CN102839138A - 一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ，该菌株已于2011年12月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011456。本发明还公开了一种多糖，是由培养海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ所得到的。经实验证明，该多糖对重金属离子（尤其是Pb²⁺）具有较高的清除率，对自由基也有较好的清楚效率，抗氧化性能优良。该多糖对浑浊污水也有较好的絮凝能力。可见，在污水处理方面，本发明的菌株、多糖有着得天独厚的优势，比如制成添加剂等，相信在不久的将来，本发明的菌株、多糖在污水处理领域将占据一席之地。

Description

一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖

技术领域

本发明涉及一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖，以及其应用。 

背景技术

随着工农业生产的发展和人们生活水平的提高，污水的排放量迅速增加，处理污水成为当前社会的难题之一。利用细菌处理污水是目前的热门研究，但尚无一种较为理想的菌种。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株可以用于污水处理的海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖，以及其应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ，该菌株已于2011年12月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011456。 

该菌株的特征为：Pseudoalteromonas issachenkonii HZ为革兰氏阴性菌，短杆状，在Zobell 2216E固体培养基菌落大（直径3mm），乳黄色，圆形，隆起，边缘较圆整，不透明，无迁移性。 

本发明的菌株是通过以下方式筛选得到的：样品采集自山东荣成海域，取样时间为鲍鱼苗期幼体从附着基剥离时（5月中旬）。样品为刮取的板上10cm²面积上的附着物，存放在2ml灭菌冻存管中，密闭保存在冰盒中，24小时内送回实验室。进行异养菌的分离和DNA的提取。将采集的样品用无菌海水稀释为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个浓度，用灭菌的涂布器均匀涂布于2216E固体培养基平板上，25℃恒温培养48h，挑取形态差别显著的的菌落。用划线法进行纯化。通过苯酚-硫酸法对所得菌株是否产多糖进行检测，初筛多糖产量超过0.5g/L，得到该产多糖菌株，通过DNA序列分析确定了其种属关系，属于Pseudoalteromonas。 

一种多糖，是由培养海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ所得到的，具体如下： 

（1）培养：海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ菌株经斜面培养、种子培养后得到种子培养液，接种到发酵培养基中，接种量2%～5%（体积百分数），温度20～35℃，150～250r/min摇床培养30～40h，得发酵液； 

（2）提取：发酵液5000rpm/min离心20min，过滤去除菌体，向上清液中加入3倍体积的95%乙醇（体积百分数），静置8～12h，离心得到沉淀，即为蛋白质和多糖的混合物； 

（3）除杂蛋白：将上述得到的蛋白质和多糖的混合物溶于水中，加入总体积1/4体积的Sevag溶剂（氯仿：正丁醇=4：1，体积比），充分震荡10min，离心去除有机相；重复进行8次，得到粗多糖溶液； 

（4）分离纯化：采用DEAE-52对粗多糖进行分级，用0-2M NaCl Tris-HCl（0.01M）进行梯度洗脱，收集主峰；将收集到的主峰浓缩脱盐、冷冻干燥后，溶于0.1M NaCl溶液，用Sephadex G100层析，用0.1M NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，冷冻干燥后即得到多糖，命名为EPS-1。 

所述斜面培养、种子培养对所属领域技术人员而言是常规的技术操作，在此不再赘述。 

所述培养所用的斜面培养基为：Zobell 2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。 

所述培养所用种子培养基为：Zobell 2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。 

所述发酵培养基为：牛肉膏0.25%，蔗糖3%，海盐（硝酸铵0.00016％，硼酸0.0022％，氯化钙0.18％，磷酸氢二钠0.0008％，柠檬酸铁0.01％，氯化镁0.88％，溴化钾0.008％，氯化钾0.055％，碳酸氢钠0.016％，氯化钠1.945％，硅酸钠0.0004％，硫酸钠0.0324％，氯化锶0.0034％，氟化钠0.00024％），余量为水，pH7.6～7.8。所述百分数均为质量百分数。 

所述培养条件为：温度30℃，200r/min摇床培养36h，此条件下，多糖产量可达到2.76g/L。 

经实验证明，该多糖对重金属离子（尤其是Pb²⁺）具有较高的清除率，对自由基也有较好的清楚效率，抗氧化性能优良。该多糖对浑浊污水也有较好的絮凝能力。可见，在污水处理方面，本发明的菌株、多糖有着得天独厚的优势，比如制成添加剂等，相信在不久的将来，本发明的菌株、多糖在污水处理领域将占据一席之地。 

附图说明

一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ，该菌株已于2011年12月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011456，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。 

图1：菌体生长曲线和多糖发酵曲线。 

图2：紫外扫描数据示意图。 

图3：梯度洗脱收集得到的主峰示意图。 

图4：洗脱得到的洗脱峰示意图。 

图5-1：多糖分子量线性回归方程，横坐标：洗脱体积，纵坐标，摩尔质量，图由机器得 出。 

图5-2：多糖分子量及分子量分布示意图，横坐标：洗脱体积；纵坐标：检测器响应，此为扫描图片。 

图6：EPS-1的红外谱图。 

图7：EPS-11H核磁共振谱图（30℃）。 

图8：EPS-113C核磁共振谱图（30℃）。 

图9：胞外多糖EPS1对污水絮凝的作用示意图。 

图10：胞外多糖和Vc对·OH的清除率示意图。 

图11：胞外多糖EPS1和Vc对O^2-·的清除率示意图。 

图12：EPS1红外光谱图。 

图13：EPS1吸收Pb²⁺红外光谱图。 

图14：铅元素的线性标准曲线。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 

实施例1菌株的获得 

样品采集自山东荣成海域，取样时间为苗期幼体（鲍鱼）从附着基剥离时（5月中旬）。样品为刮取的板上10cm²面积上的附着物，存放在2ml灭菌冻存管中，密闭保存在冰盒中，24小时内送回实验室。进行异养菌的分离和DNA的提取。将采集的样品用无菌海水稀释为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个浓度，用灭菌的涂布器均匀涂布于2216E固体培养基平板上，25℃恒温培养48h，挑取形态差别显著的的菌落。用划线法进行纯化。通过苯酚-硫酸法对所得菌株是否产多糖进行检测，筛选到一株多糖产量超过0.5g/L的菌株，通过DNA序列分析确定了其种属关系，属于交替假单胞菌Pseudoalteromonas，对其进行了保藏，保藏编号为CCTCCNO：M 2011456，保藏日期为2011年12月09日。 

实施例2提取多糖 

是培养海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ所得到的，具体如下： 

（1）培养：海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ菌株经斜面培养、种子培养后得到种子培养液，接种到发酵培养基中，接种量5%（体积百分数），温度30℃，200r/min摇床培养36h，得发酵液；菌体生长曲线和多糖发酵曲线如图1所示，多糖产量达到2.76g/L。 

（2）提取：发酵液5000rpm/min离心20min，过滤去除菌体，向上清液中加入3倍体积的95%乙醇（体积百分数），静置10h，离心得到沉淀，即为蛋白质和多糖的混合物； 

（3）除杂蛋白：将上述得到的蛋白质和多糖的混合物溶于水中，加入总体积1/4体积的Sevag溶剂（氯仿：正丁醇=4：1，体积比），充分震荡10min，离心去除有机相；重复进行8次，得到粗多糖溶液；采用紫外扫描检测杂蛋白是否除干净（检测260nm和280nm波长处若没有出现吸收峰，即表明无核酸和蛋白质残存），紫外扫描数据如图2所示。 

（4）分离纯化：采用DEAE-52对粗多糖进行分级，用0-2M NaCl Tris-HCl（0.01M）进行梯度洗脱，收集主峰（如图3所示）；将收集到的主峰浓缩脱盐、冷冻干燥后，溶于0.1M NaCl溶液，用Sephadex G100层析，用0.1M NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，冷冻干燥后即得到多糖，命名为EPS-1，如图4所示。 

所述培养所用的斜面培养基为：Zobell 2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。 

所述培养所用种子培养基为：Zobell 2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。 

所述发酵培养基为：牛肉膏0.25%，蔗糖3%，海盐（硝酸铵0.00016％，硼酸0.0022％，氯化钙0.18％，磷酸氢二钠0.0008％，柠檬酸铁0.01％，氯化镁0.88％，溴化钾0.008％，氯化钾0.055％，碳酸氢钠0.016％，氯化钠1.945％，硅酸钠0.0004％，硫酸钠0.0324％，氯化锶0.0034％，氟化钠0.00024％），余量为水，pH7.6～7.8。所述百分数均为质量百分数。 

多糖纯度和分子量确定： 

使用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定多糖EPS-1的分子量，色谱柱：SHODEXSB-806HQ（8.0m×300mm）；流动相：0.2M NaCl（取氯化钠17.85g，叠氮化钠0.15g，加纯水使药品溶解并稀释至1500mL）溶液；对照样品：0.1mg/mL聚苯乙烯硫酸酯钠盐系列对照品；流速0.5mL/min，柱温35℃，取对照品各100μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，由GPC软件进行普适校正计算线性回归方程，如图5-1所示，对照品K值为0.0006，α值为0.75，取供试样品溶液100μL，同法测定，用GPC软件计算出样品的分子量及分子量分布，如图5-2所示。 

根据标准品和标准曲线积分得出分子量信息如表1所示。 

表1 

常用的平均分子量有以数量为统计权重的数均分子量(Mn)和以重量为统计权重的重均分子量(Mw)。该多糖的分散系数为1.24，说明该细菌多糖分子量分散程度较小。 

EPS-1的单糖组成分析： 

EPS-1水解液的质谱解析结果见表2。经标准质谱库检索分析,检出5种单糖,其中包括两种戊糖(阿拉伯糖和木糖),3种己糖(甘露糖、葡萄糖和岩藻糖)。从表2中的峰面积百分比可以看出,EPS-1的主要组份为木糖，并含有少量的阿拉伯糖、葡萄糖和岩藻糖。 

表2EPS-1单糖组成分析表 

EPS-1的红外光谱分析： 

从EPS-1的红外谱图（如图6所示）可见，EPS-1具有多糖类物质的特有吸收峰，其中，3398.5cm^-1有强且宽的-OH伸缩振动峰，系多糖上的羟基形成的分子间或分子内氢键；2933.7cm^-1、2889.3cm^-1为-CH₂、-CH₃的C-H伸缩振动；1319.3cm^-1、-1454.33cm^-1是C-H的变角振动吸收峰；1633.7cm^-1为C=O的伸缩振动峰；1140cm^-1左右为C-O的吸收很强的伸缩振动峰，有可能是吡喃糖环特征吸收峰；925.8cm^-1为吡喃环非对称伸缩振动峰，860.2cm^-1有可能为β-吡喃环的C-H变角振动，但由于仪器、操作技术、样品处理等原因有可能造成的偏差，还需要进一步验证。 

EPS-1的核磁共振波谱分析： 

为进一步确定EPS-1的结构，对其进行1H-NMR（图7）和13C-NMR（图8）分析，在1H-NMR谱中，异头碳C-1上质子的δ值在4.7ppm附近，未超过5ppm，表明这些葡萄糖残基均为β构型，这与红外光谱分析一致。在13C-NMR谱中，在160-180ppm处未出现羰基碳信号，说明多糖不含糖醛酸和糖蛋白，95-105ppm区间只有一组信号峰，峰值103.26，根据文献可确定EPS-1为无分支的糖链结构，以β-1，4糖苷键连接，图谱中79.3ppm处有信号出现，即C-4位置发生取代，δ<20ppm处未出现碳信号，表明EPS-1不含甲基糖。 

实施例3多糖的用途 

一、EPS-1对污水的絮凝作用 

（1）获取生活污水 

取自山东轻工业学院生活污水处理厂，经检测其A值为1.626。 

（2）微生物絮凝剂胞外多糖的制备 

将海洋细菌HZ菌株接种到1L经灭菌的无氮培养液中，28℃培养2d至瓶底产生絮凝物 质，采用沉淀法经离心后冷冻干燥获得海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ的胞外多糖，经过sevage法除蛋白，并用DEAE-52和Sephadex G100进一步分离纯化，得到多糖EPS-1（即采用实施例2的方式提取得到多糖EPS-1）。 

（3）对生活污水的处理 

在250mL三角瓶中加入l00mL的待处理废水，加入0.2g制备好的海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ的胞外多糖EPS-1，混合均匀，静置lh，采用如下指标检测胞外多糖对废水的处理效果。 

（4）絮凝率的测量 

用753分光光度计以550nm波长测定，原废水的上相液D_γ值记为A₁；经处理后废水的上相液吸光度值(D_γ值)记为B₁。絮凝效果以絮凝率来表示： 

絮凝率(%)=(A₁-B₁)/A₁×100% 

污水絮凝实验结果分析如图9所示。静置1h后，测得絮凝率为84.19%，从对生活废水的处理结果来看，由海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ菌株所制备得到的胞外多糖EPS-1已达到对生活污水进行处理的要求，效果完全达到预期，可以当做絮凝剂进行应用。 

二、EPS1对清除自由基的应用研究 

（1）对羟自由基的清除 

1.采用H₂O₂／Fe²⁺体系，通过Fenton反应生成·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含9．8mmol/LH₂O₂ lmL，9mmol/LFeSO₄ lmL，9mmol/L水杨酸-乙醇lmL，不同浓度的海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1多糖溶液lmL，其中H₂O₂是最后加入并启动整个反应。37℃反应30min，5000r/min离心10min，以蒸馏水为参比，在510nm下测量各浓度的吸光度。 

考虑待测溶液本身的吸光值不同，以9mmol/LFeSO₄ lmL，9mmol/L水杨酸-乙醇lmL，不同浓度的多糖溶液lmL和蒸馏水lmL作为待测溶液的本底吸收值。清除率计算公式为： 

清除率=[A₀-(A_x-A_x0)]／A₀×100％ 

式中：A₀为空白对照液的吸光度，A_x为加入多糖溶液后的吸光度，A_x0为多糖溶液的本底吸收值。 

2．采用2／Fe²⁺体系，通过Fenton反应生成·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含9．8mmol/LH₂O₂ lmL，9mmol/LFeSO₄lmL，9mmol/L水杨酸-乙醇lmL，不同浓度的Vc溶液lmL，其中H₂O₂是最后加入并启动整个反应。37℃反应30min，5000r/min离心10min，以蒸馏水为参比，在510nm下测量各 浓度的吸光度。 

考虑待测溶液本身的吸光值不同，以9mmol/LFeSO₄ lmL，9mmol/L水杨酸-乙醇lmL，不同浓度的Vc溶液lmL和蒸馏水lmL作为待测溶液的本底吸收值。清除率计算公式为： 

清除率=[A₀-(A_x-A_x0)]／A₀×100％ 

式中：A₀为空白对照液的吸光度，A_x为加入Vc溶液后的吸光度，A_x0为Vc溶液的本底吸收值。 

清除羟自由基（·OH）实验结果分析如图10所示。EPS1胞外多糖对羟自由基的清除效果较明显，并呈现明显的量效关系。但是胞外多糖EPS1对·OH的清除与相同浓度的Vc相比清除效果略差，说明胞外多糖EPS1对·OH的清除有一定的作用。 

（2）对超氧自由基的清除 

1.连苯三酚在碱性条件下会发生自动氧化反应，自氧化过程中产生O^2-·，O^2-加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色物质。连苯三酚在自氧化过程中，形成一系列在400～420nm处有光吸收的中间产物，由于自氧化速率依赖于O^2-·的浓度，清除O^2-·则抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价受试物清除O^2-·的能力。 

2.采用邻苯三酚自氧化法测定，取4．5mLpH8．2浓度为50mmol/Ltris-HCl缓冲液，15μL蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚151μL(以10mmol／LHCl配制，空白管用10mmol／LHCl代替邻苯三酚的HCl溶液)，迅速摇匀后倒入比色皿中，325nm下每隔30s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入邻苯三酚前，先加入1mL的EPS 1多糖溶液，蒸馏水减少，然后按上述方法计算清除率。 

清除率=(ΔA₀—ΔA)／(ΔA₀)×100％ 

其中：△A₀邻苯三酚的自氧化速率，△A为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率。 

3.采用邻苯三酚自氧化法测定，取4．5mLpH8．2浓度为50mmol/Ltris-HCl缓冲液，15μL蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚151μL(以10mmol／LHCl配制，空白管用10mmol／LHCl代替邻苯三酚的HCl溶液)，迅速摇匀后倒入比色皿中，325nm下每隔30s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入邻苯三酚前，先加入1mL的Vc多糖溶液，蒸馏水减少，然后按上述方法计算清除率。 

清除率=(ΔA₀-ΔA)／(ΔA₀)×100％ 

其中：△A₀邻苯三酚的自氧化速率，△A为加入Vc溶液后邻苯三酚的自氧化速率。 

清除超氧自由基（O^2-·）实验结果分析如图11所示。 

胞外多糖对超氧自由基的清除作用较明显，随着多糖浓度的增加，清除效果逐渐加强。在一定浓度范围内，呈量效关系，且胞外多糖的清除率略略低于Vc的清除率。 

三、EPS-1对Pb²⁺的清除作用 

1.①配制浓度为50μg/mL的醋酸铅溶液25mL，加入0.2g海洋细菌胞外多糖Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1粉末，在恒温振荡器上震荡2小时，加入95%乙醇醇沉至乙醇浓度达80%，静置，在离心机中高速离心15分钟，将上清液移入蒸馏烧瓶中，减压浓缩回收乙醇，剩余液定容25mL，待测。 

消化瓶中加入待测溶液10mL，加入硝酸—高氯酸（4：l）约10mL，通风橱中加热至棕色，冷却加约5mL浓硫酸继续加热至淡黄色或无色，定容25mL，测定。 

②样品测定：用原子吸收分光光度法测定。 

2.以去离子水配置的浓度50μg/mL的醋酸铅25mL，加入海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ胞外多糖EPS1粉末，在恒温振荡器上震荡2小时加入95%乙醇醇沉至乙醇浓度达80%，静置，在离心机中高速离心15分钟，所得沉淀冻干，研细，进行红外光谱检测。将干燥的样品与KBr压制成片，使用Necolet一Nexus470傅立叶变换红外光谱仪，扫描600一4000cm^-1波长范围的光谱吸收值。 

清除重金属离子结果分析如图12、13、14所示。 

对海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1（图12）和海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1-Pb（图13）的红外光谱在3500-1651cm-1基本相同，而在500-1651cm^-1和3650-3200cm^-1范围内，海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1（图12）和海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1-Pb（图13）的红外光谱有较大差异。海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1中的O-H振动3545.16cm^-1、3489.23cm^-1、3404.36cm^-1处吸收Pb²⁺后分别在3535.52cm^-1、3429.43cm^-1、3400.5cm^-1、3375.43cm^-1处；C=O伸缩振动在1651.07cm^-1，羧基的对称吸收峰在1425.40cm^-1，海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1-Pb中的C=O伸缩振动在1631.78cm^-1，羧基的对称吸收峰在1433.11cm^-1。由此可见，海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1的化学结构出现了变化，发生了化学变化，既海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1可以结合Pb²⁺。通过图14的铅的标准曲线我们计算得到海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkoniiHZ EPS1对Pb²⁺的清除率为98.37%，可见海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1对Pb²⁺的清除率非常高，完全能够满足我们的需要。 

综合上述所做实验所得的结果，我们可以发现海洋细菌Pseudoalteromonus isachenkonii HZEPS1在很多领域都可以得到广泛的应用，尤其在污水处理领域更是得天独厚。很多产胞外多糖细菌是从含有高水平的有毒的元素（硫或重金属）的极端海洋环境中分离出来的。所以，它们产生的一些胞外多糖对重金属有较强的吸引力，这可以广泛应用于废水中的重金属处理。虽然在前面的实验中我仅探讨了Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1对Pb²⁺的清除能力，但是从其对Pb²⁺拥有较高的清除率上看，Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1对其他重金属离子也应该有较好的表现。更加需要注意的是从Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1对自由基具有较好的清除效率来看，Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1的抗氧化性能也比较优良，虽然其对自由基的清除率略低于Vc，但考虑到Vc是一种比较活跃的还原性物质，Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1在清除自由基方面仍能与Vc在一个数量级上，可见其清除自由基的高效性。再加上海洋细菌胞外多糖对浑浊污水有较好的絮凝能，Pseudoalteromonus isachenkonii HZ EPS1在用作污水处理添加剂方面拥有得天独厚的优势，相信在不久的将来，在污水处理领域将占据一席之地。 

Claims (10)

1.一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ，其特征在于：该菌株已于2011年12月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011456。

2.一种多糖，其特征在于：是由培养海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ所得到的。

3.根据权利要求2所述的一种多糖，其特征在于：是通过以下方法得到的：

（1）培养：海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ菌株经斜面培养、种子培养后得到种子培养液，接种到发酵培养基中，接种量2%～5%，温度20～35℃，150～250r/min摇床培养30～40h，得发酵液；

（2）提取：发酵液5000rpm/min离心20min，过滤去除菌体，向上清液中加入3倍体积的95%乙醇，静置8～12h，离心得到沉淀，即为蛋白质和多糖的混合物；

（3）除杂蛋白：将上述得到的蛋白质和多糖的混合物溶于水中，加入总体积1/4体积的Sevag溶剂，充分震荡10min，离心去除有机相；重复进行8次，得到粗多糖溶液；

（4）分离纯化：采用DEAE-52对粗多糖进行分级，用0-2M NaCl Tris-HCl进行梯度洗脱，收集主峰；将收集到的主峰浓缩脱盐、冷冻干燥后，溶于0.1MNaCl溶液，用Sephadex G100层析，用0.1M NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，冷冻干燥后即得到多糖。

4.根据权利要求3所述的一种多糖，其特征在于：所述斜面培养所用的斜面培养基为：Zobell2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。

5.根据权利要求3所述的一种多糖，其特征在于：所述种子培养所用种子培养基为：Zobell2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。

6.根据权利要求3所述的一种多糖，其特征在于：所述发酵培养基为：牛肉膏0.25%，蔗糖3%，硝酸铵0.00016％，硼酸0.0022％，氯化钙0.18％，磷酸氢二钠0.0008％，柠檬酸铁0.01％，氯化镁0.88％，溴化钾0.008％，氯化钾0.055％，碳酸氢钠0.016％，氯化钠1.945％，硅酸钠0.0004％，硫酸钠0.0324％，氯化锶0.0034％，氟化钠0.00024％，余量为水，pH7.6～7.8；所述百分数均为质量百分数。

7.根据权利要求3所述的一种多糖，其特征在于：所述培养条件为：温度30℃，200r/min摇床培养36h。

8.权利要求1所述的海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ在污水处理中的应用。

9.根据权利要求3所述的一种多糖在污水处理中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述多糖作为金属离子清除剂、自由基清除剂以及絮凝剂的应用。

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