CN110063964A - 岩藻聚糖作为pcsk9抑制剂的应用及其制备方法 - Google Patents

岩藻聚糖作为pcsk9抑制剂的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的应用及其制备方法，本发明首次发现岩藻聚糖能显著抑制PCSK9蛋白的表达，为岩藻聚糖在制备PCSK9抑制剂药物上的应用提供了详实的实施案例。在本发明的实施例中，不同来源的岩藻聚糖可显著下调apoE(‑/‑)小鼠和C57BL/6小鼠PCSK9蛋白表达水平；在制备方面，本发明的实施方法简单易于大规模生产，为该发明的转化奠定了基础。

Description

岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的应用及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种化合物的医药用途，具体为一种岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的应用及其制备方法，属于生物医药领域。
背景技术
心脑血管疾病是一种高发病率、高致残率、高病死的疾病，其主要病理过程是在血管壁病变的基础上，血液成分和（或）血流动力学改变，造成缺血性或出血性疾病。其病因较多，其中一个重要的病因是动脉粥样硬化。
高血脂是诱发动脉粥样硬化的主要原因之一。当体内胆固醇过高，特别是低密度脂蛋白水平（LDL-C）以及甘油三酯增高时，氧化的LDL则可被巨噬细胞吞噬，进而沉积在动脉内皮下，引起内皮下变性，进而导致血小板在动脉内壁聚集，若同时伴有动脉壁损伤或胆固醇转运障碍，则易在动脉内膜形成脂斑，最后，血管壁隆起、向官腔内突起形成粥样斑块。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)在调节胆固醇体内平衡中起重要作用，通过与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，促进其降解，影响 LDL内化，使血液中LDL不能清除，从而导致高胆固醇血症。目前，上市的PCSK9抑制剂为单克隆抗体，价格高昂。
岩藻聚糖是存在于褐藻或棘皮动物细胞壁中的主要的生物活性物质，大量研究表明，岩藻聚糖具有抗病毒、抗血栓、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血等生物活性。岩藻聚糖的单糖构成、分子量大小、硫酸化程度对其生物活性产生重要影响。水提醇沉法获得多糖的方法虽然工艺流程简单，但获得的多糖相对分子质量范围广，组成成分复杂，不利于产品质量控制和后续临床转化应用。目前，岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的研究未见报道。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的应用及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的应用。
所述岩藻聚糖分离于藻类或棘皮动物中。
所述岩藻聚糖分离于藻类时的的提取方法包含有如下步骤：
(1）制备岩藻聚糖粗品：
藻类清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的藻类，加入质量体积比为1：5-10的石油醚或乙酸乙酯；90℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，90℃水浴加热3h，离心得上清液和滤渣（滤渣重复水提3次），收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现即为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达60%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。
（2）岩藻聚糖的纯化：岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得泡叶藻岩藻聚糖半成品。上述岩藻聚糖半成品再经Sephacryl SH-200柱层析，即可分离得到岩藻聚糖成品，经NMR、液相色谱和IR分析，确定其为岩藻聚糖。
所述岩藻聚糖分离于棘皮动物时的提取方法包含有如下步骤：
（1）制备海参岩藻聚糖粗品：海参清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的海参100g，加入2L浓度为0.1M，pH=6的醋酸盐缓冲溶液中，溶液中含有10g木瓜蛋白酶，溶液中EDTA的浓度为5mM，半胱氨酸的浓度为5mM，于60摄氏度降解24 h。所得混合液在2000×g，4摄氏度离心10 min,获得上清溶液。上清液浓缩至1L，加入2倍体积的浓度为95%的乙醇，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。
（2）海参岩藻聚糖的纯化：海参岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集第2个峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得海参岩藻聚糖半成品。上述海参岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到海参岩藻聚糖成品LFUC-H，经液相色谱和IR分析，确定其为岩藻聚糖。
本发明首次发现岩藻聚糖能显著抑制PCSK9蛋白的表达，为岩藻聚糖在制备PCSK9抑制剂药物上的应用提供了详实的实施案例。在本发明的实施例中，不同来源的岩藻聚糖可显著下调apoE(-/-)小鼠和C57BL/6小鼠PCSK9蛋白表达水平；在制备方面，本发明的实施方法简单易于大规模生产，为该发明的转化奠定了基础。
附图说明
图1A所示为实施案例1处理后，泡叶藻岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合Q-Sepharose F.F阴离子交换柱所得洗脱曲线；
图1B所示为实施案例1处理后，泡叶藻岩藻聚糖A3的Sephacryl SH-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线；
图2A所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；
图2B所示为经实施案例1处理，泡叶藻岩藻聚糖A3经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱；
图2C所示为泡叶藻岩藻聚糖A3的红外（IR）图谱；
图3所示为实施案例1处理后，泡叶藻岩藻聚糖A3下调PCSK9表达图；
图4A所示为实施案例2处理后，泡叶藻岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合Q-SepharoseF.F阴离子交换柱所得洗脱曲线；
图4B所示为实施案例2处理后，泡叶藻岩藻聚糖A2的Sephacryl SH-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线；
图5A所示为泡叶藻岩藻聚糖A3的红外（IR）图谱；
图5B所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；
图5C所示为经实施案例2处理，泡叶藻岩藻聚糖A3经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱；
图6A所示为泡叶藻岩藻聚糖A3的1H-NMR图谱；
图6B为泡叶藻岩藻聚糖A3的13C-NMR图谱；
图7所示为实施案例2处理后，泡叶藻岩藻聚糖A2下调PCSK9表达图；
图8A所示为实施案例3处理后，海带岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合Q-SepharoseF.F阴离子交换柱所得洗脱曲线；
图8B所示为实施案例3处理后，海带岩藻聚糖LFUC-H的Sephacryl SH-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线；
图9A所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；
图9B所示为经实施案例3处理，海带岩藻聚糖LFUC-H经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱；
图9C所示为海带岩藻聚糖LFUC-H的红外（IR）图谱；
图10所示为实施案例3处理后，海带岩藻聚糖LFUC-H下调PCSK9表达图；
图11A所示为实施案例4处理后，海参岩藻聚糖采用ÄKTA pure 150结合Q-SepharoseF.F阴离子交换柱所得洗脱曲线；
图11B所示为实施案例4处理后，海带岩藻聚糖LFUC-H的Sephacryl SH-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线；
图12A所示为标准单糖采用PMP衍生后的HPLC图谱；
图12B所示为经实施案例4处理，海带岩藻聚糖FUC经完全酸降解后，采用PMP衍生后所得HPLC图谱；
图12C所示为海带岩藻聚糖FUC的红外（IR）图谱；
图13所示为实施案例4处理后，海带岩藻聚糖FUC下调PCSK9表达图；
Man: 甘露糖；GluN: 葡萄糖胺；Rha: 鼠李糖；GluA : 葡萄糖醛酸；Glu: 葡萄糖；Gal :半乳糖； Xyl : 木糖；Fuc: 岩藻糖；
与模型组相比，*P＜0.05；**P＜0.01；与非诺贝特组相比，# P＜0.05, ## P＜0.01。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述：
如图所示为本发明的一个具体实施例，
实施例1：
提取制备泡叶藻岩藻聚糖A3，采取了下述步骤：
1）制备泡叶藻岩藻聚糖粗品：泡叶藻清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的泡叶藻，加入5倍体积的石油醚， 90℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，90℃水浴加热3h，离心得上清液和滤渣（滤渣重复水提3次），收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现即为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达60%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。
（2）泡叶藻岩藻聚糖的纯化：泡叶藻岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得泡叶藻岩藻聚糖A3半成品。上述泡叶藻岩藻聚糖半成品再经Sephacryl SH-200柱层析，即可分离得到泡叶藻岩藻聚糖成品A3，经NMR、液相色谱和IR分析（图谱见附图），确定其为岩藻聚糖。
泡叶藻岩藻聚糖A3作为PCSK9抑制剂的应用
SPF级载脂蛋白E敲除（apoE-/-）小鼠，雄性，体重25±2 g。动物适应性喂养1周后，将动物随机分为3组：
模型组（生理盐水）6只；
阳性药物非诺贝特组（50 mg/kg/d）6只；
和A3组（50 mg/kg/d）6只。
apoE-/-小鼠均给予高脂饲料（配方：胆固醇1 .25%、胆汁盐0 .5%、猪油10%、蛋黄粉10%、基础饲料78 .25%）。各组连续灌胃给药1月后，取材。
实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食12h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉采血0 .8-1 .0 mL，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速摘取肝脏组织，分离血浆，-80 ℃下保存备用。所得血清样本检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）；所得肝脏组织检测PCSK9蛋白表达水平。
如图1所示，泡叶藻岩藻聚糖经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化；再经Sephacryl SH-200分子筛纯化所得图谱，显示所得泡叶藻岩藻聚糖组分A3为对称单一峰，重均分子量约为200 kDa，硫酸根含量约为12.0%。
如图2A和2B所示，泡叶藻岩藻聚糖A3的单糖比例为Man : GluA : Gal : Xyl :Fuc=1 : 1.41 : 8.14 : 5.95。图2C所示，红外光谱中3424.23处为多糖羟基的伸缩振动峰，2934.60波数处为甲基和亚甲基的伸缩振动峰；1252.71波数处为硫酸根的伸缩振动吸收峰。
动物实验结果见表1泡叶藻岩藻聚糖A3对apoE(-/-)小鼠血浆TC、TG、PCSK9的影响，实验结果显示，岩藻聚糖给药组可下调TC和TG。实验结果表明：泡叶藻岩藻聚糖A3在50mg/kg即可起到显著降低高脂诱导的apoE-/-小鼠血浆脂质的能力，而且其降脂效果在apoE(-/-)小鼠中效果优于非诺贝特。值得关注的是，如图3所示，岩藻聚糖A3可显著下调PCSK9蛋白表达约60%，效果优于非诺贝特组，二者相差约15%。
表1，泡叶藻岩藻聚糖A3对高脂诱导的apoE(-/-)小鼠血脂水平的影响。
组别 模型组 非诺贝特 A3组
TC（mg/dl） 973.69±163.45 897.55±38.65 816.6±162.5*#
TG（mg/dl） 229.87±55.73 237.975±31.25 151.9±21.6**##
与模型组相比，* P＜0.05；** P＜0.01；与非诺贝特组相比，# P＜0.05，## P＜0.01。
实施例2：
提取制备泡叶藻岩藻聚糖A2，采取了下述个步骤：
（1）制备泡叶藻岩藻聚糖粗品：泡叶藻清洗除去泥沙，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的泡叶藻，加入10倍体积的乙酸乙酯，90℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，90℃水浴加热3h，离心得上清液和滤渣（滤渣重复水提3次），收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现即为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达60%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。
（2）泡叶藻岩藻聚糖的纯化：泡叶藻岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得泡叶藻岩藻聚糖A2半成品。上述泡叶藻岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到泡叶藻岩藻聚糖成品A2，经NMR、液相色谱和IR分析（图谱见附图），确定其为岩藻聚糖。
泡叶藻岩藻聚糖A2作为PCSK9抑制剂的应用：
SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重25±2 g。在实验条件下给予普通饲料适应性喂养1周，将实验动物随机分为4组：
模型组、非诺贝特组（100 mg/kg/d），A2低剂量组（50 mg/kg/d）和A2高剂量组（200 mg/kg/d）各6只。实验动物给予高脂饲料（配方：胆固醇1.0%、胆汁盐0 .5%、猪油10%、蛋黄粉10%、基础饲料78 .25%）。
实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食12h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉采血0 .8-1 .0 mL，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速摘取肝脏组织，分离血浆，-80 ℃下保存备用。所得血清样本检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）；所得肝脏组织检测PCSK9蛋白表达水平。
如图4所示，泡叶藻岩藻聚糖经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化；再经Sephacryl SH-200分子筛纯化所得图谱，显示所得泡叶藻岩藻聚糖组分A2为对称单一峰，重均分子量约为300 kDa，硫酸根含量约为19%。
如图5A所示，红外光谱中3442.24处为多糖羟基的伸缩振动峰，2933.35波数处为甲基和亚甲基的伸缩振动峰；1255.32波数处为硫酸根的伸缩振动吸收峰。如图2B和C所示，泡叶藻岩藻聚糖A2的单糖比例为Man: Gal : Xyl : Fuc= 1.0: 1.1: 5.4: 26.0。
如图6A，化学位移为1.18ppm处，为岩藻糖甲基的H信号；如图6B所示，化学位移15.51处为岩藻糖甲基的C信号。
动物实验结果见表2泡叶藻岩藻聚糖A2对C57BL/6J小鼠血浆TC和TG的影响。实验结果表明：泡叶藻岩藻聚糖A2在50mg/kg时，即可起到显著降低高脂诱导的C57BL/6J小鼠血浆脂质的能力，降脂效果与非诺贝特相当；且其降脂效果在200 mg/kg时优于非诺贝特。更为重要的是，如图7所示，岩藻聚糖A2在50mg/kg时，即可显著下调PCSK9蛋白表达约60%，效果优于非诺贝特组的38%（P＜0.05），而在200 mg/kg时，其可抑制PCSK9表达约70%，与非诺贝特组相比，P＜0.01。
表2，泡叶藻岩藻聚糖A2对高脂诱导的C57BL/6J小鼠血脂水平的影响。
组别 模型组 非诺贝特 A2组（50 mg/kg/d） A2组（200 mg/kg/d）
TG（mmol/L） 1.56 ± 0.19 1.13 ± 0.12* 1.34 ± 0.17* 0.87 ± 0.15**#
TC（mmol/L） 5.36 ± 0.39 3.63 ± 0.12* 3.84 ± 0.17* 3.21 ± 0.25**#
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与非诺贝特组相比，# P＜0.05。
实施例3：
提取制备海带岩藻聚糖LFUC-H，采取了下述个步骤：
（1）制备海带岩藻聚糖粗品：海带清洗除去泥沙，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的海带，加入8倍体积的石油醚， 90℃冷凝回流除去大部分色素、脂质。滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，90℃水浴加热3h，离心得上清液和滤渣（滤渣重复水提3次），收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现即为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达60%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。
（2）海带岩藻聚糖的纯化：海带岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得海带岩藻聚糖半成品。上述海带岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到海带岩藻聚糖成品LFUC-H，经液相色谱和IR分析（图谱见附图），确定其为岩藻聚糖。
海带岩藻聚糖LFUC-H作为PCSK9抑制剂的应用：
SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重20±2 g。在实验条件下给予普通饲料适应性喂养1周，将实验动物随机分为4组：模型组6只、非诺贝特组（100 mg/kg/d）6只，岩藻聚糖LFUC-H低剂量组（50 mg/kg/d）6只和LFUC-H高剂量组（150 mg/kg/d）6只。动物给予高脂饲料（配方：胆固醇1 .25%、胆汁盐0 .5%、猪油10%、蛋黄粉10%、基础饲料78 .25%）。实验周期为6周。
实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食12h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉采血0 .8-1 .0 mL，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速摘取肝脏组织，分离血浆，-80 ℃下保存备用。所得血清样本检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）；所得肝脏组织检测PCSK9蛋白表达水平。
如图8所示，海带岩藻聚糖经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化；再经Sephacryl SH-200分子筛纯化所得图谱，显示所得海带岩藻聚糖组分LFUC-H为对称单一峰，重均分子量约为240 kDa，硫酸根含量约为22.8%。
如图9A和B所示，海带岩藻聚糖LFUC-H的单糖比例为Man : GluA : Gal : Xyl :Fuc=1.05 : 1.38 : 1.27 : 1.00 : 5.71。如图9C所示，红外光谱中3452.9处为多糖羟基的伸缩振动峰，3228.52波数处为甲基和亚甲基的伸缩振动峰；1252.19波数处为硫酸根的伸缩振动吸收峰。
动物实验结果见表3海带岩藻聚糖LFUC-H对C57BL/6小鼠血浆TC和TG的影响。实验结果表明：海带岩藻聚糖LFUC-H在50 mg/kg即可起到显著降低高脂诱导的C57BL/6小鼠血浆TC和TG的作用，效果与剂量为100 mg/kg的非诺贝特效果相当；值得关注的是，剂量为150mg/kg时，其降脂效果显著优于阳性对照药物非诺贝特。
如图10所示，剂量为50 mg/kg的LFUC-H低剂量组，抑制PCSK9的效果与100 mg/kg的非诺贝特效果相当；而LFUC-H高剂量组效果显著优于阳性对照药物非诺贝特。
表3，海带岩藻聚糖LFUC-H对高脂诱导的C57BL/6J小鼠血脂水平的影响。
组别 模型组 非诺贝特 LFUC-H组（50 mg/kg/d） LFUC-H组（150 mg/kg/d）
TG（mmol/L） 1.64 ± 0.12 1.27 ± 0.10* 1.24 ± 0.13* 1.03 ± 0.12**#
TC（mmol/L） 5.62 ± 0.33 4.2 ± 0.22* 3.96 ± 0.15* 3.51 ± 0.17**##
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与非诺贝特组相比，# P＜0.05, ## P＜0.01。
实施例4：
提取制备海参岩藻聚糖FUC，采取了下述个步骤：
（1）制备海参岩藻聚糖粗品：海参清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛。将粉碎干燥的海参100g，加入2L浓度为0.1M，pH=6的醋酸盐缓冲溶液中，溶液中含有10g木瓜蛋白酶，溶液中EDTA的浓度为5mM，半胱氨酸的浓度为5mM”于60摄氏度降解24 h。所得混合液在2000×g，4摄氏度离心10 min,获得上清溶液。上清液浓缩至1L，加入2倍体积的浓度为95%的乙醇，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品。
（2）海参岩藻聚糖的纯化：海参岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集第2个峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得海参岩藻聚糖半成品。上述海参岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到海参岩藻聚糖成品LFUC-H，经液相色谱和IR分析（图谱见附图），确定其为岩藻聚糖。
海参岩藻聚糖抑制PCSK9的应用：
SPF级载脂蛋白E敲除（apoE-/-）小鼠，雄性，体重25±2 g。动物适应性喂养1周后，将动物随机分为3组：模型组（生理盐水）6只、阳性药物非诺贝特组（100 mg/kg/d）6只和FUC组（60 mg/kg/d）6只。 apoE-/-小鼠均给予高脂饲料（配方：胆固醇1 .25%、胆汁盐0 .5%、猪油10%、蛋黄粉10%、基础饲料78 .25%）。各组连续灌胃给药1月后，取材。实验周期为4周。
实验期间，各组均无动物死亡。于末次给药后禁食12h，采用肝素抗凝取血管眼眶静脉采血0 .8-1 .0 mL，戊巴比妥钠麻醉处死，迅速摘取肝脏组织，所得肝脏组织检测PCSK9蛋白表达水平。
如图11所示，海参岩藻聚糖经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱结合ÄKTApure 150分离纯化；再经Sephacryl SH-200分子筛纯化所得图谱，显示所得海参岩藻聚糖组分FUC为对称单一峰，重均分子量约为202 kDa，硫酸根含量约为19.8%。
如图12A和B所示，海参岩藻聚糖LFUC-H的单糖比例为Man : GluA : Gal : Xyl :Fuc= 1.0:1.3:1.2:0.9:5.5。如图12C所示，红外光谱中3448.42处为多糖羟基的伸缩振动峰，3228.54波数处为甲基和亚甲基的伸缩振动峰；1253.19波数处为硫酸根的伸缩振动吸收峰。
如图13所示，剂量为60 mg/kg的FUC海参岩藻聚糖组，抑制PCSK9的效果优于100mg/kg的非诺贝特效果，说明海参岩藻聚糖抑制PCSK9的效果优于阳性对照药物非诺贝特。

Claims (4)

1.岩藻聚糖作为PCSK9抑制剂的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述岩藻聚糖分离于藻类或棘皮动物中。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述岩藻聚糖分离于藻类时的的提取方法包含有如下步骤：
(1）制备岩藻聚糖粗品：
藻类清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛，将粉碎干燥的藻类，加入石油醚或乙酸乙酯；90℃冷凝回流除去大部分色素、脂质；滤渣干燥，研磨，采用水提法提取，90℃水浴加热3h，离心得上清液和滤渣，滤渣重复水提3次，收集上清液然后浓缩至原体积的三分之一，并根据浓缩液的体积计算需要加入氯化钙的量，使其终浓度达2%，边加边搅拌，这时会看到白色絮状沉淀出现即为褐藻胶，经离心除去沉淀并收集上清，加入95%乙醇至乙醇的终浓度达60%，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品；
（2）岩藻聚糖的纯化：岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得泡叶藻岩藻聚糖半成品；上述岩藻聚糖半成品再经Sephacryl SH-200柱层析，即可分离得到岩藻聚糖成品，经NMR、液相色谱和IR分析，确定其为岩藻聚糖。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述岩藻聚糖分离于棘皮动物时的提取方法包含有如下步骤：所述棘皮动物为海参，
（1）制备海参岩藻聚糖粗品：海参清洗，浸泡除盐，粉碎机粉碎，60℃烘干，再次粉碎，过100目筛；将粉碎干燥的海参100g，加入2L浓度为0.1M，pH=6的醋酸盐缓冲溶液中，溶液中含有10g木瓜蛋白酶，溶液中EDTA的浓度为5mM，半胱氨酸的浓度为5mM,于60摄氏度降解24 h,所得混合液在2000×g，4摄氏度离心10 min,获得上清溶液；上清液浓缩至1L，加入2倍体积的浓度为95%的乙醇，过夜使岩藻多糖充分沉淀，次日倾倒出上层乙醇溶液，沉淀部分经无水乙醇洗涤除去水分，然后减压干燥得岩藻多糖粗品；
（2）海参岩藻聚糖的纯化海参岩藻聚糖先经Q-Sepharose F.F阴离子交换柱，采用ÄKTApure 150进行分离纯化，0-2mol/L的氯化钠线性洗脱，收集第2个峰对应组分，经浓缩、透析、冷冻干燥得海参岩藻聚糖半成品；上述海参岩藻聚糖半成品再经Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析，即可分离得到海参岩藻聚糖成品LFUC-H，经液相色谱和IR分析，确定其为岩藻聚糖。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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