JP4224313B2 - アミラーゼ阻害物質の調製方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、小麦粉または小麦グルテンからアミラーゼ阻害物質を、簡単な工程で、生産性よく高収率で調製する方法に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
近年、食習慣の変化などにより、糖尿病をはじめとする代謝性疾患が急増している。過剰の栄養摂取はインシュリンの大量分泌を誘導するため間接的に代謝バランス崩壊の原因となり、耐糖機能の低下（高血糖）、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の代謝性疾患につながる。特に、糖尿病患者ではインシュリン作用が不足し耐糖能が低下しているので、食後の血糖値の上昇が著しく、毛細血管の損傷や動脈硬化などの合併症の原因となっている。
【０００３】
上記したような疾患の予防および治療には、必要な栄養を摂取しても血糖値が上昇しにくい効果や、インシュリンの大量分泌を抑制できる効果を有する薬剤や食品の摂取が有効であるとされている。そのため摂取した澱粉が糖に分解するのを抑制または阻害し得る物質およびインシュリンの分泌を抑制し得る物質が求められてきた。
【０００４】
上記の点から、澱粉を糖に分解するアミラーゼの活性を阻害する作用を有するいわゆるアミラーゼ阻害物質に対する研究が色々行われるようになっており、小麦中にもアミラーゼ阻害物質が含まれていることが報告されて以来、小麦由来のアミラーゼ阻害物質に関する研究や開発が種々なされるようになった。
小麦由来のアミラーゼ阻害物質としては、１２４個のアミノ酸からなる分子量１３,３３７のサブユニット２個から構成され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動では移動度０．１９の位置に単一のバンドが認められる蛋白質である「０．１９ＡＩ」(AI: Amylase Inhibitor)（Swiss Port: ID=IAA1_WHEAT）、および、１２３個のアミノ酸からなる分子量１３,３２６のサブユニット２個から構成され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動では移動度０．２8の位置に単一のバンドが認められる蛋白質である「０．２８ＡＩ」（特許文献１参照，Swiss Port: ID=IAA2_WHEAT）、１２４個のアミノ酸からなる分子量１３,１８５のサブユニット２個から構成され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動では移動度０．５３の位置に単一のバンドが認められる蛋白質（特許文献２参照，Swiss Port: ID=IAA5_WHEAT）などがあり、これらが血糖値上昇の抑制、インシュリン分泌調節に効果があることが知られている。ここで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による移動度は、非特許文献１に記載のように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％、ｐＨ９．５）でブロムフェノールの移動度を１としたときの移動度である。
【０００５】
また、特許文献３および特許文献４は、小麦から水、酸または含水アルコールで抽出したアミラーゼ阻害物質を糖尿病や肥満などの治療に用いることを開示している。しかし、これらの従来技術により得られる小麦由来のアミラーゼ阻害物質は、人間に経口で投与した場合に期待どおりの効果が見られず、特に米飯のような加熱調理した澱粉の消化に対しては糖への分解抑制作用が低く、しかも高価であるなどの欠点を有する。
【０００６】
特許文献５は、小麦、小麦粉または小麦グルテンを、水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールで抽出して得た抽出液、或いは小麦粉等から澱粉を取得した後の澱粉廃液に、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類を加えて不溶性の複合体を形成させて分取し、該複合体を溶媒に溶解もしくは分散させ、次いでこの複合体中の多糖類を分離除去した後に、得られた溶液を更に陽イオン交換樹脂で処理する工程を施し、その陽イオン交換樹脂通過画分からアミラーゼ阻害物質を回収することからなるアミラーゼ阻害物質の調製方法を開示している。また、当該方法により得られるアミラーゼ阻害物質が極めて高いアミラーゼ阻害活性を有する一方でトリプシン阻害活性を示さないこと、およびアミラーゼ阻害物質が、膵液中に含まれるアミラーゼに対して高い阻害活性を有していて、インシュリンの分泌節約に極めて有効であることを開示している。
【０００７】
さらに、特許文献６には、処理量が多くなってもロスの発生を抑制しながら、良好な操作性で目的とするアミラーゼ阻害物質を大量に取得できる方法を記載している。前記方法は、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性の複合体から多糖類を分離除去した後のアミラーゼ阻害物質を含む液から、アミラーゼ阻害物質を含有する液中の蛋白質の４０〜７０％の蛋白質を沈殿させる工程、沈殿した蛋白質を水に溶解させてアミラーゼ阻害物質を含有する液を再度得る工程、その液にカルシウムイオンとリン酸イオンを加えてアミラーゼ阻害物質を含む不溶性複合体を生成させ、その不溶性複合体を分別する工程、次いで分別した不溶性複合体からアミラーゼ阻害物質を水に可溶化させてアミラーゼ阻害物質を含有する液を得る工程からなる。そしてその結果得られる最終生成物はアミラーゼ阻害物質の含有率が高く、より強いアミラーゼ阻害活性を有している。
【０００８】
前記特許文献５および特許文献６に記載の方法によれば、トリプシン阻害活性がないかまたは極めて低く、しかもアミラーゼ阻害活性の極めて高いアミラーゼ阻害物質０．１９ＡＩを多く含むアミラーゼ阻害物質を得ることができ、これらの方法により得られるアミラーゼ阻害物質は、膵液中に含まれるアミラーゼに対する阻害活性が高く、インシュリンの分泌抑制に有効であり、米飯のように加熱調理された澱粉が糖に分解されるのを効果的に抑制することができる。
【０００９】
しかし、特許文献５に記載の方法は、陽イオン交換樹脂を使用する必要があり、それに伴ってアミラーゼ阻害物質の取得に用いた陽イオン交換樹脂を使用後に洗浄・再生する必要がある。また、上記特許文献６の方法は操作が多く工程が長く複雑である。このため、より簡単な工程で、しかも短い処理時間で、アミラーゼ阻害物質を生産性よく調製することができる効率のよい方法の出現が求められてきた。
【００１０】
【特許文献１】
特開平７−４１４９９号公報
【特許文献２】
特開平９−１９４３９２号公報
【特許文献３】
特開昭４６−１８３３号公報
【特許文献４】
特開昭６１−１７１４３１号公報
【特許文献５】
特開平５−３０１８９８号公報
【特許文献６】
特開平７−４８２６８号公報
【非特許文献１】
J Sci. Food Agric., 20, p.260-261 (1969)
【００１１】
【発明の目的】
本発明は、アミラーゼ阻害物質、特にアミラーゼ阻害活性の高い０．１９ＡＩを多く含むアミラーゼ阻害物質を、簡単な工程でかつ短い時間で、高収率で生産性良く得ることのできるアミラーゼ阻害物質の調製方法を提供することを目的としている。
【００１２】
【発明の概要】
本発明は、アミラーゼ阻害物質の調製方法であって、
（Ａ）下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）によりアミラーゼ阻害物質を含有する原料液を得る工程；
（Ａ１）小麦粉または小麦グルテンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールを用いて抽出処理する；
（Ａ２）小麦粉または小麦グルテンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールを用いて抽出処理した後に、酸処理および／または熱処理を行って、夾雑する不要な蛋白質を変性させて除去する；
（Ａ３）前記（Ａ１）または（Ａ２）の方法によって得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、生成した不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去する；
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、塩を加えてアミラーゼ阻害物質を不溶物として塩析させ、塩析した不溶物を回収する工程；および、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で回収した不溶物をそのまま乾燥処理するか、または該不溶物を水に溶解して水溶液にし該水溶液から塩を除去した後の水溶液を乾燥処理して、アミラーゼ阻害物質を回収する工程；
を有することを特徴としている。
【００１３】
本発明の方法において、前記工程（Ｂ）で塩析に用いる塩は塩化ナトリウムであることが好ましく、前記工程（Ｂ）の塩析時に、液中にカルシウムイオンを存在させることも好ましい。また、前記工程（Ｂ）の塩析を、液のｐＨを３〜４に調整して行うことも好ましい。
さらに、上記アミラーゼ阻害物質の調製方法では、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）のうちの少なくとも１つの工程を、アスコルビン酸および／またはシステインを添加して行うことが好ましい。
【００１４】
また、前記工程（Ｂ）の塩析に用いるアミラーゼ阻害物質を含有する液が、工程（Ａ）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する原料液を濃縮してなる濃縮液であることが好ましく、濃縮液のタンパク質濃度が１〜１００ｍｇ／ｃｍ³であることがより好ましい。
本発明のアミラーゼ阻害物質の製造方法においては、前記工程（Ａ３）が、前記（Ａ１）または（Ａ２）の方法によって得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、（Ｉ）アミラーゼ阻害物質を含有する原料液のｐＨを４．５〜５．５の範囲に調整し、これに多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との会合体溶液を調製した後、ｐＨを３．０〜４．０の範囲に調整することにより、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、次いで、（II）該不溶性複合体を液から分取して、不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去し、アミラーゼ阻害物質を溶液として回収する工程であることが好ましい。
【００１５】
上記方法においては、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体からの多糖類の分離を、グルカナーゼの作用下に行い、分離した不溶性多糖類を濾過して除去することが好ましく、不溶性多糖類の濾過を濾過助剤を添加して行うことがより好ましい。さらに、多糖類の分離時または分離後に、アミラーゼ阻害物質を含有する液を５０℃以上の温度に加熱することが好ましい。
【００１６】
【発明の具体的説明】
以下、本発明のアミラーゼ阻害物質の調製方法について具体的に説明する。
工程（Ａ）
工程（Ａ）では、小麦粉または小麦グルテンから、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液を調製する。アミラーゼ阻害物質を含有する原料液は、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）のいずれかにより得るのが好ましい。
（Ａ１）小麦粉または小麦グルテンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールを用いて抽出処理する；
（Ａ２）小麦粉または小麦グルテンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールを用いて抽出処理した後に、酸処理および／または熱処理を行って、夾雑する不要な蛋白質を変性させて除去する；
（Ａ３）前記（Ａ１）または（Ａ２）の方法によって得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、生成した不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去する。
【００１７】
工程（Ａ１）または（Ａ２）における抽出処理は、水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールのいずれを用いて行ってもよい。
工程（Ａ１）または（Ａ２）における抽出処理を、水を用いて行う場合、その抽出条件などは特に制限されず、任意の方法で小麦粉または小麦グルテンからの抽出水溶液を得ることができる。
【００１８】
たとえば、一般に小麦粉から澱粉やグルテンを採取する際には、小麦粉に水を加えて混練してドウ（生地）またはバッターをつくり、これをねかせてグルテンを充分に水和させた後、加水しながら生地の洗浄を繰り返し、グルテンと澱粉乳（グルテン洗液）とに分離し、この澱粉乳から機械的分離等により澱粉を回収する方法が広く採用されている。その際発生する水溶液中には、アミラーゼ阻害物質が含まれているので、この水溶液を本発明の方法における原料液とすることができる。この場合、小麦粉からマーチン法またはバッター法により澱粉およびグルテンを製造する際に廃液として排出される水溶液を有効利用することができるため極めて好ましい。
【００１９】
工程（Ａ１）または（Ａ２）における抽出処理を、希酸を用いて行う場合には、塩酸、リン酸などの無機酸、酢酸などの有機酸で、ｐＨを約２〜６、好ましくは２〜４に調整した酸性水溶液を用いるのが望ましい。
工程（Ａ１）または（Ａ２）における抽出処理を、希アルカリを用いて行う場合には、アンモニア、水酸化ナトリウムなどで、ｐＨを約８〜１０に調整したアルカリ性水溶液を用いるのが望ましい。
【００２０】
工程（Ａ１）または（Ａ２）における抽出処理を、含水アルコールを用いて行う場合には、アルコール濃度約１〜５０重量％のアルコール水溶液を用いるのが望ましく、その際のアルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等を用いることができる。
また、工程（Ａ１）または（Ａ２）における抽出処理は、通常、約１０〜４０℃の温度、例えば室温で撹拌しながら行う。
【００２１】
工程（Ａ１）では、抽出処理後、遠心分離、濾過、静置等の任意の方法で固形分を除去することによって、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液を得ることができる。
また、工程（Ａ２）では、抽出処理後、酸処理および／または熱処理を行って、夾雑する不要な蛋白質を変性させて除去することによって、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液を得ることができる。酸処理は、アミラーゼ阻害物質を含有する抽出液をｐＨ２〜４に調整して静置する方法、熱処理は温度７０〜９０℃、好ましくは８５〜９０℃に加熱する方法が好ましく採用される。前記変性処理を行うことによって、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液中に含まれていた不要な蛋白質が変性されて水不溶性となるので、その水不溶性の不要蛋白質を遠心分離、濾過、静置等の任意の方法で除去することによって、次の工程（Ｂ）に用いるアミラーゼ阻害物質を含有する原料液を得ることができる。
【００２２】
さらに、工程（Ａ３）では、工程（Ａ１）または（Ａ２）によって得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、アミラーゼ阻害物質と不溶性複合体を形成し得る多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、生成した不溶性複合体を分取し、不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離・除去し、アミラーゼ阻害物質を含有する液として回収する。この工程（Ａ３）によりアミラーゼ阻害物質を濃縮し、高濃度の原料液を調製することができる。
【００２３】
工程（Ａ３）において用いる多糖類は、アミラーゼ阻害物質と不溶性の複合体を形成し得る多糖類であればいずれでもよいが、例えばアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、κ−カラギーナン、ι−カラギーナン、λ−カラギーナンなどのカチオン交換機能を有する多糖類、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム等を挙げることができる。収率などの点からアルギン酸ナトリウムが好ましい。
【００２４】
多糖類は、工程（Ａ１）または（Ａ２）で得られるアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、通常、５０〜６００ｐｐｍの量になるようにして添加する。
工程（Ａ３）では、原料液のｐＨを通常２〜５．５、好ましくはｐＨ４．５〜５．５の範囲に調整し、これに多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との会合体を形成させる。次いで、ｐＨを３．０〜４．０に調整することにより、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を形成させる。この工程によれば、濾過やその他の分離手段で分離し易い、大きな塊状の不溶性複合体を形成させることができる。
【００２５】
（Ａ３）の方法における、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体の形成は、加温下で行うこともできるが、室温または冷却下で行うのが好ましい。生成した不溶性複合体は、自然沈降、濾過、遠心分離、その他適当な方法で液から分取することができる。
次いで、得られたアミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体から、多糖類を解離液中で不溶性多糖類として分離・除去し、アミラーゼ阻害物質を溶液として回収する。
工程（Ｂ）
工程（Ｂ）は、前記工程（Ａ）で得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、塩を加えてアミラーゼ阻害物質を不溶物として塩析させ、塩析した不溶物を回収する工程である。
【００２６】
工程（Ｂ）では、工程（Ａ１）、または（Ａ２）で得られた原料液をそのまま用いてもよいし、工程（Ａ１）、または（Ａ２）で得られた原料液を工程（Ａ３）またはその他公知の濃縮法に供して得られる濃縮された原料液を用いてもよい。
濃縮液を用いると、液中のアミラーゼ阻害物質の含有量が高くなって、塩の添加によってアミラーゼ阻害物質が高率で塩析され、アミラーゼ阻害物質の回収率を向上させることができるため好ましい。濃縮の程度は、濃縮前の抽出液中に含まれるアミラーゼ阻害物質の量などに応じて調整し得るが、通常は、濃縮後の液中のタンパク質濃度が１〜１００ｍｇ／ｃｍ³の範囲になる程度に濃縮するのが、アミラーゼ阻害物質の回収率、不純物の混入抑制、操作の容易性などの点から好ましい。
【００２７】
アミラーゼ阻害物質を含有する抽出液の濃縮は、工程（Ａ３）の他、減圧濃縮、限外濾過などの方法により行うことができる。
工程（Ｂ）の塩析を行うに当たって、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液中に、アミラーゼ阻害物質以外の不純蛋白質などの不純物が不溶物として懸濁または沈殿している場合は、そのような不純物を濾過、遠心分離、デカンテーションなどによって除去してから塩析を行うことが望ましい。
【００２８】
特に、濃縮液を用いる場合は、アミラーゼ阻害物質以外の不純蛋白質などの不純物が液中に懸濁していることが多いので、そのような不純物を例えば酸処理、アルギン酸処理などにより除去してから塩析を行うのが望ましい。
工程（Ｂ）において、アミラーゼ阻害物質の塩析に用いる塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸カルシウムなどを挙げることができ、そのうちでも塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムが好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。塩化ナトリウムを用いると、工程（Ａ）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する原料液中のアミラーゼ阻害物質が良好に析出し、しかも次の工程（Ｃ）において塩の除去が容易であり、その上環境汚染の問題が少ない。
【００２９】
塩析に用いる塩の量は、塩の種類、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液中でのアミラーゼ阻害物質の濃度、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液の濃縮の有無や濃縮の程度などに応じて調整し得るが、一般的には、液中の塩の濃度が１〜２０重量％、特に３〜１５重量％程度になるような量で用いると、アミラーゼ阻害物質を良好に析出させることができ、しかもアミラーゼ阻害物質以外のタンパク質の析出を防止できるので好ましい。
【００３０】
また、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの塩を用いて塩析させる場合に、それらの塩を単独で用いて塩析してもよいが、カルシウムイオンを生成する化合物（例えば、塩化カルシウム、臭化カルシウム、炭酸カルシウムなど）を併用して、カルシウムイオンの存在下に塩析を行うと、アミラーゼ阻害物質をより高率で塩析させることができる。その場合のカルシウムイオンの液中濃度は、１００〜１０,０００ｐｐｍ程度であることが塩析促進効果の点から好ましい。
【００３１】
工程（Ｂ）における塩析時の液の温度は、５０℃以下、特に３０℃以下であることが、アミラーゼ阻害物質の塩析が円滑に行われる点から好ましい。液の温度が５０℃を超えると、アミラーゼ阻害物質の変性や失活が起きる場合がある。
塩析時の液のｐＨは２〜８の範囲であることが、アミラーゼ阻害物質の塩析が効率よく行われる点から好ましく、３〜４の範囲であることがより好ましい。液のｐＨが２未満であったり、または８を超えると、塩析効率が低下してアミラーゼ阻害物質の回収率が低下する。
【００３２】
塩析により生成したアミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を液から分離・回収する。塩析物の分離・回収方法は特に制限されず、例えば、デカンター、濾過、遠心分離、自然沈降などにより行うことができる。工程（Ｂ）で得られる塩析物は液層から容易に分離するので、一般に用いられている固液分離方法を採用することにより円滑に分離・回収することができる。
【００３３】
このような工程（Ｂ）により得られた塩析物は、次工程（Ｃ）に用いる。
工程（Ｃ）
本工程は、（i）前記工程（Ｂ）で回収した不溶物をそのまま乾燥処理する工程、または（ii）工程（Ｂ）で回収した不溶物を水に溶解し、該水溶液から塩を除去した後に乾燥処理して、アミラーゼ阻害物質を回収する工程である。
【００３４】
上記（ii）の方法の場合には、アミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を水に溶解する際の水温が、１０〜８５℃、特に２０〜４０℃であることが、塩析物の水への溶解が促進され、かつアミラーゼ阻害物質の変性などが生じないことから好ましい。
また、その際の水の使用量は、塩析物の質量に対して、３〜３０質量倍であることが好ましい。
【００３５】
上記（ii）の方法において、塩析物の水溶液から塩を除去するに当たっては、限外濾過、透析、イオン交換などの方法を採用することができるが、そのうちでも限外濾過が装置メンテナンスの容易さなどの点から好ましい。
上記（ii）の方法では、塩析物の水溶液から塩を除去する前、除去時または除去した後に、必要に応じて不純物や菌などを除去するための処理（例えば濾過処理など）を行ってもよい。不純物や菌などの除去は、例えば、精密濾過膜、多孔質高分子膜、セラミックフィルターなどを用いて行うことができる。
【００３６】
工程（Ｃ）におけるアミラーゼ阻害物質を回収するための乾燥処理は、例えば、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥、ボール乾燥などにより行うことができる。そのうちでも、凍結乾燥、減圧乾燥がアミラーゼ阻害物質の変性防止の点から好ましい。さらに、アミラーゼ阻害物質を含有する水溶液を乾燥処理に供してもよいし、または該水溶液を濃縮してから乾燥処理を行ってもよい。そのうちでも、後者の方法が乾燥効率、仕上り品の嵩比重などの点から好ましい。
【００３７】
また、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）のうちの少なくとも１つの工程を、アスコルビン酸および／またはシステインを添加して行うことが好ましい。この場合には、液の着色が抑制され、その結果として白色またはそれに近い色調を有する、色調に優れるアミラーゼ阻害物質を得ることができる。
アスコルビン酸および／またはシステインの使用量は、液量に対して、１〜１，０００ｇ／ｍ³であることが好ましい。アスコルビン酸およびシステインが、アミラーゼ阻害物質を含有する液の着色抑制作用を有する理由は、液中に含まれていて液の着色に関与する酵素の活性をアスコルビン酸およびシステインが失活または低減させることによるものと考えられる。
【００３８】
本発明のアミラーゼ阻害物質の調製方法では、上記した工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）によって、アミラーゼ阻害活性の高い０．１９ＡＩなどを多く含むアミラーゼ阻害物質を、極めて簡単な工程で、短い時間で、多量に、生産性よく製造することができる。
次に、本発明のアミラーゼ阻害物質を含有する原料液の濃縮方法について説明する。
【００３９】
この方法は、
（Ｉ）アミラーゼ阻害物質を含有する原料液のｐＨを４．５〜５．５の範囲に調整し、これに多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との会合体溶液を調製した後、ｐＨを３．０〜４．０の範囲に調整することにより、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、次いで
（II）該不溶性複合体を液から分取して、不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去し、アミラーゼ阻害物質を溶液として回収することからなる。
工程（Ｉ）
本発明の濃縮方法において用いるアミラーゼ阻害物質を含有する原料液は、特に限定されないが、本発明のアミラーゼ阻害物質の調製方法の工程（Ａ１）または（Ａ２）で得られる原料液が好ましい。
【００４０】
この工程（Ｉ）で用いる多糖類としては、アミラーゼ阻害物質と不溶性の複合体を形成し得る多糖類であればいずれでもよく、具体例としては、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、κ−カラギーナン、ι−カラギーナン、λ−カラギーナンなどのカチオン交換機能を有する多糖類、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム等を挙げることができる。そのうちでもアルギン酸ナトリウムが収率などの点から好ましい。
【００４１】
多糖類は、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、通常、５０〜６００ｐｐｍの量になるようにして添加するのがよい。
工程（Ｉ）では、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液のｐＨを予め４．５〜５．５の範囲に調整し、多糖類を加えて会合体を生成させ、次いで混合液のｐＨを３．０〜４．０の範囲に調整することが必要である。
【００４２】
ｐＨ４．５〜５．５の範囲に調整した原料液に多糖類を加えることによって、アミラーゼ阻害物質と多糖類とからなる会合体が高い効率で形成され、その後にｐＨを３．０〜４．０の範囲に調整することにより、大きな塊状の不溶性複合体が形成される。その不溶性複合体は、自然沈降や遠心分離などによって液から容易に分離できる。その結果、原料液からアミラーゼ阻害物質を、高収率で回収することができる。通常、原料液中に含まれているアミラーゼ阻害物質の回収率は８０重量％以上である。
【００４３】
原料液のｐＨが４．５未満または５．５を超える状態で多糖類を添加すると、アミラーゼ阻害物質と多糖類が充分に会合せず、アミラーゼ阻害物質の回収率が低下する場合がある。
原料液のｐＨ調整には、原料液のｐＨ値などに応じて、塩酸、リン酸などの酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリを適宜用いることができる。
【００４４】
工程（Ｉ）におけるアミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体の形成は、加温下でも行いうるが、室温または冷却下、１〜３０℃で行うのが好ましい。一般には、約１〜３０℃において、原料液のｐＨを予め４．５〜５．５の範囲に調整した後に多糖類を添加して数十分〜数時間撹拌し、次いでｐＨを３．０〜４．０の範囲に調整して数十分〜数時間撹拌を続けると、大きな塊状の不溶性複合体が形成される。このため生成した不溶性複合体は、工程（II）において、自然沈降、濾過、遠心分離、その他適当な方法で液から分取することができる。このように工程（Ｉ）によれば、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体が大きな塊状で形成されるので、不溶性複合体を簡単に分取することができる。
工程（ II ）
本工程では、上記工程（Ｉ）で得た不溶性複合体を液から分取して、不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去し、アミラーゼ阻害物質を溶液として回収する。
【００４５】
不溶性複合体は、自然沈降、濾過、遠心分離、その他適当な方法で液から分取することができる。
工程（II）において、不溶性複合体から多糖類の分離は、通常、分取した不溶性複合体に解離液を加えて、解離液中で行う。解離液中では、不溶性複合体を形成していたアミラーゼ阻害物質と多糖類とは互いに解離して、これらは解離液中に溶解または膨潤する。解離液としては、単に水でもよく、或いはアンモニア、炭酸水素アンモニウム等を含む弱アルカリ性の水溶液、またはカルシウム、カリウムを含まない塩類の水溶液を使用してもよい。
【００４６】
不溶性複合体のアミラーゼ阻害物質と多糖類への解離は、室温下でも起こり得るが、通常約３０℃以上の加温下に行うと解離がより促進されるので好ましい。
特に、不溶性複合体からアミラーゼ阻害物質と多糖類の分離処理時または分離処理後にアミラーゼ阻害物質含有液の温度を５０℃以上、好ましくは６０℃以上、より好ましくは８０℃以上に少なくとも一度加温すると、通常褐色を呈する液が無色またはそれに近い色調（淡黄色）になり、その結果最終的に得られるアミラーゼ阻害物質の乾燥粉末の色調が白色またはそれに近いものになるため好ましい。
【００４７】
互いに解離したアミラーゼ阻害物質と多糖類を含む液に、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの金属イオンを添加すると、多糖類はゲル化して固形状の不溶物となり、一方アミラーゼ阻害物質はそのまま液中に溶存するので、この液を適当な分離処理に供することにより、ゲル化した不溶性多糖類を除去し、アミラーゼ阻害物質を含有する液を回収することができる。
【００４８】
多糖類がアルギン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、ι−カラギーナン、λ−カラギーナンなどである場合には、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの金属イオンの添加により、これら多糖類は容易に不溶性のゲル化物（不溶性多糖類）を生成する。例えば、解離したアルギン酸ナトリウムを含む液に塩化カルシウムを添加すると、アルギン酸カルシウムのゲル化物が容易に生成される。
【００４９】
生成した不溶性多糖類の分離または除去には、濾過、遠心分離などの分離法を採用することができるが、濾過法がアミラーゼ阻害物質の回収率、純度などの点で好ましい。
アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体から分離した不溶性多糖類を濾過によって分離除去するに当たっては、該不溶性多糖類は濾過性が悪く、フィルターの目詰まりなどによって長い濾過時間を要する。
【００５０】
そのため、多糖類からなる不溶性の固体分（不溶性多糖類）を分離する際に、液中にグルカナーゼを添加して、グルカナーゼの作用下に不溶性複合体のアミラーゼ阻害物質と多糖類への解離および／または解離した多糖類の不溶化（ゲル化）を行うと、分離した不溶性多糖類の濾過性能が向上し、不溶性多糖類を効率よく濾過・除去することができる。
【００５１】
グルカナーゼは、グルコースの多糖（グルカン）を加水分解してオリゴ糖またはグルコースを生成する酵素の総称であり、本発明ではいずれのグルカナーゼ、例えば「セルロシン」（阪急共栄物産株式会社）などのグルカナーゼを使用してもよい。
グルカナーゼは、不溶性複合体の懸濁液に最初（不溶性複合体から多糖類を解離させる前）、不溶性複合体のアミラーゼ阻害物質と多糖類との分離（解離）処理中、または分離した多糖類の不溶化（ゲル化）の際に添加してもよい。グルカナーゼは、不溶性複合体の分離（解離）処理中に添加することが、生成したゲル化多糖類（不溶性多糖類）の濾過性の向上の点から好ましい。
【００５２】
グルカナーゼの添加量は、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体またはその解離物を含む溶液または懸濁液１リットルに対して、０．１ｍｇ以上であることが好ましく、１〜１００ｍｇであることがより好ましい。
また、不溶性複合体から分離した不溶性多糖類を濾過して除去するに当たって、グルカナーゼと共に濾過助剤を添加すると、不溶性多糖類の濾過性が一層向上し、不溶性多糖類の分離除去をより円滑に行うことができる。このような濾過助剤としては、例えば、昭和化学工業社製の各種ラヂオライト、セライトコーポレーション製の各種セライト、タルクなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００５３】
濾過助剤の使用量は、被濾過固形物（主として不溶性多糖類）の質量の１／４０以上であることが好ましく、１／３０以上であることがより好ましい。
濾過助剤は、不溶性複合体から多糖類を解離させる前、不溶性複合体のアミラーゼ阻害物質と多糖類との分離（解離）処理中、または分離した多糖類の不溶化（ゲル化）の際に添加してもよい。不溶性複合体の分離（解離）処理中に濾過助剤添加することが、ゲル化多糖類（不溶性多糖類）の濾過性が一層良好になる点から好ましい。
【００５４】
不溶性多糖類を分離するに当たっては、加圧濾過機、遠心分離機などの分離装置を用いることができ、そのうちでも加圧濾過機が精密濾過の点から好ましく用いられる。加圧濾過機の形式などは特に制限されず、従来既知の装置を使用することができ、例えば自動薮田式濾過圧搾機、自動八重垣式濾過圧搾機などを挙げることができる。
【００５５】
上記の工程（II）で回収されたアミラーゼ阻害物質含有溶液は、必要に応じてさらに殺菌処理、除菌処理、陽イオン交換樹脂処理（トリプシンインヒビターの除去など）などに供してもよい。不純物や菌などの除去は、例えば、精密濾過膜、多孔質高分子膜、セラミックフィルターなどを用いて行うことができる。
また、上記のように回収したアミラーゼ阻害物質を含有する溶液を、適当な方法で乾燥することによって、粉末などの固形状のアミラーゼ阻害物質を取得することができる。この場合、本発明の方法により得られたアミラーゼ阻害物質の濃縮液をそのまま直接乾燥処理するか、またはさらに任意の方法、例えば減圧濃縮、限外濾過で濃縮して乾燥処理し、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末を得る。ここで、乾燥処理は、例えば、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥、ボール乾燥などにより行うことができる。
【００５６】
或いは、アミラーゼ阻害物質の濃縮液は、本発明のアミラーゼ阻害物質の調製方法の工程（Ｂ）に供して、この濃縮液に塩を加えてアミラーゼ阻害物質を不溶物として析出（塩析）させ、析出したアミラーゼ阻害物質から必要に応じて塩を除去し、工程（Ｃ）にて乾燥処理してアミラーゼ阻害物質の乾燥粉末を得ることができる。
【００５７】
上述した本発明の調製方法により得られるアミラーゼ阻害物質は、そのままで、または公知の担体や助剤等を使用して液剤、顆粒剤、錠剤等の形態にして血糖値上昇抑制剤および／またはインシュリン分泌調節剤として用いることができる。更に、食品、特に澱粉質を多く含むパン、クッキー等の炭水化物系食品に添加して使用したり、お茶類、スープ類、ふりかけやバター、ジャム等のスプレッド類に添加して使用することができる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、高いアミラーゼ阻害活性を有する０．１９ＡＩなどを多く含むアミラーゼ阻害物質を、従来よりも簡単な工程でかつ短い処理時間で、生産性よく製造することができる。
また、本発明の調製方法によって得られるアミラーゼ阻害物質は、高いアミラーゼ阻害活性を有する一方でトリプシン阻害活性をもたず、特に膵液中に含まれるアミラーゼに対して高い阻害活性を有しているため、インシュリンの分泌を効果的に抑制することができ、高血糖症、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、肥満などの予防および／または治療に有効である。さらに、本発明の方法で得られるアミラーゼ阻害物質は、摂取した場合に下痢や吐き気等の副作用がなく、口当たりが良好で経口摂取し易い。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の例において、０．１９ＡＩ含有量の測定方法は以下の通りである。
０．１９ＡＩ含有量の測定
アミラーゼ阻害物質を含有する溶液およびアミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体については、水分を蒸発除去して残留した固形分を水分含量が５重量％以下になるまで凍結乾燥して得た粉末を試料として用いた。また、最終的に得られたアミラーゼ阻害物質粉末については該粉末をそのまま試料として用いた。これらの試料を０．１重量％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを、下記表１に示す条件の高速液体クロマトグラフィーに供して、クロマトグラム中の０．１９ＡＩのピーク面積を測定した。一方、０．１９ＡＩ標品（純度１００％）を同じ条件下に高速液体クロマトグラフィーに供してクロマトグラム中の０．１９ＡＩのピーク面積を測定し、下記式（１）により試料中の０．１９ＡＩの含有量（重量％）を算出した。
【００６０】
試料中の０．１９ＡＩ含有量(重量％)＝（Ｓａ／Ｓｔ）×１００ …（１）
（式中、Ｓａは試料の０．１９ＡＩのピーク面積を、Ｓｔは標品の０．１９ＡＩのピーク面積をそれぞれ示す）
以下の例において、高速クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
【００６１】
【表１】

【００６２】
【実施例１】
（１）アミラーゼ阻害物質を含有する水溶液の調製：
小麦粉５０,０００ｋｇに水３０ｍ³を加え、混練して生地を形成させた。この生地を４００ｍ³の水を用いて洗浄して、グルテン３０,０００ｋｇ（湿質量）および小麦澱粉３０,０００ｋｇ（乾燥質量）を分離し、抽出液３１２ｍ³を得た。この抽出液に塩酸を加えてｐＨ３に調整し３０分放置した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６に調整すると不溶物が沈殿した。ドラバル型遠心分離機を用いて沈殿を除去して上澄み液３１０ｍ³を回収した。上記した方法で測定したところ、この上澄み液は１ｍ³当たり、０．１９ＡＩを１３０ｇの割合で含有していた。
（２）不溶性複合体の形成：
塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を用いて上記（１）で回収した上澄み液３１０ｍ³（０．１９ＡＩの含有量＝４０．３ｋｇ）のｐＨを４．９に調整した後（液温２５℃）、アルギン酸を３００ｐｐｍの割合で添加して３０分間撹拌し、次いで塩酸を加えて液のｐＨを４．０にして３０分間撹拌した後、２時間静置した。生成したアミラーゼ阻害物質とアルギン酸ナトリウムとの不溶性複合体の沈殿物をデカンターにより分離回収した後、ドラバル型遠心分離機（アルファラバル社製「ＢＲＰＸ−６１７」）で濃縮して不溶性複合体６ｍ³（湿潤物）を得た。これにより得られた不溶性複合体中の０．１９ＡＩの含有量を上記した方法で測定したところ３７．５ｋｇであり、原料液中に含まれていた０．１９ＡＩの９３重量％が不溶性複合体として回収された。
（３）不溶性複合体からの多糖類の分離とアミラーゼ阻害物質含有液の分取：
（i）上記（２）で回収した不溶性複合体６ｍ³に３０℃の精製水２ｍ³を加えて６０分間撹拌して懸濁液８ｍ³を調製した後、その懸濁液にカルシウム濃度が５，０００ｐｐｍとなるように塩化カルシウムを添加すると共に濾過助剤（昭和化学工業株式会社製「ラヂオライト＃７００」）６０ｋｇを添加して３０℃で２時間撹拌し、次いでグルカナーゼ（阪急共栄物産株式会社製「セルロシンＴＰ２５」）４０ｇを添加して３０℃で更に２時間撹拌した。
【００６３】
（ii）上記（i）で得られた懸濁液を加圧濾過機（薮田機械株式会社製「自動薮田式濾過圧搾機１００Ｄ−７０／４８型」）を用いて加圧濾過した。加圧濾過に際しては、加圧濾過機の濾布に予め１００ｋｇのラヂオライト＃７００と５６．８ｋｇの「セライト５０５」（セライトコーポレーション製）を２９．４ｋＰａ（０．３ｋｇｆ／ｃｍ²）の圧力下にコーティングしておいた。ここに懸濁液を２９．４〜１４７．１ｋＰａ（０．３〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ²）の範囲内の圧力で圧入することにより濾過を行った。この加圧濾過操作中に、圧力は２９．４〜１４７．１ｋＰａ（０．３〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ²）の範囲内で、流量一定で濾過を行うことができ、８ｍ³の懸濁液を１．５時間で濾過することができる。更に精製水１．５ｍ³を注入して分離した不溶性多糖類を洗浄し、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³を回収した。
（４）塩析工程：
上記（３）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³に硫酸アンモニウム１,０００ｋｇを加えて８〜１０℃で２時間撹拌して塩析を行い（塩析時の液のｐＨ３．５）、アミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を生成させた。生成した不溶物をデカンターにより回収し、それを等量の１０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム水溶液で洗浄した後、不溶物２５０ｋｇ（湿潤状態）を遠心分離により回収した。
（５）塩析物の回収と脱塩：
上記（４）で得られた湿潤状態の不溶物（塩析物）２５０ｋｇに、精製水２ｍ³を加え、５０℃に加温しながら撹拌して水に溶解した後、それにより得られた水溶液を上記（３）で用いたのと同様の小型加圧濾過機で濾過し、次いでセラミックフィルター（日本濾水機製「Ｓ−８６」）を用いて除菌濾過を行い、さらに限外濾過膜（ダイセンメンブレンシステムズ社製、ポリスルホン系、分画分子量３０,０００ダルトン）により濃縮・脱塩して、アミラーゼ阻害物質を含有する濃縮液を調製した。
（６）アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末の調製：
上記（５）で得られたアミラーゼ阻害物質の濃縮液−２０℃で２４時間凍結後、気圧１３３．３Ｐａ（１Ｔｏｒｒ）の条件下に温度を０℃から段階的に５０℃まで上昇させて凍結乾燥を行い、乾燥粉末１０２．９ｋｇを得た。
【００６４】
これにより得られた乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量を測定したところ、３８．６ｋｇであり、０．１９ＡＩの回収率は９５．８重量％であった。
なお、この実施例１において、上記の（４）〜（６）の処理に要した日数は３日間であった。
【００６５】
【実施例２】
（１）実施例１の（１）と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質を含有する上澄み液を調製した。
（２）上記（１）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する上澄み液のｐＨを、塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を用いて４、４．５、５、５．５および６にそれぞれ調整した後（液温２５℃）、実施例１の（２）と同様にして不溶性複合体（湿潤物）を得た。それにより得られた不溶性複合体における０．１９ＡＩの回収率（原料液中に含まれていた０．１９ＡＩの量に対する回収率）は、下記の表２に示すとおりであった。
【００６６】
【表２】

【００６７】
上記の表２の結果にみるように、本発明における工程（Ｉ）（アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を形成する工程）において、アミラーゼ阻害物質含有液のｐＨを４．５〜５．５の範囲に予め調整してから多糖類を加えると、アミラーゼ阻害物質が高率で不溶性複合体として回収される。
【００６８】
【実施例３】
（１）実施例１の（１）および（２）と同様の工程を行って、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を回収した。この不溶性複合体４５０ｃｍ³に２５℃の精製水１５０ｃｍ³を加えて３０分間撹拌して懸濁液６００ｃｍ³を調製した後、その懸濁液にカルシウム濃度が５０００ｐｐｍとなるように塩化カルシウムを添加すると共に活性炭（武田薬品工業株式会社製「タケコール」）１gを添加して３０℃で１時間撹拌した。次いで、その液を６等分してそれぞれの液温を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃および８０℃にして更に４分間インキュベートした。その後速やかに液温を３０℃に冷却し、得られた懸濁液を３,０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、不溶性複合体から分離した不溶性多糖類などの固形分を沈殿物として除去して、アミラーゼ阻害物質を含有する上澄み液をそれぞれ約９５ｃｍ³回収した。
【００６９】
アミラーゼ阻害物質を含有する上澄みの色調を同定するため、分光光度計（日立製作所製「Ｕ−２０１０」）用いて波長３８０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定したところ、下記の表３に示すとおりであった。
（２）上記（１）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する上澄み液を、実施例１の（６）と同様にして凍結乾燥して、アミラーゼ阻害物質を含有する乾燥粉末を得た。得られたアミラーゼ阻害物質中の０．１９ＡＩの回収率、アミラーゼ阻害物質（乾燥粉末）の目視による色調および標準カラーインデックス（財団法人日本色彩研究所監修、日本色研事業株式会社製「新配色カード１９９ａ」）を用いて測定した色調は、下記の表３に示すとおりであった。
【００７０】
【表３】

【００７１】
上記の表３にみるように、本発明の方法において、アミラーゼ阻害物質を含有する液を６０℃以上の温度に短時間加熱することによって、液の褐色化が抑制されて、無色またはそれに近い色調になり、それに伴って白色または白色に近い、色調に優れるアミラーゼ阻害物質粉末を得ることができる。
【００７２】
【実施例４】
（１）実施例１−（１）および（２）と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を回収した。
グルカナーゼを、下記の表４に示す量で用いた以外は、実施例１−（３）と同様の操作を行って、不溶性複合体から分離した不溶性多糖類を加圧濾過して除き、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液をそれぞれ８ｍ³ずつ回収した。分離した不溶性の多糖類を加圧濾過した際の濾過（圧入）に要した時間は、下記の表４に示すとおりであった。
（２）上記（１）で回収した濾液に対して、実施例１−（４）〜（６）と同様の処理を行って、アミラーゼ阻害物質を乾燥粉末として得た。
【００７３】
【表４】

【００７４】
上記の表４の結果に見るように、不溶性多糖類を濾過して除去する際に、グルカナーゼを存在させると、多糖類の濾過除去が円滑に行われる。特に、不溶性複合体（多糖類を分離する前の不溶性複合体）１ｍ³に対して、グルカナーゼを０．５〜２４ｇの割合で使用すると、不溶性多糖類の濾過がより円滑に行われる。
【００７５】
【実施例５】
（１）実施例１−（１）および（２）と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を回収した。
濾過助剤（ラヂオライト＃７００）を、下記の表５に示す量で用いた以外は、実施例１−（３）と同様の操作を行って、不溶性複合体から分離した不溶性多糖類を加圧濾過して除き、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液をそれぞれ８ｍ³ずつ回収した。分離した不溶性多糖類を加圧濾過した際の濾過（圧入）に要した時間は、下記の表５に示すとおりであった。
（２）上記（１）で回収した濾液に対して実施例１−（４）〜（６）と同様の処理を行って、アミラーゼ阻害物質を乾燥粉末として得た。
【００７６】
【表５】

【００７７】
上記の表５の結果に見るように、不溶性多糖類を濾過して除去する際に、濾過助剤を用いると不溶性多糖類の濾過除去が円滑に行われる。特に、不溶性複合体１ｍ³に対して、濾過助剤を５〜２０ｇの割合で使用すると、分離した不溶性多糖類の濾過がより円滑に行われる。
【００７８】
【参考例１】
（１）実施例１−（１）〜（３）と同様の工程を行って、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³を回収した。
（２）上記（１）で回収したアミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³をリン酸で中和し、中和液を８０℃に３０分間加熱した後、生成した不溶性物質を実施例１−（３）で用いたのと同じ加圧濾過機で分離して上澄み液を回収、この上澄み液を限外濾過膜（ダイセンメンブレンシステムズ社製、ポリスルホン系、分画分子量３０,０００ダルトン）にて濃縮すると共に液中に含まれている余剰カルシウム塩の脱塩を行って濃縮液４ｍ³を得た。
（３）上記（２）で得た濃縮液４ｍ³に水を加えて全量を１０ｍ³に希釈すると共に水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７．５に調整し、陽イオン交換樹脂（三菱化成株式会社製「ダイアイオンＨＰＫ−５５」を充填したカラム（長さ１．７ｍ、直径１ｍ）に１ｍ³／時間の流速で通液して、陽イオン交換樹脂に吸着せずに溶出した画分を採取した。この溶出画分を実施例１−（３）で用いたのと同じ加圧濾過機で濾過してから、セラミックフィルター（日本濾水機社製「Ｓ−８６」）で除菌濾過し、上記（２）と同じ限外濾過膜で濃縮・脱塩を行った後、実施例１−（６）と同様にして凍結乾燥して、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末３８．４ｋｇを得た。なお、この参考例１において、上記（２）およびこの（３）の処理に要した日数は８日間であり、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液から粉末状のアミラーゼ阻害物質を得るまでの要処理時間は、実施例１に比べて長いものであった。
【００７９】
【実施例６】
（１）アミラーゼ阻害物質を含有する原料液の調製（工程（Ａ））：
実施例１−（１）に従って、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液３１０ｍ³を回収した。この原料液は１ｍ³当たり、０．１９ＡＩを１３０ｇの量で含有していた。
（２）塩析（工程（Ｂ））：
上記（１）で得た原料液３１０ｍ³を減圧下で７７．５ｍ³まで濃縮し（濃縮液のタンパク質濃度１０．８ｍｇ／ｃｍ³）、塩酸を用いて濃縮液のｐＨを３．５に調整した後、その濃縮液に塩化ナトリウム１１,６００ｋｇ（濃縮液中の塩化ナトリウム濃度１５重量％）および塩化カルシウム８６０ｋｇ（液中のカルシウムイオン濃度４,０００ｐｐｍ）を加えて４℃で２時間撹拌して塩析を行い（塩析時の液のｐＨ３．５）、アミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を生成させた。生成した不溶物をフィルタープレスにより回収し、それを等量の１５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、フィルタープレスにより不溶物（塩析物）３２０ｋｇ（湿潤状態）を回収した。なお、液のタンパク質濃度はバイオラット社製の「ＤＣプロテインアッセイキット」を用いて測定した。
（３）アミラーゼ阻害物質の脱塩・回収（工程（Ｃ））：
上記（２）で得られた不溶物（塩析物）３２０ｋｇに、精製水４ｍ³を加え、４０℃に加温しながら撹拌して水に溶解した後、得られた水溶液を濾過装置（薮田式濾過圧搾機６６−Ｄ−２２型）で濾過し、次いでセラミックフィルター（日本濾水機社製「Ｓ−８６」）を用いて除菌濾過を行った。さらに限外濾過膜（ダイセンメンブレンシステムズ社製、ポリスチレン系、分画分子量３０,０００ダルトン）により濃縮・脱塩して、アミラーゼ阻害物質を含有する濃縮液を調製した。この濃縮液を、−２０℃で２４時間凍結後、気圧１３３．３Ｐａ（１Ｔｏｒｒ）の条件下に、温度を０℃から段階的に５０℃まで上昇させて凍結乾燥して、乾燥粉末１９２ｋｇを得た。乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量は、４０．３ｋｇであり、０．１９ＡＩの回収率は１００重量％であった。
【００８０】
【実施例７】
実施例６の（２）において、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムを添加する前の濃縮液（濃縮した上澄み液）のｐＨを、２．５、３．０、３．５、４．０および４．５にそれぞれ調整し、それ以外は実施例６と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末を調製した。得られた乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量を測定し、０．１９ＡＩの回収率を求めた。これらの結果を表６に示す。
【００８１】
【表６】

【００８２】
上記の表６にみるように、塩化ナトリウムを添加する際のアミラーゼ阻害物質含有溶液のｐＨが３〜４の範囲内であるとき、特にｐＨ３．５のときにアミラーゼ阻害物質（０．１９ＡＩ）の回収率が高い。
【００８３】
【実施例８】
（１）実施例６−（２）において、塩酸を加えてｐＨ３．５に調整したアミラーゼ阻害物質を含有する溶液の濃縮の程度および塩析時の溶液中の塩化ナトリウム濃度およびカルシウムイオン濃度を以下の表７に示すように調整し、それ以外は実施例６と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末を調製した。上記において塩析前の上澄み液またはその濃縮液中のタンパク質の濃度は下記の表７に示すとおりであった。なお、溶液中のタンパク質濃度は、実施例６と同様にして測定した。
（２）得られた乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量を測定し、０．１９ＡＩの回収率を求めた。これらの結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】

【００８５】
【実施例９】
（１）アミラーゼ阻害物質を含有する水溶液の調製（工程（Ａ））：
小麦粉５０,０００ｋｇに水３０ｍ³を加え、混練して生地を形成させた。この生地を４００ｍ³の水を用いて洗浄して、グルテン３０,０００ｋｇ（湿質量）および小麦澱粉３０,０００ｋｇ（乾燥質量）を分離し、抽出液３１２ｍ³を得た。この抽出液中のタンパク質濃度を実施例１と同様にして測定したところ、４．２ｍｇ／ｃｍ³であった。また、この抽出液は１ｍ³当たり、０．１９ＡＩを１２９．２ｇ含有していた。
（２）塩析（工程（Ｂ））、アミラーゼ阻害物質の脱塩・回収（工程（Ｃ））：
上記（１）で得られた抽出液３１２ｍ³をそのまま用いて、実施例６−（２）と同様の操作を行い、その際に塩酸を加えてｐＨ３．５に調整したアミラーゼ阻害物質を含有する抽出液の濃縮の程度および塩析時の液中の塩化ナトリウム濃度およびカルシウムイオン濃度を以下の表８に示すように調整し、それ以外は実施例６と同様にして、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末を調製した。上記において塩析前の抽出液またはその濃縮液中のタンパク質の濃度は実施例６と同様にして測定した。その結果を下記の表８に示す。
（３）得られた乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量を測定し、０．１９ＡＩの回収率を求めた。これらの結果を表８に示す。
【００８６】
【表８】

【００８７】
【実施例１０】
塩析用の塩として、塩化ナトリウム１１,６００ｋｇの代わりに硫酸アンモニウム１２,０００ｋｇを用いた以外は実施例６と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末２０２ｋｇを得た。アミラーゼ阻害物質乾燥粉末中の０．１９ＡＩ含有量を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの回収率は１００重量％であった。
【００８８】
【実施例１１】
（１）実施例６の（１）と同様にして得られたアミラーゼ阻害物質を含有する上澄み液３１０ｍ³を減圧下に水分を留去することによって７７．５ｍ³まで濃縮し（濃縮液中のタンパク質濃度１０．８ｍｇ／ｃｍ³）、塩酸を用いて濃縮液のｐＨを３．５に調整した。これにより得られた濃縮液の色は褐色であった。
（２）上記（１）で得られた濃縮液７７．５ｍ³に、塩化ナトリウム１１,６００ｋｇ（濃縮液中の塩化ナトリウム濃度１５重量％）および塩化カルシウム８６０ｋｇ（液中のカルシウムイオン濃度４,０００ｐｐｍ）を加えると共に、アスコルビン酸を下記の表９に示す量で加えて、４℃で２時間撹拌して塩析を行い、アミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を生成させた。生成した不溶物をデカンターにより回収し、それを等量の１０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム水溶液で洗浄した後、塩析物（湿潤状態）をデカンターにより回収した。
（３）上記（２）で得られた塩析物に対して実施例６の（３）と同様の濃縮・脱塩処理および乾燥処理を行って乾燥粉末を得た。得られた乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量を測定して、０．１９ＡＩの回収率を求めたところ、アスコルビン酸の添加量に拘わらず、いずれの場合もほぼ１００重量％であった。また、得られた乾燥粉末の色調を目視で観察すると共に、実施例３−（２）と同様に明度を測定した。その結果を表９に示す。
【００８９】
【表９】

【００９０】
上記の表９の結果にみるように、アミラーゼ阻害物質を含有する液にアスコルビン酸を添加すると着色が抑制されて、白色または白色に近い色調を有する、色調に優れるアミラーゼ阻害物質粉末が得られる。
【００９１】
【実施例１２】
実施例９の（２）において、アスコルビン酸の代わりに、システインを用いた以外は実施例９の（１）〜（３）と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質の乾燥粉末を調製した。それにより得られた乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量を測定して、０．１９ＡＩの回収率を求めたところ、システインの添加量に拘わらず、いずれの場合もほぼ１００重量％であった。また、得られた乾燥粉末の色調を目視で観察すると共に、実施例１１と同様に明度を測定した。この結果を表１０に示す。
【００９２】
【表１０】

【００９３】
上記の表１０の結果にみるように、アミラーゼ阻害物質を含有する液にシステインを添加すると着色が抑制されて、白色または白色に近い色調を有する、色調に優れるアミラーゼ阻害物質粉末が得られる。
【００９４】
【実施例１３】
（１）実施例６の（１）と同じ操作を行って、アミラーゼ阻害物質を含有する原料液３１０ｍ³を得た。この上澄み液１ｍ³当たりの０．１９ＡＩの含有量は１３０ｇであった。
（２）上記（１）で得られた原料液３１０ｍ³（０．１９ＡＩの含有量＝４０．３ｋｇ）にアルギン酸を３００ｐｐｍの割合で添加した後、塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を用いて液のｐＨを４．９に調整した（液温２５℃）こと以外は、実施例１−（２）〜（３）と同様にして、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³を回収した。
（３）上記（２）で得られた濾液８ｍ³に塩化ナトリウム５００ｋｇを加えて８〜１０℃で２時間撹拌して塩析を行い（塩析時の液のｐＨ３．５）、アミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を生成させた。生成した不溶物をデカンターにより回収し、それを等量の１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、不溶物２５０ｋｇ（湿潤状態）をデカンターにより回収した。
（４）上記（３）で得られた不溶物２５０ｋｇに、精製水２ｍ³を加え、５０℃に加温しながら撹拌して水に溶解した後、それにより得られた水溶液を小型加圧濾過機（薮田機械株式会社製の自動薮田式濾過圧搾機）で実施例１−（５）と同様の条件にて濾過し、次いでセラミックフィルター（日本濾水機社製「Ｓ−８６」）を用いて除菌濾過を行い、さらに限外濾過膜（ダイセンメンブレンシステムズ社製、ポリスルホン系、分画分子量３０,０００ダルトン）により濃縮・脱塩して、アミラーゼ阻害物質の濃縮液を調製した。
（５）上記（４）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する濃縮水溶液を−２０℃で２４時間凍結後、気圧１３３．３Ｐａ（１Ｔｏｒｒ）の条件下に温度を０℃から段階的に５０℃まで上昇させて凍結乾燥して、乾燥粉末１０９．７ｋｇを得た。この乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量は３９．５ｋｇであり、０．１９ＡＩの回収率は９８重量％であった。
【００９５】
また、本実施例において、上記の（３）〜（５）の処理に要した日数は３日間であった。
（６）また、上記（３）の塩析処理を、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液のｐＨを３または４に変えて、同様の操作を行ったところ、濾液がｐＨ３のときには最終的な０．１９ＡＩの回収率は８７重量％、ｐＨ４のときには最終的な０．１９ＡＩの回収率は８９重量％であった。
【００９６】
上記の結果から、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液のｐＨを３．５に調整して塩析を行うと、０．１９ＡＩの回収率が極めて高くなることが判明した。
【００９７】
【実施例１４】
実施例１３−（３）の塩析処理において、塩化ナトリウムを下記の表１１に示す量で添加した以外は実施例１３と同じ操作を行って、アミラーゼ阻害物質（乾燥粉末）を調製した。０．１９ＩＡの回収率を下記の表１１に示す。
【００９８】
【表１１】

【００９９】
【実施例１５】
実施例１３−（３）の塩析処理において、塩化ナトリウム５００ｋｇの代わりに硫酸アンモニウム１,０００ｋｇを使用した以外は実施例１３と同じ操作を行って、アミラーゼ阻害物質を調製した。その結果、０．１９ＡＩの回収率は９５．８重量％であった。
【０１００】
【実施例１６】
（１）実施例１３−（１）〜（２）と同様の工程を行って、アミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³を回収した。この濾液の色調は褐色であり、また波長３８０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を分光光度計（日立製作所製「Ｕ−２０１０」）を使用して測定したところ、それぞれ１．２８および１４．９８であった。（２）上記（１）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する濾液８ｍ³に硫酸アンモニウム１０００ｋｇと、下記の表１２に示す量のアスコルビン酸を加えて、８〜１０℃で２時間撹拌して塩析を行い、アミラーゼ阻害物質を含有する不溶物（塩析物）を生成させた後、該不溶物をデカンターにより回収し、等量の１０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム水溶液で洗浄し、次いで洗浄した不溶物２５０ｋｇをデカンターにより回収した。
（３）上記（２）で得られた不溶物（塩析物）２５０ｋｇに精製水２ｍ³を加えて溶解し、実施例１３−（４）と同様にして濃縮・脱塩を行って、アミラーゼ阻害物質を含有するそれぞれの濃縮水溶液を調製した。それぞれの濃縮水溶液の色調を目視により観察すると共に、波長３８０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を上記（１）で用いたのと同じ分光光度計で測定した。その結果を下記の表１２に示す。
（４）上記（３）で得られたアミラーゼ阻害物質を含有する濃縮液を実施例１３−（５）と同様に処理して、アミラーゼ阻害物質を乾燥粉末として得た。得られた乾燥粉末の色調を目視にて、および明度を実施例１１と同様に測定した。これらの結果を表１２に示す。また、０．１９ＡＩの回収率は９４〜９６重量％であった。
【０１０１】
【表１２】

【０１０２】
上記の表１２の結果にみるように、アミラーゼ阻害物質を含有する液にアスコルビン酸を添加すると着色を抑制することができ、特にアスコルビン酸の添加量がアミラーゼ阻害物質を含有する液１ｍ³当たり１〜１,０００ｇのときに着色抑制効果に優れている。
【０１０３】
【実施例１７】
（１）実施例１６−（２）において、アスコルビン酸の代わりに、システインを用いた以外は実施例１６−（１）〜（２）と同様の操作を行って、アミラーゼ阻害物質を含有する濃縮液を調製した。この濃縮液の色調を目視により観察すると共に、波長３８０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を実施例１６と同様にして測定した。その結果を下記の表１３に示す。
（２）上記（１）で得られた濃縮液を実施例１３−（５）と同様に処理して、アミラーゼ阻害物質を乾燥粉末として得た。得られた乾燥粉末の色調を目視にて、および明度を実施例１１と同様に測定した。これらの結果を表１３に示す。
【０１０４】
【表１３】

【０１０５】
上記の表１３の結果にみるように、アミラーゼ阻害物質を含有する液にシステインを添加すると着色を抑制することができ、特にシステインの添加量がアミラーゼ阻害物質を含有する液１ｍ³当たり１５〜１０,０００ｇのときに着色抑制効果に優れている。

Claims (11)

1. アミラーゼ阻害物質の調製方法であって、
   （Ａ）下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）によりアミラーゼ阻害物質を含有する原料液を得る工程；
   （Ａ１）小麦粉または小麦グルテンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールを用いて抽出処理する；
   （Ａ２）小麦粉または小麦グルテンを水、希酸、希アルカリまたは含水アルコールを用いて抽出処理した後に、酸処理および／または熱処理を行って、夾雑する不要な蛋白質を変性させて除去する；
   （Ａ３）前記（Ａ１）または（Ａ２）の方法によって得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、生成した不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去する；
   （Ｂ）前記工程（Ａ）で得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、塩を加えてアミラーゼ阻害物質を不溶物として塩析させ、塩析した不溶物を回収する工程；および、
   （Ｃ）前記工程（Ｂ）で回収した不溶物をそのまま乾燥処理するか、または該不溶物を水に溶解し、該水溶液から塩を除去した後の水溶液を乾燥処理して、アミラーゼ阻害物質を回収する工程；
   を有することを特徴とするアミラーゼ阻害物質の調製方法。
2. 工程（Ｂ）で塩析に用いる塩が、塩化ナトリウムである請求項１に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
3. 工程（Ｂ）の塩析時に、液中にカルシウムイオンを存在させる請求項１または２に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
4. 工程（Ｂ）の塩析を、液のｐＨを３〜４に調整して行う請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
5. 工程（Ｂ）の塩析に用いるアミラーゼ阻害物質を含有する液が、工程（Ａ）で得られた
   アミラーゼ阻害物質を含有する原料液を濃縮してなる濃縮液である請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
6. 濃縮液のタンパク質濃度が１〜１００ｍｇ／ｃｍ³である請求項５に記載のアミラーゼ
   阻害物質の調製方法。
7. 工程（Ｂ）および工程（Ｃ）のうちの少なくとも１つの工程を、アスコルビン酸および／またはシステインを添加して行う請求項１〜６のいずれか１項に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
8. 工程（Ａ３）が、前記（Ａ１）または（Ａ２）の方法によって得たアミラーゼ阻害物質を含有する原料液に、
   （I）アミラーゼ阻害物質を含有する原料液のｐＨを４．５〜５．５の範囲に調整し、こ
   れに多糖類を加えて、アミラーゼ阻害物質と多糖類との会合体溶液を調製した後、ｐＨを３．０〜４．０の範囲に調整することにより、アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体を生成させ、次いで、
   （II）該不溶性複合体を液から分取して、不溶性複合体から多糖類を不溶性多糖類の形態で分離させて除去し、アミラーゼ阻害物質を溶液として回収する工程である請求項１〜７のいずれか１項に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
9. アミラーゼ阻害物質と多糖類との不溶性複合体からの多糖類の分離を、グルカナーゼの作用下に行い、分離した不溶性多糖類を濾過して除去する請求項１〜８のいずれか１項に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
10. 不溶性多糖類の濾過を、濾過助剤を添加して行う請求項９に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。
11. 多糖類の分離時または分離後に、アミラーゼ阻害物質を含有する液を５０℃以上の温度に加熱する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアミラーゼ阻害物質の調製方法。