CN103740685B - 利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，包括以下步骤：步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；步骤B、配制发酵营养基、灭菌，接入步骤A中的菌悬液，并在38~42℃下培养；步骤C、从培养72h起、流加可溶性硫酸盐和还原糖的混合液，再继续发酵培养24h，发酵过程中100mL培养基含有2g还原糖，发酵得含有凝乳酶的粗样品。本发明降低了微生物发酵生产过程中染菌的几率，减少了因种子培养基灭菌造成的能源消耗，而且发酵的时间缩短，提高了发酵的效率；且发酵液凝乳酶活力由原有工艺的210IMCU/mL可提高到410IMCU/mL，提高了将近95%。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法。
背景技术
凝乳酶属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，是生产奶酪不可缺少的制剂，其产值占整个酶制剂总产值的15.5%。目前该酶主要有三种来源，分别为动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。
动物凝乳酶以其凝乳活力与蛋白水解能力的高比值而成为制作奶酪的首选酶，其传统来源是哺乳期小牛的皱胃；但是动物生长缓慢且价格昂贵，容易增加企业生产成本，并且从动物中提取酶液的程序和工艺较复杂。木瓜、无花果、菠萝、南瓜、合欢树、银杏树等植物都含有能使牛奶凝固的蛋白酶。植物来源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物性凝乳酶没有得到大规模商业化应用。微生物凝乳酶来源广泛，目前发现有40余种微生物可生产一定量的凝乳酶。例如，米黑毛霉（Mucor miehei）、总状毛霉（Muco racelnosus）、乳白耙霉（Irpex lacteus）、易脆毛霉（Mucor fragilis）芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、寄生内座壳菌（Endothia parasitisa）等。由于微生物生长快，繁殖周期短，生长和产酶过程容易控制，且微生物所产的凝乳酶是一种包外酶，提取方便，成本低，且安全无毒，而被广泛使用。
传统的利用微生物发酵的模式为：种子扩大培养→发酵培养。该模式的发酵中，需要在种子罐中将菌种逐级扩大培养，其中，种子培养基灭菌、培养以及转种过程中会增加染菌几率以及菌种变异、退化的几率，从而降低了凝乳酶的产量和活力，且因种子培养基灭菌造成了大量的能源消耗。
基于世界市场对于凝乳酶的需求量很大，进一步开展发酵法生产凝乳酶的研究，提高凝乳酶的发酵水平仍有很高的经济价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，该方法将种子扩大培养→发酵培养的传统发酵模式改为菌种活化后直接发酵培养，减少了种子逐级扩大培养的过程，从而降低了培养基灭菌、培养及转种过程中菌种染杂菌、变异和退化的可能性，也降低了整个发酵过程中的染菌几率，且所得的发酵液凝乳酶活力较高；该生产工艺简单、适于大规模的工业化生产。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，包括以下步骤：
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、配制发酵营养基、灭菌，接入步骤A中的菌悬液，并在38~42℃下培养；
步骤C、从培养72h起、流加可溶性硫酸盐和还原糖的混合液，再继续发酵培养24h，发酵过程中100mL培养基含有2g还原糖，发酵得含有凝乳酶的粗样品。
优选的，所述菌悬液的接种量为发酵营养基体积的万分之一。
步骤B中所述发酵营养基的配制方法为：称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。
步骤C中100mL混合液溶有可溶性硫酸盐与还原糖60g，其中可溶性硫酸盐与还原糖的重量份数比为：20-200：1200。
所述可溶性硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵，还原糖为葡萄糖。硫酸铵和葡萄糖参与了凝乳酶的代谢过程，从而提高了凝乳酶的活力。
上述技术方案中，采用编号为ATCC No.16457的米黑毛霉菌株经活化后直接用于发酵培养、生成凝乳酶粗品。该过程省略了种子罐的逐级扩大培养，降低了杂菌污染的几率和菌种变异、退化的几率。而且在发酵过程中流加的硫酸盐和还原糖参与了凝乳酶的代谢过程，提高了凝乳酶的活力。
采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明以活化后的菌种直接用于发酵培养，省去种子的逐级扩大培养，降低了微生物发酵生产过程中染菌的几率，减少了因种子培养基灭菌造成的能源消耗，而且发酵的时间缩短，提高了发酵的效率；（2）发酵液凝乳酶活力由原有工艺的210IMCU/mL可提高到410IMCU/mL，提高了将近95%，在后提取过程收率和原有工艺一致的情况下，最终产品的产量得到大幅度提高，经济效益明显。
具体实施方式
实施例1
本发明凝乳酶的发酵过程为：
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；本发明中菌种活化采用常规的方法和试剂；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。将发酵营养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养；
步骤C、从培养72h起、流加硫酸钠和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（即100mL发酵营养基中含有2g作为还原糖的葡萄糖），发酵结束后得凝乳酶的粗样品，测试该发酵液中凝乳酶的活力。
其中，硫酸钠与葡萄糖的比例为20g:1200g，混合液的总浓度为60%（100mL混合液中含有硫酸钠和葡萄糖共60g）。
凝乳酶活力的测试方法为：
一、试剂准备
1、 1mol/L醋酸溶液：吸取5.9mL的醋酸于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
2、pH5.5缓冲溶液：量取10mL 1mol/L的醋酸溶液，称取10g三水合乙酸钠，将两者放入一烧杯中，溶解后转入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。若其pH在5.5，不用调节。
3、50g/L氯化钙溶液：称取5g氯化钙于烧杯中，用适量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
4、0.5g/L氯化钙溶液：吸取50g/L的氯化钙溶液5mL于500mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
5、底物溶液：称取22±0.1g的脱脂奶粉，量取200mL 0.5g/L氯化钙溶液，将两者放入一烧杯中，缓慢搅拌均匀，用磁力搅拌器搅拌30分钟，搅拌过程中避免产生泡沫。将该底物溶液在黑暗处室温放置30分钟，若其pH在6.5左右，不用调节。（该制备好的底物溶液在黑暗处室温放置不要超过4小时）。
6、凝乳酶标准品溶液制备：称取凝乳酶标准品2500±1mg于烧杯中，用适量pH5.5缓冲溶液溶解后转入50mL容量瓶中，用该缓冲溶液定容至刻度（第一次稀释），摇匀。将该凝乳酶标准品溶液做适当稀释（第二次稀释），使其凝结时间控制在350-550s范围。
二、测试步骤
1、样品处理：称取步骤C中一定量凝乳酶的粗样品，用缓冲溶液稀释成一定浓度，使其凝结时间控制在标准品溶液的凝结时间±40s的范围内，记录凝乳酶粗样品的稀释倍数（D）。
2、 量取25±0.1mL的所述底物溶液放入干燥的100mL三角瓶中，将三角瓶置于32±0.2℃的水浴槽中水浴至少12分钟（不要超过20分钟），吸取0.5mL的凝乳酶标准品溶液加入上述三角瓶中，并开始计时。边振荡边观察凝结情况（动作要轻，避免泡沫产生），记录瓶壁开始出现凝结物的时间，即凝乳酶标准品溶液所用的凝结时间tref，单位s。
样品（凝乳酶的粗样品）经步骤1处理后，进行上述相同的操作，记录凝乳酶的粗样品所用的凝结时间。
凝乳酶标准品溶液和凝乳酶的粗样品要使用同一批次底物溶液。凝乳酶标准品溶液和样品溶液各做2个平行，凝结时间取各自平行的平均值。
3. 计算
International Milk-clotting Units/mL=（tref×mref×V1×D×S）/（t×Vd1×Vd2）
式中 tref ----凝乳酶标准品溶液所用的凝结时间，s
mref ----称取的凝乳酶标准品的质量，g
V1----制备凝乳酶标准品溶液时，从第一次稀释液中所取的体积，mL
D----样品的稀释倍数
t----凝乳酶的粗样品所用的凝结时间，s
Vd1----制备凝乳酶标准品溶液时，第一次稀释所定容的体积，mL
Vd2----制备凝乳酶标准品溶液时，第二次稀释所定容的体积，mL
S----凝乳酶标准品的凝乳活力，IMCU/mL
按照上述公式计算发酵液样品的活力为298IMCU/mL。
实施例2
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。将发酵培养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养；
步骤C、从培养72h起、流加硫酸钾和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为302IMCU/mL。其中，硫酸钾和葡萄糖的比例为20g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
实施例3
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵培养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养72h；
步骤C、培养72h起流加硫酸铵和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为286IMCU/mL。其中硫酸铵与葡萄糖的比例为20g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
实施例4
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵培养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在42℃下培养72h；
步骤C、培养72h后起流加硫酸钠和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%，发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为286IMCU/mL。其中硫酸钠与葡萄糖的比例为150g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
实施例5
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵培养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养72h；
步骤C、培养72h起流加硫酸钾和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为295IMCU/mL。其中，硫酸钾和葡萄糖的比例为150g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
实施例6
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵营养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养72h；
步骤C、培养72h后起流加硫酸铵和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为410IMCU/mL。其中硫酸铵与葡萄糖的比例为150g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
若采用Arima 方法测定发酵液样品中凝乳酶的活力，具体方法如下：用0.01mol/L CaCl2 溶液配制10% 的脱脂奶粉溶液，取5mL 10% 的脱脂奶粉液于35℃保温10 分钟，加入0.5mL 适当稀释的酶液，立即摇匀，开始计时，并把试管倾斜45 度以上，沿试管轴方向旋转，观察试管壁上开始出现凝结小颗粒为终点，记录凝乳时间。在上述条件下，40min 凝乳1mL 10% 脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位（SU）
酶活力（SU）=( 供试乳体积/ 凝乳酶体积)×D×2400/t
式中， D 为酶液稀释倍数；t 为反应时间。
按照上述方法测得的凝乳酶活力为：82000U/mL。
实施例7
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵营养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在42℃下培养72h；
步骤C、培养72h后起流加硫酸钠和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为286IMCU/mL。其中硫酸钠与葡萄糖的比例为200g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
实施例8
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵营养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养72h；
步骤C、培养72h后起流加硫酸钾和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为289IMCU/mL。其中，硫酸钾和葡萄糖的比例为200g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
实施例9
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、按照下述配方配制发酵营养基：
称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；将发酵培养基灭菌后，接入步骤A中的菌悬液，接种量为发酵营养基体积的万分之一，在38℃下培养72h；
步骤C、培养72h后起流加硫酸铵和葡萄糖的混合液，并继续发酵培养24h，发酵过程中维持葡萄糖的浓度为2%（同上），发酵结束后按照实施例1中的方法测试发酵液中凝乳酶的活力为285IMCU/mL。其中硫酸铵与葡萄糖的比例为200g:1200g，混合液总浓度为60%（同上）。
对比例1
按照以下配方配制营养基，大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升，灭菌后接入提前在种子罐中培养好的米黑毛霉（Mucor miehei ATCC16457）种子培养物（按相同比例配制的种子培养基），接种量为万分之一（V/V，菌悬液中孢子浓度为1012CFU/mL），培养温度38℃，培养96小时后结束培养，测得的发酵样品中凝乳酶的活力为210IMCU/mL。
对比例2
按照以下配方配制营养基，大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；灭菌后接入提前在种子罐中培养好的米黑毛霉（Mucor miehei ATCC16457）种子培养物（按相同比例配制的种子培养基），接种量为万分之一（V/V，菌悬液中孢子浓度为1012CFU/mL），培养温度38℃，72小时起流加葡萄糖溶液，浓度为60%（同上），发酵过程维持葡萄糖浓度为2%（同上），继续培养24小时后结束培养，测得的发酵样品中凝乳酶活力为236IMCU/mL。
将对比例和实施例1~9进行比较，结果显示：菌种活化与菌种扩大培养相比，经活化后直接发酵所得的凝乳酶的粗产品活力明显提高，流加的葡萄糖和硫酸盐参与了凝乳酶的代谢过程，从而进一步提高了凝乳酶的活力。
综上所述，本发明去掉了菌种在种子罐中扩大培养的步骤，降低了微生物发酵生产过程中染菌的几率，减少了能量消耗；且发酵活力与原有工艺的210IMCU/mL相比，有了显著的提高，最高可提高95%。
Claims (7)
1.一种利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤A、米黑毛霉菌种活化：米黑毛霉（Mucor miehei）菌株购自美国模式培养物集存库，编号为ATCC No.16457，活化后菌悬液中孢子浓度不小于1012CFU/mL；
步骤B、配制发酵营养基、灭菌，接入步骤A中的菌悬液，并在38~42℃下培养；
步骤C、从培养72h起、流加可溶性硫酸盐和还原糖的混合液，再继续发酵培养24h，发酵过程中100mL培养基含有2g还原糖，发酵得含有凝乳酶的粗样品；
步骤B中所述发酵营养基的配制方法为：称取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸钠105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。
2.根据权利要求1所述的利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于步骤B中所述菌悬液的接种量为发酵营养基体积的万分之一。
3.根据权利要求1所述的利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于步骤B和步骤C中培养温度为38℃。
4.根据权利要求1所述的利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于步骤C中100mL混合液溶有可溶性硫酸盐与还原糖60g，其中可溶性硫酸盐与还原糖的重量份数比为：20-200：1200。
5.根据权利要求4所述的利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于可溶性硫酸盐与还原糖的重量份数比为150：1200。
6.根据权利要求1或4所述的利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于所述可溶性硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵，还原糖为葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的利用米黑毛霉生产凝乳酶的方法，其特征在于所述可溶性硫酸盐为硫酸铵。
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