CN105734098A - 一种提高棘白菌素b产量的方法 - Google Patents

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CN105734098A CN201610176112.1A CN201610176112A CN105734098A CN 105734098 A CN105734098 A CN 105734098A CN 201610176112 A CN201610176112 A CN 201610176112A CN 105734098 A CN105734098 A CN 105734098A
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郑裕国
邹树平
熊严
牛坤
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Abstract

本发明公开了一种提高棘白菌素B产量的方法，所述方法为：以构巢曲霉CCTCC M 2012300为生产菌株，将构巢曲霉CCTCC M 2012300接种至添加有金属离子的发酵培养基中，在20～30℃、220～280rpm下培养7～12天，得到发酵液，发酵液经分离纯化得到棘白菌素B；本发明提供一种通过添加金属离子提高阿尼芬净前体化合物棘白菌素B产量的方法，通过在发酵培养基中添加硫酸锰、氯化钙、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸镁等提高阿尼芬净前体化合物棘白菌素B产量；结果表明，在发酵培养体系中最高产量达到1738.6mg/L，比不加金属离子的对照组提高了64.7％，本发明对于利用构巢曲霉(Aspergillus nidulans)为生产菌株发酵生产棘白菌素B具有重要意义。

Description

一种提高棘白菌素B产量的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种提高阿尼芬净前体化合物EchinocandinB产量的培养方法。
(二)背景技术
棘白菌素B(EchinocandinB)是一种具有环状六肽核心和脂肪酸侧链结构天然环状脂肽类化合物。化学名是，分子式为C52H81N7O16，分子量为1060，结构式如下：
棘白菌素(Echinocandin)类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。阿尼芬净(Anidulafungin)是继卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)之后的第三代全身抗真菌类棘白菌素衍生物药物，2006年2月21日，由辉瑞公司生产的阿尼芬净通过了美国FDA认证，主要治疗念珠菌血症和其他形式的念珠菌感染(腹腔脓肿、腹膜炎)和食管念珠菌等。阿尼芬净是由前体化合物棘白菌素B经犹他游动放线菌脱酰基酶脱去侧链亚油酰基，然后在DMF中与活性中间体4"-戊氧基-[1,1',4',1"]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反应制得。
目前国内外棘白菌素(Echinocandin)类抗生素前体均是利用微生物发酵法进行制备，其中棘白菌素B由构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的发酵获得。目前关于棘白菌素B发酵的文献报道较少，相关文献大多集中于卡泊芬净及米卡芬净的前体化合物发酵。MariaPapagianni等人综述了棘白菌素B发酵过程中的接种量、碳氮源种类及浓度、pH、温度及搅拌速率等因素对构巢曲霉生长的影响，表明中性pH有利于菌体生长和孢子形成，且其比生长速率会随温度的升高而升高，但是温度升高后菌体出现失水加剧的后果，最终会导致目标化合物的合成量降低。FritzBenz等学者通过红外、核磁共振等方法确定了棘白菌素B的分子结构，且发现其水解成分中包括了亚油酸、4-羟基-L-脯氨酸、4-羰基-L-脯氨酸、L-苏氨酸、(2S,3S,4S)-4-甲基-3-羟脯氨酸等。Petersen等人考察了不同金属离子添加对PneumocandinB0发酵的影响，发现培养基中添加锌离子、铜离子、钴离子和镍离子均对PneumocandinB0合成产生抑制作用，其中锌离子和钴离子抑制作用最显著。Petersen等人还考察了脯氨酸的添加对PneumocandinB0的影响，发现当培养基中不添加脯氨酸时，其效价仅为274mg/L，当添加10g/L脯氨酸后其效价提高至494mg/L；国内刘靓等人也发现在培养基中添加3g/L的脯氨酸能够有效地提高PneumocandinB0在发酵产物中的比例。
目前主要问题是国内棘白菌素B的发酵制备水平较低，因此利用发酵代谢调控手段对发酵过程进行优化，提高棘白菌素B产量，对于阿尼芬净的工业化生产来说具有极其重要的意义。本发明旨在通过金属离子来对构巢曲霉的代谢进行调控以实现棘白菌素B产量的提高，为后续的大规模发酵奠定基础。
(三)发明内容
本发明目的在于针对现有的棘白菌素B发酵产量低的缺陷，提供一种通过添加金属离子提高棘白菌素B发酵水平的技术。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种提高棘白菌素B产量的方法，所述方法为：以构巢曲霉CCTCCM2012300为生产菌株，将构巢曲霉CCTCCM2012300接种至添加有金属离子的发酵培养基中，在20～30℃、220～280rpm下培养7～12天，得到红褐色的发酵液，发酵液经分离纯化得到棘白菌素B；所述发酵培养基质量终浓度组成为：甘油0.5～5％，蛋白胨0.5～5％，L-脯氨酸0.1～0.5％，甘露醇1～10％，黄豆饼粉1～10％，鸟氨酸0.1～0.5％，花生油0.5～5％，K2HPO4·3H2O0.2～2％，溶剂为蒸馏水，pH值自然；所述金属离子添加终浓度为50～2000mg/L发酵培养基，优选50～600mg/L，更优选500～600mg/L。
进一步，所述金属离子为锰、亚铁、钙、铜或镁中的一种或多种，所述金属离子以氯化盐或硫酸盐的形式加入，更优选氯化钙、氯化亚铁、硫酸锰、硫酸铜或硫酸镁。
进一步，所述金属离子添加方法为：在构巢曲霉CCTCCM2012300发酵培养的0～72h时，向培养基中添加金属离子，每次添加终浓度为100～250mg/L，每隔6～24h添加一次，使金属离子终浓度达到50～2000mg/L，优选添加次数为1-4次，最优选3次；更优选每次添加终浓度为150～200mg/L，每隔8～12h添加一次。
进一步，所述构巢曲霉CCTCCM2012300发酵前先进行斜面活化和种子培养，所述斜面活化方法为：将构巢曲霉CCTCCM2012300接种至斜面培养基，25～30℃培养24～48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂粉20g/L，pH自然，溶剂为水；
所述种子培养为：将斜面菌体接种至种子培养基，25～30℃培养24～48h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：棉籽粉25g/L，葡萄糖10g/L，甘油10g/L，pH值6.8～7.0，溶剂为蒸馏水。
更进一步，所述发酵培养基质量终浓度组成为：甘油1％，蛋白胨0.9％，L-脯氨酸0.5％，甘露醇10％，黄豆饼粉4％，L-鸟氨酸0.5％，花生油2％，K2HPO4·3H2O1％，溶剂为蒸馏水，pH值6.8～7.0。
本发明所述构巢曲霉ZJB09223(AspergillusnidulansZJB09223)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCCNO：M2012300，保藏日期为2012年07月25日，已在《MutagenesisbreedingofhighechinocandinBproducingstrainandfurthertiterimprovementwithculturemediumoptimization》中公开。
本发明所述发酵液中棘白菌素B含量检测采用HPLC法。样品预处理：取5ml发酵液置于10ml离心管中，5000rpm离心5min，弃沉淀、收集上清液；上清液与无水乙醇按体积比1:4混合，10000rpm离心10min，收集上清液采用0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析。HPLC流动相配制：准确称取0.30gKH2PO3、0.35gNa2HPO3，用超纯水溶解并定容至500ml，0.45μm微滤膜过滤；滤液与色谱纯乙腈按体积比3:7混合，并采用超声波脱除气体。HPLC分析条件：岛津LC-20AT泵，岛津SPD-20A紫外-可见光检测器，色谱柱为C18柱(大连依利特4.6mm×250mm)，流动相比例采用乙腈：甲醇：水＝2：7：1，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为222nm，进样量为20μL，柱温40℃。
本发明旨在通过金属离子对棘白菌素B的代谢进行调控以实现棘白菌素B产量的提高，从而为降低棘白菌素B生产成本，为工业化生产阿尼芬净奠定基础。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种通过添加金属离子提高阿尼芬净前体化合物棘白菌素B产量的方法，通过在发酵培养基中添加硫酸锰、氯化钙、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸镁等提高阿尼芬净前体化合物棘白菌素B产量。结果表明，在发酵培养体系中最高产量达到1738.6mg/L，比不加金属离子的对照组提高了64.7％。本发明对于利用构巢曲霉(Aspergillusnidulans)为生产菌株发酵生产棘白菌素B具有重要意义。
(四)附图说明
图1发酵培养基中添加氯化钙对棘白菌素B产量的影响；
图2发酵培养基中终浓度0.5g/L氯化钙不同添加次数棘白菌素B产量的影响；
图3发酵培养基中3次添加终浓度0.5g/L氯化钙不同间隔时间对棘白菌素B产量的影响；
图4发酵培养基中添加硫酸锰对棘白菌素B产量的影响；
图5发酵培养基中添加硫酸铜对棘白菌素B产量的影响；
图6发酵培养基中添加硫酸镁对棘白菌素B产量的影响；
图7发酵培养基中添加氯化亚铁对棘白菌素B产量的影响；
图8发酵培养基中添加硫酸锰、氯化钙、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸镁对棘白菌素B产量的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：发酵培养基中添加氯化钙对棘白菌素B产量的影响；
(1)斜面培养：将构巢曲霉ZJB09223接种至斜面培养基，25～30℃培养28h，获得斜面菌体；采用的斜面培养基终浓度组成为：土豆200g/L(取水煮上清)，蔗糖20g/L，琼脂粉20g/L，pH自然，溶剂为水，经121℃，20min高温灭菌冷却后使用；
(2)种子培养：将步骤(1)斜面菌体接种至种子培养基，25～30℃培养48h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：棉籽粉25g/L，葡萄糖10g/L，甘油10g/L，pH6.8～7.0，溶剂为蒸馏水，经115℃，30min高温灭菌冷却后使用。
(3)发酵培养：步骤(2)种子液以10％的接种量分别接种至添加0g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L终浓度氯化钙的发酵培养基(氯化钙首次在0h开始添加，共添加3次，每隔8h添加一次，至终浓度分别达到0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L)，25℃、250rpm下培养12天，得到发酵液，采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量；所述发酵培养基终浓度组成如下：甘油1％，蛋白胨0.9％，L-脯氨酸0.5％，甘露醇10％，黄豆饼粉4％，L-鸟氨酸0.5％，花生油2％，K2HPO4·3H2O1％，溶剂为蒸馏水，pH值6.8～7.0。本发明中培养基组成以质量体积(w/v)百分比表示，某组分浓度1％即表示100mL培养基中含有该组分1g。
发酵液中棘白菌素B含量检测采用HPLC法，具体为：样品预处理：取5ml发酵液置于10ml离心管中，5000rpm离心5min，弃沉淀、收集上清液；上清液与无水乙醇按体积比1:4混合，10000rpm离心10min，收集上清液采用0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析。HPLC流动相配制：准确称取0.30gKH2PO3、0.35gNa2HPO3，用超纯水溶解并定容至500ml，0.45μm微滤膜过滤；滤液与色谱纯乙腈按体积比3:7混合，并采用超声波脱除气体。HPLC分析条件：岛津LC-20AT泵，岛津SPD-20A紫外-可见光检测器，色谱柱为C18柱(大连依利特4.6mm×250mm)，流动相比例采用乙腈：甲醇：水＝2：7：1，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为222nm，进样量为20μL，柱温40℃。
如图1所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223开始时，通过添加0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L终浓度的氯化钙，考察其对棘白菌素B合成的影响。结果发现添加终浓度为0.3g/L的氯化钙，比没有任何添加物的对照提高了22.5％；添加终浓度为0.4g/L的氯化钙，比没有任何添加物的对照提高了32.4％；添加终浓度为0.5g/L的氯化钙，对棘白菌素B的合成促进作用最大，比没有任何添加物的对照组提高了39.1％；而添加终浓度为0.6g/L的氯化钙时，棘白菌素B的产量只比对照组提高了33.9％。根据少量多次以及实际实验确定在发酵培养基中最佳添加方式为每隔8h添加一次0.167g/L的氯化钙，共添加3次(即最后一次添加时间16h)，最终浓度为0.5g/L，初始添加时间为0h。
对比例1：
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养基质量终浓度组成为：甘油1％，蛋白胨0.5％，L-脯氨酸0.1％，甘露醇1％，黄豆饼粉1％，鸟氨酸0.1％，花生油0.5％，K2HPO4·3H2O0.2％，溶剂为蒸馏水，pH值6.8～7.0。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至发酵培养基，氯化钙初始添加时间为0h，每隔8h添加一次0.167g/L的氯化钙，共添加3次(即最后一次添加时间为16h)，最终浓度为0.5g/L。25℃、250rpm下培养12天，得到发酵液。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量。以相同培养条件下实施例1所述发酵培养基作为对照。
经HPLC法检测，与相同培养条件下实施例1所述发酵培养基相比，该培养基下ECB发酵终浓度降低了70.1％。
对比例2：
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养基质量终浓度组成为：甘油5％，蛋白胨5％，L-脯氨酸0.5％，甘露醇10％，黄豆饼粉10％，鸟氨酸0.5％，花生油5％，K2HPO4·3H2O2％，溶剂为蒸馏水，pH值6.8～7.0。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至发酵培养基，氯化钙初始添加时间为0h，每隔8h添加一次0.167g/L的氯化钙，共添加3次(即最后一次添加时间为16h)，最终浓度为0.5g/L。25℃、250rpm下培养12天，得到发酵液。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量。以相同培养条件下实施例1所述发酵培养基作为对照。
经HPLC法检测，与相同培养条件下实施例1所述发酵培养基相比，该发酵培养基下ECB发酵终浓度降低了32.4％。
对比例3：
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养基质量终浓度组成为：甘油3％，蛋白胨5％，L-脯氨酸0.5％，甘露醇5％，黄豆饼粉4％，鸟氨酸0.5％，花生油2％，K2HPO4·3H2O1％，溶剂为蒸馏水，pH值6.8～7.0。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至发酵培养基，氯化钙初始添加时间为0h，每隔8h添加一次0.167g/L的氯化钙，共添加3次(即最后一次添加时间为16h)，最终浓度为0.5g/L。25℃、250rpm下培养12天，得到发酵液。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量。以相同培养条件下实施例1所述发酵培养基作为对照。
经HPLC法检测，与相同培养条件下实施例1所述发酵培养基相比，该发酵培养基下ECB发酵终浓度降低了17.6％。
实施例2：发酵培养基中终浓度0.5g/L的氯化钙不同添加次数对棘白菌素B产量的影响
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至发酵培养基，设置1个对照组(对照组不添加氯化钙)和4个实验组(组1-组4)，组1-组4分别分1，2，3，4次添加氯化钙，从初始时间0h开始添加，每隔8h分别添加一次(组1(即1次添加组)添加氯化钙浓度为5g/L，组2(即2次添加组)每次添加氯化钙浓度为2.5g/L,组3(即3次添加组)每次添加氯化钙浓度为1.67g/L，组4(即4次添加组)每次添加氯化钙浓度为1.25g/L)，至氯化钙终浓度均为0.5g/L，25℃、250rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量，所述发酵培养基质量终浓度组成同实施例1。
如图2所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223时，对终浓度为0.5g/L的氯化钙分不同添加次数，来确定最佳的添加次数。结果表明，在发酵培养基中一次性加入终浓度为0.5g/L的氯化钙，比对照组提高了39.1％；而分2次添加终浓度为0.5g/L的氯化钙时，比对照组提高了41.5％；分3次添加终浓度为0.5g/L的氯化钙时，比对照组提高了51.0％；分4次添加终浓度为0.5g/L的氯化钙时，只比对照组提高了39.6％。因此根据少量多次的原则，首先确定对不同终浓度的添加物添加次数为3次。
实施例3：发酵培养基中终浓度0.5g/L的氯化钙不同添加间隔时间对棘白菌素B产量的影响
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至发酵培养基，设置1个对照组(对照组不添加氯化钙)和4个实验组(组1-组4)，组1-组4分别在发酵开始0h时添加一次氯化钙，然后分别间隔6h，8h，10h，12h添加一次氯化钙，每次添加浓度0.167g/L，直至氯化钙终浓度均为0.5g/L，20～30℃、220～280rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量，所述发酵培养基质量终浓度组成同实施例1。
图3则表示，在基本培养基中分3次添加终浓度为0.5g/L，每次间隔不同时间。结果发现，在发酵培养开始每隔6h添加一次，共计3次，加入终浓度为0.5g/L时，比对照组产棘白菌素B提高了51.0％；结果发现，在发酵培养开始每隔8h添加一次，共计3次，加入终浓度为0.5g/L时，比对照组产棘白菌素B提高了53.8％；结果发现，在发酵培养开始每隔10h添加一次，共计3次，加入终浓度为0.5g/L时，比对照组产棘白菌素B提高了45.3％；结果发现，在发酵培养开始每隔12h添加一次，共计3次，加入终浓度为0.5g/L时，比对照组产棘白菌素B提高了40.2％。通过本实施例确定氯化钙的最佳添加方式为每隔8h添加一次0.167g/L的氯化钙，共添加3次(即最后一次添加时间为16h)，最终浓度为0.5g/L，初始添加时间为0h。
实施例4：发酵培养基中添加硫酸锰对棘白菌素B产量的影响；
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至添加0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L终浓度硫酸锰的发酵培养基(硫酸锰首次在0h开始添加，共添加3次，每隔8h添加一次，至终浓度分别达到0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L)，20～30℃、220～280rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量；所述发酵培养基终浓度组成同实施例1。
如图4所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223开始时，通过添加0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L终浓度的硫酸锰，考察其对棘白菌素B合成的影响。结果发现添加终浓度为0.1g/L的硫酸锰，比没有任何添加物的对照提高了24.3％；添加终浓度为0.2g/L的硫酸锰，对棘白菌素B的合成促进作用最大，比没有任何添加物的对照提高了37.7％；添加终浓度为0.3g/L的硫酸锰，比没有任何添加物的对照组提高了35.3％；而添加终浓度为0.4g/L的硫酸锰时，棘白菌素B的产量只比对照组提高了32.0％。根据实施例4的方案确定在发酵培养基中最佳添加方式为每隔8h添加一次0.067g/L的硫酸锰，共添加3次(即最后一次添加时间16h)，最终浓度为0.2g/L，初始添加时间为0h。
实施例5：发酵培养基中添加硫酸铜对棘白菌素B产量的影响；
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至添加0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L终浓度硫酸铜的发酵培养基(硫酸铜首次在0h开始添加，共添加3次，每隔8h添加一次，至终浓度分别达到0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L)，20～30℃、220～280rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量；所述发酵培养基终浓度组成同实施例1。
如图5所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223开始时，通过添加0.4g/L、0.5g/L、0.6g/、0.7g/L终浓度的硫酸铜，考察其对棘白菌素B合成的影响。结果发现添加终浓度为0.4g/L的硫酸铜，比没有任何添加物的对照提高了5.4％；添加终浓度为0.5g/L的硫酸铜，比没有任何添加物的对照提高了18.8％；添加终浓度为0.6g/L的硫酸铜，对棘白菌素B的合成促进作用最大，比没有任何添加物的对照组提高了30.0％；而添加终浓度为0.7g/L的硫酸铜时，棘白菌素B的产量只比对照组提高了25.4％。根据实施例5的方案确定在发酵培养基中最佳添加方式为每隔8h添加一次0.2g/L的硫酸铜，共添加3次(即最后一次添加时间16h)，最终浓度为0.6g/L，初始添加时间为0h。
实施例6：发酵培养基中添加硫酸镁对棘白菌素B产量的影响；
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至添加0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L终浓度硫酸镁的发酵培养基(硫酸镁首次在0h开始添加，共添加3次，每隔8h添加一次，至终浓度分别达到0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L)，20～30℃、220～280rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量；所述发酵培养基终浓度组成同实施例1。
如图6所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223开始时，通过添加0.4g/L、0.5g/L、0.6g/、0.7g/L终浓度的硫酸镁，考察其对棘白菌素B合成的影响。结果发现添加终浓度为0.4g/L的硫酸镁，比没有任何添加物的对照提高了11.1％；添加终浓度为0.5g/L的硫酸镁，比没有任何添加物的对照提高了22.6％；添加终浓度为0.6g/L的硫酸镁，对棘白菌素B的合成促进作用最大，比没有任何添加物的对照组提高了28.6％；而添加终浓度为0.7g/L的硫酸镁时，棘白菌素B的产量只比对照组提高了25.4％。根据实施例6的方案确定在发酵培养基中最佳添加方式为每隔8h添加一次0.167g/L的硫酸镁，共添加3次(即最后一次添加时间16h)，最终浓度为0.5g/L，初始添加时间为0h。
实施例7：发酵培养基中添加氯化亚铁对棘白菌素B产量的影响；
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至添加0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L终浓度的氯化亚铁的发酵培养基(氯化亚铁首次在0h开始添加，共添加3次，每隔8h添加一次，至终浓度分别达到0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L)，20～30℃、220～280rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照。采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量；所述发酵培养基终浓度组成同实施例1。
如图7所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223开始时，通过添加0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L终浓度的氯化亚铁，考察其对棘白菌素B合成的影响。结果发现添加终浓度为0.05g/L的氯化亚铁，比没有任何添加物的对照提高了29.2％；添加终浓度为0.1g/L的氯化亚铁，比没有任何添加物的对照提高了23.5％；添加终浓度为0.15g/L的氯化亚铁，比没有任何添加物的对照组提高了21.0％；而添加终浓度为0.2g/L的氯化亚铁时，棘白菌素B的产量只比对照组提高了13.1％。根据实施例7的方案确定在发酵培养基中最佳添加方式为每隔8h添加一次0.017g/L的氯化亚铁，共添加3次(即最后一次添加时间16h)，最终浓度为0.05g/L，初始添加时间为0h。
实施例8：发酵培养基中添加硫酸锰、氯化钙、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸镁对棘白菌素B产量的影响；
斜面培养和种子培养同实施例1。
发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量分别接种至发酵培养基，通过在0h、8h、16h分3次共添加终浓度0.5g/L氯化钙、0.2g/L硫酸锰、0.05g/L氯化亚铁、0.6g/L硫酸铜和0.5g/L硫酸镁，20～30℃、220～280rpm下培养12天，得到发酵液，以不添加金属离子为对照，采用HPLC法检测发酵液中棘白菌素B含量；所述发酵培养基终浓度组成同实施例1。
如图8所示，在发酵培养基中培养构巢曲霉ZJB09223开始时，通过在0h、8h、16h分3次添加0.5g/氯化钙、0.2g/L硫酸锰、0.05g/L氯化亚铁、0.6g/L硫酸铜、0.5g/L硫酸镁，考察对棘白菌素B合成的影响。结果发现添加后，比没有任何添加物的对照提高了64.7％。

Claims (9)

1.一种提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述方法为：以构巢曲霉CCTCCM2012300为生产菌株，将构巢曲霉CCTCCM2012300接种至添加有金属离子的发酵培养基中，在20～30℃、220～280rpm下培养7～12天，得到发酵液，发酵液经分离纯化得到棘白菌素B；所述发酵培养基质量终浓度组成为：甘油0.5～5％，蛋白胨0.5～5％，L-脯氨酸0.1～0.5％，甘露醇1～10％，黄豆饼粉1～10％，鸟氨酸0.1～0.5％，花生油0.5～5％，K2HPO4·3H2O0.2～2％，溶剂为蒸馏水，pH值自然；所述金属离子添加终浓度为50～2000mg/L发酵培养基。
2.如权利要求1所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述金属离子为锰、亚铁、钙、铜或镁中的一种或多种。
3.如权利要求1所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述金属离子以氯化盐或硫酸盐的形式加入。
4.如权利要求1所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述金属离子添加终浓度为50～600mg/L发酵培养基。
5.如权利要求1所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述金属离子添加方法为：在构巢曲霉CCTCCM2012300发酵培养的0～72h时，向培养基中添加金属离子，每次添加终浓度为100～250mg/L，每隔6～24h添加一次，使金属离子终浓度达到50～2000mg/L。
6.如权利要求5所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述每次添加终浓度为150～200mg/L，每隔8～12h添加一次。
7.如权利要求5所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述添加次数为1～4次。
8.如权利要求1所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述构巢曲霉CCTCCM2012300发酵前先进行斜面活化和种子培养，所述斜面活化方法为：将构巢曲霉CCTCCM2012300接种至斜面培养基，25～30℃培养24～48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂粉20g/L，pH自然，溶剂为水；
所述种子培养为：将斜面菌体接种至种子培养基，25～30℃培养24～48h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：棉籽粉25g/L，葡萄糖10g/L，甘油10g/L，pH6.8～7.0，溶剂为蒸馏水。
9.如权利要求1所述提高棘白菌素B产量的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：甘油1％，蛋白胨0.9％，L-脯氨酸0.5％，甘露醇10％，黄豆饼粉4％，L-鸟氨酸0.5％，花生油2％，K2HPO4·3H2O1％，溶剂为蒸馏水，pH6.8～7.0。
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