HU176462B - Eljárás ergolin-származékok előállítására fermentációs úton - Google Patents

Description

A találmány tárgya ipari eljárás ergolin-származékok elsősorban az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidák és 9,10-dihidroalkaloidák, valamint ergometrin előállítására fermentációs úton egy új mikroorganizmus, a Claviceps purpurea (Fr.) Túl. se- 5 jitségével szintetikus tápközegekben történő szubmerz (felület alatti) tenyésztéssel. A képződött anyarozs-alkaloidákat azután a fermentációs folyadékból izoláljuk, és kívánt esetben 9,10-helyzetben dihidrogénezzük. Az említett alkaloidák és 9,10-di- 10 hidroalkaloidák terápiás szempontból igen értékesek, és a belgyógyászatban, neurológiában és ginekológiában nyernek alkalmazást.

Az anyarozsalkaloidák nagyipari előállítása, mint ismeretes, ma is nagymértékben úgy történik, 15 hogy a rozson parazitaként élő Claviceps purpurea mikroorganizmus alkaloida-tartalmú szklerociáit földművelésszerűen tenyésztik. Az ezzel kapcsolatos tetemes hátrányok elkerülése végett, már régóta folytatnak olyan kísérleteket, hogy a Claviceps-et 20 fermentorban is alkaloida-képzésre késztessék.

Általános tapasztalatok szerint az ilyen, szintetikus közegeken végzett tenyésztések esetében az anyarozsalkaloidák bioszintézisére csak igen kevés, kizárólag erre a célra tenyésztett Claviceps-törzs 25 képes.

Mivel ezeknek a törzseknek az öröklött tulajdonságoknak megfelelően különböző az összetételük, csak egy részűk képezi az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidákat, amelyek a különösen 30 értékes peptid-típusú anyarozsalkaloidákon belül terápiásán differenciáltak.

Annak ellenére, hogy néhány ilyen törzs már ismert (lásd a 150 631 számú magyar szabadalmi leírást, a 41 967 számú Német Demokratikus Köztársaság-beli szabadalmi leírást, az 1 158 380 számú Nagy Britannia-i szabadalmi leírást, az 1 806 984 és 1 909 216 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásokat), még semmiképpen sincsen megoldva csak az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidák, vagy egyéb anyarozsalkaloidákkal kombinált szaprofitikus előállítása nagyipari méretekben. A folyamatos előállítás szempontjából előfeltétel, hogy a fermentációs eljáráshoz inokulumként nagy mennyiségben, könnyen és biztonságosan előállíthatóan mindig rendelkezésre álljon a törzsnek egy teljesítőképes kiindulási anyaga. A technikai mikrobiológiában ebből a szempontból szokásos és előnyös módszer abból áll, hogy ennek az organizmusnak speciális szaporodóegységeit (konídium-spórákat) alkalmazzák, amelyek nemcsak azt teszik lehetővé, hogy a törzs megkívánt tulajdonságait sok éven át liofilizált spórakonzervek segítségével stabilan tartsák, anélkül, hogy szükség lenne az 1 206 384 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban ismertetett igen komplikált és drága törzskiaiakításra, hanem elsősorban azt is lehetővé teszik, hogy a nagy spóraszám/térfogategység következtében nagy mennyiségű tápoldatot csak kis mennyiségű inokulummal kell beoltani.

Ennek az eljárásnak az alkalmazása feltételezi, hogy a törzsnek egy meghatározott, ugyancsak örökletes, rögzített tulajdonsága van, nevezetesen az, hogy megfelelő körülmények között az alkaloidák bioszintéziséhez szükséges nagy számú, igen nagy potenciájú spórákat képez, amelynek következtében a tápoldat beoltását, még nagyipari méretekben is, a konídium-spórák szuszpenziójával lehet végezni. Mint ahogyan ez a 150 631 számú magyar szabadalmi leírásból, valamint Amici cikkéből [lásd: Appl. Microbiology 18, 464-468 (1969)] világosan kivehető, pontosan ez a tulajdonság teljesen vagy csaknem teljesen hiányzik a szaprofitikusan tenyésztett ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidákat képező ismert Claviceps purpurea törzsekből. Érmek következtében az oltóanyagot szilárd táptalajon közbenső szaporításnak kell alávetni, és az így kapott micéliumot az előtenyészet nagyipari berendezéséhez steril körülmények között kell homogenizálni, ami igen kedvezőtlen feltételeket teremt.

Az említett irodalmi forrásokból az is kitűnik, hogy ezeknél az ergotoxin-képzőknél a fermentációs eljárás befejeztéig a sejtekben képződött ergotoxinnak csak csekély része vándorol a sejtfalon át az ezt körülvevő vizes tápközegbe.

Ennek megfelelően a képződött alkaloidák teljes kinyeréséhez külön fel kell dolgozni mind a tenyésztési szűrletet, mind a micéliumot. A szubmerz tenyésztés során az anyarozsalkaloidák bioszintézisére képes törzsek rendszerint nagy mennyiségű pigment- és ballasztanyagot képeznek, ennek következtében nagyon komplikált eljárásmódok szükségesek a feldolgozáshoz, amennyiben a kitermelési százalékok nem kielégítőek. Az 1 158 380 számú Nagy-Britannia-i szabadalmi leírás szerint a tenyésztési szűrletet 9-es pH-nál kloroformmal extrahálják, a kapott extraktumot vizes borkősav-oldattal extrahálják és ezt az extraktumot egyesítik a hasonlóan komplikált módon kapott és tisztított micélium-extraktummal. Az egyesített extraktumot be párolják és hexánnal leválasztják a nyers alkaloida-bázisokat. A kapott csapadékból jégecettel, metanollal és kénsawal eltávolítják az ergotamin-szulfátot, a maradékot bepárolják, vízben oldják és a vizes oldatot 9-es pH-nál újból kloroformmal extrahálják. A koncentrált kloroform-extraktumot 100-szoros mennyiségű szilikagélen kromatografálják és végül az így tisztított ergokriptint benzolból izolálják bázis alakjában. Egy további kromatográfiás frakcióból, bepárlás és a maradék vizes acetonos oldása után további ergotamint izolálnak.

Az alábbiakban részletesebben ismertetett új Claviceps purpurea törzs segítségével végzett tenyésztések esetében az anyarozsalkaloidák izolálására' leírt általános eljárások (1 158 380 számú Nagy-Britannia-i szabadalmi leírás és a 3 485 722 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) nem vezettek eredményhez. Elsősorban az okozott zavart, hogy a kloroformos extrakciónál a tenyésztési szűrlet, valamint a micéliumextraktum is könnyen képezett emulziót. Ugyancsak nem sikerült az ergotoxint kristályos bázissá alakítani, és a fenti szabadalmi leírásokban a nem-kristályos tiszta- vagy nyersalkaloid-koncentrátumokra leírt kitermelési százalékokat sem lehetett elérni.

A 41 967 számú Német Demokratikus Köztársaság-beli szabadalmi leírás értelmében a csekély alkaloida-koncentrációjú tenyésztési folyadékokból nyert extraktumot, amely egymás mellett tartalmaz ergotoxint és ergometrint, növekvő polaritásü eluálószerekkel kromatografálják és az egyes alkaloidákat önmagában ismert módon kristályosítják. Általában ismeretes azonban, hogy a metanol-tartalmú oldószerekkel végzett eluálás olyan ergometrint szolgáltat, amelynek túl nagy, azaz nem kielégítő a pigment-tartalma.

Az ergotoxin nyomás alatti hidrogénezését a 883 153 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás és a 470 573 számú kanadai szabadalmi leírás szerint végzik nagy aktivitású palládium, illetve hordozóhoz kötött palládium katalizátor segítségével. Az ilyen eljárás a hidrogénezett termék nem-kívánatos pigment-tartalmához vezet, ami nyilvánvalóan a nem-kielégítő szelektivitásnak a következménye, és ezért további tisztítási lépések szükségesek.

A találmány szerinti eljárás célja, hogy megjavítsa az ipari eljárást ergolin-származékok, elsősorban az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidák és a 9,10-dihidroalkaloidák, valamint ergometrin előállítására.

Azt találtuk, hogy egy új törzs, nevezetesen a Claviceps purpurea (Fr.) Túl., amely szintetikus, szervetlen nitrogén-tartalmú vegyületeket, cukrot, szerves savakat és a szokásos szervetlen sókat tartalmazó táptalajokban szubmerz tenyésztés során képezi az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidákat, ergometrint, valamint további ergolin-származékokat, egyrészt ipari szempontból igen előnyös alkaloid-szintézist tesz lehetővé, másrészt szilárd vagy folyékony tápközegeken, meghatározott körülmények között a fermentáció-technikai célok szempontjából különösen előnyös mennyiségű, nagy potenciájú, alkaloid-szintézishez alkalmas spórákat képez.

Ezenkívül a micéliumot körülvevő fermentációs közeg tartalmazza a képződött ergotoxin nagy részét és az ergometrin gyakorlatilag teljes mennyiségét.

Továbbá azt találtuk, hogy ha az új Claviceps purpurea törzs tenyésztési folyadékot szűrjük, és víz hozzáadása nélkül, vagy célszerűbben azonos térfogatú vízzel történő hígítás után a tenyésztési folyadék pH-ját ammóniumhidroxid-oldattal 8-9-re állítjuk be, úgy e tenyésztési folyadékot gyakorlatilag teljesen (kimerítően) és a zavaró emulzióképzés nélkül extrahálhatjuk karbonsav-alkilészterekkel, előnyösen etilacetáttal, illetve a hígitási variáns esetében végezhetjük az extrakciót klórozott szénhidrogénekkel is, előnyösen metilénkloriddal. A hígitási variáns esetében ilyenkor a ballasztanyag kívánt csökkentésén kívül meglepő módon emelkedik a tenyésztési szűrletben levő ergotoxin mennyisége.

A szűrés után kapott biomasszát, a fennmaradó alkaloid-tartalomtól függően acetonnal extraháljuk, a szűrés után kapott zavarosság-mentes extraktu1 mot először vizes sav-oldatokkal, előnyösen foszforsav-oldattal beállítjuk pH = 2-3-ra, és ekkor tisztíthatjuk szénhidrogén-keverékekkel, például petroléterrel vagy petroléter-xilol-eleggyel. az elvált vizes fázis pH-ját ammóniumhidroxid-oldattal beállítjuk pH = 8—9-re, majd karbonsav-(rövidszén!áneú alkíl)észterekkel, előnyösen etilacetáttal extraháljuk és a kapott extraktumot vízzel mossuk.

Azt találtuk továbbá, hogy meglepő és elegáns módon úgy is eljárhatunk, hogy az anyarozsalkaloidákat az ammóniumhidroxid-oldattal meglúgosított, az új Claviceps purpurea-t tartalmazó tenyésztési folyadékból, a biomassza előzetes elválasztása nélkül, ammóniumszulfát hozzáadásával közvetlenül extrahálhatjuk karbonsav-(rövidszénláncú alkil)-észterekkel, előnyösen etilacetáttal, majd eltávolíthatjuk a zavaró kísérőanyagokat oly módon, hogy híg vizes savakkal, előnyösen foszforsav-oldatokkal folyadék-folyadék-extrakciót végzünk, majd a kapott vizes extraktumot pH = 8-9nél karbonsav-(rövidszénláncú alkil/-észterekkel, előnyösen etilacetáttal, folyadék-folyadék-extrakciónak vetjük alá.

Az előzőek szerint tisztított alkaloid-extraktumot +30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten bepárolhatjuk, és a kapott koncentrátumokból megkezdjük az alkaloidák differenciált végső tisztítását.

Azt találtuk továbbá, hogy a tiszta alkaloidák kinyerése szempontjából, összehasonlítva a 41 967 számú Német Demokratikus Köztársaság-beli szabadalmi leírással előnyösebb, ha a fentiek szerint kapott nyers alkaloid-koncentrátumokat 1-3 térfogatrész kloroformban oldjuk, az oldatokat +10 C-t meg nem haladó hőmérsékleten tároljuk, a meglepő módon csaknem kvantitatíve kikristályosodó pigmentszegény eigometrin-kloroform-adduktot leszűrjük és átalakítjuk nagy tisztaságú savaddíciós sóvá, előnyösen hidrogénmaleináttá. Az ergometrin leszűrése után kapott szűrletet ezután +30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten zavarmentesen koncentrálhatjuk, előnyösen oly módon, hogy előbb adszorbeáltatjuk, majd deszorbeáltatjuk vagy az ún. Batch-eljárás segítségével, vagy alumíniumoxidon végzett oszlopkromatográfia útján, aholis az alkaloid-koncentrátumban levő össz + -alkaloidmennyiségre számított arány előnyösen 1 :20 vagy 1 :5, és egyúttal aktív-szén hozzáadásával (adszorbeálószerek aránya: alumíniumoxid : aktív-szén = 5:1), és eluáíószerként karbonsav-alkilésztereket, előnyösen etilacetátot alkalmazunk, vagy klórozott szénhidrogéneket, előnyösen kloroformot, vagy az előbbi oldószerek egymással képezett vagy aromás szénhidrogénekkel, előnyösen benzollal képezett két-komponensű oldószer-eíegyeket alkalmazunk. Az extraktumokat vagy eluátumokat ezután +30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten bepároljuk, a kapott ergotoxin-ergotoxinin-keverékeket aromás szénhidrogénekkel, például benzollal, toluollal vagy xilollal végzett kristályosítással szétválasztjuk, és a kapott epimer-mentes nagytisztaságú kristályos ergotoxin-aromás vegyület-adduktot adott esetben átalakítjuk az ergotoxin savaddíciós sójává, előnyösen etánszulfonátjává.

Továbbá azt taiaiiuk, hogy a fenti módon kapott ergotoxin kevés aktív Raney-nikkel jelenlétében Ί-5Ο—8Ο °C, előnyösen +60 °C hőmérsékleten és 30-70 atm, előnyösen 50 atm nyomáson dioxánban, vagy légnyomáson +20-30 C, előnyösen +25 °C hőmérsékleten, 5-10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében, vizes dioxánban hidrogénezzük rotációs berendezésben, és így jutunk a pigment-mentes 9,10-dihidroergotoxinhoz. A hidrogénezett bázisokat önmagában ismert módon átalakítjuk savaddíciós sóikká.

Az új, tenyésztés útján kapott törzset, amelynek jellemzői eddig ismeretlenek, és amely alkalmas technikai és gazdasági szempontból előnyös ipari anyarozsalkaloida-termelésre, különösen az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidák és ergometrin termelésére, a Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena dér Deutschen Akademie dér Wissenschaften zu Berlin nevű intézetben deponáltuk, és a deponálási száma IMET PA 130.

Az új törzset egy kísérleti parcellából származó szkleróciumból végzett tenyésztésből izoláltuk, és mutagén kezelésnek vetettük alá. Az új törzs az

1. táblázatban összefoglalt morfológiai tulajdonságokkal rendelkezik.

I. Táblázat

A Claviceps purpurea (Fr.) Túl. (IMET PA 130) törzs morfológiai tulajdonságai, különböző agar-táptalajokon, 14 napos, Petri-csészékben 24 °C-on végzett tenyésztés után

1. Táptalaj (3% szacharóz,

0,3% náíriumnitrát,

0,1% káliumhidrogénfoszfát,

0,05% magnéziumszulfát-heptahidrát,

0,001% vas(II)-szulfát-heptahidrát,

1% kukoricát duzzasztó víz,

3% agar, pH = 6,8-6,9)

A képződött kolónia alakja:

Domború, kompakt, szabálytalan és erősen haj fogatott kolónia, az alsó része sima, nem emelkedik el a laptól.

A kolónia átmérője: 1,0-1,5 cm.

A kolónia színe: felső része vüágos barna - ibolya színű, a széle fehér, az alsó része barna és az alsórész széle világosbarna.

Átlagos spórásodás: 46,3 x 10^e konídium/kolónia.

2. Táptalaj (15% sörcefre,

0,5% élesztő extraktum,

0,5% ammóniumfoszfát,

0,1% ammóniumcitrát,

3% agar, pH = 6,0)

A képződött kolónia alakja:

A középső része domború, kráter alakú bemélyedésekkel, a széle radiálisán hajtogatott, a teljes agar tele van a tenyészettel, a kolónia elemelkedik a lap aljától.

A kolónia átmérője: 2-3 cm.

A kolónia színe: A felső- és az alsórésze világos szürke.

Átlagos spórásodás: 34,1 x 10® konídium/kolónia.

3. Táptalaj (2% glükóz,

50% vizes burgonya-extraktum,

3% agar, pH = 6,0)

A képződött kolónia alakja:

A középső része domború, kráter alakú bemélyedésekkel, a teljes agar tele van a tenyészettel, a kolónia elemelkedik a lap aljától.

A kolónia átmérője: 1,5-2,0 cm.

A kolónia színe: A felső oldala szürkés ibolya, az alsórésze szürkés barna.

Átlagos spórásodás: 3,3 x 10® konídium/kolónia.

A konídiumok és hifák mikroszkopikus jellemzői:

A konídiumok minden esetben elliptikus alakúak, amelyeknek a hosszú tengelye 6-10 Mm és a rövid tengelye 4—8£im. A szubsztrátum-hifák hoszsza legfeljebb 200 μτη, az átmérőjük pedig 4-8 Mm. A hólyagos domború résznek az átmérője 8-16 pm. Levegő-hifák is fellépnek, amelyeknek hossza több mint 200 Mm, átmérőjük pedig

2—4 Mm.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példák illusztrálják, minden korlátozó jelleg nélkül:

1. példa

A konídium-spórák tenyésztéséhez sovány tejben liofilizálással szárított spórákat tartalmazó törzs-konzervből szuszpenziót készítünk, amelyet egy 3%-os agar táptalajon (pH = 6,0) 15% sörcefrével, 0,5% élesztő-extraktummal, 0,5% ammóniumfoszfáttal és 0,1% ammóniumcitráttal 14 napig tenyésztünk 19 °C-on, ferde tenyésztésként. A szubmerz-tenyésztéshez oltóanyagként evvel az eljárással 1000 ml-es jénai szélesnyakú lombikokban IxlO¹⁰ spóra/tenyészedény mennyiséget kapunk. Az oltóanyaggal szükség esetén még 120 liter tápoldatot is beolthatunk.

2. példa

Az inokulum előállítása céljából az 1. példa szerint kapott spóra-szuszpenziót átvisszük egy olyan folyadék-közegbe, amely 15% sörcefrét és 2% élesztő-extraktumot tartalmaz, olyan mennyiségben, hogy a spóra koncentrációja 1 x 10⁵/ml legyen. A tenyésztést 500 ml-es gömblombikban 120 ml folyadék-közeggel 22 °C hőmérsékleten egy cirkulációs rázógépben végezzük. A tenyészet 14 nap után 6xl0⁹ spóra/lombik mennyiséget tartalmaz, és ezt a tenyészetet alkalmazhatjuk oltóanyagként az alkaloida-fermentációhoz.

3. példa

A spóra-tenyésztéshez szükséges inokulum előállítását az 1. példa szerint végezzük. Táptalajként 3%-os agar táptalajt (pH = 6,8-6,9) alkalmazunk, amely 3% szacharózt, 0,3% náuiumnitrátot, 0,1% káliumhidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfát-hepahidrátot, 0,05% káliumkloridot, 0,001% vas(II)-szulfát-hepahidrátot és 1% kukoricát duzzasztó vizet tartalmaz.

500 ml-es szűknyakú ipari üveg-lombikokban, ferde tenyésztéssel, 14 napig 24 °C-on végzett tenyésztéssel 3xl0⁹ spóra/edényt kapunk. Ez az anyag a kiindulási anyaga a szubmerz-tenyésztésnek, az alkaloid-szintézishez.

4. példa

Az 1. példa szerint tenyésztett oltóanyag-tenyészet spóráit szuszpendáljuk, ennek egyrészét inokulumként azonos mennyiségekben elosztunk álló gömblombikokban (500 ml befogadóképességű), amelyek egyenként 120 ml elő tenyészet-táptalajt (10% szacharóz, 1,5% ammóniumcitrát, 0,1% kaüciumnitrát, 0,025% káliumdihidrogénfoszfát, 0,01% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, desztillált víz, pH = 5,5, sterilizálás 30 percig 0,5 atm nyomáson) tartalmaznak. A lombikokat 24 °C hőmérsékleten cirkulációs rázógépen rázzuk (175 U/perc). 7 nap múlva a lombik tartalmát átoltjuk 1:10 arányban Erlenmeyer-lombikokba (500 ml befogadóképességű), amelyekbe egyenként 120 ml főtenyészet-táptalajt (20% szacharóz, 1% ammóniumcitrát, 0,1% kalciumnitrát, 0,025% káliumdihidrogénfoszfát, 0,01% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, desztillált víz, pH = 5,5, sterilizálás 30 percig 0,5 atm nyomáson) helyeztünk. Ezeket a lombikokat ugyanolyan körülmények között rázzuk, mint ahogy az előbbiekben ismertettük.

nap múlva az Urk-reakció segítségével 2470 mg alkaloida/tenyészfolyadék-liter mennyiséget mutatunk ki, ergotoxin-dimaleinátként számolva. Az alkaloidákat Hohmann és Rochelmeyer [Arch. Pharmazie 297, 186—187 (1964)] módszerével analóg módon metilénkloriddal extraháljuk, majd formamiddal impregnált kovasavgélen vékonyréteg kromatográfiásan szétválasztjuk és ultraibolya spektrofotometrikus úton meghatározzuk. 1280 mg ergotoxint és 340 mg ergometrint kapunk literenként, a többi rész két eddig ismeretlen természetes peptid-alkaloidát, valamint egyszerű ergolin-származékokat, például agroklavint, kanoklavint tartalmaz.

A leszívatás útján elválasztott micélium és szűrlet párhuzamos vizsgálata szerint a teljes ergometrin mennyisége, valamint a képződött ergotoxin

90%-a a szűrletben található.

5. példa darab 2 literes üvegfermentort beoltunk a

2. példa szerint készített szubmerz-spóratenyészettel. Minden fermentor 1,3 liter A) tápoldatot tartalmaz. [A) tápoldat: 10% szacharóz, 1,5% ammóniumcitrát, 0,05% káliumdihidrogénfoszfát, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szulfát, 0,0004% cinkszulfát, csapvíz, pH = 5,5, sterilizálás 30 percig 0,5 atm nyomáson.] A fermentációt 24 °C hőmérsékleten, 400 U/perc keveréssel, illetve 0,3 liter levegő/perc befúvatással végezzük. 7 nap múlva az egyik fermentor tartalmát 10 liter B) táptalajt tartalmazó 18 literes nemesacél fermentorba áthelyezzük. [B) tápoldat: 10% szacharóz, 1,4% citromsav, 1,0% 25%-os ammóniumhidroxid-oldat, 0,05% kalciumnitrát, 0,025% káliumdihidrogénfoszfát, 0,01% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,001% vas(II)-szuífát, 0,0004% cinkszulfát, csapvíz, pH = 5,5.] A tenyésztést 24 °C-on, 360 U/perc keveréssel és 2,5 liter levegő/perc átfúvatással végezzük. Az 5. napon a fermentor tartalmának felét inokulumként alkalmazzuk 40 liter C) tápoldatot tartalmazó 63 literes nemesfém-fermentorhoz. [C) tápoldat: 20% szacharóz, 1,75% citromsav, 0,075% káliumdihidrogénfoszfát, 0,02% káliumklorid, 0,03% magnéziumszulfát, 0,0012% cinkszulfát, csapvíz, ammóniumhidroxid-oldattal pH beállítás 5,3-ra, sterilizálás 60 percig 110°C hőmér-, sékleten.] A tenyészetet 7 napig 24 °C hőmérsékleten 300 U/perc sebességgel keverjük és 27 liter levegőt/perc vezetünk át a tenyészeten, és szükséges esetben hozzáadunk habzásgátló-szert. A tenyésztés befejeztével a tenyészfolyadék 2640 mg összalkaloidát tartalmaz literenként. A 4. példa szerint végzett analízis szerint ebből 1300 mg az ergotoxin és 550 mg az ergometrin.

6. példa

A 3. példa szerint tenyésztett oltóanyag-tenyészet spóra-mennyiségét inokulumként elosztjuk két darab 18 literes nemesfém-fermentorban levő

10-10 liternyi A) táptalajban (lásd az 5. példát). A fermentorok tartalmát 7 napig 24 °C hőmérsékleten 260 U/perc sebességgel keverjük és 2,5 liter levegőt/perc vezetünk át rajtuk. Ezután a két fermentor tartalmát áthelyezzük 250 literes nemesfém-fermentorba, amely 180 liter B) tápoldatot (lásd az

5. példát) tartalmaz, és a tenyésztést folytatjuk 24 °C hőmérsékleten 160 U/perc-es keveréssel és 0,5 liter levegőt/liter tápoldat x perc átfúvatva. 5 nap múlva áthelyezzük a tenyészetet 1400 liter C) tápoldatot (lásd az 5. példát), valamint 0,0005% nikkelszulfátot is tartalmazó 2000 literes nemesfém-fermentorba. A tenyésztést 24 °C hőmérsékleten 160 U/perc keverési sebességgel és 1 liter tápoldatra vonatkoztatva, 0,6 liter levegőt/perc vezetünk át a tenyészeten. Szükség esetén mindegyik fermentorba még adagolhatunk habzásgátló-szert is. A 7. napon a tenyészet 2430 mg összalkaloidát tartalmaz tenyészfolyadék-literenként. A 4. példa szerint végzett analízis szerint ebből 1150 mg az ergotoxin és 490 mg az ergometrin tenyészfolyadék-literenként.

7. példa

A 6. példa szerint előállított tenyészfolyadékhoz a micélium elválasztása előtt 1 : 1 térfogatarányban keverés közben vizet adunk, majd leszűijük a micéliumot. 200 liter ily módon kapott tenyésztési szűrletet 25%-os ammóniumhidroxid-oldattal pH = 8,5-re lúgosítunk, majd az ergotoxin-alkaloidát és az ergometrint kétlépcsős ellenáramú extrakciós berendezésben 50 liter etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetát-extraktumot vákuumban 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten a kiindulási térfogat 1/20-adára töményítjük és a kapott maradékhoz 2 térfogatrész kloroformot adunk. A reakcióelegyet 15 óra hosszat +4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, miközben az ergometrin-kloroform-addukt kikristályosodik. A kristályokat leszívatjuk és így kapunk 35,4 g (75%) sárgás ergometrin-kloroform-adduktot.

35,4 g ergometrin-kloroform-adduktot aktív szén jelenlétében, melegítés közben feloldunk 3,1 liter acetonban, leszűijük az aktív szenet és a szűrlethez számított mennyiségű maleinsav acetonos oldatát adjuk. A kapott kristályos ergometrin-dimaleinátsót leszívatjuk és +70 °C-on szárítjuk. Az alkaloidsót vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér-sárgás kristályos por alakjában kapjuk, 90%-os kitermeléssel, 98-100%-os tisztaságú fokkal.

[α]θ° =+50° (c= 1, vízben).

A kapott ergotoxin-tartalmú szűrletet tovább koncentráljuk 0,297 literre, majd

a) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 20-szoros mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxid-oszlopon etilacetáttal kromatografáljuk, majd 3,8 liter etilacetáttal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten szárazra pároljuk, a kapott 74,2g-nyi bepárlási maradékot feloldjuk 0,212 liter benzolban és az oldatot 15 óra hosszat +4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kiváló ergotoxin-benzol-adduktot leszívatjuk, benzollal mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 55,2 g vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-benzol-adduktot kapunk, amelynek 95%-os a tisztasági foka.

Md =—183° (c= 1,8, kloroformban), vagy

b) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 20-szoros mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxiddal addig keverjük, amíg a reakcióelegy homogén színűvé válik. A reakcióelegyet 10 percig állni hagyjuk, majd háromszor 3,82 liter etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumot +30 °C hőmérsékleten szárazra pároljuk, és a további feldolgozást az a) pontban leírtak szerint végezzük. így kapunk 52,5 g vékonyrétegkromatográfíai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-benzol-adduktot, amelynek 95%-os a tisztasági foka.

[α]ρ^Ο = -183° (c= 1,8, kloroformban), vagy

c) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 5-szörös mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxid + aktív-szén-oszlopon (adszorbensek aránya: alumíniumoxid : aktív-szén= 5:1) etilacetáttal kromatografáljuk, majd liter etilacetáttal eluáljuk, és a. további feldolgozást az a) pontban leírtak szerint végezzük. így kapunk 55 g vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-benzol-adduktot, amelynek tisztasági foka 96%-os.

[o]B° =-183° (c= 1,8 kloroformban), vagy

d) az alkaloida-koncentrátum összalkaloid-menynyiségére számított 5-szőrös mennyiségű semleges I aktivitási fokú alumíniumoxid + aktív-szén adszorbens keverékkel (adszorbensek aránya: alumíniumoxid : aktív-szén = 5:1) elkeverjük egy ke verő-szűrő berendezésben 3 liter etilacetáttal, majd kétszer

2,5 liter etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumot +30 °C hőmérsékleten szárazra pároljuk, és a további feldolgozást az a) pontban leírtakkal analóg módon végezzük. így kapunk 55 g vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-benzil-adduktot, amelynek a tisztasági foka 96%-os.

[“Id* ⁼ ~183° (c = 1,8, kloroformban).

55,2 g ergotoxin-benzol-adduktot enyhe melegítés közben feloldunk 830 ml abszolút etanolban, majd hozzáadjuk a számított mennyiségű etánszulfonsav 0,5 mólos abszolút etanolos oldatát és

4,2 liter vízmentes étert. A kapott kristályokat leszívatjuk és +70 °C hőmérsékleten szárítjuk. így kapunk 95%-os kitermeléssel vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos ergotoxin-etánszulfonátot, amelynek tisztasági foka 98—100%-os.

8. példa

A megfelelő mennyiségű tenyészfolyadék szűrésével kapott 12,0kg-nyi micéliumot 3 óra leforgása alatt 20 °C hőmérsékleten 18 liter acetonnal extraháljuk, majd a szűrés után kapott vizes-acetonos extraktumot foszforsavval pH = 2-3 ra állítjuk be, és kétszeres extrakcióval zsírmentesítjük és tisztítjuk, nevezetesen 17 liter petroléterrel és 11 liter 1 :1 térfogatarányú petroléter-xilol-eleggyel. A kapott alkaloid-tartalmú alsó (nehezebb) fázist pH = 8—9-nél (pH-beállítás: ammóniumhidroxid-oldattal) kimerítően extraháljuk összesen 7 liter etilacetáttal. A felső fázist azonos térfogatú vízzel mossuk, majd 30 °C hőmérsékleten 0,70 literre töményítjük, hozzáadunk 1,40 liter kloroformot, és az így kapott reakcióelegyet +4°C hőmérsékleten éjszakán át állni hagyjuk. Az iszapszerűen kivált csapadékot leszűrjük.

A szűrletet a fentiekben megadott körülmények között 0,180-literre töményítjük, és 2 liter etilacetáttal 1,100 kg I aktivitási fokú alumíniumoxidon kromatografáljuk, a kapott eluátumot vákuumban szárazra pároljuk, és a maradékot feloldjuk 100 ml toluolban (benzolban vagy xilolban). Az oldatot éjszakán át +4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd elválasztjuk az elkülönült anyagot és vákuum exszikkátorban szárítjuk. így kapunk 14,0 g fehér, kristályos, ergotoxin-toluol-adduktot, amelynek tisztasági foka 98-100%-os.

9. példa

Az 5. példa szerint kapott tenyészfolyadék 10,0 literét keverés és l0súly% ammóniumszulfát hozzáadása közben pH = 8—9-nél és 20 °C hőmérsékleten 25,0 liter etilacetáttal extraháljuk. Az alsó (nehezebb) biofázist elöntjük, a szerves fázist kétszer 5,0 liter 2%-os foszfoisawal extraháljuk, az egyesített vizes fázis pH-ját ammóniumhidroxid-oldattal beállítjuk 8—9-re, és kétszer 5,0 liter etilacetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist 30 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten 200 ml-re bepároljuk, a maradékhoz 400 ml kloroformot adunk és a reakcióelegyet éjszakán át +4°C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kikristályosodott anyagot leszívatjuk és vákuum exszikkátorban szárítjuk. 4,20 g (71,2%) ergometrin-kloroform-adduktot kapunk, amelynek a tisztasági foka 90,7%-os.

A fentiekben megadott körülmények között 120 ml-re töményített ergotoxin-tartalmú szűrletet 300 g I aktivitási fokú alumíniumoxidon kromatografáljuk etilacetáttal, az eluátumot vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot feloldjuk 30 ml benzolban és az oldatot éjszakán át +10°C-t meg nem haladó hőmérsékleten hűtjük. A kivált anyagot leszívatjuk és vákuum-exszikkátorban szárítjuk, így kapunk 7,90 g (73,6%) fehér, kristályos ergotoxin-benzol-adduktot, amelynek a tisztasági foka 91,6%-os.

10. példa

A 7. példa szerint kapott ergotoxin-benzol-adduktot feloldjuk 0,7 liter dioxánban, és az oldatot 60 °C hőmérsékleten 50 atm hidrogéngáz-nyomáson fűthető rázó- vagy keverő-autoklávban Raney-nikkel jelenlétében 2 óra leforgása alatt hidrogénezzük. A kapott 9,10-dihidroergotoxin-oldatról leszűrjük a katalizátort és a tiszta szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot feloldjuk etilacetátban és az oldatot +4 °C-on állni hagyjuk. A kikristályosodott hidrogénezett bázist leszívatjuk és 60 °C-on szárítjuk. 47,5 g (90%) vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos dihidroergotoxin-bázist kapunk, amelynek tisztasági foka 90%-os.

[a]p° = —45,6° (c = 2, piridinben).

A kapott kristályos dihidroergotoxin-bázist hozzáadjuk keverés közben 200 ml metanol és a számított mennyiségű etánszulfonsav 1 mólos metanolos oldatának elegyéhez. Rövid idő múlva kikristályosodik az alkaloidsó, amelyet leszívatunk és szárítunk. 48,5 g (95%) vékonyrétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos dihidroergotoxin-etánszulfonátot kapunk, amelynek tisztasági foka 98—100%-os.

11. példa

A 9. példa szerint kapott ergotoxin-benzol-addukt 7,20 g-ját 250 ml 90%-os vizes dioxánban 20—25 °C hőmérsékleten, fény kizárása közben, 2,9 g 5%-os palládiumos aktívszén jelenlétében egy speciális cirkulációs készülékben (amely áll egy hidrogénező edényből, a hidrogénező edényen van adagoló és cirkulációs vezeték, hőmérő, fecskendőnyílás, gáztartály és laboratóriumi vízsugárszivattyú) hidrogénezzük 138,5 h¹ fordulatszám, 120 mm kénsav-oszlopnak megfelelő ejektor-nyomás és 2 mm-es ejektorszelep-átmérő alkalmazásával, 4 óra leforgása alatt. A kapott 9,10-dihidroergotoxin-oldatról leszűrjük a katalizátort, a tiszta szűrletet rotációs vákuum-bepárló segítségével +30 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten szárazra pároljuk, és a kapott maradékot feloldjuk 30 ml kloroformban. A kapott oldathoz 35 ml dietilétert adunk, és erélyes keverés közben 70 ml telített éteres maleinsav-oldattal teljes mértékben leválasztjuk a dihidroergotoxin-dimaleinátot. A terméket leszívatjuk, 30 ml dietiléterrel mossuk és vákuumexszikkátorban azonnal foszforpentoxid fölött szárítjuk. így kapunk 6,55 g (93,5%) vékony rétegkromatográfiai szempontból tiszta, fehér, kristályos dihidroergotoxin-dimaleinátot, amelynek a tisztasági foka 97,9%-os.

Claims (8)

1. Szabadalmi igénypontok:

   1. Eljárás ergolin-származékok, elsősorban az ergotoxin-csoportba tartozó alkaloidák, a 9,10-dihidroalkaloidák és ergometrin, valamint savaddiciós sóik előállítására fermentációs úton, azzal jellemezve, hogy az IMET PA 130 szám alatt deponált Claviceps purpurea (Fr.) Túl. törzs segítségével szaprofitikus körülmények között szilárd vagy folyékony táptalajon 15-25 °C hőmérsékleten konidium-spórákat tenyésztünk, ezekkel a spórákkal szacharózt, szervetlen, nitrogént és egyéb önmagában ismert adalékanyagokat tartalmazó táptalajt oltunk be, a tenyészetet önmagában ismert módon fermentorban tenyésztjük, a tenyésztés befejeztével

   a) a tenyésztési folyadékot 10% ammónium-szulfát hozzáadása után 8-9 pH-értéknél valamilyen karbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel extraháljuk, az extraktumot valamilyen híg savval extraháljuk és a vizes-savas alkaloidaextraktumot 8—9 pH-értéknél valamilyen karbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel extraháljuk, vagy

   b) a micélium elválasztása után kapott tenyésztési folyadékot 8-9 pH-értéknél valamilyen karbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel extraháljuk, vagy

   c) a tenyésztési folyadékot a micélium elválasztása előtt 1 :1 térfogatarányban vízzel hígítjuk, majd a micélium elválasztása után kapott tenyésztési szűrletet 8—9 pH-értéknél valamilyen karbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel vagy metilénkloriddal extraháljuk, majd a b) és c) eljárásváltozat szerint a tenyésztési folyadéktól elválasztott micéliumot acetonnal kimerítő extrakciónak vetjük alá, a kapott extraktumot 2—3 pH-értéknél valamilyen szénhidrogén-keverékkel tisztítjuk és a vizes fázist 8-9 pH-értéknél valamilyen karbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel

   5 extraháljuk és a vizes-savas és a szerves extraktumokat egyesítjük, tisztítjuk, koncentráljuk, majd a kapott nyers alkaloida-koncentrátumhoz 1-3-szoros térfogatnyi kloroformot adunk hűtéses tárolás után a kikristályosodott ergometrin-kloroform adduktu0 mot izoláljuk és adott esetben ismert módon az ergometrin gyógyászati szempontból megfelelő savaddiciós sóját képezzük, majd az ergometrin leválasztása után kapott extraktumot koncentráljuk, az alkaloida-koncentrátumban levő

   5 alkaloidák összes mennyiségére vonatkoztatott 1 :5-1 :20 arányban alkalmazott alumíniumoxidon adott esetben aktívszén adagolásával egyidejűleg, amikor is az alumíniumoxid és az aktívszén aránya 5:1, adszorpcióval vagy adszorpciós kromatográfiá0 val tisztítjuk, valamilyen karbonsav-rövidszénláncú alkilészterrel, halogénezett szénhidrogénnel vagy aromás szénhidrogénnel extraháljuk, illetve eluáljuk és így nagy tisztaságú epimermentes ergotoxin-aromás-adduktumot kapunk, a kapott ergotoxin-bázi5 sokat adott esetben Raney-nikkel jelenlétében +50—70 °C hőmérsékleten, 30—70 afm nyomáson dioxánban, illetve 5—10%-os palládiumos aktívszén katalizátor jelenlétében +20-30 °C hőmérsékleten normál nyomáson vizes dioxánban 9,10-dihidrogéj nézzük és adott esetben gyógyászati szempontból megfelelő savaddiciós sóját képezzük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a konidium-spórákat ; 18-24 °C hőmérsékleten tenyésztjük.
3. 3. Az 1. igénypont a) vagy b) eljárásváltozata szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az extrakciót etilacetáttal végezzük.
4. 4. Az 1. igénypont c) eljárásváltozata szerinti > eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az extraktum tisztítását petroléterrel vagy petroléter/xilol elegyével hajtjuk végre.
5. 5. Az 1. igénypont a) eljárásváltozata szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyészfolyadék extrakciója után kapott extraktumot foszforsavval extraháljuk.
6. 6. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az ergotoxin-aromás adduktumot benzollal, toluollal vagy xilollal végezzük.
7. 7. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a Raney-nikkel jelenlétében történő hidrogénezést +60 °C hőmérsékleten és 50 atm nyomáson hajtjuk végre.
8. 8. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a palládiumos aktívszén jelenlétében történő hidrogénezést 25 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.