CN102732583A - 一种深海细菌胞外多糖的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种深海细菌胞外多糖的制备方法与应用，制备方法如下：（1）将深海细菌SM-A87菌株接种于液体种子培养基，震荡培养2～3天，然后接种于发酵培养基，培养20～30h，然后调整发酵温度，继续培养8～10天，制得发酵液；（2）向发酵液中加入无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；（3）将粗多糖溶于水中，加入碱性蛋白酶，酶解5～6h；再加入无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。本发明制得的深海细菌胞外多糖具有很好的吸湿保湿性能和抗氧化性能，在化妆品领域中有很好的应用潜力。

Description

一种深海细菌胞外多糖的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种深海细菌胞外多糖的制备方法与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

现代科学技术的飞速发展和广泛应用给化妆品行业带来了全新的发展机遇，化妆品已从洁肤、润肤为目的的基础护肤品向延缓衰老、美化肤色为目的的功效型化妆品方向发展，化妆品的研发已经历了化学美容、植物美容，正向着生物美容和基因美容的目标发展。生物活性多糖作为功效性化妆品添加剂在化妆品中的应用，是生物美容的一个重要方向，可产生保湿、延缓衰老、促进上皮纤维成细胞增殖和美化肤色等多种功能，为功效性化妆品的开发注入新的活力。细菌胞外多糖优良的的生物学活性和理化性质为其在化妆品中的应用提供了基础，将各种细菌胞外多糖应用于化妆品中，能产生保湿、稳定、改善肤色、抗衰老和抗菌等功能，且高分子多糖无毒副作用，与常用化妆品成分配伍性好。因此，细菌胞外多糖作为功效型化妆品添加剂将有着广阔的前景。

由于年龄的增长和外界环境的影响，皮肤的保湿机构受到损伤，皮肤组织细胞和细胞间的水分含量减少，导致细胞排列紧密，胶原蛋白失水硬化，当角质层中水分降到10%以下时，皮肤就会显得干燥、失去弹性、起皱，加速皮肤老化。因此，水分对皮肤健康至关重要，保水保湿一直是护肤化妆品最主要的研究课题之一。保湿剂按来源可分为天然保湿剂和合成保湿剂两种。目前在化妆品中最常用的是合成保湿甘油、丙二醇、山梨醇等，均吸湿性能显著、保湿性能一般，作为保湿产品还存在一定不足。多糖具有营养和保湿双重功能，作为功效性添加剂在化妆品中应用，符合保湿剂的发展方向和市场需要。另一方面，皮肤的衰老是一个复杂的生理过程，“自由基学说”认为，过氧化作用是造成人体皮肤衰老的根本原因，而过氧化作用主要是因为氧自由基引起的。氧自由基氧化能力极强，一个自由基往往能产生许多其他的自由基，从而增大破坏作用，导致皮肤衰老、色斑、皱纹和皮肤疾病。因此，清除氧自由基，即抗氧化是延缓衰老最有效的办法。多糖的抗氧化作用已有较多的研究报道，抗氧化作用机理尚未有明确的解释，但研究发现，多糖衍生物中随着取代度的增加，即糖环上游离羟基数目减少，多糖衍生物捕获或猝灭自由基的能力降低，这表明，多糖结构中的还原性羟基可捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链长度，因此，可阻断或减缓脂质过氧化的进行，起到抗氧化的作用。也有研究认为，多糖环上的羟基可与产生羟自由基等所必需的金属离子（Fe²⁺、Cu²⁺等）络合，使其不能产生启动脂质过氧化的羟基自由基或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化氢，从而抑制活性氧的产生

海洋是生命资源的宝库，地球上80%的生物存在于海洋，资源总量巨大。海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的胞外多糖具有特殊结构，预示着可能在化妆品领域中将有新的潜在用途。然而，对于海洋微生物分泌的胞外多糖国内外已经有一些研究，但总体来看开发利用程度仍然很低，尤其在化妆品领域还没有商品化的海洋细菌胞外多糖。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种深海细菌胞外多糖的制备方法与应用。

一种深海细菌胞外多糖的制备方法，步骤如下：

（1）将深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株接种于液20℃条件下震荡培养2～3天，然后按3～5%（v/v）的接种量接种于发酵培养基，在15～20℃、溶解氧饱和度高于30%的条件下，培养20～30h，然后调整发酵温度为8～12℃，继续培养8～10天，在继续培养期间补加乳糖溶液，制得发酵液；

（2）向步骤（1）制得发酵液中加入1.5～3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；

（3）将步骤（3）制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为0.5～1%的溶液，单位为g/L；加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5～10U/mL，在45～50℃、180～200rpm的条件下，酶解5～6h；再加入1.5～3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。

上述步骤（1）中所述深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株购自中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO:AB206139T。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株是在温度为15～20℃条件下，于固体培养基活化培养2.5～3天后制得的。

根据本发明进一步优选的，上述固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.887份，酵母粉0.5份，乳糖3.221份，人工海水100份，pH为8.0。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中补加的乳糖溶液浓度为200g/L，由人工海水和乳糖配制获得，每次补料的量为发酵培养基体积的10%。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的补加乳糖溶液的次数为两次，补加乳糖溶液的时间为继续培养的第3天和第5天。

根据本发明优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的醇沉，温度为3～6℃，时间为20～40min。

根据本发明优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的烘干，温度为55～60℃，时间为24～30h。

上述深海细菌胞外多糖做为吸湿、保湿和/或抗氧化成分在制备化妆品中的应用。

有益效果

1、通过本发明所述制备方法获得的深海细菌SM-A87菌株发酵液中，胞外多糖含量为11.4g/L，远高于现有发酵方法获得的产量；

2、通过本方法制得的胞外多糖，在相对湿度为43%和81%的条件下，吸湿率分别为12.5±0.5%和28.8±2%；在硅胶环境中，胞外多糖保湿率为73.2±0.5%，具有良好的吸湿、保湿效果；

3、通过本方法制得的胞外多糖具有良好的清除自由基的能力，在浓度为10.0mg/mL的条件下，对有机自由基1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到48.5±1.5%、58.7±0.8%和27.2±0.6%。

附图说明

图1、发酵时间与发酵液粘度、深海细菌胞外多糖产量和菌体浓度关系的曲线图；

图2、在相对湿度为43%的条件下，深海细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油的吸湿率曲线图；

图3、在相对湿度为81%的条件下，深海细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油的吸湿率曲线图；

图4、深海细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油保湿率的曲线图。

图5、深海细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对有机自由基DPPH·的清除作用的曲线图；

图6、深海细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对羟自由基的清除作用的曲线图；

图7、深海细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对超氧阴离子自由基的清除作用的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株购自中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO:AB206139T。

碱性蛋白酶购自丹麦诺维信公司；人工海水为购自美国Sigma公司的海盐按照产品说明书进行配制获得；透明质酸购自山东福瑞达生物医药有限公司公司、壳聚糖购自苏州亚科化学试剂有限公司、海藻酸钠购自天津大茂化学试剂厂、甘油购自天津市登科化学试剂有限公司、维生素C购自美国Sigma公司、DPPH购自美国Sigma公司、邻苯三酚购自天津市科密欧化学试剂有限公司，其他试剂均为普通市售产品。

培养基的配制原料均为本领域常用原料，可市场购得。

实施例1：

一种深海细菌胞外多糖的制备方法，步骤如下：

（1）将购买的深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株划线接种于固体培养基，在20℃条件下活化培养3天，然后接种于100mL液体种子培养基中，在20℃、200rpm的条件下震荡培养2天，然后按5%（v/v）的接种量接种于5L发酵培养基中，在20℃、溶解氧饱和度80~100%的条件下，培养24h，然后调整发酵温度为10℃，继续培养9天，并在继续培养的第3天和第5天分别补加由乳糖和人工海水配制的浓度为200g/L的乳糖溶液500mL，制得发酵液；

上述固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨1份，酵母粉0.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.887份，酵母粉0.5份，乳糖3.221份，人工海水100份，pH为8.0；

（2）向步骤（1）制得发酵液中加入2倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉30min，10000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、60℃烘干24h，制得粗多糖；

（3）将步骤（3）制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为1%的溶液，单位为g/L；加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5U/mL的碱性蛋白酶，在50℃、200rpm的条件下，酶解5h；再加入2倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉30min，10000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、60℃烘干24h，制得深海细菌胞外多糖。

实施例2：深海细菌胞外多糖的吸湿、保湿性能测定

深海细菌胞外多糖的吸湿性能测定具体方法为：

将饱和硫酸铵溶液和饱和碳酸钾溶液分别置于2个干燥器（直径300mm）内，存放于25℃的恒温箱中，制成相对湿度分别为81%和43%的环境。

将深海细菌胞外多糖、透明质酸、壳寡糖和海藻酸钠粉碎至80目，和甘油一起置真空干燥器中，以P₂O₅为干燥剂，40℃下干燥至恒重。

分别精确称取0.5000g（精确到0.0001g）的深海细菌胞外多糖、透明质酸、壳寡糖和海藻酸钠各两份，分别放入25×25mm的称量瓶中，然后分别放入相对湿度为81%和43%的干燥器内进行吸湿实验。

于3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h将称量瓶取出称重，由测定前后试样的质量差计算吸湿率，求出各样品在不同时间下的吸湿率：

吸湿率=(W_n－W₀)／W₀×100%，

其中：W₀为干燥样品质量，W_n为放置一定时间后样品质量。

结果如图2所示，在相对湿度为43%的环境中，随时间的增加几种多糖样品和甘油的吸湿率逐渐增加，在72h时，各样品的吸湿性大小顺序为：甘油＞透明质酸＞深海细菌胞外多糖＞海藻酸钠＞壳聚糖。同时，从图2可以看出，湿度愈大，样品的吸湿率愈大。最终，在放置72h、相对湿度为43%时，深海细菌胞外多糖的吸湿率为12.5±0.5%。

结果如图3所示，在相对湿度为81%的环境中，随时间的增加几种多糖样品和甘油的吸湿率逐渐增加，在72h时，各样品的吸湿性大小顺序为：甘油＞透明质酸＞深海细菌胞外多糖＞海藻酸钠＞壳聚糖。同时，从图3可以看出，湿度愈大，样品的吸湿率愈大。最终，在放置72h、相对湿度为43%和81%时，深海细菌胞外多糖的吸湿率为28.8±2%。

在几种多糖样品中，透明质酸为目前公认的最佳吸湿保湿天然物质，吸湿率最高，而深海细菌胞外多糖的吸湿率仅次于透明质酸，具有很好的吸湿效果。

深海细菌胞外多糖的保湿性能测定具体方法为：

将在相对湿度43%环境中吸湿达到平衡的样品取出，放入装有变色硅胶的干燥器（直径300mm）中，置于25℃的恒温箱中。

于3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h将称量瓶取出称重。由测定前后试样的质量差计算保湿率：

保湿率=H_n/H₀×100%，

其中：H₀为试样最初含水质量，H_n为放置一段时间后试样含水质量。

在硅胶环境中各样品的保湿率如图4所示，几种多糖与甘油的保湿率大小顺序为壳聚糖＞透明质酸＞海藻酸钠＞深海细菌胞外多糖＞甘油。其中甘油的保湿率下降速率远大于其他多糖，在放置72h后保湿率为50.3±0.9%说明甘油虽然具有较好的吸湿性，但保湿性较差；几种多糖的保湿率非常接近，在放置72h后保湿率能维持在73-77%之间，其中深海细菌胞外多糖保湿率为73.2±0.5%，明显优于甘油，显示出较好的保湿效果。因此由以上结果可知，深海细菌胞外多糖具有较好的保湿效果，在化妆品领域有很好的应用前景。

实施例3：

深海细菌胞外多糖的抗氧化性能测定，具体方法如下：

1.对有机自由基（DPPH·）的清除作用

将深海细菌胞外多糖去离子水配成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.5和10.0mg/mL的溶液作为样品组。维生素C和透明质酸用去离子水配成相同浓度的溶液作为对照组。

DPPH用少量无水乙醇溶解，再用50%的乙醇配成浓度100μM的溶液。

取2mL的DPPH溶液加入10mL离心管中，再加入1mL样品溶液，充分混匀，室温避光反应40min，在525nm处测定吸光度Ai。

以1mL去离子水代替样品作为空白对照管，以2mL50%乙醇代替DPPH溶液加入1mL不同浓度的多糖作为样品参比管，并以等体积去离子水和50%乙醇混合液空白调零，按照同样的方法测定525nm波长下的吸光值，样品对DPPH·的清除作用计算公式：

清除率=[1－(A_i－A_j)/A₀]×100%，

其中：A_i为样品管的吸光值；A_j为样品参比管的吸光值；A₀为空白对照管的吸光值。

结果如图5所示。

维生素C对DPPH·有很强的清除作用在浓度为0.5mg/mL时基本就可以完全清除反应体系中的DPPH·；深海细菌胞外多糖在所选的浓度范围内对DPPH·有一定的清除作用，其清除能力随着多糖加入量的增加，清除率上升，在浓度为10.0mg/mL时清除率达到48.5±1.5%。对照组透明质酸对DPPH·的清除效果较差，清除率最高为1.7±0.3%。这说明了深海细菌胞外多糖在高浓度时具有较好的DPPH·清除能力。

2.对羟自由基（·OH）的清除作用

将深海细菌胞外多糖去离子水配成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.5和10.0mg/mL的溶液作为样品组。维生素C和透明质酸用去离子水配成相同浓度的溶液作为对照组。

10mL离心管中加入1mL9mM的FeSO₄、1mL9mM的水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的样品1mL，最后加1mL8.8mM的H₂O₂启动反应，37℃反应0.5h，以去离子水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。用去离子水代替样品作为空白对照，考虑到样品本身的吸光值，以1mL9mM的FeSO₄、1mL9mM水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的样品溶液1mL和1mL去离子水作为样品的本底吸收值，样品对·OH的清除作用计算公式：

·OH清除率=[1－(B_i－B_j)/B₀]×100%，

其中：B_i为样品管的吸光值；B_j为样品的本底吸光值；B₀为空白对照管的吸光值。

结果如图6所示。

结果显示，深海细菌胞外多糖对·OH的清除效果与一定范围的多糖浓度呈现正相关，在浓度为10.0mg/mL时清除率达到58.7±0.8%。然而，维生素C的清除活性明显高于多糖样品，在浓度为0.5mg/mL时，其清除活性即达到100%。而对照组透明质酸的清除作用较弱，在浓度10.0mg/mL时清除率只有15.2±0.2%，只有深海细菌胞外多糖的1/4左右。因此，结果表明胞外多糖具有较高的·OH清除活性。

3.对超氧阴离子自由基（O₂ ^-·）的清除

将深海细菌胞外多糖去离子水配成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.5和10.0mg/mL的溶液作为样品组。维生素C和透明质酸用去离子水配成相同浓度的溶液作为对照组。

取50mM、pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL25mM的邻苯三酚溶液（用10mM的HCl配制），混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL8mM的HCl终止反应，于320nm处测定吸光度，用10mM的HCl代替邻苯三酚溶液作为样品的本底吸收，空白对照组以相同体积去离子水代替样品，每个试样做3个平行，取平均值，样品对O₂ ^-·的清除作用计算公式：

O₂ ^-·清除率=[1－(C_i－C_j)/C₀]×100%，

其中：C_i为样品管的吸光值；C_j为样品的本底吸光值；C₀为空白对照管的吸光值。

结果如图7所示。

由图可知，随着深海细菌胞外多糖浓度的增加，对O₂ ^-·的清除活性逐渐升高，但总体能力稍弱，在浓度为10.0mg/mL时清除率为27.2±0.6%；维生素C对O₂ ^-·清除作用很强，在浓度为1.0mg/mL时已能完全清除反应体系中的O₂ ^-·；透明质酸也有较弱的O₂ ^-·清除能力，清除能力最高达到15.2±0.2%。因此，结果表明胞外多糖具有一定的O₂ ^-·清除活性。

Claims (10)

1.一种深海细菌胞外多糖的制备方法，步骤如下：

（1）将深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株接种于液体种子培养基，在15～20℃条件下震荡培养2～3天，然后按3～5%（v/v）的接种量接种于发酵培养基，在15～20℃、溶解氧饱和度高于30%的条件下，培养20～30h，然后调整发酵温度为8～12℃，继续培养8～10天，在继续培养期间补加乳糖溶液，制得发酵液；

（2）向步骤（1）制得发酵液中加入1.5～3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；

（3）将步骤（3）制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为0.5～1%的溶液，单位为g/L；加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5～10U/mL的碱性蛋白酶，在45～50℃、180～200rpm的条件下，酶解5～6h；再加入1.5～3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的深海细菌（Zunongwangia profunda）SM-A87菌株是在温度为15～20℃条件下，于固体培养基活化培养2.5～3天后制得的。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.887份，酵母粉0.5份，乳糖3.221份，人工海水100份，pH为8.0。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中补加的乳糖溶液浓度为200g/L，由人工海水和乳糖配制获得，每次补料的量为发酵培养基体积的10%。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的补加乳糖溶液的次数为两次，补加乳糖溶液的时间为继续培养的第3天和第5天。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中的醇沉，温度为3～6℃，时间为20～40min。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中的烘干，温度为55～60℃，时间为24～30h。

10.权利要求1所述深海细菌胞外多糖做为吸湿、保湿和/或抗氧化成分在制备化妆品中的应用。 

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