CN116536368A - 一种海洋芽孢杆菌发酵产物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋芽孢杆菌发酵产物、制备方法及其应用，该方法以海洋芽孢杆菌包括太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM 25873、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluskimchi)DSM23341或伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusiheyensis)THE831中的一种或多种菌作为菌种，在含有麸皮提取液的培养基中进行发酵，将发酵后的菌体与发酵液进行共破碎的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域、海洋天然产物发酵技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌发酵产物以及制备方法，包括以海洋芽孢杆菌在含有麸皮提取液的培养基中进行发酵，将发酵后的菌体与发酵液进行共破碎的步骤。本发明还涉及上述发酵产物在抗衰老化妆品中的应用。
背景技术
海洋杆菌属(Oceanobacillus)，隶属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)。其标准种Oceanobacillus iheyensis于2001年被首次发现。迄今为止，该属包括16个种和亚种以及1个invalidname种，它们分离自不同的环境：O.iheyensis分离自深海沉积物。O.oncorhynchi subsp.Oncorhynchi分离自虹鳟鱼，O.oncorhynchi subsp.Incaldanensis分离自海藻，O.picturae分离自壁画，O.profundus分离自深海沉积物岩心，O.chironomi分离自摇蚊卵块，O.caeni分离自废水处理系统，O.kapiali分离自发酵的虾酱，O.sojae分离自酱油生产设备，O.neutriphilus分离自活性污泥，O.locisalsi分离自盐田，O.manasiensis分离自盐湖，O.kimchi分离自芥菜泡菜，O.indicireducens分离自发酵的靛蓝，O.chungangensis分离自沙丘，O.polygoni分离自发酵液。海洋杆菌属的细菌具有如下特征：革兰氏阳性，具有周生鞭毛，且能够形成椭圆形芽孢；主要脂肪酸组分为anteiso-C15：0；主要呼吸醌为MK7。DNA G+C含量范围在35.8–40.1mol％。本发明所使用的芽孢杆菌分别为太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM 25873、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341、伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831。
根据目前海洋杆菌属(Oceanobacillus)应用的报道，该菌属的应用主要用于淀粉酶，脲酶，脂酶等工业酶制剂的生产，用于处理强碱性的工业废水，将废液转化为单细胞蛋白。同时，还可作为黏度调节剂应用于在纺织领域。日本花王公司曾报道过一株海洋杆菌属(Oceanobacillus)的菌株，在洗涤剂试验中清洁率由对照组的21％提高了一倍至40％，与其它酶如碱性纤维素酶配合使用，效果提高至50％。Meike B,Ole F,WoilgangL.Identification and Characterization of a Novel Intracellular AlkalineAmylase from the Hyperthermophilic Bacterium Thermotoga maritime MSB8[J].ApplEnviron Microbiol,2006,3:2206-2211。青岛海洋大学的张晓华教授团队通过对分离自南太平洋环流区底层沉积物菌株XH204T的一系列表型特征和遗传学特征的鉴定，确定XH204T为海洋杆菌属(Oceanobacillus)的一个新种，命名为太平洋海洋杆菌(Oceanobacilluspacificus sp.nov.)。XH204T是一株嗜碱微生物，其脂肪酸成分中拥有较高含量的anteiso-C15:0，在分离嗜碱胞外酶及发酵制备有特殊活性的脂肪酸上有很大的潜力。因此，在造纸，纺织，印染，洗涤剂合成，废液处理领域嗜碱微生物XH204T具有很高的开发价值。但目前仍未看到将海洋杆菌属(Oceanobacillus)的发酵产物应用于化妆品领域的报道，更未见本发明所述的具体海洋杆菌属(Oceanobacillus)的3种具体菌种的发酵产物应用于化妆品领域的报道。
同时，根据已有报道，其他种属的芽孢杆菌科(Bacillaceae)的发酵产物，应用于化妆品领域，其主要成份为细胞代谢产物、氨基酸、多糖、蛋白质与核酸等，是在化妆品领域使用的一种功效性原料，体外实验证明了其发酵产物具有良好的保湿、修护、延缓衰老等功效。但是，现有化妆品中应用的芽孢杆菌发酵产物，其制备工艺局限于利用芽孢杆菌发酵后离心所得上清液进行制备，其目的在于获得菌体发酵过程中分泌到细胞外的代谢成分，而没有充分利用活性成分含量更为丰富的菌体细胞。功效活性成分如蛋白和核酸含量较少等问题，影响发酵产物的品质。
真表皮连接层DEJ(dermal-epidermaljunction)是真皮层和表皮之间存在的一个明显边界，它是一个致密的胶原蛋白网络，形成了起伏的真皮表皮连接结构，对表皮层和真皮层起到很好的结构支撑作用。DEJ的老化，是皮肤老化的一个重要表现。DEJ的功能在很大程度上依赖于特定结构蛋白的活性，特别是各种胶原蛋白、层粘连蛋白和整合蛋白。大量研究表明，衰老皮肤中各型胶原蛋白、层粘连蛋白的含量都会大幅度减少。
同时，当一个人长期感受到压力、处于负面的精神状态时，脑——皮肤轴便会被激活，通过神经内分泌系统去干扰身体的汗腺分泌、血管舒张和收缩、皮肤屏障功能、皮肤DNA修复和胶原形成等等，导致皮肤疾病、加重皮肤老化。在化妆品领域，一些产品已经开始进入“情感荷尔蒙“领域，通过促进正面积极的荷尔蒙产生，或是减少降低压力荷尔蒙的含量水平，从而提升皮肤状态。情感荷尔蒙包括皮质醇、多巴胺、β-内啡肽、血清素等。其中，皮质醇是一种压力激素，在皮肤细胞表面上就有大量的糖皮质激素受体。当皮肤稳态失衡时，这一激素变得无处不在。而压力导致的皮质醇升高会引起皮肤干燥，经皮水分流失增加；同时，皮肤变薄，弹性减小，更容易出现细纹、皱纹。
发明内容
本发明人经研究发现，采用海洋芽孢杆菌作为菌种，在含有麸皮提取液的培养基中进行发酵，将发酵后的菌体与发酵液进行共破碎，可以得到一种具有改进性能的海洋芽孢杆菌发酵产物，其不仅具有麸皮提取液的活性成份，例如：膳食纤维、多糖、多酚、和蛋白质等，同时还具有发酵工艺产生的活性成分和包容物的活性成分，例如：多糖、氨基酸和核酸，从而具有优异的抗衰老功效，可以作为化妆品的原料。
一方面，本发明涉及一种海洋芽孢杆菌发酵产物的制备方法，包括以海洋芽孢杆菌作为菌种，在含有麸皮提取液的培养基中进行发酵，将发酵后的菌体与发酵液进行共破碎的步骤；
其中，所述海洋芽孢杆菌包括太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus pacificus)DSM 25873、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341或伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)THE 831中的一种或多种。
在一个实施例中，所述制备方法，包括下述步骤：
S1:采用海洋芽孢杆菌作为菌种，进行活化，得种子液；
S2:将S1所述种子液接种在含有麸皮提取液培养基的发酵罐中进行发酵，得到发酵液产物；
S3:过滤S2所述发酵液产物，滤除杂质，得除杂质发酵液；
S4:高压共破碎S3所述除杂质发酵液，得发酵破碎液，离心，得到作为上清液的发酵破碎液；
S5:超滤S4所述发酵破碎液，截留分子量小于100KDa的小分子量可溶发酵液；
S6:向S5所述小分子量可溶发酵液中加入防腐剂，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
本发明所选用的菌种为海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)，隶属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)。其标准种Oceanobacillus iheyensis于2001年被首次发现。迄今为止，该属包括16个种和亚种以及1个invalidname种，它们分离自不同的环境，其种和亚种包括：O.iheyensis，O.oncorhynchisubsp.Oncorhynchi，O.kapialis，O.indicireducens，O.polygoni，O.neutriphilus，O.pacificus，O.oncorhynchisubsp.incaldanensis，O.locisalsi，O.sojae，O.chungangensis，O.picturae，O.manasiensis，O.caeni，O.kimchii，O.chironomi，O.profundus。本发明尝试海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)多种菌种和亚种进行发酵后应用本发明的制备方法制备海洋芽孢杆菌发酵产物，并将其应用于抗衰老化妆品的原料，意外发现，太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)、伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusiheyensis)效果最优，其中，所述太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus pacificus)DSM25873，保藏单位为德国DSM菌种保藏中心，来自于深海沉积物；所述泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341，保藏单位为德国DSM菌种保藏中心，分离自韩国的发酵食品芥末泡菜；所述伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831，保藏单位为日本JCM菌株保藏中心，分离自深海沉积物。上述菌种以冻干粉的形式商购，太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM 25873和泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluskimchi)DSM 23341购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司，伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
本发明采用酶法制备麸皮提取物，具体方法为：取100-200g麸皮与1500-4500g水混合，再添加0.01-0.08g/L中性蛋白酶和0.03-0.06g/Lα-淀粉酶，40-60℃消化2-5小时。麸皮的种类可以来自常见的北美硬红春麦，澳大利亚白麦，中国产春麦和冬麦等。本发明中优选中国产春麦。
用上述的麸皮提取液制备步骤S2中的发酵培养基，其中8-12g/L蛋白胨、5-10g/L酵母提取物、0.8-1.2g/L磷酸氢二钾、0.1-0.3g/L七水硫酸镁，补充20-30g/L氯化钠，并添加200-400g/L麸皮提取液，然后用氯化氢或氢氧化钠水溶液调节pH至6.5-8.5。
上述步骤S2在含有麸皮提取液培养基的发酵罐中进行发酵，得到发酵液产物是本领域中常用的技术，例如：按照约60-80％(v/v)的装液量，将含有麸皮的发酵培养基在约95-140℃的超高温瞬时杀菌约4-30秒后加入约100-20000L已经空消无菌状态的发酵罐中，或将含有麸皮的发酵液培养基加入约100-20000升发酵罐中，并以约95-121℃灭菌约10-30分钟。按发酵罐中培养基体积计将太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus pacificus)DSM25873、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341、伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831中的一种或多种菌种直投式菌剂或上述菌种的种子液在无菌条件下接入发酵罐中，优选采用种子液在无菌条件下接入发酵罐中，接种量为1-10％，发酵条件为：约30-40℃温度和约100-200rpm的转速下进行搅拌，通气量为2-6m3/h，连续发酵约48-72小时，进一步优选，接种量为2-3％，通气量为4-5m3/h，连续发酵约48-60小时，停止发酵，即完成发酵过程，得到发酵液产物。
其中，所述海洋芽孢杆菌以直投式菌剂的形式可直接投入发酵罐中，或者，所述海洋芽孢杆菌种子液是通过培养基进行活化培养得到的。本发明中是将海洋芽孢杆菌接种于ZMA种子液培养基的无菌锥形瓶中，ZMA培养基成分包括5g/L胃蛋白胨、1g/L酵母提取物、0.1g/L柠檬酸铁、19.45g/L氯化钠、8.8g/L氯化镁、3.24g/L硫酸钠、1.8g/L氯化钙、0.55g/L氯化钾、0.16g/L碳酸氢钠、80mg/L溴化钾、34mg/L氯化锶、22mg/L硼酸、4mg/L硅酸钠、1.6mg/L硝酸铵、2.4mg/L氟化钠；称取约0.1-10g/L、优选约0.5-5g/L以ZMA液培养基计的相应质量的海洋芽孢杆菌菌粉将其加入到种子液培养基中，在约30-45℃下培养约4-12小时，即得到所述海洋芽孢杆菌种子液。
进一步的，可将pH调节剂加入到培养基中，以将培养基的pH调节到约6.5-8.5。所述pH调节剂是本领域已知的，例如，包括但不限于氯化氢、氢氧化钠、乳酸、柠檬酸、氨水、乳酸钠、柠檬酸钠和氢氧化钠，优选氯化氢和氢氧化钠。
上述步骤S3中过滤所述发酵液产物是本领域已知技术，例如，采用碟式离心机或管式离心机，在约8000-10000rpm下进行约1-10分钟。或者，可通过陶瓷膜或有机膜等进行膜分离过滤。还可以通过滤网进行过滤，所述滤网孔径在100-500目。本发明中优选采用滤网过滤，滤除杂质，得除杂质发酵液。
上述步骤S4中高压共破碎所述除杂质发酵液，也就是将发酵后的菌体和发酵液共同进行破碎，得发酵破碎液，可采用的方式包括且不限于高压破碎法、超声破碎、反复冻融法、酶解法等。例如，在破碎阀门循环冷却情况下，将发酵后的菌体和发酵液共同进行破碎，破碎仪器采用高压破碎仪，工作压力为800-1500bar、破碎2-3次和破碎温度2-10℃；或超声破碎仪，工作功率2000-2400W、每10L样品的破碎时长120分钟和破碎温度2-10℃。然后，将经破碎的发酵液进行过滤，通常使用的离心机为碟式离心机或管式离心机，在约分离因素8000-13000G下进行10-15分钟，在OD600nm下测定离心后的吸光度，取吸光度值小于等于0.3作为上清液的发酵破碎液。或者，通过有机膜或陶瓷膜进行分离，分离出在OD600nm下测定离心后的吸光度，取吸光度值小于等于0.3作为上清液的发酵破碎液。
上述S5步骤中，可溶性菌体溶胞物进行超滤，是本领域已知的技术。可采用膜材质有陶瓷膜、醋酸纤维素膜、空纤维聚砜膜、聚醚砜膜等，例如，采用聚醚砜膜，在过膜温度20-25℃，过膜压力0.1-0.4MPa的条件下用100KDa的超滤膜将样液浓缩，收集分子量小于100KDa的小分子量可溶发酵液。
所述方法还可进一步包括在所得产物中加入防腐剂，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。然后，将加入防腐剂的产物转至存储罐存储，并分装。所述防腐剂为化妆品常用防腐剂，例如，包括但不限于苯氧乙醇、苯甲酸钠、辛酰羟戊酸、1，2-己二醇等。所述防腐剂的配方在该领域是已知的，例如1％苯氧乙醇和0.25％苯甲酸钠组合或者2％的1，2-己二醇。
通过上述方法制得的海洋芽孢杆菌发酵产物，透明，含有麸皮自身的营养成分，其中包括8种人体必需的氨基酸、维生素、矿物质、酚类和多糖等，和发酵新生成的功效成分，其中包括胞外多糖、核酸、有机酸和氨基酸等。通常，经本方法所得海洋芽孢杆菌发酵产物，包括总多糖0.71-0.87mg/mL和总核酸283.3-327.68μg/mL。因此，所得的海洋芽孢杆菌发酵产物含有丰富的活性营养物质，可以作为原料营养物用于抗衰老化妆品中，显示了其优异的抗衰老效果。
另一方面，本发明涉及一种海洋芽孢杆菌发酵产物，其是通过采用海洋芽孢杆菌中的太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM 25873、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341或伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusiheyensis)THE 831中的一种或多种菌作为菌种、以麸皮提取物作为培养基进行发酵而获得的。
通常，经本方法所得海洋芽孢杆菌发酵产物，包括总多糖0.71-0.87mg/mL和总核酸283.3-327.68μg/mL。
再一方面，本发明所涉及所述的海洋芽孢杆菌发酵产物在制备抗衰老化妆品中的用途。
又一方面，本发明涉及一种抗衰老化妆品，所述抗衰老化妆品包含(A)：上述海洋芽孢杆菌发酵产物。
所述海洋芽孢杆菌发酵产物(A)在所述抗衰老化妆品中的含量可以在较宽的范围内变化，例如：0.1％-100％，优选为0.5％-20％。
除了上述海洋芽孢杆菌发酵产物外，所述的抗衰老化妆品还可以任选包含(B)：化妆品组合物中的常用成分，其包括但不限于基本成分、活性成分和辅料等。组分(B)是本领域已知的，本领域技术人员可以根据需要选择类型和用量，例如基于抗衰老化妆品组合物总重量的0-99％。
所述基本成分包括例如稀释剂和载体等，包括但不限于：去离子水、乙二醇，这些基本成分在化妆品的配方中是已知的，并且这些基本成分通常占化妆品(B)成分的5％-95％。
所述活性成分包括保湿剂等物质。
所述保湿剂包括但不限于常用的小分子保湿剂有：甘油(分子量Mw：92)、丙二醇(Mw：76)、丁二醇(Mw：90)、甲基丙二醇、皮肤天然保湿因子(平均Mw：128)：乳酸、乳酸钠、吡咯烷酮羧酸钠(PCA-Na)、尿素、赤藓糖醇(Mw：120)、木糖醇(Mw：152)、鼠李糖(Mw：164)、甘露糖(Mw：180)、山梨醇(Mw：182)、海藻糖(Mw：342)、棉籽糖(Mw：504)、麦芽四糖(Mw：666)、菊粉、艾素糖、酵母提取物(蕴含较全面的多糖、核酸、小分子肽、甘油葡糖苷等成分)等。常用的高分子成膜保湿剂有：透明质酸、普鲁兰多糖、银耳多糖、β-葡聚糖、γ-聚谷氨酸钠、酸豆籽多糖、小核菌胶和神经酰胺等。常用的封闭性油脂主要分为：矿物油脂(凡士林、白矿油等)，合成油脂(烷烃类等)和植物油脂(橄榄油、霍霍巴油、乳木果油、澳洲坚果油等)，所述保湿剂占化妆品(B)成分的5％-10％。
所述辅料包括例如螯合剂、防腐剂等。
所述螯合剂包括但不限于：EDTA-2Na，EDTA-3Na，EDTA-4Na，乙二胺四乙酸，乙二胺二琥珀酸三钠等。所述螯合剂为本领域已知的，所述螯合剂占化妆品(B)成分的0.05％-2％。
所述防腐剂包括但不限于：羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、双(羟甲基)咪唑烷基脲、山梨酸钾、苯甲酸钠、氯苯甘醚、脱氢乙酸钠、辛酰羟肟酸、1,2-己二醇、1,2-戊二醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇、甘油辛酸酯、十一碳烯酸甘油酯、山梨坦辛酸酯、乙基己基甘油、牡丹根提取物等中的一种或多种。所述防腐剂在所述抗衰老化妆品中含量是本领域已知的，所述防腐剂占化妆品(B)成分的0.5％-1％。
所述抗衰老化妆品的制备方法为本领域常用的方法，例如：将去离子水加入水相锅中，搅拌下加入丁二醇、EDTA二钠、黄胶原和玻尿酸，加热至85℃溶解待用。在油相水浴锅内加入甘油、1，2己二醇、对羟基苯乙酮搅拌均匀，加热至80℃溶解待用。乳化锅预热至85℃，先加入水相相，再加入油项相，均质乳化(3200R/min)5min后搅拌(25R/min)，抽真空至0.4个大气压，冷却水慢慢放冷却至45℃待用。再加入海洋芽孢杆菌发酵产物，搅拌(15R/min)15分钟均匀，38度出料，存放静置间。
所述抗衰老化妆品可根据需要制成各种剂型，例如溶液、悬浮液、膏、霜、乳液、凝胶、粉末、精华、喷剂等。
有益效果：
(1)本发明提供了海洋芽孢杆菌菌种包括太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM 25873、泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM23341、伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831中的一种或多种作为发酵菌种，在含有麸皮提取液的培养基中进行发酵，将发酵后的菌体与发酵液进行共破碎，可以得到一种具有改进性能的海洋芽孢杆菌发酵产物，其不仅具有麸皮提取液的活性成份，例如：膳食纤维、多糖、多酚、和蛋白质等，同时还具有发酵工艺产生的活性成分和包容物的活性成分，例如：胞外多糖、氨基酸和核酸，从而具有优异的抗衰老功效，可以作为化妆品的原料。所得产物富含活性成分多糖等，功效数据显示其可以增加表皮和真皮部连接蛋白数量、降低被称为压力荷尔蒙的皮质醇含量，具有较好的抗老化和舒缓压力的功效。
(2)本发明所用海洋芽孢杆菌发酵生产的培养基，增加了麸皮提取液成分。麸皮是作为面粉加工的主要副产物之一，富含膳食纤维、多糖、多酚、蛋白质等成分，每年全世界90％以上的麸皮都是用作饲料。将麸皮制备成提取液，应用于海洋芽孢杆菌的发酵生产，有益于促进低碳经济的发展，在产品方面能极大地提升发酵水平和发酵产物中多糖和核酸等活性成分的含量，同时改善了产品的颜色和气味。
(3)与现有收集芽孢杆菌发酵上清液制备发酵产物的技术相比，本发明使用能耐高盐的海洋芽孢杆菌作为发酵菌种，并进一步地将发酵后的菌体与发酵液共同进行细胞破碎，再经离心和超滤，该流程工艺能有效释放菌体内的活性物质，使得多糖、核酸等活性成分能更顺利地溶出。
(4)破碎后再使用超滤的处理工艺，去除了不溶性并且难以透皮吸收的大分子物质，解决了现有工艺制备的产品中存在一些大分子蛋白等成分不易吸收的问题，改善了产品的澄清度，提高了产品的品质。
(5)与现有收集芽孢杆菌发酵上清液制备发酵产物的技术相比，使用本发明提供的工艺获得的芽孢杆菌发酵产物，由于活性成分含量的增加，功效上也得到了提升。功效具体表现在能通过增加表皮真皮连接相关蛋白基因表达，降低被称为压力荷尔蒙的皮质醇含量，从而具有抗老化、舒缓压力的双重功效。
附图说明
图1显示了层粘连蛋白332和胶原蛋白IV型基因表达结果。
图2显示了压力荷尔蒙——皮质醇含量检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。但是，应当理解为，这些实施例、对比例仅仅是用于更详细地说明本发明，而不应理解为用于以任何形式限制本发明所附权利要求书的范围。
实施例1-5所使用的太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM25873，保藏单位为德国DSM菌种保藏中心，来自于深海沉积物；所述泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341，保藏单位为德国DSM菌种保藏中心，分离自韩国的发酵食品芥末泡菜；所述伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831，保藏单位为日本JCM菌株保藏中心，分离自深海沉积物。上述菌种以冻干粉的形式商购，太平洋海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluspacificus)DSM 25873和泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacilluskimchi)DSM 23341购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司，伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例1：
(1)制备种子液：将太平洋海洋芽孢杆菌DSM 25873接种于含ZMA液体培养基的无菌锥形瓶中，在30℃、200rpm条件下振荡培养活化，制备成种子液。
(2)发酵：发酵培养基配方为300g/L麸皮提取液，10g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、0.8g/L磷酸氢二钾、0.2g/L七水硫酸镁，补充30g/L氯化钠，调节pH至7.4。将种子液转接至发酵罐里，接种量为3％，通气量为5m3/h，调节温度为30℃，48小时后停止发酵。
(3)发酵液破碎：将包含菌体的发酵液先过300目的滤网，滤除大颗粒杂质，然后使用高压细胞破碎仪破碎，破碎仪工作压力为1400bar，反复破碎三次，破碎时保持用循环冷却水保持破碎阀门温度低于10℃。
(4)破碎液分离：使用碟式离心机将破碎液进行分离，调节分离因素为13000G，离心至OD600nm值小于0.3即可，然后收集离心上清液。
(5)离心上清液进一步超滤分离：离心上清液过100KDa超滤膜，去除分子量大于100KDa的物质。制备终产品：向已过100KDa超滤膜的发酵产物加入2％己二醇作为防腐剂，充分混匀，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
取海洋芽孢杆菌DSM 25873发酵产物测试其总多糖和总核酸，结果如表1所示。同时测试，层粘连蛋白332的相关基因LAMA3和胶原蛋白Ⅳ型的相关基因COL4A1的表达情况的影响，结果见图1。还测试了对皮质醇释放的影响，结果见图2。
实施例2：
(1)制备种子液：将泡菜海洋芽孢杆菌DSM 23341接种于含ZMA液体培养基的无菌锥形瓶中，在30℃、200rpm条件下振荡培养活化，制备成种子液。
(2)发酵：发酵培养基配方为200g/L麸皮提取液，10g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、0.8g/L磷酸氢二钾、0.2g/L七水硫酸镁，补充30g/L氯化钠，调节pH至7.4。将种子液转接至发酵罐里，接种量为2％，通气量为5m3/h，调节温度为30℃，60小时后停止发酵。
(3)发酵液破碎：将包含菌体的发酵液先过300目的滤网，滤除大颗粒杂质，然后使用超声破碎仪破碎，其工作功率2400W，10L样品的破碎时长120分钟，破碎温度保持在4℃。
(4)破碎液分离：使用碟式离心机将破碎液进行分离，调节分离因素为13000G，离心至OD600nm值小于0.3即可，然后收集离心上清液。
(5)离心上清液进一步超滤分离：离心上清液过100KDa超滤膜，去除分子量大于100KDa的物质。
(6)制备终产品：向已过超滤膜的发酵产物中加入2％己二醇作为防腐剂，充分混匀，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
取泡菜海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus kimchi)DSM 23341发酵产物测试其总多糖和总核酸，结果如表1所示。同时测试，层粘连蛋白332的相关基因LAMA3和胶原蛋白Ⅳ型的相关基因COL4A1的表达情况的影响，结果见图1。还测试了对皮质醇释放的影响，结果见图2。
实施例3：
(1)制备种子液：将伊赫氏海洋芽孢杆菌HTE831接种于含ZMA液体培养基的无菌锥形瓶中，在30℃、200rpm条件下振荡培养活化，制备成种子液。
(2)发酵：发酵培养基配方为200g/L麸皮提取液，10g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、0.8g/L磷酸氢二钾、0.2g/L七水硫酸镁，补充30g/L氯化钠，调节pH至7.4。将种子液转接至发酵罐里，接种量为2％，通气量为5m3/h，调节温度为30℃，60小时后停止发酵。
(3)发酵液破碎：将包含菌体的发酵液先过300目的滤网，滤除大颗粒杂质，然后使用高压细胞破碎仪破碎，破碎仪工作压力为1400bar，反复破碎三次，破碎时保持用循环冷却水保持破碎阀门低于10℃。
(4)破碎液分离：使用管式离心机将破碎液进行分离，调节分离因素为13000g，离心至OD600nm值小于0.3即可，然后收集离心上清液。
(5)离心上清液进一步超滤分离：离心上清液过100KDa超滤膜，去除分子量大于100KDa的物质。
(6)制备终产品：向已过超滤膜的发酵产物加入1％苯氧乙醇和0.25％苯甲酸钠作为防腐剂，充分混匀，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
取伊赫氏海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)THE 831发酵产物测试其总多糖和总核酸，结果如表1所示。同时测试，层粘连蛋白332的相关基因LAMA3和胶原蛋白Ⅳ型的相关基因COL4A1的表达情况的影响，结果见图1。还测试了对皮质醇释放的影响，结果见图2。
实施例4
(1)制备种子液：将伊赫氏海洋芽孢杆菌HTE831接种于含ZMA液体培养基的无菌锥形瓶中，在30℃、200rpm条件下振荡培养活化，制备成种子液。
(2)发酵：发酵培养基配方为400g/L麸皮提取液，12g/L蛋白胨、8g/L酵母提取物、1.2g/L磷酸氢二钾、0.3g/L七水硫酸镁，补充20g/L氯化钠，调节pH至8.5。将种子液转接至发酵罐里，接种量为2％，通气量为5m3/h，调节温度为30℃，60小时后停止发酵。
(3)发酵液破碎：将包含菌体的发酵液先过300目的滤网，滤除大颗粒杂质，然后使用高压细胞破碎仪破碎，破碎仪工作压力为1500bar，反复破碎三次，破碎时保持用循环冷却水保持破碎阀门低于10℃。
(4)破碎液分离：使用管式离心机将破碎液进行分离，调节分离因素为10000g，离心至OD600nm值小于0.3即可，然后收集离心上清液。
(5)离心上清液进一步超滤分离：离心上清液过100KDa超滤膜，去除分子量大于100KDa的物质。
(6)制备终产品：向已过超滤膜的发酵产物加入1％苯氧乙醇和0.25％苯甲酸钠作为防腐剂，充分混匀，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
实施例5
(1)制备种子液：将泡菜海洋芽孢杆菌DSM 23341接种于含ZMA液体培养基的无菌锥形瓶中，在30℃、200rpm条件下振荡培养活化，制备成种子液。
(2)发酵：发酵培养基配方为300g/L麸皮提取液，8g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、1.0g/L磷酸氢二钾、0.1g/L七水硫酸镁，补充25g/L氯化钠，调节pH至6.5。将种子液转接至发酵罐里，接种量为2％，通气量为5m3/h，调节温度为30℃，60小时后停止发酵。
(3)发酵液破碎：将包含菌体的发酵液先过300目的滤网，滤除大颗粒杂质，然后使用高压细胞破碎仪破碎，破碎仪工作压力为800bar，反复破碎三次，破碎时保持用循环冷却水保持破碎阀门低于10℃。
(4)破碎液分离：使用管式离心机将破碎液进行分离，调节分离因素为8000g，离心至OD600nm值小于0.3即可，然后收集离心上清液。
(5)离心上清液进一步超滤分离：离心上清液过100KDa超滤膜，去除分子量大于100KDa的物质。
(6)制备终产品：向已过超滤膜的发酵产物加入1％苯氧乙醇和0.25％苯甲酸钠作为防腐剂，充分混匀，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
对照例1
与实施例1不同的是，发酵生产所用培养基为ZMA液体培养基，而不是含麸皮提取液的高盐培养基。
对照例2
与实施例1不同的是，发酵结束后，不进行破碎，直接使用碟式离心机分离菌体和发酵液，分离因素14000G，离心至OD600nm值小于0.3即可，然后收集离心后的发酵上清液，再使用100KDa超滤膜过滤，并添加1％苯氧乙醇和0.25％苯甲酸钠作为防腐剂。
效果实施例
成分检测分析
多糖含量测定参照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》中的苯酚硫酸法。核酸含量按GB/T 34796-2017《水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法》测定，平均消光系数取值为45。
表1成分检测结果
| 总多糖(mg/ml) | 总核酸(μg/ml) | |
| 实施例1 | 0.87 | 327.68 |
| 实施例2 | 0.74 | 283.30 |
| 实施例3 | 0.71 | 299.71 |
| 对照例1 | 0.42 | 238.43 |
| 对照例2 | 0.68 | 10.19 |
对照1和2的各项成分含量均低于实施例，而两者与实施例存在的主要区别在于，对照例1所用发酵培养基为ZMA培养基，不包含麸皮提取液，对照例2未对发酵后包含菌体的发酵液进行破碎。一方面表明海洋芽孢杆菌发酵麸皮提取液后，能产生更多的多糖，同时核酸含量的的增多也意味着菌体发酵水平也获得了提升(核酸主要存在于菌体细胞内)；另一方面，将发酵后包含菌体的发酵液进行破碎的方式极大地增加活性成分核酸的溶出。意味着菌体破碎这一工艺可以显著提升产物中的核酸含量。
功效评价
层粘连蛋白332的相关基因LAMA3和胶原蛋白Ⅳ型的相关基因COL4A1的表达情况：
将人角质形成细胞(表达层粘连蛋白332的基因LAMA3)以4×105个/孔接种于6孔细胞培养板上，在37℃的CO2培养基箱中培养24小时。将人成纤维细胞(表达胶原蛋白Ⅳ型的相关基因COL4A1)以4×105接种于6孔细胞培养板上，在37℃的CO2培养基箱中培养24小时，然后分别往实施例和对照例中添加2％的芽孢杆菌发酵产物，继续孵育24小时。根据RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取并检测其纯度和浓度，以RNA为模板反转录成cDNA。随后采用RT-PCR法检测目的基因表达情况，以GAPDH作为管家基因。结果见图1。
结果表明，实施例1-3都具有优异的功效，可较大程度地促进层粘连蛋白332和胶原蛋白Ⅳ型相关基因表达，而对照例1和对照例2中的两种相关基因表达量都明显低于其它加样组，意味着用海洋芽孢杆菌发酵麸皮提取液及破碎包含菌体的发酵液的方法，能显著增强产品的增加表皮真皮连接部相关蛋白表达(层粘连蛋白332和胶原蛋白Ⅳ型)的功效。
皮质醇释放研究
将人角质形成细胞接种在12孔细胞培养板上，在37℃的CO2培养基箱中培养24小时。实施例和对照例分别加入2％对应的芽孢杆菌发酵产物，37℃孵育2小时。接下来所有培养孔内都加入1μmol/L可的松，继续孵育24小时。在1000×g和4℃条件下离心20分钟收集上清液。然后用人皮质醇(Cortisol)ELISA试剂盒测定上清液中的皮质醇含量。结果见图2。
结果表明，实施例1-3所得产物均具有较好地抑制压力荷尔蒙——皮质醇分泌的功效，皮质醇含量的降低，可以有效地缓解皮肤压力。而对照例1和对照例2，相比于其它样品处理组，皮质醇分泌量较高，意味着用海洋芽孢杆菌发酵麸皮提取液及破碎包含菌体的发酵液的方法，能显著增强产品抑制皮质醇分泌的功效。
祛除鱼尾纹和眼下方细纹测试(志愿者)
本次测试共招募20名志愿者，通过连续8周的人体试用，测试使用含2％芽孢杆菌发酵产物的精华液使用前和连续使用4周、8周后，根据志愿者面部的鱼尾纹数量、面积和眼下方细纹数量、平均深度，评价样品的抗老化功效。
具体为每位志愿者半脸使用测试产品，测试样品左右半脸随机分配，每日早晚各使用一次，连续使用8周。在使用前、使用4周、8周后，对面部进行VISIA面部成像测试、皮肤表面形态分析。
采用实施例1和对照例2中制备的海洋芽孢杆菌发酵产物来制备抗衰老精华液，其配方如下：
表2测试用精华液配方
表3鱼尾纹和眼下纹测试结果
结果显示，与使用前相比，使用4周、8周后，受试者的平均鱼尾纹和眼下纹数量具有下降；使用实施例与对照例相比，实施例1减少受试者鱼尾纹和眼下纹数量的效果明显高于对照例2。
上述为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述内容的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种海洋芽孢杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于：以海洋芽孢杆菌作为菌种，在含有麸皮提取液的培养基中进行发酵，将发酵后的菌体与发酵液进行共破碎的步骤；
其中，所述海洋芽孢杆菌包括太平洋海洋芽孢杆菌DSM25873、泡菜海洋芽孢杆菌DSM23341或伊赫氏海洋芽孢杆菌THE831中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种海洋芽孢杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
S1:采用海洋芽孢杆菌作为菌种，进行活化，得种子液；
S2:将S1所述种子液接种在含有麸皮提取液培养基的发酵罐中进行发酵，得到发酵液产物；
S3:过滤S2所述发酵液产物，滤除杂质，得除杂质发酵液；
S4:高压共破碎S3所述除杂质发酵液，得发酵破碎液，离心，得到作为上清液的发酵破碎液；
S5:超滤S4所述发酵破碎液，截留分子量小于100KDa的小分子量可溶发酵液；
S6:向S5所述小分子量可溶发酵液中加入防腐剂，即得海洋芽孢杆菌发酵产物。
3.根据权利要求2所述的一种海洋芽孢杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于：所述含有麸皮提取液的培养基为：8-12g/L蛋白胨、5-10g/L酵母提取物、0.8-1.2g/L磷酸氢二钾、0.1-0.3g/L七水硫酸镁，20-30g/L氯化钠和200-400g/L麸皮提取液，pH为6.5-8.5；
所述麸皮提取液制备方法：取100-200g麸皮与1500-4500g水混合，再添加0.01-0.08g/L中性蛋白酶和0.03-0.06g/Lα-淀粉酶，40-60℃消化2-5小时。
4.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于：所述S1步骤中活化，得种子液，其活化培养基为ZMA培养基，成分包括：5g/L胃蛋白胨、1g/L酵母提取物、0.1g/L柠檬酸铁、19.45g/L氯化钠、8.8g/L氯化镁、3.24g/L硫酸钠、1.8g/L氯化钙、0.55g/L氯化钾、0.16g/L碳酸氢钠、80mg/L溴化钾、34mg/L氯化锶、22mg/L硼酸、4mg/L硅酸钠、1.6mg/L硝酸铵和2.4mg/L氟化钠，pH为7.6。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的一种海洋芽孢杆菌发酵产物的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中高压共破碎包括：在工作压力800-1500bar和破碎温度2-10℃的条件下使用高压破碎仪破碎2-3次和/或在工作功率2000-2400W和破碎温度2-10℃的条件下使用超声破碎仪对每10L样品的破碎时长120分钟；
所述步骤S4中离心包括使用碟式离心机或管式离心机进行离心，分离因素8000-13000G，在OD600nm下测定离心后的吸光度，取吸光度值小于或等于0.3作为上清液的可溶发酵破碎液。
6.一种可通过权利要求1-5任意一项制备方法所获得的海洋芽孢杆菌发酵产物。
7.根据权利要求6所述的海洋芽孢杆菌发酵产物，其特征在于：所述海洋芽孢杆菌发酵产物包括总多糖0.71-0.87mg/mL和总核酸283.3-327.68μg/mL。
8.一种权利要求6或7所述的海洋芽孢杆菌发酵产物在制备抗衰老化妆品中的应用。
9.一种抗衰老化妆品，其特征在于：所述抗衰老化妆品包含权利要求6或7所述的海洋芽孢杆菌发酵产物。
10.根据权利要求9所述的抗衰老化妆品，其特征在于：海洋芽孢杆菌发酵产物添加量为0.5％-20％。
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