KR20110122048A - 김치로부터 분리된 바실러스 속 균주가 생산하는 항산화 및 항노화 활성을 지닌 세포외다당류 및 그 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 김치로부터 세포외다당류 생성능을 가지는 바실러스 리케니포미스 KS-17(Bacillus licheniformis KS-17)과 바실러스 리케니포미스 KS-20(B. licheniformis KS-20) 균주, 이로부터 생성된 항산화 및 항노화능을 보유한 세포외다당류 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 균주로부터 최적의 배양조건 하에 생산된 세포외다당류는 항산화 효과가 뛰어나서 식품 및 화장품 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

김치로부터 분리된 바실러스 속 균주가 생산하는 항산화 및 항노화 활성을 지닌 세포외다당류 및 그 생산방법 {Exopolysaccharides with antioxidant and antiaging activity produced by Bacillus sp. strains isolated from kimchi, a fermented korean food and the method for manufacturing the same}
본 발명은 김치로부터 분리되고 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS)를 생산하는 바실러스 리케니포미스 KS-17(Bacillus licheniformis KS-17), 바실러스 리케니포미스 KS-20(Bacillus licheniformis KS-20) 균주와 상기 균주들이 생산하는 항산화 활성을 보유한 세포외다당류의 생산방법에 관한 것이다.
현재 식품산업 등에서 산업적으로 주로 이용되는 항산화제는 BHA(Butylated hydroxyanisole), BHT(Butylated hydroxytoluene), PG(Propyl gallate), TBHQ(Tertiary butylhydroquinone) 등으로 합성된 항산화제를 사용하고 있다. 그러나 이런 합성 항산화제로 인한 cytotoxicity(Valentao P et al., 2002), 발암성, 고농도시 간 비대증 유발(Lee KH et al., 2006) 등의 문제점을 지님으로 인한 새로운 친환경적인 생산방법을 필요로 하고 있음에 따라 천연 항산화제의 개발은 매우 중요한 산업적 과제이다. 현재 천연 항산화제로는 천연식물 및 미생물 유래의 물질 등이 사용되고 있는데, 특히, 버섯 등과 같은 곰팡이 및 유산균 등 미생물의 대사산물로서 얻어지는 다당체의 항산화 효과에 대한 연구들이 이루어진 바 있다(Cui Y et al., 2005). 한편, Lactic acid bacteria(LAB), Propionibacteria, bifidobacteria 등 식품으로부터 유래된 미생물이 생산하는 세포외 다당류(exopolysaccharide, EPS)와 같은 대사산물은 GRAS(generally regarded as safe)로 여겨지고 있다.
미생물 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질형태로서 발효 중에 축적되는, 미생물의 1차 또는 2차 대사산물을 세포외 다당류(exopolysaccharide, EPS)라고 한다(Kim DJ et al., 2001). 미생물로부터 생산되는 다당류는 긴 사슬(long-chain) 및 고분자(high-molecular-mass)의 특성을 가진 폴리머로 텍스처라이저(texturizers), 증점제(viscosifiers), 유화제(emulsifiers), 필름 형성능 등의 다양한 기능을 보유하며 식품 공업에서 오래전부터 사용되어 왔으며, 최근 혈당조절 효과(Cho EJ et al,. 2007), 자외선차단효과(Bae JT et al., 2005), 항산화 효과(Asker MMS et al., 2009; Wang J et al., 2007), 항균성 및 면역강화 효과(Kolodzieja H et al., 2007) 등 건강에 유익한 효과의 연구보고에 따라 식품 및 제약산업 등 넓은 범위에서 활용 가능한 기능성 소재로서 그 중요성이 점점 증가하고 있다(Shivakumar S et al,. 2006). 또한 이렇게 미생물이 생산하는 세포외다당류는 배지의 구성성분 및 배양 조건 등을 개선함에 따라 그 생산성을 크게 높일 수 있다고 보고되고 있다(Vijayendra SVN et al., 2008).
이런 기능성 다당류는 주로 버섯과 같은 곰팡이류(fungi)에서 많이 생산되는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 예로 차가버섯(Inonotus obliquus)등과 같은 고등균사체 버섯에 의해서 생산되는 베타 글루칸(β-glucan)을 들 수 있는데, 이러한 베타 글루칸은 최근 여러 연구로부터 항암(Cha JY et al., 2004), 항산화(Cui Y et al., 2005), 항고지혈증 및 혈당조절(Kim MA et al., 2009)등을 지닌 것으로 알려짐에 따라 큰 주목을 받고 있다. 그러나 버섯과 같은 곰팡이류는 세균 (bacteria)에 비하여 성장속도가 느리고 배양특성상 상대적으로 대량 배양이 어려우며, 또한 EPS 생산량이 많지않은 단점을 지니고 있다.
한편, 식품으로부터 분리된 균주로부터 생산된 세포외 다당류에 대한 연구는 발효유제품으로부터 분리된 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.) 등과 특히 김치로부터 분리된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 웨이셀라 속(Weissella sp.) 등과 같은 유산균으로부터 생산된 세포외다당류가 있으나, 그 수가 많지 않으며 또한 각 미생물이 생산하는 세포외 다당류의 생산량이 매우 적은 것으로 알려져 상기의 산업적인 이용을 목적으로 할 경우 매우 곤란한 문제점을 가지고 있다(Vuyst LD et al., 2001; Kim BJ et al., 2001; Kim HJ et al., 2006; Kim MJ et al., 2008). 따라서 기능성을 보유한 세포외 다당류를 고생산하는 균주의 발굴 및 보다 간편한 방법으로 다량 생산할 수 있도록 다당류 생산을 위한 배양조건의 최적화 방법에 대한 연구가 필요하다.
전통발효식품인 김치는 유제품 등과 달리 염의 농도가 높고(Park SJ,. 2001) 고추가루, 마늘, 생강 등 부재료의 영향을 받으며(Lee SH et al,. 2005), 발효가 진행됨에 따라 pH가 낮아지는 등 미생물이 생육하기 어려운 환경을 지니고 있는데(Kim JG et al., 2005) 이러한 관점에서 김치로부터 분리된 균주는 비교적 극한 환경에서도 견딜 수 있는 장점 또한 지니리라 생각되어 본 발명에서는 김치로부터 세포외 다당류를 고생산하는 균주를 분리하고자 하였다.
현재까지 김치로부터 미생물을 분리한 선행 연구는 몇 편에 불과하고 특히 바실러스 속(Bacillus sp.)을 분리한 선행연구는 아직 없다. 또한 현재까지 김치에서 분리한 바실러스 리케니포미스로부터 생산된 엑소폴리사카라이드의 항산화 및 항노화 효과 및 이의 대량생산을 위한 조건 등에 대한 구체적인 결과는 없다. 따라서 안전성을 보유한 다당류의 항산화 및 항노화 같은 기능성 및 생산성이 확보된다면 식품산업 등에 바로 적용 가능한 기능성 소재로서의 장점을 지니게 될 것으로 기대된다.
이에 본 발명자들은 종래의 미생물성 세포외다당류(exopolysaccharide: EPS)와는 다른 새로운 세포외다당류를 생산할 수 있는 미생물의 탐색을 위하여 예의 연구한 결과, 한국 전통 식품인 김치로부터 균주 탐색을 통해 다량의 세포외다당류를 생산하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주를 발견하였고, 특히 상기 균주로부터 생산된 다당류는 항산화 및 항노화성 특징을 나타냈으며, 이를 이용한 대량생산공정을 확립하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 김치로부터 분리된 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 또는 항노화 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화 기능을 가지는 세포외다당류의 생산방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 김치로부터 분리되고, 수탁번호 KACC91570P를 갖는 바실러스 리케니포미스 KS-17(Bacillus licheniformis KS-17) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 김치로부터 분리되고, 수탁번호 KACC91571P를 갖는 바실러스 리케니포미스 KS-20(Bacillus licheniformis KS-20) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스 KS-17 또는 바실러스 리케니포미스 KS-20의 균주로부터 생산된 세포외다당류를 제공한다. 상기 세포외다당류는 글루코스로 이루어져 있으며, KS-17은 평균 분자량이 1.40 내지 1.50 kDa 인 것을 특징으로 하고, KS-20은 평균분자량이 1.50 내지 1.60 kDa 인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 세포외다당류는 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유하는 배지에서 균주를 배양하여 얻어지는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 KS-17 또는 KS-20으로부터 생산되는 세포외다당류를 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항노화 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 KS-17 또는 KS-20으로부터 생산되는 세포외다당류를 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항노화 식품을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 KS-17 또는 KS-20으로부터 생산되는 세포외다당류를 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 KS-17 또는 KS-20으로부터 생산되는 세포외다당류를 생산 또는 회수하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로는, KS-17로부터 생산되는 세포외다당류는 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유한 배지에 바실러스 리케니포미스 KS-17 균주를 접종한 후, 초기 pH 6.5 내지 7.5에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 조건으로 배양한 배양액으로부터 세포외다당류를 생산 또는 회수할 수 있다. 상기 배지에서, 자당은 90 내지 110g/L이고, 트립톤은 8 내지 12g/L, 효모 추출물은 4 내지 6g/L, 디포타슘 포스페이트는 4 내지 6g/L, 디암모니움 시트르산은 4 내지 6g/L인 것이 바람직하다.
또한 KS-20으로부터 생산되는 세포외다당류는 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유한 배지에 바실러스 리케니포미스 KS-20 균주를 접종한 후, 초기 pH 5.5 내지 6.5에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 조건으로 배양한 배양액으로부터 세포외다당류를 생산 또는 회수할 수 있다. 상기 배지에서, 자당은 65 내지 85g/L, 트립톤은 8 내지 12g/L, 효모 추출물은 4 내지 6g/L, 디포타슘 포스페이트는 4 내지 6g/L, 디암모니움 시트르산은 4 내지 6g/L인 것이 바람직하다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 김치로부터 분리된 신균주 바실러스 리케니포미스 KS-17(Bacillus licheniformis KS-17)과 바실러스 리케니포미스 KS-20(Bacillus licheniformis KS-20)으로부터 생산되는 높은 항산화능(antioxidnat capacity) 또는 항노화(antiaging capacity) 능을 보유한 세포외다당류는 인체에 안전한 천연 고기능성 다당류로서, 본 발명의 최적의 배지 및 배양조건에 따라 제조됨에 따라 식품 및 화장품 산업 등에 신규 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 자당(Sucrose)이 함유된 배지에 배양된 바실러스 리케니포미스 KS-17과 KS-20의 사진이다.
도 2는 바실러스 리케니포미스 KS-17 균주의 분자생물학적 계통분류도이다.
도 3은 바실러스 리케니포미스 KS-20 균주의 분자생물학적 계통분류도이다.
도 4는 바실러스 리케니포미스 KS-17과 KS-20 균주로부터 생산된 세포외다당류(EPS KS-17 및 KS-20)의 분자량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 TLC에 의한 단당류 구성성분을 분석한 것이다.
도 6은 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 HPLC-ELSD 분석에 의한 단당류 구성성분을 분석한 것이다.
도 7은 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 FT-IR 스펙트럼 분석에 의해 구조 분석한 것이다.
도 8은 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 자당(Sucrose) 농도에 따른 균체당 세포외다당류의 생산율(Specific rate)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 초기 pH에 따른 균체당 세포외다당류의 생산율(Specific rate)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 배양 온도에 따른 균체당 세포외다당류의 생산율(Specific rate)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 배양 시간에 따른 균체당 세포외다당류의 생산율(Specific rate)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 전자 공여능에 대한 효과를 나타내주는 그래프이다.
도 13은 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 SOD 유사 활성능에 대한 항산화능을 보여주는 그래프이다.
도 14는 세포외다당류 KS-17과 KS-20의 tyrosinase 저해 활성에 대한 항산화능을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 김치로부터 분리된 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KS-17, KS-20 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 김치로부터 미생물성 세포외 다당류를 생산하는 균주로서, 이를 순수 분리하여, 16S rDNA 염기서열 분석과 생화학적 특성 분석으로 동정한 결과, 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 것으로 동정되었으며, 이를 바실러스 리케니포미스 KS-17(Bacillus licheniformis KS-17)과 바실러스 리케니포미스 KS-20(B. licheniformis KS-20)으로 명명하였다.
또한 상기 균주 바실러스 리케니포미스 KS-17과 바실러스 리케니포미스 KS-20은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2010년 7월 28일자로 KACC(Korean Agricultural Culture Collection, 농업생명공학연구원)에 수탁번호 제 KACC91570P와 KACC91571P로서 기탁하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate), 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유하는 배지에서 상기 균주를 배양하여 항산화 기능을 가지는 세포외다당류를 생산하였다. 바실러스 리케니포미스 KS-17로부터 생산된 세포외다당류는 글루코스(glucose)로 이루어져 있고, 평균분자량이 1.45kDa 이었으며, 바실러스 리케니포미스 KS-20로부터 생산된 세포외다당류는 글루코스로 이루어져 있고, 평균분자량이 1.55kDa 이었다.
또한 본 발명은 상기 균주들로부터 세포외다당류를 생산하는 방법에 있어서, 항산화 또는 항노화 기능이 가장 높은 배지의 조성물 및 배양조건을 제공한다.
본 발명에서 배지란 동물세포, 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체배지 또는 액체배지를 의미하며, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다.
자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유한 배지에 바실러스 리케니포미스 KS-17 균주를 접종한 후, 초기 pH 6.5 내지 7.5에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 조건으로 배양한 배양액으로부터 세포외다당류를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 상기 자당은 90 내지 110g/L이고, 트립톤은 8 내지 12g/L, 효모 추출물은 4 내지 6g/L, 디포타슘 포스페이트는 4 내지 6g/L, 디암모니움 시트르산은 4 내지 6g/L이며, 초기 pH는 7, 온도는 37℃이다.
또한 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유한 배지에 바실러스 리케니포미스 KS-20 균주를 접종한 후, 초기 pH 5.5 내지 6.5에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 조건으로 배양한 배양액으로부터 세포외다당류를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 상기 자당은 65 내지 85g/L, 트립톤은 8 내지 12g/L, 효모 추출물은 4 내지 6g/L, 디포타슘 포스페이트는 4 내지 6g/L, 디암모니움 시트르산은 4 내지 6g/L이고, 초기 pH는 6, 온도는 37℃이다.
상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 상기 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 상기 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.
상기 방법으로 생산된 본 발명의 세포외다당류는 항산화 또는 항노화 기능을 가진다. 본 발명의 일 실시예에서는 바실러스 리케니포미스 KS-17과 바실러스 리케니포미스 KS-20로부터 생산된 세포외다당류의 DPPH 라디컬 소거능에 따른 전자공여능, 수퍼라디칼(superoxide radical) 소거능 및 티로시나제(tyrosinase) 저해 활성능을 측정한 결과, 대조군인 β-glucan 보다 높은 항산화능을 가지고 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 바실러스 리케니포미스 KS-17 또는 바실러스 리케니포미스 KS-20로부터 생산된 세포외다당류를 포함하는, 항산화 또는 항노화 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물일 수 있으며, 항산화제로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화되어 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 바실러스 리케니포미스 KS-17 또는 바실러스 리케니포미스 KS-20로부터 생산된 세포외다당류를 포함하는, 항산화 또는 항노화 식품을 제공한다.
본 발명의 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품은 일예로, 건강기능식품, 발효식품 또는 음료일 수 있다.
상기 건강 기능 식품이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제ㆍ캅슐제ㆍ산제ㆍ과립제ㆍ액제ㆍ환제 등의 형태로 제조ㆍ가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다.
본 발명의 세포외다당류를 포함하는 식품은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어난 장점이 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산 발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 KS-17 또는 KS-20으로부터 생산된 세포외다당류 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
또한 본 발명은 바실러스 리케니포미스 KS-17 또는 바실러스 리케니포미스 KS-20로부터 생산된 세포외다당류를 포함하는, 항산화 또는 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 외용제 또는 화장품 등으로 제형화될 수 있다. 상기 피부 외용제는 연고제, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤 등을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 세포외다당류 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 김치로부터 세포외다당류를 생성하는 균주의 분리
김치로부터 EPS를 생성하는 균주를 분리하기 위하여 수집된 김치의 내용물 전체를 마쇄한 다음, 멸균된 희석용액 0.1% peptone water를 이용하여 십진법으로 순차적으로 희석하였다. 희석된 각 시료의 100㎕를 취하여 2% CaCO3가 첨가 된 MRS(Difco Laboratories, MI, U.S.A.) 한천배지(1.5% agar, w/v)에 도말하여 37℃에서 30시간 동안 정치배양하여 1차적으로 균주를 분리하였다. 1차적으로 분리한 균주들의 EPS 생성능을 조사하기 위하여, 분리된 각 균주의 colony를 1.5% agar를 함유한 sucrose medium(표 1)을 pH 7.0으로 조정한 고체배지에 접종하여 37℃에서 30시간동안 배양하며 EPS를 고생산하는 두 균주를 선별하였다.
슈크로오즈 배지(sucrose media)의 변화된 조성
Component gram/Liter
Sucrose 50.00
Tryptone 10.00
Yeast extract 5.00
Dipotassium phosphate 5.00
Diammonium citrate 5.00
실시예 2 : 균주 동정
선별된 EPS 생성균주는 16S rDNA 염기서열 분석 및 생화학적 특성 분석을 통하여 동정하였다. 16S rDNA 유전자의 염기서열 분석을 위해 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 universal primer인 proF(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 534r(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'), 9Rev(5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3') 세가지의 primer가 사용되었으며, PCR은 PCR cycler Primus(MWG-BIOTECH)을 사용하여 수행하였다(표 2). 염기서열분석은 ABI PRISM 3730 DNA analyzer로 결정하였으며 분석된 염기서열은 DDBJ 프로그램으로 Genbank에 등록되어 있는 ribosomal RNA 유전자 염기서열과 비교하여 상동성 결과를 나타내었다.
PCT 반응조건
Reaction mixture PCR condition
10ㅧTaq reaction buffer 5㎕ 95℃, 2min
95℃, 1min ━━━┑
54℃, 30sec 30 cycle
72℃, 1min ━━━┙
72℃, 5min
dNTP mix(2.5mM each) 4㎕
primer proF 0.5㎕
primer 534r 0.5㎕
template 15㎕
Enzyme(2.5U/ul) 0.5㎕
D.W up to 50㎕
또한, 선별된 EPS 생성 분리균주의 생화학적 특성에 대한 분석은 VITEK(VITEK 2 System)을 사용하여 검토하였으며, 그 결과는 표 3에 나타냈다.
VITEK를 사용한 균주의 생화학적 분석
　 Strain 　 Strain
Biochemical details KS-17 KS-20 Biochemical details KS-17 KS-20
BXTL - - dMAN + +
LysA - - dMNE + +
AspA (-) - dMLZ + -
LeuA + + NAG - -
PheA + + PLE + +
ProA - - IRHA - -
BGAL + + BGLU + +
PyrA + + BMAN - -
AGAL - - PHC - -
AlaA - - PVATE - -
TyrA + + AGLU + +
BNAG - - dTAG + +
APPA + (-) dTRE + +
CDEX + + INU - -
dGAL - - dGLU + +
GLYG - - dRIB - -
INO - - PSCNa - -
MdG + + NaCl6.5% + +
ELLM + + KAN - -
MdX - - OLD - -
AMAN - - ESC + +
MTE + + TTZ - -
GlyA + + POLYB_R - -
이상의 방법으로부터의 균주동정 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 분리 균주 KS-17은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)와 99%의 상동성을 나타내었으며 VITEK를 사용한 생화학적 분석결과 바실러스 리케니포미스와 85%의 유사성을 나타냈다. 분리 균주 KS-20의 경우는 도 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 리케니포미스와 99.1%의 상동성을 나타내었으며 VITEK를 사용한 생화학적 분석결과 바실러스 리케니포미스와 85%의 유사성을 나타냈다.
즉, 김치로부터 분리된 엑소폴리사카라이드를 생성하는 분리균주 KS-17과 KS-20은 16S rDNA 염기서열과 생화학적 분석 결과 바실러스 리케니포미스(B, licheniformis)로 동정되었으며, 그 결과 KS-17을 바실러스 리케니포미스 KS-17 (B. licheniformis KS-17), KS-20을 바실러스 리케니포미스 KS-20(B. licheniformis KS-20)으로 명명하였다.
실시예 3 : 세포외다당류 정제
균주로부터 EPS를 생산하기 위하여, 자당(sucrose) 50g/L, 트립톤(tryptone) 10g/L, 효모 추출물(yeast extract) 5g/L, 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 5g/L 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate) 5g/L로 조제한 배지를 사용하여 37℃, 150rpm의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 균체 배양액은 배양 완료 후 항온수조(Water bath)에서 100℃, 20분 동안 열탕하여 효소를 불활성화 시킨 뒤 단백질의 제거를 위하여 4℃ 상태의 배양액에 최종농도가 4%가 되게 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 처리하여 원심분리(10,000rpm, 25분, 4℃)를 통해 균체와 침전된 단백질을 제거하였다. 상기의 상청액은 4℃의 에탄올(EtOH)를 3배 첨가 및 교반 한 뒤 4℃에서 하룻밤동안 추출 및 침전시킨 뒤 침전물인 EPS는 원심분리(10,000rpm, 20분, 4℃)를 통해 회수하고, 남아있는 에탄올은 진공농축기(MG-2200, EYELA, Japan)을 사용하여 제거한 뒤 3차 증류수에 재용해하여 배양액으로부터의 유리당을 제거하기 위하여 4℃에서 24시간 동안 투석(Mw cut off 12,000)한 다음 동결건조 후 분말 형태로 하여 시료로 사용하였다.
실시예 4 : 세포외다당류의 특성 규명
4-1. 분자량 측정
정제 된 EPS인 KS-17과 KS-20의 분자량을 측정하기 위해 시료를 0.15M NaCl을 함유한 0.5M Phosphate buffer(pH 6.8)에 1mg/ml(w/v)로 녹인 수용액 1ml을 sephadex G-200을 이용한 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 표준물질로 블루 덱스트란 2000(blue dextran 2000, GE Healthcare)과 gel filtration standard (thyroglobulin 670kDa, bovine gamma-globulin 158kDa, chicken ovalbumin 44kDa, equine myogolbin 17kDa, vitamin B12 1.35kDa)를 이용하여 용출 시간비와 분자량과의 관계에 따른 결과를 도 4에 나타내었다. KS-17의 분자량은 1.45kDa, KS-20의 분자량은 1.55kDa 정도로 조사되었다.
4-2. 구성 당 확인
EPS KS-17과 KS-20의 구성당을 조사하기 위하여 EPS 시료 10mg을 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid)을 통하여 가수분해하여 TLC 및 HPLC-ELSD로 분석하였다. TLC 분석은 표준물질(standard)로 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 프락토스(fructose), 만노스(mannose)를 사용하였고, silica gel TLC 판(Merck, TLC aluminium sheet, silica gel 60F254)에 standard와 시료는 1μl씩 점적하고 n-butanol/2-propanol/water/acetic acid(7:5:4:2, v/v/v/v)로 2번 전개시켜 건조 한 뒤 ethanol/sulfuric acid/p-anisaladehyde(18:1:1, v/v/v) 발색용액을 뿌린 뒤 120℃에서 1분 동안 발색시켜 확인하였다. 그 결과, 도 5에서 보여지는 것과 같이 KS-17 및 KS-20을 구성하는 환원당의 주성분은 글루코스(glucose)로 나타났으며, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC-ELSD)를 이용해 표준물질(standard)로 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 프락토스(fructose), 만노스(mannose), 락토스(lactose)를 사용하였을 때, 표 4의 조건으로 분석한 결과 글루코스로만 구성되어 중합체를 형성하는 호모폴리사카라이드 인 것으로 결정되었다. KS-17에서의 다른 하나의 피크는 알 수 없는 성분(unknown material)으로 표준물질로 사용한 단당류와 다른 retention time을 보였으나 이는 추출 과정중에 함께 추출된 DNA 고분자로 여겨지기 때문에 최종적으로 KS-17 및 KS-20이 생산하는 EPS는 글루코스로 이루어진 다당류임을 알 수 있었다.
HPLC-ELSD 분석조건
Instrument Waters 1515 Binary HPLC Pump
Detector ELSD 800 (Alltech)
Column SupelcosilTM LC-NH2, 5㎛, 4.6ㅧ250 mm
(GL Sciences Inc. Japan)
Mobile Phase water : MeCN = 25 : 75
Drift tube Temp. 55℃
Column Temp. room temp.
Flow Rate 1.0 mL/min
Injection Vol. 10 ㎕
4-3. 구조분석을 위한 FT-IR 스펙트럼
EPS KS-17과 KS-20 다당류의 구조분석을 위한 적외선 흡수스펙트럼에서 다당류의 특이적인 흡수띠인 3410 cm-1에서 강한 O-H 그룹, 2936 cm-1에서 C-H 그룹, 1645 cm-1에서 C=O 스트레칭 밴드(Ha JY et al., 2010), 1456cm-1에서 C-H2 밴드(Ha JY et al., 2010)와 1127 cm-1, 1061 cm-1 및 1015 cm-1는 강한 C-O-C 스트레칭 밴드를 나타내는 것으로 두 다당류의 결과가 유사하였다(도 7).
실시예 5 : 세포외다당류의 최적 배양 조건
EPS KS-17과 KS-20의 최적 배양 조건의 최적화를 위하여, sucrose 50g/L, tryptone 10g/L, yeast extract 5g/L, dipotassium phosphate 5g/L, diammonium citrate 5g/L로 조제한 배지를 사용하여 37℃, 150rpm의 조건에서 48시간 동안 배양하는 것을 기본 조건으로 하였다(표 1). 또한 균체량 및 EPS량의 측정은 배양 완료 후 원심분리(10,000rpm, 25분, 4℃)하여 침전된 것을 회수하여 균체로 하고, 상청액을 최종농도가 4%가 되도록 트리클로로아세틱에시드(trichloroacetic acid)를 첨가하여 단백질을 침전 및 원심분리(10,000rpm, 25분, 4℃)로 제거한 상청액에 4℃의 에탄올을 3배 가하여 4℃에서 하룻밤 침전시킨 후 원심분리(10,000rpm, 25분, 4℃)로 침전시켜 회수하였다. 이렇게 회수된 균체와 EPS는 감압, 건조한 후 건조중량을 측정하였다.
5-1. 탄소원(Carbon source)의 영향
분리 균주의 배양액의 조제 조건에서의 탄소원에 따른 균체량 및 EPS량과 그에 따른 특이율(Specific rate = EPS 생성량/균체량, w/w)을 조사하기 위하여 상기에 기술된 기본 배양 배지 조성에서 탄소원으로 프락토스(fructose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 슈크로오스(sucrose)를 50g/L의 비율로 각각 조제하여 확인하였다. 표 5에서 나타난 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 KS-17, 바실러스 리케니포미스 KS-20은 모두 슈크로오즈를 탄소원으로 하였을 때, 각각 6.44±0.39, 7.51±2.03 g/L의 생성량을 보여 KS-17의 경우 0.99±0.05g/L로 최저생산량을 보인 글루코스에 비하여 약 6.5배, 그리고 KS-20의 경우 0.83±0.63g/L로 최저생산량을 보인 갈락토스에 비하여 약 9배의 EPS를 생성함으로써 최대 생성량을 나타내었다.
탄소원(carbone source)에 따른 균체량 및 EPS 생성량
Carbon
source		 B. licheniformis KS-17 B. licheniformis KS-20
Biomass
(g/L)		 EPS
(g/L)		 specific
rate of EPS		 Biomass
(g/L)		 EPS
(g/L)		 specific
rate of EPS
fructose 3.39±0.22 1.12±0.11 0.35±0.03 2.79±0.22 1.43±0.11 0.51±0.06
galactose 2.32±0.25 1.45±0.18 0.63±0.12 3.11±0.22 0.83±0.63 0.27±0.21
glucose 2.69±0.24 0.99±0.50 0.36±0.15 2.33±0.29 1.63±0.21 0.70±0.04
lactose 2.23±0.12 1.48±0.40 0.66±0.15 1.96±0.03 1.16±0.37 0.59±0.18
sucrose 5.87±0.76 6.44±0.39 1.10±0.09 5.01±0.19 7.51±2.03 1.51±0.46
5-2. 슈크로오즈(sucrose) 농도의 영향
분리 균주의 배양액의 조제 조건에서의 상기 실시예 5-1에서 선정된 탄소원인 슈크로오즈의 농도에 따른 균체량 및 EPS량과 그에 따른 EPS 특이율(Specific rate = EPS 생성량/균체량, w/w)을 조사하기 위하여 상기에 기술된 기본 배양 배지 조성에서 탄소원을 0g, 25g, 50g, 75g 100g/L의 농도로 각각 조제하여 확인하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 KS-17은 슈크로오즈 농도를 100g/L로 하였을 때 11.6±0.6g/L로 최대 EPS 생성량 및 Specific rate을 나타내었고, 바실러스 리케니포미스 KS-20은 슈크로오즈 농도를 75g/L로 하였을 때 10.6±0.9g/L로 최대 EPS 생성량을 나타내었다(p<0.05).
5-3. 초기(initial) pH의 영향
분리 균주의 배양액의 기본적인 배지 조제 조건에서의 초기 pH에 따른 균체량 및 EPS량과 그에 따른 EPS 특이율(Specific rate = EPS 생성량/균체량, w/w)을 조사하기 위하여 상기에 기술된 기본 배양 배지 조성에서 초기 pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0으로 각각 조제하여 확인하였다. 도 8에서 나타난 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 KS-17은 초기 pH를 7.0로 하였을 때 10.7±0.3 g/L로 최대 EPS 생성량 및 Specific rate을 나타내었고, 바실러스 리케니포미스 KS-20은 초기 pH 6.0으로 하였을 때 12.5±0.8g/L로 최대 EPS 생성량 및 Specific rate을 나타내었고, 반면 pH 4에서는 두 균주 모두 생장하지 못하였다(p<0.001).
5-4. 배양 온도의 영향
분리 균주의 배양액의 기본 배지 조성 조건에서의 배양 온도에 따른 균체량 및 EPS량과 그에 따른 EPS 특이율(Specific rate = EPS 생성량/균체량, w/w)을 조사하기 위하여 상기에 기술된 기본 배양 배지 조성을 기반으로하여 배양 온도를 20, 30, 37, 40, 45℃로 각각 설정하여 확인하였다. 그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 바실러스 리케니포미스 KS-17와 바실러스 리케니포미스 KS-20은 모두 배양 온도를 37℃로 하였을 때 각각 13.2±0.7g/L과 12.4±0.5g/L로 최대 EPS 생성량 및 Specific rate을 나타내었다(p<0.001).
5-5. 배양 시간에 따른 생성량
분리 균주의 배양액의 배양 시간에 따른 균체량 및 EPS량과 그에 따른 EPS 특이율(Specific rate = EPS 생성량/균체량, w/w)을 조사하기 위하여 상기에 기술된 기본 배지 조성 및 배양 조건을 기반으로 하여 배양 시간을 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72시간 마다의 생성량을 확인하였다. 그 결과, 도 10에서 나타내었듯이 바실러스 리케니포미스 KS-17은 배양 후 60시간에서 18.9±0.4g/L로 최대 EPS 생성량 및 Specific rate을 나타내며 그 뒤 배양시간이 길어지면 오히려 EPS 생성량 및 Specific rate이 감소되었다. 한편 바실러스 리케니포미스 KS-20은 배양 후 72시간까지 꾸준히 생성량이 증가되는 경향을 보이며 배양 72시간에서 15.2±0.4g/L의 EPS 생성량 및 높은 Specific rate을 나타내었다.
실시예 6 : 세포외다당류의 항산화능
본 발명으로부터 얻어진 EPS KS-17과 KS-20의 항산화능력을 시험하기 위하여 차가버섯(Inonotus obliquus)으로부터 추출한 β-glucan과 함께 동일한 농도구배별로 비교 및 분석되었다. 지금까지 차가버섯(자실체)은 항암(Cha JY et al., 2004), 항산화(Cui Y et al., 2005), 항고지혈증 및 혈당조절(Kim MA et al., 2009)등의 효과연구가 국내외에서 이루어지고 있으며, 그 기능성을 이유로 기능성식품 개발을 위한 소재로써 관심을 받고 있는 물질이다.
6-1. DPPH 라디컬 소거능에 따른 전자공여능
DPPH 라디컬 소거 활성 분석은 전자 공여능(electron donating ability, EDA) 측정에 사용되는 DPPH는 비교적 안정한 라디칼을 갖고 있으며, 라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크다면 높은 항산화 활성 및 활성산소를 비롯한 다른 라디칼에 대한 높은 제거 활성을 기대할 수 있기 때문에 특정 물질의 항산화능을 측정하는데 주로 이용되고 있는 방법으로(Lee SL, 2009), 분석은 다음과 같은 조건으로 이루어졌다. 0.4mM DPPH solution 0.4ml와 각 농도구배별로 준비 된 EPS KS-17과 EPS KS-20를 증류수에 녹인 샘플 0.1ml은 잘 교반되어 어두운 상태로 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 517nm의 흡광도에서 측정되었다. 계산식은 전자공여능(%)=[1-(시료흡광도/대조구흡광도)]×100으로 하였다. 이때 ascorbic acid로 실험이 제대로 수행되었는지 여부를 확인한 뒤, 우수한 항산화능을 보유하고 알려진 차가버섯으로부터 추출한 β-glucan을 함께 비교 분석하였다. 분석 결과, 표 6과 도 11에서 보여지는 것과 같이 KS-17과 KS-20 모두 1-20mg/ml의 농도에서 농도 구배가 증가할수록 활성이 증가 되었으며, β-glucan에 비하여 높은 항산화능을 보였다(P<0.01).
EPS KS-17과 KS-20의 전자공여능(%)
(Mean±Stdev)
mg/ml 1 2.5 5 7.5 10 15 20
KS-17 26.8±1.7b 33.5±1.5 33.6±0.8 33.9±1.9a 34.9±0.7 37.8±1.2 38.3±1.1
KS-20 30.0±0.6a 32.7±2.9 33.5±2.6 35.5±0.7a 36.1±0.2 37.7±2.3 38.8±1.4
β-glucan 31.1±1.6a 30.5±2.8 30.9±1.9 31.1±1.2b 33.1±2.1 - -
* ab: Value with different superscrips within the same colume are significantly different by ANOVA with Dancan's multiple range test at p<0.01.
6-2. 수퍼라디칼(superoxide radical) 소거능
수퍼라디칼 소거 활성은 SOD(superoxide dismutase)와 유사한 역할을 하는 저분자 물질로 주로 phytochemicals에 속하며 superoxide의 반응성을 억제하여 산화적 장해를 방어하는 것으로 알려짐(Marklund et al,. 1974)에 따라 높은 SOD 유사활성을 갖는 물질의 이용은 노화억제와 더불어 산화적 장해를 방어할 수 있는 하나의 방법으로 여겨지고 있다. 이 분석은 0-10mg/ml의 농도로 준비된 시료 1ml와 pH 8.2로 조정한 0.5mM tris-HCL 버퍼(50mM tris(hydroxymethyl)amino-methane+10mM EDTA) 3ml를 잘 섞어준 뒤 0.2ml 7.2mM pyrogallol과 25℃에서 10분간 반응 한 뒤 0.5ml의 1N HCl로 반응 정지 시킨 뒤 420nm에서 흡광도로 분석하였다. 계산식은 SOD 유사활성(%)=100-[(시료흡광도/대조구흡광도)×100]으로 하였다. 이때 ascorbic acid로 실험이 제대로 수행되었는지 여부를 확인한 뒤, 우수한 항산화능을 보유하고 알려진 차가버섯으로부터 추출한 β-glucan을 함께 비교하였다. 분석 결과, 표 7과 도 12에서 보여지는 것과 같이 KS-17과 KS-20 모두 1-10mg/ml의 농도에서 농도 구배가 증가할수록 활성이 증가 되었으며, β-glucan에 비하여 KS-20은 상대적으로 저 농도에서 KS-17은 상대적으로 고 농도에서 더 높은 항산화능을 보였다(P<0.001).
EPS KS-17과 KS-20의 SOD 유사활성(%)
(Mean±Stdev)
mg/ml EPS17 EPS20 β-glucan
1 5.66±3.25c 18.52±3.80b 14.65±0.23b
2 8.42±2.21d 21.59±2.04b 16.76±0.30c
3 11.91±1.75d 21.77±0.68b 17.61±0.33c
4 12.51±3.51d 25.93±2.10b 19.12±0.28c
5 15.11±1.84d 25.55±1.21b 18.97±0.34c
6 17.83±0.69d 27.8±1.30b 21.03±0.15c
7 17.68±2.51d 26.70±0.79b 20.39±0.33c
8 22.79±1.91c 26.25±±2.14b 23.16±0.28c
9 23.66±2.29b 25.82±±3.08b 27.38±0.34b
10 29.79±1.59b 25.18±0.77d 27.23±0.34c
*abcd: Value with different superscrips within the same colume are significantly different by ANOVA with Dancan's multiple range test at p<0.001.
6-3. Tyrosinase 저해 활성능
tyrosinase는 흑갈색의 멜라닌 색소 생성에 관여하는 효소로서, 사람에게서 피부의 암갈색 색소물질을 침착시키는 원인이 되기도 하며, 피부 흑화 현상의 원인이 되는 것으로 알려짐에 따라 높은 tyrosinase 억제 활성을 갖는 물질의 이용은 노화억제와 더불어 산화적 장해를 방어할 수 있는 하나의 방법으로 여겨지고 있다. 이 분석은 0-10mg/ml의 농도로 준비된 시료 1ml와 pH 6.8로 조정된 67mM phosphate buffer에 용해시킨 8.3mM L-DOPA 0.12ml과 샘플 0.04ml을 잘 섞어준 뒤 495nm에서 효소 반응 전에 흡광도를 미리 측정하였다. 그런 후, 125U/ml mushroom tyrosinase 0.04ml를 첨가해 37℃에서 20분간 효소반응 시켜주고, 다시 495nm에서 흡광도 측정하여 비교된 계산값을 통해 생성된 DOPA chrome의 양을 계산하여주었다. 계산은 티로시나아제 저해활성(%)=[{(ControlAbs- BlankAbs) - (SampleAbs - BlankAbs)}/(ControlAbs - BlankAbs)]×100으로 하였다. 이때 ascorbic acid로 실험이 제대로 수행되었는지 여부를 확인한 뒤, 우수한 항산화능을 보유하고 있다고 알려진 차가버섯으로부터 추출한 β-glucan을 함께 비교하였다. 분석 결과, 표 8과 도 13에서 보여지는 것과 같이 KS-17과 KS-20 모두 1-10mg/ml의 농도에서 농도 구배가 증가할수록 활성이 증가 되었으며, β-glucan에 비하여 KS-20은 상대적으로 저 농도에서 KS-17은 상대적으로 고 농도에서 더 높은 항산화능을 보였다(P<0.001).
EPS KS-17과 KS-20의 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성(%)
(Mean±Stdev)
mg/ml KS-17 KS-20 β-glucan
1 22.66±2.86a 23.09±0.63a 5.62±2.67b
2 22.41±1.80a 22.23±1.37a 9.30±1.30b
3 22.84±2.65b 28.43±0.80a 9.49±1.49c
4 25.21±3.17a 27.63±1.27a 10.79±1.75b
5 25.10±3.42a 26.75±1.85a 9.95±1.95b
6 24.41±1.91a 26.95±0.98a 11.27±2.10b
7 24.58±3.44b 31.53±0.46a 17.94±2.08c
8 26.96±2.53b 33.42±0.96a 16.53±3.70c
9 30.72±2.20a 33.41±0.98a 16.64±3.58b
10 31.13±3.65b 38.00±2.06a 14.96±1.80c
*abc: Value with different superscrips within the same colume are significantly different by ANOVA with Dancan's multiple range test at p<0.01.
실시예 7 : 통계처리
모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 유의성 검증은 Version 12.0 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) Software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.
농업생명공학연구원 KACC91570 20100714 농업생명공학연구원 KACC91571 20100714

Claims (13)

  1. 김치로부터 분리된, 세포외다당류 생성 능력이 있는 신균주 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KS-17 균주 (수탁번호 KACC91570P).
  2. 김치로부터 분리된, 세포외다당류 생성 능력이 있는 신균주 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KS-20 균주 (수탁번호 KACC91571P).
  3. 제 1항 또는 제 2항의 균주로부터 생산된 세포외다당류.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 제 1항의 균주로부터 생산된 세포외다당류는 글루코스(glucose)로 이루어져 있으며, 평균분자량이 1.40 내지 1.50kDa 인 것을 특징으로 하는 세포외다당류.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 제 2항의 균주로부터 생산된 세포외다당류는 글루코스로 이루어져 있으며, 평균분자량이 1.50 내지 1.60kDa 인 것을 특징으로 하는 세포외다당류.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 세포외다당류는 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유하는 배지에서 균주를 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 세포외다당류.
  7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 세포외다당류를 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항노화 조성물.
  8. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 세포외다당류를 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항노화 식품.
  9. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 세포외다당류를 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항노화 화장료 조성물.
  10. 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유한 배지에 제 1항의 바실러스 리케니포미스 KS-17 균주를 접종한 후, 초기 pH 6.5 내지 7.5에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 조건으로 배양한 배양액으로부터 세포외다당류를 생산 또는 회수하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 자당은 90 내지 110g/L이고, 트립톤은 8 내지 12g/L, 효모 추출물은 4 내지 6g/L, 디포타슘 포스페이트는 4 내지 6g/L, 디암모니움 시트르산은 4 내지 6g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 자당(sucrose), 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 및 디암모니움 시트르산(diammonium citrate)을 함유한 배지에 제 2항의 바실러스 리케니포미스 KS-20 균주를 접종한 후, 초기 pH 5.5 내지 6.5에서 36.5℃ 내지 37.5℃ 조건으로 배양한 배양액으로부터 세포외다당류를 생산 또는 회수하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 자당은 65 내지 85g/L, 트립톤은 8 내지 12g/L, 효모 추출물은 4 내지 6g/L, 디포타슘 포스페이트는 4 내지 6g/L, 디암모니움 시트르산은 4 내지 6g/L인 것을 특징으로 하는 방법.



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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486002A (zh) * 2018-03-14 2018-09-04 广西师范大学 一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用
WO2022171748A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Danstar Ferment Ag Compositions comprising exopolysaccharides and uses thereof
CN116536368A (zh) * 2023-06-26 2023-08-04 广东迪美新材料科技有限公司 一种海洋芽孢杆菌发酵产物、制备方法及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101704922B1 (ko) * 2014-09-19 2017-02-08 이화여자대학교 산학협력단 4-하이드록시사타바신을 포함하는 조성물
KR102044153B1 (ko) * 2018-07-06 2019-11-13 (주)바이오일레븐 신규한 바실러스 리체니포미스 BioE-BL11 균주 및 이을 이용하여 면역활성이 우수한 세포외다당체를 생산하는 방법

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108486002A (zh) * 2018-03-14 2018-09-04 广西师范大学 一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用
CN108486002B (zh) * 2018-03-14 2021-03-23 广西师范大学 一株产胞外多糖的罗汉果内生菌菌株及其生产胞外多糖的方法和胞外多糖的应用
WO2022171748A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Danstar Ferment Ag Compositions comprising exopolysaccharides and uses thereof
CN115209903A (zh) * 2021-02-11 2022-10-18 丹斯塔发酵股份公司 组合物及其用途
CN116536368A (zh) * 2023-06-26 2023-08-04 广东迪美新材料科技有限公司 一种海洋芽孢杆菌发酵产物、制备方法及其应用
CN116536368B (zh) * 2023-06-26 2023-10-13 广东迪美新材料科技有限公司 一种海洋芽孢杆菌发酵产物、制备方法及其应用

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