO₃, 4: Na₂MoO₄ + H₃BO₃).
도 19는 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 물질을 조합하여 첨가하는 경우 키틴 분해 활성 변화를 측정한 결과 그래프이다(1: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃, 2: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄, 3: Na₂HPO₄ + H₃BO₃, 4: Na₂MoO₄ + H₃BO₃).
도 20은 본 발명의 대량배양복합체의 미량요소 물질을 조합하여 첨가하는 경우 젤라틴 분해 활성 변화를 측정한 결과 그래프이다(1: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃, 2: Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄, 3: Na₂HPO₄ + H₃BO₃, 4: Na₂MoO₄ + H₃BO₃).
도 21은 본 발명의 대량배양복합체를 처리하여 재배한 토마토의 생초장 측정 결과 비교 그래프이다(SMC : 토양멸균+복합체 배양액+게껍질, NSMC : 토양비멸균+복합체 배양액+게껍질, NSF : 토양비멸균+비료, NSMP : 토양비멸균+농약+미생물, NSMF : 토양비멸균+농약+비료, 1차 조사 : 정식 5주차, 2차 조사 : 정식 7주차).
도 22는 본 발명의 대량배양복합체를 처리하여 재배한 토마토의 생체중 측정 결과 비교 그래프이다(SMC : 토양멸균+복합체 배양액+게껍질, NSMC : 토양비멸균+복합체 배양액+게껍질, NSF : 토양비멸균+비료, NSMP : 토양비멸균+농약+미생물, NSMF : 토양비멸균+농약+비료, 1차 조사 : 정식 5주차, 2차 조사 : 정식 7주차).
도 23은 본 발명의 대량배양복합체를 처리하여 재배한 토마토의 건체중 측정 결과 비교 그래프이다(SMC : 토양멸균+복합체 배양액+게껍질, NSMC : 토양비멸균+복합체 배양액+게껍질, NSF : 토양비멸균+비료, NSMP : 토양비멸균+농약+미생물, NSMF : 토양비멸균+농약+비료, 1차 조사 : 정식 5주차, 2차 조사 : 정식 7주차).
도 24는 본 발명의 대량배양복합체를 처리하여 재배한 토마토의 뿌리혹의 수를 측정한 결과 비교 그래프이다(SMC : 토양멸균+복합체 배양액+게껍질, NSMC : 토양비멸균+복합체 배양액+게껍질, NSF : 토양비멸균+비료, NSMP : 토양비멸균+농약+미생물, NSMF : 토양비멸균+농약+비료, 1차 조사 : 정식 5주차, 2차 조사 : 정식 7주차).
도 25는 본 발명의 대량배양복합체를 처리하여 재배한 토마토의 선충에 의해 형성된 난낭의 수를 측정한 결과 비교 그래프이다(SMC : 토양멸균+복합체 배양액+게껍질, NSMC : 토양비멸균+복합체 배양액+게껍질, NSF : 토양비멸균+비료, NSMP : 토양비멸균+농약+미생물, NSMF : 토양비멸균+농약+비료, 1차 조사 : 정식 5주차, 2차 조사 : 정식 7주차).
도 26은 본 발명의 대량배양복합체를 처리가 토마토 재배 토양내 선충 유충수를 측정한 결과 비교 그래프이다(SMC : 토양멸균+복합체 배양액+게껍질, NSMC : 토양비멸균+복합체 배양액+게껍질, NSF : 토양비멸균+비료, NSMP : 토양비멸균+농약+미생물, NSMF : 토양비멸균+농약+비료, 1차 조사 : 정식 5주차, 2차 조사 : 정식 7주차).

이하 본 발명의 바람직한 실시 예들의 상세한 설명이 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 하기 설명에서 구체적인 특정 사항들이 나타나고 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해 제공된 것일뿐, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명은 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체를 제공한다.

본 발명의 대량배양 복합체는 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 항선충 미생물은 선충 억제 활성을 가지는 물질을 생산 및 분비하는 미생물을 모두 포함하며, 바람직하게는 리소박터 캡시시(Lysobacter capsici)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 리소박터 캡시시 YS1215(Lysobacter capsici YS1215)일 수 있다. 리소박터 캡시시 YS1215(Lysobacter capsici YS1215)는 Lysobacter sp.의 일종으로 토양으로부터 분리되었다. Lysobacter sp.는 대표적인 길항미생물로서 활주성을 가진 그람 음성 박테리아이며, 다양한 lytic enzymes와 항생물질을 분비하여 식물 병원성 곰팡이 및 식물 해충을 억제하고, 식물생장 호르몬을 생성하여 작물의 생장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

상기 항선충 미생물로 억제할 수 있는 선충은 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 멜로이도진 종(Meloidogyne sp.), 티렌코린쿠스 종(Tylenchorhynchus sp.), 호플로라이무스 종(Hoplolaimus sp.), 헬리코틸렌쿠스 종(Helicotylenchus sp.), 프란티렌쿠스 종(Pratylenchus sp.), 헤테로데라 종(Heterodera sp.), 글로보데라 종(Globodera, sp.), 트리코도루스 종(Trichodorussp.), 파라트리코도루스 종(Paratrichodorus sp.), 시피네마 종(Xiphinema sp.), 및 크리코네마 종(Criconema sp.)의 선충일 수 있으며, 상기 선충은 구체적으로 멜로이도진 인코그니타(Meloidogyne incognita) (뿌리혹 선충), 글로보데라 로스키엔시스(Globodera rostochiensis) 및 글로보데라 파일리다(globodera pailida)(감자 낭포종 선충); 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)(콩 낭포종 선충); 헤테로데라 스카이츠티(Heterodera schachtii)(근대 낭포종 선충); 및 헤테로데라 아베나에(Heterodera avenae)(곡물 낭포종 선충)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

미생물 보조 영양원은 미생물의 생장 촉진에 필요한 성분의 혼합물을 말한다. 본 발명의 미생물 보조영양원은 아미노산 액체비료를 포함하는 것을 특징으로 한다.

액체비료는 액상의 비료로서, 물 또는 기타 용제에 식물이 필요로 하는 영양분이 용해되어 있거나 양분 또는 미생물 등 미세한 입자가 용제에 분산되어 있는 형태를 가진다. 액체비료는 각종 유기물을 혼합, 발효하여 만든 유기농산부산물, 축산부산물, 임산부산물, 어류부산물, 광물부산물, 토양, 효소 및 활성액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 재료를 혼합하여 제조되며 그 종류는 특별히 한정되지 아니하며, 예를 들어, 가축분뇨 액체비료, 식물 추출 액체비료, 퇴비 발효 액체비료, 퇴비 여과 액체비료일 수 있다. 아미노산 액비는 글루탐산 생산과정의 부산물로 제조한 액체비료를 말하며, 각종 아미노산을 함유하고 있다.

본 발명의 미생물 보조영양원은 아미노산 액체비료 외에 인산이수소칼륨(제1인산칼륨, Mono potassium phosphate, KH₂PO₄), 게껍질, 쌀겨, 골분 및 팜에쉬를 추가로 포함할 수 있다.

골분은 소나 돼지의 뼈를 고온, 고압 처리한 후 분쇄한 것으로 약 20%의 인산석회를 포함하며, 모든 작물과 과실의 빛깔과 맛을 좋게 하며, 토양의 산성화를 방지하고, 뿌리 발육을 촉진한다.

팜에쉬(palm ash)는 인도네시아의 팜오일 제조 공장에서 나오는 부산물인 빈 송이 자루를 태워서 만든 재로 칼륨의 함량 약 30%로 매우 높아 친환경 유기농산물 재배 시 문제되는 칼륨 비료의 부족을 충족시킬 수 있는 최고급 유기질 비료이다.

상기 아미노산 액체비료 외에 인산이수소칼륨, 게껍질, 쌀겨, 골분 및 팜에쉬의 비율은 특별히 한정되지 아니하나, 바람직하게는 미생물 보조영양원 전체 중량 대비, 아미노산 액체비료는 80 내지 95 중량%, 인산이수소칼륨은 1 내지 5 중량%, 게껍질은 1 내지 5 중량%, 쌀겨는 1 내지 5 중량%, 골분은 1 내지 5 중량%, 팜에쉬는 1 내지 5 중량% 비율로 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 미생물 보조영양원은 인산수소나트륨(Sodium Phosphorate Dibasic, Na₂HPO₄), 몰리브덴산 나트륨(Sodium Molybdate, Na₂MoO₄) 및 붕산(boracic acid, H₃BO₃)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미량요소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 미량요소의 추가로 인해 본 발명의 항선충 미생물 대량배양복합체를 이용한 항선충 미생물의 배양이 더욱 안정적이며 효율적으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 복합체는 항선충 활성을 가지는 미생물을 매우 효율적으로 손쉽게 배양할 수 있는 효과가 있다. 본 발명의 복합체를 탄소원 및 질소원이 포함된 배양배지와 혼합하여 배양하면 선충을 효과적으로 억제할 수 있는 항선충 미생물이 대량으로 증식되어 미생물 농약으로 바로 사용이 가능하다.

따라서 본 발명은 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양배지 및 제1항의 항선충 미생물 복합체를 혼합하여 배양하는 단계를 포함하는 항선충 미생물대량 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 배양 방법은 제1항의 항선충 미생물 복합체를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양배지와 혼합하여 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 탄소원 및 질소원은 공지의 미생물 배양용 탄소원 및 질소원이면 어떤 것이든 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 탄소원은 포도당, 자당, 과당, 갈락토스, 글리세롤, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 질소원은 효모추출물, 효모농축액, 비프추출물, 옥수수침지가루, 옥수수침지액, 참치추출물, 글루타민산나트륨, 펩톤, 트립톤, 구연산암모늄, 인산암모늄, 암모니아수, 질산나트륨, 황산암모늄 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 배지는 질소원은 효모 추출물 일 수 있으며, 탄소원은 자당(수크로스, sucrose) 또는 포도당일 수 있다.

또한, 상기 탄소원은 총 배지에 대하여 0.1∼20 %(w/v)이고, 상기 질소원은 총 배지에 대하여 0.01∼5 %(w/v)일 수 있다.

상기 배지는 항선충 미생물의 효율적인 증식을 위하여 각종 염 및 미량성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 배양배지는 바람직하게는 L-글루탐산나트륨(L-monosodiumglutamate, MSG)을 0.1 내지 10g/L, 효모추출물(Yeast extract)을 0.1 내지 10g/L, 자당(Sucrose)을 1 내지 10g/L, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄)을 0.1 내지 5g/L, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)을 0.1 내지 5g/L, 탄산칼슘(CaCO₃)을 0.1 내지 5g/L, 황산마그네슘(MgSO₄)을 0.1 내지 1g/L, 황산구리(CuSO₄)를 0.001 내지 0.1g/L, 황산아연(ZnSO₄)을 0.001 내지 0.1g/L, 염화제이철(FeCl₃)을 0.01 내지 0.1g/L 포함하는 배양배지 일 수 있다. 본 발명의 배양배지는 가장 바람직하게는 증류수 1L당 L-글루탐산나트륨(L-monosodiumglutamate, MSG) 1.0g, Yeast extract 1.0g, Sucrose 3.0g, KH₂PO₄ 1.4g, (NH₄)₂SO₄ 1.0g, CaCO₃ 1.0g, MgSO₄ 0.3g, CuSO₄ 0.02g, ZnSO₄ 0.02g, FeCl₃ 0.03g을 포함하는 배지일 수 있다.

본 발명의 배양은 당업계에 알려진 미생물 배양 조건 및 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 높은 항선충 활성을 가지는 본 발명의 항선충 미생물 대량배양복합체를 손쉽게 배양할 수 있어 미생물 농약 제조에 효과적이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 항선충 미생물 대량배양 복합체 제조

<1-1> 항선충 미생물 대량배양 복합체 제조

기본 배지(표 1)에 젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물 접종양을 조절하여 최적의 대량배양복합체를 만들기 위하여 표 3과 같은 조합을 작성 하였다.

기본 배지 조성

성분	용량(g/L)
L-monosodiumglutamate(MSG)	1.0g
Yeast extract	1.0g
Sucrose	3.0g
KH2PO4	1.4g
(NH4)2SO4	1.0g
CaCO3	1.0g
MgSO4	0.3g
CuSO4	0.02g
ZnSO4	0.02g
FeCl3	0.03g

미생물 보조 영양원 조성

성분	함량(%)
아미노산 액체비료	88.5
인산이수소칼륨	2.5
게껍질	2
쌀겨	2
골분	2
팜에쉬	2
미량요소	1

젤라틴/키틴 배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물 조합

조합번호	키틴	젤라틴	미생물 보조영양원	Lysobacter capsici YS1215 (7X109CFU/ml)
1	0.4g	0.1g	2ml	0.5ml
2	0.4g	0.1g	4ml	1ml
3	0.4g	0.2g	2ml	1ml
4	0.4g	0.2g	4ml	0.5ml
5	0.6g	0.15g	3ml	0.75ml
6	0.8g	0.1g	2ml	1ml
7	0.8g	0.1g	4ml	0.5ml
8	0.8g	0.2g	2ml	0.5ml
9	0.8g	0.2g	4ml	1ml

<1-2> 항선충 미생물 대량배양 복합체 배양물 제조

실시예 <1-1>에서 제조한 다양한 조합의 복합체를 각각 5일간 배양하여 배양물을 수득하였다. [표 3]에 따른 다양한 조합의 복합체를 [표 1]의 기본배지 조성과 함께 증류수에 혼합하여 140rpm으로 30℃에서 5일간 배양하였다.

<실시예 2> 항선충 미생물 대량배양 복합체의 항선충 효과 실험

<2-1> 뿌리혹선충 유충 방제 효과 실험

실시예 <1-2>에서 배양한 복합체를 사용한 경우 뿌리혹선충 유충의 치사율을 확인하였다.

실시예 <1-2>에서 배양한 복합체를 각각 원심분리하여 상등액을 취한 후 유충 300개가 들어있는 24 well-plate에 처리하고, 1, 2일째 유충 치사율을 조사하였다.

9개의 조합에 따른 뿌리혹선충 유충의 치사율을 조사한 결과 2번 조합에서 조사 2일째 84.8%로 가장 높은 유충 치사율을 나타내는 것을 확인하였다([도 1] 참조). 또한 50%이상의 유충 치사율을 나타내는 조합으로는 1, 4, 5, 6, 7 및 9번으로 각각 72.9%, 75.0%, 60.5%. 66.0%, 57.1% 및 56.2%로 조사되었다.

<2-2> 뿌리혹선충 알 방제 효과 실험

실시예 <1-2>에서 배양한 복합체를 사용한 경우 뿌리혹선충 알의 부화율을 확인하였다.

실시예 <1-2>에서 배양한 복합체를 각각 원심분리하여 상등액을 취한 후 알 500개가 들어있는 24 well-plate에 처리하고, 2, 5일째 알 부화 억제율을 조사하였다.

젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 뿌리혹선충 알 부화율에 미치는 영향에 대하여 조사한 결과 5번 조합에서 조사 5일째 10.4%로 물처리구 60% 부화율에 비해 50% 정도 부화율이 억제 되는 것으로 조사 되었다. 20%이하의 알 부화율을 나타내는 조합으로는 3번, 4번 및 9번으로 각각 19.4%, 14.2% 및 16.3%로 조사되었다. 또한 20% 이상의 알 부화율을 보인 조합으로는 1번, 2번, 6번, 7번 및 8번 조합으로 각각 24.5%, 24.8%, 21.7%, 22.8% 및 25%로 조사되었다. 이러한 결과는 물 처리구에 비해 1번부터 9번 조합 모두 40%이상의 알 부화억제 효과가 있는 것으로 나타났다([도 2] 참조).

<실시예 3> 항선충 미생물 대량배양 복합체의 미생물 생육 활성 측정

젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 미생물(Lysobacter capsici YS1215) 생육 정도를 조사하였다.

실시예 <1-2>에서 배양한 배양액을 대상으로 UV 흡광도 측정기를 이용하여 600nm 흡광도로 미생물 생육(optical density, OD600)을 조사하였다.

그 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이, 2번 조합이 2.12로 가장 높게 나타났고, 6번 조합이 6.04로 가장 낮게 나타났다. 1번부터 9번 조합으로 만든 미생물 배양액을 이용하여 영양배지(LB media)에 도말하여 미생물 생육 지수인 Log10 CFU/ml을 조사한 결과 1번 조합에서 1.0 Log10 CFU/ml로 가장 높게 나타났고, 7번 배지 조합에서 0.5 Log10 CFU/ml로 가장 낮게 나타났다.

<실시예 4> 항선충 미생물 대량배양 복합체의 효소 활성 측정

젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 배양물의 효소 활성을 조사하였다.

<4-1> 키틴분해효소 활성 실험

키틴분해효소 활성은 다음과 같이 측정하였다. 배양물을 원심 분리하여 상등액 50ul를 취하고 0.5% colloidal chitin 500ul, sodium acetate buffer(pH5.0) 450ul를 첨가 후 37℃에서 한 시간 반응시킨다. 1N NaOH 200ul를 가한 후 14,000rpm으로 5min 원심분리 하였다. 상등액 750ul를 취하여 Schales' reagent 1ml를 가하여 발색시키고 420nm에서 측정하였다.

키틴분해효소 활성 조사 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이, 1번 조합에서 1.36 Unit/ml로 가장 높게 나타났고, 3번 조합에서 0.74 Unit/ml로 가장 낮게 나타났다. 1.0 Unit/ml 이상의 활성을 보인 조합으로는 5번, 6번, 7번, 8번 및 9번으로 조사 되었고 각각 1.09, 1.00, 1.25, 1.16 및 1.17 Unit/ml로 조사되었다. 이러한 결과는 키틴 양이 많은 5번, 6번, 7번, 8번 및 9번에서 키틴분해활성이 높게 나타난 것으로 보아 키틴의 양에 따라 키틴분해효소 활성이 영향을 받은것으로 보여진다.

<4-2> 젤라틴분해효소 활성 실험

젤라틴분해효소 활성은 다음과 같이 측정하였다. 25 mg의 젤라틴이 포함된 기질용액 5 ml을 중탕 가열한 후 0.1 ml 효소액 또는 배양액을 원심분리한 후 얻은 배양 상등액을 가하여 37℃에서 5시간 반응시켰다. 반응액을 원심분리한 후 상등액 0.2 ml과 Ninhydrin 용액 (4 g ninhydrin, 100 ml ethylene glycol monoetyl ether, 0.16% SnCl₂?₂O) 2 ml을 혼합하여, 100℃에서 20분간 끓이고, ice-water에서 냉각 시킨 후 10 ml 희석액 (50% 1-propanol)을 가한 것을 15분동안 실온에서 방치한 후 A570에서 측정하였다.

젤라틴분해효소(gelatinase) 활성 조사 결과 [도 5]에서 보는 바와 같이, 8번 조합에서 15.82 Unit/ml로 가장 높게 나타났지만, 9번 조합 15.80 Unit/ml 활성 차이에서 오차범위 내에 있었다. 가장 낮은 활성을 보인 조합으로는 2번 조합으로 14.53 Unit/ml로 나타났다. 3번, 4번 및 5번에서의 젤라틴분해효소활성은 오차범위 내에서 각각 15.21, 15.34, 15.36 Unit/ml로 비슷한 결과를 보였다. 1번, 6번 및 7번에서의 젤라틴분해효소활성은 각각 15.02, 15.08 및 15.26 Unit/ml로 조사되었다. 조사 결과 젤라틴분해효소 활성은 배지내의 젤라틴 함량이 상대적으로 높은 3번, 4번, 8번 및 9번에서 높게 나타나는 것으로 보아 젤라틴 함량의 차이로 인해 젤라틴분해효소활성의 차이도 나타나는 것으로 보여진다.

<실시예 5> 배양 온도에 따른 항선충 미생물 대량배양 복합체의 특성 변화 실험

<5-1> 배양 온도에 따른 유충 치사율 시험

젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 최적의 조합을 조사한 결과를 종합하여 조합 5번과 9번을 선택하여 온도 영향 조사를 하였다. 실험 온도는 20℃, 30℃ 및 40℃로 하였다.

유충 치사율 시험은 <실시예 2>와 동일한 방법으로 수행되었다.

조사 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이, 뿌리혹선충 유충 치사율에서는 조사 3일째 30℃ 9번 조합 (30_9)에서 72.0%로 가장 높게 나타났고, 40℃ 5번 조합(40_5)에서 38.4%의 치사율로 가장 낮게 조사되었다. 40℃에서의 유충 치사율은 20℃ 및 30℃에 비해 상대적으로 낮게 나타났다. 이는 미생물(Lysobacter capsici YS1215)의 생육이 매우 낮아 유충 치사에 영향을 주는 2차대사산물의 생산이 적은 것 때문으로 사료된다. 20℃에서의 유충 치사율은 각각 5번 조합 62.9% 및 9번 조합 63.5%로 조사되었고, 30℃의 유충 치사율보다 약간 낮게 나타났다.

<5-2> 배양 온도에 따른 알 부화 억제율 시험

배양 온도에 따른 알 부화 억제율 시험은 <실시예 2>와 동일한 방법으로 수행되었다. 젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 최적의 조합을 조사한 결과를 종합하여 조합 5번과 9번을 선택하여 온도 영향 조사를 하였다.

조사 결과, [도 7]에서 보는 바와 같이, 조사 5일째 30℃ 9번 조합(30_9)에서 뿌리혹선충 알 부화율이 11.7%로 가장 낮게 나타났고, 40℃ 5번 조합(40_5)에서 24.5%의 부화율로 가장 높게 조사되었다. 40℃에서의 알 부화율은 유충 치사율과 유사하게 20℃ 및 30℃에 비해 상대적으로 높게 나타났다. 이는 미생물(Lysobacter capsici YS1215)의 생육이 매우 낮아 알 부화 억제에 영향을 주는 2차 대사산물의 생산이 적은 것 때문으로 사료된다. 20℃에서의 알 부화율은 각각 5번 조합 17.8% 및 9번 조합 17.2%로 조사되었고, 30℃의 부화율보다 약간 높게 나타났다.

<5-3> 배양 온도에 따른 미생물 생육활성 시험

젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 최적의 조합을 조사한 결과를 종합하여 조합 5번과 9번을 선택하여 온도 영향 조사를 하였다.

조사 결과 [도 8]에서 보는 바와 같이, 접종 미생물 개체수 는 40℃에서는 거의 조사 되지 않았다. 가장 높은 Log10 CFU 값은 30℃ 9번 조합으로 4.04를 나타냈다. 30℃와 20℃의 미생물 개체수 비교에서는 30℃에서 더 높게 나타났다

<5-4> 배양 온도에 따른 키틴 분해 활성 시험

키틴분해효소(chitinase) 및 젤라틴분해효소(gelatinase)의 활성은 미생물을 20℃, 30℃ 및 40℃에서 각각 배양한 후 실시예 4 에서와 동일한 방법으로 측정하였다.

키틴분해효소 활성 조사 결과, [도 9]에서 보는 바와 같이, 20℃ 9번과 30℃ 9번 조합에서 10.9Unit/ml로 가장 높게 나타났고, 40℃ 5번 조합에서 7.9 Unit/ml로 가장 낮게 나타났다. 20℃ 5번, 30℃ 5번 및 40℃ 9번은 각각 10.7, 10.4, 및 7.9 Unit/ml로 조사되었다. 조사결과 비교적 고온인 40℃에서의 키틴분해효소 활성은 상당히 낮게 나타났다.

<5-5> 배양 온도에 따른 젤라틴 분해 활성 시험

젤라틴분해효소(gelatinase) 활성 조사 결과는 [도 10]에서 보는 바와 같이, 30℃ 9번 조합에서 14.8 Unit/ml로 가장 높게 나타났다. 20℃ 5번, 20℃ 9번, 30℃ 5번 및 40℃ 9번 조합에서 각각 14.0, 13,9, 14.4 및 13.3 Unit/ml 활성으로 조사되었다. 가장 낮은 활성을 보인 조합으로는 40℃ 5번 조합으로 12.8 Unit/ml로 나타났다

<실시예 6> 미량요소 첨가에 따른 항선충 미생물 대량배양 복합체의 특성변화 실험

젤라틴/키틴배양체, 미생물 보조영양원 및 미생물접종 비율 조합에 따른 최적의 조합을 조사한 결과를 종합하여 조합 5번과 9번을 선택하여 온도 영향 조사를 하였다. 온도 영향 조사 결과 30℃ 9번에서 선충 유충 치사율과 알 부화 억제율에서 높은 활성을 보임에 따라 9번 조합에 배양온도를 30℃로 결정하여 미량요소 첨가 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 미량요소 및 물질은 MnSO₄, Organic sulfur (유황), Na₂HPO₄, Na₂MoO₄ 및 H₃BO₃ 등으로 0.001g/L 농도로 각각 사용하였다.

<6-1> 미량요소 첨가에 따른 유충 치사율 시험

미량요소가 첨가된 항선충 미생물 대량배양 복합체를 배양하여 <실시예 2-1>에서와 동일한 방법으로 유충방제 효과를 실험하였다.

조사결과 [도 11]에서 보는 바와 같이, 조사 3일째 H₃BO₃ 처리구에서 80.9%의 가장 높은 유충치사율을 보였고, MnSO₄ 처리구에서 64.8%로 가장 낮은 치사율을 보였다. Organic sulfur 처리구는 66.6%, Na₂HPO₄ 처리구는 79.2%, Na₂MoO₄ 처리구는 78.7%의 치사율을 보였다. 하지만 Na₂HPO₄, Na₂MoO₄ 및 H₃BO₃ 의 처리구간 큰 차이는 보이지 않았고, MnSO₄와 Organic sulfur (유황) 처리구간에도 큰 차이는 보이지 않았다.

<6-2> 미량요소 첨가에 따른 알 부화 억제율 시험

미량요소가 첨가된 항선충 미생물 대량배양 복합체를 배양하여 <실시예 2-2>에서와 동일한 방법으로 뿌리혹선충 알의 부화율을 확인하였다.

미량요소 (MnSO₄, Organic sulfur (유황), Na₂HPO₄, Na₂MoO₄ 및 H₃BO₃) 첨가에 따른 뿌리혹선충 알 부화율 조사결과 조사 [도 12]에서 보는 바와 같이, 5일째 H₃BO₃ 처리구에서 11.0%의 가장 낮은 알 부화율을 보였고, 유황 처리구에서 19.0%로 가장 높은 부화율을 보였다. MnSO₄, Na₂HPO₄, 및 Na₂MoO₄ 처리구는 각각 18.8%, 14.0% 및 11.5%의 부화율을 보였다. Na₂MoO₄ 처리구와 H₃BO₃ 처리구는 0.5% 의 근소한 알 부화율 차이를 보였다.

<6-3> 미량요소 첨가에 따른 미생물 생육활성 시험

미량요소가 첨가된 항선충 미생물 대량배양 복합체를 배양하여 <실시예 3>에서와 동일한 방법으로 미생물(Lysobacter capsici YS1215)의 생육 정도를 조사하였다.

미량요소 (MnSO4, Organic sulfur (유황), Na₂HPO₄, Na₂MoO₄ 및 H₃BO₃) 첨가에 따른 미 생물 개체수 영향을 조사한 결과, [도 13]에서 보는 바와 같이, 유황 처리구가 3.40 Log10 CFU/ml로 가장 생육이 좋은 것으로 조사되었고, MnSO₄ 처리구가 2.48 Log10 CFU/ml로 가장 생육이 낮은 것으로 조사되었다. Na₂HPO₄ 처리구는 3.26 Log10 CFU/ml, Na₂MoO₄ 처리구는 2.87 Log10 CFU/ml 및 H₃BO₃ 3.05 Log10 CFU/ml로 조사 되었다.

<6-4> 미량요소 첨가에 따른 키틴 분해활성 시험

미량요소가 첨가된 항선충 미생물 대량배양 복합체를 배양하여 <실시예 4>에서와 동일한 방법으로 배양물 내의 키틴분해효소 활성을 측정하였다.

미량요소 (MnSO₄, Organic sulfur (유황), Na₂HPO₄, Na₂MoO₄ 및 H₃BO₃) 첨가가 키틴분해효소(chitinase)의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, [도 14]에서 보는 바와 같이, H₃BO₃ 처리구가 9.0 Unit/ml로 가장 높게 나타났고, MnSO₄ 및 Organic sulfur (유황)에서 각각 8.0 Unit/ml의 활성을 보임으로 가장 낮게 나타났다. Na₂HPO₄ 및 Na₂MoO₄ 첨가에 따른 키틴분해효소 활성은 8.4 Unit/ml 및 8.3 Unit/ml로 각각 조사되었다.

<6-5> 미량요소 첨가에 따른 젤라틴 분해활성 시험

미량요소가 첨가된 항선충 미생물 대량배양 복합체를 배양하여 <실시예 4>에서와 동일한 방법으로 배양물 내의 젤라틴분해효소 활성을 측정하였다.

미량요소 (MnSO₄, Organic sulfur (유황), Na₂HPO₄, Na₂MoO₄ 및 H₃BO₃) 첨가가 젤라틴 분해효소(gelatinase)의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, [도 15]에서 보는 바와 같이, Organic sulfur 처리구가 16.3Unit/ml로 가장 높게 나타났고, H₃BO₃에서 16.0 Unit/ml의 활성을 보임으로 가장 낮게 나타났다. MnSO₄ 및 Na₂HPO₄ 첨가에 따른 젤라틴분해효소 활성은 16.2 Unit/ml로 같은 값의 활성을 보였다.

<6-6> 미량요소 물질의 조합에 따른 유충 치사율 시험

1차 미량요소 첨가에 따른 뿌리혹선충 유충 치사율, 알 부화율, 미생물 개체수, 키틴분해효소 활성 및 젤라틴분해효소 활성을 조사한 후 종합 분석한 결과 Na₂HPO₄, Na₂MoO₄, H₃BO₃에서 뿌리혹선충 억제에 효과가 있는 것으로 판단하였다. 이러한 결과를 토대로 이 3가지의 요소들을 상호 조합하여 선충 억제 효과를 분석하였다.

상기 3가지 미량요소를 모두 첨가한 항선충 미생물 대량 배양복합체와, 상기 3가지 미량요소 중 두 가지를 조합하여 첨가한 복합체을 각각 배양하여 <실시예 2-1>에서와 동일한 방법으로 유충방제 효과를 실험하였다.

조사결과 [도 16]에서 보는 바와 같이, 조사 3일째 Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구에서 81.9%의 가장 높은 유충치사율을 보였고, Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구는 74.9%의 치사율을 보였다. Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구는 76.4%, Na₂HPO₄ + H₃BO₃ 처리구는 75.6%의 치사율을 보였다. 하지만 4개의 조합 처리구간 큰 차이는 보이지 않았다 (그림 16).

<6-7> 미량요소 물질의 조합에 따른 알 부화 억제율 시험

<실시예 6-7>과 동일한 조합의 미량요소를 첨가한 복합체를 각각 배양하여 <실시예 2-2>와 동일한 방법으로 뿌리혹선충 알의 부화율을 확인하였다.

Na₂HPO₄, Na₂MoO₄, H₃BO₃를 조합하여 미생물 배양 배지에 첨가하고 5일간 배양한 후 뿌리혹선충 알 부화율에 관하여 조사한 결과, [도 17]에서 보는 바와 같이, 조사 5일째 Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구에서 18.4%의 가장 낮은 알 부화율을 보였고, Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구에서 22.3%로 가장 높은 알 부화율을 보였다. Na₂HPO₄ + H₃BO₃ 처리구는 18.7%, Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구는 19.9%의 치사율을 보였다. 하지만 4개의 조합 처리구간 큰 차이는 보이지 않았다.

<6-8> 미량요소 물질의 조합에 따른 미생물 생육활성 시험

<실시예 6-7>과 동일한 조합의 미량요소를 첨가한 복합체를 각각 배양하여 <실시예 3>과 동일한 방법으로 미생물(Lysobacter capsici YS1215)의 생육 정도를 조사하였다.

Na₂HPO₄, Na₂MoO₄, H₃BO₃ 를 조합하여 미생물 배양 배지에 첨가하고 5일간 배양한 후 미생물 (Lysobacter capsici YS1215) 개체수 변화에 관하여 조사한 결과, [도 18]에서 보는 바와 같이, Na₂HPO₄ + H₃BO₃ 처리구에서 3.75 Log10 CFU/ml로 가장 높은 미생물 개체수 증가를 보였고, Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구에서 2.41 Log10 CFU/ml로 가장 낮은 미생물 개체수 증가를 보였다. Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구는 3.32 Log10 CFU/ml, Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구는 2.85 Log10 CFU/ml의 미생물 개체수를 보였다. 미생물 개체수 증가에 관한 조사결과 OD600값과 Log10 CFU/ml 값의 변화 경향성이 거의 일치 한 것으로 조사 되었다.

<6-9> 미량요소 물질의 조합에 따른 키틴 분해 활성 시험

<실시예 6-7>과 동일한 조합의 미량요소를 첨가한 복합체를 각각 배양하여 <실시예 4>와 동일한 방법으로 배양물 내의 키틴분해효소 활성을 측정하였다.

Na₂HPO₄, Na₂MoO₄, H₃BO₃ 를 조합하여 미생물 배양 배지에 첨가하고 5일간 배양한 후 키틴분해효소 활성 변화에 관하여 조사한 결과 [도 19]에서 보는 바와 같이, Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구에서 10.1 Unit/ml로 가장 높게 나타났고, Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구에서 7.9 Unit/ml로 가장 낮은 활성을 보였다. Na₂HPO₄ + H₃BO₃ 처리구는 8.4 Unit/ml, Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구 8.4 Unit/ml로 같은 활성을 보였다.

<6-10> 미량요소 물질의 조합에 따른 젤라틴 분해 활성 시험

<실시예 6-7>과 동일한 조합의 미량요소를 첨가한 복합체를 각각 배양하여 <실시예 4>와 동일한 방법으로 배양물 내의 젤라틴분해효소 활성을 측정하였다.

Na₂HPO₄, Na₂MoO₄, H₃BO₃ 를 조합하여 미생물 배양 배지에 첨가하고 5일간 배양한 후 젤라틴분해효소 활성 변화에 관하여 조사한 결과 결과 [도 20]에서 보는 바와 같이, Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구에서 28.6 Unit/ml로 가장 높게 나타났고, Na₂MoO₄ + H₃BO₃ 처리구에서 27.5 Unit/ml로 가장 낮은 활성을 보였다. Na₂HPO₄ + Na₂MoO₄ 처리구는 27.6 Unit/ml, Na₂HPO₄ + H₃BO₃ 처리구 28.3 Unit/ml로 같은 활성을 보였다.

<실시예 7> 대량배양복합체 처리를 통한 토마토 생산 시험

<7-1> 실험방법

항선충 미생물 대량배양복합체 시제품의 효과를 토마토 포트(pot) 실험을 통하여 검정하였다. 포트 재배 실험을 위해서 4주된 토마토 모종을 900 g의 토양이 들어있는 포트에 옮겨 심고, 1, 2, 3, 4주 후에 아래와 같이 각각의 처리구 별로 처리하였다. 상업적으로 판매하는 농약은 1주 후에 한번만 처리하였다. 모든 처리구는 1 주 후에 포트 당 대략 1,000 마리 유충과 5,000개의 알을 접종하였다. 포트 실험 기간 동안에 생초장, 생체중, 건물중, 뿌리 무게, 토양 내 유충 수, 토마토 뿌리의 난낭 수와 혹 등을 조사하였다.

■ 처리구

1 : SMC; 토양멸균+항선충 미생물 대량배양복합체배양액+게껍질 --> 토양을 포트에 옮기기 전 토양과 게껍질을 멸균한 뒤 포트에 옮기고, 토마토 정식 후 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액을 주기적으로 처리하였다.

2 : NSMC; 토양비멸균+항선충 미생물 대량배양복합체 배양액+게껍질 --> 토양을 멸균하지 않고 토양에 게껍질을 처리한 뒤 포트에 옮기고, 토마토 정식 후 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액을 주기적으로 처리하였다.

3 : NSF; 토양비멸균+비료 --> 멸균하지 않은 토양을 사용하였고, 토마토 정식 후 복합비료를 주기적으로 처리하였다.

4 : NSMP; 토양비멸균+농약+항선충 미생물 대량배양복합체 배양액 --> 멸균하지 않은 토양을 사용하였으며, 농약(선충탄)을 1회 처리한 후 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액을 주기적으로 처리하였다.

5 : NSMF; 토양비멸균+농약+비료 --> 멸균하지 않은 토양을 사용하였으며, 농약(선충탄)을 1회 처리한 후 복합비료를 주기적으로 처리하였다.

<7-2> 토마토 지상부 생초장, 생체중 및 건체중 측정

상기 기재에 따라 처리하여 생육된 토마토작물을 정식 후 5주차 및 7주차에서 각각 생육 정도를 측정하였다.

생초장은 토마토작물을 채취한 후 지상부 및 뿌리로 나누고, 지상부의 잎 끝까지의 평균 길이를 측정하였다. 생체중은 토마토작물을 채취한 후 저울을 이용하여 측정하였다. 건체중은 생체중을 측정한 토마토를 80℃ 건조기에서 3일 동안 건조 후 측정하여 구하였다.

모든 측정은 각 처리군 별로 (5)개의 개체를 측정한 후 평균값 및 표준편차를 구하여 표시하였다.

측정 결과, [도 21]에서 보는 바와 같이, 토마토 생초장에서 1차 조사에서 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 처리구가 28.0 cm로 가장 높게 나타났고, 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구가 25.8 cm로 가장 낮게 나타났다. 2차 조사에서는 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구가 44.5 cm로 가장 높게 나타났다. 2차 결과에서 농약 처리구인 토양비멸균+농약+미생물 (NSMP)와 토양비멸균+농약+비료 (NSMF)에서의 토마토 생육상태는 좋지 않은 것으로 보아 농약에 의한 약해 때문인 것으로 사료된다. 하지만 토양비멸균+농약+미생물(NSMP) 처리구에 약재(선충탄) 처리에 의한 생육 지연 현상 극복을 토양비멸균+농약+비료 (NSMF) 처리구 보다 더 빠르게 하는 것으로 조사 되었다. 이는 약재 처리후 미생물 처리의 영향인 것으로 판단된다.

생체중 측정 결과는 [도 22]에서 보는 바와 같이, 1차 조사에서 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 처리구가 12.1g으로 가장 높게 나타났고, 그 다음으로 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구, 토양비멸균+비료(NSF) 처리구, 토양비멸균+농약+미생물 (NSMP) 처리구 및 토양비멸균+농약+비료(NSMF) 처리구 순으로 나타났다. 2차 결과 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구, 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 및 토양비멸균+농약+미생물 (NSMP) 처리구가 토양비멸균+비료 (NSF) 처리구와 토양비멸균+농약+비료 (NSMF) 처리구 보다 생육정도가 좋은 것으로 측정되었다.

건체중 조사 결과는 [도 23]에서 보는 바와 같이, 1차 조사와 2차 조사에서 토마토 생체중의 결과와 유사한 경향을 보였다. 2차 조사 결과 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구 3.8g, 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 처리구 4.0g으로 나머지 다른 처리구에 비하여 높게 나타났다. 이러한 결과는 작물체 정식전 처리한 게껍질의 양분화와 미생물 배양액에 의한 영향으로 보인다.

측정결과, 본 발명의 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액을 처리한 경우 체중이 증가하며, 약제에 의한 생육저하 현상이 억제되는 것을 확인하였다.

<7-3> 토마토 선충병해 방제 시험1- 뿌리혹 수 측정

토마토 뿌리에 선충 침입에 의해 형성된 뿌리혹의 수는 선충의 피해 정도를 나타내는 지표로써, 선충 피해가 심할수록 높게 나타난다.

뿌리혹 수 1차 조사 결과 [도 24]에서 보는 바와 같이, 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구에서 토마토 뿌리 1개당 6.8개로 가장 낮게 나타났고, 가장 피해가 심한 처리구는 36.3개로 토양비멸균+비료 (NSF) 처리구로 나타났다. 이러한 결과는 대량배양복합체 배양액이 포함된 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC), 토양비멸균+미생물+게껍질(NSMC) 처리가 선충의 피해 억제에 상당한 역할을 하였다는 것을 시사한다.

<7-4> 토마토 선충병해 방제 시험2- 난낭의 수 측정

선충 침입에 의해 토마토 뿌리에 형성된 난낭의 수는 Phloxine B를 이용하여 난낭을 염색한 후 육안으로 조사하였다. 토마토 뿌리를 씻어 0.15%의 Phloxine B 용액에 15분 내지 20분간 침지시킨 후, 붉게 변한 난낭의 수를 count하였다.

그 결과 [도 25]에서 보는 바와 같이, 1차 조사 (5주차)와 2차 조사 (7주차)의 뿌리혹 수 결과와 난낭 수의 결과가 유사한 경향을 보이는 것을 확인하였다. 또한 미생물 배양액 처리구인 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC), 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 처리구가 비료 처리구인 토양비멸균+비료 (NSF) 처리구 보다 난낭의 수가 상당히 낮게 조사된 것으로 확인되었으며, 이는 본 발명의 대량배양복합체 배양액이 선충의 피해를 줄인 것을 시사한다.

<7-5> 토마토 재배 토양의 선충병해 방제 시험

작물체 뿌리에 형성되는 뿌리혹과 난낭의 형성 여부로 선충 피해를 검정하는 것 외에 토양 내 존재하는 뿌리혹선충 유충을 확인하여 선충 피해를 검정할 수 있다. 토양내 존재하는 유충을 조사하기 위해 토양10g을 사용하였다.

토양 시료를 10g을 취한 후 직경이 10 cm, 눈금이 50 mesh 되는 체에 킴와이프 2장을 겹쳐서 깔고, 이체를 물이 담긴 얇은 접시에 놓은 후 시계접시를 올려놓고 여기에 채취한 토양 시료을 올려놓고 2-3일간 놓아둔 후 체를 들어내고 물에 모여 있는 선충을 분리하여, 현미경 하에서 유충수를 세었다.

조사 결과 [도 26]에서 보는 바와 같이, 1차 조사 (5주차)와 2차 조사 (7주차)의 뿌리혹 수 결과 및 난낭 수의 결과와 유사한 경향을 보였다. 토양내 유충 2차 조사에서 토양비멸균+비료 (NSF) 처리구에서 193.0 마리로 가장 피해가 심한 것으로 조사 되었고, 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC) 처리구 107.0 마리, 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 처리구 118.0 마리, 토양비멸균+농약+미생물 (NSMP) 처리구 84.0마리로 각각 조사되었다.

이로서 본 발명의 복합체는 항선충 미생물의 대량생산 효과가 우수한 것을 확인하였다.

한편 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구의 범위뿐 아니라 이 특허청구의 범위와 균등한 것들에 의해서 정해져야 한다.

Claims (8)

1. 아미노산 액체비료를 포함하는 미생물 보조영양원 1 내지 10 ml/L, 키틴 0.1 내지 2 g/L, 젤라틴 0.01 내지 1 g/L, 및 항선충 미생물 1.0X10⁵ 내지 1.0X10¹⁰ CFU/L를 포함하는 항선충 미생물 대량배양 복합체에 있어서 상기 항선충 미생물은 리소박터 캡시시 YS1215인 것을 특징으로 하며, 상기 미생물 보조영양원은 아미노산 액체비료, 인산이수소칼륨, 게껍질, 쌀겨, 골분 및 팜에쉬를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 미생물 보조영양원은 인산수소나트륨(Na₂HPO₄), 몰리브덴산 나트륨(Na₂MoO₄) 및 붕산(H₃BO₃)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미량요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 미생물 보조영양원은 아미노산 액체비료 80 내지 95 중량%, 인산이수소칼륨 1 내지 5 중량%, 게껍질 1 내지 5 중량%, 쌀겨 1 내지 5 중량%, 골분 1 내지 5 중량%, 팜에쉬 1 내지 5 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 항선충 미생물 대량배양 복합체.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양배지 및 제1항의 항선충 미생물 복합체를 혼합하여 배양하는 단계를 포함하는 항선충 미생물대량 배양 방법에 있어서 상기 항선충 미생물은 리소박터 캡시시 YS1215인 것을 특징으로 하는 방법.
   
   
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 상기 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양배지는 L-글루탐산나트륨(L-monosodiumglutamate, MSG)을 0.1 내지 10g/L, 효모추출물(Yeast extract)을 0.1 내지 10g/L, 자당(Sucrose)을 1 내지 10g/L, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄)을 0.1 내지 5g/L, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)을 0.1 내지 5g/L, 탄산칼슘(CaCO₃)을 0.1 내지 5g/L, 황산마그네슘(MgSO₄)을 0.1 내지 1g/L, 황산구리(CuSO₄)를 0.001 내지 0.1g/L, 황산아연(ZnSO₄)을 0.001 내지 0.1g/L, 염화제이철(FeCl₃)을 0.01 내지 0.1g/L 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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