CN110638033B - 一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、制备方法及应用 - Google Patents

一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：制备黑虎掌菌粗多糖；制备黑虎掌菌纯多糖，将黑虎掌菌粗多糖，置于层析柱中分离得到多糖组分，将多糖组分冷冻干燥72h，即得黑虎掌菌纯多糖；将有机硅、所述的黑虎掌菌纯多糖分别溶于水，然后分别溶解得到有机硅溶液和黑虎掌菌纯多糖溶液，再将有机硅溶液与黑虎掌菌纯多糖溶液混合，得到有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液，将有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液超声处理，得到有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物。本发明有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物具有更好的清除自由基的效果，改善细胞形态，提高抵抗过氧化氢损伤的能力，无毒副作用，制备方法简单。

Description

一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、制备方法及应用。
背景技术
细胞若一直暴露于有氧气的环境下，就会不断的产生“氧自由基”。而细胞在需要氧的环境下代谢时，也同时会产生抗氧自由基防御系统来抵制由氧自由基对细胞造成的伤害。不管细胞内抗氧自由基的防御系统如何健全，只要受到氧自由基伤害过的核酸(DNA)以及蛋白质，在细胞的生存当中，累积到相当量后，就会导致年龄依赖性的各种疾病，诸如动脉硬化、关节炎、神经退化性的疾病以及癌症。
氧自由基诱导细胞突变的结果，造成癌症的引发和进行，这在正常人类细胞中是经常发生的事情，虽然氧自由基对肿瘤的调控促进作用还未在人类中得以证明，可是有实验证据指出，氧化压力可以诱导肿瘤细胞的增殖。因此氧自由基应该可以被认为是一类主要的致癌剂，可以在癌的各种发展阶段中刺激癌症的形成。因此，避免或减少氧自由基的产生，或增加抗氧化的防御系统，比如向体内输送抗氧化剂，可以减少患癌的几率。
如今最常用的抗氧化剂大多是化学合成的，存在肝损伤以及引发癌症的安全隐患。因此，寻找安全高效的抗氧化剂显得尤为重要。国内外大量研究表明，天然食用菌多糖不仅安全，无副作用，而且具有多种生物药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗衰老及免疫刺激活性，在国际上被称为“生物反应调节剂”，食用菌多糖是绝佳的清除体内自由基，调节机体、治疗疾病的天然药物。然而天然食用菌多糖自身的生物活性有限，常常达不到理想的清除效果，限制了食用菌多糖的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：天然食用菌多糖的生物活性有限，提供了一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、制备方法及应用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备黑虎掌菌粗多糖
(11)将黑虎掌菌子实体粉碎，过60目筛得到黑虎掌菌粉料；按所述黑虎掌菌粉料与蒸馏水的质量体积比1：10向所述黑虎掌菌粉料中加入所述蒸馏水得到浸提原液，然后对所述浸提原液进行超声处理20min，再于80℃下浸提2h，最后使用四层纱布对浸提原液进行过滤得到上清液，重复提取3次，合并上清液得到浸提液；
(12)采用旋蒸的方式，对所述浸提液进行浓缩，得到浓缩浸提液，然后向所述浓缩浸提液中加入无水乙醇，所述浓缩浸提液与无水乙醇的体积比为1：4，搅拌混匀后于4℃下静置12h，然后离心过滤得沉淀物，将沉淀物溶于水即得黑虎掌菌粗多糖水溶液；
(13)去除所述黑虎掌菌粗多糖水溶液中的蛋白质，即得黑虎掌菌多糖溶液，对所述黑虎掌菌多糖溶液进行流水透析后，再浓缩得到浓稠状液体，将所述浓稠状液体进行真空冷冻干燥，即得黑虎掌菌粗多糖；
(2)制备黑虎掌菌纯多糖
将所述的黑虎掌菌粗多糖，置于层析柱中，以蒸馏水作为流动相，流速为1ml/min，分离得到多糖组分，在-50℃、气压0.1mbar下将所述多糖组分冷冻干燥72h，即得黑虎掌菌纯多糖；
(3)制备有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物(MON-SAP)
将有机硅、所述的黑虎掌菌纯多糖(SAP)分别溶于水，然后分别超声溶解30min得到有机硅溶液和黑虎掌菌纯多糖溶液，再将有机硅溶液与黑虎掌菌纯多糖溶液按照体积比10：1混合，得到有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液，将所述的有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液超声处理20min，得到有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物(MON-SAP)。
所述步骤(12)中，离心过程在离心机上完成，所述离心机的转速为5000rpm/min。
所述步骤(13)中，使用透析袋进行流水透析，所述透析袋的截留分子量为3500Da。
所述步骤(13)中，使用Savage试剂去除蛋白质，所述的Savage试剂包括体积比为4：1的三氯甲烷和正丁醇，所述黑虎掌菌粗多糖水溶液与Savage试剂的体积比为1：1。
所述步骤(2)中，层析柱为琼脂糖凝胶CL-48层析柱，黑虎掌菌纯多糖的提取率为5.3％。
由有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法制备得到的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物(MON-SAP)。
所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物包括有机硅、黑虎掌菌纯多糖，所述有机硅与所述黑虎掌菌纯多糖的质量比为10：1，所述黑虎掌菌纯多糖的分子量为1.5×106Da。
一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物在制备抗氧化保健食品上的应用。
一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物在制备抗衰老药物上的应用。
本发明公开了一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，步骤简单，效率高，制备得到的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物，对DPPH自由基的清除率达到88.5％，对超氧阴离子自由基的清除率达到82.5％，对羟基自由基的清除率达到65.5％，通过对氧化氢损伤的细胞模型的干预发现，可以有效提高损伤细胞模型的生存率；通过细胞凋亡、细胞形态观察和酶活力测定发现，可以明显减少过氧化氢造成的细胞凋亡，改善细胞形态；提高过氧化氢诱导导致的细胞相关酶(SOD、GSH)的活力，降低MDA的酶活力，并且呈现浓度依赖性，帮助细胞提高抵抗过氧化氢损伤的能力，保护细胞发生的氧化应激损伤，对氧化氢诱导的人胚肺成纤维细胞(Helf)的氧化损伤具有较好的保护作用，且无毒副作用，显示其有良好的拮抗过氧化氢损伤的作用，相比游离的黑虎掌菌纯多糖具有更好的清除自由基的效果，具有研发抗氧化抗衰老保健食品，美容产品和药物的应用前景。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物相比游离的黑虎掌菌纯多糖具有更好的清除自由基的效果，有效提高损伤细胞模型的生存率，明显减少过氧化氢造成的细胞凋亡，改善细胞形态，提高抵抗过氧化氢损伤的能力，无毒副作用，制备方法简单。
附图说明
图1为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的红外光谱图；
图2为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的差示扫描量热(DSC)表征结构；
图3为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的X射线(XRD)表征结果；
图4为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对DPPH的清除效果；
图5为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对超氧阴离子自由基的清除效果；
图6为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对羟基自由基的清除效果；
图7为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对Helf细胞活力的影响；
图8为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞的形态影响，
a-正常组、b-H2O2氧化损伤模型组模型组、c-有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度50ug/ml、d-有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度100ug/ml、e-有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度200ug/ml、f-有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度400ug/ml、g-有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度600ug/ml；
图9为正常组Helf细胞用流式细胞仪检测的结果；
图10为氧化损伤模型组细胞用流式细胞仪检测的结果；
图11为浓度为50ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果；
图12为浓度为50ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果；
图13为浓度为100ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果；
图14为浓度为100ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果；
图15为浓度为200ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果；
图16为浓度为200ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果；
图17为浓度为400ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果；
图18为浓度为400ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果；
图19为浓度为600ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果；
图20为浓度为600ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果；
图21为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞SOD的影响；
图22为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞MDA的影响；
图23为有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞GSH-PX的影响。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备黑虎掌菌粗多糖
(11)将黑虎掌菌子实体粉碎，过60目筛得到黑虎掌菌粉料；按所述黑虎掌菌粉料与蒸馏水的质量体积比1：10向所述黑虎掌菌粉料中加入所述蒸馏水得到浸提原液，然后对所述浸提原液进行超声处理20min，再于80℃下浸提2h，最后使用四层纱布对浸提原液进行过滤得到上清液，重复提取3次，合并上清液得到浸提液；
(12)采用旋蒸的方式，对所述浸提液进行浓缩，得到浓缩浸提液，然后向所述浓缩浸提液中加入无水乙醇，所述浓缩浸提液与无水乙醇的体积比为1：4，搅拌混匀后于4℃下静置12h，然后在离心机上离心过滤得沉淀物，所述离心机的转速为5000rpm/min，将沉淀物溶于水即得黑虎掌菌粗多糖水溶液；
(13)使用Savage试剂去除所述黑虎掌菌粗多糖水溶液中的蛋白质，所述的Savage试剂包括体积比为4：1的三氯甲烷和正丁醇，所述黑虎掌菌粗多糖水溶液与Savage试剂的体积比为1：1，即得黑虎掌菌多糖溶液，对所述黑虎掌菌多糖溶液使用透析袋进行流水透析后，再浓缩得到浓稠状液体，所述透析袋的截留分子量为3500Da，将所述浓稠状液体进行真空冷冻干燥，即得黑虎掌菌粗多糖；
(2)制备黑虎掌菌纯多糖
将所述的黑虎掌菌粗多糖，置于琼脂糖凝胶CL-48层析柱中，以蒸馏水作为流动相，流速为1ml/min，得到多糖组分，在-50℃、气压0.1mbar下将所述多糖组分冷冻干燥72h，即得黑虎掌菌纯多糖，所述黑虎掌菌纯多糖的提取率为5.3％；
(3)制备有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物(MON-SAP)
将有机硅、所述的黑虎掌菌纯多糖(SAP)分别溶于水，然后分别超声溶解30min得到有机硅溶液和黑虎掌菌纯多糖溶液，再将有机硅溶液与黑虎掌菌纯多糖溶液按照体积比10：1混合，得到有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液，将所述的有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液超声处理20min，得到有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物。
2、对所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物进行表征
分别使用红外光谱法、差示扫描量热法(DSC)、X射线法(XRD)对所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物进行表征。
(1)红外光谱法：
分别取有机硅、有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、黑虎掌菌纯多糖的冻干粉适量与KBr粉末混合研磨压片，在4000～400cm-1波长范围内进行FT-IR扫描，结果见图1，说明由虎掌菌纯多糖和有机硅制备的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物是新的物质，不是两者简单的混合。
(2)差示扫描量热(DSC)法：
分别取有机硅、有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、黑虎掌菌纯多糖适量，放置于样品台上轻轻压实进行DSC测试。实验中持续充氮气，流量为50ml/min，测试温度范围为30～300℃，升温速率为10℃/min。结果见图2，说明虎掌菌多糖已经和有机硅形成了新的复合物。
(3)X射线(XRD)法：
分别取有机硅、有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物、黑虎掌菌纯多糖的冻干粉适量，放置于样品台上轻轻压实并进行XRD测试。用Cu靶和100mA的电流测量不同粉末的X射线衍射图，扫描范围在5°～45°范围内。结果见图3，说明虎掌菌多糖已经和有机硅形成了新的复合物。
实施例2
本实施例测试实施例1制备的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的清除自由基的能力
(1)清除DPPH自由基
分别配制浓度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml、2.0mg/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液，配制浓度为0.22mmol/l的DPPH的甲醇溶液，取不同浓度的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液各2ml，分别与2ml DPPH的甲醇溶液混合。振荡混合均匀并于室温下孵育30min，于517nm处测定吸光值，抗坏血酸作阳性对照，每组实验设置三个平行，取吸光值的平均值。
DPPH自由基清除能力＝(1-(A1-A2)/A0)×100％
其中，
A0-不含样品的空白对照吸光值；
A1-加入不同浓度多糖样品的吸光值；
A2-多糖样品吸光值；
计算出有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对DPPH自由基的IC50值为0.5mg/mL。如图4所示，当有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度在1.2mg/ml时，对DPPH自由基的清除率达到88.5％，与抗坏血酸的相当。
(2)清除超氧阴离子
分别配制浓度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml、2.0mg/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液，配制Tris-HCl缓冲液(50mM，pH值8.2)，取不同浓度的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液各0.5ml，分别与0.5mL的Tris-HCl缓冲液混合后震荡摇匀，室温静置20min，再分别加入0.1mL邻苯三酚(3mmol)，充分混合后于325nm处测定吸光值。去离子水代替样品作空白照组，抗坏血酸作阳性对照，每组实验设置三个平行，取吸光值的平均值。
计算超氧阴离子自由基清除能力＝(A0-A1)/A0×100％
A0-不含样品的空白对照吸光值；
A1-加入不同浓度多糖样品的吸光值；
计算出有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对超氧阴离子的IC50值0.5mg/mL。如图5所示，当有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物在1.2mg/ml时，对超氧阴离子自由基的清除率达到82.5％，与抗坏血酸的相当。
(3)清除羟基自由基
分别配制浓度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml、2.0mg/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液，配制2.5mM过氧化氢溶液、6mM的乙醇-水杨酸溶液、6mM硫酸亚铁溶液，取不同浓度的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液各1ml，分别加入到由1mL乙醇-水杨酸溶液及1mL硫酸亚铁溶液组成的混合溶液中，分别震荡混匀后静置10min，再分别加入1mL过氧化氢溶液反应30min。抗坏血酸(Vc)作为阳性对照。用紫外可见光分光光度计于510nm处测定吸光值。用去离子水代替有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物溶液作为空白组，代替水杨酸作为对照组，每组实验设三组平行。
计算羟基自由基清除能力＝(A2-A1)/(A0-A1)×100
其中，
A0-空白对照组吸光值；
A1-不含多糖样品的吸光值；
A2-加入多糖样品的吸光值；
计算出有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对羟基自由基的IC50值分别为0.6mg/ml。如图6所示，当有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度为1.2mg/ml时，对羟基自由基的清除率达到65.5％，与抗坏血酸的相当。
由以上实验结果可知，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物可以有效清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基，并呈浓度依赖性，高浓度组时与抗坏血酸相当，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的IC50值分别为0.5、0.5、0.6mg/ml。
实施例3
本实施例测试实施例1制备的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤Helf细胞的保护作用
(1)有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对正常细胞的毒性检测
在96孔板中接入生长状态良好的Helf细胞，每孔加入3×103个细胞。在5％CO2培养箱中适应培养24h后，分别设置5组有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物给药组、1组阳性对照组和1组空白对照组，5组有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物给药组中，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的浓度分别为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml，阳性对照组中抗坏血酸的浓度为0.2mg/ml，处理24h后，去除培养液，利用MTT法检测样品对细胞活力的影响，结果如图7。如图7所示，在测试的样品浓度下，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对Helf细胞的存活率没有影响，证明复合物对Helf细胞没有明显的毒副作用。
(2)Helf细胞氧化应激损伤模型的建立
待Helf细胞长到60～80％，将细胞悬液调整以1×105cells/孔的密度，种至96孔板中，每孔加入50μL的培养基，培养24h；分别配制浓度为0μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM的过氧化氢溶液，加入96孔板中培养4个小时；然后每孔再加入10μl浓度为5mg/ml的MTT溶液继续培养4h；再向每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡十分钟后，使结晶物充分溶解，570nm波长下测量并记录其吸光值。选择细胞存活率达到50％时的过氧化氢浓度(400μM)建立过氧化氢诱导的Helf细胞氧化应激损伤模型。
(3)有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤Helf细胞活力的影响
将细胞密度调整至1×105cells/孔，种入96孔板中，每孔加入50μL的细胞悬液；24个小时之后，将400μM浓度的过氧化氢加入到每孔中，在细胞培养箱中培养4个小时。分为正常组，氧化损伤模型组、给药组(多糖，多糖复合物)。其中给药组的样品设为5个剂量(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml)。4个小时之后，给药处理组中每孔分别加入含有不同浓度样品的DMEM培养液100μl。正常组和氧化损伤模型组每孔仅给予100μlDMEM培养液。将上述实验组置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。培养24h后，每孔加入15μl 5mg/ml的MTT，培养4h后，吸出孔板中的培养液，每孔加入200μl二甲基亚砜，振荡十分钟后，使结晶物充分溶解，于490nm波长下测定OD值，结果如图7。如图7所示，在测试的样品浓度下，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对Helf细胞的存活率没有影响，证明复合物对Helf细胞没有明显的毒副作用。
(4)有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤Helf细胞形态的影响
建立Helf细胞氧化损伤模型，方法同本实施例(2)。分为正常组，氧化损伤模型组、给药组(多糖，多糖复合物)。其中给药组的样品设为5个剂量(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml。4个小时之后，给药处理组中每孔分别加入含有不同浓度样品的DMEM培养液100μl。正常组和氧化损伤模型组每孔仅给予100μl DMEM培养液。将上述实验组置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。培养结束后，细胞采用HE染色，于倒置显微镜下观察细胞的形态。结果如图8，如图8a所示，在测试的样品浓度下，正常组Helf细胞呈现类似菱形，生长良好，胞浆丰富，细胞形态饱满。如图8b所示，H2O2氧化损伤模型组细胞体积明显变小，细胞收缩聚拢，胞核模糊，胞浆明显变少。如图8c-g所示，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对损伤细胞的形态有着明显的改善作用，如细胞的胞核渐渐清晰，胞浆明显增多，细胞形态逐渐变得饱满，而且随着浓度的增大，对细胞形态的改善作用增强。
(5)有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤Helf细胞凋亡的保护作用
建立Helf细胞氧化损伤模型，方法同本实施例(2)。分为正常组。经多糖复合物处理后，收集并洗涤细胞，按照操作步骤，进行流式细胞仪检测。结果如图9～20，图9为正常组Helf细胞用流式细胞仪检测的结果，图10为氧化损伤模型组细胞的检测结果，图11为浓度为50ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果，图12为浓度为50ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果，图13为浓度为100ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果，图14为浓度为100ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果，图15为浓度为200ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果，图16为浓度为200ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果，图17为浓度为400ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果，图18为浓度为400ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果，图19为浓度为600ug/ml的黑虎掌菌纯多糖处理后的细胞的检测结果，图20为浓度为600ug/ml的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的细胞的检测结果。
如图10所示，通过流式细胞仪测试，氧化损伤模型组细胞的晚期凋亡比率达到65.9％，如图12、14、16、18、20所示，有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对细胞凋亡有着明显的抑制作用，随着复合物浓度的增大，晚期凋亡比率逐渐减小，活细胞比率逐渐增大，对细胞凋亡的抑制作用增强，当复合物浓度达到600ug/ml时，细胞的晚期凋亡比率达到2.85％，活细胞比率达到91.9％，接近正常组。
因此，本发明所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物可以保护细胞拮抗H2O2的损伤，当有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的浓度为600μg/ml时，H2O2损伤细胞模型的细胞存活率提高至75％；通过流式细胞仪观察分析得出，经过有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物处理后的H2O2损伤细胞模型，其细胞凋亡率显著下降，且呈现浓度依赖性，当有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的浓度为600μg/ml时，细胞凋亡率降低到2.85％，活细胞比率达到91.9％，接近正常组。
实施例4
本实施例测试实施例1制备的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤细胞的重要酶类(SOD、MDA和GSH)的活性的影响效果。
(1)将细胞密度调整至1×105cells/孔，种入96孔板中，每孔加入50μL的细胞悬液；24个小时之后，将400μM浓度的过氧化氢加入到每孔中在细胞培养箱中培养4个小时。分为正常组，氧化损伤模型组、给药组(多糖，多糖复合物)。其中给药组的样品设为5个剂量(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml)。4个小时之后，给药处理组中每孔分别加入含有不同浓度样品的DMEM培养液100μl。正常组和氧化损伤模型组每孔仅给予100μl的DMEM培养液。将上述实验组置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。收集终止培养的细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入500μL的双蒸水，4000r/min的转速下离心2min，离心后去上层液体。加入200μlRIPA裂解液充分裂解，于4℃12000r/min离心10min后，收集上层清液。按照试剂盒说明书操作，进行SOD活力的测试；按照试剂盒说明书操作，进行MDA活力的测试；按照试剂盒说明书操作，进行GSH-Px活力的测试，结果如图21、22、23。
有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞SOD的影响，如图21所示，跟模型组相比，随着复合物浓度的增大，氧化损伤细胞的SOD的活力逐渐增大，当复合物浓度达到600μg/mL时，细胞中SOD活力为43U/ml，与模型组相比，分别升高了16.3U/mL，21.3U/mL，接近正常组。
有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞MDA的影响，如图22所示，跟模型组相比，随着复合物浓度的增大，氧化损伤细胞的MDA的活力逐渐降低，当复合物浓度达到600μg/mL时，细胞中MDA含量降至1.49nmol/mgprot，接近正常组，与模型组相比，分别降低了77％，90％。
有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物对氧化损伤的Helf细胞GSH-PX的影响，,如图23所示，跟模型组相比，随着复合物浓度的增大，氧化损伤细胞的GSH-PX的活力逐渐增大，当给药浓度达到600μg/mL时，细胞中GSH-PX活力为8.4mg/gprot，接近正常组，与模型组相比，分别提升了77％、90％。
因此，本发明所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物可以提高氧化损伤Helf细胞中SOD和GSH的活力，降低MDA的活力，当有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度为600μg/mL时，氧化损伤Helf细胞中的SOD、MDA和GSH活力均接近正常组。

Claims (8)

1.一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备黑虎掌菌粗多糖
（11）将黑虎掌菌子实体粉碎，过60目筛得到黑虎掌菌粉料；按所述黑虎掌菌粉料与蒸馏水的质量体积比1：10向所述黑虎掌菌粉料中加入所述蒸馏水得到浸提原液，然后对所述浸提原液进行超声处理20min，再于80℃下浸提2h，最后使用四层纱布对浸提原液进行过滤得到上清液，重复提取3次，合并上清液得到浸提液；
（12）采用旋蒸的方式，对所述浸提液进行浓缩，得到浓缩浸提液，然后向所述浓缩浸提液中加入无水乙醇，所述浓缩浸提液与无水乙醇的体积比为1：4，搅拌混匀后于4℃下静置12h，然后离心过滤得沉淀物，将沉淀物溶于水即得黑虎掌菌粗多糖水溶液；
（13）去除所述黑虎掌菌粗多糖水溶液中的蛋白质，即得黑虎掌菌多糖溶液，对所述黑虎掌菌多糖溶液进行流水透析后，再浓缩得到浓稠状液体，将所述浓稠状液体进行真空冷冻干燥，即得黑虎掌菌粗多糖；
（2）制备黑虎掌菌纯多糖
将所述的黑虎掌菌粗多糖，置于层析柱中，以蒸馏水作为流动相，流速为1ml/min，分离得到多糖组分，在-50℃、气压0.1mbar下将所述多糖组分冷冻干燥72h，即得黑虎掌菌纯多糖；
（3）制备有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物
将有机硅、所述的黑虎掌菌纯多糖分别溶于水，然后分别超声溶解30min得到有机硅溶液和黑虎掌菌纯多糖溶液，再将有机硅溶液与黑虎掌菌纯多糖溶液按照体积比10：1混合，得到有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液，将所述的有机硅/黑虎掌菌多糖混合溶液超声处理20min，得到有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物；
将有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物浓度调节在1.2mg/ml，用于制备抗氧化保健食品。
2.根据权利要求1所述的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（12）中，离心过程在离心机上完成，所述离心机的转速为5000rpm。
3.根据权利要求1所述的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（13）中，使用透析袋进行流水透析，所述透析袋的截留分子量为3500Da。
4.根据权利要求1所述的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（13）中，使用Savage试剂去除蛋白质，所述的Savage试剂包括体积比为4：1的三氯甲烷和正丁醇，所述黑虎掌菌粗多糖水溶液与Savage试剂的体积比为1：1。
5.根据权利要求1所述的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，层析柱为琼脂糖凝胶CL-48层析柱。
6.根据权利要求1所述的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，黑虎掌菌纯多糖的提取率为5.3%，黑虎掌菌纯多糖的分子量为1.5×106 Da。
7.一种由权利要求1～6任一项所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物的制备方法制备得到的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物。
8.根据权利要求7所述的一种有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物，其特征在于，所述的有机硅/黑虎掌菌多糖纳米复合物包括有机硅、黑虎掌菌纯多糖，所述有机硅与所述黑虎掌菌纯多糖的质量比为10：1。
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