CN103937707B

CN103937707B - 一种北极海洋细菌与应用

Info

Publication number: CN103937707B
Application number: CN201410108720.XA
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 孙美玲; 陈秀兰; 石梅; 张熙颖; 宋晓妍; 解彬彬; 苏海楠; 秦启龙; 周百成
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-03-21
Also published as: CN103937707A

Abstract

本发明涉及一种北极海洋细菌与应用，该菌株于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号：CCTCC M2013437。该菌株可以大量分泌北极海洋细菌胞外多糖。该多糖具有良好的流变学性质，吸湿、保湿和清除有机自由基，羟自由基、氧自由基的活性，安全无毒、无刺激性等特点。

Description

一种北极海洋细菌与应用

技术领域

本发明涉及一种北极海洋细菌与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

微生物胞外多糖是微生物的次级代谢产物，是微生物在生长过程中分泌到细胞壁外形成与菌体分离的可溶性多糖及多糖复合物。微生物胞外多糖种类繁多，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖等单糖组成。它们具有植物多糖不具备的优良性质：生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。微生物多糖在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，如作为微生物絮凝剂、微生物采油中的生物化学调剖剂、食品添加剂、保鲜剂、抗癌医药品、包装材料、化妆品等。尤其在化妆品领域，多糖作为人体皮肤真皮层重要组成成分，在皮肤新陈代谢过程中具有突出调节作用。多糖的生物学活性和理化性质为其在化妆品中的应用提供了理论依据，将各种多糖应用于化妆品中，能产生保湿、稳定、改善肤色、抗氧化和抗菌、保护血管、促进上皮纤维的细胞增殖和美化皮肤等功能，其中在保湿和抗氧化作用上显得尤为重要。在保湿方面，保湿作用一直是护肤化妆品最主要的研究课题之一。当皮肤组织细胞和细胞间的水分含量减少时，细胞排列紧密，胶原蛋白失水硬化，皮肤就会显得干燥、失去弹性、起皱、老化。多糖的糖分子链相互交织成网状保持了一定的水分，且多糖分子中极性基团可与水分子形成氢键而结合大量的水分，这便为皮肤提供了水分来源。多糖还有具有良好的成膜性能，可在皮肤表面形成一层均匀的薄膜，减少皮肤表面的水分蒸发，保存皮肤自身的水分。在抗氧化方面，根据自由基理论，过氧化作用是造成人体皮肤衰老的根本原因。多糖能够捕获或淬灭脂质过氧化反应中产生的自由基，起到抗氧化的作用。

但是，当前只有黄原胶、结冷胶等很少种类的微生物多糖被应用于实际生产中。因此，有必要筛选、分离新的多糖产生菌，并对它们所产多糖的结构、物理化学特性进行深入探究，以进一步拓展它们的应用领域。近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖产量的年增长量在10％以上，而一些新型多糖年增长量在30％以上，现在世界上每年多糖总需求量在100万吨以上，总价值50-100亿美元。因此，多糖的生产具有巨大的市场价值。

海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的胞外多糖具有特殊结构，预示着可能在生物技术领域中将有新的潜在用途。虽然海洋微生物分泌的胞外多糖国内外已经有一些研究，但总体来看开发利用程度仍然很低。北极独特的地理和气候条件，形成了一个低温、干燥、强辐射的极端环境，而在北极海洋中生存着大量可产胞外多糖的微生物菌群。生存于北极海洋这个极端环境中的微生物所产的胞外多糖更是具有独特的分子结构与物理化学性质，使其在制药、化妆品、食品添加剂等方面具有广阔的市场前景。因此制备北极海洋微生物所产胞外多糖，并研究其结构及性质，对于开发和利用北极海洋微生物胞外多糖的应用潜力具有非常重要的意义，也是开辟和利用北极海洋自然资源的迫切需要。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种北极海洋细菌与应用，该北极海洋细菌能够产生具有新颖结构、良好流变学性质、安全无毒的胞外多糖。

一株北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株，该菌株于2013年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号：CCTCCM2013437。

提取该北极海洋细菌的16SrRNA基因进行菌种鉴定。将其基因序列在NCBI数据库中比对后发现，与北极海洋细菌相似性较高的菌株有PolaribactersejongensisKOPRI21160^T(相似度：99.13％)，PolaribacterbutkevichiiKMM3938^T(相似度：98.67％)和Polaribacterirgensii23-P^T(相似度：97.43％)。因此，北极海洋细菌属于极杆菌属(Polaribacter)。

上述北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用。

根据本发明优选的，上述应用，步骤如下：

(1)将活化后的北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株接种于液体种子培养基中，在15～20℃条件下震荡培养1～2天，然后按2～3％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在10～15℃、溶解氧饱和度高于30％、培养过程中pH控制在7.5～8.0的条件下，培养6～9天，在培养期间补加工业葡萄糖溶液，制得发酵液；

(2)向步骤(1)制得的发酵液中加入1.5～3倍体积的无水乙醇，经醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥后，溶于水中配制浓度为0.02～0.03g/mL的溶液；然后，加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为10～15U/mL，在45～50℃、120～150rpm的条件下，酶解5～6h；再加入1.5～3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；

(3)将步骤(2)制得的北极海洋细菌胞外多糖粗品溶于蒸馏水中，制得浓度为0.5～2mg/mL的溶液，然后经离子交换层析、凝胶过滤层析纯化，干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中活化后的北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株是将北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株在温度为15～20℃条件下，在固体培养基活化培养2～3天后制得的。

根据本发明进一步优选的，上述固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份、琼脂1.0～1.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的液体种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.8～1.0份，酵母粉0.5～0.75份，人工海水100份，pH为7.5～8.0。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的发酵培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工业葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH为7.5。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的工业葡萄糖溶液为由人工海水和工业葡萄糖配制的浓度625g/L的溶液。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的补加工业葡萄糖溶液的次数为三次，补加时间为培养的第3天、第4天和第5天，补加的体积分别为发酵培养基体积的4％、4％和2％。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的复合蛋白酶购自上海金穗生物科技有限公司。添加复合蛋白酶的目的是分解溶液中的蛋白质，因此本领域技术人员可以根据需要选择合适的市售产品。

根据本发明优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中的醇沉，温度为3～6℃，时间为20～40min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中的干燥为真空冻干，温度为-50～-60℃。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的离子交换层析次数为一次，层析柱规格：16mm×250mm，凝胶类型：DEAE-SepharoseFastFlow，0～0.7MNaCl溶液梯度洗脱，流速36mL/h。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中凝胶过滤层析次数为二次，层析柱规格：16mm×950mm，凝胶类型：Sepharose4B，以蒸馏水洗脱，流速15mL/h。

上述制备方法制得的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，分子量为220kDa；

上述制备方法制得的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，其组分如下，均为摩尔百分比：

N-乙酰己糖胺28％、甘露糖23.4％、葡萄糖醛酸21.4％、半乳糖17.4％、海藻糖7.4％、葡萄糖1.6％、鼠李糖0.8％；

上述制备方法制得的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，糖苷键连接方式如下，均为摩尔百分比：

4-连接的葡萄糖醛酸残基13.2％、2-连接的半乳糖残基13.0％、末端半乳糖残基11.5％、4-连接的葡萄糖残基10.2％、末端海藻糖残基9.2％、2,3-连接的甘露糖残基8.5％、4-连接的海藻糖残基7.9％、3-连接的半乳糖残基7.9％、4-连接的N-乙酰己糖胺残基6.5％、末端甘露糖残基5.6％、末端N-乙酰己糖胺残基2.9％、3-连接的甘露糖残基1.8％、末端葡萄糖残基1.0％、4,6-连接的甘露糖残基0.6％、2-连接的鼠李糖残基0.2％。

有益效果

1、本发明首次以北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127为菌株发酵生产胞外多糖，建立该菌株合成分泌的胞外多糖的优化发酵生产工艺，通过本发明的生产工艺获得的北极海洋细菌SM1127发酵液中，胞外多糖含量为17.84±0.22g/L。本发明的北极海洋细菌属于极杆菌属(Polaribacter)，已报道的对极杆菌属的细菌的研究很少，其中产胞外多糖的细菌更少，目前还未有报道研究极杆菌属细菌的产胞外多糖量，因此本发明的北极海洋细菌在极杆菌属中产糖量最高，而且远高于其它属的海洋细菌及现有发酵方法获得的多糖产量；

2、通过本方法制得的胞外多糖具有与其它多糖不同的结构，分析其糖基组成和糖苷键连接方式，可得多糖由N-乙酰己糖胺(28％)、甘露糖(23.4％)、葡萄糖醛酸(21.4％)和半乳糖(17.4％)组成，还含有部分海藻糖(7.4％)，少量的葡萄糖(1.6％)和鼠李糖(0.8％)；其糖苷键连接方式呈现多样化，且各连接方式所占比例分布较为平均，包括4-连接的葡萄糖醛酸残基(13.2％)，2-连接的半乳糖残基(13.0％)，末端半乳糖残基(11.5％)，4-连接的葡萄糖残基(10.2％)等等，且分子量大小为220kDa，属于一种新颖的胞外多糖；

3、通过本方法制得的胞外多糖具有良好的粘弹性、剪切稀化性和触变性等流变学性质，并具有良好的温度稳定性、pH稳定性和盐稳定性，在化妆品、石油开采等工业领域具有良好的应用潜力；

4、通过本方法制得的胞外多糖在小鼠急性经口毒性实验中表现为无毒，在兔子皮肤刺激性实验中表现为无刺激性，属于安全性产品，可安全用于化妆品、药品、食品等领域；

5、通过本方法制得的胞外多糖，具有良好的吸湿、保湿效果，在相对湿度为43％和81％的条件下，吸湿率分别为10.0±0.5％和22.1±0.6％；在干硅胶环境中放置72h后，胞外多糖保湿率为75.79±2.5％。已报道的多糖中，保湿性比较高的有假单胞菌属的(Pseudomonasfluorescens)PGM37产的胞外多糖、裂褶多糖(PSG)和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)多糖。其中，(Pseudomonasfluorescens)PGM37产的胞外多糖和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)多糖的保湿性低于透明质酸，裂褶多糖保湿性低于甘油，而本方法制得的胞外多糖在相同的检测方法和条件下保湿性高于透明质酸和甘油，是目前发现的保湿效果最好的多糖。而且，具有吸湿、保湿性的北极海洋细菌胞外多糖的研究还未见报道，本发明制备的多糖纯品可作为吸湿、保湿剂应用于化妆品中，在化妆品领域具有良好的应用前景；

6、通过本方法制得的胞外多糖具有良好的清除自由基的能力，在浓度为10.0mg/mL的条件下，对有机自由基1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到55.40±3％、52.1±2.1％和28.2±3％。具有抗氧化活性的北极海洋细菌胞外多糖的研究还未见报道，本发明制备的多糖纯品在医药、化妆品等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1、发酵时间与北极海洋细菌胞外多糖产量的曲线图；

图2、北极海洋细菌胞外多糖的阴离子交换层析洗脱曲线图；

图3、北极海洋细菌胞外多糖的凝胶过滤层析洗脱曲线图；

图4、北极海洋细菌胞外多糖的GC/MS糖基组成图；

图5、北极海洋细菌胞外多糖的GC/MS糖苷键连接方式图；

图6、不同浓度的北极海洋细菌胞外多糖溶液的粘度变化曲线图；

图7、不同浓度的北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的剪切速率下的粘度变化曲线图；

图8、不同浓度的北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的温度下的粘度变化曲线图；

图9、北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的pH下的粘度变化曲线图；

图10、北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的盐及盐浓度下的粘度变化曲线图；

图11、北极海洋细菌胞外多糖溶液的触变性曲线图；

图12、北极海洋细菌胞外多糖的急性经口毒性实验中KM小鼠的体重变化曲线图；

图13、北极海洋细菌胞外多糖的急性经口毒性实验中KM小鼠的组织切片图；

其中：图A1和图A2为心脏组织的切片图(200×)，图B1和图B2为肾脏组织的切片图(200×)，图C1和图C2为肝脏组织的切片图(200×)、图D1和图D2为脾脏组织的切片图(400×)，图A1，B1，C1，D1为对照组，图A2，B2，C2，D2为实验组；

图14、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油的吸湿率曲线图；

其中：图A为在相对湿度43％条件下的吸湿率曲线图，图B为在相对湿度81％条件下的吸湿率曲线图；

图15、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油保湿率的曲线图。

图16、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对有机自由基DPPH·的清除作用的曲线图；

图17、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对羟自由基的清除作用的曲线图；

图18、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对超氧阴离子自由基的清除作用的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述人工海水由购自美国Sigma公司的海盐按照产品使用说明书配制成盐浓度为3wt％的人工海水；

复合蛋白酶购自上海金穗生物科技有限公司；

实施例中所述固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

液体种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨1份，酵母粉0.5份，人工海水100份，pH为7.5～8.0；

发酵培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工业葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH为7.5；

实施例1

实施例2

实施例1所述北极海洋细菌(Polaribactersejongensissp.)SM1127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用，步骤如下：

(1)将北极海洋细菌(Polaribactersejongensissp.)SM1127菌株划线接种于固体培养基中，在20℃条件下活化培养2天，然后接种于100mL液体种子培养基中，在20℃、200rpm的条件下震荡培养1天，然后按2％(v/v)的接种量接种于5L发酵培养基中，在11.3℃、溶解氧饱和度30～100％的条件下，连续培养8天，培养过程中控制pH为7.5，并在培养的第3天、第4天和第5天分别补加由工业葡萄糖和人工海水配制的浓度为625g/L的工业葡萄糖溶液200mL、200mL和100mL，制得发酵液；

(2)向步骤(1)制得发酵液中加入2倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉30min，8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、-53℃真空冻干72h；冻干的多糖溶于水中，配成浓度为0.02g/mL的溶液；加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为12U/mL，在50℃、120rpm的条件下，酶解5h；再加入2倍体积的无水乙醇，在4℃条件下醇沉30min，8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、-53℃真空冻干72h，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；

(3)将步骤(2)制备的北极细菌胞外多糖粗品用蒸馏水溶解，配成浓度为1mg/mL的溶液，上清液加入DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱(柱型16mm×250mm)，蒸馏水冲洗，0～0.7MNaCl溶液梯度洗脱，流速36mL/h；用自动分部收集器收集液体，每管3mL，苯酚－硫酸法测定每管溶液的总糖含量，收集含有多糖的洗脱液，透析，-53℃真空冻干；

然后溶解于蒸馏水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，用Sepharose4B凝胶柱(柱型16mm×950mm)层析，以蒸馏水洗脱，流速15mL/h，洗脱液以每管5mL收集，苯酚-硫酸法检测每管溶液的总糖含量，收集有糖的溶液，透析，-53℃真空冻干；重复Sepharose4B凝胶柱层析的操作一次，制得北极海洋细菌胞外多糖。

结果如图2所示，经过阴离子交换后，得到2个洗脱峰，对第二个峰的多糖进行收集，经过两次凝胶过滤层析，得到图3所示的对称单峰，对此峰的多糖进行收集，得到北极海洋细菌胞外多糖的纯品。

实施例3

实施例1所述北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用，步骤如下：

(1)将北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株划线接种于固体培养基中，在15℃条件下活化培养3天，然后接种于100mL液体种子培养基中，在15℃、200rpm的条件下震荡培养2天，然后按3％(v/v)的接种量接种于5L发酵培养基中，在15℃、溶解氧饱和度60～80％的条件下，连续培养6天，培养过程中控制pH为8.0，并在培养的第3天、第4天和第5天分别补加由工业葡萄糖和人工海水配制的浓度为625g/L的工业葡萄糖溶液200mL、200mL和100mL，制得发酵液；

(2)向步骤(1)制得发酵液中加入3倍体积的无水乙醇，在6℃条件下醇沉40min，8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、-60℃真空冻干72h；冻干的多糖溶于水中，配成浓度为0.03g/mL的溶液；加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为15U/mL，在45℃、150rpm的条件下，酶解6h；再加入3倍体积的无水乙醇，在6℃条件下醇沉40min，8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、-60℃真空冻干72h，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；

(3)将步骤(2)制备的北极细菌胞外多糖粗品用蒸馏水溶解，配成浓度为2mg/mL的溶液，上清液加入DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱(柱型16mm×250mm)，蒸馏水冲洗，0～0.7MNaCl溶液梯度洗脱，流速36mL/h；用自动分部收集器收集液体，每管3mL，苯酚－硫酸法测定每管溶液的总糖含量，收集含有多糖的洗脱液，透析，-60℃真空冻干；

然后溶解于蒸馏水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，用Sepharose4B凝胶柱(柱型16mm×950mm)层析，以蒸馏水洗脱，流速15mL/h，洗脱液以每管5mL收集，苯酚-硫酸法检测每管溶液的总糖含量，收集有糖的溶液，透析，-60℃真空冻干；重复Sepharose4B凝胶柱层析的操作一次，制得北极海洋细菌胞外多糖。

实施例4

北极海洋细菌胞外多糖的糖基组成和糖苷键链接方式分析，具体方法如下：

取实施例1或实施例2制得的北极海洋细菌胞外多糖500μg与20μg的肌糖混合，溶于400μL的2M三氟乙酸中，120℃水解1h后，冻干；加入含有1MHCl的甲醇溶液中，80℃处理16h；然后在甲醇中用吡啶和乙酸酐重新对多糖样品进行N-乙酰化；然后用Tri-sil(购自美国Pierce公司)在80℃处理0.5h，再用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析其糖基组成，其中气相色谱(7890A，购自美国Agilent公司)连接到质量选择检测器(5975C，购自美国Agilent公司)，分离毛细管用EC-1石英毛细管(30m×0.25mm，购自美国Supelco公司)；

取实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖2mg加入200μL二甲基亚砜中，并用通入氮气流混合7h，然后加入CH₃I混合，过夜；然后通过一个C18的层析柱，冻干；然后在四氢呋喃溶液中用重锂分解，中和电荷，脱水；在干的二甲亚砜中用NaOH和CH₃I做甲基化处理，2M三氟乙酸121℃处理2h水解，用NaBD4还原并用乙酸酐/三氟乙酸乙酰化。生成的部分甲基化的糖醛醋酸盐用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析其糖苷键连接方式，其中气相色谱(7890A，购自美国HewlettPackard公司)连接到质量选择检测器(5975C，购自美国HewlettPackard公司)，分离毛细管用2380石英毛细管(30m×0.25mm，购自美国Supelco公司)；

取实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖100μg溶于蒸馏水中，同分子量分别为1189kDa，759kDa，511kDa，167kDa的标准葡聚糖进行TSKGelG5000PW的尺寸排阻色谱层析(柱型7.5mm×300mm，购自日本TosohBiosciences公司)，以pH5.5的50mM醋酸铵溶液洗脱，以ELS检测器(购自美国Agilent公司)检测洗脱液成分，根据多糖样品的出峰时间来分析其分子量大小。

经GC/MS分析后，根据多糖的糖基组成图谱(图4)和糖苷键连接方式图谱(图5)，得到多糖的糖基组成(表1)和糖苷键连接方式(表2)；

表1

表2

由表1和表2可知，北极海洋细菌胞外多糖主要由N-乙酰己糖胺(28％)、甘露糖(23.4％)、葡萄糖醛酸(21.4％)和半乳糖(17.4％)组成，还含有部分海藻糖(7.4％)，少量的葡萄糖(1.6％)和鼠李糖(0.8％)。北极细菌胞外多糖的糖苷键连接方式呈现多样化，且各连接方式所占比例分布较为平均，包括4-连接的葡萄糖醛酸残基(13.2％)，2-连接的半乳糖残基(13.0％)，末端半乳糖残基(11.5％)，4-连接的葡萄糖残基(10.2％)等，表明了多糖可能是多分支的结构。经过尺寸排阻色谱层析后得出多糖的分子量大小为220kDa。

北极海洋细菌胞外多糖的糖基组成和糖苷键连接方式与其它已报道的多糖都不相同，是一种新颖的胞外多糖。

实施例5

北极海洋细菌胞外多糖的流变学性质研究，具体方法如下：

(1)将实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度分别为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0g/100ml的多糖水溶液，用BrookFieldDV-II粘度计，S16转子于转速20rpm、25℃下测定溶液的粘度；

(2)将制备的北极海洋细菌胞外多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度分别为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0g/100ml的多糖水溶液，用BrookFieldDV-II粘度计，S16转子于转速1、2、10、15、20、40、60rpm，25℃下测定各溶液的粘度。

(3)将制备的北极海洋细菌胞外多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度分别为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0g/100ml的多糖水溶液，用BrookFieldDV-II粘度计，S16转子于转速20rpm，分别在10、20、30、40、50、60、70、80℃条件下测定各溶液的粘度。

(4)将制备的北极海洋细菌胞外多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度为1.5g/100ml的多糖水溶液，用10M的HCl和NaOH溶液调节pH至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，用BrookFieldDV-II粘度计，S16转子于转速20rpm、25℃条件下测定各溶液的粘度。

(5)将制备的北极海洋细菌胞外多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度为1.5g/100ml的多糖水溶液，加入NaCl和CaCl₂至终浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10g/100ml，用BrookFieldDV-II粘度计，S16转子于转速20rpm、25℃下测定溶液的粘度。

(6)将制备的北极海洋细菌胞外多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度为1.5g/100ml的多糖水溶液，用BrookFieldDV-II粘度计，S16转子于转速20rpm、25℃下每隔5min测定溶液的粘度，测定时间为30min。30min后转子转速调至2.0rpm，每隔5min测定溶液的粘度，测定时间为30min。

结果如图6所示，随多糖溶液浓度的提高溶液的粘度也升高。因此北极海洋细菌胞外多糖具有自身增粘性，但浓度和粘度并不成线性关系，表现为非牛顿流体特性。

结果如图7所示，胞外多糖具有典型的假塑性流体特性，表观为粘度随剪切速率的增加而降低。多糖浓度越高，粘度越大，但不同浓度的多糖溶液粘度随剪切速率增加而降低的趋势是一致的。

结果如图8所示，胞外多糖的粘度在温度逐步升高的情况下略有小幅度降低，70℃时略有升高，但基本不受温度改变的影响，表明在短时间的高温下多糖不会降解，其热稳定性非常好。

结果如图9所示，胞外多糖在不同的pH下粘度有一定变化，在pH9时粘度最高，在pH小于4时多糖溶液粘度下降较明显，但在pH4-14范围内粘度变化幅度较小，维持在较高的粘度，在碱性pH为9时出现一个峰值。因此，此胞外多糖可以在较宽的pH范围内保持高粘度，这有利于胞外多糖应用于各种不同的pH环境中。

结果如图10所示，在加入2g/100ml的盐时，多糖溶液粘度略有下降，之后再提高盐的浓度多糖溶液粘度下降幅度很小。说明北极海洋细菌胞外多糖在高浓度的盐溶液中能保持稳定，不絮凝不沉淀，能维持较高的粘度，这使得该多糖可应用于高矿化度环境中，例如作为油田增粘剂、聚驱剂，特别是可在海洋采油中应用。

结果如图11所示，S16转子于转速20rpm作用时，多糖溶液粘度缓慢下降，25min后达到稳定。S16转子于转速2.0rpm作用时，被剪切稀化的多糖溶液粘度又缓慢升高，25min后达到稳定。表明多糖具有正触变性。

实施例6

实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖的急性经口毒性实验(参照OECDGuidelinesforAcuteToxicityofChemicalsNumber420)，具体方法如下：

预实验：1只体重在20g左右的雌性KM小鼠，禁食过夜，不限制饮水。灌胃法灌入溶于蒸馏水中的胞外多糖溶液，灌入的量与小鼠体重比为5、50、300、2000、5000mg/kg，每隔24h灌入一个剂量，小鼠24h内不死亡则灌入下一剂量，最终剂量灌入后，观察72h后小鼠是否死亡。

正式试验：10只体重20g左右的雌性KM小鼠，分为实验组和对照组，每组5只，禁食过夜，不限制饮水。称量每只小鼠的体重后，实验组灌入与小鼠体重比为5000mg/kg的多糖溶液，多糖溶液由实施例1制备的北极海洋细菌胞外多糖配制而得，约0.8mL，分4次灌入，每次间隔2h，最后一次灌入后继续禁食4h。对照组灌入相同体积的蒸馏水。每天观察小鼠的中毒表现和死亡情况，及肢体活动和行为等改变。每周称量小鼠的体重。观察时间持续14天。14天后，实验组和对照组小鼠各取一只，取出心、肾、肝、脾做成组织切片，观察多糖是否对实验组小鼠造成病理学影响。

结果如图12所示，预实验得出5000mg/kg的剂量未致小鼠死亡，于是正式试验采用5000mg/kg的量灌入，灌入后实验组和对照组小鼠的体重在14天中差别很小。通过观察，发现实验组小鼠无任何死亡，说明多糖的半数致死量(LD₅₀)大于5000mg/kg，属无毒级别，且与对照组小鼠表现出相同的反应敏捷，动作有力，无中毒症状。

结果如图13所示，A为小鼠心脏组织切片，B为肾脏组织切片，C为肝脏组织切片，D为脾脏组织切片。编号为1的是对照组，2是实验组。观察发现实验组与对照组相比，心、肾、肝、脾都没有出现明显的细胞分散和细胞聚集，细胞的形态也未发生变化，说明北极细菌胞外多糖为造成小鼠的病理学反应。

以上结果表明，北极海洋细菌胞外多糖在急性经口毒性实验中表现为无毒，可应用于食品、药品、化妆品等领域。

实施例7

实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖的皮肤刺激性实验(参照OECDGuidelinesforAcuteDermalIrritationofChemicalsNumber404)，具体方法如下：

急性皮肤刺激性实验：取3只体重1.5kg左右的白色日本大耳兔，适应环境2天。试验前约24h，将兔子背部脊柱两侧毛剪掉，不损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。取溶于蒸馏水中的多糖溶液0.5mL(0.06g/mL)直接涂在皮肤上，然后用二层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照，涂抹0.5mL蒸馏水。采用封闭试验，敷用时间为4h。试验结束后用蒸馏水清洗实验区和对照区。在清除多糖后的1、24、48和72h观察涂抹部位皮肤反应，按下表3进行皮肤反应评分，以兔子皮肤积分的平均值进行综合评价，根据24、48和72h各观察时点最高积分均值，判定皮肤刺激强度。

表3皮肤刺激反应积分

结果如表4所示，在清除多糖后的1、24、48和72h时，涂抹部位皮肤未出现红斑、焦痂和水肿，计分为0，因此兔子皮肤积分的平均值为0，即急性皮肤刺激指数PII＝0，属于无刺激性。

表4

多次皮肤刺激性实验：取3只体重1.5kg左右的白色日本大耳兔，适应环境2天。试验前约24h，将兔子背部脊柱两侧毛剪掉，不损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。取溶于蒸馏水中的多糖溶液0.5mL(0.06g/mL)直接涂在皮肤上，另一侧皮肤涂抹0.5mL蒸馏水作为对照。每天涂抹1次，连续涂抹14天。从第二天开始，每次涂抹前剪毛，用蒸馏水清除残留受试物。1h后观察结果，按上表3评分，最后计算出每天每只动物平均积分，判定皮肤刺激强度。

结果如表5所示，每天观察涂抹部位皮肤，未出现红斑、焦痂和水肿，计分为0。因此，14天每只兔子积分均值为0，每天每只兔子积分均值为0，连续皮肤刺激性指数CII＝0，属于无刺激性。

表5

以上结果表明，北极海洋细菌胞外多糖对皮肤无刺激性，可应用于化妆品、医药等领域，安全用于对皮肤进行涂抹。

实施例8

实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖的吸湿、保湿性能测定，具体方法为：

吸湿性测定：将饱和硫酸铵溶液和饱和碳酸钾溶液分别置于2个干燥器(直径300mm)内，存放于20℃的恒温箱中，制成相对湿度分别为81％和43％的环境。

将实施例1制得的北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖和海藻酸钠粉碎至80目，和甘油一起置于真空干燥器中，以P₂O₅为干燥剂，40℃下干燥至恒重。

分别精确称取0.5000g(精确到0.0001g)的实施例1制得的北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖和海藻酸钠各两份，分别放入25×25mm的称量瓶中，然后分别放入相对湿度为81％和43％的干燥器内进行吸湿实验。

于3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h将称量瓶取出称重，由测定前后试样的质量差计算吸湿率，求出各样品在不同时间下的吸湿率：

吸湿率＝(W_n－W₀)/W₀×100％，

其中：W₀为干燥样品质量，W_n为放置一定时间后样品质量。

结果如图14A所示，在相对湿度为43％的环境中，随时间的增加几种多糖样品和甘油的吸湿率逐渐增加，在96h时，各样品的吸湿性大小顺序为：甘油＞透明质酸≈海藻酸钠＞北极细菌胞外多糖＞壳聚糖。北极细菌胞外多糖在相对湿度为43％、放置96h时，吸湿率为10.0±0.5％和22.1±0.6％，仅低于在化妆品中具有广泛应用的透明质酸，且大于在高级化妆品中使用的壳聚糖。

同时，从图14B可以看出，湿度愈大，样品的吸湿率愈大。最终，在相对湿度为81％的环境中，随时间的增加几种多糖样品和甘油的吸湿率逐渐增加，在96h时，各样品的吸湿性大小顺序为：甘油＞透明质酸＞海藻酸钠＞北极海洋细菌胞外多糖＞壳聚糖。同时，从图12可以看出，湿度愈大，样品的吸湿率愈大。北极细菌胞外多糖在相对湿度为81％、放置96h时，吸湿率为22.1±0.6％，大于在高级化妆品中使用的壳聚糖。

综上所述，在几种多糖样品中，透明质酸为目前公认的最佳吸湿保湿天然物质，吸湿率最高，而北极海洋细菌胞外多糖的吸湿率略低于透明质酸，大于在高级化妆品中使用的壳聚糖，也具有很好的吸湿效果。

保湿性测定：将在相对湿度43％环境中吸湿达到平衡的样品取出，放入装有变色硅胶的干燥器(直径300mm)中，置于25℃的恒温箱中。

于3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、60h、72h将称量瓶取出称重。由测定前后试样的质量差计算保湿率：

保湿率＝H_n/H₀×100％，

其中：H₀为试样最初含水质量，H_n为放置一段时间后试样含水质量。

在硅胶环境中各样品的保湿率如图15所示，几种多糖与甘油的保湿率大小顺序为北极海洋细菌胞外多糖＞海藻酸钠＞透明质酸＞壳聚糖＞甘油。在放置72h后，北极海洋细菌胞外多糖保湿率为75.79±2.5％，优于其它多糖样品，且明显高于吸湿性好、但保湿性较差的甘油，显示出较好的保湿效果。因此由以上结果可知，北极海洋细菌胞外多糖具有较好的保湿效果，在化妆品领域有很好的应用前景。

实施例9

实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖的抗氧化性能测定，具体方法如下：

对有机自由基(DPPH·)的清除作用：将北极海洋细菌胞外多糖溶于去离子水配成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.5和10.0mg/mL的溶液作为实验组。抗坏血酸和透明质酸用去离子水配成相同浓度的溶液作为对照组。

DPPH用少量无水乙醇溶解，再用50％的乙醇配成浓度100μM的溶液。

取2mL的DPPH溶液加入10mL离心管中，再加入1mL样品溶液，充分混匀，室温避光反应40min，在525nm处测定吸光度A_i。

以1mL去离子水代替样品作为空白对照管，以2mL50％乙醇代替DPPH溶液加入1mL不同浓度的样品作为样品参比管，并以等体积去离子水和50％乙醇混合液空白调零，按照同样的方法测定525nm波长下的吸光值，每个样品做3个平行，取平均值，样品对DPPH·的清除作用计算公式：

清除率＝[1－(A_i－A_j)/A₀]×100％，

其中：A_i为样品管的吸光值；A_j为样品参比管的吸光值；A₀为空白对照管的吸光值。

在实验过程中可以发现，抗坏血酸在浓度为0.5mg/mL时基本就可以完全清除反应体系中的DPPH·。结果如图16所示，北极海洋细菌胞外多糖在所选的浓度范围内对DPPH·有一定的清除作用，其清除能力随着多糖浓度的增加而增大，在多糖浓度为10.0mg/mL时清除率达到55.4±3％。对照组透明质酸对DPPH·的清除效果较差，清除率最高为1.74±0.9％。这说明了北极细菌胞外多糖在高浓度时具有较好的DPPH·清除能力。

对羟自由基(·OH)的清除作用：将北极细菌胞外多糖溶于去离子水配成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.5和10.0mg/mL的溶液作为实验组。抗坏血酸和透明质酸用去离子水配成相同浓度的溶液作为对照组。

10mL离心管中加入1mL9mM的FeSO₄、1mL9mM的水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的样品1mL，最后加1mL8.8mM的H₂O₂启动反应，37℃反应0.5h，以去离子水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。用去离子水代替样品作为空白对照，考虑到样品本身的吸光值，以1mL9mM的FeSO₄、1mL9mM水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的样品溶液1mL和1mL去离子水作为样品的本底吸收值，每个样品做3个平行，取平均值，样品对·OH的清除作用计算公式：

·OH清除率＝[1－(B_i－B_j)/B0]×100％，

其中：B_i为样品管的吸光值；B_j为样品的本底吸光值；B₀为空白对照管的吸光值。

在实验过程中可以发现，抗坏血酸在浓度为0.5mg/mL时，对·OH的清除活性即达到100％。结果如图17所示，北极细菌胞外多糖对·OH的清除效果在多糖浓度高于2mg/mL时，呈现正相关，在浓度为10.0mg/mL时清除率达到52.1±2.1％。而对照组透明质酸的清除作用较弱，在浓度10.0mg/mL时清除率只有19.14±1.8％，只有北极细菌胞外多糖的37％左右。因此，结果表明胞外多糖具有较高的·OH清除活性。

对超氧阴离子自由基(O₂ ^－·)的清除：将深海细菌胞外多糖溶于去离子水配成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.5和10.0mg/mL的溶液作为实验组。抗坏血酸和透明质酸用去离子水配成相同浓度的溶液作为对照组。

取50mM、pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL25mM的邻苯三酚溶液(用10mM的HCl配制)，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL8mM的HCl终止反应，于320nm处测定吸光度，用10mM的HCl代替邻苯三酚溶液作为样品的本底吸收，空白对照组以相同体积去离子水代替样品，每个样品做3个平行，取平均值，样品对O₂ ^－·的清除作用计算公式：

O₂ ^－·清除率＝[1－(C_i－C_j)/C₀]×100％，

其中：C_i为样品管的吸光值；C_j为样品的本底吸光值；C₀为空白对照管的吸光值。

在实验过程中可以发现，抗坏血酸在浓度为1.0mg/mL时已能几乎完全清除反应体系中的O₂ ^－·。结果如图18所示，随着北极细菌胞外多糖浓度的增加，对O₂ ^－·的清除活性逐渐升高，但总体能力稍弱，在浓度为10.0mg/mL时清除率为28.2±3.0％。透明质酸的O₂ ^－·清除能力较弱，清除能力最高达到15.2±2.5％。因此，结果表明胞外多糖具有一定的O₂ ^－·清除活性。

综上所述，北极海洋细菌胞外多糖具有良好的清除有机自由基(DPPH·)和羟自由基的能力，并能清除部分的超氧阴离子自由基，可作为抗氧化成分应用于化妆品、药品中使用。

Claims

1.一株北极海洋细菌Polaribactersp.SM1127菌株，该菌株于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号：CCTCCM2013437。

2.权利要求1所述北极海洋细菌Polaribactersp.SM1127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）将活化后的北极海洋细菌Polaribactersp.SM1127菌株接种于液体种子培养基中，在15～20℃条件下震荡培养1～2天，然后按2～3%（体积百分比）的接种量接种于发酵培养基中，在10～15℃、溶解氧饱和度高于30%、培养过程中pH控制在7.5～8.0的条件下，培养6～9天，在培养期间补加工业葡萄糖溶液，制得发酵液；

（2）向步骤（1）制得的发酵液中加入1.5～3倍体积的无水乙醇，经醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥后，溶于水中配制浓度为0.02～0.03g/mL的溶液；然后，加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为10～15U/mL，在45～50℃、120～150rpm的条件下，酶解5～6h；再加入1.5～3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；

（3）将步骤（2）制得的北极海洋细菌胞外多糖粗品溶于蒸馏水中，制得浓度为0.5～2mg/mL的溶液，然后经离子交换层析、凝胶过滤层析纯化，干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中活化后的北极海洋细菌Polaribactersp.SM1127菌株是将北极海洋细菌Polaribactersp.SM1127菌株在温度为15～20℃条件下，在固体培养基活化培养2～3天后制得的。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体培养基组分如下，均为重量份：

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下，均为重量份：

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下，均为重量份：

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的工业葡萄糖溶液为由人工海水和工业葡萄糖配制的浓度625g/L的溶液。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的补加工业葡萄糖溶液的次数为三次，补加时间为培养的第3天、第4天和第5天，补加的体积分别为发酵培养基体积的4%、4%和2%。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中的醇沉，温度为3～6℃，时间为20～40min。

11.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中的干燥为真空冻干，温度为-50～-60℃。

12.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中的离子交换层析次数为一次，层析柱规格：16mm×250mm，凝胶类型：DEAE-SepharoseFastFlow，0～0.7MNaCl溶液梯度洗脱，流速36mL/h。

13.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中凝胶过滤层析次数为二次，层析柱规格：16mm×950mm，凝胶类型：Sepharose4B，以蒸馏水洗脱，流速15mL/h。

14.由权利要求3制备的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，分子量为220kDa，其组分如下，均为摩尔百分比：

N-乙酰己糖胺28%、甘露糖23.4%、葡萄糖醛酸21.4%、半乳糖17.4%、海藻糖7.4%、葡萄糖1.6%、鼠李糖0.8%。

15.如权利要求14所述的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，糖苷键连接方式如下，均为摩尔百分比：

4-连接的葡萄糖醛酸残基13.2%、2-连接的半乳糖残基13.0%、末端半乳糖残基11.5%、4-连接的葡萄糖残基10.2%、末端海藻糖残基9.2%、2,3-连接的甘露糖残基8.5%、4-连接的海藻糖残基7.9%、3-连接的半乳糖残基7.9%、4-连接的N-乙酰己糖胺残基6.5%、末端甘露糖残基5.6%、末端N-乙酰己糖胺残基2.9%、3-连接的甘露糖残基1.8%、末端葡萄糖残基1.0%、4,6-连接的甘露糖残基0.6%、2-连接的鼠李糖残基0.2%。