CN107868757A - 一种植物内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物内生真菌，其分类命名为烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT‑HS8，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年3月31日，保藏编号为Bjerkandera adusta CCTCC M 2017159，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明提供的菌株，可通过生物转化法制备具有神经保护疗效的化合物8α,15α‑环氧化石杉碱甲。此方法具有发酵条件简单、菌种易培养、转化产率高、具备产业化开发潜力等优点，是一种获得具有神经保护的石杉碱甲衍生物的新途径，为获得活性石杉碱甲衍生物提供了一种新的思路。

Description

一种植物内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种植物内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲中的应用，该应用主要是采用微生物转化的方法制备8α,15α-环氧化石杉碱甲。
背景技术
石杉碱甲(huperzine A)是来源于石松属植物蛇足石杉(Huperzia serrata)的一个生物碱类化合物。大量科学研究已表明，石杉碱甲对中枢乙酰胆碱酯酶(acetylcholineesterase,AChE)具有高效、可逆、高选择性的抑制作用，可用于治疗阿尔茨海默症(AD)，同时对重症肌无力、记忆障碍、血管性痴呆具有显著的疗效。因此，石杉碱甲受到了研究人员的广泛关注，研究的热点主要集中于该化合物及其类似物的化学合成、结构修饰、活性评价、构效关系等方面。
目前，石杉碱甲衍生物的制备主要有两种方法：一、从蛇足石杉植株中提取。从天然来源提取是获得天然产物及其衍生物的常用方法之一。然而，由于蛇足石杉属于高等蕨类植物，生长缓慢(自然生长周期长达10-15年)，孢子萌发率低，野生资源匮乏，属于再生困难的资源，因此严重限制这一方法的实施与开展。此外，蛇足石杉化学成分极其复杂，存在多种其他类型的石松生物碱，这为从植物中提取石杉碱甲衍生物类成分造成了另一障碍。二、化学法结构修饰。利用化学法开展结构修饰是获得天然产物衍生物另一常用方法。然而，由于石石杉碱甲分子结构存在较强的刚性，对其开展化学法结构修饰难度较大，目前已经报道的修饰也主要集中于其结构中的吡啶酮环和游离氨基，结构修饰位点较单一。而且，多数化学合成路线存在反应条件苛刻、目标产物收率低、无法实现工业化生产等技术障碍。
微生物生物转化是获得天然产物衍生物的一种新兴手段，其本质是利用微生物产生的酶(系)对外源添加物进行结构修饰的过程，具有操作简便、条件温和、选择性高、立体专一性强等优势，而且可以完成非活化饱和碳链的氧化、醚键的断裂等化学方法难以进行的反应。有关石杉碱甲的微生物转化研究鲜有报道。
由此可见，利用微生物生物转化作用开展石杉碱甲衍生物的制备是切实可行的。在微生物转化过程中，利用微生物酶(系)功能的新颖性、多样性和高效性开展石杉碱甲的生物转化，有望以较高产率获得结构新颖多样性的石杉碱甲衍生物。2010年，中国医学科学院药物研究所戴均贵研究员通过研究Streptomyces griseus CACC200300(来源未报到)对石杉碱甲的微生物转化，首次获得了包括8α,15α-环氧石杉碱甲在内的5个新化合物(ZhangXY,Zou JH and Dai JG.Tetrahedron Lett,2010,51,3840-3842.)；其后的药理学研究表明仅8α,15α-环氧石杉碱甲对硝普钠诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用(Ning N,Hu JF,Yuan YH,Dai JG and Chen NH.Acta.Pharmacol.Sin.,2012,33,34-40)，显示出了该化合物具有被开发成为神经保护类药物的潜质。
综上，由于微生物转化过程中，酶(系)功能的新颖性、多样性和高效性制约着转化反应的类型，转化产物结构的新颖性、多样性，以及转化的效率；因此，如何寻找到一种新的微生物，利用其高效获取具有药效功能的化合物8α，15α-环氧化石杉碱甲，是本领域技术人员急需攻克的技术难题。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，筛选得到了一株烟管菌，通过该菌株的发酵与转化，以石杉碱甲为底物制得8α,15α-环氧化石杉碱甲，解决了现有技术中的技术缺陷。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案提供了一种植物内生真菌，经分子生物学鉴定为烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017159，保藏日期为2017年3月31日，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明所述的烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8，菌株的ITS碱基序列为：
CTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTCTGCTGGCTCGCAAGGGCATGTGCACGCCTGTCTCATCCACTCTCAACTTCTGTGCACTTTTCATAGGCCGGCTTGTGGGTGCGTTCGCGCACTTGTAGGTGTCGGGCTTATGCTTTATTACAAACGATTCAGTTTTAGAATGTCATACTTTGCTATAACGCAATTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTCTCATGGAATTCTCAACCTTCAACTTTATTGATGAAGGCTTGGACTTGGAGGTCGTGCCGGCTCTCGTAGTCGGCTCCTCTGAAATGCATTAGTGCGAACGTTACCAGCCGCTTCAGCGTGATAATTATCTGCGTTGCTGTGGAGGGTATTCTAGTGTTCACGCTTCTAACCGTCTTCGGACAAATTTCTGAACTCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT
本发明所述的烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8，菌株的固体培养特征为：
在沙保氏琼脂培养基上，于28℃下培养，菌落形态为：培养3-4天，菌落直径为50-70mm，培养到5-7天能铺满整个培养皿，菌落在生长2-3天时颜色为白色，菌落中心菌丝体初显致密，后分散，有绒毛状；5-7天生长至整个平板，菌丝略显稀疏，呈绒毛状渐变为棉花羊毛状到羊毛絮状，基内菌丝为气生菌丝；菌落干燥，不透明，边缘不平整，背面呈浅黄色。
上述沙保氏琼脂培养基，通过如下方法制得：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂溶解于1L去离子水中，于121℃高温灭菌20分钟。
本发明还提供了一种植物内生真菌——烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8经发酵转化制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用，制备步骤如下：
(1)挑取烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8菌丝体接种于沙保氏琼脂培养基，28℃培养，使菌株活化；(2)将活化好的菌株接种于沙保氏液体培养基，投入底物石杉碱甲，28℃发酵培养，得转化产物；
(2)发酵结束，除去菌丝，调节发酵液pH至9～11，在发酵液中加入大孔吸附树脂，搅拌后放置过夜；然后过滤回收树脂，将树脂装入开放色谱柱，先以体积比2:8的甲醇-水溶液冲洗柱子，弃去该部分洗脱液，再以体积比8:2的甲醇-水溶液洗脱，合并所得洗脱液减压蒸馏回收溶剂，得转化产物粗提物；
(3)将转化产物粗提物用ODS C18填料进行柱层析，再经半制备HPLC分离，即得转化产物8α,15α-环氧化石杉碱甲；
优选的，步骤(2)的发酵条件为28±2℃、转速为160-200转/分钟，培养时间为6-14天，底物石杉碱甲的终浓度为0.01-0.1mg/mL。
优选的，步骤(3)中的发酵液pH调节剂为低浓度碳酸钠或氨水，所用大孔吸附树脂为弱极性或非极性吸附树脂，树脂加入量为20-40克每升发酵液。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的保藏编号为CCTCC M 2017160的烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8，是发明人经多年创造性实验劳动发现的一株菌，具有能将石杉碱甲转化为8α,15α-环氧化石杉碱甲的真菌，原创性极强，本发明还提供了一种该菌株在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用。采用该方法制得的终产物8α，15α-环氧化石杉碱甲具有神经保护疗效，且该方法具有发酵条件简单、菌种易培养等优势，具有工业化规模生产的潜力。
此外，发明人经大量创造性实验发现；利用本发明的烟管菌Bjerkandera adustaZJUT-HS8转化石杉碱甲，其转化率远高于其他来源微生物，优势明显；烟管菌Bjerkanderaadusta ZJUT-HS8代表了一种尚待开发的微生物资源，可用于天然产物的微生物转化。本发明为石杉碱甲及其类似物的获取提供了一种新途径，保护了珍稀药用石杉科植物资源免遭破坏。
附图说明：
图1为本发明烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8的菌落形态。
图2为采用本发明方法制得的化合物8α,15α-环氧化石杉碱甲1H-NMR谱图。
图3为采用本发明制得的化合物8α,15α-环氧化石杉碱甲13C-NMR谱图。
具体实施方式
以下实施例便于更好的理解本发明，但不限定本发明。以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
实施例1烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8的分离
(1)菌株的分离
用自来水将采集的植株表皮、根部都洗净，将洗净的样品浸入装有75％乙醇的容器中，2分钟后取出，并以无菌水冲洗3到5次，再2浸入装有0.1％升汞溶液的容器中，维持1分钟后取出，用大量无菌水冲洗除去残留的升汞溶液。在无菌操作的条件下，用灭菌的镊子和刀片将植物的外表皮剥去，再切成0.3cm×0.3cm大小的组织片种植于沙保氏琼脂培养基平板上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态，颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的平板上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，接入沙保氏琼脂培养基斜面，28℃暗培养4-7天后，转至4℃冰箱内保存备用。
如图1所示，培养起初，菌丝呈白色绒毛状，生长蓬松、呈放射形生长，且多为气生菌丝，与培养基结合紧密；当培养4-7天，菌落即铺满整皿，菌落干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。
实施例2烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8的分子生物学鉴定
(1)DNA的提取
取培养6天的发酵液，离心收集菌丝体，将菌丝用液氮冷冻研磨后，用SK1375基因组DNA提取试剂盒(厂家：上海生物工程(上海)有限公司)提取基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。
(2)序列的PCR扩增
引物序列为：
ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’
ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’
PCR体系(50μL)构成为：Template(基因组)10pmol，primer 1(10μM)1μL，primer 2(10μM)1μL，dNTP mix(10Mm each)1μL，10×Taq reaction Buffer 5μL，Taq(5U/μL)0.25μL，加水至50μL。
PCR程序设定为：98℃预变性5分钟，95℃变性35秒，55℃复性35秒，72℃延伸40秒，35个循环，最后72℃延伸8分钟。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，经UNIO-10柱式DNA凝胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)纯化。
纯化产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，测得ITS区碱基序列为：
CTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTCTGCTGGCTCGCAAGGGCATGTGCACGCCTGTCTCATCCACTCTCAACTTCTGTGCACTTTTCATAGGCCGGCTTGTGGGTGCGTTCGCGCACTTGTAGGTGTCGGGCTTATGCTTTATTACAAACGATTCAGTTTTAGAATGTCATACTTTGCTATAACGCAATTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTCTCATGGAATTCTCAACCTTCAACTTTATTGATGAAGGCTTGGACTTGGAGGTCGTGCCGGCTCTCGTAGTCGGCTCCTCTGAAATGCATTAGTGCGAACGTTACCAGCCGCTTCAGCGTGATAATTATCTGCGTTGCTGTGGAGGGTATTCTAGTGTTCACGCTTCTAACCGTCTTCGGACAAATTTCTGAACTCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT
(3)数据处理
序列数据在美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation USA NCBI)中的序列比较，鉴定该菌株为烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8。
实施例3利用烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8转化制备8α,15α--环氧化石杉碱甲的方法
①菌株活化
沙保氏琼脂培养基，通过如下方法制得：将40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g琼脂溶解于1L去离子水中，于121℃高温灭菌20分钟，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，28℃培养7天；
②发酵与转化
沙保氏琼脂培养基，通过如下方法制得：将40g葡萄糖、10g蛋白胨溶解于1L去离子水中，于121℃高温灭菌20分钟。
将活化好的烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8菌株接种于350个250mL三角瓶(瓶中装有100mL沙保氏液体培养基，已于121℃灭菌)中，与28℃、180转/分钟振荡培养。培养6天后，在无菌操作条件下，将0.1mL石杉碱甲无水乙醇溶液(10mg/mL)加入各三角瓶中，摇匀，于28℃静置培养14天。
③转化产物的提取
发酵结束，先后以纱布过滤，离心操作等方式除去菌丝；用低浓度碳酸钠或者氨水溶液调节发酵液PH至9-11，在发酵液中(35L)加入AB-8大孔吸附树脂(700g)，搅拌后放置过夜；然后过滤回收树脂，将树脂装入开放色谱柱，先以体积比2:8的甲醇-水溶液冲洗柱子，弃去该部分洗脱液，再以体积比8:2的甲醇-水溶液洗脱4个柱体积，合并所得洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，得转化产物粗提物(4.3g)；
转化产物提取物经ODSC18柱分离，依次用体积比4:6的甲醇-水溶液、体积比5:5的甲醇-水溶液、体积比6:4的甲醇-水溶液、体积比7:3的甲醇-水溶液、体积比8:2的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液均洗脱2个柱体积，以氯仿:甲醇＝13:11为展开剂进行薄层层析检测，合并比移值(Rf值)为0.25左右的部分，减压浓缩后再经半制备HPLC分离，制备柱为YMCODS C18柱(250×10mm)，流动相组成为甲醇:水＝35:65，检测波长为310nm，收集保留时间为32.5-38.5min的洗脱部分，减压回收溶剂，即得8α,15α-环氧化石杉碱甲(36.3mg)，转化率为36.3/0.1×10×350＝10.4％。
8α,15α-环氧化石杉碱甲呈白色无定型粉末状，溶于甲醇，丙酮，氯仿。紫外灯下可见明显紫外吸收，10％硫酸乙醇显色剂显灰色。碘化铋钾显色剂显红色。
实施例4 8α,15α--环氧化石杉碱甲的结构鉴定
通过应用质谱、核磁共振波谱等技术，并与文献数据(Zhang XY,Zou JH and DaiJG.Tetrahedron Lett,2010,51,3840-3842.)比对，确定化合物为8α,15α-环氧化石杉碱甲。
质谱显示其准分子离子峰为ESI-MS m/z:259[M+H]+，结合核磁共振图谱数据，可推断其分子式为C15H18N2O2。
本发明制得的8α,15α-环氧化石杉碱甲，氢谱数据(表1)如下：δH1.16(3H,s,H-16),1.71(3H,d,J＝6.8Hz,H-10),1.86(1H,d,J＝14.4Hz,Ha-14),2.01(1H,d,J＝14.4Hz,Hb-14),2.89(1H,dd,J＝16.4,1.1Hz,Ha-6),3.00(1H,dd,J＝16.4,5.5Hz,Hb-6)，2.99(1H,brs,H-8),3.66(1H,brs,H-7),5.64(1H,q,J＝6.7Hz,H-11),6.50(1H,d,J＝9.5Hz,H-2),7.96(1H,d,J＝9.5Hz,H-3)。
如图3所示，本发明制得的8α,15α-环氧化石杉碱甲，碳谱数据(表1)如下：δc12.6(C-10),24.5(C-16),31.4(C-6),33.0(C-7),47.8(C-14),52.9(C-13),57.1(C-15),64.2(C-8),117.3(C-11),118.2(C-2),122.2(C-4),139.3(C-12),141.0(C-3),142.1(C-5),165.6(C-1)。
表1. 8α,15α-环氧化石杉碱甲的核磁数据(溶剂为氘代氯仿)
氢谱、碳谱分别在500和125MHz测试。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种植物内生真菌及其应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 598
<212> DNA
<213> 烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8
<400> 1
ctgcggaagg atcattatcg agttttgaac gggttgtctg ctggctcgca agggcatgtg 60
cacgcctgtc tcatccactc tcaacttctg tgcacttttc ataggccggc ttgtgggtgc 120
gttcgcgcac ttgtaggtgt cgggcttatg ctttattaca aacgattcag ttttagaatg 180
tcatactttg ctataacgca attatataca actttcagca acggatctct tggctctcgc 240
atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca 300
tcgaatcttt gaacgcacct tgcgctcctt ggtattccga ggagcatgcc tgtttgagtc 360
tcatggaatt ctcaaccttc aactttattg atgaaggctt ggacttggag gtcgtgccgg 420
ctctcgtagt cggctcctct gaaatgcatt agtgcgaacg ttaccagccg cttcagcgtg 480
ataattatct gcgttgctgt ggagggtatt ctagtgttca cgcttctaac cgtcttcgga 540
caaatttctg aactctgagc tcaaatcagg taggactacc cgctgaactt aagcatat 598

Claims (6)

1.一种植物内生真菌，其特征在于：分类学命名为烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017159，保藏日期为2017年3月31日，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学。
2.根据权利要求1所述的植物内生真菌，其特征在于：其在沙保氏培养基上的菌落形态为：28℃培养3～4天，菌落直径为50～70mm，培养到5～7天能铺满整个培养皿，菌落在生长2-3天时颜色为白色，菌落中心菌丝体初显致密，后分散，有绒毛状；5～7天生长至整个平板，菌丝显稀疏，呈绒毛状渐变为棉花羊毛状到羊毛絮状，基内菌丝为气生菌丝；菌落干燥，不透明，边缘不平整，背面呈浅黄色。
3.根据权利要求1所述的植物内生真菌，其特征在于：所述烟管菌Bjerkandera adustaZJUT-HS8的ITS区碱基序列为：
CTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTCTGCTGGCTCGCAAGGGCATGTGCACGCCTGTCTCATCCACTCTCAACTTCTGTGCACTTTTCATAGGCCGGCTTGTGGGTGCGTTCGCGCACTTGTAGGTGTCGGGCTTATGCTTTATTACAAACGATTCAGTTTTAGAATGTCATACTTTGCTATAACGCAATTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTCTCATGGAATTCTCAACCTTCAACTTTATTGATGAAGGCTTGGACTTGGAGGTCGTGCCGGCTCTCGTAGTCGGCTCCTCTGAAATGCATTAGTGCGAACGTTACCAGCCGCTTCAGCGTGATAATTATCTGCGTTGCTGTGGAGGGTATTCTAGTGTTCACGCTTCTAACCGTCTTCGGACAAATTTCTGAACTCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 。
4.一种权利要求1所述的植物内生真菌的应用，其特征在于，所述烟管菌Bjerkanderaadusta ZJUT-HS8在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲中的应用。
5.权利要求4所述的植物内生真菌的应用，其特征在于，应用具体步骤如下：
1)挑取烟管菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8菌丝体接种于沙保氏琼脂培养基，28℃培养，使菌株活化；
2)将活化好的菌株接种于沙保氏液体培养基，投入底物石杉碱甲，28℃发酵培养，得转化产物；
3)发酵结束，过滤除去菌丝，调节发酵液pH至9-11，在发酵液中加入大孔吸附树脂，搅拌后放置过夜；然后过滤回收树脂，将树脂装入开放色谱柱，以甲醇洗脱，得甲醇洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，得转化产物粗提物；
4)将转化产物粗提物用ODS C18填料进行柱层析，再经半制备HPLC分离，即得转化产物8α,15α-环氧化石杉碱甲。
6.根据权利要求5所述的植物内生真菌的应用，其特征在于，步骤(2)中的发酵条件为28±2℃、转速为160-200转/分钟，培养时间6-14天，底物石杉碱甲的终浓度为0.01-0.1mg/mL；步骤(3)中的发酵液pH调节剂为低浓度碳酸钠或氨水，所用大孔吸附树脂为弱极性或非极性吸附树脂，树脂加入量为20-40克每升发酵液。
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