TWI291464B

TWI291464B - Methods for the preparation, isolation and purification of epothilone B, and X-ray crystal structures of epothilone B

Info

Publication number: TWI291464B
Application number: TW092126105A
Authority: TW
Inventors: Daniel A Benigni; Robert Stankavage; Shu-Jen Chiang; Hsing Hou; Bruce Eagan
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-09-23
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2007-12-21
Also published as: JP2006500031A; KR20120080649A; US7767432B2; WO2004026254A2; IS7768A; CA2695671A1; EP1542998A2; WO2004026254A3; MXPA05003006A; ZA200501680B; EP2280014B1; CO5540384A2; USRE42191E1; US7241899B2; IL222455A0; HK1113387A1; JP5193983B2; CN1705662A; EP2287168A3; CA2695720C

Description

1291464 · ⑴ 玖、發明說明相關申請案本申請案主張2002年9月23日提出之美國臨時專利申請案號60/4 1 2,994的優先權。【發明所屬之技術領域】本發明關於用來製備 '分離及純化埃坡黴素 (Epothilone) B之改良方法。這些方法包括，例如：用於產製埃坡黴素B之醱酵方法、經由吸附在樹脂上之分離方法，及隨後之純化方法。【先前技術】埃坡黴素爲一類相當新的大環內酯化合物，其最初係經由黏液細菌（纖維小體堆囊菌（Sorangium Cellulosum) 醱酵製得。由於這些化合物具抗黴菌性質，因此，起初係作爲植物保護劑。後來，由於埃坡黴素對動物細胞具細胞毒性，因此引起人們的興趣，並將其特性描述爲管蛋白聚合劑。現已知：埃坡黴素展現出類似於普利泰索 (paclitaxel)(TAXOL®)之微小管-穩定效果，及對抗快速增殖細胞（如：腫瘤細胞或其它過度增殖之細胞疾病）的細胞毒性。埃坡黴素在作爲化學治療劑方面之用途說明Bollag et al.，Cancer Research 5 5,23 25，1 995 中。埃坡黴素A和B (分別爲e ρ ο A或e ρ ο B )具下列構造： 1291464 (2)

R

埃坡黴素A R = H 埃坡黴素B R = M( HSfle等人在WO 93/10121中揭示一種用於取得埃坡黴素的計劃流程。Η δ fl e在含碳源、氮源和礦物鹽類之基質中培養一種纖維小體堆囊菌株。在該菌株之培養期間加入吸附樹脂。將埃坡黴素隨著溶劑從吸附樹脂洗提出。將不同的埃坡黴素藉逆相色層分析法分開並使其結晶化。然而，Ηδ fie等人考慮此方法僅產製少量的埃坡黴素b，且在醱酵物中埃坡黴素B對埃坡黴素a之比例亦很低。此低比例之埃坡黴素B對埃坡黴素a使得回收純埃坡黴素B很困難。因此，本技藝中需要改良之醱酵方法，以製備較埃坡黴素A多之埃坡黴素B，及改良之分離和純化埃坡黴素B的方法。【發明內容】本發明係針對用於產製埃坡黴素B之改良的醱酵法。本發明還包括經由突變取得之新纖維小體堆囊菌株，以用來產製埃坡黴素。本發明亦包括經由在醱酵中加入添加劑來改良由新纖 1291464 (3) 維小體堆囊菌株所產製之埃坡黴素B對埃坡黴素A之比例的方法。在一種較佳之實施例中，此添加劑爲丙酸化物、經適當調節pH的丙酸，或另一種丙酸化物先質。本發明亦包括改良之萃取方法，以利用樹脂將埃坡黴素B從醱酵基質中分離出來。本發明還包括用來淸洗富含埃坡黴素之樹脂的方法，以減少雜質含量，並改良下游之處理程序。本發明亦包括改良之純化埃坡黴素B的方法。在一種實施例中係利用結晶化作用來純化。在另一種實施例中係藉色層分析法來純化，其包括一般相色層分析法或逆相色層分析法。在另一種實施例中係經由組合進行結晶化，及藉色層分析（包括一般相和逆相色層分析）這類將樣本純化之方法來純化。還有一種實施例係僅將樹脂萃取物藉結晶化反應來操作。埃坡黴素B(“eP〇B”）可作爲製備衍生物1( “ D1”）之中間體（如美國專利6，262,094號中之描述，其倂爲本文之參考資料），其中在噻唑環上之2-甲基被一個胺所取代：

埃坡黴素B可作爲製備衍生物2( “ d2，，）之中間體 -8- 1291464 (4) (這，-類埃坡黴素B之內酯轉化成衍生物2之內醯胺的反應描述於 Borzilleri et al., J. Amer. Chem. Soc. 1 22,8 890,2000 ，及W 0 9 9 / 0 2 5 1 4中，其倂爲本文之參考資料）：

再者，埃坡黴素B( “epoB”）可用來製備衍生物3(埃坡黴素D， “ D3”）（如美國專利6,3 20,045號中之描述，其倂爲本文之參考資料）：

Me

本發明還包括利用本文所描述之方法和物質產製之埃坡黴素B的結晶型。吾人應了解前述之一般說明和下列詳細說明僅爲本發明之示範，而非用來限制本發明。 -9- 1291464

本發明之詳細說明本發明描述特殊處理方法與新穎之纖維小體堆囊菌突變株’這些突變株可一起或分別產製出具改良之埃坡黴素 B濃度的醱酵物，其主要是經由降低在醱酵物中之埃坡黴素A的產量來達成。纖維小體堆囊菌或其它合適微生物之細胞係，如：透過一或多次初始生長期之培養來增加，並用來提供用於產製埃坡黴素之醱酵物的接種體。在醱酵的則幾小時之間，如：2 4 - 7 2小時前後，細胞會利用在基質中的養分而開始生長。然後，將有助於產製埃坡黴素之量的養分，如：維他命、礦物質、醣類和胺基酸（或其它碳源或氮源，如：胺基酸先質）加入基質中。在一種實施例中，所加入之養分（如：維他命、礦物質、醣類和胺基酸）量爲可維持醱酵期間埃坡黴素A或埃坡黴素B之最大生產速度的量。在一種實施例中，埃坡黴素A或埃坡黴素B 之最大生產速率爲與不加入添加劑或養分者之生產量相較下，其中有較多量之埃坡黴素A或埃坡黴素B產生，或者是當加入之添加劑或養分低於理想量時，亦可產生較大之生長速率。在醱酵期間，加入足夠量之丙酸、丙酸之先質，或其鹽，以增加埃坡黴素B對埃坡黴素A之比例（“產物比”）。本發明亦針對可用來產製埃坡黴素之新纖維小體堆囊菌株。這些新菌株，尤其是菌株 SC16048，已藉致變反應，及後續之隨機選擇來取得。 -10- 1291464 (6) 纖維小體堆囊菌首先係在1 9 8 5年從南非南貝斯 (Zambesi)河岸之土壤樣本中分離出來。H0fU等人（如上述）最先描述使用此有機體可產製埃坡黴素。H0fle等人所使用之菌株稱爲 So ce90，其存放在 Deutsche Sammlung von Mikroorganism(德國微生物收集處，DSM) 中，存放編號6773。先讓菌株So ce90接受UV致變反應，再進行隨機選擇，以產生菌株 So ce90B2。菌株So ce90B2(亦稱爲 SC 1 6224)在搖動培養瓶（每一培養瓶中含有，如：1.8重量/容積％樹脂）可產生約50毫克/升或2.8毫克/克樹脂（其可在，如：3.5或4.5毫克/克之範圍內）之埃坡黴素B力價，及約〇 . 6之埃坡黴素B / A比。在本發明中，係以亞硝基胍（NTG)讓菌株 So ce90B2 或其衍生株產生突變，再進行隨機選擇，以產生菌株 SC 1 6408(存放之 ATCC 編號爲 PTA-3 8 80)和 SC 1 6449(存放之ATCC編號爲PTA- 3 8 8 1 )。後二種菌株根據布達佩斯條約存放於美國類型培養收集處，作爲專利存放菌株。選擇方法之細節說明於實施例中。在一種實施例中，本發明提供可在每升肉湯容積中產生（如：在下述定義之製備條件下）至少約1 〇〇毫克埃坡黴素 B的纖維小體堆囊菌株。在另一種實施例中，本發明提供可在相當於埃坡黴素B之製備條件下，每升肉湯容積至少產生8 0毫克埃坡黴素b，且埃坡黴素b對埃坡黴素A之比至少爲1的菌株。在一種實施例中，本發明提供可製造 5毫克埃坡黴素B/克埃坡黴素]3樹脂，或5毫克/克樹 -11 - 1291464 (7) 脂’且埃坡黴素B/A比至少爲1.0之菌株。在另一種實施例中，埃坡黴素Β/Α比至少爲1 · 5。而在另一種實施例中，埃坡黴素Β/Α比爲1.5至4.0。本發明亦針對可經由在醱酵物中加入添加劑來改良由纖維小體堆囊菌所產生之埃坡黴素Β對Α之比例的方法。在一種較佳之實施例中，該添加劑含有丙酸化物，此添加劑係在細胞已至多生長96小時後加入，但宜在生長 2 4-48小時後加入。在某些較佳之實施例中，在細胞已生長約3 4小時後才加入丙酸化物。早期藉由檢查G B F所進行之硏究中，在其它影響醱酵的因素中，在基質中加入一次丙酸化物的效果在〇 · 1 %之水準。這產生比例在0.5 9至 0.95間之埃坡黴素B/埃坡黴素A(B/A)。本文之發明者驚訝地發現（且此爲本發明的特性之一）：在搖動培養瓶，1 4 升醱酵器和產製醱酵器中所產生之埃坡黴素，尤其是埃坡黴素B，和B/A比可經由加入丙酸化物或丙酸鈉而顯著改良。加入丙酸化物或丙酸鈉可顯著改良埃坡黴素B之力價。例如：以培養瓶產製埃坡黴素B可經由在開始餵養後，定期（如：每天）補充在較佳之〇·〇5至0.80毫克/毫升 (0.0 0 5 - 0.0 8 %)範圍（在培養中所偵察到者）內的丙酸鈉而獲得顯著改良，更合適的爲補充在0.005-0.04%之範圍內的丙酸鈉。在一種實施例中，培養中之丙酸化物的目標量係 0.0 2 %或更少。另外，其它與丙酸化物相關之化合物（包括但不限於：丙酸甲酯和丙酸乙酯）亦被發現可改良埃坡黴素 B之產量，及B/A比。 1291464 (8) 在一種特別適合用於培養瓶醱酵的實施例中係另外加入含有一鹼價和二鹼價磷酸化物之混合物（選擇可提供適當之pH値的比例）的餵料。此餵料可倂入丙酸化物餵料中，或分開加入。本發明中描述一種成功利用樹脂添加物的大規模埃坡黴素純化方法。加入樹脂被發現可用來分離和純化埃坡黴素’並可顯著改良埃坡黴素之力價。在本發明之一種較佳實施例中，該樹脂爲乙烯苯/二乙烯苯聚合樹脂，如：XAD 樹脂，宜爲XAD-16或其同等物（可使用來自密蘇里州聖路易市之史格馬-歐德里奇公司（Sigma-Aldrich)，或賓州費城之羅姆和哈斯公司（Rohm and Raas)之安伯來特XAD-16(Amberlite XAD-16))。其它具疏水表面之安伯來特樹脂，如：以苯乙烯爲基礎之 XAD-4、XAD-1180或 XAD-1 600(羅姆和哈斯公司），以及如··以苯乙烯爲基礎之 XAD-207、HP20、HP21、SP825、SP8 5 0、SP700 或 SP207(其由於加入溴化物基團故較具疏水性）（這些樹脂係來自日本東京市三菱公司或美國紐約州懷普蘭市三菱化學公司）亦可用於本發明中。在基質中可倂入在大範圍內之樹脂，如：0.2重量/容積％至5.0重量/容積％，宜爲1.5 重量/容積％至4.0重量/容積％。將來自醱酵之含埃坡黴素的樹脂隨意以水及20-30% 水溶性乙腈或水溶性甲醇淸洗，以移除極性雜質，或以含淸潔劑（宜爲離子性淸潔劑，如：以硫酸烷酯爲基礎之淸潔劑），和一些胺（以驗的型式加入溶液中）的溶液淸洗之。 1291464 氯 (9) 所選擇之量需改良稍後從樹脂取得之埃坡黴素萃取物的品質。一種較佳之淸洗水溶液係利用0.5重量/容積％十二烷基硫酸鈉和0.5重量/容積％氨。在此最後一種實施例中，在以溶劑萃取前，宜先以水淸洗樹脂一或多次。來自醱酵之含埃坡黴素的樹脂宜以不能與水相混合之溶劑（與水相分開之相），如：醋酸乙酯或甲基-第三-丁醚（Μ T B E)萃取，以移除吸附在樹脂上之埃坡黴素。可用來萃取埃坡黴素Β之其它溶劑包括：正-丁醇、醋酸異丙酯、醋酸正-丙酯、醋酸正-丁酯和醋酸第三-丁酯。較合適的爲，將此濃溶劑萃取液加以濃縮，再將埃坡黴素Β從濃縮物中結晶出來。在一種實施例中係以水淸洗此濃溶劑，並將此經水淸洗之濃溶劑濃縮，並隨意地磨光過濾。當該溶劑合適時（如：爲醋酸乙酯時），可經由將蒸餾溶劑交換成抗-溶劑來將埃坡黴素Β結晶化。換言之，將一埃坡黴素Β大體上無法溶於其中之沸點相當高的第二種溶劑加入此濃溶劑中，並將此濃溶劑蒸餾至足夠的程度，以使其結晶化。可使用抽真空法來驅動或協助蒸餾。在一種實施例中係將溶劑濃縮，並加入適量之抗-溶劑。有用之抗-溶劑包括甲苯、己烷和庚烷類。可將所產生之漿液加熱，再冷卻至所選擇之設定好的温度，以增加所產生之晶體的品質。温度波動可用來改良晶體純度，將細粒減至最少，並產生較快速過濾之漿液。在某些其它溶劑方面，如：ΜΤΒΕ ，蒸餾濃縮之濃溶劑可在冷卻時產生有效之結晶環境（不使用抗-溶劑）。所產生的結晶宜進行過濾，以 -14· 1291464 (10) 產生初級埃坡黴素B。在半取和起始結晶化之期間係將埃坡徽素B與存在於起始萃取液中的大部分雜質（尤其是埃坡黴素A)分開。通常，埃坡黴素A爲初級埃坡黴素B中所含有之主要雜質。通常還有其它二種從醱酵衍生而來之構造上類似的雜質存在，也就是下列之哼唑同系物和乙基噻唑同系物：

本文所描述之純化埃坡黴素B的方法（包括再結晶和色層分析步驟）牽涉到除了去除其它物質外，亦將此二種化合物移除，直到其存在量不再具有意義的程度。然後，可將（宜經由上述方法取得）初級埃坡黴素B(也就是含甲苯之結晶型eP〇B，初級）在醋酸乙酯中加熱，再加入甲苯並持續加熱，以使其結晶化。然後，將混合物冷卻，再將所產生之結晶漿液過濾，並以甲苯淸洗濾餅來產生再結晶化一次之埃坡黴素B(也就是含甲苯之結晶型 epoB，再結晶化的）。或者，可將初級埃坡黴素B透過如實施例中所描述之製備性高效能逆相色層分析步驟（如：在管柱型式之RP/C-1 8上）來處理。隨意地，在將埃坡黴素樣本塡至管柱上前，先加入一爲先行容積的合適有機溶 -15- (11) 1291464 c 劑，或有機溶劑之混合物，以減少埃坡黴素沈澱。在一種實施例中，該有機溶劑爲，如：二甲亞楓（DMSO)。隨意地，加入一爲尾隨容積的合適有機溶劑，或有機溶劑之混合物，以減少埃坡黴素沈澱。然後，以一合適之有機溶劑、有機溶劑之混合物’或有機溶劑之水溶液來洗堤埃坡黴素。在一種實施例中，以乙腈和水之混合物洗提埃坡黴素。利用這些溶劑之洗提略圖可爲，如：線性或梯度，且係選擇可取得低度雜質之洗提略圖。累積具所需純度之含埃坡黴素B的分液，濃縮之，並以溶劑（包括但不限於醋酸乙酯）萃取之。然後，將濃溶劑萃取液加以濃縮並結晶化，如··經由加入低極性溶劑，如：正-庚烷或庚烷類，再隨意冷卻之。將漿液過濾，並以溶劑/抗-溶劑（以所選出之不會溶解天量埃坡黴素B的比例和量進行），如：2: 1之醋酸乙酯/正-庚烷淸洗之。將淸洗好之結晶乾燥，以產生高品質之埃坡黴素B。亦可使用其它純化方法，如：在一般相（如：矽石，或以矽石爲基礎之一般相，等）上進行色層分析。例如：可使用高效能一般相色層分析。可將在相當低極性之溶劑（如：二氯甲烷）中的樣本塡至管柱上，並以較高極性之溶劑（如：醋酸乙酯和庚烷之混合物）洗提埃坡黴素。利用這些溶劑之洗提略圖可爲，如：線性或梯度，且係選擇可取得低度雜質之洗提略圖。累積所需之分液，將其濃縮並結晶化，如：經由加入低極性溶劑，如：正-庚烷、庚烷，或甲苯，以將其從醋酸乙酯結晶出來。將漿液過濾，並以溶劑/抗·溶 -16- 1291464 (12) 劑（以所選出之不會溶解大量埃坡黴素B的比例和量進行），如：2 : 1之醋酸乙酯/甲苯淸洗之。將淸洗好之結晶乾燥，以產生高品質之埃坡黴素B ° 在某些其中不需大量移除乙基噻唑或哼唑同系物的情況（如：D 1之合成方法）中，可僅藉結晶作用來純化埃坡黴素B。例如：將固態埃坡黴素B物質溶解在，如：暖醋酸乙酯中，並經由冷卻至周圍温度或更低之温度來進行結晶化 (或再結晶化），接著，再過濾並乾燥之（如：在真空中）。結晶作用可重覆進行，如：2至3次，以取得所需之純度。用於生長產製埃坡黴素之微生物的生長基質可依，如：下述方法來配製：

-17- (13) 1291464 成分較佳者 (克/升）更佳者 (克/升）再更佳者 (克/升）粉末狀之脫脂奶 0.5-12 1-8 2-6 烤過之奈舒（Nutrisoy)粉1 0.5-12 1-8 2-6 德斯東（TastonepiS^ 0.5-12 1-6 1-4 麥精（MaltrirO-MtHO1 4-18 6· 1 4 8-12 CaCl2 · 2H2〇 0.2-2.4 0.4-1.6 0.8-1.2 MgS04 · 7H2〇 0.2-2.4 0.4-1.6 0.8-1.2 EDTA，鐵III，鈉鹽 0.002- 0.004- 0.006- 0.02 0.0 16 0.014 HEPES 6-20 8-16 10-14 甘油 0.5-12 1-8 2-6

用於生長產製埃坡黴素之微生物及用於產製埃坡黴素 (尤其是在搖動培養瓶中）的製造基質可依上述方法配製，但在甘油及接下去加入之樹脂的部分有些不同：成分較佳者更佳者再更佳者 (克/升） (克/升） (克/升）甘油 2-20 4-16 6-14 樹脂 10-40 12-35 15-30 有用之養分餵養溶液（尤其是用於搖動培養瓶者）含有： -18- 1291464 (14) 成分較佳 (%) 亦可交換使用其它脫脂奶、大豆粉、酵母萃取物和麥精澱粉且具可相比擬之結果。

丙酸鈉 2-5 麥精-Μ040 8-12 德斯東-1 5 4 2-5 這類養分餵料還可含有如下述之磷酸二鈉和磷酸一鈉： ___ 成分較佳（％ ) 巡里；鈉 1.0-2.0 巡！^鈉 0.3-0.7 所選擇之磷酸二鈉對磷酸一鈉之比例係能在將其加入鶴料時，可將培養之Ρ Η値從所需ρ Η値偏離的情況減至最低。爲了用於醱酵器中，上述之養分成分（HEPES除外，實將此項刪除）宜與抗起泡劑（如：來自道康寧公司，AF乳 ^ ’食品級）一起使用，此抗起泡劑係依下述方法加入： -19- (15) 1291464 成分較佳者 (克/升）更佳者 (克/升）再更佳者 (克/升）抗起泡劑 0.5-5 1-4.5 1.5-4 苛性劑（氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液）可依需要加入醱酵基質中，以維持可用之p Η範圍。樹脂可依下述方法加入：成分較佳者 (克/升）更佳者 (克/升）再更佳者 (克/升）樹脂 10-50 12-45 15-40 在產製醱酵過程中，宜依需要將丙酸化物和養分分別加入。丙酸化物餵料可，如：含有 8 0至1 5 0克/升丙酸鈉，最好加入可將丙酸化物量維持（如：藉HPLC決定）在 0.05至0.20毫克/ΜΙ間之量。丙酸化物可在將培養種母加入醱酵器20 _40後再開始加入。養分係以如下述之無菌餵料器貯存物來供應：成分較佳（克/升）德斯東-1 5 4 15-25 麥精-Μ040 55-75 抗起泡劑 0.5-1 .5 1291464 (16) 在長期醱酵方面，宜加入額外養分，如：來自下列無菌鶴料器貯存物之養分，與前述鶴料器貯存物相比下，其所加入之量較多：· 成分較佳（克/升）粉末狀脫脂奶 40-60 麥精-M040 140-180 甘油 60-90 抗起泡劑 0.5-1 .5 上述這二種鶴料之養分需選擇可避免啓動生長相者。本發明包括其中係將埃坡黴素B(“eP〇B”）依美國專利6,262,094號（其倂爲本文之參考資料）中之描述轉化爲具下式之衍生物1 ( “ D 1 ”）的產製埃坡黴素B的方法：

本發明亦包括其中係將埃坡黴素B轉化成具下式之衍生物 2( “D2”）（如 Borzilleri et al.，J. Amer· Chem. Soc· 1 22,8990,2000及WO 99/025 1 4號（其倂爲本文之參考資料） -21 - 1291464 (17) 中所描述者）的產製埃坡黴素B的方法：

本發明還包括其中係將埃坡黴素B(“epoB”）依美國專利6,3 20,045號（其倂爲本文之參考資料）中之描述轉化爲具下式之衍生物3( “ D3”）的產製埃坡黴素B的方法：

Me

埃坡黴素B之結晶型：本申請者亦藉本文所描述之方法和材料製備多種埃坡黴素B之結晶型。埃坡黴素b已可利用不同的溶劑和溶劑系統來取得。例如：本申請者已發現一種含甲苯之埃坡黴素B的溶劑化物化結晶型，本文稱爲epoB_ Το/3，其單位小格數據記錄於表1中。本申請者亦利用乙腈（也就是’ ep〇B- ΑΝ々）、醋酸乙酯（也就是，ep〇B_ EayS)、和異 -22- 1291464 (18) 丙醇（也就是，epoB- Ip /3 )，以及描述於下列實施例7中之溶劑系統來取得埃坡黴素B的結晶。這些結晶學上之異構型具有帶一 P2!間隔基團的單斜籠形構造，此P2 i間隔基團含有沿著b軸通過整個晶體延伸的親脂性溶劑道（1 道/單位小格）。各道可含有至多二種溶劑分子，如：甲苯、乙腈、醋酸乙酯或異丙醇（理想上可產生1 : 1之埃坡黴素B 溶劑化物）。從甲苯/醋酸乙酯溶劑混合物（如：1 : 1混合物）結晶化可使甲苯被優先倂入籠形道中（也就是取得eP〇B-T0 /3型，而非epoB-EA /3 )。該藥物之二種氫鍵-供給者 (羥基）與藥物間氫鍵有關，因而無法連接，及束縛住外來溶劑。

epoB- T 0 ^ 、epoB- ANyS 、epoB- EAyS 、禾口 ep ο B - IP 冷顯示出呈現在表1中之單一小格數據。用來取得這些含甲苯、乙腈、醋酸乙酯和庚烷之結晶型的結晶化條件描述於下列實施例中。根據實施例7製備之結晶的PXRD樣式顯示於第9、1 1和1 3圖中，亦進一步說明於下。列於表中之這些結晶型的特殊示範性變數如下，並顯示於表1中： -23- 1291464 (19) 型式 epoB- T0/3 依實施例8A中之描述從甲苯中結晶而出。 epoB- AN/3 依實施例8B中之描述從乙腈中結晶而出。 epoB- EA/3 依實施例 8C中之描述從醋酸乙酯（EtO Ac)中結晶而出。 epoB - IP 依實施例 8D中之描述從異丙醇（IPA)中結晶而出。 epoB- AN β ' epoB- EA β 、 epoB· IP/3 和 epoB- TO 卢之小數原子座標分別顯示在表2、3、4和5中。

-24- 1291464 (20) i 纖鑼您七赵酹 110-125 (部分熔化及再結晶)； 130(熔化） 82-94 100 理想之溶劑部位 1甲苯 /epo B ! I_ 1乙腈 /epo B 1 EtOAc /epo B 1IPA /epo B Q： 0.09 0.07 0.07 0.09 | ^ T- 1.201 I I L·—— 1.145 1.215 1.158 ί ί V/Z 829 ί 796 814 814 N CN CN CM CM > 1659(1) I 1592(1) 1628(1) 1628(1) CQ 113.04(1) 111.89(1) 111.87(1) 111.92(1) 0(A) 14.328(2) ! 13.601(2) 13.882(1) 13.870(2) b(A) 10.613(2) i 10.543(1) 10.587(1) 10.610(1) a(A) 11.853(1) 11.961(1) 11.939(1) 11.928(2) T(°C) CO CO CO CO CO 型式 Epo B-To/3 Epo B-AN β Epo B-EA β Epo B-lp/3 ! Μ铂顆郵^33»4|麽二載S擗这蘅瓔 -25- 1291464 (21) 表2 埃坡黴素B乙腈溶劑化物，EpoB- ANA型之小數原子座標（大部分氫原子已被省略）原子 X γ z

C1 0.4422 0.2380 0.3076 C2 0.5619 0.2882 0.3165 C3 0.6422 0.1833 0.3013 C4 0.7565 0.2263 0.2807 C5 0.8531 0.2847 0.3800 C6 0.8409 0.4180 0.4193 C7 0.8968 0.4218 0.5419 C8 0.8360 0.3345 0.5975 C9 0.7205 0.3935 0.6018 C10 0.6345 0.2947 0.6184 C11 0.5287 0.3609 0.6355 C12 0.4328 0.2722 0.6397 C13 0.3118 0.2674 0.5573 C14 0.2626 0.3435 0.4562 C15 0.2748 0.2789 0.3613 016 0.3977 0.3084 0.3684 C16 0.7197 0.3194 0.1878 C17 0.8080 0.1051 0.2508 C18 0.9083 0.5112 0.3717 C19 0.9258 0.3048 0.7095 C20 0.4763 0.1572 0.7109 C21 0.1833 0.3270 0.2580 C22 0.1927 0.4656 0.2359 C23 0.1008 0.2458 0.1993 C24 -0.0043 0.2676 0.1034 C25 -0.0708 0.1728 0.0409 C26 -0.1519 0.3799-0.0163 C27 -0.2252 0.4942-0.0664 S -0.1936 0.2297-0.0595 N -0.0507 0.3873 0.0719 〇1 0.3897 0.1501 0.2552 02 0.6748 0.1045 0.3926 05 0.9464 0.2278 0.4266 07 0.8893 0.5485 0.5778 〇12 0.3313 0.3359 0.6550 H3 0.5936 0.1283 0.2313 H6 0.7466 0.4426 0.3937 H7 0.9913 0.3942 0.5683 H8 0.8117 0.2471 0.5514 H13 0.2618 0.1794 0.5410 H15 0.2633 0.1778 0.3662 H3〇 0.6691 0.0154 0.3705 H7〇 0.9636 0.5994 0.5825 N27 0.4609 0.5049 0.0188 乙腈 C28 0.3963 0.4080 0.0038 乙腈 C29 0.3379 0.2975-0.0775 乙腈 -26- 1291464 (22)

埃坡黴素B醋酸乙酯溶劑化物，ΕροΒ- ΕΑ；5 型之小數原子座標（大部分氫原子已被省略）原子 X Υ Ζ C1 0.4400 0.2438 0.3107 C2 0.5605 0.2943 0.3190 C3 0.6416 0.1904 0.3056 C4 0.7559 0.2327 0.2857 C5 0.8532 0.2913 0.3822 C6 0.8410 0.4228 0.4212 C7 0.8957 0.4275 0.5404 C8 0.8319 0.3405 0.5928 C9 0.7164 0.4000 0.5966 C10 0.6298 0.3042 0.6134 C11 0.5231 0.3717 0.6266 C12 0.4266 0.2844 0.6321 C13 0.3066 0.2780 0.5503 C14 0.2581 0.3526 0.4526 C15 0.2706 0.2867 0.3589 016 0.3940 0.3148 0.3668 C16 0.7203 0.3272 0.1940 C17 0.8079 0.1121 0.2559 C18 0.9092 0.5160 0.3757 C19 0.9227 0.3099 0.7056 C20 0.4667 0.1703 0.7040 C21 0.1800 0.3335 0.2576 C22 0.1887 0.4688 0.2331 C23 0.0962 0.2506 0.2011 C24 -0.0076 0.2687 0.1042 C25 -0.0762 0.1706 0.0472 C26 -0.1515 0.3743-0.0242 C27 -0.2158 0.4821 -0.0821 5 -0.1923 0.2232-0.0566 Ν -0.0487 0.3847 0.0652 〇1 0.3878 0.1559 0.2575 03 0.6749 0.1137 0.3972 06 0.9464 0.2337 0.4280 07 0.8889 0.5526 0.5755 012 0.3257 0.3484 0.6457 Η3 0.5927 0.1346 0.2372 Η6 0.7463 0.4478 0.3947 Η7 0.9884 0.3992 0.5620 Η8 0.8080 0.2533 0.5499 Η13 0.2573 0.1911 0.5357 Η15 0.2575 0.1863 0.3624 Η30 0.6713 0.0150 0.3759 Η70 0.9745 0.5994 0.5930 028 0.5242 0.5794 0.0077 031 0.4179 0.4326 0.0063 C28 0.4731 0-5098 0.0256 C29 0.4265 0.4705 0.0892 C31 0.3610 0.3621 -0.0408 C30 0.2548 0.3272-0.0460 (醋酸乙酯) (醋酸乙酯) (醋酸乙酯) (醋酸乙酯) (醋酸乙酯)

-27- 1291464 (23) 表4 埃坡黴素B異丙醇溶劑化物，EpoB- IP /3型之小數原子座標（大部分氫原子已被省略）

原子 X 丫 Z C1 0.4418 0.2548 0.3104 C2 0.5609 0.3055 0.3186 C3 0.6429 0.2009 0.3049 C4 0.7565 0.2462 0.2851 C5 0.8541 0.3018 0.3837 C6 0.8410 0.4357 0.4229 C7 0.8977 0.4390 0.5415

u8 u.834d u.^49^ u.o^O C9 0.7184 0.4107 0.5972 C10 0.6325 0.3111 0.6156 C11 0.5261 0.3793 0.6303 C12 0.4292 0.2892 0.6329 C13 0.3087 0.2842 0.5528 C14 0.2607 0.3630 0.4551 C15 0.2736 0.2932 0.3613 016 0.3950 0.3241 0.3669 C16 0.7179 0.3380 0.1935 C17 0.8084 0.1250 0.2541 C18 0.9098 0.5290 0.3774 C19 0.9269 0.3222 0.7069 C20 0.4742 0.1736 0.7031 C21 0.1807 0.3387 0.2590 C22 0.1879 0.4780 0.2352 C23 0.1028 0.2530 0.2009 C24 -0.0041 0.2724 0.1029 C25 -0.0678 0.1712 0.0456 C26 -0.1517 0.3781 -0.0198 C27 -0.2289 0.4888-0.0775 S -0.1896 0.2262-0.0575 N -0.0526 0.3893 0.0653 〇1 0.3903 0.1657 0.2594 03 0.6763 0.1239 0.3954 05 0.9485 0.2459 0.4293 07 0.8898 0.5642 0.5781 012 0.3283 0.3539 0.6476 H3 0.5946 0.1457 0.2365 H6 0.7464 0.4597 0.3977 H7 0.9915 0.4115 0.5668 H8 0.8111 0.2625 0.5504 H13 0.2582 0.1971 0.5380 H15 0.2640 0.1927 0.3679 H3〇 0.6731 0.0260 0.3733 H70 0.9599 0.6223 0.5696 028 0.4344 0.2122 0.0495 (異丙醇） C28 0.3601 0.2863 -0.0462 (異丙醇） C30 0.4351 0.3798-0.0762 (異丙醇） C29 0.2460 0.3279-0.0487 (異丙醇） -28- 1291464 (24) 表5 埃坡黴素B甲苯溶劑化物，EpoB- TO /3型之小數原子座標（大部分氫原子已被省略）原子 X Y Z C1 0.4314 0.2211 0.3158 C2 0.5581 0.2739 0.3228 C3 0.6395 0.1704 0.3110 C4 0.7506 0.2081 0.2888 C5 0.8509 0.2746 0.3880 C6 0.8414 0.4043 0.4212 C7 0.8976 0.4053 0.5382 C8 0.8372 0.3234 0.5911 C9 0.7204 0.3812 0.5930 C10 0.6312 0.2790 0.6075 C11 0.5255 0.3494 0.6227 C12 0.4302 0.2588 0.6250 C13 0.3014 0.2537 0.5473 C14 0.2538 0.3361 0.4501 C15 0.2643 0.2640 0.3626 016 0.3877 0.2964 0.3648 C16 0.7158 0.3123 0.2026 C17 0.8082 0.0907 0.2610 C18 0.9061 0.4961 0.3806 C19 0.9323 0.2951 0.6989 C20 0.4703 0.1447 0.6945 C21 0.1702 0.3170 0.2598 C22 0.1709 0.4486 0.2391 C23 0.0898 0.2230 0.2030 C24 - 0.0145 0.2462 0.1060 C25 -0.0811 0.1430 0.0546 C26 -0.1432 0.3561 -0.0251 C27 -0.2089 0.4563 -0.0926 S -0.1987 0.1985 -0.0555 N -0.0507 0.3632 0.0580 01 0.3838 0.1303 0.2676 03 0.6742 0.0956 0.3983 05 0.9468 0.2169 0.4313 07 0.8912 0.5329 0.5727 012 0.3254 0.3255 0.6408 H3 0.5816 0.1062 0.2496 H6 0.7457 0.4264 0.3944 H7 0.9919 0.3719 0.5628 H8 0.8141 0-2297 0.5521 H13 0.2871 0.1529 0.5221 H15 0.2567 0.1589 0.3722 H30 0.6633 -0.0002 0.3785 H70 0.9663 0.5756 0.5776 C28 0.4258 0.4317 0.0030 (甲苯) C29 0.3526 0.3996 0.0429 (甲苯) C30 0.2586 0.3239 0.0126 (甲苯） C31 0.2245 0.2386 -0.0713 (甲苯) C32 0.2984 0.2800 -0.1182 (甲苯） C33 0.3923 0.3496 -0.1016 (甲苯） C34 0.5043 0.4979 -0.0119 (甲苯） -29- 1291464 (25) 疋義爲了本申請案之目的下列名詞應具如下述之個別意義： “埃坡黴素B之相當的產製條件”。爲了測量菌株間之埃坡黴素B對埃坡黴素A的相對產量，或埃坡黴素B 的淨產量，需要有標準的條件。“埃坡黴素B之相當的產製條件”列於下。注意：標準條件可依實施例中之描述做適當的比例調整（如：根據實施例2使用之125毫升生產培養瓶做比例調整）。 1 ) F 1階段：將1毫升來自冷凍瓶或維持培養瓶中的內容物轉移至含有約1 0毫升基質E (組成物說明於下）之1 2 5毫升的培養瓶內。將F1培養瓶在30°C、160rpm下培養3-4天。 2) F2階段：將來自F1培養瓶之全部內容物（約10毫升）轉移（10%) 至含有90毫升基質E之2 5 0毫升的培養瓶內。將此F2培養瓶以類似方法在30°C、160rpm下培養3-4天。 3 )產製階段：以10%量（10毫升）之來自F2階段的物質接種生產培養瓶（含90毫升基質E之250毫升培養瓶，見下述之基質配方）。或者，可使用“維持培養瓶”，這些經由每3 -4 天將培養進行例行的培養瓶轉移（在5%至10%量之範圍內） (26) 1291464 警而衍生得來。產製相中倂入至少1 5克/升之樹脂。一旦接種後，將生產培養瓶在3 0。(：、1 6 0 r p m下培養1 4天。加入鶴料以改良B對A之比例。鶴料係在接種後7 2小時依下述方法開始添加：從第3至11天，每天在每一生產培養瓶（1〇〇毫升培養容積）中加入1毫升餵料，另外，亦可依指示持續至第 14天。含丙酸化物之餵料含有10%麥精（Maltrin)-M040、4% 丙酸鈉，和3 %德士東（T a s t ο n e) - 1 5 4，因此，當依說明做 1 0 0倍稀釋時，每日在培養肉湯中之最終濃度爲〇 . i %麥精-Μ 0 4 0、0.0 4 %丙酸鈉，和〇 · 〇 3 %德士東-1 5 4 (不包括來自先前添加之量）。通常係在接種後1 4天將培養瓶成，以進行分析。 “丙酸先質”係指任何化合物，當將有效量之此化合物加入適當之培養中時，其可產生能有效增加埃坡黴素Β 對埃坡黴素Α之比例的丙酸量。丙酸可，如：透過細胞酶之作用，藉易產生丙酸的酯自動產生。本技藝中之一般技術人士可辨識出那些可很容易地測試出其是否可用來產生丙酸，或是否可增加埃坡黴素B對埃坡黴素A之比例的候選化合物。示範實例包括丙酸之甲酯和乙酯類。 “餵養”係指在醱酵期間，超過一次地將至少一或多種養分或添加劑，如：丙酸化物、丙酸鈉、含丙酸鈉之混合物或溶液、維他命、礦物質、醣類來源或胺基酸來源加入其中（如：定期地，經由間歇性饌養、經由大致上連續餵 -31 - (27) 1291464 黪養’等）。需了解：在整個醱酵期間連續餵養係包含在“加入超過一次”一詞的意義中。含甲苯”意指含有可測得之量的甲苯的溶劑化物 (經由如，但不限於：紅外線“IR”或X-射線粉末繞射法來測量）’其中該含甲苯之溶劑化物亦可含或不含—或多g 其它溶劑。【實施方式】除非另外詳細說明，下列實施例係利用本技藝中之技術熟習人士所熟知及例行使用之標準技術進行。這些#方拒例僅用來說明，而非限制本發明。實施例1 藉突變和選擇方式來製備菌株SCI 6408之方法，及細胞庫之製備方法先以亞硝基胍（NTG)處理菌株 So ce90B2 (SC 1 6224)，再藉隨機選擇來衍生出菌株 SC 1 6408。爲此，將SC 1 6224懸浮在10mMTris-HCl緩衝液中，並以1 毫克/毫升NTG，在ρΗ8·2下處理60分鐘。以NTG處理後，藉菌落選擇來取得菌落細胞株，並測試其埃坡黴素B 產製力，及B/A比。將分離出之菌落轉移至培養瓶中，並培養8-14天，再每隔3-4天將其在生長基質（基質E)中轉移：用於搖動培養瓶之生長基質E: •32· 1291464 (28) 成分克/升粉末狀脫脂奶 4 烤過之奈舒粉 4 德斯東-1 5 4 2 麥精-Μ 1 8 0 10 CaCl2 · 2H2〇 1 MgS04 · 7H2〇 1 EDTA，鐵III，鈉鹽 0.008 HEPES 12 甘油 4.3 將上述成分加入蒸餾水中，並以10%NaOH(或KOH) 將pH値調爲pH7.2 ，再於12 PC滅菌30分鐘。硏究細胞庫之製備方法：將1 〇毫升容積來自菌株 SC16408之三天-齡的培養轉移入含90毫升基質E的250 毫升培養瓶中。然後，將培養瓶在3(TC、160rpm下培養 2天，再從培養瓶中取出每份1 . 8毫升之培養液，並將其轉移入冷凍小瓶中，然後在-70 °C下冷凍。主細胞庫之製備方法：將2瓶來自硏究細胞集合庫的小玻瓶解凍，並將其轉移入2個含1 0毫升基質E的2 5 0 毫升培養瓶中，再在 30t、160rpm下培養4_5天。接著，將2x10毫升轉移入2個含90毫升基質E的250毫升培養瓶中，再於30°C、160rpm下培養2-4天。最後，將 1291464 (29) 這2個培養瓶累積起來並將每份1 · 8毫升之培養液轉移入冷凍小瓶中，然後貯存在-7 0 °C之冷凍庫中。操作細胞庫之製備方法：將5瓶來自主細胞庫的小玻瓶解凍，並將其轉移入5個含1〇毫升基質E的250毫升培養瓶中，再在30°c、160rPm下培養3-6天。接著’將 5x10毫升轉移入含90毫升基質E的5個250毫升培養瓶中，再於30。(：、16〇rpm下培養2-4天。使用這5個培養瓶中之細胞來接種1 2個含9 0毫升基質E的2 5 0毫升培養瓶，再將其在30°C、160rpm下培養2-4天。最後’將這些培養瓶累積起來，並將每份8毫升之養液轉移入冷凍小瓶中，然後貯存在-7 0 °c之冷凍庫中。約可製造出5 0 0 -600個用於此操作細胞庫之小瓶。實施例2 進行培養以藉由搖動培養瓶醱酵作用來產製埃坡黴素將來自冷凍小瓶之細胞（1 · 5毫升）接種於裝在1 2 5毫升培養瓶內之45毫升基質E中’並在30°C、160rpm下生長4-8天（F1階段）。然後，將5毫升之F1階段轉移入含45毫升基質E之新125毫升培養瓶中，並使其生長 3 -4天（F2階段）。然後，使用F2階段之細胞作爲用於埃坡黴素B醱酵作用之接種體。將1〇%接種體（5.0毫升）轉移入含45毫升生產基質之125毫升培養瓶中。然後，將培養瓶在搖動器（160rpm)中，上於30°C培養2週。此產製基質爲修改過之基質E，其含有1.6%(0·8克）XAD-16樹 -34 - (30) 1291464 脂。用於搖動培養瓶之產製基質的組成物顯示於下：用於搖動培養瓶之埃坡黴素B產製基質：成分克/升粉末狀脫脂奶粉 4 烤過之奈舒粉 4 德斯東-1 5 4 2 麥精-M040 10 CaCl2*2H2〇 1 MgS04 · 7H2〇 1 EDTA、鐵m、鈉鹽 0.008 HEPES 12 甘油 10 XAD-16樹月旨 16 將上述成分溶解在蒸餾水中，並以10%NaOH(或KOH) 將pH調整爲7.2 ，再於121 °C滅菌30分鐘。用於搖動培養瓶埃坡黴素B醱酵作用之餵養溶液的組成物爲：4%丙酸鈉、10%麥精- 040和 3 %德斯東_154。以 NaOH將餵料（100毫升，在125毫升之培養瓶中）調整爲 PH6.8-7.0，並將其在121°C滅菌30分鐘。在接種後之第 3至第14天，每天在各醱酵培養瓶中加入0.5毫升之餵養溶液。或者，現已發現可經由在第3、5、7和1 0天加 -35- 1291464 (31) 入二倍量之饌料來取得相當之結果。亦可再在上述餵養溶液中補充磷酸化物以獲得改良之結果，補充之磷酸化物可以1.5%二價磷酸化鈉和0.5%—價磷酸化鈉之型式加入，以在稀釋 100倍時，最終濃度分別成爲 0.015%和 0.00 5 % (不包括來自前次添加之殘餘量）。加入磷酸化物之另一種優點爲不需要調整pH値。透過補充磷酸化物，還可再增加10-20%額外之產量（以埃坡黴素B計）。在埃坡黴素之分析方面，收成樹脂樣本（0.8克），並藉HP LC分析。14天時，在搖動培養瓶中之埃坡黴素的產製量應可在第1 4天時產生下列力價：埃坡黴素A: 5.0-7.0毫克/克樹脂埃坡黴素Β:8·0-12.0毫克/克樹脂 Β/Α 比：1 · 1 ·2.0 與先前之菌株相此，菌株SC16408之培養顯示出可在搖動培養瓶中產製較多之埃坡黴素Β。實施例3 進行培養以在14升醱酵器中產製埃坡黴素 -36- 1291464 (32) F 1階段將3.0毫升來自2個冷凍小玻瓶之培養液接種入裝在250毫升培養瓶中之90毫升基質E內，並使：S：在30 °C和160 rPm下生長4_8天。 F2階段將2 0毫升（1 〇 % ) F 1階段細胞轉移入裝在5 0 0毫升培養瓶中之180毫升基質E內，再於30 °C和 160rpm下培養2-4天。 F3階段重複F2階段以增加接種量。將20毫升來自F2 階段之接種體轉移入6-8個各含180毫升基質E 之5 0 0毫升大的培養瓶內，並將培養瓶在3 0 °C和 160rpm下培養2-4天。 F4階段將120毫升（10%)來自F3階段之培養液轉移入含有1080毫升基質E之4升大的吸氣瓶內，然後在3 0°C和160rpm下培養2-4天。使用基質E來增加用於14升醱酵器之接種體。搖動培養瓶及吸氣瓶階段之高壓滅菌時間分別爲3 0和60分鐘。在醱酵器方面，生產基質係在121 °C滅菌60分鐘。該14升醱酵器生產基質爲一種改良的搖動培養瓶生產基質（如上述），其中已刪除HEPES，並加入2.5克/升抗起泡劑（來自道康寧公司之抗泡沫（Antifoam ) AF)。將6升之生產基質（pH値調整爲7.2-7.4)分裝在一 14升之醱酵器中，並進行滅菌。下表摘述在1 4升醱酵器規模時的處理變數： -37- 1291464 (33) 實驗室醱酵器之處理變數： F1 至 F4 14升温度 3 0°C 3 2〇C 壓力 1 Opsi 氣流 0.2 5 v vm pH___ 7.2-7.4 DO 2 0 - 4 0 % 扇葉直徑（英吋） 3.3-4.2 尖端速度（米/秒） 1.3-2.2 餵料滅菌時間 60分鐘基質滅菌時間 3 0分鐘 60分鐘樹脂 15-30克/升養分餵料組成物： --— 在一 5升大之瓶內製備由4.1%麥精-M040和1.3%德斯東-154組成之溶液。將此餵料在1 2 1°C滅菌6 0分鐘。速度：進料速度爲6毫升/小時。丙酸鈉餵料：將5.0%丙酸鈉（1.5升，在2升大之瓶 -—^ 內）在121°C滅菌60分鐘。丙黢鈉進料速度：從24-48小時至完成，2毫升/小時。根據HPLC之分析調整進料速度，以將丙酸鈉濃度維持在0.05-0.2 毫克/毫升之間。 (34) 1291464 在1 4升醱酵器中之埃坡黴素B的力價範圍摘述於下：埃坡黴素B力價，毫克/克 B / A比 5-12 1.0-3.0 實施例4 埃坡黴素之產製方法 5 0升醱酵器種母階段：在F1階段方面，製備基質E(2升），並在17個250 毫升大小的培養瓶中各裝入90毫升基質。然後，在121 °C下，將培養瓶高壓滅菌3 0分鐘。在各培養瓶中各接種來自一冷凍小瓶中之細胞，並使其在約30°C和160rpm下生長4-8天。在F2階段方面，製備27升基質E，並存17個4升大小的培養瓶中各裝入1 . 5升基質。然後，依上述方法滅菌。在各4升培養瓶中各接種來自F 1階段培養瓶的全部內容物，並使其在約30°C和160rpm下生長2-4天。在F3階段方面，製備80升之基質E*，並將其分裝入2個50升不銹鋼種母醱酵器中，並在各50升醱酵器中各接種三個來自F2階段之4升培養瓶的內容物。讓該5 〇升醱酵器在3 0 -3 3 t生長2-4天，然後，將其合倂在〜起，並用來接種800升醱酵器。基質E*爲： -39- 1291464 (35) 成分克/升粉末狀脫脂奶粉 (或大豆蛋白質濃縮物） 5 烤過之奈舒粉 5 德斯東-1 5 4 2.5 麥精-Μ 0 4 0 12.3 CaCl2 · 2H2〇 1.2 MgS04 · 2H2〇 1.2 EDTA、鐵瓜、鈉鹽 0.012 甘油 5.4 抗起泡劑 2.5

800升醱酵器種母階段：讓接種體在800升不銹鋼醱酵器中生長，直到細胞量足夠用來接種下一個種母階段（5，000升之醱酵器）。以去離子水（400升）製備用於此批之基質E* ，並將混合物（ρΗ8·7-8·9)9在17 psig，124°C滅菌60分鐘。將基質從滅菌器轉移入800升醱酵器中，並將pH値調整爲 ρΗ7·1_7·3。然後，將來自F3階段之80升內容物接種入醱酵器。以下列控制設定點來操作此批： -40- (36) 1291464 壓力· 8-12psig 氣流： 0.5 - 0 · 7 V V Μ 溫度： 3 0 - 3 3 °C PH: 7.1-7.3 攪動器之軸速： 5 0-60rPm 依需要加入無菌之苛性劑（氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液），以將pH維持在7 · 1至7.3之範圍內。每間隔一段時間採取本批樣品並分析其無菌性、pH、沈澱物和葡萄糖濃縮分。將C02排出，並偵察〇2。在約48 -60小時，當葡萄糖濃度開始下降時，將800升醱酵器之內容物（約 440-480升）轉移至5,000升醱酵器內。 5,000升醱酵器種母階段：在此階段之接種過程中係使用5,000升不銹鋼醱酵器。讓接種體在醱酵器中生長，直到細胞量足夠用來接種 40,〇〇〇升之產製醱酵器。將依上述方法製備之基質E*(在2,600升去離子水中配製）轉移入5,000升醱酵器中，並以約440-480升來自 800升醱酵器之接種體接種之。同樣地，將pH維持在7· 1 至7.3之範圍內。在約48 -72小時，當葡萄糖濃度開始下降時，將5,000升醱酵器之內容物轉移至40,000升醱酵器內。 40,〇〇〇升醱酵器產製階段： 1291464 (37) 使用 40,000升不銹鋼醱酵器來製備埃坡黴素B。一旦將醱酵器滅菌，並塡入無菌基質後，以在5,000升醱酵器中所製備的接種體接種之。一旦達到特殊的生產參數後，收成生產醱酵器中的內容物。將用於產製醱酵器之基質分成二份滅菌。將樹脂加入 2,800升水中，並將混合物在17psig，124°C滅菌75分鐘：成分量淸洗過之XAD-16樹脂 15-40克/升爲了製備1 8,000升基質，將下列成分加入去離子水 . (1 5，000升）中，並將PH調整爲7.1至7.3。將基質在連續 ^ 滅菌器中’於1 5 〇 C滅囷（保持時間1 0 0秒’出口温度6 0 °C )： -42- 1291464 (38) 成分重量（公斤）粉末狀脫脂奶粉 130 烤過之奈舒粉 ------. 130 德斯東-15 4 ----—, 65 麥精-M040 238 CaCl2 · 2H2〇 2 1.6 MgS〇4· 7H2〇 -—-- 2 1.6 EDTA、鐵瓜、鈉鹽 ^ _—---— 0.22 甘油 2 16 抗起泡劑 — ~~--- 54 '———1 將基質和樹脂轉移入生產醱酵器中，然後，以約 3100升來自5000升醱酵器之接種體接種之。以上述之控制設定點操作此批，但氣流爲〇.2-0.4vvm。依需要，以苛性鹼提高pH値（於0-80小時之間）。80小時後，以硫酸降低pH値。依需要，以抗起泡劑控制起泡。每天至少從醱酵器採樣一次，以測試無菌性、pH、沈澱物、葡萄糖、丙酸化物及埃坡黴素B之濃度。偵察在排出氣體中之 C〇2，並記錄之。只要C02至少爲0.3%，則約在3 0-60小時後開始餵養。將丙酸鈉（102克/升）注入醱酵器中，注入量爲1.9升/ 注射（範圍1.5-3.0)。注射之間隔時間爲從60分鐘開始， 1291464 (39) 每1 2小時減少，直至最少爲1 2分鐘。將丙酸化物加入 2800升去離子水中，並將溶液在17psig、124°C滅菌75 分鐘。在一種較佳之實施例中，丙酸鈉餵料係與含其它基質成分之餵料分開。以14.5升之注射量將麥精-M040和德斯東-154送進醱酵器中。注射之間隔時間從60分鐘開始，在1 04小時改變爲40分鐘。將成分加入去離子水（3000升）中，並在 17psig、124°C滅菌75分鐘。此餵料含有：成分克/升德斯東-1 5 4 20 麥精-M040 66 抗起泡劑 1.0 在作用期間，某些基質成分，如：脫脂奶粉、麥精-M040和甘油會用盡。在約1 15小時開始，中斷先前的餵料，每間隔40分鐘將下列混合物以14.5升之注入量加入產製醱酵器中。將成分加入去離子（3000升）中，並將混合物，ρΗ8·7-8.9，在 17psig、124°C 滅菌 75 分鐘： -44- 1291464 (40) 成分克/升粉末狀脫脂奶 49 麥精-Μ 0 4 0 154 德斯東-154 20 甘油 78 抗起泡劑 1.6

當達到所需之埃坡黴素B濃度（通常係在9 - 2 1天後）時，收集瓶中之內容物。埃坡黴素B力價之範圍爲約5 _ 24毫克/克樹脂，B/A比爲從約1.5至4。實施例5

以MTBE從XAD-16萃取埃坡黴素B，並將其結晶化以產生固體埃坡黴素B;藉逆相色層分析進行純化；最終分離出高品質之埃坡黴素B 將所收集且以水淸洗過之含埃坡黴素（約5.03公斤埃坡黴素B)的XAD-16樹脂（約5 5 0公斤）與水溶性甲醇混合，並將其以漿液型式塡入萃取管柱中。以水溶性甲醇淸洗塡好的樹脂（先使用一床容積之30%MeOH，再使用一床容積之50% Me OH)，以移除高極性之不希望有的物質。以MTBE淸洗之（約4床容積），移除埃坡黴素。收集濃洗提液並將其磨光過濾。經重力沈澱以去除任何水相後，將濃MTBE加以濃縮。將濃縮液經重力沈澱，去除水相， -45- 1291464 (41) 再將額外之MTBE(2床容積）加入此批中。將此批再濃縮成每升約含5至1 5克埃坡黴素B的濃縮液。將此批在約〇 °C下，於5-6小時之期間逐漸冷卻，以將其結晶化。將此結晶型固體過濾、淸洗並乾燥之。將所產生之產物餅溶解在温醋酸乙酯中，並磨光過濾。將濃濾液在真空中濃縮成每升約含20-45克埃坡黴素B之濃縮液。加熱至70 °C 後，將此批慢慢冷卻至約〇 °C，以產生結晶型漿液，然後，再將此漿液過濾，以冷EtOAc淸洗之，並在低於40 °C下乾燥，以產生分離出之再結晶的埃坡黴素B (來自樹脂之產量爲84%)。然後，將此產物藉逆相色層分析法純化。以水溶性乙腈（3 0-5 0%容積/容積）平衡裝塡有逆相靜止支持物RP/C-18的色層分析管柱。將再結晶之產物溶解在二甲亞碾UDMSO，1-1.5升/公斤）中，過濾混合物以去除不溶之物質，然後塡至管柱上（在此之前先塡入一份 100% DMS0)，然後，隨後塡入等容積之DMS0，以在加入水溶性流動相時減少樣本沈澱的情况。利用水溶性乙腈 (3 0- 5 0%容積/容積）將樣本從管柱洗提出，並藉UV檢出器在2 9 0 nm處偵察流出物。將埃坡黴素B之尖峰收集在許多分液中。藉HP LC分析分液中之埃坡黴素A和B，以及其它相關雜質。將所需之累積的管柱分液塡入蒸餾包中，並將此批在低於40 °C之温度下藉真空濃縮，以去除乙腈。將所產生之水溶液相以醋酸乙酯萃取至多三次，再將有機溶液在低 -46 - 1291464 (42) 於40°C之温度下’於真空中濃縮，以產生〇1至〇.2克/ 鼋升埃坡黴素B。將正-庚烷（或庚烷類）在4 〇艽加入此批中，然後，將此批慢慢冷卻至2到-1 〇。(：，並維持至少2 小時。將結晶漿液過濾，以醋酸乙酯/正-庚烷溶液淸洗之’然後’將最終之埃坡黴素B濾餅在真空中、3 5 - 4 0 °C 下乾燥’以產生3 · 3 6 7公斤產物，其所具有之效力相當於 91.7%之3.09公斤埃坡黴素b活性。來自樹脂之產量爲 6 1.4%。HPLC指出99.6面積％爲埃坡黴素B，0.4面積％爲埃坡黴素A，無其它存在量>〇.；!面積之雜質。實施例6

以醋酸乙酯從XAD-16樹脂萃取埃坡黴素B，並以甲苯作爲抗溶劑將其結晶化，以產生固體埃坡黴素B ;藉逆相色層分析法進行純化；最終分離出高品質之埃坡黴素B 在振動篩（SWECO TM)上以水淸洗含埃坡黴素B的 XAD-16樹脂，以淸洗樹脂。將一部分（約6.6升，含15.6 克埃坡黴素B，每克樹脂測定含2.36毫克埃坡黴素B)轉移至2 0升大小之容器中，利用約5升水淸洗樹脂。然後’將醋酸乙酯（約2床容積（BV)之投入樹脂）加入容器中。將漿液攪拌約1小時，並利用6 0 0毫升螺絲帽離心罐在3 5 00rpm離心5分鐘，以將不同層分開。將第一次之濃醋酸乙酯上淸液輕輕倒出，並測量其容積。接著，將稀薄之含樹脂的底層水溶液在容器中累積，並將醋酸乙酯（2 BV)加入容器中。將漿液攪拌約丨小時，然後離心，以將 -47- 1291464 * (43) 不同層分開。將第二次之濃醋酸乙酯上淸液輕輕倒出，並測量其容積。然後，將水（〜〇·3 BV之投入樹脂）加入第一次和第二次濃醋酸乙酯的合倂液流中，並攪動約3 0分鐘。接著，將下層水溶液從上層濃醋酸乙酯層分開。將濃淸洗好之醋酸乙酯層在低於4 5 °C之温度下濃縮成每升約含1 0克埃坡黴素B活性的濃縮液。然後，將此濃縮之濃醋酸乙酯溶液磨光過濾，並濃縮成每升含20-25克埃坡黴素B之濃縮液。濃縮後，加入甲苯，並將此批在真空中，於低於5 0 t之條件下濃縮成此批在加入甲苯前的一半容積。讓此批在約1小時的期間內冷卻至約1 8 °C，然後，在此温度下擾伴16小時，以產生結晶。接著’將此結晶批過灑，並以甲苯（〜0.2 BV)淸洗之，然後，將固體乾燥，以產生含 1 3.5克埃坡黴素B活性的固體約3 0.4克。來自起始樹脂之活性物產量爲87%。將利用上述方法從樹脂萃取得來之固體埃坡黴素B藉逆相色層分析進行純化。將管柱（Phenomenex Luna，15, C18(2) ，5.0公分x25公分，BV 400毫升柱）預先以3 BV之40%容積/容積乙腈-水平衡。將約4-6克之固體埃坡黴素B溶解在約4(TC之約6毫升之DMSO中，然後，將混合物通過濾紙以去除微粒。將約1.5毫升之DMSO注入樣本環中，以預防埃坡黴素在管中沈澱。然後，將富含埃坡黴素之濾液注入樣本環。注入後，以約〇 · 5毫升之 -48- 1291464 * > (44) DMSO淸洗埃坡黴素濾液容器，並將其與約1毫升之 D M S Ο —起注入樣本環內。在注入埃坡黴素樣本後注入 D M S 0 ’可預防在管內沈灑。將樣本環之內容物以約5毫升/分鐘之速度塡至管柱上。將埃坡黴素塡至管柱上後，藉唧筒讓4 0 %乙腈-水溶液通過管柱。3 - 4分鐘後，將流速增加爲約6 0毫升/分鐘。將埃坡黴素Α和Β之尖峰部分收集在分液中。通常，含濃埃坡黴素B之分液可在介於約2 · 5升和3 · 2 5升洗提容積間之切份中取得（埃坡黴素B尖峰通常在介於約 6和8床容積間洗提出）。累積之分液的容積約爲〇 . 7 5 升。當埃坡黴素B之尖峯幾乎到達基線（<1〇%尖峯高度）後，藉唧筒讓1 〇〇%乙腈通過管柱。當色層分析圖指出在 2 9 Onm處之吸收大致回到基線時，藉唧筒將40%乙腈-水溶液加至管柱上，以開始將管柱再平衡，供下一次使用。通常，使用2 BV之100%乙腈和3 BV之40%乙腈-水溶液來淸洗管柱，並將其再平衡。利用HPLC分析來決定分液之純度，並累積所需之分液。通常產量爲9 0 - 9 8 %。將累積之埃坡黴素B分液在真空中，於低於40 °C之條件下濃縮至約爲50%起始容積。以醋酸乙酯萃取濃縮之分液。將累積之醋酸乙酯萃取液在約4 0 °C之浴温下濃縮成約0.1克/毫升埃坡黴素B。一邊攪拌，一邊將正-庚烷 (或庚烷類）（使用50%容積之醋酸乙酯溶液）在約15分鐘之期間加入其中。然後，將萃取液冷卻至5 °C，並在此温度 -49- (45) 1291464 維持至少2小時。將產物結晶過濾，並以1 :2(容積/容積）正-庚烷：醋酸乙酯溶液淸洗之。最後，將結晶在約40 °C、真空中乾燥12小時。HP LC指出在不同批方面。有 99.5〜99.7%面積％爲埃坡黴素Β，Ό.3〜0.5面積％爲埃坡黴素Α。實施例7

以醋酸乙酯從XAD-16樹脂萃取埃坡黴素B，並以甲苯作爲抗溶劑將其結晶化，再進行再結晶以產生初級埃坡黴素 B ;藉一般-相色層分析法純化；最終分離出高品質之埃坡黴素B 步驟A·利用EtOAc萃取-甲苯結晶化來製備初級埃坡黴素 B: 將以水淸洗過之富含埃坡黴素B的樹脂（1 3 5 0克）塡至管柱上。使用水（2700毫升）來裝塡及淸洗管柱。經由將 94 5 0毫升（7床容積）之醋酸乙酯通過管柱來洗提埃坡黴素活性。讓醋酸乙酯洗提液沈澱至少1小時。去除深棕色水層及乳液層。將濃醋酸乙酯溶液在真空下濃縮成每升約含 20克埃坡黴素B之濃縮液。將濃縮液靜置2小時，並冷卻至20 °C。將已冷卻之濃縮液磨光過濾，並以醋酸乙酯 (3 6毫升）淸洗濾器。將合倂之濾液和淸洗液濃縮成每升約含8 0克ί矢坡傲素B之濃縮液’並將其加熱至6 5 C。在 10-15分鐘之期間內，一邊攪拌一邊加入等容積之甲苯，且將温度保持在60 °C上。將温度維特在65 °C 30分鐘，再 1291464 (46) 於1.5小時之期間內將温度降至40°C，然後再將温度於2 小時內降至PC。將所產生之結晶漿液在1 °C攪拌至少60 分鐘。將固體濾除，並以甲苯（漿液容積之20%)淸洗之。 (在多次重覆此方法時，母液通常含有2-6%之輸入埃坡黴素B活性）。將固體在真空中，40-45 °C之烤箱內乾燥至少4小時。或者，將固體在真空中、其温度介於40 °C和室温之烤箱內乾燥至少4小時。乾燥之初級埃坡黴素B濾餅的重量在8.4至20克之間，埃坡黴素B之效力在65 0至713微克/毫克間。此埃坡黴素B濾餅亦含有12%至26%埃坡黴素 A(面積百分比）。殘餘溶劑量爲0.7 % (重量/重量）EtO Ac和13%(重量/ 重量）甲苯。在所評估之5批方面：輸入重量分析（克e ρ 〇 epo B輸入在一級餅中 %回收 (克） B/公斤） (克）之Epo B(克） 1327-1391 4.4-12.2 6.0-16.5 5.5-13.6 87-98

此分離過程中之全部損失平均爲9.4 %。從樹脂到初級濾餅之埃坡黴素A尖峰對埃坡黴素B尖峰的百分比從平均4 9 %降至1 9 %。根據此步驟取得之結晶溶劑化物的 PXRD樣式和熱分析分別列於第9和1 〇圖中。步驟B.埃坡黴素B之再結晶化： -51 - 1291464 (47) 將EtOAc(0.14升）加入15克初級埃坡黴素b(710微克/毫克）中’並一邊攪拌一邊加熱至65 -6 8 °C。（濃縮成每升含7 5 - 8 0克活性之埃坡黴素B目標濃縮液）。在20分鐘之間加入甲苯（〇·14升），同時將温度維持在60 °C以上。將所產生之漿液維持在6 5 °C 〇 · 2 5 -1小時。然後，將此批在3小時之間冷卻至40 °C。將此批在2小時之間持續冷卻至〇 - 2 °C。然後，將此批維持在〇 - 2 °C 1 2小時。將所產生之結晶漿液過濾，並以甲苯（2 X 0 · 0 2 8升）淸洗據餅。通常，少於3%之輸入埃坡黴素B活性會流失至合倂的母液和淸洗液中。將濾餅在42 t及29吋Hg柱之真空烤箱中乾燥2小時。或者，將濾餅在40 °C和室温間，及 29吋Hg柱的真空烤箱中乾燥2小時。乾燥之濾餅重量爲 13.6克，具764微克/毫克效力。殘餘溶劑包括EtOAc(0.9 重量％)及甲苯（13.2%)。通常，存在之EtOAc和甲苯的合倂量爲1 3 -1 4重量％。結晶化濾餅之埃坡黴素A尖峰相對於埃坡黴素B尖峰之再結晶濾餅的面積百分比降至平均 6.9%。根據此步驟取得之結晶溶劑化物的PXRD樣式和熱分析分別列於第1 1和1 2圖中。般相色層分析：製備下列流動相： 2 0%(容積/容積）醋酸乙酯/正-庚烷溶液（〜10升）， 40%醋酸乙酯/正-庚烷溶液（〜1〇升），及 -52- 1291464 * . (48) 1 00%醋酸乙酯（〜1 〇升）。設立下列儀器：

Waters Delta Prep 4000:檢出器：UV 設在 290nm;管柱：Phenomenex Luna，1 0 微米，矽石（2) ，5.0 公分 χ25 公分（管柱容積〜490毫升）。在注射埃坡黴素溶液前，先以3床容積之20%(容積/ 容積）醋酸乙酯/正-庚烷溶液平衡管柱。將埃坡黴素B濾餅（5.5克）溶解在55毫升二氯甲烷中。將此批通過1微米PTFE濾器，以移除任何可能存在之微粒。使用二氯甲烷（2-5毫升）淸洗濾器。將濃二氯甲烷濾液注射至管柱上，前3 0秒之起始流速爲5毫升/ 分’再增加流速爲20毫升/分，直到樣本全部塡入。以二氯甲烷（2-5毫升）淸洗含埃坡黴素濾液之容器，並將淸洗液亦塡至管柱上。以20%EtOAc/庚烷開始洗提，同時將流速增加爲U8 毫升/分。當流速達到1 1 8毫升/分後，使用唧筒程式控制 _ $操作所需之啷筒程式。使用下列唧筒程式： 1291464 (49) 醋酸乙酯/庚烷體積床體積時間流速 (毫升/分） A B C 毫升 BV 0 118 20 7.5 118 20 897 1.83 7.6 118 40 45.6 118 40 4496 9.18 45.7 150 100 69.3 150 100 3 5 5 5 7.26 69.4 150 20 85.7 150 20 2460 5.02 85.8 0 20

收集分液並利用HPLC分析純度。礓I 在5批中，所收集之分液中之埃坡黴素B的面積百分比爲9 9.5 9 - 9 9.9 3 %，產量平均9 1 %。隨意地，使用等力之40%醋酸乙酯/正-庚烷洗提步驟，加上類似之1 〇〇%醋酸乙酯管柱淸洗步驟，和接下去之4 0%醋酸乙酯再平衡步驟，藉類似方法進行色層分析。

使用相同之色層分析儀器，但使用較小直徑之管柱1 .0公分x2 5公分。在中心切份之分液中的埃坡黴素B色層分析產量（164毫克）爲86%，且在收集之分液中的埃坡黴素B -54- (50) 1291464 面積百分比爲99.4%。上述之同等效力方法亦可在一 11 公分軸之塡壓管柱上進行，在中心切份中洗提出之eP〇B 爲31-35克，其色層分析產量爲90-94%。在收集之中心切份中的埃坡黴素B的面積百分.比爲99.6-99.9%。管柱可重複使用多次。步驟C .最終之結晶化：將所需之中心切份分液累積在一起，以產生一批容積爲1.62- 1 .73升之分液。在真空中，40-45 °C下去除溶劑。目標之蒸餾容積爲25 -2 8毫升（埃坡黴素B之濃度約爲 200-2 1 0克/升）。將温（約4 0°C )庚烷（50毫升）加入濃縮液中。或者，可在此步驟將温（約40°C)EtOAc(50毫升）加入濃縮液中。將所產生之漿液在約40 °C下攪拌約2小時，然後，在約5小時的期間，冷卻至〇 t，並再在約〇 °C攪拌至少5小時。在整個結晶過程中使用中速之機械攪拌。將結晶漿液過濾’並以冷1 : 1 E10 A c /庚院（2 5毫升）淸洗濾餅。將固體在40-45 °C、真空烤箱中乾燥5-6小時。或者，將固體在40 °C和室溫間之真空烤箱中乾燥5-6小時。來自再結晶（一次）之埃坡黴素B之分離出的埃坡黴素 B的重量（共5批）約4 · 2 - 5 · 0克（8 3.5 - 8 5 · 6 %活性產量），且HPLC純度爲99.7 8 -99.93 %面積百分比（平均99.80%)。在母液中流失之埃坡黴素B相對於輸入色層分析之埃坡黴素B活性而言約爲4%。濾餅中之殘餘溶劑爲Et〇Ac(5.8-6.0 %重量/重量）和庚烷（〇 · 6 - 〇 · 7 %重量/重量）。最終之埃坡 -55- 1291464 (51) 黴素B濾餅的效力在9 1 .5-92· 7 %重量/重量間。HP LC純度高於99.7面積百分比。或者’將累積之含4.83公斤ΕροΒ(1790升）的中心切份在真空中，<30°C下濃縮成濃度約爲200_210克/升之目標濃縮液，然後，加入庚烷（6 0升）。重複進行濃縮，再額外加入6 0升庚烷。將漿液在3小時內冷卻至2 〇它，然後’收集之並以3 0升庚烷淸洗之。將固體在真空中，2 0 -3 6 °C下乾燥1 6小時。取得全部重5 ·丨4 i公斤之固體， HPLC純度>99.6面積％。在濾餅中之殘餘溶劑爲 10.6%EtOAc和1.4%庚烷。根據此步驟取得之結晶溶劑化物的PXRD樣式和熱分析分別列於第1 3和1 4圖中。

實施例7A 從樹脂萃取埃坡黴素B，再重複進行再結晶將以水淸洗過之估計含有4.1 0公斤埃坡黴素B活性 (埃坡黴素B之面積％ = 58%，埃坡黴素A之面積％ = 29.2%) 的富含埃坡黴素的樹脂（549.8公斤）與水一起漿化，並將其塡入管柱（700升）中。將管柱排乾，吹入氮氣。然後以每小時〜1床容積之速度讓醋酸乙酯（2969公斤）洗提通過管柱’共通過〜6床容積。讓合倂之濃醋酸乙酯的洗提液重力沈澱〜1小時，再去除較下方之水相。然後，將濃醋酸乙酯濃縮成〜5 74公斤。然後，讓濃縮之醋酸乙酯在〜20 °C靜置〜2天，再進行磨光過濾。以醋酸乙酯（全部〜1 1 5公斤）淸洗濾器和管線。然後，將磨光濾液和淸洗液濃縮成 -56- 1291464 (52) 容積〜64升，然後暖至〜65 t：。將等容積之温甲苯加入其中，並一邊攪拌，再將此物質在〜65 °C保持〜30分鐘。然後，將此批在〜4小時之間慢慢冷卻至〜40 °C，再於〜2· 5小時之間冷卻至〇 t。然後，將冷漿液在〜0 °C維持約1小時。然後，將所產生之結晶漿液過濾’並以甲苯（〜64升）淸洗濾餅。將所產生之濾餅在真空中短暫乾燥，再利用温醋酸乙酯（〜200 1公斤）將其從過濾乾燥器中重新溶解。依類似方法將醋酸乙酯濃縮成〜6 5升來進行第一次再結晶。在温至 6 5 °C後，一邊攪拌，一邊加入等容積之甲苯，並將此物質維持在65 °C約3 0分鐘。以類似上述之方法將此批冷卻，過濾所產生之結晶型漿液，並利用與上述相同之步驟和儀器淸洗之。依上述方法再另外進行二次類似之再結晶，以產生埃坡黴素B結晶濾餅（4.3 84公斤）（81. 5%重量/重量）（3.5 73公斤埃坡黴素B)(埃坡黴素B之HPLC面積％ = 97.18:埃坡黴素 Α=1·40;埃坡黴素 F = 〇.3〇;噚唑同系物=0.30，乙基噻_同系物=0.56)。HPLC未偵測出超過〇」面積百分比之其它雜質。產物中含有13·8 %重量/重量甲苯和〇.8 %重量/重量醋酸乙酯。來自樹脂之分離出的純化埃坡黴素Β 的全部活性產量爲87%。實施例7Β 從母液流回收Ε ρ ο Β 將從ΜΤΒΕ或EtOAc萃取物結晶出ερ〇Β時所產生的 •57- 1291464 (53) 母液合倂，且每升溶液中含.2克EpoB及4.8克Ep〇A°將 10升此溶液在<5〇 °C之真空下濃縮成每升含1 1-15克Ep〇B 的濃縮液。加入一容積甲苯後開始形成固體；持續蒸觀直到再度取得1 1-15克EpoB/升之濃縮液。·再加入一容積甲苯，並再重複蒸館一次，以達到11-15克EpoB/升。將漿液在1小時之間冷卻至室温，然後攪拌90分鐘。將混合物再度加熱至5 0。(：，攪拌1小時，並在1小時之間冷卻至室温。至少攪拌3小時後，收集固體，以回收94%之 EpoB。分析固體可得42% EpoB和27% EpoA。

實施例7C 另一種替換法爲將累積之200毫升含有646毫克的 Ερ ο B的中心切份（來自實施例7中所提出之一般相色層分析步驟）慢慢加入43毫升甲苯中，並在<40 °C，真空下濃縮成40-45毫升。冷卻至18t後，置放1小時，收集結晶，以 2x4毫升甲苯淸洗並乾燥，以產生 7 5 3毫克之 EpoB，HPLC純度爲99·77面積％(不包括甲苯面積°/〇)。殘餘在濾餅中之溶劑爲13.5%甲苯，1.3%£1〇八(：和0.1%庚烷。實施例8 特殊結晶型之製備方法實施例8Α·· ΕροΒ-ΤΟβ之製備方法埃坡黴素Β甲苯溶劑化物之製備方法 -58- (54) 1291464 此方法涉及在6 5 -6 8 °C 將埃坡黴素B完全溶解在 EtO Ac中。將1容積之甲苯在>6〇 °C下加入此溶液中。經由温度循環順序（也就是在65 °C攪拌漿液（〇.5小時），冷卻至4 0 °C (超過3小時），然後冷卻至〇 - 2 °C (超過3小時），並至少在0-2°C維持1小時來提供漿液。過濾所產生之漿液，以甲苯淸洗後乾燥之，以提供帶有〜9_ 14%甲苯之埃坡黴素B。EpoB-TO /9型之單斜單位小格的分子構造及EpoB-TO冷之PXRD樣式分別顯示於第4和6圖中。實施例8B: EpoB-AN yS之製備方法埃坡黴素B乙腈溶劑化物之製備方法讓在水溶性乙腈中，大體純化之埃坡黴素B的溶液 (從實施例5中之逆相色層分析法產生之管柱分液累積得到）在室温中慢慢蒸發，以從乙腈-水中產生結晶漿液。直接藉X-射線繞射檢查結晶漿液。EpoB-AN /3型之單斜單位小格的分子構造及EpoB-AN /3之PXRD樣式分別顯示於第2和7圖中。實施例8C: EpoB-E A /3之製備方法埃坡黴素β EtOAc溶劑化物之製備方法將在1:1 EtOAc/庚烷中之埃坡黴素B的溶液濃縮爲〜19〇-195克/升之目標濃縮液。將1〇容積，〜4(rc之 EtOAc力口入埃坡黴素β之濃漿液中並一邊攪拌。將所產生之漿液在40。(：攪拌2小時，將其在5小時之間冷卻至〇 -59- (55) 1291464 # °c，然後再在0°c至少攪拌5小時。將漿液過濾，並以泠 1 : 1 EtOAc/庚烷淸洗濾餅。將濾餅在真空中乾燥5-6小時，以產生帶有〜5-14% EtOAc之最終埃坡黴素B濾餅。 Ep〇B_EA "型之單斜單位小格的分子構造及EpoB_EA/3之 PXRD樣式分別顯示於第1和5圖中。實施例8D: EpoB-IP冷之製備方法埃坡黴素B IPA溶劑化物之製備方法經由加熱溶液來將埃坡黴素B(70毫克）溶解在4毫升 IP A中，直到形成透明溶液。將溶液冷卻至周圍温度。經由過濾立即移除形成之任何固體。將透明濾液置於小玻瓶中，並蓋上具數個針孔之鋁箔。讓溶劑在周圍温度下在數天之內以非常慢的速度蒸發，直到觀察到實質之結晶生成。將結晶以溼漿液型式進行X -射線分析。Ε ρ ο B -1P /5型之單斜單位小格的分子構造及EpoB-IP /3之PXRD樣式分別顯示於第3和8圖中。實施例9 從埃坡黴素B(—種內酯）形成衍生物2(—種內醯胺）將四丁基銨氯化物與疊氮化鈉在THF/DMF中混合，以製備四丁基銨疊氮化物（TBA疊氮化物）溶液。經由過濾去除NaCl晶體以回收所產生之TBA疊氮化物溶液。將選擇用來穩定烯丙基陽離子、氯化銨、埃坡黴素B和TB A 疊氮化物溶液之爲催化量的試劑，如：三（二亞苄基丙酮）二 -60- (56) 1291464 鈀或此催化劑之氯仿加成物一邊攪動，一邊塡入培養瓶中。經由在0-5 t下通入氮氣25分鐘孑火將漿液脫氧。在0-5 °C下，將三甲膦加入其中。將反應混合物加熱至 3 2-3 8 °C，並持續攪動4-16小時，以製造從酯官能斷裂產生之胺基酸中間體。將反應混合物冷卻至18_24°C，並將其過濾以去除固體。以THF淸洗固體，並將此濾液與濃濾液合倂。將溶液在9-10小時之間，於3 0-3 7 °C下一滴滴地加入1-羥基苯並三唑水合物、1-(3-二甲胺基丙基）-3-乙基碳二醯胺氫氯化物和碳酸鉀的THF-DMF漿液中。將所產生之混合物冷卻至0-12 °C，以水驟冷之，但將温度維持在< 1 〇 °C。以醋酸乙酯萃取混合物三至四次，並以環己烷稀釋合倂的醋酸乙酯層（3 : 1醋酸乙酯-環己烷比），再以水回向萃取之。以額外之環己烷將有機層進一步稀釋成 2：1醋酸乙酯：環己烷比，並將其通過塡滿活性炭之藥筒，如：Zeta Pad R51SP 或R53SP，以減少殘餘鈀之量。將三乙胺（1 %)加入有機濾液中，並以含1 %三乙胺之2 : 1 醋酸乙酯：環己烷藉短矽膠過濾法來純化。收集濃洗提液，並將其在<3 7°C下濃縮成最終之11-14毫升/克的濃縮液。加入額外之環己烷，並將漿液在67-78 °C加熱45-60 分鐘。將漿液慢慢冷卻至約21 °C，過濾之並以 1:1醋酸乙酯：環己烷淸洗結晶型固體。將溼濾餅在真空中，<45 °C下乾燥，以產生埃坡黴素B之結晶型內醯胺同系物，產量約56M%。 (57) 1291464 « 實施例10 從埃坡黴素B形成經胺基取代之埃坡黴素衍生物（衍生物 1) 經由將在埃坡黴素B之噻唑環上的2 _甲基進行酶性羥基化，以將埃坡黴素B轉化成埃坡黴素F。此轉化作用可經由讓放射菌菌株作用在埃坡黴素B上來達成。用於此步驟之放射菌菌株揭示於下列文獻中：於2 0 0 2年1 2月1 7 曰提出之美國專利申請序號10/321，188和WO 00/39276，其倂爲本文之參考資料。將在乙醇中之埃坡黴素B ( 5 °/。容積/重量）加入微生物中，使其在16-18 °C下生長於一合適基質中，並以5〇 %重量/容積氫氧化鈉或30%重量/容積硫酸將pH値維持在6.9 和7 · 1之間。持續進行生物轉化，直到埃坡黴素b之濃度減至其起始値之3 -5 %。將能吸附埃坡黴素F之樹脂，如：XAD-16或XD-207力卩入醱酵槽（5%容積/重量）中，並在 1 〇 -1 8 °C攪拌1 6 - 7 2小時。將醱酵肉湯輕輕倒出，並以水淸洗樹脂（2 : 1水-樹脂比）。再重複淸洗二次。經由在巴克納（Buchner)漏斗上過濾來移除大部分殘餘水分。以水將帶有預先吸附之埃坡黴素F的X A D - 1 6樹脂漿化，並將其塡至管柱上。以醋酸乙酯萃取樹脂柱，並收集濃洗提液。將水溶液層吸出，然後，以5%碳酸氫鈉溶液和水淸洗濃醋酸乙酯分液，以去除顏色。將濃有機分液在減壓下濃縮，然後通過一預先以砂石塗覆之濾器，再進行 1 0 μΜ磨光過濾。然後，將產物在真空下蒸飽，將作爲抗_ 1291464 ‘ . (58) 溶劑之甲苯加入其中，並一邊攪拌，以將初級埃坡黴素F 結晶化。將濃甲苯混合物進一步濃縮，以減少醋酸乙酯含量，並加入更多甲苯。將結晶型漿液過濾，並以甲苯淸洗之。將埃坡黴素F溶解在二氯甲烷，或二氯甲烷/醋酸乙酯之混合物中，然後塡至裝塡有HPLC級矽石之色層分析管柱上，此管柱已以60-80:40-20醋酸乙酯：正-庚烷混合物（容積/容積）平衡過。將產物先以等力或60-80:40-20之醋酸乙酯：正-庚烷混合物（容積/容積），再以60-80:40-20之醋酸乙酯：正-庚烷混合物（容積/容積）從管柱中洗提出。經由在290nm 之U V偵測來偵察樣本及過程。將埃坡黴素f產物波峯分級分離出，以將很接近之洗提雜質減至最少。將累積之濃分液在真空下蒸餾成約1 00克/升的目標濃度。一邊攪拌，一邊將等容積之正-庚烷加入埃坡黴素F之獎液中。將此批在真空中蒸I留成約1 0 0克/升之目標濃度，加入醋酸乙酯，然後，把漿液維持在4 0 °C。將此批冷卻爲2到-1 〇 °C ’並在能使產物從溶液中結晶而出的温度下維持至少 5小時。將所產生之漿液過濾並以冷1 : 1醋酸乙酯：正-庚烷溶液淸洗之。將最終之埃坡黴素F過濾在真空中，3 5 -4〇°C下乾燥。將1，8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯（〇311，1.8當量）慢慢加入在四氫呋喃中之埃坡黴素F和二苯基膦醯疊氮化物（1.5當量）的懸浮液（預先在3A MS上乾燥）中，並將反 * 63 ~ 1291464 · (59) 應物在15-2 5 °C攪拌12-24小時。將三甲膦/四氫呋喃溶液 (1 · Ο Μ ，1 · 1當量）慢慢加入反應混合物中。加入水和氫氧化銨，並將混合物再攪拌3 0分鐘。以水稀釋反應混合物，並以三份二氯甲烷萃取水相。然後，以稀釋之氫氧化銨和半飽和氯化鈉溶液淸洗有機相，並蒸發至乾燥，以產生在噻唑甲基團上官能化之粗胺基衍生物（衍生物1)。利用預先以2.5%甲醇-0.2%三乙胺-二氯甲烷處理過之矽膠，藉管柱色層分析將粗產物純化。將合適品質之分液合倂，顯微過濾後蒸發至乾燥，以產生經色層分析之衍生物1。將此物質加至醋酸乙酯中τ，並將所產生之懸浮液在72-75 °C加熱，以取得溶液。將抗溶劑正-庚烷慢慢加入其中，並讓混合物在晶種之存在下慢慢冷卻至1 5 - 2 5 °C並一邊攪拌。冷卻後，維持在〜5 °C，經由過濾將所產生之固體分離出，再於真空中乾燥，以產生純化之結晶型胺基衍生物（衍生物1)，來自埃坡黴素 F之平均產量爲約 7 0M%。實施例1 1 從埃坡黴素B製備埃坡黴素D (衍生物3)的方法

Me

-64- 1291464 (60) [4S-[4R*，7S*，8R*，9R*，15R*(E)]]-4,8-二羥基-5，5, 7, 9，13-五甲基-16-Π-甲基- 2-(2-甲基-4·噻唑基）乙烯基]-1-氧雜-13(Z)-環六癸烯·2,6-二酮[埃坡黴素 D，衍生物 3]。在氬氣下，將WC16(198毫克，0.5毫莫耳）加入-78°C 之無水THF (5毫升）中，再加入正-丁基鋰（在己烷中之 1.6M溶液，0.625 毫升，1.0毫莫耳）。讓反應物在20 分鐘之間回暖至室温。去除一份（.〇 . 5 0毫升，0.0 5毫莫耳）鎢試劑，並將其在氬氣下加至埃坡黴素 Β(9·0毫克， 0.0 1 8毫莫耳）中，並將反應混合物攪拌1 5分鐘，然後，經由加入飽和NaHC03(l毫升）將其驟冷。以EtOAc(3xl 毫升）萃取反應混合物，將合倂的萃取液乾燥（NaeCU)，過濾並在真空下去除揮發物。將殘質以35%EtOAc/己烷進行色層分析，以產生標題化合物（7 ·〇毫克，〇·014毫莫耳）。 MS m/z : 492.3 ( M + + H) 〇【圖式簡單說明】第1圖顯示epoB-ΕΑβ型之單斜晶體單位小格的分子構造。第2圖顯示epoB-AN卢型之單斜晶體單位小格的分子構造。第3圖顯示6?〇；8-1?5型之單斜晶體單位小格的分子構造。 -65- (61) 1291464 * 第4圖顯示ep 〇 b _ τ 〇冷型之單斜晶體單位小格的分子構造。第5圖顯示埃坡黴素β之醋酸乙酯溶劑化物（epoB-EA /3結晶型）之觀察到的（上方）和模擬的（下端）PXRD樣式。第6圖顯示埃坡黴素b之甲苯溶劑化物（epoB-TO泠結晶型）之觀察到的（上方）和模擬的（下端）PXRD樣式。第7圖顯示埃坡黴素b之乙腈溶劑化物（6ροΒ-ΑΝ^ 結晶型）之觀察到的（上方）和模擬的（下端）PXRD樣式。第8圖顯示埃坡黴素b之異丙醇溶劑化物（e ρ ο B -1P冷結晶型）之觀察到的（上方）和模擬的（下端）PXRD樣式。第9圖顯示所觀察到之根據實施例7，步驟A製造的埃坡黴素B之含甲苯的初級溶劑化物之PXRD樣式。第1 〇圖顯示第9圖之含甲苯的初級溶劑化物的熱分析（DSC 和 TGA)。第11圖顯示所觀察到之根據實施例7，步驟B製造的埃坡黴素B之含甲苯的再結晶溶劑化物之PXRD樣式。第1 2圖顯示第1 1圖之含甲苯的再結晶溶劑化物的熱分析（DSC和TGA)。第1 3圖顯示所觀察到之根據實施例7，步驟C製造的埃坡黴素B之含醋酸乙酯的溶劑化物的PXRD樣式。第1 4圖顯示第1 3圖之含醋酸乙酯的溶劑化物的熱分析（DSC 和 TGA)。

Claims

； ! I年月曰修(更)正本匕酱^-----1 拾、申請專利範圍附件2A : 第92 1 26 1 05號專利申請案中文申請專利範圍替換本民國96年8月6日修正 1·一種增進產製埃坡黴素之微生物產製埃坡黴素B之方法，其包含：

(a )於培養基中且於藉由疏水性交互作用吸附埃坡黴素B之樹脂的存在下，醱酵產製埃坡黴素之微生物菌株，其中經培養該微生物達2 4至4 8小時時，將丙酸、丙酸前驅物、或彼等之鹽或酯之進料加入至該培養基中以使相對於在不含該丙酸、丙酸前驅物、或彼等之鹽或酯之進料的情況下經醱酵該微生物所產製之埃坡黴素B對埃坡黴素A之比例，埃坡黴素B對埃坡黴素A之比例係增加至少2倍；

(b) 在以水爲底質之基質中收集樹脂； (c) 利用選出之用於萃取埃坡黴素B並將其自該以水爲底質之基質中分開的溶劑以萃取樹脂；及 (d )在色層分析步驟前，結晶來自萃取相之埃坡黴素B。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該來自步驟（d) 之結晶化的埃坡黴素B實質上爲純埃坡黴素b。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該樹脂係經由 —種極性溶劑萃取。 1291464 (2) 4.如申請專利範圍第1項之方法，其中該添加劑爲丙酸鈉、丙酸甲酯或丙酸乙酯。 5 .如申請專利範圍第！項之方法，其中該結晶化步驟之進行係用來將埃坡黴素Α之量減少至約爲萃取步驟（c) 後所存在之埃坡黴素A量的55%或更少。 6 ·如申請專利範圍第5項之方法，其更包含步驟 (Ο至少一種能有效地將埃坡黴素A的量減少至約爲結晶化步驟（d)後所存在之埃坡黴素A量的55%或更少的第二次結晶化步驟。 7·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該產製埃坡黴素之微生物爲纖維小體堆囊菌。 8 .如申請專利範圍第丨項之方法，其中該樹脂爲以苯乙烯/二乙烯基苯爲底質之聚合物。 9 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中該樹脂爲 X A D -1 6 〇 1 0 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟（d)包含： (1)加入第二種埃坡黴素B無法溶於其中，或僅稍溶於其中的溶劑； (Π)移除至少一部分萃取溶劑；及 (i i i)將所產生之溶劑或溶劑混合物的温度轉移成埃坡黴素B可結晶化之温度。 1 1 ·如申請專利範圍第1 0項之方法，其中該萃取溶劑爲醋酸乙酯或MTBE，且該第二種溶劑爲甲苯。 1291464 (3) 12. 如申請專利範圍第1項之方法，其更包含步驟 (f)在步驟（c)之前，以水溶性乙腈，或水溶性甲醇，或含清潔劑及以鹼之型式加入的胺試劑的水溶性基質清洗樹脂，該所選出之水溶性基質不會洗提出埃坡黴素B。 13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（c)更包含將含有埃坡黴素B之溶劑磨光過濾。 1 4 .如申請專利範圍第1項之方法，其更包含將埃坡黴素B或其鹽轉化成具下式之衍生物2’或其鹽：

衍生物2 1 5 .如申請專利範圍第1項之方法，其更包含將埃坡黴素B或其鹽轉化成具下式之衍生物1 ’或其鹽：

衍生物1 1 6.如申請專利範圍第1項之方法，其更包含將埃坡 1291464 (4) 黴素B或其鹽轉化成具下式之衍生物3，或其鹽： Me

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