CN1705662B - 埃坡霉素b的制备、分离和纯化的方法,及埃坡霉素b的x-射线晶体结构 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及埃坡霉素B的生产、分离和纯化的改进方法。例如，这些方法包括生产埃坡霉素B的发酵过程、通过在树脂上吸附的分离以及随后的纯化过程。

Description

埃坡霉素B的制备、分离和纯化的方法,及埃坡霉素B的X-射线晶体结构
相关申请
本申请要求以2002年9月23日提交的美国临时申请序号60/412,994为优先权。
发明领域
本发明涉及埃坡霉素(epothilone)B的生产、分离和纯化的改进方法。例如，这些方法包括生产埃坡霉素B的发酵过程、通过在树脂上吸附的分离以及随后的纯化过程。
发明背景
埃坡霉素是一类较新的大环内酯化合物，最初由粘细菌(纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum))发酵获得。由于这类化合物具有抗真菌的性质最初它们是作为植物保护剂进行研究。然后由于它们对动物细胞具有细胞毒活性埃坡霉素变得引人注意，后来将这种细胞毒活性表征为微管蛋白聚合剂。现在知道埃坡霉素能发挥类似于紫杉醇(
Figure S03822662619950430D000011
)的稳定微管效应和抗快速增殖细胞如肿瘤细胞或其它过度增殖细胞的疾病的细胞毒活性。埃坡霉素作为化疗剂的用途在Bollaget等，Cancer Research 55，2325，1995中有描述。
埃坡霉素A和B(分别为epo A或epo B)具有下面的结构，
Figure S03822662619950430D000012
埃坡霉素A R＝H
埃坡霉素B R＝Me
获得埃坡霉素的示意图由Hofle等在WO93/10121中揭示。Hofle在含碳源、氮源和无机盐的介质中培养了纤维堆囊菌的菌株。在该菌株的培养过程中加入了吸附剂树脂。用溶剂从吸附树脂上洗脱埃坡霉素。通过反相色谱法分离各种埃坡霉素并使其结晶。然而，Hofle等承认这种方法只能生产低数量的埃坡霉素B，以及在发酵中埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例也低。这种埃坡霉素B相对于埃坡霉素A的低比例使得纯埃坡霉素B的回收困难。因此，在技术上需要生产埃坡霉素B优于埃坡霉素A的改进的发酵方法，以及分离和纯化埃坡霉素B的改进方法。
发明概述
本发明涉及一种生产埃坡霉素B的改进的发酵方法。
本发明还包括用于埃坡霉素生产的通过诱变获得的纤维堆囊菌新菌株。
本发明还包括通过对发酵提供添加剂来提高纤维堆囊菌的新菌株生产的埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例的方法。在一优选的实施方案中，添加剂为丙酸盐、调节至合适的pH的丙酸或另一丙酸盐前体。
本发明还包括一种用于使用树脂从发酵培养基中分离埃坡霉素B的改进的萃取方法。还包括减少杂质含量和改进下游处理的洗涤富含埃坡霉素树脂的方法。
本发明还包括一种纯化埃坡霉素B的改进方法。在一实施方案中，利用结晶实现纯化。在另一实施方案中，通过色谱法实现纯化，其中色谱法包括正相色谱法或反相色谱法。在另一实施方案中，通过结晶与色谱分离法纯化样品相结合实现纯化，其中色谱分离法包括正相和反相色谱法。在进一步的实施方案中，树脂萃取物仅通过结晶处理。
埃坡霉素B(″epo B″)作为中间体用于衍生物1(″D1″)的制备中，(在美国专利6,262,094中作了描述，在此引入作为参考)，其中噻唑环上的2-甲基被胺取代：
衍生物1
埃坡霉素B也用于衍生物2(″D2″)的制备中(这种将埃坡霉素B内酯转化成衍生物2内酰胺的方法在Borzilleri等，J.Amer.Chem.Soc.122，8890，2000以及WO9902514中作了描述，在此引入作为参考)：
Figure S03822662619950430D000032
衍生物2
此外，埃坡霉素B(″epo B″)还用于衍生物3(埃坡霉素D，″D3″)的制备中(在美国专利6,320,045作了描述，在此引入作为参考)：
Figure S03822662619950430D000033
衍生物3
本发明还包括利用本文中描述的方法和材料生产的埃坡霉素B的晶形。
应当理解以上概述和以下的详细说明为本发明的示例，而不是限制本发明。
附图简述
本发明的优点、特性和各种特点似乎更充分地体现在附图上。附图中：
图1显示的是晶形epoB-EAβ的单斜晶胞中的分子结构，在该单斜晶胞的客通道(guest channel)中含两分子的埃坡霉素B和两分子的乙酸乙酯。
图2显示的是晶形epoB-ANβ的单斜晶胞中的分子结构，在该单斜晶胞的客通道中含两分子的埃坡霉素B和两分子的乙腈。
图3显示的是晶形epoB-Ipβ的单斜晶胞中的分子结构，在该单斜晶胞的客通道中含两分子的埃坡霉素B和两分子的异丙醇。
图4显示的是晶形epoB-Toβ的单斜晶胞中的分子结构，在该单斜晶胞客通道中含两分子的埃坡霉素B和两分子的甲苯。
图5显示的是埃坡霉素B的乙酸乙酯溶剂合物(晶形epoB-EAβ)的PXRD观察图(上部)和PXRD模拟图(底下)。在图5中，模拟图是根据-33℃下单斜晶结构中提炼的原子参数计算出的，观察图是在+23℃下测量得出的。
图6显示的是埃坡霉素B的甲苯溶剂合物(晶形epoB-TOβ)的PXRD观察图(上部)和PXRD模拟图(底下)。在图6中，模拟图是根据-33℃下单斜晶结构中提炼的原子参数计算出的，观察图是在+23℃下测量得出的。
图7显示的是埃坡霉素B的乙氰溶剂合物(晶形epoB-ANβ)的PXRD观察图(上部)和PXRD模拟图(底下)。在图7中，模拟图是根据-40℃下单斜晶结构中提炼的原子参数计算出的，观察图是在+23℃下测量得出的。
图8显示的是埃坡霉素B的异丙醇溶剂合物(晶形epoB-IPβ)的PXRD观察图(上部)和PXRD模拟图(底下)。在图8中，模拟图是根据-3℃下单斜晶结构中提炼的原子参数计算出的，观察图是在+23℃下测量得出的。
图9显示的是按照实施例7步骤A中描述的方法生产的含甲苯的初级的埃坡霉素B溶剂合物的PXRD观察图。
图10显示的是对于图9中含甲苯的初级的溶剂合物进行的热分析(DSC和TGA)。
图11显示的是按照实施例7步骤B中描述的方法生产的含甲苯的再结晶的埃坡霉素B的溶剂合物的PXRD观察图。
图12显示的是对于图11中含甲苯的再结晶的溶剂合物进行的热分析(DSC和TGA)。
图13显示的是按照实施例7步骤C中描述的方法生产的含乙酸乙酯的埃坡霉素B的溶剂合物的PXRD观察图。
图14显示的是对于图13中含乙酸乙酯的溶剂合物进行的热分析(DSC和TGA)。
图15显示的是按照实施例7C描述的方法制备的含甲苯的溶剂合物的PXRD观察图(上部)，连同室温下埃坡霉素B的甲苯溶剂合物的PXRD模拟图(底下)。
图16显示的是对于图15中含甲苯的溶剂合物进行的热分析(DSC和TGA)。
应当理解这些图是为了说明本发明的构思，本质上不是限制本发明。为了清楚在图1-4中埃坡霉素所有的甲基和亚甲基的氢原子都被忽略。在图1-4中，分子间氢键以虚线条显示在图的右下和左上部分，且氢键长(埃)是指分子间的氧-氧距离。
发明详述
本发明描述具体的处理方法和纤维堆囊菌的新突变株，这些突变株一起或单独地产生增加埃坡霉素B浓度的发酵，这主要是通过减少在发酵过程中埃坡霉素A产生的相对量实现的。例如，纤维堆囊菌或其它合适的微生物的细胞经一个或多个最初的成长期培养扩增，于是用于为产埃坡霉素发酵提供接种物。在发酵的第一时段期间，例如大约24-72小时，当细胞利用介质中的营养素时发生细胞生长。此后，将营养素，如维生素、矿物质、碳水化合物和氨基酸(或其它碳或氮源如氨基酸前体)以有助于埃坡霉素产生的量加入到介质中。在一实施方案中，将营养素如维生素、矿物质、碳水化合物和氨基酸以维持发酵过程中埃坡霉素A或埃坡霉素B的最大生产率的量加入。在一实施方案中，埃坡霉素A或埃坡霉素B的最大生产率是这样的生产率：与不加入添加剂或营养素相比产生更大量的埃坡霉素A或埃坡霉素B，也比添加剂或营养素以低于最佳的量加入时产生更大的生产率。在发酵过程中，将丙酸、其前体或其盐以有效增加埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例(″产物比例″)的量加入。
本发明还涉及用于生产埃坡霉素的纤维堆囊菌的新菌株。这些新菌株，尤其是菌株SC16408，已经通过诱变继之以随机选择获得。
纤维堆囊菌最初是1985年从南非Zambesi河的堤岸收集的土样中分离得到的。Hofle等首先描述了该生物产生埃坡霉素的特征(上面有引用)。Hofle等使用的菌株称为So ce90，并保藏在Deutsche Sammiungvon Mikroorganismen(German Collection of Microorganisms，DSM)，保藏号为6773。So ce90菌株经过UV诱变继之以随机选择产生Soce90B2菌株。So ce90B2菌株(也称为SC16224)生产的埃坡霉素B在振摇烧瓶(例如每个烧瓶中含1.8w/v％树脂)中的滴度为约50mg/L或2.8mg/g树脂例如可为3.5或4.5mg/g)，且埃坡霉素B/A的比例为约0.6。
本发明中，So ce90B2菌株或其衍生物经历用亚硝基胍(NTG)诱变、继之以随机选择产生SC16408菌株(以ATCC编号PTA-3880保藏)和SC16449(以ATCC编号PTA-3881保藏)。后面的两种菌株作为按照布达佩斯条约规定的专利保藏由美国标准菌库保藏。选择过程的详述在实施例中阐述。
在一实施方案中，本发明提供产生(例如，在以下定义的生产条件)下每升肉汤体积至少约100mg埃坡霉素B的纤维堆囊菌菌株。在另一实施方案中，本发明提供在生产埃坡霉素B的同等条件下产生每升肉汤体积至少80mg埃坡霉素B且埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例为至少1的纤维堆囊菌菌株。在一实施方案中本发明提供产生5mg埃坡霉素B/g树脂的埃坡霉素B、或产生5mg/g树脂的埃坡霉素B且埃坡霉素B/A的比例为至少1.0的菌株。在另一实施方案中，埃坡霉素B/A的比例为至少1.5。在另一实施方案中，埃坡霉素B/A的比例为至少1.5至4.0。
本发明还涉及通过对发酵供给添加剂提高纤维堆囊菌生产的埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例的方法。在优选的实施方案中，添加剂包括丙酸盐，在细胞已经生长直到96小时、但优选约24-48小时之后加入。在一些优选的实施方案中，在加入丙酸盐之前让细胞生长大约34小时。早期GBF的研究探查了，在影响发酵的其它因素中，丙酸盐加入到介质中的时间对于埃坡霉素B/埃坡霉素A(B/A)比例增加的改进产生0.1％的影响。本发明的发明人已经意外地发现通过供给丙酸盐或丙酸钠能明显提高埃坡霉素尤其是埃坡霉素B的滴度、以及在振摇烧瓶、14L发酵罐和生产发酵罐中产生的B/A比例是本发明的特点之一。供给丙酸盐或丙酸钠引起埃坡霉素B的滴度明显提高。例如，埃坡霉素B的烧瓶生产可通过以下方式提高：一旦开始供给就定期地(例如，每天)补充丙酸钠至优选范围0.05到0.80mg/ml(0.005-0.08％)内，更优选在0.005-0.04％的范围内，这可在培养物中进行监测。在一实施方案中，培养物中丙酸盐的量定在0.02％或更低。此外，还发现其它丙酸盐相关的化合物包括但不限于丙酸甲酯和丙酸乙酯能提高埃坡霉素B生产量和B/A比例。
在一实施方案中，尤其是用于烧瓶中的发酵，加入含磷酸二氢盐和磷酸氢盐混合物的其它进料，磷酸二氢盐和磷酸氢盐所选择的比例能维持合适的pH。可将这种进料掺入到丙酸盐进料中或分开加入。
本发明中，描述了大规模的埃坡霉素纯化的方法，该方法成功地利用了树脂的加入。发现这种树脂的掺入对于埃坡霉素的分离和纯化是有用的，它能显著地提高埃坡霉素的滴度。在本发明的一个优选的实施方案中，树脂为苯乙烯/二乙烯基苯聚合树脂，如XAD树脂，优选XAD-16或同等物(可以Amberlite XAD-16的商品名购自Sigma-Aldrich，St Louis，MO或Rohm和Haas公司，Philadelphia，PA)。其它带有疏水性表面的Amberlite树脂也可用于本发明中，如基于苯乙烯的XAD4、XAD-1180或XAD-1600(Rohm和Haas公司)，还有树脂如基于苯乙烯的XD-207、HP20、HP21、SP825、SP850、SP700或SP207(由于加入溴基团疏水性更强)(这些树脂由Mitsubishi，Tokyo，Japan或Mitsubishi Chemical America，Inc.White Plains，NY生产)。可将树脂以较宽的含量范围掺入介质中，如0.2w/v％至5.0w/v％，优选1.5w/v％至4.0w/v％。
含源自发酵的埃坡霉素的树脂任选地用水与20-30％乙腈水溶液或甲醇水溶液洗涤以除去极性杂质，或用含洗涤剂和一定量的胺的溶液洗涤(以碱形式加入到溶液中)，其中洗涤剂优选离子型洗涤剂如基于烷基硫酸盐的洗涤剂。选择各成分的量以提高后面的由树脂中获得的埃坡霉素萃取物的质量。一种优选的水洗涤剂使用了0.5w/v％十二烷基硫酸钠和0.5w/v％氨。在最后的实施方案中，在溶剂萃取之前优选地将树脂用水洗涤一次或多次。
优选地将含发酵获得的埃坡霉素用与水相不混溶的(不发生相分离的)溶剂如乙酸乙酯或甲基叔丁基醚(MTBE)萃取以移去吸附在树脂上的埃坡霉素。可用于萃取埃坡霉素B的其它溶剂包括正丁醇、乙酸异丙酯、乙酸正丙酯、乙酸正丁酯和乙酸叔丁酯。优选地将富溶剂萃取物浓缩，并将埃坡霉素B从浓缩物中结晶。在一实施方案中，将富溶剂用水洗涤，并将水洗涤过的富溶剂浓缩和任选地研磨过滤。当溶剂合适时，如为乙酸乙酯，通过将蒸镏溶剂交换到反溶剂中从而使埃坡霉素B结晶出来。换而言之，将相对高沸点的第二种溶剂(埃坡霉素B基本上不溶于其中)加入到富溶剂中，并将富溶剂蒸发至足以产生结晶。可用真空推进或促进蒸馏。在一实施方案中，将溶剂浓缩并加入适量的反溶剂。适用的反溶剂包括甲苯、己烷和庚烷。可将所得的浆液加热、并冷却至所选择的设定温度以提高产生的晶体的质量。可变化温度以提高晶体的纯度、使粉末减至最少、和产生更快的过滤浆液。对于其它的溶剂，如MTBE，蒸镏浓缩富溶剂能产生冷却时的有效结晶环境(不使用反溶剂)。优选地将所得的晶体过滤生产初级的埃坡霉素B。
在萃取和最初的结晶过程中埃坡霉素B与存在于初始萃取物中的大多数杂质尤其是埃坡霉素A分离。初级的埃坡霉素B通常含有埃坡霉素A，它是一种主要杂质。通常还存在由发酵产生的两种其它的结构相似的杂质，即下面的噁唑类似物和乙基噻唑类似物
噁唑                                                                乙基噻唑
随后使用的本文中描述的用于埃坡霉素B纯化的方法(包括再结晶和色谱分离步骤)尤其包括除去这两种化合物至它们的含量不再显著。
然后可将初级的埃坡霉素B(即含甲苯的晶形epo B，初级)，优选按上述方法获得的埃坡霉素B，通过在乙酸乙酯中加热接着加入甲苯并继续加热再结晶。然后冷却该混合物，将所得的结晶浆液过滤并用甲苯洗涤滤饼得曾经再结晶的埃坡霉素B(即含甲苯的晶形epoB，再结晶的)。另外，可将初级的埃坡霉素B经实施例中描述的制备型高效反相色谱(例如，在RP/C-18柱上)步骤处理。任选地，在将埃坡霉素样品装入柱子之前，预先加入一定体积的合适的有机溶剂或有机溶剂的混合物以减少埃坡霉素沉淀。在一实施方案中，有机溶剂为诸如二甲亚砜(DMSO)的有机溶剂。任选地，加入痕量的合适的有机溶剂或有机溶剂的混合物以减少埃坡霉素沉淀。然后用合适的有机溶剂、有机溶剂的混合物或有机溶剂的水溶液洗脱。在一实施方案中，用乙腈和水的混合物洗脱埃坡霉素。例如，使用这类溶剂的洗脱图可以是线性的或梯度的，对其进行选择以获得低的杂质含量。将含埃坡霉素B的部分合并、浓缩、并用包括但不限于乙酸乙酯的溶剂萃取。然后将该富溶剂的萃取物浓缩和结晶(例如通过加入低极性溶剂如正庚烷或庚烷)，任选地冷却。过滤浆液，用溶剂/反溶剂(所选择的比例和量不致溶解大量的埃坡霉素B)如比例为2∶1的乙酸乙酯/正庚烷洗涤。将洗涤过的晶体干燥得高质量的埃坡霉素B。
也可使用其它的提纯方法，例如在正相(如硅土、或以硅土为基础的正相等)色谱分离法。例如，可应用高效正相色谱分离法。可将样品以较低极性的溶剂如二氯甲烷装在柱子上，并用较高极性的溶剂如乙酸乙酯和庚烷的混合物洗脱埃坡霉素。例如，使用这类溶剂的洗脱图可以是线性的或梯度的，对其进行选择以获得低的杂质含量。将该需要的部分合并、浓缩和结晶，例如通过加入低极性溶剂如正庚烷、庚烷或甲苯从乙酸乙酯中结晶。过滤浆液，用溶剂/反溶剂(所选择的比例和量不致溶解大量的埃坡霉素B)如比例为2∶1的乙酸乙酯/正庚烷或乙酸乙酯/甲苯洗涤。将洗涤过的晶体干燥得高质量的埃坡霉素B。
在某些情况下不需要除去乙基噻唑或噁唑类似物，如在D1的合成中，可通过单独结晶纯化埃坡霉素B。例如，将固体埃坡霉素B物溶解在温热的乙酸乙酯中并通过冷却至环境温度或通过冷却器结晶(或再结晶)，接着过滤并干燥(例如，在真空中)。可重复结晶以获得所需的纯度，如结晶2至3次。
例如，用于使产埃坡霉素的微生物生长的生长培养基可配制如下：
组分 优选(g/L)  更优选(g/L) 更更优选(g/L)
脱脂乳粉 0.5-12  1-8  2-6
烤Nutrisoy粉1 0.5-12 1-8 2-6
Tastone-1541 0.5-12  1-6  1-4
Maltrin-M0401 4-18  6-14  8-12
CaCl2·2H2O 0.2-2.4  0.4-1.6  0.8-1.2
MgSO4·7H2O 0.2-2.4  0.4-1.6  0.8-1.2
EDTA，Felll，Na盐 0.002-0.02 0.004-0.016 0.006-0.014
HEPES 6-20  8-16  10-14
甘油 0.5-12  1-8  2-6
1也可以其它脱脂乳、豆粉、酵母萃取物和Maltrin淀粉替换使用取得同等的结果。
例如用于使产埃坡霉素的微生物生长和用于生产埃坡霉素的生产培养基，尤其是振摇烧瓶中的培养基，可按上述配方进行配制，只是甘油有如下的差异、以及有下述的树脂的加入：
  组分   优选(g/L)   更优选(g/L)   更更优选(g/L)
  甘油   2-20   4-16   6-14
  树脂   10-40   12-35   15-30
有效的营养料液，尤其是用于振摇烧瓶中的营养料液，含有：
  组分   优选(％)
  丙酸钠   2-5
  Maltrin-M040   8-12
  Tastone-154   2-5
这种营养料液可进一步含如下的磷酸二钠和磷酸一钠的混合物：
  组分   优选(％)
  磷酸二钠   1.0-2.0
  磷酸一钠   0.3-0.7
选择磷酸二钠与磷酸一钠的比例以使加料时培养物偏离所需的pH的pH变化最小。
为了在发酵罐中使用，优选地将如上所述的除HEPES(优选地将HEPES除掉)之外的营养组分与消泡剂(例如源自Dow Corning，AFEmulsion，食品级)一起使用，消泡剂的加入如下：
  组分   优选(g/L)   更优选(g/L)   更更优选(g/L)
  消泡剂   0.5-5   1-4.5   1.5-4
可将苛性碱(氢氧化钠或氢氧化钾溶液)加入到发酵培养基中以维持有效的pH范围。树脂可加入如下：
  组分   优选(g/L)   更优选(g/L)   更更优选(g/L)
  树脂   10-50   12-45   15-40
在生产发酵过程中，优选地将丙酸盐和营养素根据需要分开加入。例如，丙酸盐进料可含80至150g/L丙酸钠，所加入的最优选的量应将丙酸盐含量维持(例如，由HPLC测定)在0.05至0.20mg/ml。可在将起始培养物加入到发酵罐20-40小时之后开始加入丙酸盐。补充营养素，例如补充下述的无菌原料：
  组分   优选(g/L)
  Tastone-154   15-25
  Maltrin-M040   55-75
  消泡剂   0.5-1.5
对于较长时期的发酵，优选地加入其它营养素，例如加入下述无菌的原料，与前述的原料相比其加入量较大：
  组分   优选(g/L)
  脱脂乳粉   40-60
  Maltrin-M040   140-180
  甘油   60-90
  消泡剂   0.5-1.5
可对上述两种营养素进行选择以防止引发生长期。
本发明包括生产埃坡霉素B的方法，其中埃坡霉素B(″epo B″)被转化为下式的衍生物1(″D1″)(在美国专利6,262,094中有记载，在此引入作为参考)：
Figure S03822662619950430D000131
衍生物1
本发明还包括生产埃坡霉素B的方法，其中埃坡霉素B被转化为下式的衍生物2(″D2″)(在Borzilleri等，J.Amer.Chem.Soc.122，8890，2000和WO99/02514中有记载，在此引入作为参考)：
Figure S03822662619950430D000132
衍生物2
本发明还包括生产epothiione B的方法，其中epothiione B(″epoB″)被转化为下式的衍生物3(埃坡霉素D，″D3″)(在美国专利6,320,045中有记载，在此引入作为参考)：
衍生物3
埃坡霉素B的晶形
申请人还利用本发明的方法和本文中描述的物质已经获得多种埃坡霉素B的晶形。利用不同的溶剂和溶剂体系获得了多种埃坡霉素B晶体。例如，申请人已经发现了含甲苯的埃坡霉素B溶剂合物晶形，本文中称为epoB-Toβ，该晶形具有下面的表1所报告的晶胞数据。埃坡霉素B含甲苯的溶剂合物的晶形进一步用本文中的图9-12和图15和16说明。申请人还利用乙腈(即epoB-ANβ)、乙酸乙酯(即epoB-Eaβ)、和异丙醇(即epoB-Ipβ)、以及在下面的实施例中所述的溶剂体系获得了多种埃坡霉素B晶体。这些结晶学的异构形式具有单斜晶笼形结构，其中P21晶架群含有亲脂性溶剂通道，这些通道沿b轴贯穿整个晶体(1个通道/晶胞)。每个通道可容纳最高达两个溶剂分子如甲苯、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇、或MTBE(理想地产生1∶1的埃坡霉素B溶剂合物)。从甲苯/乙酸乙酯的溶剂混合物(例如，1∶1混合物)中结晶导致甲苯优先掺入到笼形结构的通道中(即，获得晶形epoB-TOβ，而不是epoB-EAβ)。埃坡霉素的氢键给体(羟基)包含于埃坡霉素间的氢键中，不能有效地与客溶剂结合，而是抑制这种结合。
晶形epoB-TOβ、epoB-ANβ、epoB-EAβ和epoB-IPβ显示出表1所示的晶胞数据：获得这些含甲苯、乙腈、乙酸乙酯和异丙醇的晶形的结晶结晶条件在下面的实施例中给出。利用实施例7中描述的方法制备的晶体的PXRD图显示在图9、11和13中，在下面还作了进一步的描述。
制成表的这些晶形的具体示例性的参数如下，如表1所示：
晶形
epoB-TOβ  按实施例8A的描述从甲苯中结晶
epoB-ANβ  按实施例8B的描述从乙腈中结晶
epoB-EAβ  按实施例8C的描述从乙酸乙酯(ETOAc)中结晶
epoB-IPβ  按实施例8D的描述从异丙醇(IPA)中结晶
epoB-ANβ、epoB-EAβ、epoB-IPβ和epoB-Toβ的部分原子坐标分别如表2、3、4和5所示。图9、11和13显示的PXRD图由下面的表6、7和8中所列的数据表征。
Figure S03822662619950430D000161
表2
埃坡霉素B乙腈溶剂合物的部分原子坐标EpoB-ANβ晶形(大部分氢原子被忽略)
原子    X         Y         Z
C1      0.4422    0.2380    0.3076
C2      0.5619    0.2882    0.3165
C3      0.6422    0.1833    0.3013
C4      0.7565    0.2263    0.2807
C5      0.8531    0.2847    0.3800
C6      0.8409    0.4180    0.4193
C7      0.8968    0.4218    0.5419
C8      0.8360    0.3345    0.5975
C9      0.7205    0.3935    0.6018
C10     0.6345    0.2947    0.6184
C11     0.5287    0.3609    0.6355
C12     0.4328    0.2722    0.6397
C13     0.3118    0.2674    0.5573
C14     0.2626    0.3435    0.4562
C15     0.2748    0.2789    0.3613
O16     0.3977    0.3084    0.3684
C16     0.7197    0.3194    0.1878
C17     0.8080    0.1051    0.2508
C18     0.9083    0.5112    0.3717
C19     0.9258    0.3048    0.7095
C20     0.4763    0.1572    0.7109
C21     0.1833    0.3270    0.2580
C22     0.1927    0.4656    0.2359
C23     0.1008    0.2458    0.1993
C24     -0.0043   0.2676    0.1034
C25     -0.0708   0.1728    0.0409
C26     -0.1519   0.3799    -0.0163
C27     -0.2252   0.4942    -0.0664
S       -0.1936   0.2297    -0.0595
N       -0.0507   0.3873    0.0719
O1      0.3897    0.1501    0.2552
O2      0.6748    0.1045    0.3926
O5      0.9464    0.2278    0.4266
O7      0.8893    0.5485    0.5778
O12     0.3313    0.3359    0.6550
H3      0.5936    0.1283    0.2313
H6      0.7466    0.4426    0.3937
H7      0.9913    0.3942    0.5683
H8      0.8117    0.2471    0.5514
H13     0.2618    0.1794    0.5410
H15     0.2633    0.1778    0.3662
H3O     0.6691    0.0154    0.3705
H7O     0.9636    0.5994    0.5825
N27     0.4609    0.5049    0.0188(乙腈)
C28     0.3963    0.4080    0.0038(乙腈)
C29     0.3379    0.2975    -0.0775(乙腈)
表3
埃坡霉素B乙酸乙酯溶剂合物的部分原子坐标晶形EpoB-EAβ(大部分氢原子被忽略)
原子    X         Y         Z
C1      0.4400    0.2438    0.3107
C2      0.5605    0.2943    0.3190
C3      0.6416    0.1904    0.3056
C4      0.7559    0.2327    0.2857
C5      0.8532    0.2913    0.3822
C6      0.8410    0.4228    0.4212
C7      0.8957    0.4275    0.5404
C8      0.8319    0.3405    0.5928
C9      0.7164    0.4000    0.5966
C10     0.6298    0.3042    0.6134
C11     0.5231    0.3717    0.6266
C12     0.4266    0.2844    0.6321
C13     0.3066    0.2780    0.5503
C14     0.2581    0.3526    0.4526
C15     0.2706    0.2867    0.3589
O16     0.3940    0.3148    0.3668
C16     0.7203    0.3272    0.1940
C17     0.8079    0.1121    0.2559
C18     0.9092    0.5160    0.3757
C19     0.9227    0.3099    0.7056
C20     0.4667    0.1703    0.7040
C21     0.1800    0.3335    0.2576
C22     0.1887    0.4688    0.2331
C23     0.0962    0.2506    0.2011
C24     -0.0076   0.2687    0.1042
C25     -0.0762   0.1706    0.0472
C26     -0.1515   0.3743    -0.0242
C27     -0.2158   0.4821    -0.0821
S       -0.1923   0.2232    -0.0566
N       -0.0487   0.3847    0.0652
O1      0.3878    0.1559    0.2575
O3      0.6749    0.1137    0.3972
O6      0.9464    0.2337    0.4280
O7      0.8889    0.5526    0.5755
O12     0.3257    0.3484    0.6457
H3      0.5927    0.1346    0.2372
H6      0.7463    0.4478    0.3947
H7      0.9884    0.3992    0.5620
H8      0.8080    0.2533    0.5499
H13     0.2573    0.1911    0.5357
H15     0.2575    0.1863    0.3624
H3O     0.6713    0.0150    0.3759
H7O     0.9745    0.5994    0.5930
O28     0.5242    0.5794    0.0077(乙酸乙酯)
O31     0.4179    0.4326    0.0063(乙酸乙酯)
C28     0.4731    0.5098    0.0256(乙酸乙酯)
C29     0.4265    0.4705    0.0892(乙酸乙酯)
C31     0.3610    0.3621    -0.0408(乙酸乙酯)
C30     0.2548    0.3272    -0.0460(乙酸乙酯)
表4
埃坡霉素B，异丙醇溶剂合物，EpoB-IPβ晶形的部分原子坐标(大部分氢原子被忽略)
原子      X         Y         Z
C1        0.4418    0.2548    0.3104
C2        0.5609    0.3055    0.3186
C3        0.6429    0.2009    0.3049
C4        0.7565    0.2462    0.2851
C5        0.8541    0.3018    0.3837
C6        0.8410    0.4357    0.4229
C7        0.8977    0.4390    0.5415
C8        0.8345    0.3493    0.5940
C9        0.7184    0.4107    0.5972
C10       0.6325    0.3111    0.6156
C11       0.5261    0.3793    0.6303
C12       0.4292    0.2892    0.6329
C13       0.3087    0.2842    0.5528
C14       0.2607    0.3630    0.4551
C15       0.2736    0.2932    0.3613
O16       0.3950    0.3241    0.3669
C16       0.7179    0.3380    0.1935
C17       0.8084    0.1250    0.2541
C18       0.9098    0.5290    0.3774
C19       0.9269    0.3222    0.7069
C20       0.4742    0.1736    0.7031
C21       0.1807    0.3387    0.2590
C22       0.1879    0.4780    0.2352
C23       0.1028    0.2530    0.2009
C24       -0.0041   0.2724    0.1029
C25       -0.0678   0.1712    0.0456
C26       -0.1517   0.3781    -0.0198
C27       -0.2289   0.4888    -0.0775
S         -0.1896   0.2262    -0.0575
N         -0.0526   0.3893    0.0653
O1        0.3903    0.1657    0.2594
O3        0.6763    0.1239    0.3954
O5        0.9485    0.2459    0.4293
O7        0.8898    0.5642    0.5781
O12       0.3283    0.3539    0.6476
H3        0.5946    0.1457    0.2365
H6        0.7464    0.4597    0.3977
H7        0.9915    0.4115    0.5668
H8        0.8111    0.2625    0.5504
H13       0.2582    0.1971    0.5380
H15       0.2640    0.1927    0.3679
H3O      0.6731    0.0260     0.3733
H7O      0.9599    0.6223     0.5696
O28      0.4344    0.2122     0.0495(异丙醇)
C28      0.3601    0.2863     -0.0462(异丙醇)
C30      0.4351    0.3798     -0.0762(异丙醇)
C29      0.2460    0.3279     -0.0487(异丙醇)
表5
埃坡霉素B乙腈溶剂合物的部分原子坐标晶形EpoB-TOβ，(大部分氢原子被忽略)
原子      X         Y         Z
C1        0.4314    0.2211    0.3158
C2        0.5581    0.2739    0.3228
C3        0.6395    0.1714    0.3110
C4        0.7506    0.2081    0.2888
C5        0.8509    0.2746    0.3880
C6        0.8414    0.4043    0.4212
C7        0.8976    0.4053    0.5382
C8        0.8372    0.3234    0.5911
C9        0.7204    0.3812    0.5930
C10       0.6312    0.2790    0.6075
C11       0.5255    0.3494    0.6227
C12       0.4302    0.2588    0.6250
C13       0.3014    0.2537    0.5473
C14       0.2538    0.3361    0.4501
C15       0.2643    0.2640    0.3626
O16       0.3877    0.2964    0.3648
C16       0.7158    0.3123    0.2026
C17       0.8082    0.0907    0.2610
C18       0.9061    0.4961    0.3806
C19       0.9323    0.2951    0.6989
C20       0.4703    0.1447    0.6945
C21       0.1702    0.3170    0.2598
C22       0.1709    0.4486    0.2391
C23       0.0898    0.2230    0.2030
C24       -0.0145   0.2462    0.1060
C25       -0.0811   0.1430    0.0546
C26       -0.1432   0.3561    -0.0251
C27       -0.2089   0.4563    -0.0926
S         -0.1987   0.1985    -0.0555
N         -0.0507   0.3632    0.0580
O1        0.3838    0.1303    0.2676
O3        0.6742    0.0956    0.3983
O5        0.9468    0.2169    0.4313
O7        0.8912    0.5329    0.5727
O12       0.3254    0.3255    0.6408
H3        0.5816    0.1062    0.2496
H6        0.7457    0.4264    0.3944
H7        0.9919    0.3719    0.5628
H8        0.8141    0.2297    0.5521
H13    0.2871    0.1529    0.5221
H15    0.2567    0.1589    0.3722
H3O    0.6633    -0.0002   0.3785
H7O    0.9663    0.5756    0.5776
C28    0.4258    0.4317    0.0030(甲苯)
C29    0.3526    0.3996    0.0429(甲苯)
C30    0.2586    0.3239    0.0126(甲苯)
C31    0.2245    0.2386    -0.0713(甲苯)
C32    0.2984    0.2800    -0.1182(甲苯)
C33    0.3923    0.3496    -0.1016(甲苯)
C34    0.5043    0.4979    -0.0119(甲苯)
表6
埃坡霉素B含甲苯的溶剂合物的PXRD数据，利用实施例7的方法步骤A生产如图9所示
Figure S03822662619950430D000251
表7
埃坡霉素B含甲苯的溶剂合物的PXRD数据，利用实施例7的方法步骤B生产，如图11所示
表8
埃坡霉素B含乙酸乙酯的溶剂合物的PXRD数据，利用实施例7的方法步骤C生产，如图13所示
Figure S03822662619950430D000261
定义
就本申请而言，下列术语有如下所述的各自的含义：
“埃坡霉素B比较生产条件。”为了测量埃坡霉素B相对于埃坡霉素A的生产量，或菌株之间埃坡霉素B的净生产量，需要标准的条件。埃坡霉素B比较生产条件″的含义如下。应当注意标准条件可以按实施例中的描述进行适当地换算(例如，按照实施例2中的125mL生产烧瓶换算)：
1)F1阶段：
将1mL冷冻的小瓶或维持烧瓶转入125mL装有约(ca.)10mL培养基E(如下所述的组合物)的烧瓶中。将F1烧瓶在30℃和160rpm下保温3-4天。
2}F2阶段：
将F1烧瓶(约10mL)中的全部内容物转入(10％)250mL含90mL培养基E的烧瓶中。将该F2烧瓶同样在30℃和160rpm下保温3-4天。
3)生产阶段：
将生产烧瓶(250mL装有90mL培养基E的烧瓶，参见下面的培养基配方)以F2阶段培养物灌输至10％的量(10mL)。另外，可以运用″固定烧瓶″，这些固定烧瓶由常规烧瓶每3-4天移植5％至10％的量而来。生产阶段掺入至少15g/L的树脂。一旦接种，生产烧瓶就在30℃和160rpm下保温14天。掺入进料以提高埃坡霉素B/A的比例。进料从接种后72小时开始加入如下：
每个生产烧瓶(100mL培养物容量)每天加入1mL进料，从3-11天开始，需要时继续加入直到第14天。
含丙酸盐的进料装有10％Maltrin-M040、4％丙酸钠、和3％Tastone-154，这样当按所述方式以100倍稀释倍数加入时，每天在培养肉汤中的最终浓度变成0.1％Maltrin-M040、0.04％丙酸钠、和0.03％Tastone-154(不包括先前加入的剩余含量)。通常采集烧瓶用于接种后14天的分析。
“丙酸前体”是指可以有效产生丙酸的量加入到适当的培养物中的任何化合物，其中丙酸的量能有效增加埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例。例如，丙酸可以用不稳定的酯通过细胞的酶作用自然产生。本领域的普通技术人员能识别用于产生丙酸或用于增加埃坡霉素B与埃坡霉素A的比例易于试验的侯选化合物。例子包括丙酸的甲酯和乙酯。
“进料，”是指将至少一种或多种营养素或添加剂，如丙酸盐、丙酸钠、含丙酸钠的混合物或溶液、维生素、矿物质、碳水化合物源或氨基酸源，在发酵过程期间不只一种场合加入，例如定时地、通过脉动进料、通过基本上连续进料等等。应当理解术语“不只一次加入”的含义包括在整个发酵期间连续进料。
“含甲苯”是指一种主要含一定量的甲苯溶剂合物，甲苯的量可由本领域的技术人员运用分析技术进行测量，其中含甲苯的溶剂合物可含有也可不含有一种或多种其它溶剂。
“含乙酸乙酯”是指一种主要含一定量的乙酸乙酯的溶剂合物，乙酸乙酯的量可由本领域的技术人员运用分析技术进行测量，其中含乙酸乙酯的溶剂合物可含有也可不含有一种或多种其它溶剂。
实施例
以下实施例是使用本领域技术人员公知的和常规的标准技术进行的，除另有详细的说明外。这些实施例是示例性的，但不限制本发明。
实施例1
通过突变和选择制备SC16408菌株，以及制备细胞库
SC16408菌株由亚硝基胍(NTG)处理So ce90B2菌株(SC16224)、继之以随机选择而产生。这样，将SC16224悬浮在10mM Tris-HCl缓冲液中并在pH8.2下经受1mg/mL NTG处理60分钟。用NTG处理后，通过菌落选择获得菌落细胞系并试验其埃坡霉素B的生产能力、和B/A的比例。将分离的菌落转入烧瓶中培养8-14天，接着在生长培养基(培养基E)每隔3-4天转移一次：
用于振摇烧瓶的生长培养基E：
  组分   g/L
  脱脂乳粉   4
  烤Nutrisoy粉   4
  Tastone-154   2
  Maltrin-M180   10
  CaCl2·2H2O   1
  MgSO4·7H2O   1
  EDTA，Felll，Na盐   0.008
  HEPES   12
  甘油   4.3
将上述组分加入到蒸馏水中并用10％NaOH(或KOH)将pH调至pH7.2后在121℃下灭菌30分钟。
研究细胞库的制备：将10mL SC16408菌株的3天培养物转入装有90mL培养基E的250mL烧瓶中。然后将烧瓶在30℃、160rpm下保温2天。在2天结束时，从烧瓶中取出1.8mL试样量并转入低温的小瓶中，然后在-70℃下冷冻。
原始细胞库的制备：将2小瓶源自研究细胞库的培养物解冻并转入装有10mL培养基E的2×125mL的烧瓶中，然后在30℃、160rpm下保温4-5天。下一步，将2×10mL培养物转入装有90mL培养基E的2×250mL的烧瓶中，然后在30℃、160rpm下保温2-4天。最后，合并这两个烧瓶并将1.8mL试样量转入低温的小瓶中，并在冷冻箱中于-70℃下贮存。
工作细胞库的制备：将5小瓶源自原始细胞库工作单元库的培养物解冻并转入装有10mL培养基E的2×125mL的烧瓶中，然后在30℃、160rpm下保温3-6天。下一步，将5×10mL培养物转入装有90mL培养基E的5×250mL的烧瓶中，然后在30℃、160rpm下保温2-4天。用这5个烧瓶内的细胞接种装有90mL培养基E的12×250mL烧瓶，将其再一次在30℃、160rpm下保温2-4天。最后，将这些烧瓶一起合并，并将1.8mL试样量转入低温的小瓶中并在冷冻箱中于-70℃下贮存。产生约500-600小瓶供工作细胞库之用。
实施例2
通过振摇烧瓶发酵培养生产埃坡霉素
将来自冷冻小瓶(1.5mL)中的细胞接种到125mL烧瓶内的45mL培养基E中并使其在30℃和160rpm下生长4-8天(F1阶段)。然后，将5mL F1阶段的细胞转入装有45mL培养基E的125mL新烧瓶中并使其生长3-4天(F2阶段)。然后将F2阶段的细胞用作埃坡霉素B发酵的接种物。将百分之十的接种物(5.0mL)转入装有45mL生产培养基的125mL烧瓶中。然后将这些烧瓶在振荡器(160rpm)内于30℃保温2周。生产培养基为改良的培养基E，其中含1.6％(0.8g)XAD-16树脂。用于振摇烧瓶的生产培养基的组合物显示如下：
用于振摇烧瓶的埃坡霉素B生产培养基
  组分   g/L
  脱脂乳粉   4
  烤Nutrisoy粉   4
  Tastone-154   2
  Maltrin-M040   10
  CaCl2·2H2O   1
  MgSO4·7H2O   1
  EDTA，Felll，Na盐   0.008
  HEPES   12
  甘油   10
  XAD-16resin   16
将上述组分溶解于蒸馏水中并用10％NaOH(或KOH)将pH调至pH7.2后在121℃下灭菌30分钟。
用于振摇烧瓶埃坡霉素B发酵的料液组合物为4％丙酸钠、10％Maltrin-M040和3％Tastone-154。将进料(100mL在250mL烧瓶中)用NaOH调至pH6.8-7.0并于121℃下灭菌30分钟。从接种后第3天到第14天，每天向每个发酵烧瓶中加入0.5mL料液。另外，还发现双倍进料并在第3、5、7和10天加入时可取得同样的结果。也可通过以下方式取得改进的结果：通过用磷酸盐(以1.5％磷酸二钠和0.5％磷酸一钠的形式)进一步补充上述料液，这样当进入培养基中稀释100倍时，最终含量分别为0.015％和0.005％，排除先前加入的剩余含量。加入磷酸盐的增加的优点是不需进行pH调节。另外通过补充磷酸盐可提高产率(对于埃坡霉素B)达到10-20％。
至于埃坡霉素的分析，采集树脂样品(0.8g)并通过HPLC分析。在第14天振摇烧瓶中的埃坡霉素产物能产生以下的滴度：
埃坡霉素A：5.0-7.0mg/g树脂
埃坡霉素B：8.0-12.0mg/g树脂
B/A比例：1.1-2.0
与先前的菌株相比，SC16408培养显然在振摇烧瓶中产生更多的埃坡霉素B。
实施例3
在14L发酵罐中培养生产埃坡霉素
  F1阶段   将取自两个冷冻小瓶中的3.0mL等分试样接种到250mL烧瓶内的90mL培养基E中并使其在30℃和160rpm下生长4-8小时。
  F2阶段   将20mL(10％)F1阶段的细胞转入500mL烧瓶内的180mL培养基E中并在30℃和160rpm下保温2-4天。
  F3阶段   重复F2阶段步骤以增加接种物数量。将20mLF2阶段的接种物转入各装有180mL培养基E的6-8×500mL烧瓶中并在30℃和160rpm下保温2-4天。
  F4阶段   将120mL(10％)F3阶段的培养物转入4L抽气瓶内的1080mL培养基E中，然后在30℃和160rpm下保温2-4天。
利用培养基E形成用于14L发酵罐的接种物。振摇烧瓶和抽气瓶阶段的高压灭菌时间分别是30和60分钟。至于发酵罐，将生产培养基在121℃下灭菌60分钟。14L发酵罐生产培养基为改良的振摇烧瓶生产培养基(如上所述)，其中HEPES已经被除掉并加入了2.5g/L的消泡剂(Antifoam AF，来自Dow Corning)。在14L发酵罐中配制六升生产培养基(pH调至7.2-7.4)并灭菌。下表对14L发酵罐规模的过程参数进行了汇总：
实验台的最高发酵罐工艺参数：
  F1至F4   14L
  温度   30℃   32℃
  压力   10psi
  气流   0.25vvm
  pH   7.2-7.4
  DO   20-40％
  叶轮直径(英寸)   3.3-4.2
  端速(m/s)   1.3-2.2
  进端灭菌时间   60min
  培养基灭菌时间   30min   60min
  树脂   15-30g/L
  营养物进料组合物：   在5L的瓶内配制含4.1％Maltrin-M040和1.3％Tastone-154的溶液。将进料在121℃下灭菌60分钟。
  营养物进料速度：   进料速度为6mL/小时。
  丙酸钠进料：   将5.0％丙酸钠(1.5L在2L的瓶内)在121℃下灭菌60分钟。
  丙酸钠进料速度：   从24-48小时开始至结束，2Ml/小时。调整进料速度以将丙酸钠浓度维持在0.05-0.2mg/mL之间(HPLC分析)。
14L发酵罐内的埃坡霉素B滴度范围总结如下：
埃坡霉素B滴度，mg/g树脂     B/A比例
5-12                        1.0-3.0
实施例4
埃坡霉素的生产方法
50L发酵罐接种期：
对于F1阶段，配制培养基E(2L)并将其分配到17个单独的250mL烧瓶中，各90mL。然后将烧瓶在121℃下通过高压灭菌法灭菌30分钟。将来自一个冷冻小瓶中的细胞接种到每个烧瓶中并使其在大约在约30℃和160rpm下生长4-8天。
对于F2阶段，配制27L的培养基E并将其分配到17个单独的4L烧瓶中，各1.5L，然后按上述方法灭菌。用来自F1阶段的烧瓶中的全部内容物接种每个4L烧瓶，然后使其在约30℃和160rpm下生长2-4天。
对于F3阶段，配制80L的培养基E并分到两个50L不锈钢的种发酵罐中，每个50L发酵罐用来自F2阶段的三个4L烧瓶中的内容物接种。使这些50L的发酵罐在30-33℃下生长2-4天，然后合并并用于接种800L的发酵罐。
培养基E＊是：
  组分   g/L
  脱脂乳粉(或豆蛋白浓度)   5
  烤Nutrisoy粉   5
  Tastone-154   2.5
  Maltrin-M040   12.3
  CaCl2·2H2O   1.2
  MgSO4·7H2O   1.2
  EDTA，Felll，Na盐   0.012
  甘油   5.4
  消泡剂   2.5
800L的发酵罐接种期：
使接种物在800L的不锈钢发酵罐中生长直到细胞群足以接种下一个接种期(5,000L发酵罐)。
将这批培养基E＊转入去离子水(400L)中配制并将该混合物，pH8.7-8.9，在17磅/平方英寸、124℃下灭菌60分钟。将培养基从杀菌器转移到800L的发酵罐中，并将pH调至pH7.1-7.3。然后用80L来自F3阶段培养物接种该发酵罐。该批在以下控制设定值下进行：
  压力：8-12psig温度：30-33℃搅拌器轴转速：50-60rpm   气流：0.5-0.7wmpH：7.1-7.3
根据需要，加入苛性碱(氢氧化钠或氢氧化钾溶液)使pH从无菌的补充物到维持在7.1-7.3范围内。每隔一段时间对该批取样并分析其无菌状态、pH、沉积以及葡萄糖浓缩。并监测出口气CO2和O2。在大约48-60小时时，当葡萄糖浓缩开始下降时，将800L发酵罐(大约440-480L)中的内容物转入5,000L的发酵罐中。
5,000L的发酵罐接种期：
在此阶段接种物的处理中使用5,000L的不锈钢发酵罐。使接种物在该发酵罐中生长直到细胞群足以接种40,000L的生产发酵罐。
将按上述方法制备的培养基E(转入到去离子水中，2,600L)转入5,000L的发酵罐中，然后用大约440-480L来自800L的发酵罐中的接种物接种。该批在调控设定值下进行并进行如上所述的监测。再将pH维持在7.1-7.3的范围内。在约48-72小时，当葡萄糖浓缩开始下降时，将5,000L发酵罐中的内容物转入40,000L的发酵罐中。
40,000L的发酵罐生产阶段：
在该埃坡霉素的生产阶段中使用40,000L的不锈钢发酵罐。一旦将发酵罐灭菌和装入无菌培养基后，就用在5,000L发酵罐中制备的接种物接种。一旦达到特定的生产参数，就采集生产发酵罐中的内容物。
用于生产发酵罐的培养基分为两部分灭菌。将树脂加入到2,800L的水中并将该混合物在17磅/平方英寸、124℃下灭菌75分钟：
  组分   量
  洗过的XAD-16树脂   15-40g/L
为获得18,000L的培养基，将下列组分加入到去离子水(15,000L)中并将pH调至7.1-7.3。培养基在连续式杀菌机于150℃下灭菌(持续时间100秒，出口温度60℃)：
  组分   重量(kg)
  脱脂乳粉   130
  烤Nutrisoy粉   130
  Tastone-154   65
  Maltrin-M040   238
  CaCl2·2H2O   21.6
  MgSO4·7H2O   21.6
  EDTA，Felll，Na盐   0.22
  甘油   216
  消泡剂   54
将培养基和树脂转入生产发酵罐中，然后用约3,100L来自5,000L的发酵罐中的接种物接种。将该批在如上所述的控制设定值下进行，除气流为0.2-0.4wm外。根据需要，用苛性碱上调pH(在0和80小时之间)。在80小时之后，用硫酸下调pH。根据需要，用消泡剂调节起泡。至少一天一次对该发酵罐取样分析其无菌状态、pH、沉积、葡萄糖、丙酸盐和埃坡霉素B的浓度。监测并记录出口气的CO2。在大约30-60小时时开始进料，一直到CO2不低于0.3％。
用1.9L/注(范围为1.5-3.0)的注料量给发酵罐供给丙酸钠(102g/L)。注料的时间间隔开始时为60分钟，每隔12小时递减，至最短的12分钟。将丙酸盐加入到2,800L的去离子水中并将该溶液在17磅/平方英寸、124℃下灭菌75分钟。在优选的实施方案中，丙酸钠进料与含其它培养基组分的进料分开。
给该发酵罐进料Maltrin-M040和Tastone-154，注料量为14.5L。注料的时间间隔开始时为60分钟，在104小时时变化到40分钟。将各组分加入到去离子水(3,000L)中并在17磅/平方英寸、124℃下灭菌75分钟。进料含：
  组分   g/L
  Tastone-154   20
  Maltrin-M040   66
  消泡剂   1.0
在该过程中，一些培养基组分如脱脂奶粉、Maltrin-M040和甘油被耗尽。在大约115小时开始，先前的进料被中止，将下述混合物以14.5L的注料量每隔40分钟加入到生产发酵罐中。将各组分加入到去离子水(3,000L)中，并将该混合物，pH8.7-8.9，在17磅/平方英寸、124℃下灭菌75分钟。
  组分   g/L
  脱脂乳粉   49
  Maltrin-M040   154
  Tastone-154   20
  甘油   78
  消泡剂   1.6
当达到所需的埃坡霉素B的浓度时(通常在9-21天之后)，采集容器中的内容物。埃坡霉素B滴度在大约5-24mg/g树脂之间变化，B/A比例大约为1.5-4。
实施例5
用MTBE从XAD-16树脂中萃取埃坡霉素B并结晶得到固体埃坡霉素B；用反相色谱分离纯化；最后分离高质量的埃坡霉素B
将所收集的并水洗过的含埃坡霉素(大约5.03kg埃坡霉素B)的XAD-16树脂(大约550kg)与甲醇的水溶液混合并以浆液的形式装入萃取柱。将该填充的树脂用甲醇的水溶液(先用30％MeOH然后用50％MeOH各1柱床体积)洗涤以除去不需要的高极性物质。用MTBE洗涤(大约4柱床体积)脱掉埃坡霉素。收集富洗脱液并研磨过滤。在重力沉降除去任何水相之后，浓缩富MTBE液。重力沉降浓缩液，移去水相，向该批中另外加入MTBE(2柱床体积)。将该批再浓缩至大约每升5至15g埃坡霉素B的浓度。通过5-6小时逐渐冷却至约0℃使该批结晶。将结晶固体过滤、洗涤并干燥。将所得的产物滤饼溶解于温热的乙酸乙酯中并研磨过滤。将富滤液在真空下浓缩至大约每升20至45g埃坡霉素B的浓度。加热至70℃后，然后将该批缓慢冷却至大约0℃得到结晶浆液，将结晶浆液过滤、用冷的EtOAc洗涤、并在低于40℃下干燥得到分离的再结晶的埃坡霉素B(以树脂中的量计产率为84％)。然后将该产物通过反相色谱分离法纯化。
将填充有反相固定栽体RP/C-18的色谱柱(11cm直径×40cm层床长度)用乙腈的水溶液(30-50％v/v)平衡。将再结晶的产物溶解于二甲亚砜(DMSO，每公斤1-1.5L)，过滤该混合物以除去不溶物，然后装在柱子上，装柱前先加入等份的100％DMSO，追加等体积的DMSO以减少在含水流动相加入时样品的沉淀。使用乙腈的水溶液(30-50％v/v)从柱中洗脱样品，并通过UV检测器在290nm处监测流出物。收集若干部分的埃坡霉素B产物峰。以HPLC分析各部份的埃坡霉素A和B及其它相关的杂质。
将所需的合并柱部份装入蒸馏箱，并将该批在低于40℃的温度下真空浓缩以除去乙腈。将产生的水相用乙酸乙酯萃取高达三次，并将该有机溶液在低于40℃的温度下真空浓缩得到浓度为0.1至0.2g/mL的埃坡霉素B。在40℃下向该批中加入正庚烷(或庚烷)，然后将该批缓慢冷却到2至-10℃并维持至少2小时。过滤结晶浆液并用乙酸乙酯/正庚烷溶液洗涤，然后将最终的埃坡霉素B滤饼在35-40℃下真空干燥得到3.367kg，效能为91.7％，相当于3.09kg的埃坡霉素B活性。从树脂中得到的产率为61.4％。HPLC显示埃坡霉素B占面积的99.6％、埃坡霉素A占面积的0.4％，没有面积＞0.1％的其它杂质。
实施例6
用乙酸乙酯从XAD-16树脂中萃取埃坡霉素B并用甲苯作为反溶剂结晶得到固体埃坡霉素B；用反相色谱法分离纯化；最后分离出高质量的埃坡霉素B
在振动筛(SWECO TM)上用水洗涤含埃坡霉素B的XAD-16树脂以净化该树脂。将该树脂的一部分(大约6.6L，含15.6g埃坡霉素B，经检测每克树脂2.36mg埃坡霉素B)使用大约5L的水转入20L的容器中以用水冲冼该树脂。然后将乙酸乙酯(大约2柱床体积(BV)的进料树脂)加入到容器中。将浆液搅拌约一小时，并使用600mL螺帽离心容器在3,500rpm下离心5分钟以分层。倾出第一份富乙酸乙酯的上清液，并测量其体积。接下来，将倾斜的含多水树脂的底层在容器中合并并向该容器中加入乙酸乙酯(2BV)。将该浆液搅拌约1小时然后离心分层。倾出第二份富乙酸乙酯的上清液，并测量其体积。
然后将水(～0.3BV进料树脂)加入到合并的第一份和第二份富乙酸乙酯馏份中并搅拌大约5分钟。让各层静置大约30分钟。接下来，下面的水层与上面的富乙酸乙酯层分离。将洗涤过的富乙酸乙酯层在低于45℃的温度下浓缩至浓度为大约每升10g的埃坡霉素活度。然后将浓缩的富乙酸乙酯溶液研磨过滤并浓缩至20-25g/L的埃坡霉素B。
浓缩后，加入甲苯并利用真空在低于50℃下再浓缩至加入甲苯之前该批的体积。使该批经大约1小时冷却至约18℃，然后在此温度下搅拌大约16小时以得到产物晶体。接下来，将该批结晶过滤并用甲苯(～0.2BV)洗涤，干燥所得的固体得大约30.4g含13.5g埃坡霉素B活度的固体。从起始树脂中计算活性产率为87％。
将利用以上处理从树脂中萃取的固体埃坡霉素B以反相色谱法进行纯化。柱子(Phenomenex Luna，15，C18(2)，5.0cm×25cm，柱BV 400mL)用3BV的40％(v/v)乙腈-水预平衡。将大约4-6g的固体埃坡霉素B在约40℃下溶解于大约6mL的DMSO中，然后将混合物经滤膜过滤以除去微粒。将大约1.5mL的DMSO注入到样品环中以防止埃坡霉素在管中沉淀。然后富含埃坡霉素的滤液注入到样品环注入之后，用约0.5mL的DMSO洗涤埃坡霉素滤液容器并随之注入约1mL的DMSO到样品环中。注入埃坡霉素样品后注射DMSO可防止在管中产生沉淀。以大约5mL/分钟的流速将样品环的内容物装在柱上。
将埃坡霉素装在柱上后，然后向柱中泵入40％乙腈水溶液。3-4分钟后，流速增至大约60ml/分钟。收集若干部分的埃坡霉素A和B峰。含富含埃坡霉素B的部份一般在2.5L和3.25L洗脱体积之间的馏分中获得(通常埃坡霉素B峰在约6和8柱床体积之间流出)。该合并的部份的体积为大约0.75L。埃坡霉素B峰几乎达到基线(＜10％的峰高)后向柱中泵入100％乙腈。当色谱显示在290nm处的吸收基本上回到基线时，向柱中泵入40％乙腈-水溶液再平衡该柱以进行下一次色谱。通常使用2BV的100％乙腈和3BV40％乙腈洗涤和再平衡柱子。
利用HPLC分析对各部份进行分析以测定纯度，并将所需要的部份合并。通常产率为90-98％。
将合并的埃坡霉素B部份在低于0℃下真空浓缩至大约50％的初始体积。该浓缩部份用乙酸乙酯萃取两次。将合并的乙酸乙酯extracts在约40℃的浴温下浓缩至大约0.1g/mL埃坡霉素B。在约15分钟内边搅拌边加入正庚烷(或庚烷)(使用一定量的50％乙酸乙酯溶液)。将萃取物冷却至5℃并在该温度下保持至少2小时。将产物晶体过滤并用1∶2(v∶v)的正庚烷∶乙酸乙酯溶液洗涤。最后，将晶体在约40℃下真空干燥大约12小时。HPLC显示各批中埃坡霉素B占面积的99.5-99.7％，埃坡霉素A占面积的0.3-0.5％。
实施例7
用乙酸乙酯从XAD-16树脂中萃取埃坡霉素B并用甲苯作为反溶剂结晶，继之以重结晶得到初级的埃坡霉素B；用正相色谱法分离纯化；最后分离出高质量的埃坡霉素B
步骤A，使用EtOAc萃取-甲苯结晶制备初级的埃坡霉素B：
将水洗过的富含埃坡霉素B的树脂(1350g)装在柱上。用水(2700mL)装柱和冲冼柱子。以9450mL(7柱床体积)的乙酸乙酯过柱洗脱活性的埃坡霉素。让乙酸乙酯洗脱液沉降至少一小时。除去棕褐色水层和乳剂层。将富乙酸乙酯溶液在真空下浓缩至目标浓度为大约每升20g埃坡霉素B。让浓缩液静置2小时并冷却至20℃。将冷却了的浓缩液研磨过滤，并用乙酸乙酯(36mL)洗涤过滤器。将合并的滤液和冲洗液浓缩至大约每升80g埃坡霉素B并加热至65℃。加入等体积的甲苯，搅拌10-15分钟以上，同时将温度保持在60℃以上。将温度维持在65℃30分钟，接着在1.5小时内降温至40℃，然后在2小时内降温至1℃。将产生的结晶浆液在1℃下搅拌至少60分钟。滤出固体物并用甲苯(浆液体积的20％)洗涤。(在该方法的多次重复中，母液通常含2-6％的进料的埃坡霉素B活度)。在烘箱中于40-45℃下将固体物真空干燥至少4小时。另外，也可以在烘箱中在40℃和室温之间的温度下将固体物真空干燥至少4小时。
该干燥的原始的埃坡霉素B滤饼的重量范围在8.4至20g之间，埃坡霉素B效能范围在650至713μg/mg之间。滤饼中还含有12％至26％的埃坡霉素A(面积百分比)。残留溶剂含0.7％(w/w)EtOAc和13％(w/w)甲苯。
对于5批的计算如下：
 进料重(g)   分析(gepo B/Kg)  epo B进料(g)   原始滤饼中的Epo B(g)   ％回收率
 1327-1391   4.4-12.2  6.0-16.5   5.5-13.6   87-98
分离过程中总损失平均为9.4％。对于原始滤饼从树脂中得到的埃坡霉素A峰相对于埃坡霉素B峰的百分比平均从49％降至19％。在此步骤所述的方法之后得到的晶体溶剂合物的PXRD图和热分析分别显示在图9和10中。图9的PXRD图进一步由上面的表6报告的数据表征。
步骤B，埃坡霉素B的再结晶：
将EtOAc(0.14L)加入到15g初级的埃坡霉素B(710μg/mg)中并边搅拌边加热到65-68℃。(埃坡霉素B的目标浓度为每升75-80g活度)。在20分钟内将甲苯(0.14L)加入同时将温度维持在60℃以上。将产生的浆液保持在65℃下0.25小时至1小时。然后将该批在3小时内冷却至40℃。将该批在2小时内继续冷却至0-2℃。然后将该批保持在0-2℃下12小时。然后过滤所得的结晶浆液并用甲苯(2×0.028L)洗涤滤饼。通常，不到3％的进料埃坡霉素B活度损失到合并的母液和冲洗液中。在真空烘箱中于42℃和29英寸Hg的压力下将滤饼干燥2小时。另外，也可以在真空烘箱中在40℃和室温之间的温度和29英寸的压力下将滤饼真空干燥2小时。该干燥的滤饼重量为13.6g，效能为764μg/mg。残留的溶剂包括EtOAc(0.9wt％)和甲苯(13.2％)。通常，EtOAc和甲苯以13-14wt％的总含量存在。再结晶的滤饼的埃坡霉素A峰相对于埃坡霉素B峰的面积百分比降至平均6.9％。
在此步骤所述的方法之后得到的晶体溶剂合物的PXRD图和热分析分别显示在图11和12中。图11的PXRD图进一步由上面的表7报告的数据表征。
正相色谱分离：
配制下列流动相：
20％(v/v)乙酸乙酯/正庚烷溶液(～10L)，
40％乙酸乙酯/正庚烷(～10L)，和
100％乙酸乙酯(～10L)。
安装以下设备：
Waters Delta Prep4000；检测器：UV定在290nm；柱：Phenomenex Luna，10微米，硅土(2)，5.0cm×25cm(柱体积～490mL)。
在注射埃坡霉素溶液之前用3柱床体积的20％(v/v)乙酸乙酯/正庚烷溶液平衡柱子。
将埃坡霉素B滤饼(5.5g)溶解于55mL的二氯甲烷中。将该批通过1微米的PTFE滤膜过滤以除去任何可能存在的微粒。用二氯甲烷(2-5mL)冲冼该滤膜。将富二氯甲烷滤液注入柱中，最初的30秒内的初始流速为5mL/分钟，接着将流速增至20mL/分钟直到样品完全装上。用二氯甲烷(2-5mL)冲洗含埃坡霉素滤液的容器，将冲冼液也输入柱中。
用20％EtOAc/庚烷开始洗脱，同时将流速增加至118mL/分钟。在流速达到118mL/分钟之后，运用泵程序控制器运行期望的的泵程序。应用下述泵程序：
收集各部份洗脱液并用HPLC分析纯度。
在5批中，所收集的部份中埃坡霉素B的面积百分比为99.59-99.93％，产率平均为91％。
任选地，类似地应用等浓度的40％乙酸乙酯/正庚烷洗脱步骤、类似的100％乙酸乙酯冲洗柱步骤继之以40％乙酸乙酯再平衡进行色谱分离。使用同样的色谱分离设备，其中使用直径较小的柱1.0cm×25cm。在中心馏份中埃坡霉素B的色谱分离产率为86％且所收集的部份中埃坡霉素B的面积百分比为99.4％。上述等浓度方法还可在11cm轴向压缩柱上进行，其中中心馏份中洗脱的epo B为31-35gm，色谱的产率为90-94％。所收集的中心馏份中埃坡霉素B的面积百分比为99.6-99.9％。柱子可重复行使多次。
步骤C，最后的结晶：
将需要的中心部馏份合并得到1.62-1.73L的批量体积。在40-45℃下真空除去溶剂。目标蒸馏体积为25-28mL(埃坡霉素B的浓度为大约200-210g/L)。向浓缩液中加入温热的(大约40℃)庚烷(50mL)。另外，也可以在此步骤将温热的(约40℃)EtOAc(50mL)加入到浓缩液中。将产生的浆液在约40℃下搅拌约2小时，然后在约5小时内冷却至约0℃并在约0℃下再搅拌至少5小时。在整个结晶期间应用中等速度的机械搅拌。将结晶浆液过滤并用冷的1∶1EtOAc/庚烷(25mL)洗涤。在真空烘箱中于40-45℃下将固体物干燥5-6小时。另外，也可以在真空烘箱中在40℃和室温之间的温度下将固体物干燥5-6小时。自再结晶的(一次)埃坡霉素B分离得到的埃坡霉素B的重量(对于5批)为大约4.2-5.0g(83.5-85.6％活度产率)，其HPLC纯度为99.78至99.93％面积百分比(平均99.80％)。对于色谱分离的埃坡霉素B活度进料而言损失到母液中的埃坡霉素B为大约4％。滤饼中残留的溶剂为EtOAc(5.8-6.0％w/w)和庚烷(0.6-0.7％v/v)。最终的埃坡霉素B滤饼的效能范围为91.5至92.7％w/w。HPLC纯度在99.7面积百分比以上。使用此步骤所述的方法得到的晶体溶剂合物的PXRD图和热分析分别显示在图13和14中。从图14可以看出，按照上述操作制备和干燥所得的乙酸乙酯溶剂合物的熔点为约102℃。图13的PXRD图进一步由上面的表8报告的数据表征。
另外，也可以将合并的含4.83Kg Epo B中心馏份(1790L)在＜30℃下真空浓缩至目标浓度为200-210g/L，然后加入正庚烷(60kg)。重复该浓缩操作然后另外加入60kg庚烷。将浆液在三小时内冷却至20℃，然后收集并用30Kg庚烷洗涤。将所得固体物在真空下于20-36℃干燥16小时。总共获得5.141Kg固体，其HPLC纯度＞99.6面积％。滤饼中的残留溶剂为10.6％乙酸乙酯和1.4％庚烷。
实施例7A
从树脂中萃取埃坡霉素B，接着重复再结晶
将水洗过的含估计量4.10Kg埃坡霉素B活度(面积％：埃坡霉素B＝58.0％；埃坡霉素A＝29.2％)富含埃坡霉素的树脂(549.8kg)用水匀浆并装柱(700L)。排去柱中液体并用氮气吹柱。然后用乙酸乙酯(2969Kg)洗脱，以每小时～1柱床体积的速率通过柱子，总共～6柱床体积。让合并的富含乙酸乙酯的洗脱液重力沉降～1小时，然后除去下层的水相。然后将富乙酸乙酯浓缩至～574kg。然后将浓缩的富乙酸乙酯在研磨过滤之前于～20℃下静置～2天。将滤膜和管道用乙酸乙酯(总共～115kg)洗涤。然后将研磨滤液和冲洗液浓缩至体积为～64L，然后温热至～65℃。然后边搅拌边加入等体积温热的甲苯并将所得物保持在～65℃下～30分钟。然后将该批在～4小时内缓慢冷却至～40℃，接着在～2.5小时内冷却至0℃。然后将冷浆液在～0℃下保持～1小时。然后过滤所得的结晶浆液并用甲苯(～64L)洗涤滤饼。将产生的滤饼在真空下略微干燥，然后用温热的乙酸乙酯(200kg)从过滤干燥装置将其再溶解。
类似地通过将富乙酸乙酯浓缩至～65L进行第一次再结晶。在温热至65℃之后边搅拌边加入等体积的甲苯并将所得物保持在～65℃下～30分钟。类似地按照上述方法将该批冷却，并使用上述同样的操作和设备过滤和洗涤所产生着结晶浆液。
如上所述再进行两次类似的再结晶得到埃坡霉素B结晶滤饼(4.384kg)(81.5％w/w)(3.573kg埃坡霉素B)(HPLC面积％：埃坡霉素B＝97.18；埃坡霉素A＝1.40；埃坡霉素F＝0.30；噁唑类似物＝0.30和乙基噻唑类似物＝0.56)。没有可检测的(＞HPLC0.1面积％)别的杂质。产物中含13.8％w/w甲苯和0.8％w/w乙酸乙酯。从树脂到分离纯化的埃坡霉素B总活度产率为87％。
实施例7B
从母液流回收Epo B
将MTBE或EtOAc萃取物Epo B结晶后的母液合并，母液每升溶液中含2.2g Epo B和4.8g Epo A。在50℃下将十升该溶液真空浓缩至浓度为每升11-15g Epo B。加入1体积的甲苯开始形成固体物；继续蒸馏直至达到11-15g Epo B/L的浓度。再加入1体积的甲苯，并将蒸馏再重复一次至达到11-15g Epo B/L。在1小时内将浆液冷却至室温，然后搅拌90分钟。然后将混合物再加热至～50℃，搅拌1小时并在1小时内冷却至室温。在搅拌至少3小时之后，通过过滤收集固体物，用甲苯洗涤然后在～40℃下真空干燥得到～92％Epo B活度的回收率。对固体物进行分析：42.9％w/w Epo B，16％w/w甲苯。母液中含66％的进料埃坡霉素A并仅含5％的进料埃坡霉素B。
实施例7C
按实施例7中所述的正相色谱分离操作合并的中心馏份(200mL)含646mg Epo B，将其缓慢加入到43mL的甲苯中同时在水套内冷却水温度为～65℃下真空浓缩至～43ml。在真空的条件下加入甲苯(43mL)，同时在水套内冷却水温度为～65℃下继续蒸馏。将所得浆液浓缩至～43mL然后让其在～3小时内冷却至～20℃。收集所得晶体，用2×5mL甲苯洗涤并在～40℃下真空干燥(29″Hg)30分钟得到729mg的分离出的结晶滤饼85.3％w/w Epo B)。HPLC纯度为99.77面积％(不包括甲苯的面积％)。滤饼中残留的溶剂为15.3％w/w甲苯和0.3％w/w EtOAc。母液和冲洗液仅含0.5％的埃坡霉素B进料活度。
按此步骤中描述的方法得到的晶体溶剂合物PXRD观察图显示在图15中(上图)，伴有一幅室温下甲苯溶剂合物的PXRD模拟图(下图)。该晶体溶剂合物的热分析如图16所示
实施例8
特定晶形的制备
实施例8A：epoB-TOβ的制备
埃坡霉素B甲苯溶剂合物的制备
将Epo B在～40℃下溶解于～13mL的乙酸乙酯中。加入1体积的甲苯接着在浴温＜40℃下浓缩至9mL。将其再加热至～55℃，接着再加入1体积的甲苯。然后浓缩至～10mL并让其冷却至18℃。所得浆液用于X射线结构测定。
按照上述方法得到的epoB-Toβ单斜晶胞的分子结构和epoB-Toβ的PXRD图分别如图4和6所示。
实施例8B：epoB-ANβ的制备
埃坡霉素B乙腈溶剂合物的制备
让基本纯的埃坡霉素B在乙腈水溶液中的溶液(由实施例5中反相色谱分离产生的柱馏份合并而成)在室温下缓慢蒸发得到乙腈-水结晶浆液。直接通过X射线衍射检测该结晶浆液。
按照上述方法得到的epoB-ANβ单斜晶胞的分子结构和epoB-ANβ的PXRD图分别如图2和7所示。
实施例8C：epoB-EAβ的制备
埃坡霉素B EtOAc溶剂合物的制备
将埃坡霉素B在1∶1EtOAc/庚烷中的溶液浓缩至目标浓度为～190195g/L。在～40℃下向该埃坡霉素B的稠浆液中边搅拌边加入10体积的EtOAc。将产生的浆液在40℃下搅拌2小时，在5小时内冷却至约0℃并在0℃下再搅拌至少5小时。然后将结晶浆液过滤并用冷的1∶1EtOAc/庚烷洗涤滤饼。将滤饼在真空烘箱中干燥5-6小时得到最终的含～5-14％EtOAc的埃坡霉素B滤饼。
按照上述方法得到的epoB-EAβ单斜晶胞的分子结构和epoB-EAβ的PXRD图分别如图1和5所示。
实施例8D：epoB-IPβ的制备
埃坡霉素B IPA溶剂合物的制备
通过溶液加热将埃坡霉素B(70mg)溶解于4mL的IPA中直至形成透明的溶液。将该溶液冷却至环境温度。通过过滤除去刚形成的任何固体。将清滤液置于小型的小瓶中并用带有若干针孔的铝箔覆盖。让溶剂在环境温度下若干天内慢慢地蒸发直至观察到相当的晶体成长。晶体以湿浆液送去X射线分析。
按照上述方法得到的epoB-IPβ单斜晶胞的分子结构和epoB-IPβ的PXRD图分别如图3和8所示。
实施例9
由埃坡霉素B(内酯)形成衍生物2(内酰胺)
通过将四丁铵氯化物和叠氮化钠在THF/DMF中混合制备四丁铵叠氮化物(TBA叠氮化物)溶液。通过过滤除去NaCI晶体回收所产生的TBA叠氮化物溶液。将催化量的试剂如三(二亚苄基丙酮)-二钯或该催化剂的氯仿加合物(选择这类试剂以稳定烯丙基阳离子、氯化铵、埃坡霉素B和THF/DMF溶液)在搅拌下加入烧瓶中。通过在0-5℃下通入氮气约25分钟除去浆液中的氧气。在0-5℃下加入三甲基膦。将反应混合物加热至32-38℃并持续搅拌4-16小时由于酯官能键的断裂而生成氨基酸中间体。将反应混合物冷却至18-24℃并过滤除去固体物。用THF洗涤固体物并将该滤液与富滤液合并。在30-37℃下将该溶液在9-10小时内滴加至1-羟基苯并三唑水合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和碳酸钾的THF-DMF浆液中。将所得的混合物冷却至0-12℃、用水熄灭同时将温度保持＜10℃。将混合物用乙酸乙酯萃取三至四次，并将合并的乙酸乙酯层用环己烷(3∶1的乙酸乙酯-环己烷比例)稀释，反过来用水萃取。将有机层再用环己烷进一步稀释至2∶1的乙酸乙酯-环己烷比例并通过充满活性炭的筒如Zeta PadR51 SP或R53SP中以降低残留的Pd量。将三乙胺(1％)加入到有机滤液中并将该溶液用短硅胶以含1％三乙胺的2∶1乙酸乙酯-环己烷过滤纯化。收集富洗脱液并在＜37℃下浓缩至最终浓度为11-14mL/g。加入另外的环己烷并将该浆液在67-78℃下加热45-60分钟。将浆液缓慢冷却至约21℃、过滤并用1∶1乙酸乙酯-环己烷洗涤结晶固体。将湿滤饼在＜45℃下真空干燥得到埃坡霉素B的晶体内酰胺类似物，产率为约56M％。
实施例10
由埃坡霉素B形成氨基取代的埃坡霉素衍生物(衍生物1)
通过酶在埃坡霉素B噻唑环上2-甲基的羟基化作用将埃坡霉素B转化为埃坡霉素F。通过放线菌菌株在埃坡霉素B上的作用实现该转化。用于此步骤中的放线菌菌株公开于2002年12月17日申请的美国专利申请序号10/321,188和WO00/39276，这两篇文献都在此引入作为参考。
将埃坡霉素B的乙醇溶液(5％v/w)加入微生物中，使其在适当的培养基中于16-18℃下生长，并用50％w/v氢氧化钠或30w/v硫酸将pH维持在6.9和7.1之间。继续进行生物转化直至埃坡霉素B的浓度降低至其初始值的3-5％。将能吸附埃坡霉素F的树脂如XAD-16或SP207加入到发酵罐中(5％v/w)并在10-18℃下搅拌16-72小时。倾出发酵肉汤并用水(2∶1水-树脂的比例)洗涤该树脂。重复洗涤两次以上。通过在布氏漏斗上过滤除去大部分残留的水。
将预先吸附了埃坡霉素F的XAD-16树脂用水浆液并上柱。用乙酸乙酯萃取树脂柱并收集富洗脱液。放出水层然后用5％碳酸氢钠溶液和水洗涤富乙酸乙酯部份以脱色。在减压下浓缩富有机部份，然后通过硅土预涂的滤膜，接着进行10μM研磨过滤。然后将产物真空蒸馏并通过在搅拌下加入作为反溶剂的甲苯使最初的埃坡霉素F结晶。将富甲苯混合物进一步浓缩以减少乙酸乙酯含量并加入更多的甲苯。过滤所得的结晶浆液并用甲苯洗涤。
将埃坡霉素F溶解于二氯甲烷或二氯甲烷/乙酸乙酯的混合物中，然后装在填充有高效液相色谱级硅土的色谱柱上，色谱柱已经用60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷混合物(v/v)平衡。
将产物用等浓度的或逐步梯度的60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷混合物(v/v)、继之以60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷(v/v)从柱上洗脱。通过在290nm处的UV检测对样品和过程监测。把埃坡霉素F产物峰分成几部分以使洗脱出的杂质减至最少。将合并的富部份真空蒸馏至目标浓度为约100g/L。向埃坡霉素F的浆液中边搅拌边加入等体积的正庚烷。将该批再真空蒸馏至目标浓度为大约100g/L，加入乙酸乙酯，并将该浆液维持在40℃。将该批冷却至2至-10℃并在该温度下维持至少5小时以使产物从溶液中结晶。将产生的浆液过滤并用冷的1∶1乙酸乙酯/正庚烷溶液洗涤。将最终的埃坡霉素F滤饼在35-40℃下真空干燥。
将1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，1.8当量)缓慢加入到埃坡霉素F和二苯基磷酰叠氮(1.5当量)在四氢呋喃(预先在3A MS上干燥)的混悬液中，并将该反应物在15-25℃下搅拌12-24小时。将三甲基膦/四氢呋喃溶液(1.0M，1.1当量)缓慢加入到反应混合物中。加入水和氢氧化铵并将混合物再搅拌30分钟。将反应混合物用水稀释并将水相用三份二氯甲烷萃取。然后将有机相用稀氨水和半饱和的氯化钠溶液洗涤、并蒸干得到粗制的在噻唑的甲基上功能化的氨基衍生物(衍生物1)。
将粗制品用以2.5％甲醇-0.2％三乙胺-二氯甲烷预处理的硅胶通过柱色谱法纯化。将适宜质量的部份合并、微米滤网过滤并蒸干得到色谱分离的衍生物1。将所得物加入到乙酸乙酯中并将产生的混悬液在72-75℃下加热得到溶液。缓慢加入反溶剂正庚烷，并让混合物在晶种存在的情况下缓慢冷却同时于15-25℃下搅拌。冷却并保持在～5℃后，通过过滤分离出产生的固体，接着真空干燥得到纯化的晶体氨基衍生物(衍生物1)，埃坡霉素F的平均产率为约70M％。
实施例11
由埃坡霉素B制备埃坡霉素D(衍生物3)
[[4S-[4R＊，7S＊，8R＊，9R＊，15R＊(E)]]-4，8-二羟基-5，5，7，9，13-五甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-1-氧杂-13(Z)-环十六碳二烯-2，6-二酮[埃坡霉素D，衍生物3]
在-78℃氩气氛围下向无水THF(5ml)中加入WCl6(198mg，0.5mmol)接着加入nBuLi(0.625ml的1.6M在己烷中的溶液，1.0mmol)。将反应物在20分钟内温热至室温。取出一部分的(0.50ml，0.05mmol)钨试剂并在氩气的氛围下加入到埃坡霉素B(9.0mg，0.018mmol)中，将该反应混合物搅拌15分钟，然后通过加入饱和NaHCO3(1ml)熄灭反应。用EtOAc(3×1ml)萃取该反应混合物，将合并的萃取液干燥(Na2SO4)、过滤，并在真空下除去挥发物。将残留物用35％EtOAc/己烷色谱分离得到发明名称的化合物(7.0mg，0.014mmol)。MS m/z 492.3(M++H)。

Claims (7)

1.一种从产埃坡霉素的微生物中分离埃坡霉素B的方法，该方法包括：
(a)在树脂存在的情况下使产埃坡霉素的微生物菌株发酵，所述树脂通过疏水作用吸附埃坡霉素B，所述产埃坡霉素的微生物是纤维堆囊菌菌株ATCC号PTA 3880；
(b)收集水基介质中的树脂；
(c)用选择用来萃取埃坡霉素B且使其与水基介质分离的溶剂萃取树脂；和
(d)在色谱步骤之前使埃坡霉素B从萃取相中结晶出来，
其中所述发酵步骤还包括进料添加剂，其中所述添加剂为丙酸盐或丙酸酯。
2.权利要求1的方法，其中树脂用极性溶剂萃取。
3.权利要求1的方法，其中所述步骤(d)包括：
(i)加入另一种埃坡霉素B在其中不溶或微溶的溶剂；
(ii)除去至少一部分萃取溶剂；和
(iii)将所得溶剂或溶剂混合物的温度转变至埃坡霉素B结晶的温度。
4.权利要求3的方法，其中萃取溶剂为乙酸乙酯或MTBE，且所述的另一种溶剂为甲苯。
5.制备下式的衍生物2或其溶剂合物的方法，所述方法包括通过权利要求1的方法获得埃坡霉素B，以及将埃坡霉素B或其溶剂合物转化成下式的衍生物2或其溶剂合物： 
衍生物2
。
6.制备下式的衍生物1或其溶剂合物的方法，所述方法包括通过权利要求1的方法获得埃坡霉素B，以及将埃坡霉素B或其溶剂合物转化成下式的衍生物1或其盐或溶剂合物：
Figure FC20015963200380022662601C00022
衍生物1
。
7.制备下式的衍生物3或其溶剂合物的方法，所述方法包括通过权利要求1的方法获得埃坡霉素B，以及将埃坡霉素B或其溶剂合物转化成下式的衍生物3或其溶剂合物： 
Figure FC20015963200380022662601C00031
衍生物3
。 
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