CN104046581B

CN104046581B - 一株溶藻金黄杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用

Info

Publication number: CN104046581B
Application number: CN201410245446.0A
Authority: CN
Inventors: 杨虹; 郭星亮
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2014-06-04
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2034-06-04
Also published as: CN104046581A

Abstract

本发明公开了一株溶藻金黄杆菌及其在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY‑4205，保藏号为CGMCC No.8283，并且从其发酵产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分3‑异丙基‑六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮、7‑羟基‑3‑异丁基‑六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮、六氢‑3‑(2‑甲基丙基)‑吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮和六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮。上述四种溶藻物质对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为3.9、0.95、2.82和5.7μg/mL。除六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮对聚球藻BN60无致死效果外，其余三种溶藻物质对聚球藻BN60的半致死量LD50分别为17.19、1.31和3.84μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

Description

一株溶藻金黄杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，特别涉及一株具有溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205及其在蓝藻水华控制中的应用。

背景技术

近些年来湖泊富营养化导致的蓝藻水华爆发对湖泊水系的污染日益严重，太湖﹑巢湖﹑滇池等淡水水域都受到了严重的影响。因此探索控制蓝藻生物量和抑制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。

蓝藻水华的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法如机械除藻、电磁场除藻等可以作为水华爆发的辅助控制措施，但是缺点在于治标不治本，并且处理能力有限；化学方法如除草剂等化学杀藻剂可以直接杀死藻类，但这些化学物质的专一性差，而且容易富集在食物链中造成二次污染。

其中由于物理方法和化学方法存在上述缺陷，生物方法因其环保﹑经济等优点，受到越来越多的关注。针对蓝藻的溶藻细菌(algae-lysing bacteria)是一类可以直接(菌藻细胞接触)或者间接(分泌胞外物质)抑制灭杀蓝藻的细菌统称，它们是淡水生态环境系统的重要组成部分，对减少蓝藻的生物量，维持生态平衡具有重要作用。

因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。

发明内容

鉴于现有技术中物理方法和化学方法处理能力有限、容易造成二次污染的缺陷，本发明所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。

为实现上述目的，本发明提供了一株具有溶藻活性的金黄杆菌及其代谢产物在蓝藻水华控制中的应用。

本发明提供了一株具从太湖水体中分离获得的有溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205，该菌株为革兰氏阴性，杆状，大小为0.5μm～1.0μm×3.0μm～4.0μm，在液体培养基中摇床培养24h后，个别菌体长达8μm。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，黄色，菌落大小为2mm～3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某金黄杆菌菌株有99％的同源性，故鉴定为金黄杆菌属细菌，命名为金黄杆菌GLY-4205。

该菌种已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8283，保藏日期为2013年9月27日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是KC688880。

进一步地，本发明提供了上述金黄杆菌GLY-4205在控制蓝藻水华中的应用。

进一步地，本发明金黄杆菌GLY-4205在控制蓝藻水华中的应用方式可以是通过其发酵产物，包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。

金黄杆菌GLY-4205发酵产物的制备步骤如下：

1)、发酵金黄杆菌GLY-4205菌株，获得发酵液；

2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液；

3)、将萃取液蒸干，获得粗提物；

4)、将粗提物溶于水后过滤；

5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质，即为发酵液提取物。

优选地，步骤1)中，发酵条件为，金黄杆菌GLY-4205接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、200rpm环境条件下发酵48h。

优选地，步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即金黄杆菌GLY-4205发酵液的萃取液。

优选地，步骤3)中，过滤为使用0.22μm孔径滤膜过滤。

优选地，步骤4)中，进一步提纯手段为柱层析，具体为：将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到四种具有溶藻活性的有效成分4205-A、4205-B、4205-C和4205-D。

金黄杆菌GLY-4205的代谢产物中有效的溶藻成分的化学结构通过UPLC-ESI-MS﹑GC-EI-MS和NMR分析获得。

有效溶藻成分4205-A的分子离子峰为197.1285m/z，样品分子量为196.1212，分子式为C₁₀H₁₆N₂O₂，核磁共振谱结果是¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.37(1H,s,N-H),4.06(1H,t,J＝7.5Hz,H-6),3.92(1H,s,H-9),3.62(1H,m,H-3a),3.54(1H,dt,J＝8.9,2.6Hz,H-3b),2.61(1H,m,H-10),2.45-2.28(1H,m,H-5a),2.14-1.97(2H,m,H-4a,H-5b),1.93-1.86(1H,m,H-4b),1.06(3H,d,J＝7.2Hz,H-11),0.90(3H,d,J＝6.8Hz,H-12)；¹³H NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.93(C-7),45.07(C-3),22.31(C-4),28.35(C-5),60.38(C-9),170.13(C-1),58.76(C-6),28.48(C-10),16.01(C-11),19.11(C-12)。

有效溶藻成分4205-B的分子离子峰为227.1390m/z，样品分子量为226.1319，分子式为C₁₁H₁₈N₂O₃，核磁共振谱结果是¹H NMR(400MHz,dimethylsulphoxide-d₆(DMSO-d₆))δ8.00(1H,s,N-H),5.09(1H,d,J＝2.8Hz,4-OH),4.39(1H,dd,J＝10.6,6.7Hz,H-4),4.28(1H,d,J＝2.8Hz,H-9),4.05(1H,t,J＝6.1Hz,H-6),3.48(1H,dd,J＝12.3,4.4Hz,H-3a),3.23(1H,dd,J＝12.4,3.0Hz,H-3b),2.04(1H,dd,J＝13.0,6.7Hz,H-5a),1.98-1.82(2H,m,H-10),1.77(1H,ddd,J＝13.5,8.3,5.0Hz,H-11),1.42-1.25(1H,m,H-5b),0.87(6H,dd,J＝6.5,2.6Hz,H-12,H-13)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ170.71(C-1),166.60(C-7),67.05(C-4),57.08(C-6),53.70(C-3),52.53(C-9),37.75(C-10),36.65(C-5),24.06(C-11),22.79(C-13),21.89(C-12)。

有效溶藻成分4205-C的分子离子峰为211.1441m/z，样品分子量为210.1368，分子式为C₁₁H₁₈N₂O₂，核磁共振谱结果是¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.75(1H,s,N-H),4.09(1H,t,J＝8.2Hz,H-6),3.99(1H,dd,J＝9.5,3.5Hz,H-9),3.67-3.41(2H,m,H-3),2.32(1H,m,H-5a),2.22-1.94(3H,m,H-10a,5b,4a),1.94-1.78(1H,m,H-4b),1.77-1.63(1H,m,H-11),1.49(1H,ddd,J＝14.5,9.6,5.0Hz,H-10b),0.97(3H,d,J＝6.6Hz,H-13),0.92(3H,d,J＝6.6Hz,H-12)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ170.06(C-1),166.12(C-7),58.98(C-6),53.36(C-9),45.51(C-3),38.61(C-10),28.11(C-5),24.72(C-11),23.29(C-4),22.73(C-12),21.16(C-13)。

有效溶藻成分4205-D的分子离子峰为155.0821m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C₇H₁₀N₂O₂，核磁共振谱结果是¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.22(s,1H),4.06(dd,J＝17.3,2.7Hz,1H),3.77(d,J＝17.3Hz,1H),3.44(dd,J＝8.7,4.8Hz,2H),2.41–2.12(m,1H),2.09–1.71(m,3H)。

由此可以确定，上述金黄杆菌GLY-4205的发酵提取物中四种具有溶藻活性的有效成分4205-A、4205-B、4205-C和4205-D分别为具有结构式(Ⅰ)的3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、具有结构式(Ⅱ)的7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、具有结构式(Ⅲ)的六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和具有结构式(Ⅳ)的六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

经测定，上述四种溶藻物质对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为3.9(Ⅰ)、0.95(Ⅱ)、2.82(Ⅲ)和5.7(Ⅳ)μg/mL。除六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅳ)对聚球藻BN60无致死效果外，其余三种溶藻物质对聚球藻BN60的半致死量LD50分别为17.19(Ⅰ)、1.31(Ⅱ)和3.84(Ⅲ)μg/mL。

进一步地，本发明所提供的具有溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205可制成溶藻菌剂。

进一步地，本发明所提供的具有溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205的发酵产物，包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物，可制成溶藻药剂。

在本发明的实施例3中给出了金黄杆菌GLY-4205发酵液对下列藻株的溶藻效果数据。

4天溶藻率分别为：衣藻BS3为92.2±4.3％，绿藻B1为89.2±2.7％，铜绿微囊藻PCC7806为83.2±5.3％，铜绿微囊藻9110为82.1±2.8％，颤藻BN35为79.2±3.1％，绿色微囊藻FACHB-979为77.3±2.2％，聚球藻BN60为83±6.8％，色球藻FACHB-191为35.1±3.5％；

6天溶藻率分别为：衣藻BS3为95.2±4.1％，绿藻B1为97.8±1.7％，铜绿微囊藻PCC7806为92.7±2.5％，铜绿微囊藻9110为98.9±0.9％，颤藻BN35为97.6±2.2％，绿色微囊藻FACHB-979为89.1±6.2％，聚球藻BN60为98.1±1.3％，色球藻FACHB-191为40.5±2.9％。

本发明的金黄杆菌GLY-4205的溶藻效果具有广谱性。其发酵液制备方法简单，制备周期短。金黄杆菌GLY-4205的发酵液对太湖中的铜绿微囊藻9110、聚球藻BN60、绿藻B1、颤藻BN35等具有很好的溶藻效果，而铜绿微囊藻和聚球藻是太湖蓝藻水华中的主要蓝藻。金黄杆菌GLY-4205发酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制，且溶藻效果较好。其中，金黄杆菌GLY-4205发酵液对铜绿微囊藻9110的6天溶藻率达到98.9±0.9％，对聚球藻BN60的6天溶藻率达到98.1±1.3％。金黄杆菌GLY-4205的代谢产物3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅰ)、7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅱ)、六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅲ)和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅳ)对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60具有较好的致死作用，可用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

以下将结合附图对本发明的金黄杆菌GLY-4205菌株及其发酵产物3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅰ)、7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅱ)、六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅲ)和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(Ⅳ)在蓝藻水华控制中的效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是加入溶藻菌GLY-4205后铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间变化的曲线图；

图2是加入溶藻菌GLY-4205后聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间变化的曲线图；

图3是溶藻菌GLY-4205的发酵液乙酸乙酯萃取液加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果照片；

图4是溶藻菌GLY-4205的四种溶藻物质分别加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果照片；

图5是溶藻菌GLY-4205的四种溶藻物质分别加入到藻液中后，铜绿微囊藻9110的24小时存活率随加入的溶藻物质浓度变化的曲线图。

图6是是溶藻菌GLY-4205的四种溶藻物质分别加入到藻液中后，聚球藻BN60的24小时存活率随加入的溶藻物质浓度变化的曲线图。

具体实施方式

实施例1 溶藻细菌的筛选

将太湖梅梁湾水域采集的2mL自然水样加入到98mL对数期的铜绿微囊藻9110的藻液中，两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平板，28℃培养24h，取菌落密度适中的平板，按照菌落形态的不同挑选不同菌株。

将筛选出来的菌株分别接种入10mL牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃，220rpm培养24h，将2mL培养好的菌液分别加入98mL对数期铜绿微囊藻的藻液中。另外将2mL灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基同样加入98mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养48h后计算其溶藻效率，选取了其中溶藻效率最高的一株细菌进行进一步研究，该菌株代号为GLY-4205。

藻液培养条件：铜绿微囊藻9110用BG11液体培养基培养，放置于光照培养箱中，25℃，光照强度40μmol photons m^-2s^-1，光暗周期比为12h:12h(光照：黑暗)。

溶藻效率计算方法：溶藻效率(％)＝(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/对照组藻细胞密度×100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度用血球计数板测定。

图1为加入溶藻菌GLY-4205后铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的变化曲线(溶藻菌GLY-4205(2×10⁶CFU/mL)(◇)和空白对照(●))。

图2为加入溶藻菌GLY-4205后聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的变化曲线(溶藻菌GLY-4205(2×10⁶CFU/mL)(◇)和空白对照(●))。

实施例2金黄杆菌GLY-4205菌株的鉴定

用形态观察、染色、生理生化反应、16srRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的GLY-4205进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性，杆状，大小为0.5μm～1.0μm×3.0μm～4.0μm，在液体培养基中摇床培养24h后，个别菌体长达8μm。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，黄色，菌落大小为2mm～3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某金黄杆菌菌株有99％的同源性，故鉴定为金黄杆菌属细菌，命名为金黄杆菌GLY-4205。

实施例3 金黄杆菌GLY-4205发酵液及其乙酸乙酯萃取液的制备方法

将金黄杆菌GLY-4205按照1％接种量接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下220rpm摇床培养48h后得到金黄杆菌GLY-4205含菌发酵液，将上述发酵液8,000×g离心30min收集上清。将乙酸乙酯按照1：1的比例加入发酵液上清中，放入振荡器中振荡24h，分离出上层溶液，即乙酸乙酯萃取液。将乙酸乙酯蒸干，加水溶解，再使用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后用于进一步纯化代谢产物。

实施例4 金黄杆菌GLY-4205对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果比较

将8份培养好的(培养条件：pH7.0的牛肉膏蛋白胨培养基，28℃，200rpm培养24h)2mL金黄杆菌GLY-4205菌液分别加入6株蓝藻和2株真核藻(表1)的藻液中(98mL，所有藻液均培养到对数期)，同样使用2mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基分别加入8种藻液中(98mL，所有藻液均培养到对数期)作为对照，在光照培养箱中培养4天和6天后分别测定所有实验组和对照组的藻液的叶绿素浓度，计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样，表示成平均值±标准差的形式。

实验中用到的藻种有3株购自武汉水生所藻种库，另外5株筛选自太湖水体。实验结果表明，金黄杆菌GLY-4205的发酵液对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果，对色球藻FACHB-191没表现出很好的溶藻效果(表1)。此结果表明金黄杆菌GLY-4205的溶藻能力具有广谱性，是一种非常有潜力的溶藻细菌。

表1.金黄杆菌GLY-4205对8株藻株的溶藻效果

注：表中用星号(*)标记的藻株是从太湖无锡梅梁湾水体中筛选得到的，其余藻株都是购买自中国淡水藻种库。

金黄杆菌GLY-4205对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110溶藻效果如图1所示，对聚球藻BN60的溶藻效果如图2所示。图1表明，加入金黄杆菌GLY-4205后，铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而下降，第六天时的溶藻率为98.9±0.9％。而空白对照中铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而上升。其中金黄杆菌GLY-4205为2×10⁶CFU/mL。图2表明，加入金黄杆菌GLY-4205后，聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的延长而下降，第六天时的溶藻率为98.1±1.3％。而空白对照中聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的延长而上升。其中金黄杆菌GLY-4205为2×10⁶CFU/mL。

实施例5 GLY-4205菌株溶藻机制的研究

将金黄杆菌GLY-4205发酵液按照步骤3所述的方法制成乙酸乙酯萃取液，用离心干燥器蒸干后，用无菌水溶解后备用。最后把灭菌牛肉膏蛋白胨培养基同样离心干燥浓缩作为对照。将按照上述方法制得的萃取液以及浓缩牛肉膏蛋白胨对照分别加到圆纸片(直径0.5cm)上，放置于铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上。藻平板放入光照培养箱中培养2天后观察圆纸片周围的抑藻圈的形成以判断其溶藻效果。

铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法：向每块平板上倒入适量(约20mL)BG11琼脂培养基(琼脂比例1.5％)，待其凝固后备用。将300mL培养好的铜绿微囊藻藻液4000g离心20min后弃掉上清，收集藻细胞沉淀加入到100mL灭菌后的BG11软琼脂固体培养基中(1％琼脂，放置于53℃水浴中防止凝固)，摇匀后倒入制好的BG11固体平板上层(每块平板约倒入20mL)，待其凝固后放入光照培养箱中培养并备用。

实验结果如图3所示，显示金黄杆菌GLY-4205的发酵液萃取液有很好的溶藻效果，这表明该菌株具有分泌胞外溶藻物质进行溶藻的性能。

实施例6 金黄杆菌GLY-4205发酵产物中溶藻有效成分的提取纯化

利用HPLC技术将溶藻菌GLY-4205的溶藻发酵产物纯化，得到四种具有溶藻功能的纯化合物4205-A、4205-B、4205-C和4205-D，具体步骤如下：

将金黄杆菌GLY-4205发酵液的萃取液通过DIKMA公司的Supersil^TM C18-EP半制备柱，水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行初步纯化，得到溶藻有效成分。然后通过DIKMA Supersil^TM C18-EP分析柱，水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行进一步纯化，得到四种有效溶藻成分4205-A、4205-B、4205-C和4205-D，用于结构鉴定。

实施例7 金黄杆菌GLY-4205发酵产物中有效溶藻成分的化学结构鉴定

利用UPLC-ESI-MS﹑GC-EI-MS和NMR分析(核磁共振氢谱，碳谱和二维谱分析)具有溶藻功能的代谢产物的化学结构。并且，所有的结构信息都经过化学合成的标准品确认。

将纯化后的样品4205-A进行UPLC-ESI-MS分析，得到样品4205-A的分子离子峰为197.1285m/z，样品分子量为196.1212，分子式为C₁₀H₁₆N₂O₂。

将纯化后的样品4205-A进行GC-EI-MS分析，离子峰154、125、和70分别对应3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮分子(M)-C₃H₆,M-C₄H₉N和M-C₆H₈NO₂。

将样品4205-A进行核磁共振谱分析，得到以下结果：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.37(1H,s,N-H),4.06(1H,t,J＝7.5Hz,H-6),3.92(1H,s,H-9),3.62(1H,m,H-3a),3.54(1H,dt,J＝8.9,2.6Hz,H-3b),2.61(1H,m,H-10),2.45-2.28(1H,m,H-5a),2.14-1.97(2H,m,H-4a,H-5b),1.93-1.86(1H,m,H-4b),1.06(3H,d,J＝7.2Hz,H-11),0.90(3H,d,J＝6.8Hz,H-12)；¹³HNMR(101MHz,CDCl₃)δ164.93(C-7),45.07(C-3),22.31(C-4),28.35(C-5),60.38(C-9),170.13(C-1),58.76(C-6),28.48(C-10),16.01(C-11),19.11(C-12)。

将样品4205-A的UPLC-ESI-MS﹑GC-EI-MS和NMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的发酵产物4205-A是3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，其化学结构如下图所示。

将纯化后的样品4205-B进行UPLC-ESI-MS分析，得到样品4205-B的分子离子峰为227.1390m/z，样品分子量为226.1319，分子式为C₁₁H₁₈N₂O₃。

将纯化后的样品4205-B进行GC-EI-MS分析，离子峰86、170分别对应7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮分子(M)-C₆H₆NO₃、M-C₄H₈。

将样品4205-B进行核磁共振谱分析，得到以下结果：

¹H NMR(400MHz,dimethylsulphoxide-d₆(DMSO-d₆))δ8.00(1H,s,N-H),5.09(1H,d,J＝2.8Hz,4-OH),4.39(1H,dd,J＝10.6,6.7Hz,H-4),4.28(1H,d,J＝2.8Hz,H-9),4.05(1H,t,J＝6.1Hz,H-6),3.48(1H,dd,J＝12.3,4.4Hz,H-3a),3.23(1H,dd,J＝12.4,3.0Hz,H-3b),2.04(1H,dd,J＝13.0,6.7Hz,H-5a),1.98-1.82(2H,m,H-10),1.77(1H,ddd,J＝13.5,8.3,5.0Hz,H-11),1.42-1.25(1H,m,H-5b),0.87(6H,dd,J＝6.5,2.6Hz,H-12,H-13)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ170.71(C-1),166.60(C-7),67.05(C-4),57.08(C-6),53.70(C-3),52.53(C-9),37.75(C-10),36.65(C-5),24.06(C-11),22.79(C-13),21.89(C-12)。

将样品4205-B的UPLC-ESI-MS﹑GC-EI-MS和NMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的发酵产物4205-B是7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，其化学结构如下图所示。

将纯化后的样品4205-C进行UPLC-ESI-MS分析，得到样品4205-C的分子离子峰为211.1441m/z，样品分子量为210.1368，分子式为C₁₁H₁₈N₂O₂。

将纯化后的样品4205-C进行GC-EI-MS分析，与GC-EI-MS数据库中六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮的结构相似,相似性指数＞960。

将样品4205-C进行核磁共振谱分析，得到以下结果：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.75(1H,s,N-H),4.09(1H,t,J＝8.2Hz,H-6),3.99(1H,dd,J＝9.5,3.5Hz,H-9),3.67-3.41(2H,m,H-3),2.32(1H,m,H-5a),2.22-1.94(3H,m,H-10a,5b,4a),1.94-1.78(1H,m,H-4b),1.77-1.63(1H,m,H-11),1.49(1H,ddd,J＝14.5,9.6,5.0Hz,H-10b),0.97(3H,d,J＝6.6Hz,H-13),0.92(3H,d,J＝6.6Hz,H-12)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.06(C-1),166.12(C-7),58.98(C-6),53.36(C-9),45.51(C-3),38.61(C-10),28.11(C-5),24.72(C-11),23.29(C-4),22.73(C-12),21.16(C-13)。

将样品4205-C的UPLC-ESI-MS﹑GC-EI-MS和NMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的代谢产物4205-C是六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，其化学结构如下图所示。

将纯化后的样品4205-D进行UPLC-ESI-MS分析，得到样品4205-D的分子离子峰为155.0821m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C₇H₁₀N₂O₂。

将纯化后的样品4205-D进行GC-EI-MS分析，其中4205-D与GC-EI-MS数据库中六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的结构相似,相似性指数＞980。

将样品4205-D进行核磁共振谱分析，得到以下结果：

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.22(s,1H),4.06(dd,J＝17.3,2.7Hz,1H),3.77(d,J＝17.3Hz,1H),3.44(dd,J＝8.7,4.8Hz,2H),2.41–2.12(m,1H),2.09–1.71(m,3H)。

将样品4205-D的UPLC-ESI-MS﹑GC-EI-MS和NMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的代谢产物4205-D是六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮，其化学结构如下图所示。

实施例8金黄杆菌GLY-4205溶藻代谢产物3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的溶藻效能研究

使用上述GLY-4205菌株溶藻方式的研究中的方法，经实验发现3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-A)，7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-B)，六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-C)和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-D)在铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上能形成明显的抑藻圈，而空白对照则不会形成抑藻圈(图4)。

将上述四种溶藻物质分别加入太湖中主要的两种蓝藻即铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60中，使其浓度分别形成一个系列：0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.5、5、10、20、30、40、50和100μg/mL。将加入上述溶藻物质的铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60放入光照培养箱中培养24小时后测定溶藻率。实验结果表明，上述四种溶藻物质对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为3.9、0.95、2.82和5.7μg/mL；除六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮对聚球藻BN60无致死效果外，其余三种溶藻物质对聚球藻BN60的半致死量LD50分别为17.19、1.31和3.84μg/mL。此结果表明金黄杆菌GLY-4205的发酵产物3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮是十分有效的控制蓝藻的物质。

图5显示了加入不同浓度溶藻物质3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-A)、7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-B)、六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-C)和六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(4205-D)后铜绿微囊藻9110存活率变化曲线。图6显示了加入不同浓度上述四种溶藻物质后聚球藻BN60存活率变化曲线。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一株具有溶藻活性的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8283，保藏日期为2013年9月27日，所述金黄杆菌GLY-4205能发酵产生3-异丙基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、7-羟基-3-异丁基-六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

2.如权利要求1所述的金黄杆菌GLY-4205在控制蓝藻水华中的应用。

3.如权利要求1所述的金黄杆菌GLY-4205的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。

4.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205。

5.一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GLY-4205的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物或发酵液提取物。

6.一种控制蓝藻水华的方法，包括如下步骤：

1)、发酵权利要求1所述的金黄杆菌GLY-4205菌株，获得发酵液；

2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液；

3)、将萃取液蒸干，获得粗提物；

4)、将粗提物溶于水后过滤；

7.如权利要求6所述的方法，其中步骤1)中，发酵条件为，金黄杆菌GLY-4205接种于pH 7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、220rpm环境条件下发酵48h。

8.如权利要求6所述的方法，其中步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。

9.如权利要求6所述的方法，其中步骤5)中，所述进一步提纯手段为：将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到单一组分的有效溶藻成分。