CN109613156B - 一种石杉碱甲及石杉碱甲注射液有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种石杉碱甲原料和石杉碱甲注射液中有关物质的检测方法。该检测方法以杂质A、杂质B与石杉碱乙为对照品，量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图，计算杂质A、杂质B、石杉碱乙的含量。

Description

一种石杉碱甲及石杉碱甲注射液有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及一种治疗记忆障碍和“老年痴呆症”(Alzheimer’s disease，AD)药物石杉碱甲及石杉碱甲注射液有关物质的检测方法。
背景技术
石杉碱甲是从石松科植物千层塔[Huperzia serrata(Thunb)Thev.]中分离到的一种高活性生物碱。英文名称：Huperzine A，化学名称：(5R，9R，11E)-5-氨基-11-亚乙基-5，8，9，10-四氢-7-甲基-5，9-亚甲基环辛四烯并[b]吡啶-2-(1H)-酮，结构式为：
Figure GDA0003096365320000011
石杉碱甲通常用其光学异构体石杉碱甲作为药物活性成分，石杉碱甲是一高效、高选择性的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，具有提高学习、记忆效果的功能，可用于多种神经精神类疾病的治疗。石杉碱甲片于1995年在中国上市，临床用于阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD又名老年性痴呆)和记忆障碍的治疗；在国外石杉碱甲作为食品添加剂、功能性饮料活性成分得到广泛使用，主要用于改善老年人记忆功能，提高运动员大脑反应速度。
AD是一种慢性神经退行性疾病，主要临床表现为进行性记忆和认知功能的缺损，发病率逐年增加的原因较为复杂，有社会、不良生活方式、遗传等因素，但与世界人口逐年老龄化、老龄队伍不断扩大密切相关。AD的主要病理学改变包括脑萎缩、老年斑、神经元内神经纤维缠结、神经元(及突触)丢失和胶质增生等。虽然有关AD发病机制尚不完全清楚，但尸检证实与学习、记忆有关联的脑部胆碱系统功能存在明显衰竭有关，用胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱治疗AD记忆障碍取得一定疗效提示胆碱能神经系统受损是AD的原因之一，据此提出了胆碱能补偿治疗策略。胆碱酯酶抑制剂(AChE)是目前该策略中较为成功的一类治疗药物，它通过抑制突触间隙乙酰胆碱酯酶，使释放的乙酰胆碱在突触间隙的水解减慢，从而提高脑内乙酰胆碱水平。
自20世纪90年代以来，美国FDA已相继批准他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利斯的明(rivastigmine)及加兰他敏(galantamine)4个胆碱酯酶抑制剂用于AD治疗。近年来的研究发现，AChE除具有提高脑内乙酰胆碱水平作用外，还有抗氧化、抗细胞凋亡、提高脑内神经生长因子以及调控淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein，APP)的代谢等多重作用机制，提示其对退行性神经系统疾病可能具有广阔的治疗前景。但是，已有AChE抑制剂还存在半衰期短、较严重的外周胆碱能系统副作用，以及他克林在治疗过程中有40％左右肝毒性发生率等缺点，它们的临床应用前景受到限制。因此，寻找作用时间长、副作用小的新一代AChE抑制剂仍是国际各大药厂关注的热点。
石杉碱甲是从民间草药千层塔中分离到的一种新型石松类生物碱有效单体，是一种天然的高效、高选择性可逆中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂，与FDA批准的同类药物他克林、多奈哌齐、利斯的明及加兰他敏相比，具有作用时间长、口服生物利用度高、易通过血脑屏障、不良反应低、价格低廉等特点。石杉碱甲自1994年获卫生部新药办批准在国内临床广泛用于治疗AD至今，已积累大量临床病例，证实对早、中期AD病人有确切的对症治疗效果。随着临床应用与研究的扩大和深入，发现石杉碱甲对血管性痴呆(vascular dementia，VD)及其他病因造成的记忆障碍也具有一定的改善作用。
目前常见剂型为片剂、胶囊剂，无注射剂上市。注射剂由于起效快、吸收个体差异小，比较适用于病情稍重的住院病人，马永兴等的临床试验结果表明，用石杉碱甲注射液双盲对照治疗120例老年期记忆障碍，治疗组有效率为68.3％，对照组25.5％，故我公司研制了石杉碱甲注射液。
综上所述，记忆障碍的发生率高，尤其是随着老龄化社会的到来，AD的发病率都在逐年升高，而目前用于治疗记忆障碍的AChE抑制剂类药物均存在疗效不佳，且毒副作用较大的缺点，所以迫切需要开发疗效更佳、毒副作用更小的替代药物。石杉碱甲作为新型AChE抑制剂，依据独特的化学结构，对脑内AChE具有极高选择性抑制，可提高脑内ACh水平作用持续达6小时，疗效优于其它同类产品且无明显的毒副作用。另外，我公司凭借自身的优势开发的石杉碱甲注射液，填补了国内注射液的空白。和目前国内已上市的其它剂型相比，具有起效快，吸收影响因素小等特点，适用于病情稍重的住院病人，预计该注射液具有广阔的市场前景。
现有制备方法中，所得石杉碱甲和石杉碱甲注射液含有相关的杂质，主要的杂质如下：
杂质A：
(1R,2S,8R,9S,E)-8-氨基-10-亚乙基-9-甲基-2,3,4,8,9,9a-六氢-2,8-环氧乙烷基[2',3'：5,6]环辛四烯[1,2-b]吡啶-5-(1H)-酮。
Figure GDA0003096365320000031
杂质B：
(2'R,5S,9R)-5-氨基-3',7-二甲基-5,6,9,10-四氢螺[5,9-甲基环辛四烯[b]吡啶
-11,2'-环氧基]-2(1H)-酮。
Figure GDA0003096365320000032
石杉碱乙：
(4aR,5S,10bR)-12-甲基-2,3,4,4a,5,6-六氢-1H-5,10b-丙[1]烯-1,7-菲咯啉-8(7H)-酮。
Figure GDA0003096365320000033
从制备方法分析，上述杂质石杉碱乙为工艺杂质，杂质A和杂质B为降解杂质(氧化降解)。
石杉碱甲质量标准当前国内外药典仅中国药典收载，有“有关物质”检查项，具体测定方法如下：
1.ChP2015：HPLC法，C18，流动相：以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(86：14)，波长：310nm，进样量：20μl，供试品溶液：0.1mg/ml，对照溶液2.5μg/ml(2.5％)，限度：各杂质和≤2.5％。(同ChP2010)
石杉碱甲注射液质量标准当前国内外药典仅中国药典收载，有“有关物质”检查项，具体测定方法如下：
1.ChP2015：HPLC法，C18，流动相：以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至2.5)-乙腈(86：14)，波长：310nm，进样量：20μl，供试品溶液：0.1mg/ml，对照溶液2.5μg/ml(2.5％)，限度：各杂质和≤2.5％。(同ChP2010)
本发明在研究石杉碱甲及石杉碱甲注射液的方法过程中，意外发现和分离检测了中国食品药品检定研究院(中检院)的石杉碱甲对照品中含有的未知杂质(图1)，并且中国药典2015年版检测方法未能将此杂质与石杉碱甲主峰分离(图2)。
本发明在制备石杉碱甲及石杉碱甲注射液的过程中，发现了两种结构未知的主要杂质：分别为杂质A和杂质B。
本发明对这两个杂质，杂质A和杂质B进行了结构确认，同时对其进行含量测定。并以此两种杂质和石杉碱乙为质量控制指标，结果大大提高了石杉碱甲和石杉碱甲注射液的质量，提高患者用药安全性。
发明内容
本发明提供一种石杉碱甲和石杉碱甲注射液中有关物质的检测方法。
本发明的另一个目的在于提供三种杂质，分别为杂质A，杂质B和石杉碱乙，这三种杂质在检测方法中作为对照品使用。
其中，本发明所述杂质A，其结构式如下所示：
Figure GDA0003096365320000051
其中，本发明所述杂质B，其结构式如下所示：
Figure GDA0003096365320000052
其中，本发明所述石杉碱乙，其结构式如下所示：
Figure GDA0003096365320000053
本发明对杂质A和杂质B进行研究，确定为高效液相测定图谱中相对主峰保留时间约为0.25和1.45的杂质。
为控制石杉碱甲原料药产品中上述杂质的含量，需要对杂质进行含量测定。为此，本发明提出了杂质的检测方法，所述的检测方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液的配制：取石杉碱甲适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg石杉碱甲的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，对照品溶液的配制：取杂质A、杂质B与石杉碱乙适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg杂质A、杂质B与石杉碱乙的混合溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg石杉碱甲的溶液，作为对照溶液；
步骤3，系统适用性溶液的配制：另取石杉碱甲、杂质A、杂质B及石杉碱乙适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲0.1mg、约含杂质A、杂质B和石杉碱乙各0.1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
步骤4，取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤5，精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
或者，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤6，根据色谱图，计算杂质A、杂质B、石杉碱乙与未知杂质的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：
固定相为C18，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相A：0.02mol/L乙酸铵缓冲液，用乙酸调节该缓冲液的pH值至5.55±0.1；
流动相B：乙腈，
柱温：30℃，
检测波长：310nm，
流速：每分钟1ml，
梯度洗脱过程如下所示：
表1，
Figure GDA0003096365320000061
Figure GDA0003096365320000071
本发明的另一个目的在于提供一种石杉碱甲注射液中有关物质的检测方法。
对于石杉碱甲注射液，测定方法主要包括供试品溶液的配制，方法为，精密量取石杉碱甲注射液适量，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约含0.1mg石杉碱甲的溶液，作为供试品溶液；其他步骤和石杉碱甲原料药的检测方法相同。
具体的，本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的配制：精密量取石杉碱甲注射液适量，加0.01mol/L盐酸溶液稀释制成每1ml中约含0.1mg石杉碱甲的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，对照品溶液的配制：取杂质A、杂质B与石杉碱乙适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg杂质A、杂质B与石杉碱乙的混合溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg石杉碱甲的溶液，作为对照溶液；
步骤3，系统适用性溶液的配制：另取石杉碱甲、杂质A、杂质B及石杉碱乙适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲0.1mg、约含杂质A、杂质B和石杉碱乙各0.1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
步骤4，取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤5，精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
或者，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤6，根据色谱图，计算杂质A、杂质B、石杉碱乙与未知杂质的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：
固定相为C18，规格为250×4.6mm，5μm；
流动相A：0.02mol/L乙酸铵缓冲液，用乙酸调节该缓冲液的pH值至5.55±0.1；
流动相B：乙腈，
柱温：30℃，
检测波长：310nm，
流速：每分钟1ml，
梯度洗脱过程如下所示：
表2，
Figure GDA0003096365320000081
优选的，石杉碱甲原料药或注射液中有关物质的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的配制：取石杉碱甲适量，精密称定，或精密量取石杉碱甲注射液适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲0.1mg的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，对照品溶液的配制：取杂质A、杂质B与石杉碱乙适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg的溶液，作为对照溶液；
步骤3，系统适用性溶液的配制：另取石杉碱甲、杂质A、杂质B及石杉碱乙适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲0.1mg、约含杂质A、杂质B和石杉碱乙各0.1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
步骤4，取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，主峰保留时间约为17.5分钟，出峰顺序依次为杂质A、石杉碱乙、石杉碱甲与杂质B，石杉碱甲主峰与各杂质峰之间的分离度均应符合要求；
步骤5，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤6，根据色谱图，按带校正因子的自身对照法计算杂质A、杂质B、石杉碱乙与未知杂质的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：固定相为C18；以0.02mol/L乙酸铵缓冲液(用乙酸调节pH值至5.55±0.1)为流动相A；以乙腈为流动相B，按表3程序进行线性梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为310nm，流速为每分钟1ml。
表3，梯度洗脱程序
Figure GDA0003096365320000091
表4，杂质的校正因子表
Figure GDA0003096365320000092
线性关系及校正因子考察证明：石杉碱甲和杂质A、杂质B的线性关系均良好，杂质A的校正因子为3.54，杂质B的校正因子为1.26，所以，定量方法应该采用加校正因子的自身对照法或外标法测定。
其中，本发明的色谱柱选自2个品牌的C18柱(GL Science Inc.，250×4.6mm，5μm，S/N：3BR98280和DIKMA，250×4.6mm，5μm，批号99603)。优选为，DIKMA C18柱(250×4.6mm，5μm)。
本发明的有益效果，主要表现在以下方面。
本发明的检测方法是经过大量实验优选得到的，实验过程如下：
一、色谱条件确立
参考中国药典2010年版二部(110页)石杉碱甲注射液有关物质的色谱条件，根据杂质特点，完善了有关物质分析方法的色谱条件，检测方法开发过程简要如下：
(1)按中国药典收载的有关物质色谱条件进行考察
中国药典(2010年版)收载的石杉碱甲注射液有关物质色谱条件如下：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH至2.5)-乙腈(86：14)为流动相；检测波长为310nm；进样体积为20μl；供试品溶液浓度按主药计为0.1mg/ml(0.01mol/L盐酸溶液为溶剂)。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于2.5％。
色谱条件1：按照药典收载的方法，以磷酸盐缓冲液(pH2.5)-乙腈(86：14)
为流动相，流速为1.0ml/min，柱温25℃，检测波长为310nm，进样体积为20μl；
色谱柱：2个品牌的C18柱(GL Science Inc.，250×4.6mm，5μm，S/N：3BR98280和DIKMA，250×4.6mm，5μm，批号99603)
供试品溶液：石杉碱甲原料药溶液
杂质分离情况见下表(表5)和图5。
表5，不同品牌色谱柱对杂质分离的影响
Figure GDA0003096365320000101
结果显示，两个品牌的色谱柱下，主峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，相对而言，C18柱(DIKMA，250×4.6mm，5μm，批号99603)的分离度稍高，选择DIKMA C18柱(250×4.6mm，5μm)进行深入研究。
(2)流动相pH对杂质分离能力的影响
为了改善杂质峰与主峰间的分离，通过改变流动相pH来考察杂质的分离情况(pH分别变为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.5，磷酸盐浓度均为0.02mol/L)。色谱条件2：采用DIKMA C18柱(250×4.6mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(不同pH)-乙腈(90：10)为流动相，流速为0.7ml/min，柱温30℃，检测波长为310nm，进样体积为20μl。
供试品溶液：石杉碱甲原料药溶液(符合中国药典2010年版二部要求，批号：
Q04130402，浓度约0.1mg/ml)。
比较结果见下表(表6)，pH5.55下的原料药溶液图谱见图6。
表6，不同流动相pH对杂质分离的影响
Figure GDA0003096365320000111
结果显示，流动相pH5.55条件下，主峰与相邻杂质峰分离度为3.7，达到基线分离(图6)，远优于pH2.5的流动相条件(图7)，因此设定流动相pH为5.55。色谱条件3：以磷酸盐缓冲液(pH5.55)-乙腈(90：10)为流动相，流速为1.0ml/min，
柱温30℃，检测波长为310nm，进样体积为20μl。
供试品溶液：同(1)下供试品溶液。
结果见图8。提高流速主峰出峰明显提前，且主峰与相邻杂质峰的分离度仍大于2.5，适合主峰与杂质的分离。
(3)特定杂质的出峰情况
根据石杉碱甲原料药易氧化降解的特点，分别进样降解杂质(杂质A和杂质B)以及工艺杂质(石杉碱乙，浙江省食品药品检验研究院，批号2012112701)定位溶液。同时，流动相水相采用乙酸-乙酸铵缓冲液(pH5.55，0.02mol/L)代替磷酸盐。确定最终条件为色谱条件4。
色谱条件4：采用DIKMA C18柱(250×4.6mm，5μm)，以0.02mol/L乙酸铵缓冲液(用乙酸调节pH值至5.55±0.1)为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为310nm，进样体积为20μl。
表7，梯度洗脱程序
Figure GDA0003096365320000112
Figure GDA0003096365320000121
供试品溶液：含有石杉碱甲浓度约为0.1mg/ml，以及定位用的特定杂质(杂质A、杂质B、杂质C和石杉碱乙)的混合溶液。
在该色谱条件下，主峰保留时间17.75分钟，杂质A保留时间为4.6分钟，石杉碱乙为8.2分钟，杂质B为28.3分钟，杂质C为32.4分钟。
二、有关物质分析方法的验证
(1)专属性
(a)杂质定位与分离试验
已知杂质的出峰顺序依次为杂质A、石杉碱乙和杂质B，石杉碱甲主峰与相邻杂质峰之间能基线分离，溶剂和辅料不干扰测定(表8)。
表8，已知杂质的出峰顺序与定位结果
溶液名称 组分物质 溶液浓度 保留时间(分钟)
溶剂 0.01mol/L盐酸溶液 —— 无响应
空白辅料 氯化钠 —— 无响应
杂质A 杂质A 0.150μg/mL 4.561
石杉碱乙 石杉碱乙 0.147μg/mL 8.064
参比溶液(a) 石杉碱甲 0.100mg/mL 17.924
杂质B 杂质B 0.151μg/mL 25.982
(b)杂强制降解试验
强制降解实验加速对石杉碱甲注射液破坏，同时以空白辅料和石杉碱甲原料药在相同条件下破坏作为对照，评估所建立分析方法的有效性和适用性。
表9，制剂强制降解试验物料平衡结果
0h 酸破坏 碱破坏 高温破坏 强光破坏 氧化破坏
C(mg/ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
物料平衡 100.0％ 96.2％ 98.7％ 97.2％ 96.9％ 98.9％
以未破坏溶液的响应为基数，计算破坏溶液的物料回收率，结果显示所有破坏试验物料基本平衡。
表10，制剂强制降解试验结果
Figure GDA0003096365320000122
Figure GDA0003096365320000131
设定阈值为990，当纯度因子大于990时，认为峰纯度符合要求，药物经强制降解后主峰的纯度均符合要求。空白辅料强制降解试验无杂质产生。石杉碱甲原料强制降解结果与制剂基本一致,除氧化破坏有新增杂质产生，酸破坏、碱破坏、高温破坏、光破坏条件下较稳定，与未破坏基本一致(表10)。
专属性试验结果表明，建立的色谱条件能有效分离3个特定杂质及强制破坏样品中杂质，且主峰纯度符合要求，显示该方法具有良好专属性。
(2)系统适用性试验
精密量取分离度溶液20μl注入液相色谱仪，记录的色谱图中，出峰顺序依次为杂质A、石杉碱乙、石杉碱甲和杂质B，结果见表11。
表11，分离度溶液
Figure GDA0003096365320000132
系统适应性试验表明：主峰与已知杂质，相邻杂峰之间的最小分离度为5.97(要求不得小于1.5)；重复进样3针参比溶液(b)中石杉碱甲峰面积RSD为0.74％，小于5％。
(3)检测限(LOD)和定量限(LOQ)
表12，杂质A的LOD和LOQ测定结果
Figure GDA0003096365320000141
表13，石杉碱乙的LOD和LOQ测定结果
Figure GDA0003096365320000142
表14，杂质B的LOD和LOQ测定结果
Figure GDA0003096365320000143
表15，未知杂质(石杉碱甲)的LOD和LOQ测定结果
Figure GDA0003096365320000144
(4)线性及范围
对已知杂质，在一定浓度范围内(LOQ浓度至不低于150％限度浓度)取6个浓度点进行研究。线性关系以测得峰面积对被分析物浓度作图，用最小二乘法进行线性回归，要求该线性回归系数不小于0.990。
对未知杂质，用石杉碱甲代表考察未知杂质的线性和范围。
校正因子：物质的吸收与浓度在一定范围内呈一定的线性规律，因此，可用带校正因子的0.1％主峰对照法代替外标法来计算已知杂质的含量。利用线性方程的y＝a+bx，主成分的斜率(b)与已知杂质的斜率(b)之比值即为该已知杂质的校正因子。
表16，杂质的校正因子
Figure GDA0003096365320000151
(5)精密度
(a)重复性
重复性是通过配制6个供试品溶液并进行测试。要求测定结果的杂质峰数一致，杂质之和的绝对偏差不得超过标准限度的20％(总杂质的标准限度为1.0％)，以此证实方法是否具有良好的精密度。
表17，重复性测定结果
Figure GDA0003096365320000152
(b)中间精密度
另一名分析员独立建立系统，重新配制6个供试品溶液进行检测。
表18，中间精密度测试结果
Figure GDA0003096365320000153
Figure GDA0003096365320000161
(6)准确度
准确度是通过供试品溶液中定量加入限度80％、100％、120％的已知杂质，测定并计算回收率所得。测定加样样品中该已知杂质总含量，扣除样品中的原杂质含量，再与加入量进行比较，即得回收率，以百分率％表示。
未知杂质用主药石杉碱甲来代替，用空白溶剂分别配制浓度为未知杂质限度80％、100％、120％的溶液。
用以计算的已知杂质对照溶液：浓度均约0.15μg/ml(0.15％)。未知杂质为参比溶液b(石杉碱甲浓度约为0.1μg/ml，0.10％)
表19，杂质A回收率测试结果
Figure GDA0003096365320000162
表20，石杉碱乙回收率测试结果
Figure GDA0003096365320000163
Figure GDA0003096365320000171
表21，杂质B回收率测试结果
Figure GDA0003096365320000172
表22，未知杂质回收率测试结果
Figure GDA0003096365320000173
(7)溶液稳定性
分离度溶液与供试品溶液在自然日光灯条件下的放置稳定性。将分离度溶液与供试品溶液放置0h、1.5h、3h、4.5h、7.5h、9h、12h后，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察有关物质变化情况，试验结果见下表。
表23，供试品溶液放置稳定性
Figure GDA0003096365320000181
表24，分离度溶液放置稳定性
Figure GDA0003096365320000182
以上实验结果显示：本发明所建立的有关物质的检测方法，该方法经过专属性、系统适用性、检测限和定量限、线性及范围、精密度、准确度、溶液稳定性等方法学研究，表明本法准确可靠，适用于石杉碱甲注射液和石杉碱甲原料药中有关物质的控制。
附图说明
图1：本发明方法检测中检院石杉碱甲对照品意外发现的未知杂质
图2：中国药典方法未能将中检院石杉碱甲对照品未知杂质分离
图3：杂质A氢核磁共振谱图
图4：杂质B氢核磁共振谱图
图5：中国药典方法检测原料药色谱图
图6：方法调整过程中pH5.55下流速0.7的原料药溶液色谱图
图7：方法调整过程中pH2.5的流动相条件色谱图
图8：确定的色谱方法的原料药溶液色谱图
图9：杂质A线性关系图
图10：石杉碱乙线性关系图
图11：杂质B线性关系图
图12：未知杂质线性关系图
图13：石杉碱甲Q04130401有关物质测定图谱
图14：石杉碱甲Q04130402有关物质测定图谱
图15：石杉碱甲Q04130403有关物质测定图谱
图16：石杉碱甲20130501有关物质测定图谱
图17：石杉碱甲Q04140601有关物质测定图谱
图18：石杉碱甲20140803有关物质测定图谱
图19：石杉碱甲注射液SSJY150701有关物质测定图谱
图20：石杉碱甲注射液SSJY150702有关物质测定图谱
图21：石杉碱甲注射液SSJY150703有关物质测定图谱
图22：石杉碱甲注射液SSJY130201有关物质测定图谱
具体实施方式
实施例是对本发明的进一步解释与说明，不意味以任何方式对本发明的保护范围进行限制。
实施例1石杉碱甲原料药有关物质测定
步骤1，供试品溶液的配制：取石杉碱甲适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，取杂质A对照品、杂质B对照品与石杉碱乙对照品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg的溶液，作为对照溶液；
步骤3，另取石杉碱甲对照品、杂质A对照品、杂质B对照品及石杉碱乙对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲对照品0.1mg、约含杂质A、杂质B和石杉碱乙各0.1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
步骤4，取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，主峰保留时间约为17.5分钟，出峰顺序依次为杂质A、石杉碱乙、石杉碱甲与杂质B，石杉碱甲主峰与各杂质峰之间的分离度均应符合要求；
步骤5，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤6，根据色谱图，按带校正因子的自身对照法计算杂质A、杂质B、石杉碱乙与未知杂质的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：固定相为C18；以0.02mol/L乙酸铵缓冲液(用乙酸调节pH值至5.55±0.1)为流动相A；以乙腈为流动相B，按表25程序进行线性梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为310nm，流速为每分钟1ml。
表25，梯度洗脱程序
Figure GDA0003096365320000201
表26，杂质的校正因子表
Figure GDA0003096365320000202
将收集到的不同生产厂家共6批市场样品，按上述方法测定，结果见表27，代表性图谱见图13～18。
表27，不同批次石杉碱甲有关物质测定结果
Figure GDA0003096365320000203
Figure GDA0003096365320000211
实施例2石杉碱甲注射液有关物质测定
步骤1，精密量取石杉碱甲注射液适量，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约含0.1mg石杉碱甲的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，取杂质A对照品、杂质B对照品与石杉碱乙对照品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg的溶液，作为对照溶液；
色谱方法同实施例1。
将收集到的不同4批样品，依法测定，结果见表28，代表性图谱见图19～22。
表28，不同批次石杉碱甲有关物质测定结果
Figure GDA0003096365320000212
实施例3、杂质A的制备及结构鉴定
杂质A的制备过程：
取2g石杉碱甲置于反应瓶中，加入200ml双氧水，置油浴回流过夜。将反应液冷却，加二氧化锰，搅拌，用淀粉碘化钾试纸测试不显蓝色为止。过滤，取滤液，35℃旋干，制备分离，得杂质A。
杂质A的鉴定过程：
本发明对杂质A进行核磁共振光谱(lH-NMR)和质谱(MS)结构确认，核磁共振光谱(lH-NMR)有关数据及解析见表29。
Figure GDA0003096365320000221
表29，样品的氢核磁共振光谱数据及归属
化学位移(ppm) 多重性 质子数 质子归属
1.15 s 3 a
1.70 d 3 b
1.85 d 1 d
1.87 d 1 d
2.78 d 1 c
2.96-3.02 m 2 f,c
3.65-3.66 m 1 e
5.61-5.66 q 1 g
6.51 d 1 h
7.98 d 1 i
解析：样品的的氢核磁共振谱图中，l位上的氨基上的质子和K位酰胺上的质子没有出峰，所以1H-NMR谱给出11种质子峰，相对于15个质子。
(1)δ1.15处有一单峰，当于3个质子，是a位的甲基峰。
(2)δ1.70处有一双重峰，相当于3个质子，是b位的甲基峰。
(3)δ1.85处有一双重峰，相当于1个质子，是d位的亚甲基峰。
(4)δ1.87处有一双重峰，相当于1个质子，是d位的亚甲基峰.
(5)δ2.78处有一双重峰，相当于1个质子，是c位的亚甲基峰.
(6)δ2.96-3.02处有一多重峰，相当于2个质子，是c位和f位的氢.
(7)δ3.65-3.66处有一组多重峰，相当于1个质子，是位于e位上的氢.
(8)δ5.61-5.66处为四重峰，相当于1个质子，是位于g位双键上的氢.
(9)δ6.51处有一双重峰，相当于1个质子，是吡啶环上h位的氢.
(10)δ7.98处有一双重峰，相当于1个质子，是吡啶环上i位的氢.
以上核磁氢谱的数据与杂质A氢核磁共振谱图(图3)相吻合。
质谱(MS)数据及解析见表30。
表30，样品的质谱数据解析表
m/e 相对丰度(％) 碎片离子峰 备注
259 100 [M+H]<sup>+</sup> M为样品的精确分子量
517 100 [2M+H]<sup>+</sup> 倍频峰
实施例4、杂质B的制备及结构鉴定
杂质B的制备过程：
取2g石杉碱甲置于反应瓶中，加入200ml双氧水，置油浴回流过夜。将反应液冷却，加二氧化锰，搅拌，用淀粉碘化钾试纸测试不显蓝色为止。过滤，取滤液，35℃旋干，制备分离，得杂质B。杂质B的鉴定过程：
本发明对杂质B进行核磁共振光谱(lH-NMR)和质谱(MS)结构确认，核磁共振光谱(lH-NMR)有关数据及解析见表31。
Figure GDA0003096365320000231
表31，样品的氢核磁共振光谱数据及归属
Figure GDA0003096365320000232
Figure GDA0003096365320000241
解析：样品的的氢核磁共振谱图中，q位上的氨基上的质子和p位酰胺上的质子没有出峰，所以1H-NMR谱给出10种质子峰，相对于15个质子。
(1)δ1.50处有一双重峰，当于3个质子，是b位的甲基峰。
(2)δ1.59处有一单峰，相当于3个质子，是a位的甲基峰。
(3)δ2.09-2.27处有一组多重峰，相当于2个质子，是d位的亚甲基峰。
(4)δ2.40-2.42处有一多重峰，相当于1个质子，是c位亚甲基的峰。
(5)δ2.62处有一双重峰，当于1个质子，是c位亚甲基的峰。
(6)δ3.10处有一dd峰，相当于1个质子，是e位的氢。
(7)δ3.47处有一组四重峰，相当于1个质子，是位于g位双键上的氢。
(8)δ5.43处为双重峰，相当于1个质子，是位于f位双键上的氢。
(9)δ6.45处有一双重峰，相当于1个质子，是吡啶环上h位的氢。
(10)δ7.83处有一双重峰，相当于1个质子，是吡啶环上i位的氢。
以上核磁氢谱的数据与杂质B氢核磁共振谱图(图4)相吻合。
质谱(MS)数据及解析见表32。
表32，样品的质谱数据解析表
m/e 相对丰度(％) 碎片离子峰 备注
259 100 [M+H]<sup>+</sup> M为样品的精确分子量
300 100 [M+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup> 乙腈加合峰
517 50 [2M+H]<sup>+</sup> 倍频峰

Claims (2)

1.一种石杉碱甲原料药有关物质的测定方法，其中使用如下化合物作为对照品：杂质A，化学名称为：(1R,2S,8R,9S,E)-8-氨基-10-亚乙基-9-甲基-2,3,4,8,9,9a-六氢-2,8-环氧乙烷基[2',3'：5,6]环辛四烯[1,2-b]吡啶-5-(1H)-酮
Figure FDA0003098982570000011
杂质B，化学名称为：(2'R,5S,9R)-5-氨基-3',7-二甲基-5,6,9,10-四氢螺[5,9-甲基环辛四烯[b]吡啶-11,2'-环氧基]-2(1H)-酮，
杂质B：
Figure FDA0003098982570000012
其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的配制：取石杉碱甲适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，取杂质A对照品、杂质B对照品与石杉碱乙对照品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg的溶液，作为对照溶液；
步骤3，另取石杉碱甲对照品、杂质A对照品、杂质B对照品及石杉碱乙对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲对照品0.1mg、约含杂质A、杂质B和石杉碱乙各0.1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
步骤4，取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，主峰保留时间约为17.5分钟，出峰顺序依次为杂质A、石杉碱乙、石杉碱甲与杂质B，石杉碱甲主峰与各杂质峰之间的分离度均应符合要求；
步骤5，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤6，根据色谱图，按带校正因子的自身对照法计算杂质A、杂质B、石杉碱乙与未知杂质的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：固定相为C18柱，DIKMA，250×4.6mm，5μm，批号99603；以0.02mol/L乙酸铵缓冲液为流动相A，所述乙酸铵缓冲液用乙酸调节pH值至5.55±0.1，以乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为310nm，流速为每分钟1ml，梯度洗脱程序为
Figure FDA0003098982570000021
其中，杂质A，杂质B，石杉碱乙的校正因子分别为3.54，1.26，1.14。
2.一种石杉碱甲注射液中有关物质的测定方法，其中使用如下化合物作为对照品：
杂质A，化学名称为：(1R,2S,8R,9S,E)-8-氨基-10-亚乙基-9-甲基-2,3,4,8,9,9a-六氢-2,8-环氧乙烷基[2',3'：5,6]环辛四烯[1,2-b]吡啶-5-(1H)-酮
Figure FDA0003098982570000031
杂质B，化学名称为：(2'R,5S,9R)-5-氨基-3',7-二甲基-5,6,9,10-四氢螺[5,9-甲基环辛四烯[b]吡啶-11,2'-环氧基]-2(1H)-酮，
杂质B：
Figure FDA0003098982570000032
其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，精密量取石杉碱甲注射液适量，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约含0.1mg石杉碱甲的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，取杂质A对照品、杂质B对照品与石杉碱乙对照品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
或用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约0.1μg的溶液，作为对照溶液；
步骤3，另取石杉碱甲对照品、杂质A对照品、杂质B对照品及石杉碱乙对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含石杉碱甲对照品0.1mg、约含杂质A、杂质B和石杉碱乙各0.1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液，
步骤4，取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，主峰保留时间约为17.5分钟，出峰顺序依次为杂质A、石杉碱乙、石杉碱甲与杂质B，石杉碱甲主峰与各杂质峰之间的分离度均应符合要求，
步骤5，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
步骤6，根据色谱图，按带校正因子的自身对照法计算杂质A、杂质B、石杉碱乙与未知杂质的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：固定相为C18，DIKMA，250×4.6mm，5μm，批号99603；以0.02mol/L乙酸铵缓冲液为流动相A，所述乙酸铵缓冲液用乙酸调节pH值至5.55±0.1，以乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为310nm，流速为每分钟1ml，梯度洗脱程序为
Figure FDA0003098982570000041
其中，杂质A，杂质B，石杉碱乙的校正因子分别为3.54，1.26，1.14。
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