KR20040033616A - 파일로리 및 리스테리아 모노사이토진의 생육을 억제하는항균활성물질을 생산하는 페디오코커스 펜토사세우스ｃｂｔ-8로 명명되는 유산균주, 이를 이용한 항균특성을갖는 항균물질 제조 방법 및 그 제조된 항균물질 기능성식품 및 의약품에 이용하는 방법 - Google Patents

파일로리 및 리스테리아 모노사이토진의 생육을 억제하는항균활성물질을 생산하는 페디오코커스 펜토사세우스ｃｂｔ-8로 명명되는 유산균주, 이를 이용한 항균특성을갖는 항균물질 제조 방법 및 그 제조된 항균물질 기능성식품 및 의약품에 이용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8로 명명된 유산균주 및 이를 이용한 항균특성을 갖는 항균물질 제조 방법 및 그 제조된 항균물질을 기능성 식품 및 의약품에 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 위염증(궤양) 원인균인 헬리코박터 파일로리균 및 식중독 원인균인 리스테리아 모노사이토진균에 대한 감염예방 및 제균작용에 의한 치료효과를 동시에 수행할 수 있는 항균활성물질을 제조할 수 있으며, 이로부터 특정 원인균에 대한 감염예방 및 치료 기능을 갖는 기능성 식품이나 의약품을 생산 공급할 수 있는 장점을 가진다.

Description

파일로리 및 리스테리아 모노사이토진의 생육을 억제하는 항균활성물질을 생산하는 페디오코커스 펜토사세우스 ＣＢＴ-8로 명명되는 유산균주, 이를 이용한 항균특성을 갖는 항균물질 제조 방법 및 그 제조된 항균물질 기능성 식품 및 의약품에 이용하는 방법 {Pediococcus pentosaceus CBT-8 which produces antimicrobial materials for restraining Helicobacter pylori and Listeria monocytogenes, and Production method of antimicrobial materials from Pediococcus pentosaceus CBT-8, and Application process for functional foods and/or drugs using the strain and the antimicrobial materials}
본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8로 명명된 유산균주, 상기 유산균주를 이용하여 소정의 항균활성물질을 제조하는 방법과 그 제조된 항균물질, 상기 제조된 항균물질을 농축하는 방법과 그 방법에 따라 농축된 항균활성물질농축제, 상기 항균활성물질농축제를 건조시키는 방법과 그 방법에 따라 건조된 항균활성물질농축제건조물질 및 상기 항균활성물질농축액 또는 그 건조물질을 기능성 식품 및 의약품에 이용하는 방법에 관한 것이다.
헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori)은 유아기 이후 경구를 통하여 감염되는 것이 일반적이며, 통계적으로 살펴보면 국내 성인의 70% 이상이 보균자로 추산되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 인체 내에서 위염증 및 위암 발생의 원인균으로 잘 알려져 있다. 그런데, 종래에는 위 또는 십이지장 염증이나 궤양증을 치료하기 위해서는 항생제, 위산억제제 및 위점막 보호제 등 3개 약제를 동시에 투여하는 3제 요법이 대중화되고 있으며, 일부에서는 그에 따른 치료 효과가 보고되고 있다. 그러나, 이러한 종래의 3제 요법은, 장내 유익균총 파괴에 따른 설사나 변비증의 동반, 투여된 약제에 대한 내성 균주가 등장하는 문제로 인한 약효능의 저하 및 반복적 치료를 위해서 과량 투여 등의 약제사용에 대한 부작용이 발생되고 있으며, 일단 치료되었더라도 다시 재발하는 등의 문제점도 지적되고 있다.
유아의 경우에는 젖떼는 시기에서부터 감염이 시작되고, 유아기 이후라도 국물이나 음료 등을 상시적으로 음용하는 식습관을 갖는 성인 등의 경우에는 경구를 통한 감염 가능성이 높으며, 성인 보균자의 경우에는 약제에 의한 제균치료 후에도일상생활에서 다시 감염될 위험에 빈번하게 노출되어 있어 있다.
상기와 같이, 종래에 행해지고 있는 항생제 등 약제를 사용한 제균요법에 의한 위염증을 유발시키는 병원균을 제어하는 데에는 한계가 있기 때문에, 감염후 치료보다는 사전에 감염으로부터 예방하는 차원의 다른 시도가 필요하게 되었다.
이러한 감영 예방에 관한 시도는 종래의 항생제를 포함한 의약품에만 의존하는 감염 제어방식과는 달리, 균체, 균체파쇄액, 요소분해효소(Urease), p54 단백질 등을 면역원으로 이용하여 생성시킨 항체를 이용하거나 면역란을 이용하여 헬리코박터 파일로리균을 제어하기 위한 방향으로 연구되고 있다.
또 다른 방법으로, 헬리코박터 파일로리균이 위장관 등에 부착되는 것을 방지시키기 위한 목적으로 제균성능이 있는 유산균이나 그로부터 생산된 항균 물질이 첨가된 각종 건강식품, 발효유 및 유제품이 소개되는 등 의약품이 아닌 기능성 식품을 사용하여 감염 예방이나 제균 또는 치료 목적이 달성될 수 있도록 하는 제품개발 연구가 진행되고 있다.
한편, 유산균은 면역증강기능, 장내 유익균총 유지, 정장기능 등을 갖고 있는 이외에도 헬리코박터 파일로리균이 위점막에 부착되는 것을 방지하는 역할은 물론 제균 작용까지도 수행하고 있으므로, 위염증 예방 및 병증 개선 작용을 동시에 발휘하는 것으로 알려져 있다.
첫째, 헬리코박터 파일로리균은 요소분해효소(Urease) 활성을 갖고 있으므로, 위산 중화능력을 갖고 있으며, 유기산만의 작용으로는 목적하는 바와 같은 위염증 예방 및 제균과 관련된 활성도 높은 효과를 기대하기 어려우며, 둘째, 헬리코박터 파일로리균은 위점막 상피세포에 점착하여 생육하기 때문에 위점막 상피세포와 결합력이 뛰어난 세포구조를 지닌 특정 유산균이 먼저 부착부위를 선점함으로써 헬리코박터 파일로리균이 위점막에 부착되는 것을 방지하는 작용을 하므로 생균체 및 사균체에 대해서는 소정의 목적하는 바를 달성할 수 있지만, 이미 위점막에 헬리코박터 파일로리균이 부착되어 있는 감염자에게는 제균효과가 높지 않은 문제점이 있었으며, 마지막으로, 유산균이 생산하는 항균활성물질(antimicrobial peptide), 미확인(un-known) 항균활성물질 또는 면역강화 성분에 의한 제어기능으로서 헬리코박터 파일로리균이 위점막에 부착하는 것을 방지(예방)하거나 동시에 제균효과(치료)까지도 달성할 수 있으며 발효과정 및 물질 회수기술에 의해 농축 제조된 고농도의 항균활성물질을 이용하는 경우에는 헬리코박터 파일로리균이 야기시키는 위염증에 대해 양호한 예방효과는 물론 치료효과까지도 기대할 수 있게 되었다.
이상 살펴본 것처럼 유산균을 이용한 기능성식품으로서 헬리코박터 파일로리균을 제어하기 위해서는 위에 열거한 세가지 요인을 적절한 조건에서 적극 활용할 필요가 있다. 특히, 유산균이 생산하는 항균활성물질(Antimicrobial peptide, 박테리오신(Bacteriocin)이라 총칭하기도 함)은 고유의 분자량, 아미노산 염기서열 및 구조에 따라 침투할 수 있는 미생물 구조(세포막, 그람(Gram) 음성균의 경우 외막구조)에 따른 특이성이 있기 때문에 항균영역에 분명한 선택성이 있다. 따라서, 유산균이 생산하는 항균물질을 이용하는 경우에는 항생제에서 나타나는 유익균총 파괴와 같은 부작용이 발생하지 않으며, 그 작용기작이 타겟 미생물 세포막에 선택적으로 리크(leak)를 형성하는 것이므로 내성개발의 우려도 없으므로, 식품으로의 이용에 매우 적합한 안전한 생체 친화적인 특성을 지니고 있다. 또한, 항균활성물질 유도 및 고농도 발효기술과 물질분리 기술에 의하여 고활성을 지닌 제품생산이 가능하며, 유산균 생균제 및 다른 기능성 소재들과 병용이 가능한 물성을 지니고 있어 다양한 용도 적성이 개발될 수 있는 장점이 있다.
한편, 리스테리아 모노사이토진은 주로 치즈 등 유가공품, 식육가공품 및 기타 냉장 유통 식품 등에 오염되어 저온유통 중에도 증식하여 식중독 사고를 일으키는 미생물로서 인체에 무해한 천연 식품보존제에 의한 제균 및 오염방지가 필요한 병원성 세균이다.
전술한 종래의 문제점에 기초하여 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 종래의 위염증 등을 치료하기 위한 3제 요법 등이 갖는 문제점을 해결하고 감염 후 치료 목적은 물론 감염 예방 목적을 달성할 수 있는 항균물질을 생성시키는 소정의 유산균주를 활용하고자 함에 있으며, 이러한 기술적 과제를 달성하기 위하여, 헬리코박터 파일로리균(Helicobacter pylori) 및 리스테리아 모노사이토진균(Listeria monocytogenes)의 생육을 억제하는 항균물질을 생산하는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8로 명명된 유산균주, 상기 유산균주를 이용하여 소정의 항균활성물질을 제조하는 방법과 그 제조된 항균활성물질, 상기 제조된 항균활성물질을 농축하는 방법과 그 방법에 따라 농축된 항균활성물질 농축제, 상기 항균활성물질 농축제를 건조시키는 방법과 그 방법에 따라 건조된 항균활성물질 농축제 건조물질 및 상기 항균활성물질농축액 또는 그 건조물질을 이용하여 제조된 기능성 식품 및 의약품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 유산균주의 16S rDNA 염기서열
도 2는 본 발명에 따른 유전학적 동정을 살피기 위한 DNA-DNA 혼성결과도
도 3은 본 발명에 따른 유산균주의 발생학적 계보도
도 4는 본 발명에 따른 항균활성물질 제조 흐름도
도 5는 본 발명에 따른 항균활성물질의 발효공정 경시변화 그래프
도 6은 본 발명에 따른 항균활성물질의 생육저지환 시험결과의 사진
도 7은 본 발명에 따른 항균활성물질의 DOB수치 저하효과를 나타내는 그래프
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제의 달성을 위해 본 발명은 위염증 원인균인 헬리코박터 파일로리균과 식중독 원인균인 리스테리아 모노사이토진의 생육을 동시에 억제할 수 있는 소정의 항균활성물질을 생산하는 미생물 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8로 명명된 유산균을 제공하고, 그를 이용하여 소정의 항균특성을 갖는 항균활성물질을 제조하는 방법과 그 제조된 항균활성물질을 식품 또는 의약품에 이용하는 방법을 제공한다.
구체적으로 살펴보면, 본 발명에서 제공되는 유산균주는 헬리코박터 파일로리균에 대한 생육 억제능과 리스테리아 모노사이토진균에 대한 생육 억제능을 갖는 항균활성물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) CBT-8로 명명된 유산균주이다.
한편, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주를 이용하여 헬리코박터 파일로리균과 리스테리아 모노사이토진균 모두에 항균활성도를 항균활성물질을 제조하는 방법은, (a) 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 유산균주 중량대비 3 내지 5 중량%의 포도당, 0.5 내지 1 중량%의 효모추출물 (Yeast Extract), 1 내지 1,5 중량%의 육엑기스, 0.5 내지 1 중량%의 단백질가수분해물, 0.01 내지 0.1 중량%의 암모늄 시트레이트, 소듐 아세테이트, 디포타시움포스테이트, 마그네슘 셀페이트, 망간 셀페이트, 소듐 클로라이드 중 선택된 하나 이상의 이온결합성화화물을 첨가하여 물에 용해시키는 단계; (c) 상기 첨가물이 포함된 수용액을 살균하는 단계; 및 (d) 상기 살균된 수용액에 상기 (a) 단계에서 준비된 유산균주를 투입하고 혐기적 발효관에서 배양하는 단계를 포함하여 진행하는 것을 특징으로 한다.
한편, 상기 (d)단계 이후에, 상기 제조된 항균활성물질에 대해 고속원심분리 또는 여과장치를 이용하여 균체를 제거한 후 여액을 농축하는 단계를 더 포함하여 진행하면, 항균활성물질의 활성도를 향상시킬 수 있으므로 바람직하다. 더 구체적으로는, 상기 여과장치를 이용하여 농축하는 단계는, 제1여과단계에서는 균체와 최대배제분자량을 초과하는 물질을 제거하고, 제2여과단계로 최소배제분자량 미만의물질을 연속적으로 제거하여 소정 범위의 분자량을 갖는 항균물질만을 농축하는 2단 여과방법으로 수행하게 되면, 일정 범위 내의 분자량을 갖는 항균물질만을 선택적으로 농축할 수 있으므로 바람직하다.
이와 더불어, 상기 농축단계진행 결과물인 항균활성물질 농축액에 대해 동결건조방식 또는 분사식 유동층 건조방법에 따라 건조시키는 단계를 더 포함하여 진행하면, 상용화되는 최종 제품의 성상에 따라 다양한 활용가능성을 확보할 수 있어 바람직하다.
그리고, 본 발명이 제공하는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주로부터 생산되는 헬리코박터 파일로리균 및 리스테리아 모노사이토진에 대한 항균특성을 갖는 항균활성물질을 식품 또는 의약품에 첨가함으로써, 헬리코박터 파일로리균과 리스테리아 모노사이토진균에 대한 감염예방은 물론 치료효과를 달성할 수 있는 기능성 식품 또는 의약품을 개발할 수 있어 바람직하다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 설명하고, 발명에 대한 이해를 돕기 위해 첨부도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어지지 않아야 한다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어지는 것이다.
유산균 CBT-8의 균학적 성질의 동정
본 발명에 따른 유산균주는 API 50 CHL을 사용한 당자화능을 시험해본 결과 하기 표 1과 같은 당자화능 결과를 얻을 수 있었다.
순서 기질(Substrate) 결과(Result)
1 글리세롤(Glycerol)
2 에리스리톨(Erythritol)
3 디 아라비노즈(D Arabinose)
4 엘 아라비노즈(L Arabinose) +
5 리보오즈(Ribose) +
6 디 자이로즈(D Xylose) +
7 엘 자이로즈(L Xylose)
8 아도니톨(Adonitol)
9 베타 메틸-디 자이로사이드(βmethyl-D Xyloside)
10 갈락토오즈(Galactose) +
11 글루코즈(Glucose) +
12 프럭토즈(Fructose) +
13 만노즈(Mannose) +
14 솔보즈(Sorbose)
15 람노즈(Rhamnose)
16 듈시톨(Dulsitol)
17 이노시톨(Inositol)
18 만니톨(Mannitol)
19 솔비톨(Sorbitol)
20 알파-메틸-디 만노사이드(α-Methyl-D Mannoside)
21 알파-메틸-디 글루시오사이드(α-Methyl-D Glucioside)
22 엔 아세틸 글로코사민(N Acetyl Glucosamine) +
23 아미고달린(Amygodalin) +
24 알부틴(Arbutin) +
25 에스쿠린(Esculin) +
26 살리실린(Salicine) +
27 셀로비오즈(Cellobiose) +
28 말토오즈(Maltose) +
29 락토오즈(Lactose)
30 멜리비오즈(Melibiose)
31 수크로즈(Sucrose) +
32 트리할로즈(Trehalose) +
33 인슐린(Inulin)
34 멜레지토즈(Melezitose)
35 라피노즈(Raffinose)
36 전분(Starch)
37 글리코겐(Glycogen)
38 자일리톨(Xylitol)
39 젠티오비오즈(Gentiobiose) +
40 디 유라노즈(D Turanose)
41 디 라익소즈(D Lyxose)
42 디 타가토즈(D Tagatose) +
43 디 퓨코즈(D Fucose)
44 엘 퓨코즈(L Fucose)
45 디 아라비톨(D Arabitol)
46 엘 아라비톨(L Arabitol)
47 글로코네이트(Gluconate)
48 2 케토글루코네이트(2 Keto Gluconate)
49 5 케토 글루코네이트(5 Keto Gluconate)
또한, 상기 유산균주의 16S rDNA 염기서열을 분석하고, 분석결과는 별도의 염기서열목록을 도시한 도 1과 같다. 상기 분석된염기서열목록의 결과를 가지고, 발생학적 계보를 파악하기 위해 이미 알려져 있는 균주들과의 16S rDNA 염기서열을 비교해본 결과 하기 표 2와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
비교균주의 스트레인(Strain) 기탁번호(ascceddion No.) 유사도(%) 차이개수/비교갯수(nt/nt)
페디오코커스 펜토사세우스(Pedicoccus pentosaceus) DSM 20336T AJ305321 99.52 7/1471
페디오코커스 액시딜라티시(Pedicoccus acidilactici) B1104 AJ305322 97.96 30/1471
페디오코커스 액시디락티시(Pedicoccus acidilactici) DSM 20284T AJ305320 97.89 31/1471
페디오코커스 이노핀투스(Pedicoccus inopinatus) DSM 20285T AJ271383 94.70 78/1471
페디오코커스 담노서스(Pedicoccus damnosus) DSM 20331 AJ318414 94.56 80/1471
락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) JCM 1558T D79211 92.80 105/1458
바이셀라 하니(Weissella hanii) IH1012T AY040669 87.14 187/1454
로이코노스톡 게리둠(Leuconostoc gelidum) NRIC 1778 AB022921 84.13 227/1430
한편, 본 발명에 따른 유산균주의 스트레인(strain)과 페디오코커스 유형의 스트레인(strain)인 페디오코커스 텍스트리니쿠스(KCTC3506), 페디오코커스 펜토사세우스(KCTC3507), 페디오코커스 파르부러스(KCTC 3615) 및 페디오코커스 이노피나투스(KCTC3653) 등과의 DNA-DNA 혼성(hybridization)을 시킨 경우, 본 발명에 따른 유산균주는 페디오코커스 펜토사세우스와 93%이상(100~50 ng/nu 범위에서의 평균)의 유전적 관련성을 보임을 하기 표 3과 도 1을 통해 확인할 수 있었다.
ng/ul 200 150 100 75 50 38 25
CBT-8 58791 49561 37251 31608 24899 21887 19775
JC2059 33770 42167 36419 30597 21326 12304 7225db
유사도(%) 57.40 85.08 97.76 96.8 85.65 56.21 36.53
100~50 범위 내에서 유사도 평균 약 93%
상기 표 1에 따른 당자화능 결과치와 상기 표 2에 따른 16S rDNA 염기서열의 유사성, 그리고 상기 표 3 및 도 2에 나타난 바와 같은 DNA-DNA 혼성결과를 종합적으로 동정해본 결과, 본 발명에 따른 유산균주는 페디오코커스 펜토사세우스의 변종으로 파악되며, 이러한 근거에 의해 그 발생학적 계보(Phylognetic tree)를 그려보면 도 3처럼 도시할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명에 사용되는 미생물 유산균주는 당자화능 및 유전학적 분석에 의하여 페디오코커스 펜토사케우스(Pediococcus pentosaceus)로 동정되는 것으로서, 이를 구체적으로 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8로 명명하고, 2002년 6월25 일부로 대한민국 미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하여 균주기탁번호 KCTC 10297 BP를 부여받았다.
유산균 CBT-8의 항균영역 및 항균활성
본 발명에 따른 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스 CBT-8이 갖고 있는 항균영역과 항균활성도를 페디오코커스 펜토사세우스 CBT-8의 배양여액을 사용하여 각 지시균의 배양평판에 대한 생육 저해 활성도를 측정하여 확인해 본 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
마이크로오르가니즘 인디케이터(microorganism indicator) AU/ml(Culture broth)
헬리코박터 파일로리(H.pylori) ATCC 43504 1,600
리스테리아 이바노이(L. ivanoii) KCTC 3444 100
리스텔리아 그라비(L. gravy) KCTC 3443 3,200
리스테리아 세엘리거(L. seeliger) KCTC 3591 200
리스테리아 벨시메리(L. welshimeri) KCTC 3587 800
리스테리아 오노큐아(L. innocua) KCTC 3587 400
리스테리아 모노사이토진(L. monocytogenes) KCTC 3569 1,600
살모넬라 갈리나룸(S.gallinarum) ATCC 9184 200
프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium.acnes) ATCC29399 200
상기 표 4에 나타난 결과로 확인해보면, 식중독 원인균인 리스테리아 모노사이토진균과 위염증 원인균인 헬리코박터 파일로리균의 생육을 강력하게 저해한다.
본 발명에 따른 유산균주를 이용하여 최종 응용단계인 기능성 식품이나 의약품으로 활용하기 위한 농축된 건조분말을 형성하는 단계는, (a)유산균 CBT-8의 선발단계, (b)유산균 배양단계, (c)항균물질 발효단계, (d)발효액의 농축 및 젖산제거단계 및 (e)농축액의 건조분체화 단계로 순차적으로 진행(도 4 참조)되며, 이하에서는 이들 각각의 단계에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다.
(a) 유산균 CBT-8의 선발단계
지시균으로서 헬리코박터 파일로리균을 사용하여 10% 말 혈청액(Horse serum)이 첨가된 콜롬비아 블러드 아가(Colombia blood agar) 평판 배지에서 37℃, 10% CO2 조건으로 배양하고, 리스테리아 모노사이토진균에 대해서는 ATP 배지에서 37℃ 및 통성조건에서 배양한 여액을 사용한 생육 저해 활성도 측정을 통하여 각각 800Au/ml, 800Au/ml 이상의 항균활성을 발휘하는 유산종균을 선발한 후 발효생산 배지조건에서 배양하여 접종액으로 사용한다.
(b) 유산균 배양단계
중량비 3 내지 5% 범위의 포도당, 0.5 내지 1% 범위의 효모추출물, 1 내지 1.5% 범위의 육엑기스, 0.5 내지 1% 범위의 단백가수분해물, 0.01% 내지 0.1% 범위의 암모니움 시트레이트, 소듐 아세테이트, 디포타슘 포스테이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소듐 클로라이드 등을 포함하는 이온성분을 물에 용해시키고 혐기적 발효관에서 살균시킨 후, 상기 선발된 유산종균을 배양한다.
(c) 항균물질 발효단계
항균물질 발효공정의 경시변화는 도 5에 도시하였으며, 상기 도 5에서 "L.m"은 리스테리아 모노사이토진의 항균활성도를 나타내며, "H.p"는 헬리코박터 파일로리균의 항균활성도를 구별하기 위한 식별자로 기재되었다. 상기 도 5에 도시된 바에 따르면, 발효 개시 후, 16시간 경과할 때, 위염증 원인균인 헬리코박터 파일로리균에 대하여는 최대 1600 Au/ml의 저해활성을 나타내고, 리스테리아 모노사이토진에 대해서는 1600 Au/ml의 저해활성을 나타내는 항균활성 물질이 생산됨을 알 수 있다.
(d) 발효액의 농축 및 젖산제거단계
상기 발효단계를 종료한 후, 발효액은 15,000 RPM 이상의 고속원심분리기나 균체분리용 한외여과기에 의해 균체로부터 분리시킨다. 균체가 분리된 발효여액은 배제분자량 10,000 정도인 한외여과막(Ultra filtration membrane)에 1차 여과하고 투과액에 대하여 배제분자량 1000 정도인 나노미터여과막(Nanometer membrane)에 의하여 분리 추출함으로써 분자량 1,000에서 10,000사이의 활성분획만을 포집하여농축시킨다.
상기 농축액에 대해서는 5배량의 무균수를 연속적으로 가하며 pH가 6.0이상이 될 때까지 다이아 여과(Dia-filtration)하여 유기산 성분을 완전 제거하고 유기산이 제거된 최종 농축액의 부피는 발효원액에 대비하여 1/10의 부피로 조절한다. 발효액으로부터 항균물질을 분리 포집하고 젖산을 제거하는 공정에서의 항균활성물질의 경시변화는 하기 표 5에 나타내었으며, 최종 농축액의 항균활성 자료는 도 6에 도시되어 있으며, 상기 도 6은 본 발명에 따른 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스 CBT-8의 배양농축액에 대한 생육저지환(Clear zone) 시험 결과를 나타낸 사진이다.
공 정 항균활성
헬리코박터 파일로리균 리스테리아 모노사이토진균
16시간 발효원액 1,600 Au/ml 1,600 Au/ml
균체제거 발효원액 1,600 Au/ml 1,600 Au/ml
항균물질 농축액 16,000 Au/ml 16,000 Au/ml
건조분말 16,000 Au/ml 16,000 Au/ml
(e) 농축액의 건조분체화 단계
상기 농축액의 중량 대비 1 내지 10%의 유당, 말토덱스트린, 만니톨, 탈지분유를 혼합하여 용해시키고 80℃의 온도 조건에서 교반시키면서, 2회 30분간 열처리 함으로써 기타 잡균 및 잔존 유산균 등을 살균한 후, 동결건조기에 투입하여 건조시키거나 또는 분사식 유동층건조기를 이용하여 건조시킨 후, 건조물을 분쇄하여 분말을 제조한다. 이후, 응용제품의 용도에 맞추어 추가로 첨가되는 각종 부형제및 희석제의 종류와 그 첨가량 등을 다양한 형태로 변형시켜 사용한다.
본 발명에 따른 유산균을 활용하여 위염증 원인균인 헬리코박터 파일로리균과 식중독 원인균인 리스테리아 모노사이토진 균의 생육을 저해하는 항균활성물질을 제조하는 방법을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
실시예 1
먼저, 포도당 25㎏, 육엑기스 5㎏, 효모추출물 2.5㎏, 카제이펩톤 2.5㎏, 소이펩톤 2.5㎏, 디포타슘 포스페이트 0.25㎏, 암모니움 시트레이트 0.25㎏, 소듐 아세테이트 0.25㎏, 마그네슘 설페이트 0.05㎏, 망간 설페이트 0.05㎏을 물 500L에 첨가하여 용해시키고 800L 용량의 혐기적 발효관에 이송하여 121℃에서 15분간 살균하여 상온으로 냉각시킨 후 미리 배양한 종균 10L를 접종하여 20시간 발효시킨다.
이어서, 상기 발효액을 60L/h의 유속으로 연속식 원심분리기에 이송시키면서 균체를 제거하고, 배양여액을 배제분자량 10,000의 한외여과기 필터에 통과시키고 투과액을 회수하여 다시 배제분자량 1,000의 나노미터 필터에 통과시켜 분자량 1000 내지 10,000사이의 항균물질 농축액을 50L를 획득한다.
이후, 상기 농축액에 대하여 다시 5배량의 무균수를 연속적으로 가하며 배제분자량 1,000의 나노미터 필터에 통과시켜 투과액과 농축액을 재분리한다. 이 공정에서 잔존유기산, 색소, 불용성 성분 등이 완전히 제거되었고, 헬리코박터 파일로리균 및 리스테리아 모노사이토진균에 대하여 항균활성을 지닌 분자량 1000 내지 10,000사이의 항균물질분획이 선택적으로 분리농축되어진다.
상기 분리 농축된 항균물질 포집액은 최종 부피를 발효원액의 1/10수준으로 농축하면, 위염증 및 식중독 원인균에 대한 항균활성 또한 10배로 농축된다. 항균물질 분리 농축액의 중량에 대비하여 5 내지 50% 범위의 만니톨, 유당 등의 수용성 부형제를 사용하여 동결건조 또는 분사식 유동층 건조하여 수용성 분말화한다. 이때 항균활성은 최종 분말의 경우 1,600 내지 16,000 Au/g이 되도록 희석비를 조정할 수 있다.
이상의 본 발명에 따른 유산균주로부터 제조된 항균물질과 그 농축과정 등을 진행하여 제조된 최종 산물인 항균활성물질은, 식중독 원인균인 리스테리아 모노사이토진과 위염증 원인균인 헬리코박터 파일로리균의 생육을 강력하게 저해하고, 장질환 유발균인 살모넬라 갈리나룸과 여드름증 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스 등에도 동시에 항균활성을 나타내고 있음을 알아본 바와 같으므로, 이를 유해균의 감염예방이나 치료목적으로 제조된 소정의 식품 또는 의약품에 활용할 수 있으며, 경우에 따라서는 제조에서부터 섭취에 따른 소비과정에 상당한 기간이 소요되는 식품 등에서 유해균을 차단시키기 위한 목적으로 식품보존제로도 활용될 수 있음을 다음 실험예 1 내지 3을 통해 구체적으로 알아보기로 한다.
실험예 1
본 실험예 1에서는 감염균으로 헬리코박터 파일로리균을 이용하고, 이에 대한 감염방지 및 제균효과를 확인하기 위해, 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 CBT-8 생균과 항균활성물질(상품명 "SAFELAC") 분리건조물 등 총 2개의 시료를 이용하였으며, 대상 임상물로는 6주령의 사막모래쥐(Gerbil)를 이용하였으며,병소감염테스트(ELISA Test)에 의하여 항체가의 변화를 관찰하였다.
이때, 각 실험구는 비투여 대조구(A군), 감염균에 의한 감염구(B군), 항균활성물질 경구투여후 감염균으로 감염시도구(C군), 감염균에 감염된 후 항균활성물질에 의한 치료시도구(D군), 감염균과 항균활성물질 동시 투여구(E군) 등 총 5개의 실험구로 구분하여 부착방지 및 제균효과를 동시에 관찰하였다. 실험동물은 각 실험구별로 5마리씩 구성하였다. 이러한 실험을 위한 실험군의 구성은 하기 표 6에 따라 구성하였다.
실 험 군
대조구A 감염구B 경구투여후감염시도구C 감염후치료시도구D 동시투여구E
실험쥐 No. 5 5 ×2 5 ×2 5 ×2 5 ×2
감염균(H.파일로리균)투입량 - 108cells/0.3 ml 108cells/0.3 ml 108cells/0.3 ml 108cells/0.3 ml
항균활성물질(상품명"SAFELAC") 투입량 - - 50 Au/0.2 ml 50 Au/0.2 ml 50 Au/0.2 ml
처리내용 무처리 7일간H.pylori경구투여감염 시도 30일간SAFELAC경구투여종료 후7일간H.pylori경구투여감염시도 H.pylori감염확인 후30일간SAFELAC경구투여 30일간SAFELAC경구투여하며,초기 7일간H.pylori경구투여감염시도
확인내용 대조구 감염 확인 감염 방지 확인 제균 효과 확인 감염 방지 확인
각 실험군에 따른 기간별 항체가의 변화에 대해서는 하기 표 7에 나타내었다.
구 분 항체가온도(℃)
기간(일) 0 30 45 65 80
실험구 A 1 1 1.4 1 1.3
실험구 B 1 3.4 4 3.6 3.2
실험구 C 1 1 0.9 1 0.9
실험구 D 1 4 4.1 3 1.8
실험구 E 1 1 1 1.3 1.25
상기 표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 실험대조구와 각 실험구에 대해 개별적이고 구체적으로 진행된 실험내용과 그 결과에 대해 설명하면 다음과 같다.
상기 실험예 1에서, 상기 대조구(A군)를 제외한 나머지 실험군(B, C, D 및 E군)의 경우 생균의 경구 투여를 통해 감염시도를 행하는 헬리코박터 파일로리균의 농도는 108 cells/0.3㎖를 사용하였고, 항균물질 분리건조물의 경우는 항균 활성도가 50 Au/0.2㎖인 것을 사용하였다.
한편, 헬리코박터 파일로리균의 감염은 7일간 경구투여 후 항체가를 측정하여 감염을 확인하였고(B군), 부착방지능을 검토하기 위한 실험구(C군)의 경우에는 항균물질 분리건조물 시료를 30일간 경구투여 후, 그 투여를 중지하고 헬리코박터 파일로리균의 감염을 시도하였다.
그 결과, 헬리코박터 파일로리균의 사막모래쥐 모델에서의 헬리코박터 파일로리균을 경구 투여 종료 후 약 3주 경과시에 항체가가 3.4 이상으로 상승하여 감염이 확인되었으며(B군), 항균물질 분리건조물 시료를 먼저 경구투여한 후 감염을 시도한 실험구(C군)의 경우 항체가 상승이 나타나지 않아 부착방지 및 감염방어 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 감염 후의 제균효과를 알아보기 위한 실험구(D군)에서는 30일 간의 시료투여 종료시점부터 항체의 감소가 발생하기 시작하여 3주 후 무처리구인 대조구(A군) 수준으로 감소하였다. 그리고, 헬리코박터 파일로리균과항균물질 분리건조물 시료를 동시에 투여한 실험구(E군)의 경우에도 항체 상승이 발생되지 않아 감염방어 효과를 확인할 수 있었다.
이상과 같은 실험을 통해서 살펴본, 헬리코박터 파일로리균에 대한 감염방어 (부착방지) 및 제균효과는 유산균 생균 시료에서도 같은 경향을 나타내고 있음을 확인하였으므로, 유산균 및 그 항균물질이 동시에 위염증의 예방과 치료효과를 발휘할 수 있는 것을 보여 주고 있다. 유산균의 경우에는 위점막 상피세포에 정착하기 좋은 세포구조를 지니어 헬리코박터 파일로리균의 부착지점을 경쟁적으로 선점하거나 위내에 정착 및 서식하여 항균물질 등을 분비하여 헬리코박터 파일로리균에 대한 부착억제 및 제균효과가 나타나는 것이며, 항균물질의 경우에도 위내 잔존하여 같은 효과를 나타내는 것으로서 이상의 결과에서 유산균 및 항균물질의 단독 사용 또는 동시사용에 의하여 헬리코박터 파일로리균에 대한 감염방어 및 위염증 제어효과를 발휘하고 있는 것을 확인하였다.
실험예 2
본 실험예 2에서는 헬리코박터 파일로리균의 보균자에 대한 요소호기시험에 관한 것으로서, 위내시경검사, 요소분해효소(rapid urease) 검사,13C-요소호기검사에 의하여 헬리코박터 파일로리균의 감염이 확인되고, 최소 1개월 전 약물치료 경력이 없으며 간, 담도, 췌장계의 만성질환자가 아닌 성인남녀 40명을 대상으로 하여 인체에서의 헬리코박터 파일로리균에 대한 제균효과를 검토하였다.
상기 실험예 2에서 이용되는 경구 투여 시료는 페디오코커스 펜토사세우스CBT-8 생균 1010개와 항균 활성이 10,000Au/ml인 항균물질이 포함된 팩(pack)을 1일 2회씩 4주간 복용시켰으며, 시료 복용 전과 후의 13C-요소호기검사에 의한 DOB30의 수치를 관찰하여 도 7에 나타내었다. 모든 측정치는 데이터베이스 통계 프로그램 (Dbstat program)을 이용하여 통계처리하였고, 페어드 티-테스트(paired t-test)를 사용하여 p값이 0.05미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다. 그 결과, 시료 복용 전과 후의13C-요소호기검사에 의한 DOB30의 수치는 평균 26에서 15.3으로 감소하여 약 42%의 감소가 관찰되어(도 7 참조) 제균작용이 진행되고 있음을 알 수 있으며, 특별한 부작용은 나타나지 않았음을 확인하였다. 또한, 동물실험 및 인비보(in-vivo) 타입의 임상실험결과에서도 부착방지(감염방어에 따른 위염증 예방) 및 치료효과(제균작용에 따른 병증개선)가 유의성 있게 인정되었음을 확인하였다.
실험예 3
본 실험예 3에서는 상용되고 있는 유제품중의 하나인 치즈에서의 리스테리아 모노사이토진에 대한 제균효과 검토하기 위하여, 유럽산(프랑스산과 이탈리아산) 치즈의 표면에 리스테리아 모노사이토진이 104/g 정도로 인위적 오염을 시키고, 본 발명에 따른 항균물질 농축분체(상품명: 1% SAFELAC, (주)쎌바이오텍사 생산) 용액을 치즈표면에 고루 분무한 뒤 상온(25℃)과 냉장온도(4℃이하에서 각각 방치하면서 생균수의 변화를 관찰하였다.
이때, 대조구로서는 리스테리아 모노사이토진을 오염시킨 후에 상기 항균물질 농축분체 용액으로 처리하지 않은 것을 사용하였다. 상기 실험예 3에서 사용된치즈는 두가지 종류로서, 하는 프랑스산 치즈이고, 다른 하나는 이탈리아산 치즈를 이용하였으며, 그 결과를 구분하여 하기 표 8에 도시하였다.
구분 온도(℃) 실험기간(일)
0 3 6 9 12
프랑스산 치즈 대조구1* 25 3.6 ×104 3.3 ×104 3.9 ×104 4.3 ×105 5.3 ×106
4 3.2 ×104 3.1 ×104 3.6 ×104 5.1 ×104 4.9 ×104
실험구1** 25 2.9 ×104 6.7 ×103 1.4 ×102 1.7 ×101 1.5 ×101
4 2.7 ×104 3.5 ×103 2.1 ×102 4.6 ×101 2.4 ×101
이탈리아산 치즈 대조구2* 25 3.5 ×104 8.3 ×104 9.9 ×105 1.2 ×106 3.3 ×106
4 3.3 ×104 4.1 ×104 4.6 ×104 5.8 ×104 6.2 ×104
실험구2** 25 3.9 ×104 7.7 ×103 1.6 ×102 2.9 ×101 1.1 ×101
4 3.6 ×104 7.5 ×103 3.2 ×102 3.7 ×101 1.5 ×101
(*)은 각 치즈에 대한 리스테리아 모노사이토진을 처리한 대조구이며,(**)는 각 대조구 치즈에 대비하여 항균활성물질(1%(w/v)SAFELAC Solution)을 처리한 실험예이며, 이들 각각의 수치는 CFU의 단위를 가짐.황균물질(SAFLAC)의 활성도(Activity) : 9600 Au/g
본 실험예 3에서의 대조구 1 및 2의 경우, 상온조건에서는 리스테리아 모노사이토진이 실험기간 내내 계속 증식하여 100배 가량 증식하였고, 냉장조건에서는 증식하지는 않았으나 생존상태를 유지하였다. 한편, 항균물질 농축분체 용액을 처리한 실험구 1 및 2의 경우에는 온도조건에 관계없이 리스테리아 모노사이토진이 점점 감소하여 종국에는 사멸하는 경향을 나타내고 있음을 확인하였다. 따라서, 제조 및 유통기간 중 리스테리아 모노사이토진에 의한 오염발생 가능성이 높은 식품에 대하여 본 발명에 따른 항균물질 농축분체용액을 식품보존제로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2 페디오코커스 펜토사세우스( Pediococcus pentosace us) CBT-8균 항균물질 농축건조물을 이용한 기능성 식품의 제조
혼합유산균 13.35%, 무수결정포도당 34.5%, 오렌지맛 8%, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)CBT-8 균 항균물질 농축건조물 6%, 비타민C 2%, 분산제 (스테아린산 마그네슘) 0.1%, FOS (fructo-oligo saccharide) 12%, 퍼미자임(일종의 소화효소로서 알파 아밀라아제) 0.15%, 알로에 1.4%, 식물성분말크림 2% 및 순수 22.5%를 혼합하여 통상의 방법으로 기능성 식품을 제조하였다.
이상에서 설명된 본 발명의 최적 실시예들이 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 당업자에게 본 발명을 상세히 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용된 것이 아니다.
본 발명에 따른 유산균주로부터 제조된 향균물질을 위염증 원인균인 헬리코박터 파일로리균에 대하여 특이적인 생육 저해활성을 지니며 동시에 식중독의 원인균인 리스테리아 모노사이토진균에 대해서도 특이적인 제균활성을 지니고 있다. 또한, 상기 항균물질을 발효과정을 거쳐 농축 건조시켜 제조된 건조분말은 수용성 항균성분의 분리농축물로서 다양한 식품, 의약품 및 식품보존제 제조에 적합한 물성을 지니고 있으며, 이를 응용하여 제조된 기능성 식품이나 의약품을 이용하는 경우에는 헬리코박터 파일로리균 및 리스테리아 모노사이토진균에 대한 생육억제 및 제균작용을 발휘하므로, 감염에 대한 치료 및 예방 효과를 달성할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

Claims (7)

  1. 헬리코박터 파일로리균에 대한 생육 억제능과 리스테리아 모노사이토진균에 대한 생육 억제능을 갖는 항균활성물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주(균주기탁번호 KCTC 제10297BP호).
  2. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주를 이용하여 헬리코박터 파일로리균과 리스테리아 모노사이토진균 모두에 항균활성도를 갖는 항균활성물질을 제조하는 방법에 있어서,
    (a) 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주를 준비하는 단계;
    (b) 상기 준비된 유산균에 중량대비 3 내지 5 중량%의 포도당, 0.5 내지 1 중량%의 효모추출물, 1 내지 1,5 중량%의 육엑기스, 0.5 내지 1 중량%의 단백질가수분해물, 0.01 내지 0.1 중량%의 암모늄 시트레이트, 소듐 아세테이트, 디포타슘포스테이트, 마그네슘 셀페이트, 망간 셀페이트, 소듐 클로라이드 중 선택된 하나 이상의 이온결합성화합물을 첨가하여 물에 용해시키는 단계;
    (c) 상기 첨가물이 포함된 수용액을 살균하는 단계; 및
    (d) 상기 살균된 수용액에 상기 (a) 단계에서 준비된 유산균주를 투입하고 혐기적 발효관에서 배양하는 단계;를 포함하여 진행하는 것을 특징으로 하는 항균물질 제조방법.
  3. 제4항에 있어서,
    상기 (d)단계 이후에, 상기 제조된 항균물질에 대해 고속원심분리 또는 여과장치를 이용하여 농축하는 단계를 더 포함하여 진행하는 것을 특징으로 하는 항균물질 제조방법.
  4. 제5항에 있어서,
    상기 여과장치를 이용하여 농축하는 단계는, 제1여과단계에서는 최대배제분자량을 초과하는 물질을 제거하고, 제2여과단계로 최소배제분자량 미만의 물질을 연속적으로 제거하여 소정 범위의 분자량을 갖는 항균물질만을 농축하는 2단 여과방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항균물질 제조방법.
  5. 제5항에 있어서,
    상기 농축단계진행 결과물인 항균물질 농축액에 대해 동결건조방식 또는 분사식 유동층 건조방법에 따라 건조시키는 단계를 더 포함하여 진행하는 것을 특징으로 하는 항균물질 제조방법.
  6. 식품에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주로부터 생산되는 헬리코박터 파일로리균 및 리스테리아 모노사이토진에 대한항균특성을 갖는 항균물질을 첨가하는 것을 특징으로 항균물질 이용방법.
  7. 의약품에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CBT-8인 유산균주로부터 생산되는 헬리코박터 파일로리균 및 리스테리아 모노사이토진에 대한 항균특성을 갖는 항균물질을 첨가하는 것을 특징으로 항균물질 이용방법.
KR10-2002-0062825A 2002-10-15 2002-10-15 파일로리 및 리스테리아 모노사이토진의 생육을 억제하는 항균활성물질을 생산하는 페디오코커스 펜토사세우스ｃｂｔ-8로 명명되는 유산균주, 이를 이용한 항균특성을 갖는 항균물질 제조 방법 및 그 제조된 항균물질 기능성식품 및 의약품에 이용하는 방법 KR100483369B1 (ko)

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KR10-2002-0062825A KR100483369B1 (ko) 2002-10-15 2002-10-15 파일로리 및 리스테리아 모노사이토진의 생육을 억제하는 항균활성물질을 생산하는 페디오코커스 펜토사세우스ｃｂｔ-8로 명명되는 유산균주, 이를 이용한 항균특성을 갖는 항균물질 제조 방법 및 그 제조된 항균물질 기능성식품 및 의약품에 이용하는 방법
JP2003354432A JP3810403B2 (ja) 2002-10-15 2003-10-14 ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）及びリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の生育を抑制する抗菌活性物質を生産するペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＣＢＴ−８と命名される乳酸菌株、これを利用した抗菌特性を持つ抗菌物質製造方法、並びに生菌剤抗菌物質を機能性食品及び医薬品に利用する方法

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