PT1767535E

PT1767535E - Síntese de epotilonas, respectivos intermediários, análogos e suas utilizações

Info

Publication number: PT1767535E
Application number: PT06026750T
Authority: PT
Inventors: Samuel J Danishefsky; Alexey Rivkin; Fumihiko Yoshimura; Huajin Dong; Ana Esther Gabarda Ortega; Young Shin Cho; Ting-Chao Chou
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2010-02-24
Also published as: JP4791183B2; DE60330407D1; WO2004018478A2; EP1767535A1; CN1759115A; JP2006502246A; EP1767535B1; JP2011195589A; CN102532120A; SI1767535T1; NZ538522A; US7875638B2; WO2004018478A3; CA2496477A1; US20090149516A1; PH12012501351A1; DK1506203T3; AU2003260002B2; ES2336937T3; DK1767535T3

Description

1

DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE EPOTILONAS, RESPECTIVOS INTERMEDIÁRIOS, ANÁLOGOS E SUAS UTILIZAÇÕES"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As epotilonas A e B (2a e 2b, esquema 1) são macrolídeos citotóxicos naturais que foram isolados a partir de uma micobactéria responsável pela degradação da celulose, Sorangium cellulosum (Hofle et al. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1567 e J. Antibiot. 1996, 49, 560; cada uma destas referências é aqui incorporada por referência). Muito embora tenham estruturas muito diferentes, as epotilonas A e B partilham o mesmo mecanismo de acção do paclitaxel (Taxol®), o qual envolve a inibição do crescimento de células tumorais por polimerização de tubulina e estabilização de sistemas de microtúbulos (Bollag et al. Câncer Res. 1995, 55, 2325, incorporado por referência). Apesar do seu indiscutível valor clínico como agente de quimioterapia de primeira linha, o Taxol® está longe de ser um fármaco ideal. A sua hidrossolubilidade apenas marginal necessita do recurso a veículos de formulação, tal como Cremophor que levantam os seus próprios riscos e problemas de gestão (Essayan et al. J. Allergy Clin. Immunol. 1996, 97, 42, incluído por referência) . Além disso, o Taxol® é vulnerável à desactivação por meio do mecanismo da multirresistência aos fármacos (MDR, do inglês multiple drug resistance)

(Giannakakou et al. J. Biol. Chem. 1997,272, 17118, aqui incorporado por referência) . Porém, estudos também demonstraram que as epotilonas A e B retêm uma notável potência contra células tumorais que apresentam MDR 2 (Kowalski et. al Mol. Biol. Cell 1995, 6, 2137, aqui incorporado por referência). Adicionalmente, a maior solubilidade em água, em comparação com o paclitaxel, poderá ser útil para a facilidade de formulação das epotilonas. Enquanto o composto natural, epotilona B (2b, EpoB, no esquema 1) é um membro potente desta família, possui infelizmente, pelo menos em ratinhos com xenoenxertos, um índice terapêutico preocupantemente estreito (Su et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1093; Harris et al. J. Org. Chem. 1999, 64, 8434, cada uma destas referências é aqui incorporada por referência).

la R = Ph, Paclitaxel (Taxol) lb R =t-Bu, Docetaxel (Taxotere) 2a Ri = H, R2 = CH3 Epotilona A (EpoA) 2b Ri = CH3, R2 = CH3 Epotilona B (EpoB) 2c Ri = H, R2 = CH2OH, Epotilona E (EpoE)

2d Ri = CH3, R2 = CH2OH, Epotilona F= (EpoF

Esquema 1: Taxóides e epotilonas

Dado o limitado índice terapêutico de EpoB, foi investigada a capacidade de fornecer um melhor perfil terapêutico de outros compostos análogos de epotilona, em particular os compostos 12,13-desoxiepotilonas (vide patentes norte-americanas 6 242 469, 6 284 781, 6 300 355, 6 369 234, 6 204 388, 6 316 630, cada um destes documentos é aqui 3 incorporado por referência). Experiências in vivo, conduzidas em vários modelos de ratinhos, demonstraram que 12,13-desoxiepotilona B (3b, dEpoB no esquema 2) possui potencial terapêutico contra vários tumores humanos sensíveis e resistentes em xenoenxertos em ratinhos (Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1998, 95, 9642 e 15798; incorporado aqui por referência).

Recentemente, a superioridade terapêutica destas desoxiepotilonas em relação a outros agentes anticancerígenos foi demonstrada de modo conclusivo por meio de estudos comparativos exaustivos (Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2001, 98, 8113; aqui incorporado por referência). Graças ao seu impressionante perfil in vivo, o dEpoB tem progredido através de avaliações toxicológicas em cães e está actualmente a ser testado em ensaios clínicos em humanos como um fármaco anticancerígeno.

3 a Ri = H, R2= ch3, 4a R2 = H, R2 = CH3, de- 5a Ri = H, R2=CH3, iso-dEpoA clesoxiepotilona A (dEpoA) hidro-dEpoA (ddEpoA) 3b Ri = CH3, r2 = ch3, CT II o tc II o tn de- (_n cr gi II o tn g) II o ta iso- clesoxiepotilona B (dEpoB) hidro-dEpoB (ddEpoB) dEpoB 3C Ri = H, r2 =ch2oh, 4c Ri = H, R2 =CH20H, De- 5c Ri = H, R2 = CH20H, iso- clesoxiepotilona E (dEpoE) hidro-dEpoE (ddEpoE) dEpoE 3d Ri = ch3, R2 = CH20H, 4d Ri = CH3, R2 = CH20H, De- 5d Ri = CH3, R2 = CH20H, iso- clesoxiepotilona F (dEpoF) hidro-dEpoF (ddEpoF) dEpoF (ddEpoF) 3e Ri = H, R2 = NH2, CD II tc g II NH2, 5e Ri = H, R2 nh2, desmetilamino-dEpoA de smetilamino-ddEpoA desmetilamino-iso-dEpoA 4 (daclEpoA) 4 3f R3 — CH3, R2 desmetilaraino-dEpoB (dadEpoB)

NH2 / 4f R3 — CH3, R3 desmetilamino-ddEpoB

NH2 f 5f R3 — H, R2 — NH2^ clesmetilamino-iso-dEpoB 3g RI = CH2F, R2 = CH3, 26- 4g Ri = CH2F, R2 CH3, 26-

fluoro-dEpoB

fluoro-ddEpoB 3h Ri = CF3, R2 = CH3, 26- 4h Ri = CF3, R2 = CH3, 26-

tRifluoro-dEpoB

tRifluoro-ddEpoB

Esquema 2 Vários análogos de desoxiepotilona

Apesar da promissora utilidade terapêutica das 12,13-desoxiepotilonas, seria desejável investigar análogos adicionais bem como metodologias sintéticas adicionais para a síntese de epotilonas, desoxiepotilonas existentes e respectivos análogos, bem como novos análogos destas. Em particular, dado o interesse na utilidade terapêutica desta classe de compostos, seria também desejável desenvolver metodologias capazes de proporcionar quantidades significativas de quaisquer epotilonas ou desoxiepotilonas anteriormente descritas ou das descritas no presente documento para ensaios clínicos e preparação à escala industrial.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 é um quadro de valores IC50 de epotilonas em comparação com o crescimento celular com CCRF-CEM, CCRF-CEM/VBL e CCRF-CEM/Taxol. A inibição do crescimento celular foi medida por meio de análise de tetrazónio XTT após incubação de 72 horas, conforme descrito anteriormente (Scudiero et al. Câncer Res. 46:4827-4833, 1988; aqui incorporado por referência). Os valores IC50 foram determinados a partir da relação dose-efeito a seis ou sete 5 concentrações de cada fármaco, recorrendo-se a um programa informático (Chou et al. Adv. Enzyme Regul. 22:27-55, 1984; Chou et al. CalcuSyn for Windows (Biosoft, Cambridge, UK), 1997; ambos aqui incluídos por referência) como anteriormente descrito (Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:15798-15802, 1998; aqui incluído por referência). A figura 2 é um espectro 1H NMR de trans-9,10-de-hidro- 12.13- desoxiEpoB. A figura 3 é um espectro 13C NMR de trans-9,10-de-hidro- 12.13- desoxiEpoB. A figura 4 revela um esquema para a síntese de epotilonas 11-R e 14-R, utilizando a metátese da olefina de fecho do anel LACDAC e ilustra certas substituições disponíveis com estratégias sintéticas que passam por uma 9,10-de-hidroepotilona. A figura 5 apresenta dados de citotoxicidade relativos em comparação com células leucémicas humanas ín vítro para uma série de compostos de epotilona e derivados, incluindo certos compostos 9,10-de-hidro (por exemplo, composto 7 na figura 5A e composto 88 e 89 na figura 5B). A figura 6 descreve estratégias sintéticas alternativas para a preparação de análogos 9,10-de-hidroepotilona. A figura 6A ilustra uma estratégia macro-Stille, uma estratégia de acoplagem sp3-sp3 e uma estratégia β-Suzuki. A figura 6B ilustra uma olefinação de Julia, uma estratégia Wadsworth-Emmons e uma estratégia Macro-Reformatosky. A figura 6C ilustra uma estratégia de acoplamento McMurry e uma síntese de análogo de lactama. A figura 7 revela vários análogos de 9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB. 6 A figura 8 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB e dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 de carcinoma da mama humano (perfusão iv, Q2Dx3). A figura 9 revela a estabilidade dos análogos de epotilona em plasma de murino. Epo 1 é 12,13-desoxiEpoB, Epo 2 é 26-F3-12,13-desoxiEpoB, Epo 3 é (E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB e Epo 4 é 26-F3-(e)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB. A figura 10 descreve o efeito terapêutico dos análogos da epotilona em ratinhos nude com xenoenxerto HCT-116 (perfusão iv Q2Dx7, n=3) . A seta indica a administração do fármaco. Epo 3 é (E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB. A figura 11 revela as potências de vários análogos da epotilona em comparação com o crescimento celular tumoral in vitro e o indice terapêutico em comparação com paclitaxel e vimblastina. A figura 12 é um quadro que resume o efeito de dEpoB, Taxol e 26-triF-9,10-deH-dEpoB em comparação com o xenoenxerto MX-1 em ratinhos nude. A figura 13 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro- 9.10- de-hidro-EpoB e 9,10-de-hidro-EpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos MX-1 (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx6 e Q2Dx9, respectivamente). A figura 14 revela as alterações do peso corporal de ratinhos nude com carcinoma da mama humano em xenoenxertos MX-1 na sequência de tratamento com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-EpoB e 9,10-de-hidro-EpoB (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx6 e Q2Dx9, respectivamente). A figura 15 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro- 9.10- de-hidro-dEpoB e 9,10-de-hidro-EpoB no tamanho do 7 tumor em ratinhos nude com xenoenxertos MX-1 (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx6 e Q2Dx9, respectivamente). A figura 16 revela as alterações do peso corporal de ratinhos nude com carcinoma da mama humano em xenoenxertos MX-1 na sequência de tratamento com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e 9,10-de-hidro-EpoB (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx6 e Q2Dx9, respectivamente). A figura 17 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos MX-116 (perfusão iv, Q2Dx7). A figura 18 revela o efeito de 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos MX-116 do carcinoma do cólon humano (perfusão iv, Q3Dx5). A figura 19 revela o efeito de 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos A549/Taxol (perfusão iv, Q3Dx7). A figura 20 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto A549/Taxol, tratados com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e 9,10-de-hidro-dEpoB (perfusão iv durante 6 horas, Q3Dx7). A figura 21 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos A549/Taxol (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx7). A figura 22 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto A549/Taxol, tratados com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e 9,10-de-hidro-dEpoB (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx7). A figura 23 revela o efeito de 9,10-de-hidro-EpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos HCT-116 do carcinoma do cólon humano (perfusão iv durante 6 horas). A figura 24 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto de tumor HCT-116 do carcinoma do cólon humano na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-EpoB (perfusão iv durante 6 horas). A figura 25 revela a formação de microtúbulos a partir de tubulina na presença de vários análogos de epotilona a 37 °C. A figura 26 revela a formação de microtúbulos a partir de tubulina na presença de vários análogos de epotilona a 4 °C. A figura 27 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoB e dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos HCT-116 (perfusão iv, Q2Dx6). A figura 28 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxertos HCT-116 na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoB e dEpoB (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx6). A figura 29 revela o efeito de 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos HCT-116 do carcinoma do cólon humano (perfusão iv, Q3Dx4). A figura 30 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto de tumor HCT-116 do carcinoma do cólon humano na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoB (5 mg/kg por perfusão iv durante, X3Dx4). A figura 31 é um quadro com valores IC50 para análogos epotilona em comparação com o crescimento celular CCRF-CEM. 9 A figura 32 revela a estabilidade metabólica dos análogos de epotilona in vitro. A figura 33 é um quadro que pormenoriza os efeitos terapêuticos de vários análogos de epotilona em comparação com xenoenxertos de tumores humanos em ratinhos com perfusão iv durante 6 horas. A figura 34 revela o efeito de 9,10-de-hidro-EpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxerto do tumor HCT-116 do carcinoma do cólon humano (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx7). A figura 35 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxertos de tumor HCT-116 do carcinoma do cólon humano, na sequência de tratamento com 9.10- de-hidro-EpoB e oxazol-EpoD (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx7). A figura 36 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro- 9.10- de-hidro-dEpoB e 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos A549/Taxol (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx4). A figura 37 revela o efeito de 9,10-de-hidro-dEpoB no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos A549/Taxol (perfusão iv durante 6 horas, Q3Dx3). A figura 38 revela a estabilidade dos análogos de epotilona em 20 % de plasma de ratinho/PBS. A figura 39 revela a estabilidade dos análogos de epotilona em 10% de S9 fígado humano/PBS. A figura 40 revela o cromatograma da estabilidade EpoD em 10% de 59 fígado humano/PBS. A figura 41 é constituída por quadros que descrevem o efeito de vários análogos de epotilona na polimerização de 10 microtúbulos in vitro a 37 aC, na ausência de GTP (A) e a citotoxicidade de vários análogos de epotilona na linha de células do pulmão humano A549 (B). A figura 42 revela a estabilização da formação de microtúbulos por epotilonas a 35 °C e a 4 °C. A figura 43 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto (MX-1) do carcinoma da mama humano T (perfusão durante 6 horas, Q2Dx5). A figura 44 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto (MX-1) do carcinoma da mama humano na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoB (perfusão durante 6 horas, Q2Dx8) . A figura 45 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxertos HCT-116, na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoB e dEpoB (perfusão iv, Q2Dx6) . A figura 46 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoF, dEpoB e Taxol no tamanho do tumor em ratinhos nude com xenoenxerto de tumor (MX-1) do carcinoma da mama humano (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx6). A figura 47 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto de tumor (MX-1) do carcinoma da mama humano na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoF, dEpoB e Taxol (perfusão durante 6 horas, Q2Dx6) . A figura 48 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoF e dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-116 de carcinoma do cólon humano (perfusão iv, Q2Dx8). A figura 49 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto HCT-116, na sequência de 11 tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoF e dEpoB (perfusão durante 6 horas, Q2Dx8). A figura 50 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoF e dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto (A549/Taxol) de carcinoma do pulmão humano resistente ao Taxol (perfusão durante 6 horas, Q2Dx5). A figura 51 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto (A549/Taxol) do carcinoma do pulmão humano resistente ao Taxol, na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoF e dEpoB (perfusão durante 6 horas, Q2Dx5). A figura 52 é um quadro que compara a potência de vários análogos de epotilona, relativamente à inibição do crescimento do tumor in vitro e índice terapêutico relativo. A figura 53 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 (Q3Dx9, perfusão iv durante 6 horas). A figura 54 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxertos MX-1, na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-dEpoB (Q3Dx9, perfusão iv durante 6 h). A figura 55 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-epotilona B em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 (Q3Dx9, perfusão durante 6 horas). A figura 56 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxertos MX-1, na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-epotilona B (Q3Dx9, perfusão iv durante 6 h). 12 A figura 57 revela o efeito terapêutico de pequenas doses de 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 (Q2Dxl2, perfusão iv durante 6 horas). A figura 58 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto MX-1, na sequência de tratamento com baixas doses de 2b-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB (perfusão iv durante 6 h,Q2Dxl2). A figura 59 revela o efeito quimioterapêutico de análogos de epotilona contra xenoenxertos de tumor humanos em ratinhos nude. 0 tecido tumoral (40-50 mg) foi implantado s.c. no dia 0. O tratamento foi iniciado quando o tamanho do tumor atingiu cerca de 100 m3 ou mais como indicado. Todos os tratamentos, tal como indicado pelas setas, foram executados com perfusão iv durante 6 h, via veia da cauda, utilizando um mini-cateter e bomba programável como anteriormente descrito (Su, D.-S. et al, Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 2093; Chou, T. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998, 95, 15798; cada um incluindo por referência). Cada grupo de dose consistia em quatro ou mais ratinhos. O peso corporal foi indicado como o peso corporal total menos o peso do tumor, assumindo que 1 mm3 de tumor é igual a 1 mg de tecido tumoral. A. Um xenoenxerto MX-1 de carcinoma da mama tratado com uma dose baixa de 25-trifluoro-(E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB (10 mg/kg) em comparação com o quadro 1 (20 mg/kg e 30 mg/kg) . B. xenoenxertos grandes de MX-1 (500 mm3) foram tratados com 25-trifluoro-(E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB (25 mg/kg) e dEpoB (30 mg/kg). C. xenoenxerto de carcinoma do pulmão A549 de crescimento lento foram tratados com 25-trifluoro-(E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB (25 mg/kg) e dEpoB (30 mg/kg). d. xenoenxerto A549/Taxol (44 vezes resistente ao paclitaxel in vitro foram tratados com 25-trifluoro-(E)- 13 9.10- de-hidro-12,13-desoxiEpoB (20 mg/kg) e (E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB (4 mg/kg). O tratamento de deH-dEpoB no dia 28 foi suspenso devido à acentuada e rápida perda de peso corporal. A figura 60 descreve a síntese de 9,10-(E)-de-hidroepotilonas modificadas em C-21. A figura 60A revela a síntese de 26-trifluoro-21-metilamino-9,10-(E)-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B. A figura 60B é um esquema de síntese para a preparação de 26-trifluoro-21-amino-9,10-(E)-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B como intermediário na síntese de 26-trifluoro-21-dimetilamino-9,10-(E)-de-hidro-12, 13-desoxiepotilona B. A figura 61 é um quadro com valores IC50 para epotilonas modificadas em C-21 contra linha de células tumoral CCRF/CEM e respectivas sub-linhas resistentes aos fármacos. A figura 62 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro- 9.10- de-hidro-dEpoB e Taxol em ratinhos nude com xenoenxerto CCRF-CEM de leucemia linfoblástica das células T humano (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx8). A figura 63 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto CCRF-CEM de leucemia linfoblástica das células T humano na sequência de tratamento com 25-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e Taxol (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx8). A figura 64 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro- 9.10- de-hidro-dEpoB e Taxol em ratinhos nude com xenoenxerto CCRF-CEM de leucemia linfoblástica das células T humano (resistente ao Taxol) (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx7, x5). A figura 65 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto CCRF-CEM/Taxol de leucemia linfoblástica das células T humano (resistente ao 14

Taxol) na sequência de tratamento com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e Taxol (perfusão iv durante 6 horas, Q2Dx7, x5) . A figura 66 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e Taxol em ratinhos nude com xenoenxerto HCT-116 do carcinoma do cólon humano (Q2,Dx4, perfusão iv durante 6 horas). A figura 67 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto HCT-116 do carcinoma do cólon humano na sequência do tratamento com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB e Taxol (Q2Dx4, x2, perfusão iv durante 6 horas). A figura 68 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-EpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 (perfusão iv durante 6 horas). A figura 69 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-EpoB (perfusão durante 6 horas). A figura 70 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-EpoB em ratinhos nude com xenoenxerto CCRF-CEM/Taxol de leucemia linfoblástica das células T humano (resistente ao Taxol) (perfusão iv durante 6 horas, Q3Dx5, x2). A figura 71 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto CCRF-CEM/Taxol de leucemia linfoblástica das células T humano (resistente ao Taxol) na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-EpoB (perfusão iv durante 6 horas, Q3Dx5, x2) . A figura 72 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro-dEpoB e 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoF em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 carcinoma da mama humano (Q2Dxll, injecção iv). 15 A figura 73 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano na sequência do tratamento com 26-trifluoro-dEpoB 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoF (Q2Dxll, injecção iv) . A figura 74 revela o efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-dEpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano (Q3Dx9, perfusão iv durante 6 horas). A figura 75 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano na sequência de tratamento com 9,10-de-hidro-EpoB (Q3Dx9, perfusão durante 6 horas). A figura 76 revela o efeito terapêutico de 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoF em ratinhos nude com xenoenxerto (MX-1) do carcinoma do pulmão humano (perfusão iv durante 6 horas). A figura 77 revela as alterações no peso corporal de ratinhos nude com xenoenxerto MX-1, na sequência de tratamento com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoF (perfusão iv durante 6 horas e injecção iv).

DEFINIÇÕES

Determinados compostos da presente invenção e definições de grupos funcionais específicos são também descritos mais pormenorizadamente de seguida. Para os fins da presente invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a tabela periódica dos elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed., e os grupos funcionais específicos são definidos geralmente como descrito na mesma. Adicionalmente, os princípios gerais da química orgânica, bem como as fracções funcionais e reactividade específicas são descritas em "Organic Chemistry", Thomas 16

Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, cujos conteúdos são incluídos na íntegra por referência. Além disso, um perito na especialidade irá apreciar que os métodos de síntese, tal como presentemente descritos, utilizam uma variedade de grupos de protecção. 0 termo "grupo de protecção", tal como presentemente utilizado, significa que uma fracção funcional específica, por exemplo, 0, S ou N fica temporariamente bloqueada, de forma que uma reacção pode ser efectuada selectivamente noutro local de reacção num composto multifuncional. Em formas de concretização preferidas, um grupo de protecção reage selectivamente com bom rendimento para se obter um substrato protegido que é estável perante as reacções projectadas; o grupo de protecção deve ser removido de forma selectiva com bom rendimento por reagentes facilmente disponíveis, preferencialmente não tóxicos, que não atacam outros grupos funcionais, o grupo de protecção forma um derivado facilmente separável (mais preferencialmente sem a geração de novos centros estereogénicos) e o grupo de protecção possui uma funcionalidade adicional mínima para evitar outros locais de reacção. Tal como pormenorizado no presente documento, podem ser utilizados grupos de protecção oxigénio, enxofre, azoto e carbono. Os grupos de protecção de exemplo são aqui pormenorizados, no entanto será evidente que a presente invenção não se destina a ficar limitada a estes grupos de protecção, pelo contrário, pode ser facilmente identificada uma variedade de grupos de protecção equivalentes, adicionais, recorrendo aos critérios anteriores, que pode ser utilizada no método da presente invenção. Adicionalmente, encontra-se descrita uma variedade de grupos de protecção em "Protective Groups in Organic Synthesis" 3a Edição, Greene, T.W. e Wuts, P.G., 17

John Wiley and Sons, Nova Iorque 1999, cujo conteúdo é incluído na íntegra por referência.

Será evidente que os compostos, tal como descrito, podem ser substituídos por qualquer número de substituintes ou fracções funcionais. Em geral, o termo "substituído", seja precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, e substituintes contidos nas fórmulas da presente invenção referem-se à substituição de radicais hidrogénio numa dada estrutura pelo radical de um substituinte específico. Quando mais do que uma posição numa dada estrutura pode ser substituída por um ou mais do que um substituinte seleccionado de um grupo específico, o substituinte tanto pode ser igual como diferente em cada posição. Tal como presentemente utilizado, pretende-se que o termo "substituído" inclua todos os substituintes admissíveis de compostos orgânicos. Num aspecto mais lato, os substituintes admissíveis incluem substituintes acíclicos e cíclicos, ramificados e não ramificados, carbocíclicos e heterocíclicos, aromáticos e não aromáticos dos compostos orgânicos. Para os fins da presente invenção, os heteroátomos, tais como o azoto, podem ter substituintes hidrogénio e/ou quaisquer substituintes admissíveis dos compostos orgânicos presentemente descrito, o que satisfaz as valências dos heteroátomos. Além disso, não se pretende que a presente invenção seja limitada de foram alguma pelos substituintes admissíveis dos compostos orgânicos. As combinações dos substituintes e variáveis em vista pela presente invenção são preferencialmente os que resultam na formação de compostos estáveis, úteis no tratamento de, por exemplo, perturbações proliferativas, incluindo, sem constituir limitação, o cancro. 0 termo "estável, tal como presentemente utilizado, refere-se de preferência a 18 compostos que possuem estabilidade suficiente para permitir a produção e que mantêm a integridade do composto por um período de tempo suficiente para ser detectado e, de preferência, por um período de tempo suficiente para se útil para os fins descriminados. 0 termo "alifático", inclui hidrocarbonetos tanto saturados como insaturados, de cadeia linear (isto é não ramificada), ramificada, cíclicos ou policíclicos alifáticos, que são opcionalmente substituídos por um ou mais do que um grupo funcional. Tal como será evidente para alguém com formação ordinária na técnica, pretende-se que "alifático" inclua, sem ficar limitado a fracções alquilo, alcenilo, alcinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo e cicloalcinilo. Deste modo, tal como presentemente utilizado, o termo "alquilo" inclui grupos alquilo de cadeia linear, ramificada e cíclicos. Uma convenção semelhante é aplicada a outros termos genéricos, tal como "alcenilo", "alcinilo" e semelhantes. Além disso, tal como presentemente utilizado, os termos "alquilo", "alcenilo", "alcinilo" e semelhantes englobam os grupos tanto substituídos como não substituídos. Nalgumas formas de realização, tal como presentemente utilizado, "alquilo de cadeia curta" é utilizado para indicar os grupos alquilo (cíclicos, acíclicos, substituídos, não substituídos, ramificados ou não ramificados) com 1-6 átomos de carbono.

Nalgumas formas de realização, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-20 átomos de carbono alifáticos. Nalgumas outras formas de realização, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-10 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras formas de realização, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-8 átomos de carbono alifáticos. Noutras 19 formas de realização ainda, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-6 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras formas de realização, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-4 átomos de carbono. Grupos alifáticos de exemplo incluem assim, sem ficarem limitados a, por exemplo fracções metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, -CH2-ciclopropilo, alilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, ciclobutilo, -CH2-ciclobutilo, n-pentilo, sec-pentilo, isopentilo, terc-pentilo, ciclopentilo, -CH2-ciclopentilo, n-hexilo, sec-hexilo, ciclo-hexilo, -CH2-ciclo-hexil e semelhantes, os quais podem, uma vez mais possuir um mais do que um substituinte. Os grupos alcenilo incluem, sem ficarem limitados a, por exemplo etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-l-ilo e semelhantes. Os grupos alcinilo representativos incluem, sem ficarem limitados a, etinilo, 2-propinilo (propargilo), 1-propinilo e semelhantes. 0 termo "alcoxilo" ou "tioalquilo", tal como presentemente utilizado refere-se a um grupo alquilo, tal como anteriormente definido, ligado à fracção molecular progenitora por um átomo de oxigénio ou por meio de um átomo de enxofre. Nalgumas formas de realização, o grupo alquilo contém 1-20 átomos de carbono alifáticos. Nalgumas outras formas de realização, o grupo alquilo contém 1-10 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras formas de realização, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-8 átomos de carbono alifáticos. Em ainda outras formas de realização, o grupo alquilo contém 1-6 átomos de carbono alifáticos. Em outras formas de realização diferentes, o grupo alquilo contém 1-4 átomos de carbono alifáticos. Exemplos de alcoxilo incluem, 20 sem constituir limitação metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, tec-butoxi, neopentoxi e n-hexoxi. Exemplos de tioalquilo incluem, sem constituir limitação, metiltio, etiltio, propiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio e semelhantes. O termo "alquilamino" refere-se a um grupo com a estrutura -NHR', em que R' é alquilo, tal como presentemente definido. Nalgumas formas de realização, o grupo alquilo contém 1-20 átomos de carbono alifáticos. Nalgumas outras formas de realização, o grupo alquilo contém 1-10 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras formas de realização, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo empregues na presente invenção contêm 1-8 átomos de carbono alifáticos. Em ainda outras formas de realização, o grupo alquilo contém 1-6 átomos de carbono alifáticos. Em outras formas de realização diferentes, o grupo alquilo contém 1-4 átomos de carbono alifáticos. Exemplos de alquilamino incluem, sem constituir limitação, metilamino, etilamino, iso-propilamino e semelhantes.

Alguns exemplos dos substituintes das fracções dos compostos alifáticos (e outros) da presente invenção, descritos incluem sem se limitarem a alifático; heteroalifático; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxilo; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -N02; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHC12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2S02CH3; -C(o)Rx; -C02 (Rx) ; -CON(RX)0; -0C(0)Rx; -0C02Rx; -OCON(Rx)2; -N(RX)2; -S(0)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui independentemente, sem se limitar a substituintes alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo, em que cada um dos substituintes 21 alifático, heteroalifático, arilalquilo ou heteroarilalquilo descrito anteriormente e presentemente pode ser substituído ou não substituído, ramificado ou não ramificado, cíclico ou acíclico e em que qualquer um dos substituintes arilo ou heteroarilo anteriormente e presentemente descrito pode ser substituído ou não substituído. Exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em qeral são ilustrados pelas formas de realização específicas apresentadas nos exemplos descritos no presente documento.

Em geral, os termos "arilo" e "heteroarilo", tal como presentemente utilizados, referem-se a fracções monocíclicas ou policíclicas, heterocíclicas, policíclicas e poli-heterocíclicas insaturadas, de preferência com 3-14 átomos de carbono, podendo cada um ser substituído ou não substituído. Os substituintes incluem, sem se limitarem a qualquer um dos substituintes mencionados, isto é, os substituintes enumerados para fracções alifáticas ou para outras fracções tal como presentemente apresentado, resultando na formação de um composto estável. Em determinadas formas de realização da presente invenção, "arilo" refere-se a um sistema em anel carbocíclico monocíclico ou bicíclico, com um ou dois anéis aromáticos, incluindo, sem se limitar a fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, indanilo, indenilo e semelhantes. Em certas formas de realização da presente invenção, o termo "heteroarilo", tal como presentemente utilizado, refere-se a um radical aromático cíclico, com cinco a dez átomos do anel, dos quais um átomo do anel é seleccionado de entre S, 0 e N; zero, um ou dois átomos do anel são heteroátomos adicionais, seleccionados independentemente de entre S, 0 e N; e os átomos do anel restantes são carbono, sendo o 22 radical unido ao resíduo da molécula através de quaisquer dos átomos do anel, tal como, por exemplo piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo e semelhantes.

Será evidente que grupos arilo e heteroarilo (incluindo grupos arilo bicíclicos) pode ser não substituído ou substituído, incluindo a substituição de um, dois ou três dos átomos de hidrogénio existentes independentemente por qualquer uma ou por várias das fracções seguintes, incluindo, mas sem se limitar a: alifático; heteroalifático; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxilo; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -N02; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHC12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2S02CH3; -C(o)Rx; -C02 (Rx) ; -CON(RX)0; -0C(0)Rx; -0C02Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(0)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui independentemente, sem se limitar a os substituintes alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo descritos anteriormente e presentemente podem ser substituídos ou não substituídos, ramificados ou não ramificados, cíclicos ou acíclicos e em que qualquer um dos substituintes arilo ou heteroarilo anteriormente e presentemente descrito pode ser substituído ou não substituído. Exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em geral são ilustrados pelas formas de realização específicas apresentadas nos exemplos descritos no presente documento. 0 termo "cicloalquilo", tal como presentemente utilizado, refere-se especificamente a grupos com três a sete, de 23 preferência três a dez átomos de carbono. Cicloalquilos adequados incluem, sem se limitarem a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e semelhantes, que, tal como no caso de outras fracções alifáticas; heteroalifáticas ou heterociclicas podem opcionalmente ser substituídos por substituintes incluindo, sem se limitarem a alifático, heteroalifático arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxilo; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -N02; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHC12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2S02CH3; -C(o)Rx; -C02 (Rx) ; -CON(RX)0; -0C(0)Rx; -0C02Rx; -OCON (Rx) 2; -N(Rx)2; -S(0)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui independentemente, sem se limitar a substituintes alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo, em que cada um dos substituintes alifático, heteroalifático, arilalquilo ou heteroarilalquilo descrito anteriormente e presentemente pode ser substituído ou não substituído, ramificado ou não ramificado, cíclico ou acíclico e em que qualquer um dos substituintes arilo ou heteroarilo anteriormente e presentemente descrito pode ser substituído ou não substituído. Exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em geral são ilustrados pelas formas de realização específicas apresentadas nos exemplos descritos no presente documento. 0 termo "heteroalifático", tal como presentemente utilizado, refere-se a fracções alifáticas que contêm um ou mais do que um átomo de oxigénio, enxofre, azoto, fósforo ou silício, por exemplo em vez dos átomos de carbono. As fracções heteroalifáticas podem ser ramificadas ou não ramificadas, cíclicas ou acíclicas e incluem heterociclos 24 saturados e não saturados, tal como morfolino, pirrolidinilo, etc. Nalgumas formas de realização, as fracções heteroalifáticas são substituídas por substituição independente de um ou vários dos átomos de hidrogénio existentes por uma ou mais do que uma fracção, incluindo, mas sem se limitar a alifático, heteroalifático arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxilo; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHC12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2S02CH3; -C(o)Rx; -C02 (Rx) ; -CON(RX)0; -0C(0)Rx; -0C02Rx; -OCON (Rx) 2; -N(Rx)2; -S(0)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui independentemente, sem se limitar a substituintes alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo, em que cada um dos substituintes alifático, heteroalifático, arilalquilo ou heteroarilalquilo descrito anteriormente e presentemente pode ser substituído ou não substituído, ramificado ou não ramificado, cíclico ou acíclico e em que qualquer um dos substituintes arilo ou heteroarilo anteriormente e presentemente descrito pode ser substituído ou não substituído. Exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em geral são ilustrados pelas formas de realização específicas apresentadas nos exemplos descritos no presente documento. 0 termo "halogénio", tal como presentemente utilizado, refere-se a um átomo seleccionado de entre flúor, cloro, bromo e iodo. 0 termo "haloalquilo" designa um grupo alquilo tal como anteriormente definido, com um, dois ou três átomoss de halogénio ligados e é exemplificado por grupos tal como clorometilo, bromoetilo, trifluorometilo e semelhantes. 25 0 termo "heterocicloalquilo" ou "heterociclo", tal como presentemente utilizado, refere-se a um grupo policiclico não-aromático, de 5, 6 ou 7 membros no anel, incluindo, sem se limitar a um grupo biciclico ou triciclico, compreendendo anéis de seis membros fundidos entre um e três heteroátomos, seleccionados independentemente de entre oxigénio, enxofre e azoto, em que (i) cada anel de 5 membros tem 0 a 1 ligação dupla e cada anel de 6 membros tem 0 a 2 ligações duplas, (ii) os heteroátomos de azoto e de enxofre podem opcionalmente ser oxidados, (iii) o heteroátomo azoto pode opcionalmente ser quaternarizado e (iv) qualquer um dos anéis heterociclicos anteriores pode ser fundido a um anel benzeno. Os heterociclos representativos incluem, sem se limitarem a pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo e tetra-hidrofurilo. Nalgumas formas de realização, é utilizado um grupo "heterocicloalquilo ou heterociclo substituído" e tal como presentemente utilizado refere-se a um grupo heterocicloalquilo ou heterociclo tal como anteriormente definido substituído pela substituição independente de um, dois ou três dos átomos de hidrogénio existentes com, mas sem se limitar a alifático, heteroalifático arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxilo; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -N02; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHC12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2S02CH3; -C(o)Rx; -C02 (Rx) ; -CON(RX)0; -0C(0)Rx; -0C02Rx; -OCON(Rx)2; -N(RX)2; -S(0)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui independentemente, sem se limitar a os substituintes alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo 26 ou heteroarilalquilo descritos anteriormente e presentemente pode ser substituído ou não substituído, ramificado ou não ramificado, cíclico ou acíclico e em que qualquer um dos substituintes arilo ou heteroarilo anteriormente e presentemente descrito pode ser substituído ou não substituído. Exemplos adicionais de substituintes aplicáveis em geral são ilustrados pelas formas de realização específicas apresentadas nos exemplos descritos no presente documento. "marcado": Tal como presentemente utilizado, o termo "marcado" pretende indicar que o composto possui pelo menos um elemento, isótopo ou composto químico ligado para permitir a detecção do composto. Em geral, os marcadores dividem-se em três classes: a) Marcadores de isótopos, que podem ser radioactivos ou isótopos pesados, incluindo sem se limitar a 2H, 3H, 32P, 35S, 67Ga, 99mTc (Tc-99m) , mIn, 123I, i25i, 169Yb e 186Re; b) marcadores imunológicas, que podem ser anticorpos ou antigénios e c) corantes coloridos ou fluorescentes. Será evidente que os marcadores podem ser incorporados no composto em qualquer posição que não interfira com a actividade biológica ou características do composto que se pretende detectar. Nalgumas formas de realização da presente invenção, a marcação por fotoafinidade é utilizada para o esclarecimento directo das interacções intermoleculares em sistemas biológicos (por exemplo para sondar o local de ligação da epotilona num dímero de tubolina). Pode ser empregue uma variedade de fotóforos conhecidos, a maioria dependente da fotoconversão de compostos diazo, azidas ou diazirinas em nitrenos ou carbenos (vide, Bayley, H., Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology (1983), Elsevier, Amsterdão), cujos conteúdos são incluídos na íntegra por 27 referência. Nalgumas formas de realização da presente invenção, os marcadores por fotoafinidade empregues são o-azidobenzoílos, m-azidobenzoilos e p-azidobenzoilos, substituídos por uma ou mais do que uma fracção halogénio, incluindo, mas sem se limitar a ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzóico. "Polímero": 0 termo "polímero", tal como presentemente utilizado, refere-se a uma composição compreendendo cadeias que podem ser abertas, fechadas, lineares, ramificadas ou reticuladas de unidades repetitivas (monómeros) que podem ser iguais ou diferentes. Será evidente que, nalgumas formas de realização o termo polímero se refere a biopolímeros que, tal como presentemente utilizado, se pretende que designem materiais de polímero encontrados na natureza ou baseados nos materiais encontrados na natureza, incluindo, mas sem se limitar a ácidos nucleicos, peptídeos e respectivos miméticos. Noutras formas de realização, o termo polímero refere-se a polímeros sintéticos, tal como polímeros biodegradáveis ou outros materiais de polímero. Será evidente que os suportes sólidos de polímero estão também incluídos nos polímeros da presente invenção. Os compostos da invenção podem ser ligados a suportes de polímero e, assim, podem ser conduzidas modificações de síntese na fase sólida. Tal como presentemente utilizado, o termo "suporte sólido" pretende incluir, sem se limitar a pellets, discos, fibras ocas capilares, agulhas, pinos, fibras sólidas, contas de celulose, contas de vidro poroso, géis de sílica, contas de polistireno opcionalmente reticuladas com divinilbenzeno, contas co-poli enxertadas, contas de poliacrilamida, contas de látex, contas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas com Ν-Ν'-bis-acriloiletilenodiamina e partículas de vidro revestidas com 28 um polímero hidrófobo. Alguém com formação ordinária na técnica irá aperceber-se que a escolha do suporte sólido específico será limitada pela compatibilidade do suporte com a química da reacção em uso. Um suporte sólido de exemplo é uma resina amino Tentagel, um compósito de 1) uma conta de polistireno reticulada com divinilbenzeno e 2) PEG (polietileno glicol). Tentagel é um suporte sólido particularmente útil, porque proporciona um suporte versátil para utilização em ensaios em-conta ou sem-conta e apresenta um excelente comportamento de expansão em solventes desde o tolueno à água.

DESCRIÇÃO DE DETERMINADAS FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Admitindo a necessidade de desenvolver novas terapias eficazes contra o cancro, a presente invenção proporciona novas metodologias sintéticas que permitem o acesso a macrociclos com uma ampla gama de actividade biológica e farmacológica. Nalgumas formas de realização, os compostos são úteis no tratamento do cancro. Certos compostos exibem efeitos citotóxicos ou inibidores do crescimento em linhas de células cancerosas, exibindo uma capacidade de polimerizar a tubulina e estabilizar conjuntos de microtúbulos e/ou conduzir ao atrofiamento ou desaparecimento de tumores em modelos de xenoenxerto de células cancerígenas. Os compostos podem ter efeitos secundários reduzidos ou mínimos, incluindo toxicidade em órgãos vitais, náuseas, vómitos, diarreia, alopécia, perda de peso, ganho de peso, toxicidade hepática, perturbações dérmicas, etc. Os compostos podem ainda ser mais fáceis de formular graças à maior hidrossolubilidade, menos toxicidade, maior alcance terapêutico, maior eficácia, etc. 29 A presente invenção proporciona um método para a preparação de um composto da fórmula:

em que Ri é hidrogénio ou um alquilo de cadeia curta; R2 é um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo substituído ou não substituído;

Rs e Rê são cada um independentemente do outro, hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C(R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta;

Rb, é, independentemente de cada ocorrência hidrogénio; halogénio; -0RB; -SRB-; -N(RB.)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y, em que Y é F, Br, Cl, I, 0Rb·, NHRb·, N(Rb.)2 ou SRB·; - C(0)0RB·; -C (0) RB-; -CONHRb' ; -0(C=0)RB-; -0(C=0)0RB.; -NRB· (C=0) RB-; N3; N2RB',· acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB>; —SRB.; -N(RB')2; -C(0)0RB',· - C (0) Rb· ; -CONHRb·; -0(C=0)Rb.; -0(C=0)0Rb·; NRb. (C=0) Rb. ; N3; N2Rb·; acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de RB., é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, 30 arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático e m é 1, 2, 3, ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: submeter um composto da fórmula:

a condições de uma reacção de metátese de fecho do anel. A presente invenção proporciona ainda um método para a preparação de um composto da fórmula:

em que Ri é hidrogénio ou um alquilo de cadeia curta; R2 é um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo substituído ou não substituído; R5 e R6 são cada um independentemente do outro, hidrogénio ou um grupo de protecção; X é O, S, C (R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta;

Rb, é, independentemente de cada ocorrência hidrogénio; halogénio; -ORB; -SRB·; -N(RB')2; -CY3, -CHY2, -CH2Y, em que 31 Y é F, Br, Cl, I, ORb-, NHRb-, N(Rb.)2 ou SRb·; - C(0)0RB·; -C (O) RB'; -CONHRe' ; -0(C=0)RB-; -0(C=0)0RB'; -NRB- (C=0)RB·; N3; NeRb·; acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB·; -SRB>; -N(RB-)2; -C(0)0RB',· - C (0) Rb· ; -C0NHRb.; -0(C=0)Rb.; -0(C=0)0Rb.; NRb. (C=0) Rb. ; N3; N2RB·; acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de RB-, é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático e m é 1, 2, 3 ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: submeter um composto da fórmula:

a condições de uma reacção de metátese de fecho do anel. A presente invenção proporciona ainda um método para a preparação de um composto da fórmula: 32

Rs e R6 são cada um independentemente do outro, hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C(R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta;

Rb, é, independentemente de cada ocorrência hidrogénio; halogénio; -0RB; -SRB·; -N(RB.)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y, em que Y é F, Br, Cl, I, 0Rb-, NHRb., N(Rb.)2 ou SRB·; - C(0)0RB·; -C (0) RB'; -CONHRb' ; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB·; -NRB> (C=0)Rb·; N3; N2Rb>; acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB-; -SRB>; -N(RB-)2; -C(0)0RB'; - C (0) RB.; -CONHRb,; -0(C=0)Rb-; -0(C=0)0Rb·; NRb, (C=0) Rb. ; N3; N2Rb,; acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de RB., é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou 33 heteroarilalcinilo linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático e e m é 1, 2, 3, ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: redução de um composto da fórmula:

A presente invenção proporciona ainda um método para a preparação de um composto da fórmula:

Rs e R6 são cada um independentemente do outro, hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C (R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta;

Rb, é, independentemente de cada ocorrência hidrogénio; halogénio; -0RB; -SRb·; -N(Rb.)2; ~CY3, -CHY2, -CH2Y, em que Y é F, Br, Cl, I, 0RB·, NHRB·, N(RB.)2 ou SRB·; - C(0)0RB·; -C(0)Rb·; -CONHRb·; -0(C=0)RB·; -0(C=0)0RB·; -NRB· (C=0)RB·; N3; N2RB.; acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou 34 acíclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB·; -SRB·; _N(RB')2; -C(0)0RB'; - C (0) RBt; -C0NHRb· ; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB.; NRB. (C=0) RB.; N3; N2Rb·; acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de RB>, é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático e e m é 1, 2, 3, ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas:

Oxidação de um composto da fórmula: A presente invenção processa ainda um método para a preparação de um composto da fórmula:

Rs e R6 são cada um independentemente do outro, hidrogénio ou um grupo de protecção; 35 X é 0, S, C (R7) 2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta;

Rb, é, independentemente de cada ocorrência hidrogénio; halogénio; -0RB; -SRb·; -N(Rb.)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y, em que Y é F, Br, Cl, I, 0Rb., NHRb., N(Rb.)2 ou SRB>; - C(0)0RB·; -C(0)Rb·; -CONHRb.; -0(C=0)Rb.; -0(C=0)0Rb.; -NRb. (C=0)Rb.; N3; N2Rb·; acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB·; -SRB>; -N(RB<)2; -C(0)0RB-; -

N2Rb·; acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclica ou acíclica, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de RB', é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático e m é 1, 2, 3, ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: condensação de um óxido de fosfina ou reagente de Witting com a estrutura: O R1 x- R"

R’ 36 em que R' e R" são independentemente alquilo-Ci-8 de cadeia linear ou ramificada ou um fenilo, arilo, alcoxi ou ariloxi substituído ou não substituído e X é um contra-anião tal como cloro ou bromo; com uma cetona, com a estrutura:

Descrição Geral dos Compostos da Invenção

Os compostos preparados pelos métodos da presente invenção incluem os compostos da fórmula geral (0) e (θ') como se define mais pormenorizadamente em seguida:

em que Ro é um grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo substituído ou não substituído; nalgumas formas de realização Ro é um grupo arilalquilo, arilalcenilo, heteroarilalquilo ou heteroarilalcenilo; noutras formas de realização, R0 é um grupo heteroarilalcenilo; em certas formas de realização, 37

Ro é um grupo heteroarilalquilo; noutras formas de realização, Ro é um grupo arilo ou heteroarilo de 5 a 7 membros; ainda noutras formas de realização, R0 é um grupo arilo ou heteroarilo bicíclica de 8 a 12 membros; noutras formas de realização ainda, Ro é um grupo biciclico em que um anel fenilo está fundido a um grupo heteroarilo ou arilo; noutras formas de realização, R0 é um grupo biciclico em que um anel fenilo está fundido a um grupo tiazol, oxazol ou imidazol; noutras formas de realização ainda, R0 é um grupo fenilo substituído ou não substituído; R3 e R4 são cada independentemente hidrogénio ou grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo substituído ou não substituído, de cadeia linear ou ramificada, cíclica ou acíclica, alifática, heteroalifática, opcionalmente substituído por um ou mais do que um hidroxi, hidroxi protegido, alcoxi, carboxi, carboxaldeído, alquilo de cadeia linear ou ramificada ou acetal cíclico, flúor, amino, amino protegido, amino substituído por uma ou duas fracções alquilo ou arilo, N-hidroximino ou N-alcoxiimino; nalgumas formas de realização R3 e R4 são cada independentemente hidrogénio, flúor ou alquilo de cadeia curta; noutras formas de realização R3 e R4 são cada independentemente hidrogénio ou metilo; ainda noutras formas de realização, R3 é metilo e R4 é hidrogénio; R5 e R6 são cada independentemente hidrogénio ou um grupo de protecção; nalgumas formas de realização, R5 e Rg são ambos hidrogénio; X é 0, S, C (R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta; nalgumas formas de realização X é 0 e noutras formas de realização X é NH; 38 X é 0, S, NH, C (R7) 2 CH2, NR7 ου NH em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta; nalgumas formas de realização Y é 0 e noutras formas de realização Y é NH; ainda noutras formas de realização Y é CH2;

Cada R8 é independentemente hidrogénio, halogénio, hidroxi, alcoxi, amino, dialquilamino, alquilamino, flúoro, ciano ou grupo arilo, heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo ou heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo, heteroarilalcinilo substituído ou não substituído, de cadeia linear ou ramificada, cíclica ou acíclica, alifática, heteroalifática, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidroxi, hidroxi protegido, alcoxi, carboxi, carboxaldeído, alquilo de cadeia linear ou ramificada ou acetal cíclico, flúor, amino, amino protegido, amino substituído por uma ou duas fracções alquilo ou arilo, N-hidroximino ou N-alcoximino, nalgumas formas de realização R8 é hidrogénio, noutras formas de realização R8 é hidroxilo, ainda noutras formas de realização R8 é flúor, ainda noutras formas de realização R8 é alquilo de cadeia curta, tal como metilo, noutras formas de realização R8 é -CF3, -CF2H ou CFH2, noutras formas de realização R8 é um grupo alquilo perfluorado ou fluorado, ainda noutras formas de realização R8 é um grupo alquilo halogenado ou per-halogenado. R9 e Rio são cada independentemente hidrogénio ou grupo arilo, heteroarilo, arilo, arilalquilo arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo substituído ou não substituído, de cadeia linear ou ramificada, cíclica ou acíclica, alifática, heteroalifática, opcionalmente substituído por um ou mais do que um hidroxi, hidroxi protegido, alcoxi, 39 carboxi, carboxaldeído, alquilo de cadeia linear ou ramificada ou acetal cíclico, flúor, amino, amino protegido, amino substituído por uma ou duas fracções alquilo ou arilo, N-hidroximino ou N-alcoxiimino; nalgumas formas de realização um de entre Rg e Ri0 é metilo, noutras formas de realização Rg e Rio são ambos metilo; ainda noutras formas de realização, um de Rg e Ri0 é metilo e o outro é hidrogénio; nalgumas formas de realização, Rg e Ri0 são ambos hidrogénio;

Rb é independentemente de cada ocorrência 0RB-, SRB' ; N (RB') 2, -C(0)0Rb·; -C(0)Rb·; -CONHRb·; -0(C=0)Rb·; 0(C=0)0RB',· -NRb> (C=0)RB',· N3; N2RB'; acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB·; -SRb·; -N(Rb02; -C (0) 0RB'; — C (0) Rb- ; -CONHRb· ; -0(C=0)RB·; -0(C=0)0Rb·; NRb· (C=0) Rb> ; N3; N2RB',· acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, nalgumas ocorrências Rb é hidrogénio, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo, cada um não substituído ou opcionalmente substituído por um ou mais do que uma das ocorrências de halogénio, -OH, -0Rb·, NH2 ou N(Rb.)2, ou qualquer combinação destes, em que cada ocorrência de RB é independentemente hidrogénio, alquilo, arilo ou um grupo de protecção, noutras formas de 40 realização Rb é hidrogénio, metilo ou etilo, ainda noutras formas de realização Rb é metilo, ainda noutras formas de realização -CY3, -CHY2, -CH2Y, em que Y é F, Br, Cl, I, ORB', NHRb·, N(Rb-)2 ou SRb·; ainda noutras formas de realização RB é -CF3, -CH2F ou CHF2, noutras formas de realização RB é grupo alquilo perfluorado ou fluorado, ainda noutras formas de realização RB é grupo alquilo halogenado ou per-halogenado..

Cada ocorrência de RB- é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo arilo ou heteroarilo, arilalquilo, arilalcenilo, arilalcinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalcenilo ou heteroarilalcinilo linear ou ramificado, substituído ou não substituído, cíclico ou acíclico, alifático, heteroalifático; mé 1, 2, 3, ou 4, mé 1 ou 2 nalgumas formas de realização, m é 1 noutras formas de realização e respectivos derivados farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos preparados pelos métodos da presente invenção incluem os compostos da fórmula geral (I) ou (I') como se definido mais pormenorizadamente em seguida:

em que Ri é hidrogénio ou alquilo de cadeia curta, em certas formas de realização R3 é metilo, em certas formas 41 de realização Ri é -CF3, -CF2H ou CH2F, noutras formas de realização Ri é grupo alquilo perfluorado ou fluorado, ainda noutras formas de realização,

Ri é grupo alquilo halogenado ou per-halogenado; R2 é uma fracção arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo substituída ou não substituída, nalgumas formas de realização R2 é oxazol substituído ou não substituído, noutras formas de realização R2 é tiazol substituído ou não substituído; R3 e R4 são cada independentemente hidrogénio ou fracção arilo, heteroarilo, arilalquilo ou heteroarilalquilo substituída ou não substituída, de cadeia linear ou ramificada, cíclica ou acíclica, alifática, heteroalifática, opcionalmente substituída por um ou mais do que um hidroxi, hidroxi protegido, alcoxi, carboxi, carboxaldeído, alquilo de cadeia linear ou ramificada ou acetal cíclico, flúor, amino, amino protegido, amino substituído por uma ou duas fracções alquilo ou arilo, N-hidroximino ou N-alcoxiimino; nalgumas formas de realização R3 e R4 são cada independentemente hidrogénio, flúor ou alquilo de cadeia curta; noutras formas de realização R3 e R4 são cada independentemente hidrogénio ou metilo; ainda noutras formas de realização, R3 é metilo e R4 é hidrogénio; R5 e R6 são cada independentemente hidrogénio ou um grupo de protecção; nalgumas formas de realização, R5 e Rg são ambos hidrogénio; X é 0, S, C(R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta; nalgumas formas de realização X é 0 e noutras formas de realização X é NH; 42

Rb é independentemente de cada ocorrência ORB·, SRb·; N(Rb-)2, -C(0)0Rb·; -C(0)Rb·; -CONHRb· ; -0(C=0)Rb·; 0(C=0)0Rb·; -NRb- (C=0)Rb·; N3; N2RB'; acetal cíclico ou arilo ou heteroarilo, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, alifático, heteroalifático, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -ORb·; -SRb. ; -N(Rb02; -C(0)0Rw -C (0) Rb - ; -CONHRb- ; -0(C=0)RB·; -0(C=0)0Rb·; NRb. (C=0) Rb· ; N3; N2RB'; acetal cíclico ou grupo arilo ou heteroarilo, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído, alifático, heteroalifático; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, nalgumas ocorrências RB é hidrogénio, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo, cada um não substituído ou opcionalmente substituído por um ou mais do que uma das ocorrências de halogénio, -OH, -0RB', NH2 ou N (Rb-)2, ou qualquer combinação destes, em que cada ocorrência de Rb é independentemente hidrogénio, alquilo, arilo ou um grupo de protecção, noutras formas de realização RB é hidrogénio, metilo ou etilo, ainda noutras formas de realização RB é metilo, ainda noutras formas de realização RB é -CF3, -CH2F ou CHF2 respectivos derivados farmaceuticamente aceitáveis.

Nalgumas formas de realização, os compostos preparados pelos métodos da presente invenção incluem os compostos da fórmula geral (II) ou (II') com a estereoquímica definida da seguinte forma: 43

em que X, Ri, R2, R3, R4, R5, R6, RB e X são tal como anteriormente definido.

Nalgumas formas de realização X é 0. Noutras formas de realização X é NH. Noutras formas de realização X é CH2.

Nalgumas formas de realização R2 é tiazol substituído ou não substituído. Em determinadas formas de realização, R2 é 2-metil-tiazo-4-ilo. Noutras formas de realização, R2 é 2-hidroximetil-tiazo-4-ilo. Ainda noutras formas de realização, R2 é 2-aminometil-tiazo-4-ilo. Noutras formas de realização, R2 é 2-tiolmetil-tiazo-4-ilo.

Em certas formas de realização R2 é oxazol substituído ou não substituído. Em determinadas formas de realização, R2 é 2-metil-oxazo-4-ilo. Noutras formas de realização, R2 é 2-hidroximetil-oxazo-4-ilo. Ainda noutras formas de realização, R2 é 2-aminometil-oxazo-4-ilo. Noutras formas de realização, R2 é 2-tiolmetil-oxazo-4-ilo.

Em determinadas formas de realização, RB é hidrogénio, metilo, etilo, -CF3, CH2F, -CF2H. Em determinadas formas de realização RB é metilo. Ainda noutras formas de realização Rb é -CF3. Em determinadas formas de realização RB é hidrogénio. Noutras formas de realização RB é etilo. 44

Determinados compostos preferidos, preparados pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo:

45

46

47

ΌΗ ΌΗ 48

*QH ΌΗ 49

Os compostos preparados pelos métodos da presente invenção incluem os apresentados especificamente acima e presentemente descritos e são ilustrados em parte pelas várias classes, subgéneros e espécies apresentados noutras partes do presente documento.

Será evidente para alguém com formação ordinária na técnica que podem existir centros assimétricos nos compostos preparados pelos métodos da presente invenção. Deste modo, os compostos da presente invenção e respectivas composições farmacêuticas podem encontrar-se sob a forma de um enantiómero, diastereómero ou isómero geométrico individual ou podem encontrar-se sob a forma de uma mistura de estereoisómeros. Nalgumas formas de realização, os compostos preparados pelos métodos da presente invenção são compostos enantioméricos. Noutras formas de realização são apresentadas misturas de estereoisómeros ou diastereómeros.

Será evidente que algumas das classes e subclasses de compostos apresentadas anteriormente podem encontrar-se sob várias formas isoméricas. Os compostos podem ser isómeros individuais substancialmente isentos de outros isómeros e, em alternativa, como misturas de vários isómeros, por exemplo, misturas racémicas de estereoisómeros. Adicionalmente, a presente invenção engloba ambos os isómeros de dupla ligação (Z) e (E), excepto quando especificamente indicado em contrário. Deste modo, os compostos preparados pelos métodos da presente invenção, geralmente descritos na estrutura (0), (θ'), (I), (I'), (II) e (II'), englobam estas estruturas, nas quais as ligações duplas são (Z) e (E) . Em determinadas formas de realização preferidas, a ligação dupla na posição Ci2-Ci3 encontra-se na configuração cis ou Z. Nalgumas formas de realização, a ligação dupla na posição C9-C10 encontra-se 50 na configuração cis ou Z. Ainda noutras formas de realização, a ligação dupla na posição C12-C13 encontra-se na configuração cis ou Z e a ligação dupla na posição C9-C10 encontra-se na configuração trans ou E. Os compostos incluem também tautómeros dos compostos específicos tal como descritos anteriormente.

Os compostos podem ser fornecidos como derivados farmaceuticamente aceitáveis e utilizados em métodos de tratamento de um indivíduo com utilização destes compostos, respectivas composições farmacêuticas ou um destes em combinação com um ou mais do que um agente terapêutico adicional. A frase "derivado farmaceuticamente aceitável", tal como presentemente utilizado, designa qualquer sal farmaceuticamente aceitável, éster ou sal do éster deste composto ou qualquer outro aducto ou derivado que, ao ser administrado a um paciente é capaz de proporcionar (directa ou indirectamente) um composto como presentemente descrito u um respectivo metabolito ou resíduo. Os derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem, assim, entre outros, os pró-fármacos. Um pró-fármaco é um derivado de um composto, normalmente com actividade farmacológica significativamente reduzida, que contém uma fracção adicional que é susceptível de ser removida in vivo, rendendo a molécula progenitora como a espécie farmaceuticamente activa. Um exemplo de um pró-fármaco é um éster que é cindido in vivo para render um composto de interesse. Os pró-fármacos de uma variedade de compostos e materiais e métodos de derivatização da substância activa, para criar os pró-fármacos são conhecidos e podem ser adaptados à presente invenção. Certas composições farmacêuticas de exemplo e derivados farmaceuticamente aceitáveis serão discutidos em pormenor seguidamente. 51

Os compostos que se revestem de particular interesse incluem aqueles que: • Exibem efeito citotóxico ou inibidor do crescimento em linhas de células cancerígenas mantidas in vitro ou em estudos animais, utilizando um modelo de xenoenxerto de células cancerígenas cientificamente aceitável. • Exibem uma capacidade para polimerizar tubulina e estabilizar conjuntos de microtúbulos; • Exibem níveis mínimos de toxicidade nos órgãos vitais; • Conduzem ao desaparecimento do tumor em modelos de xenoenxerto de células cancerígenas cientificamente aceitáveis; • Conduzem ao atrofiamento do tumor em modelos de xenoenxerto de células cancerígenas cientificamente aceitáveis; • Conduzem ao desaparecimento do tumor em modelos de xenoenxerto de células cancerígenas cientificamente aceitáveis e recorrência demorada/ou ausência de recorrência do tumor após a paragem do tratamento; • Exibem diminuições transitórias e reversíveis do peso corporal e revelam efeitos terapêuticos em modelos de xenoenxerto de células cancerígenas cientificamente aceitáveis; • Exibem maior hidrossolubilidade em comparação com as epotilonas A, B, C ou D ou paclitaxel ou exibem adicionalmente ou alternativamente solubilidade suficiente para serem formulados em meio aquoso, utilizando proporção reduzida de cremofóros e/ou 52 • Exibem um perfil terapêutico (por exemplo nível óptimo de segurança e efeito curativo) que é superior ao da epotilona B, epotilona D ou paclitaxel.

Foi preparada, caracterizada e ensaiada uma variedade de análogos da epotilona, tal como anteriormente descrito, conforme exemplificação inclusa. Tem-se constatado que os análogos de 9,10-de-hidro-epotilona são úteis no tratamento do cancro e, em compostos particulares, foram preparados e constatou-se que possuem uma ou várias das características enumeradas anteriormente,

Metodologia de síntese A síntese de determinadas epotilonas e desoxiepotilonas e respectivos análogos foi anteriormente descrita (vide, patentes norte-americanas 6,242,469, 6,284,781, 6,300,355, 6,204,388, 6,316,630 e 6,369,234; pedidos de patente norte-americana 09/797,027, 09/796,959 e 10/236,135; publicação PCT n°. WO 99/01124, WO 99/43653 e WO 01/64650, cujo conteúdo é incluído na íntegra por referência) . Em reconhecimento da necessidade de metodologias de síntese aperfeiçoadas ou adicionais para a geração eficiente de epotilonas, desoxiepotilonas e respectivos análogos em grandes quantidades, a presente invenção proporciona uma via eficiente e modular para a síntese de epotilonas, desoxiepotilonas e respectivos análogos. Apesar de ser descrita a síntese de determinados compostos de exemplo na Exemplificação inclusa, será evidente que esta metodologia é geralmente aplicável para a geração de análogos e conjugados, como anteriormente discutido para cada uma das classes, subclasses presentemente descritas.

Em particular, os compostos de 9,10-de-hidroepotilona da presente invenção podem ser preparados numa variedade de formas, utilizando metodologias de síntese úteis na síntese 53 das epotilonas. Nalgumas formas de realização, os compostos são preparados utilizando uma via de síntese convergente. Por exemplo, a epotilona pode ser sintetizada por meio da preparação de dois ou três intermediários, que são conjugados para se obter o composto desejado. Numa concretização, um dos intermediários é uma porção acilo contendo 1-9 átomos de carbono e outro intermediário contém 10-15 átomos de carbono e pode ainda conter a cadeia lateral tiazol. Estas duas porções aproximadamente iguais da epotilona podem ser conjugadas utilizando, primeiro, uma reacção de esterificação entre C-l e um oxigénio próximo de C-15. O macrociclo pode então ser fechado com uma reacção de acoplagem carbono carbono, tal como a acoplagem Suzuki ou reacção de metátese de fecho do anel. Numa concretização, a fase final de fecho do anel é concluída utilizando uma reacção de metátese de fecho do anel para formar a ligação dupla 9,10 e fechar o macrociclo. A reacção de metátese de fecho do anel é concluída utilizando um catalisador organometálico, tal como o catalisador de Grubbs, como se mostra no esquema δ seguinte. Nalgumas formas de realização, a ligação dupla 9,10 é reduzida ou oxidada ou a ligação dupla 9,10 pode ainda ser funcionalizada para preparar derivados de epotilona adicionais.

Noutras formas de realização, a fase final de fecho do anel é concluída utilizando uma reacção de metátese de fecho do anel para formar a ligação dupla 12,13 e fechar o macrociclo. Em determinadas formas de realização a ligação dupla-12,13 é reduzida ou oxidada. Noutras formas de realização, é utilizada uma reacção de macroaldolização ou macrolactonização para formar o macrociclo. Determinadas sínteses de exemplo dos compostos da presente invenção são 54 apresentadas nas figuras e nos exemplos. Tal como será evidente para alguém com formação ordinária na técnica, pode ser preparada uma variedade de análogos e derivados utilizando os procedimentos de sintese descritos. Por exemplo, seria possível completar muitas da fases de síntese com grupos de protecção diferentes ou substituintes diferentes no anel de 16 membros.

Composições farmacêuticas É também descrita uma preparação farmacêutica compreendendo pelo menos um dos compostos descritos anteriormente e presentemente ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável, compostos esses que são capazes de inibir o crescimento ou capazes de matar as células cancerígenas e são capazes de inibir o crescimento ou matar células cancerígenas multirresistentes. A preparação farmacêutica pode também incluir um agente solubilizante ou emulsionante, tal como Cremophor (óleo de castor polioxilo 35) ou Solutol (polietilenoglicol 660 12-hidroxiestearato).

Como anteriormente discutido, são apresentados novos compostos com actividade antitumor e antiproliferativa, sendo assim úteis para o tratamento do cancro. Assim, noutro aspecto da presente invenção, são apresentadas composições farmacêuticas, em que estas composições incluem qualquer um dos compostos presentemente descritos e incluem opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições incluem ainda, opcionalmente, um ou mais do que um agente terapêutico adicional. O agente terapêutico adicional pode ser um agente anticancerígeno, tal como discutido mais pormenorizadamente no presente documento.

Será também evidente que alguns dos compostos preparados pelos métodos da presente invenção podem existir sob forma livre para tratamento ou, onde apropriado, como respectivo 55 derivado farmaceuticamente aceitável. Um derivado farmaceuticamente aceitável inclui, sem se limitar a sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres ou sais dos ésteres ou qualquer outro aducto ou derivado que, ao ser administrado a um paciente necessitado é capaz de proporcionar, directa ou indirectamente, um composto como presentemente descrito ou um respectivo metabolito ou resíduo, por exemplo um pró-fármaco.

Tal como presentemente utilizado, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais considerados, do ponto de vista médico, adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica e semelhantes e com uma proporção benefício/risco razoável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge, et al. descreve pormenorizadamente sais farmaceuticamente aceitáveis em J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977), incluído por referência, Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento final e purificação dos compostos da presente invenção ou separadamente por meio de reacção da função base livre com um ácido orgânico adequado. Exemplos de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, não tóxicos são sais de um grupo amino formados com ácidos inorgânicos tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos tal como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malónico ou recorrendo a outros métodos, utilizados na técnica, tal como a permuta iónica. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, alginato, ascorbato, 56 aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforosulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, gluco-heptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidroxietanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, valerato e semelhantes. Sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos incluem sódio, litio, potássio, cálcio e semelhantes. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, amónio não tóxico, amónio quaternário e catiões de amina formados utilizando contra-iões, tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo de cadeia curta e sulfonato de arilo.

Adicionalmente, tal como presentemente utilizado, o termo "éster farmaceuticamente aceitável" refere-se a ésteres que hidrolizam in vivo e incluem aqueles que rapidamente se decompõem no corpo humano para deixar a substância activa ou respectivo sal. Grupos éster adequados incluem, por exemplo, os que são derivados de ácidos carboxilicos alifáticos farmaceuticamente aceitáveis, particularmente ácidos alcanóicos, alcenóicos, cicloalcanóicos e alcanedióicos, nos quais a fracção alquilo ou alcenilo não tem vantajosamente mais de 6 átomos de carbono. Exemplos de ésteres específicos incluem formatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos e etilsuccinatos. 57

Além disso, o termo "pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis", tal como presentemente utilizado, refere-se aos pró-fármacos dos compostos preparados pelos métodos da presente invenção, que, no âmbito de uma avaliação médica consciente, são adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais inferiores com toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivas e semelhantes, proporcionados com uma razão beneficio/risco razoável e eficazes para o fim em vista, bem como formas zwiteriónicas, quando possível, dos compostos da presente invenção. 0 termo "pró-fármaco" refere-se aos compostos que são rapidamente transformados in vivo para se obter a substância activa da fórmula anterior, por exemplo por meio de hidrólise em sangue. Uma discussão minuciosa é apresentada por T. Higuchi e V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, e em Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, ambos incluídos por referência.

Como anteriormente descrito, as composições farmacêuticas da presente invenção incluem ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, o qual tal como presentemente utilizado inclui quaisquer e todos os solventes, diluentes ou outros veículos líquidos, adjuvantes de dispersão ou suspensão, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espessantes ou emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e semelhantes conforme adequado para a forma farmacêutica específica desejada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) divulga vários veículos utilizados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação 58 destas. Com excepção do caso de incompatibilidade de qualquer meio veiculo convencional com os compostos anticancerigenos da presente invenção, tal como por meio da revelação de qualquer efeito biológico ou outra interacção prejudicial com qualquer outro (s) componente (s) da composição farmacêutica, a sua utilização é contemplada como incluída no âmbito da presente invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem se limitarem a açúcares, tal como a lactose, glucose e sucrose, amidos tal como amido de milho e de batata; celulose e derivados tal como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanta em pó; malte, gelatina; talco; cremofor; solutol; excipientes tal como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de açafrão, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis tal como propilenoglicol; ésteres tal como oleato de etilo e laurato de etilo; agar; agentes de tamponamento tal como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água apirogénica; soro fisiológico isotónico; solução de Ringer; álcool etílico e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos, tal como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes desmoldantes, agentes de revestimento, adoçantes, aromatizantes e odoríferos, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordo com a opinião do responsável pela formulação.

Utilizações dos Compostos e Composições Farmacêuticas

Os compostos produzidos pelos métodos da presente invenção podem ser utilizados num método para a inibição do 59 crescimento do tumor e/ou metástese do tumor. É apresentado um método para o tratamento de cancros por meio da inibição do crescimento tumoral e/ou metástese tumoral para as células cancerígenas multirresistentes de tumor. 0 método envolve a administração de uma quantidade com eficácia terapêutica do composto ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável a um indivíduo (incluindo, sem se limitar a um ser humano ou animal) dele necessitado. Especificamente para o tratamento de cancros que incluem células cancerígenas multirresistentes, a quantidade com eficácia terapêutica é uma quantidade suficiente para matar ou inibir o crescimento de linhas de células cancerígenas multirresistentes. Os compostos podem ser úteis para o tratamento de tumores sólidos.

Os compostos e composições farmacêuticas preparados pelos métodos da presente invenção podem ser utilizados no tratamento e prevenção de qualquer doença ou condições, incluindo doenças proliferativas (por exemplo, cancro), doenças auto-imunes (por exemplo, artrite reumatóide) e infecções (por exemplo bacterianas, fúngicas, etc.) Os compostos e composições farmacêuticas podem ser administrados a animais, de preferência mamíferos (por exemplo animais domesticados, gatos, cães, ratinhos, ratos) e mais preferencialmente seres humanos. Pode ser empregue qualquer método de administração para distribuir o composto das composições farmacêuticas no animal. 0 composto ou composição farmacêutica pode ser administrado por via parentérica.

De acordo com os métodos de tratamento, as células tumorais são mortas ou o seu crescimento é inibido por meio de contacto das células tumorais com um composto ou composição tal como presentemente descrito. Deste modo, é descrito um 60 método de tratamento compreendendo a administração de uma quantidade com eficácia terapêutica de um composto ou composição farmacêutica compreendendo um composto, a um indivíduo necessitado deste, em quantidades e durante o tempo necessários para atingir o resultado desejado. Uma "quantidade com eficácia terapêutica" do composto da presente invenção ou composição farmacêutica consiste na quantidade eficaz para matar ou inibir o crescimento das células tumorais. Os compostos e composições preparados de acordo com o método da presente invenção podem ser administrados utilizando qualquer quantidade e qualquer via de administração eficaz para matar ou inibir o crescimento das células tumorais. Deste modo, a expressão "porção eficaz para matar ou inibir o crescimento de células tumorais" tal como presentemente utilizado, refere-se a uma quantidade suficiente de agente para matar ou inibir o crescimento das células tumorais. A quantidade exacta necessária varia de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade e estado geral do indivíduo, gravidade da infecção, agente anticancerígeno específico, modo de administração e aspectos semelhantes. Os compostos anticancerígenos da presente invenção são preferencialmente formulados em formas farmacêuticas unitárias para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A expressão "formas farmacêuticas unitárias" tal como presentemente utilizado refere-se a unidades fisicamente distintas do agente anticancerígeno apropriado para o paciente em tratamento. Subentende-se, contudo, que a utilização diária total dos compostos e composições da presente invenção será decidida pelo médico assistente no âmbito de uma avaliação médica consciente. O nível de dosagem com eficácia terapêutica específico para qualquer paciente particular ou organismo dependerá de uma série de factores, incluindo a 61 perturbação em tratamento e a gravidade dessa perturbação, a actividade do composto específico em utilização, a composição específica empregue, a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração e velocidade de excreção do composto específico empregue, a duração do tratamento, fármacos utilizados em combinação ou coincidência com o composto específico empregue e factores semelhantes, bem conhecidos em medicina. Além disso, após formulação com um veículo farmaceuticamente aceitável numa dosagem desejada, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas a seres humanos e outros animais por via oral, rectal, parentérica, intracistérnica, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como pós, unguentos ou gotas), bucal como spray oral ou nasal, ou vias semelhantes dependendo da gravidade da infecção em tratamento. Os compostos presentemente descritos podem ser formulados por meio da conjugação com quelantes hidrossolúveis ou polímeros hidrossolúveis, tal como polietilenoglicol como poli(ácido 1-glutâmico) ou poli(ácido 1-aspártico), como descrito na patente norte-americana 5,977,163, cujo conteúdo é incluído por referência. Nalgumas formas de realização, os compostos da presente invenção podem ser administrados por via oral ou parentérica a níveis de dosagem suficientes para libertar cerca de 0,001 mg/kg até cerca de 100 mg/kg, desde cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 50 mg/kg, de preferência desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 40 mg/kg, de preferência desde cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 30 mg/kg, desde cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg e mais preferivelmente desde cerca de 1 mg/kg até cerca de 25 mg/kg do peso corporal do indivíduo por dia, uma ou várias vezes ao dia, para se 62 obter o efeito terapêutico desejado. A dose desejada pode ser administrada dia sim, dia não, três em três dias, semanalmente, a cada quinze dias, a cada três semanas ou quatro semanas. Nalgumas formas de realização, a dose desejada pode ser administrada recorrendo a múltiplas administrações (por exemplo duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez administrações).

As formas farmacêuticas liquidas destinadas à administração oral incluem, sem se limitarem a emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Para além dos compostos activos, as formas farmacêuticas liquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na técnica, tal como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes tal como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butileno, dimetilformamida, óleos (particularmente óleo de semente de algodão, de amendoim, de milho, de germe, azeite, de castor e de sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido gordo de sorbitano e respectivas misturas. Para além de diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes, tal como humectantes, emulsionantes e agentes de suspensão, adiçantes, aromatizantes e agentes odoríferos.

As preparações para injecção, por exemplo suspensões injectáveis estéreis aquosas ou oleaginosas, podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida, utilizando agentes dispersantes ou humectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injectável estéril pode também ser uma solução, suspensão ou emulsão injectável estéril num diluente ou solvente parentericamente aceitável, não 63 tóxico, por exemplo uma solução de 1,3-butanediol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues encontram-se a água, solução de Ringer da farmacopeia norte-americana e solução de cloreto de sódio isotónica. Para além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregues como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim pode ser empregue qualquer óleo fixo suave, incluindo monoglicéridos ou diglicéridos sintéticos. Para além disso, os ácidos gordos tais como o ácido oleico são utilizados na preparação de injectáveis.

As formulações injectáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por meio de filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou incorporando agentes esterilizantes sob a forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas na água estéril ou outro meio injectável estéril antes da utilização. A fim de prolongar o efeito de um fármaco frequentemente é desejável tornar mais lenta a absorção do fármaco a partir da injecção subcutânea ou intramuscular. Este objectivo pode ser atingido recorrendo a uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca hidrossolubilidade. A velocidade de absorção do fármaco depende então da sua velocidade de dissolução, a qual, por sua vez, poderá depender do tamanho do cristal e forma cristalina. Em alternativa, uma absorção retardada de um fármaco administrado por via parentérica é atingida dissolvendo ou suspendendo o fármaco num veículo oleoso. As formas "depot" injectáveis são feitas formando matrizes de microencapsulamento do fármaco em polímeros biodegradáveis, tal como polilactídeo-poliglicólido. Dependendo da proporção de fármaco para polímero e da natureza do polímero específico empregue, a velocidade de libertação do 64 fármaco pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações injectáveis "depot" são também preparadas por meio de inclusão do fármaco em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.

As composições destinadas a administração rectal ou vaginal são preferencialmente supositórios que podem ser preparados misturando os compostos da presente invenção com excipientes ou veículos não irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou cera para supositórios, que são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos à temperatura corporal e, por conseguinte, fundem no recto ou cavidade vaginal e libertam o composto activo. estearato de magnésio,

As formas farmacêuticas sólidas destinadas a administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e granulados. Nestas formas farmacêuticas sólidas, o composto activo é misturado com pelo menos um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como citrato de sódio ou fosfato dicalcico e/ou a) agentes de carga ou de expansão, tal como amidos, lactose, sucrose, glucose, manitol e ácido silícico; b) aglutinantes tal como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrose e acácia; c) humectantes tal como glicerol; d) agentes desintegrantes tal como agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; e) agentes retardantes da solução tal como parafina; f) aceleradores da absorção tal como compostos de amónio quaternário; g) agentes molhantes tal como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; h) absorventes tal como caulino e bentonite e i) lubrificantes tal como talco, estearato de cálci8o, 65 polietilenoglicóis sólidos, laurilsulfato de sódio e respectivas misturas. No caso de cápsulas, comprimidos e pilulas, a forma farmacêutica pode ainda incluir agentes tampão.

Podem também ser empregues composições sólidas de um tipo semelhante como agentes de carga em cápsulas de gelatina rigida, utilizando excipientes tais como lactose, bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e semelhantes. As formas farmacêuticas sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pilulas e granulados podem ser preparadas com revestimentos e coberturas tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica da formulação farmacêutica. Podem, opcionalmente, conter agentes opacificantes e podem ainda ter uma composição tal que libertem os ingrediente(s) activo(s) apenas ou preferencialmente numa determinada parte do tracto intestinal, opcionalmente de forma retardada. Exemplos de composições envolventes que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Podem também ser empregues composições sólidas de um tipo semelhante como agentes de carga em cápsulas de gelatina rigida, utilizando excipientes tais como lactose, bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e semelhantes.

Os compostos activos podem também encontrar-se em forma microencapsulada, com um ou mais excipientee como anteriormente indicado. As formas farmacêuticas sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pilulas e granulados podem ser preparadas com revestimentos e coberturas tais como revestimentos entéricos, revestimentos de controlo da libertação e outros revestimentos bem conhecidos na técnica da formulação farmacêutica. Nestas formas farmacêuticas sólidas, o compostos activo pode ser misturado com pelo 66 menos um diluente inerte, tal como sucrose, lactose ou amido. Estas formas farmacêuticas incluem também, como é prática corrente, substâncias adicionais diferentes dos diluentes inertes, por exemplo lubrificantes de prensagem e outros adjuvantes de prensagem, tal como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma farmacêutica pode ainda incluir agentes tampão. Podem, opcionalmente, conter agentes opacificantes e podem ainda ter uma composição tal que libertem os ingrediente(s) activo(s) apenas ou preferencialmente numa determinada parte do tracto intestinal, opcionalmente de forma retardada. Exemplos de composições envolventes que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras.

As formas farmacêuticas destinadas a administração tópica ou transdérmica de um composto da presente invenção incluem unguentos, pastas, remes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inaladores ou pensos. 0 componente activo é misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões eventualmente necessários. São também contemplados no âmbito da presente invenção a formulação oftálmica, gotas para os ouvidos e para os olhos. Adicionalmente, a presente invenção contempla a utilização de pensos transdérmicos, que têm a vantagem adicional de proporcionar uma libertação controlada de um composto no corpo. Estas formas farmacêuticas podem ser preparadas dissolvendo ou aplicando o composto num meio adequado. Os intensificadores de absorção podem também ser utilizados para aumentar o fluxo do composto por toda a pele. A velocidade pode ser controlada, seja proporcionando uma membrana controladora 67 da velocidade ou dispersando o composto numa matriz de polímero ou gel.

Como anteriormente discutido, os compostos preparados segundo os métodos da presente invenção são úteis como agentes anticancerígenos e podem, assim, ser úteis no tratamento do cancro, provocando a morte da célula tumoral o inibindo o crescimento das células tumorais. Em geral, os agentes anticancerígenos são úteis no tratamento de cancros e outras perturbações proliferativas, incluindo, sem se limitar a cancro da mama, cancro do cérebro, cancro da pele, cancro cervical, cancro do cólon e do recto, leucemia, cancro pulmonar, melanoma, mieloma múltiplo, linfoma não Hodgkin, cancro do ovário, cancro pancreático, cancro da próstata e cancro gástrico, apenas para apontar alguns. Em determinadas formas de realização, os agentes anticancerígenos são activos contra células leucémicas e células de melanoma, sendo assim úteis para o tratamento de leucemias (por exemplo leucemias mielóide, linfocítica, promielocítica, mielocítica e linfoblástica, seja nas formas aguda ou crónica) e melanomas malignos. Os agentes anticancerígenos da presente invenção são activos contra tumores sólidos e também matam e/ou inibem o crescimento de células multirresistentes (células MDR). Os agentes anticancerígenos da presente invenção são activos contra cancros que são resistentes a outros agentes antineoplásicos conhecidos ou que se verificou não responderem clinicamente a outros agentes antineoplásicos conhecidos. Os agentes anticancerígenos da presente invenção são activos contra cancros que são resistentes a outros agentes estabilizantes dos microtúbulos, antineoplásicos (por exemplo paclitaxel). Será também evidente que os compostos e composições farmacêuticas 68 preparados pelos métodos da presente invenção podem ser empregues em terapias combinadas, quer dizer, os compostos e composições farmacêuticas podem ser administrados concorrentemente com, antes de ou após uma ou mais do que uma terapia desejada ou procedimento médico. A combinação particular de terapias (métodos terapêuticos ou procedimentos) a aplicar num regime combinado levará em conta a compatibilidade do método terapêutico e/ou procedimento desejado e o desejado efeito terapêutico a ser atingido. Será também evidente que as terapias empregues podem atingir um efeito desejado para a mesma perturbação (por exemplo, um composto pode ser administrado em simultâneo com outro agente anticancerígeno) ou podem atingir diferentes efeitos (por exemplo, controlo de quaisquer efeitos adversos).

Por exemplo, outras terapias ou agentes anticancerigenos que poderão ser utilizados em combinação com os agentes anticancerigenos incluem cirurgia, radioterapia (apenas alguns exemplos são radiação γ, radioterapia por feixe de neutrões, radioterapia por feixe de electrões, terapia com protões, braquiterapia e isótopos radioactivos sistémicos apenas para apontar alguns), terapia endócrina, modificadores da resposta biológica (interferões, interleuquinas e factor da necrose do tumor (TNF) para apontar alguns), hipertermia e crioterapia, agentes para atenuar qualquer efeito adverso (por exemplo, antieméticos)e outros fármacos para quimiterapia aprovados, incluindo, mas sem se limitar a fármacos alquilantes (mecloretamina, clorambucil, Ciclofosfamida, Melfalan, Ifosfamida), antimetabolitos (Metotrexate), antagonistas da purina e antagonistas da pirimidina (6-Mercaptopurina, 5-Fluorouracil, Citarabile, Gemcitabina), venenos antifuso 69 (Vinblastina, Vincristina, Vinorelbina, Paclitaxel, Docetaxel), podofilotoxinas (Etoposida, Irinotecan, Topotecan), antibióticos (Doxorubicina, Bleomicina, Mitomicina), nitrosoureias (Carmustina, Lomustina), iões inorgânicos (Cisplatina, Carboplatina), enzimas (Asparaginase) e hormonas (Tamoxifen, Leuprolide, Flutamidee e Megestrol), para apontar alguns. Para uma discussão mais abrangente sobre terapias contra o cancro actualizadas consultar em http: //www,nci.nih.gov/, uma lista de fármacos oncológicos aprovados em http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm, e The Merck Manual, 17a Ed. 1999, cujos conteúdos são incluídos na integra por referência.

Existe ainda descrito um conjunto ou módulo farmacêutico, incluindo um ou mais do que um recipiente cheio com um ou mais do que um dos ingredientes das composições farmacêuticas e que pode incluir agentes terapêuticos aprovados adicionais para utilização como terapia combinada. Opcionalmente associado a este recipiente(s) pode encontrar-se um aviso no formato recomendado por uma agência governamental reguladora do fabrico, utilização ou venda de produtos farmacêuticos, aviso esse que reflecte a aprovação pela a agência de fabrico, utilização ou venda para administração em seres humanos.

EQUIVALENTES

Os exemplos representativos que se seguem destinam-se a ajudar a ilustrar a presente invenção e não se pretende que sejam encarados como limitadores do âmbito da presente invenção. De facto, várias modificações da presente invenção e muitas outras formas de realização desta, para além das apresentadas e descritas no presente documento, serão evidentes aos peritos na especialidade a partir do 70 conteúdo integral do presente documento, incluindo os exemplos que se seguem e referências à literatura cientifica e de patentes citada. Deverá ser ainda evidente que os conteúdos das referências citadas são incluídos por referência, para ajudar a ilustrar o estado da técnica. Os exemplos seguintes contêm informação adicional importante, exemplificações e orientações que podem ser adaptadas à prática da presente invenção nas várias formas de realização e respectivos equivalentes.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Síntese de 9,10-de-hidro-12,13-desoxi-epotilonas

Este exemplo descreve a síntese de trans-9,10-de-hidro- 12.13- desoxiepotilona B, 26-trifluoro-trans-9,10- de-hidro- 12.13- desoxiepotilona B, 26-trifluoro-12,13-desoxiepotilona B e 12,13-desoxiepotilona B e ensaios biológicos destes compostos.

Foram preparados derivados fluorados de epotilonas e foram analisados dados os índices farmacocinéticos e quimioterapêuticos mais altos de outros agentes medicinais com substituições de flúor (Ojima, I.; Inoue, T.; Chakravarty, S.; J. Fluorine Chem. 1999, 97; Newman, R. A.; Yang, J.; Finlay, M. R. V.; Cabral, F., Vourloumis, D.; Stephens, L. C.; Troncoso, P.; Wu, X.; Logothetis, C. J.; Nicolaou, K. C.; Navone, N. M. Câncer Chemother. Pharmacol. 2001, 48, 319-326; cada um incluído por referência).

1 [16]dEpoB 2 26-F3-[16]dEpoB 71

Para atingir o composto 2, procurámos tirar partido de uma via muito convergente, recentemente descrita a partir do nosso laboratório, para a síntese da epotilona 490 (6' de-hidrodeoxi Epo B) no sentido de dEpoB (1, esquema 3) (Biswas, K.; Lin, H.; Njardarson, J. T.; Chappell, M.D., Chou, T.C., Guan, Y.; Tong, W. P., He, L.; Horwitz, S.B., Danishefsky, S.J. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124 (33); 9825— 9832; Rivkin, A.; Njardarson, J. T.; Biswas, K; Chou, T.C.; Danishefsky, S. J. J. Org. Chem. 2002, 67, 7737-7740; cada um incluído por referência). Nessa síntese introduzimos um grupo vinilo de flanco no composto 4 por uma acoplagem de Stille estereoespecífica de um precursor de iodeto de vinilo 3 com tri-n-butilvinilestanano. Metátese de fecho do anel, seguida de desprotecção conduziu a 6, que foi depois transformado em dEpoB (1) através de uma redução diimida selectiva da região.

Esquema 3 Síntese de epotilona 490

>3R = I S 4 R = vinilo

6 dEpoB (1) A atenção foi primeiro orientada para a síntese de 15 (esquema 4). Alquilação do enolato de lítio inicialmente descrito de 7 (Chappell, M. D.; Stachel, S. J.; Lee, C. B.; 72

Danishefsky, S.J. Org. Lett. 2000, 2(11)' 1633-1636; incluído por referência) com iodeto δ (sintetizado a partir do álcool 16 conhecido, utilizando TMSI cloreto de metileno) rendeu 9 com 78% de rendimento e elevada diastereo-selectividadel (>25:1 de) . 0 composto 9 foi avançado em três etapas até 10 como se mostra. As tentativas de conseguir a adição de brometo de metilmagnésio à acoplagem da amida de Weinreb de 10 falharam. A falha desta reacção foi atribuída à presença do acoplamento iodoalceno. No entanto, poderíamos atingir o nosso objectivo alterando a ordem destas duas fases de formação da ligação C-C. Assim, a reacção de 10 com viniltributilestanho em condições de Stille poderia ser seguida da adição de reagente de Grignard metilo para se obter a cetona 11 desejada. A condensação da cetona 11 com óxido de fosfina 12, seguida da desprotecção do éter trietilsilílico, rendeu o fragmento 13 com bom rendimento. A esterificação do 13 resultante com o fragmento ácido CICIO (Biswas, K.; Lin, H.; Njardarson, J. T.; Chappell' M.D., Chou, T.C., Guan, Y.; Tong, W. P., He' L.; Horwitz, S. B., Danishefsky, S.J. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124 (33); 9825-9832; Rivkin, A.; Njardarson, J. T.; Biswas, K; Chou, T. C.; Danishefsky, S. J. J. Org. Chem. 2002, 67, 7737-7740; incluídos por referência), forneceu o 15 desejado com 75% de rendimento (esquema 4). 73

(a) LHMDS, -78 °C, 78%; (b) i) H0Ac:THF:H20 (3:1:1); ii) CH3ONHCH3, AIMe3; iii) TESC1, imidazol, DMF, 79% global; (c) I) viniltributilestanho, Pd(dba), DMF, 80 °C, 3h 43%; II) MeMgBr, 0 °C, 94%; (d) I) n-BuLI, THF, -78 °C, 30 min., ii) 12, -78 °C à ta, 81%; iii) H0Ac:THF:H20 (3:1:1), 94%; (e) TMSI, CH2CI2, 0 °C, 92%

Infelizmente, as tentativas de efectuar a reacção de metátese de fecho do anel de 15, utilizando o catalisador de Grubbs de segunda geração (artigos: Grubbs, R. H.;

Miller, S. J.; Fu, G. C. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446;

Trnka, T. M.; Grubbs, R. H. Acc. Chem. Res. 2001, 34, 18; Alkene Metathesis in Organic Chemistry Ed. : Furstner, A.; Springer, Berlin, 1998; Furstner, A. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000, 39, 3012; Schrock, R. R. Top. Organomet. Chem. 1998, 1, 1; cada incluído por referência) em cloreto de metileno conduziu em primeiro lugar à aparente dimerização 74 do material de partida (equação 1) . Dado o facto de o RCM trabalhar bastante bem no contexto relacionado de 5->6, naturalmente atribuímos a falha no caso 15 à presença do grupo trifluorometilo em C12. 74

(1)

Conjecturou-se que o impacto negativo do substituinte 26-trifluoro residente na reacção desejada pode ser atenuado por meio da adição de um espaçador carbono entre o centro da reacção RCM e o grupo trifluorometilo. Assim, efectuámos uma síntese de 19 (equação 2) por metátese de fecho do anel de 18, que iria apresentar o grupo trifluorometilo no contexto de um anel de 17 membros contendo um (l,4)-dieno expedido.

(2) 0 programa de síntese orientado para 19 foi iniciado com a preparação do composto 21, o qual corresponde ao sector 0-alquilo do nosso substrato proposto (esquema 5). Iniciámos a alilação de 10, desta vez sob condições de reacção do radical como se mostra (Keck, a E.; Yates, J. B. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 5829; artigo: Curran, D. P. Synthesis 1988, Parte 1, pp 417-439; Parte 2, pp. 489; cada incluído por referência) . Esta conversão foi seguida da reacção do 75 produto alquilado com brometo de metilmagnésio, fornecendo assim a cetona 20 necessária. A condensação deste composto com óxido de fosfina 12, seguida da desprotecção da função éter trietilsililico, proporcionou 21 com bom rendimento.

Esquema 5 Síntese do fragmento álcool 21

(a) I) Aliltributilestanho, AIBN, benzeno, 80 °C, 3h 74%; ii) MeMgBr, 0 °C, 93%; (b) i) 12, n-BuLi, THF, -78 °C, 30 min, ii) 20, -78 °C à ta, 85%; iii) H0Ac:THF:H20 (3:1:1), 98%; (C) TMSI, CH2C12, 0 °C, 92% A esterificação de 21 com o fragmento ácido C1-C10 14 proporcionou o precursor RCM proposto 18 com 75% de rendimento (esquema 6) . Felizmente, neste caso, foi possível concluir a reacção de metátese de fecho do anel de 18 utilizando o catalisador de Grubbs de segunda geração em cloreto de metileno. Tal como no caso da conversão ou da reacção, proporcionou exclusivamente o isómero trans 22 com 57% de rendimento.êFinalmente, clivagem redutiva do gruop de protecção tricloro etoxicarbonilo com zinco e ácido acético, seguida de desprotecção do éter TES com HF-piridina, proporcionou o 19 desejado contendo uma função trifluorometilo me C22, embora no contexto da série do anel de 17 membros.

Esquema 6 Síntese de 27-F3-ddEpoB (19) 76

MesN CH2CI2 (0.002M) 57%

19R=CF3 22 23R = Me (sintetizado anteriormente) 19 sintético foi avaliado quanto à sua actividade citotóxica. Como se mostra no quadro 1-1 seguinda, a comapração directa do [17]ddEpoB (23) anteriormente descrito com 27-F3-[17]ddEpoB (19) indicou que o novo composto perfluorado possuía uma potência citotóxica comparativamente elevada.

Quadro 1-1. Citotoxicidades in vitro (IC50) com linhas de células tumorais3

Composto CCRF-CEM (IC50 (μΜ) a) CCRF-CEM/VBL (IC50 (μΜ) a) 27-F3-ddEpoB (19) 0,068 0,191 [ 17]ddEpoB (23) 0,040 0,126 [16]ddEpoB 0,020 0,068 (6) 77 aAnálise XTT na sequência de inibição 72 h. CCRF-CEM é uma linha de células de leucemia linfoblástica das células T humanas. As linhas de células CCRF-CEM/VBlioo, CCRF-CEM/VMi e CCRF-CEM/Taxoi sobreexpressam todas a glicoproteina P e apresentam um fenotipo de multirresistência em oncoliticos associados a MDR (Ojima, I.; Inoue, T.; Chakravarty, S.; J.

Fluorine Chem. 1999,drug'Newman, R. A.; Yang, J.; Finlay, M. R. V.; Cabral, F., Vourloumis, D.; Stephens, L. C.; Troncoso, P.; Wu, X.;

Logothetis, C. J.; Nicolaou, K. C.; Navone, N. M. Câncer Chemother. Pharmacol. 2001, 48, 319-326; cada incluído por referência).

Embora a substituição isotérica do trifluorometilo tenha tido pouco efeito na actividade citotóxica geral, os dados preliminares dos estudos da degradação emtabólica em plasma de ratinho revelaram que 19 é nitidamente mais estável do que o 23 progenitor. A exposição de 19 e 23 a ratinhos nude e plasma humano conduziu a uma degradação do 23 no espaço de 30 minutos, enquanto a epotilona 19 se mantinha intacta na sua maior parte. Uma vez que as questões farmacocinéticas serão, muito provavelmente, críticas na aplicação de facto de qualquer agente epotilona como fármaco, consideramos esta descoberta como sendo bastante encoraj ante. A síntese de 26-F3-dEpoB (2) pode ser conseguida por meio de uma estratégia muito convergente, relacionada com a estratégia empregue na síntese de 26-F3-[17]ddEpoB (19). Assim, fragmentos de complexidade semelhante serviriam como 78 blocos chave (esquema 7) . Previmos que o sector acilo 25 poderia servir como domínio polipropionato e o sector alquilo 21 ou 24 seria preparado como anteriormente descrito na introdução. A união de dois fragmentos 21 (24) e 25 seria iniciada por uma esterificação e consumada por meio de uma metátese de fecho do anel subsequente.

Finalmente, a clivagem dos grupos de protecção forneceria os análogos desejados 28 e 29. A redução quimiosselectiva da olefina-9,10 de 28 e 29 forneceria dEpoB (1) e o 26-F3-12,13-desoxiEpoB (2).

Esquema 7

trans-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB (28) 12,13- desoxiEpoB (1) 26-F3~trans-9,10-de-hidro-12,13-desoxiEpoB (29) 26-F3- 12,13-desoxiEpoB (2) A síntese de 1 e 2 teve início com a preparação do sector acilo 25. A cetona 30, anteriormente descrita, foi sujeita a uma reacção aldol com o aldeído 31 disponível. Depois da desprotonação e reacção do "lítio" 30 com 31, uma condensação suave deu origem a uma mistura 5,3:1 de produtos aldol 32 e 33. O principal diastereómero 32 foi facilmente separado por meio de cromatografia flash e 79 protegido como um éter silílico TBS. A hidrólise do grupo acetal diisopropilo sob catálise ácida deu origem a aldeído ceto 34, estabelecendo as condições para a segunda reacção aldol. Na sequência do método anteriormente praticado éster terc-butílico "titano" com o novo aldeído 34 como par de acoplagem, o produto de aldol desejado 35 foi obtido com elevada diastereo-selectividade (dr >20:1) e rendimento (86%). A protecção do álcool C3 de 35 com grupo sililo TES foi seguida da desprotecção do éter benzílico. A oxidação do hidroxilo primário resultante proporcionou o aldeído correspondente, que foi depois convertido numa olefina terminal por meio da reacção de Wittig, para fornecer 36 com elevado rendimento. Finalmante, a hidrólise do éster terc-butílico de 36 com TESOTf forneceu o sector acilo 25 (82%) em conjunto com um produto secundário 37 (14%), que foi convertido no sector acilo 38 com elevado rendimento. As propriedades espectrais e cromatográficas de 38 foram idênticas ao material anteriormente obtido a partir de outros programas nos laboratórios do Dr. Sinha (Scripps) .

Esquema 8 80 APt APr

APri )APi OBn- 32

>H H-l

OH OBn A Pr V^OBn (5.3; 1) 33 íTBS O OH O OTBS 'V^OBnABuCT^xYY^OBn 32 34 35

33

Reagentes e condições: (a) LDA, THF, -90 °C, 79%; (b) (i) TBSOTf, 2,6-lutidina CH2C12, -40 a -20 °C, 97%, (II) 2) p-TsOH*H20 (cat.)THF-H20 (4:1), 64 °C, 86%; (c) acetato de t- butilo, LDA, complexo quiral-Ti, Et20, —78 °C. 92%, (dr = >20:1); (d) (i)TESCl, imidazol, DMF, 0 °C à ta, 99%, (ii) H2, Pd/C (10%), EtOH, 83%, (iii) TPAP, NMO, CH2C12 , 93%, (iv) MePPh3I, n-BuLl, THF, -78 a -5 °C, 78%; (e) TESOTf, 2,6-lutidina, CH2C12, 0 °C à ta 82%; (f) (i) TBSOTf, 2,6- lutidina, CH2C12, 0 °C à ta, (ii) sat. NaHC03 (aq.), MeOH, THF, ta, 99%. A esterificação dos álcoois alilicos 21 e 24 com o fragmento ácido C1-C9 25 forneceu os precursores de ciclização RCN 26 e 27, respectivamente (esquema 9).

Esquema 9 81

21 (R'=Me, R2=H), 24 (R1=CFa R2»H), 53 (R'=Me, R2=OTBS)

, 39a(R1=Ma, R2 = H, 38%), 39b(R1=Me, R2 = H. 62%) T^F (ίϊ)3’ 1 403 <*1=0Ρ3· r2 = H·22%)- «·» (R1 =CF3. R2 = H, 60%) 0'C to rt ' 55 (Rl=Me, R2 = OTBS, 27%), 56 (R1=Me, R2 = OTBS, 57%) R1 = Me. R2 = H, (2ft 79%) R1 = CFj, R2 = H (27,70%) R1 = Me. R2 = OTBS (54, 92% do éster )

R1 = Me, R2 = H, (28, 77%) R1 = Me, Rz = H (1,60% + recuperação do material de partida em 36%) R1 = CF3, R2 = H (29, 79%) R1 - CFa, R2 = H (2, 37% +recuperação do material de partida em 60%) R1 = Me, R2 = OH (57, 77%)

As reacções de metátese de fecho do anel 26, 27 e 54 foram então efectuadas utilizando o catalisador de Grubbs de segunda geração em tolueno, o que proporcionou, tal como no nosso estudo anterior, exclusivamente o isómero trans 39a, 40a e 55 juntamente com os produtos secundários correspondentes 39b, 40b e 56. Finalmente, a desprotecção dos éteres sililicos com piridina HF conduziram aos compostos desejados 28, 29 e 57. As propriedades espectrais e cromatográficas de 28 não foram idênticas ao material anteriormente obtido a partir do programa epotilona nos laboratórios do Dr. James D. White (Universidade do Estado do Oregon). O Dr. James D. White pensou ter sintetizado 28, no entanto, fez inadvertidamente o isómero 12,13E 41, o que 82 explicaria a fraca actividade biológica observada. Consequentemente, somos os primeiros a ter sintetizado 28 e analisado a actividade antitumor deste composto. 28, 29 e 2 totalmente sintéticos foram avaliados numa variedade de tipos de células para determinar o seu potencial antitumor. Como se revela no quadro 1-2, todos os três compostos exibiam elevada actividade cititóxica contra uma variedade de linhas de células tumorais sensíveis e multirresistentes. Uma comparação directa de 28 com o dEpoB (1) anteriormente descrito indica que o novo composto possui quase três vezes mais potência.

Quadro 1-2. Citotoxicidades in vitro (IC50) com linhas de células tumorais3

Linhas de células tumorais IC50 (μΜ)a 28 29 dEpoB (1) 57 CCRF-CEM 0,0014 0,0035 0,0036 0,00051 CCRF- CEM/VBLioo 0,0065 0,0210 0,014 0,0106 CCRF- CEM/Taxol 0,00177 0,0057 0,0057 0,00073 aAnálise XTT na sequência de inibição 72 h. CCRF-CEM é uma linha de células de leucemia linfoblástica das células T humanas. As linhas de células CCRF-CEM/vblioo/ CCRF-CEM/Vmi e CCRF-CEM/Taxoi sobreexpressam todas a glicoproteína P e apresentam um fenotipo de multirresistência em oncolíticos associados a MDR ((Prie, a; Thibonnet, J.; Abarbri, M.; 83

Duchene, A.; Parrain, J. Synlett 1998, 839, incluídos por referência).

Para melhorar o rendimento geral da nossa síntese de 28, 29 e 2, decidimos realizar a reacção RCM na ausência da olefina substituída por tiazol, evitando assim a formação dos produtos secundários indesejados 39b e 40b. A desproteccão do éter silílico do 42 e 20 anteriormente vinilo

descrito produziu as hidroxicetonas 43 e 44. A esterificação das hidroxicetonas 43 e 44 resultantes com o fragmento ácido C1-C9 25 forneceu os precursores de ciclizaçâo RCN 45 e 46, respectivamente (esquema 10) . A reacção de metátese de fecho do anel de 45 e 46 foi depois realizada utilizando o catalisador de Grubbs de segunda geração em tolueno, o que produziu, tal como no nosso estudo anterior, exclusivamente o transisómero 47 e 48 com elevados rendimentos. A instalação da fracção tiazol produziu 39a, 40a e 55 com elevado rendimento. A desprotecção dos dois éteres silílicos com piridina HF conduziu a 28 e 29. Finalmente, a redução selectiva da olefina-C9-C10 rendeu as epotilonas 1 e 2 correspondentes. A estrutura de 28 foi corroborada rigorosamente pela sua conversão em 1 com elevado rendimento. A síntese total de 1 foi simplificada muito substancialmente relativamente à vias anteriormente praticadas. Deste modo, a utilização de 31 facilmente disponível, obtido a partir do conjunto quiral é, decerto, um grnde progresso relativamente à dependência do (S)-2-metil-4-pentenal, cuja síntese exige a intervenção de auxiliares quirais. 84

42, R = Ma 20, R = CF, 43. R = Me. 83% 44, RSCF5,78%

45, R = Me, 81% 46, R = CFg, 88% 47, R= Me, 78% 48, R= CF3,71%

Na posse do composto 28 de estrutura rigorosamente comprovada, ficámos surpreendidos por descobrir que as suas propriedades espectrais não coincidiam com as anteriormente descritas para um composto supostamente da mesma entidade. No entanto, é evidente, em retrospectiva, que 28 não tinha sido anteriormente preparado e, de facto, toda a família de (E)-9,10-de-hidro-epotilonas presentemente descrita é uma nova classe de compostos. O exame dos análogos sintéticos (2, 28 e 29) em cultura de células revelou efeitos inibidores mais fortes em várias linhas de células tumorais sensíveis e MDR do que os exibidos pelo nosso dEpoB (1) clínico (quadro 1-3). Sublinhamos que Epo 3 (28) é o primeiro composto de 12,13- 85 desoxiepotilona a possuir uma citotoxicidade substancialmente melhorada em relação à do dEpoB (1).

Quadro 1-3. Citotoxicidades in vitro (IC50) com linhas de células tumorais3

Composto CCRF-CEM (C) (μΜ) C/VBLioo (μΜ) C/Taxol (μΜ) Epo 1 (1, dEpoB) 0,0036 0,016 0,0046 Epo 2 (2) 0,0041 0,080 0,018 Epo 3 (28) 0,0009 0,0042 0,0012 Epo 4 (29) 0,0035 0,0210 0,0057 aAnálise XTT na sequência de inibição 72 h. CCRF-CEM é uma linha de células de leucemia linfoblástica das células T humanas. A linha de células CCRF-CEM/VBLioo é resistente à vinblastina e a CCRF-CEM/Taxol é resistente ao taxol. A impressionante inibição do crescimento celular exibido pelas epotilonas 2, 28 e 29 (Epo 2-4) em toda a gama de diferentes tumores resistentes aos fármacos levou à determinação da estabilidade no plasma sanguíneo destes novos congéneres (E)-9,10. Por exemplo, o (E)-10,11-de-hidro-EpoB (do caso 1 com um grupo CH3 em C-12) exibe uma estabilidade no plasma muito fraca no que respeita à abertura lactona. Esta instabilidade no plasma é que tem dificultado o progresso de (E)-10,11-de-hidro-EpoB. Em contraste, no caso da exposição de 2, 28 e 29 (Epo 2-4) ao plasma de murino, observá-mos uma degradação muito mais lenta do fármaco em comparação com dEpoB (1) num factor de sete. Esta estabilidade constitui um avanço substancial da 86 perspectiva da disponibilidade do fármaco relativamente a dEpoB (ver figura 9) . A combinação dos dados da citotoxicidade e estabilidade no plasma encorajou-nos a sintetizar quantidades substanciais de 28 (Epo 3) para determinar a sua eficácia in vivo, em ratinhos nude com xenoenxertos de tumor humano. A epotilona 28 (Epo 3) demonstrou uma potência marcadamente melhor na inibição do crescimento de tumores implantados, relativamente a dEpoB (ver figura 10) . A potência aperfeiçoda e estabilidade no plasma permite uma redução muito substancial da dose de fármaco (uma ordem de grandeza) no contexto dos xenoenxertos de 28 (Epo 3) .

Os nossos estudos preliminares constatámos que a epotilona B, devido ao epóxido 12,13, é significativamente mais citotóxica do que o seu análogo 12,13-desoxi (dEpoB). No entanto, da perspectiva do índice terapêutico, o composto desoxi pareceu-nos muito mais promissor. Mais recentemente, descrevemos a síntese total de (E)-9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B (28) utilizando um anel uma metátese de fecho do anel estereo-selectiva. Revelámos que a incorporação da insaturação E-9,10 no contexto da olefina Z-12,13 habitual (ver composto 1) resulta num grande aumento da potência in vitro. Além disso, este aspecto pode ser traduzido para um contexto in vivo, em ratinhos com xenoenxertos. Além disso, o composto 28 possui maiores vantagens farmacêuticas, relativametne ao dEpoB (1) . Este facto permitiu a redução dos níveis de dosagem de 28 relativamente a 1 em experiências com xenoenxertos numa ordem de grnadeza.

Assim, questionámo-nos sobre a possibilidade de a incorporação de olefina C9-C10 na epotilona B (51, EpoB) alterar o seu perfil biológico no mesmo sentido. 87

dEpoB (1) (E)-9,10-de-hidro-dEpoB (28) EpoB (51) (E)-9,10-de-hidroEpoB (49) A epoxidação de 28 com 2,2'-dimetidioxirano (DMDO) progrediu com elevada quimio-selectividade na olefina C12-C13 mais substituída para se obter 87% de rendimento de uma proporção de 1:2,6 da (E)-9,10-de-hidro-epotilona B (49) e respectivo diastereómero (50). A estereoquímica dos epóxidos foi determinada pela redução diimida selectiva das ligações duplas C9-C10. Um exame das propriedades espectrais destes produtos revelou que o produto menor (49) era dEpoB. A preferência pela α-epoxidação no caso de 28 contrasta fortemente com a epoxidação muito estereo-selectiva de dEpoB, o que ocorre a partir da face β conduzindo a EpoB Meng, D.; Bertinato, P.; Balog, A.; Su, D.-S.; Kamenecka, T.; Sorensen, E. J.; Danishefsky, S. J. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 10073; incluído por referência).

Esquema 11 88

A (E)-9,10-de-hidroepotilona B (51) foi avaliada numa variedade de tipos de células para determinar o seu potencial antitumor. Como se revela no quadro 1-4, a (E)-9,10-de-hidroepotilona B (49) exibe elevada actividade cititóxica contra uma variedade de linhas de células tumorais sensíveis e multirresistentes. Uma comparação directa de 49 e EpoB (51) indica que este novo análogo possui quase 3 vezes mais potência do que a EpoB (51), tornando-o um dos mais potentes análogos da epotilona registados até à data. Curiosamente, a série a-epóxido (50, 52) revelou uma actividade muito inferior à EpoB (51) . O gráfico seguinte mostra as conclusões para estudos in vivo do composto 49.

Quadro 1-4. Citotoxicidades in vitro (IC5o) com linhas de células tumoraisa 89

Composto CCRF-CEM CCRF- CEM/VBL CCRF-CEM/Taxol 1 (dEpoB) 0,0036 0,016 0,0046 28 0,0009 0,0042 0,0012 51 (EpoB) 0,00062 0,0037 0,0011 49 0,00023 0,00032 0,00042 50 0,0134 0,0959 0,0802 52 0, 083 0,4519 0,1507 aAnálise XTT na sequência de inibição 72 h. CCRF-CEM é uma linha de células de leucemia linfoblástica das células T humanas. As linhas de células CCRF-CEM/VBL e CCRF-CEM/Taxoi sobreexpressam todas a glicoproteína P e apresentam um fenotipo de multirresistência em oncolíticos associados a MDR.

Efeito terapêutico de 9,10-de-hidro-EpoB em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1 (perfusão iv durante 6 horas, n=4) 90

Em resumo, foi delineado anteriormente uma sintese total estereo-selectiva potente de 28 (Epo 3) e, após redução diimida selectiva do sitio, a própria dEpoB (1) . A estratégia descrita foi então aplicada directamente na preparação dos análogos trifluoro 2 e 29 (Epo 4) correspondentes. Além disso, a epoxidação de 28 forneceu 49 e 50, o que, após redução diimida selectiva do sitio, produziu epotilona B (51) e 52. Os dados registados anteriormente apontam para a emergência de uma nova família muito promissora de fármacos anticancerígenos, apropriados para avaliação mais detalhada no caminho para o avanço possível no sentido de um contexto clínico humano. Além disso, a nova estratégia de síntese inclui um aperfeiçoamento significativamente prático na síntese total de dEpoB e epotilona B.

Experiências Métodos gerais: Foram utilizados reagentes obtidos junto de fornecedores comerciais sem submeter a purificação 91 adicional excepto quando indicado em contrário. Os solventes seguintes foram obtidos a partir de um sistema de solvente seco (passado através de uma coluna de alumina previametne cheia) e foram utilizados sem secagem adicional: tetra-hidrofurano, cloreto de metileno, éter dietilico, benzeno e tolueno. Todas as reacções sensíveis ao ar e água foram executadas em vidraria seca à chama, sob uma pressão positiva de gás de árgon pré-purificado. Foram registados os espectros de NMR (1H e 13C) em Bruker AMX-400 MHz ou Bruker Advance DRX-500 MHz como indicado individualmente, referenciado em relação a CDC13 (7.27 ppm para 1H e 77,0 ppm para 13C) . Foram obtidos espectros infravermelhos (IR) num espectrómetro Perkin-Elmer FT-IR, modelo 1600. As rotações ópticas foram obtidas num polarímetro digital JASCO, modelo DIP-370, a 22 ± 2 °C. Foi executada cromatografia em camada fina analítica em placas gel de sílica E. Merck 60 F254 . Os compostos que não eram activos aos UV foram visualizados por meio de imersão das placas em molibdato de amónio cérico ou solução de para-anisaldeído e aquecimento. Foi executada cromatografia em gel de sílica, utilizando o solvente indicado em Davisil® (nível 1740, tipo 60A, 170-400 mesh).

Acrónimos e abreviaturas TES, trietilsililo; TBS, dimetiltertbutilsililo; EDCI, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; HF-PY, fluoreto hidrogénio em piridina; DMAP, 4-Jí,íí-dimetilaminopiridina; DCM, diclorometano; DMF, N,N-dimetilformamida; THF, tetra-hidrofurano .

92

Composto 32: A uma solução de LDA preparado de fresco (11,6 mmol) em THF (25 mmol) adicionou-se gota a gota uma solução de cetona 30 (2,40 g, 10,4 mmol) em THF (6,8 mL) a -78 °C. Após agitação a -40 °C durante 0,5, a mistura foi arrefecida a -90 °C. Foi adicionada gota a gota uma solução de aldeído 31 (1,38 g, 7,72 mmol) em THF (6,8 mL) . Após

agitação a -90 °C durante 35 min, a reacção foi temperada com NH4C1 sat. aq. (15 mL) e extraída com EtOAc (50 mL x 3) . Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre Na2S04 e concentrados. Purificação por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 15:1 a 12:1) produziu 32 (2,09 g, 66%) e isómero 33 (0,39 g, 12%), ambos sob a forma de óleos amarelos. 32: [a]D25 13,1 (c 1,22, CHCI3); IR (película) v 3494, 2972, 2932, 1708, 1454, 1380, 1329, 1120, 1038, 998, 734 cm-1; 3H NMR (400 MHz, CDC13) . 8 0, 98 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,06 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,10 (3H, d, J= 6,1 Hz), 1,14 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,15 (3H, s), 1,17 (3H, d, J= 6,2 Hz), 1,18 (3H, s), 1,20 (3H, d, J= 6,2

Hz), 1,81-1,92 (1H, m) , 3,33 (1H, qd, J= 7,0, 2,2, Hz), 3,51 (1H, dd, J= 8,9, 6,3 Hz), 3,64 (1H, d, J= 1,8 Hz), 3,66-3,71 (2H, m) , 3, 78-3,86 (2H, m), 4,51 (1H, d, J= 12,0 Hz), 4,54 (1H, d, J = 12,0 Hz), 4,58 (1H, s) , 7,25-7,35 (5H, m) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 10,0, 14,3, 20,5, 21,3, 21,9, 22,5, 23,5, 23,6, 36,4, 42,1, 54,1, 69,8, 71,2, 72,8, 73, 3, 73,4, 103, 8, 127, 6, 127,7 (2C), 128,5 (2C) , 138,9, 221,6; LRMS (ESI) calc, para C24H4o05Na [M+Na+] 431,3, encontrado 431,4.

Composto 32a (não representado): A uma solução arrefecida (-40 °C) de álcool 32 (1,01 g, 2,47 mmol) e 2,6-lutidina 93 (691 μΐ, 5,93 mmol) adicionou-se TBSOTf (681 pL, 3,00 mmol) e aqueceu-se a mistura a -20 °C ao longo de 3,5 h. A reacção foi temperada com NaHC03 sat. aq. (10 mL) . Após extracção com hexano (50 mL x 3) , os extractos orgânicos combinados foram secos sobre Na2S04 e concentrados. Purificação por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 50:1) produziu 32a (1,25 g, 2,39 mmol, 97%) sob a forma de um óleo incolor; [a] d25 -19,7 (c 0,58, CHC13) ; IR (película) v 2966, 2931, 1696, 1455, 1378, 1320, 1255, 1091, 1044, 991, 873, 838, 773 cm"1; XH NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,08 (6H, s) , 0,89 (9H, s), 0,99 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,04 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,07 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,07 (3H, s), 1,14 (3H, d, J= 6,1 Hz), 1,17 (3H, s), 1,17 (3H, d, J= 6,0 Hz), 1,20 (3H, d, J= 6,2 Hz), 1,76-1,85 (1H, m) , 3,21 (1H, dd, J = 9,2, 7,3 Hz), 3,32 (1H, quint, J= 7,4 Hz), 3,62 (1H, dd, J= 9,2, 5,7 Hz), 3, 78-3,85 (2H, m) , 3,87 (1H, dd, J= 7,7, 2,0 Hz), 4,46 (1H, d, J= 12,1 Hz), 4,50 (1H, d, J= 12,1 Hz), 4,73 (1H, s) , 7,24-7,37 (5H, m) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ -3,6, -3,3, 15,6, 16,8, 18,7, 18,8, 21,8, 22,1, 22,5, 23,5, 23,7, 26,4 (3C) , 39, 0, 46,2, 54,0, 69, 7, 70, 9, 72,1, 73, 4, 76,7,

103,1, 127,6, 127,8 (2C), 128,5 (2C), 139,0, 218,9; LRMS (ESI) calc. para CóoHs^sSiNa [M+Na+] 545, 4, encontrado 545,4.

Composto 34: A mistura de 32a (3,03 g, 5,79 mmol) e p-

Ts0H.H20 (286 mg) em THF aquoso (64 mL, THF/H2O = 4:1) foi aquecida sob refluxo durante 6,5 h. A mistura reaccional foi arrefecida à ta e vertida sobre NaHC03 sat. aq. (25 mL) . Após extracção com EtOAc (100 mL x 50 mL x 2), as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, 94 secas sobre Na2S04 e concentradas. Purificação por

cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 50:1 para 30:1) produziu 34 (2,37 g, 5,64 mmol, 98%) sob a forma de um óleo incolor: [a]D25 -25, 8 (c 0,515, CHC13) ; IR (pelicula) v 2955, 2931, 1731, 1696, 1455, 1360, 1255, 1091, 1026, 873, 826, 767 cm 1; 2H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,06 (3H, s), 0,07 (3H, s) , 0,90 (9H, s) , 0,95 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,03 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,28 (3H, s) , 1,33 (3H, s), 1,73-1,82 (1H, m), 3,16 (1H, dd, J= 9,2, 6,1 Hz), 3,28 (1H, quint, J= 7,3 Hz), 3,55 (1H, dd, J= 9,2, 6,7 Hz), 3,91 (1H, dd, J= 7,8, 2,1 Hz), 4,46 (2H, s), 7,27-7,36 (5H, m) , 9,58 (1H, s); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ -3,6,-3,5, 15,7, 16, 3, 18, 6, 19,8, 20,1, 26, 3 (3C) , 39, 1, 47,0, 61, 1, 71,9, 73,4, 75,8, 127,7, 128,0 (2C), 128,5 (2C), 138,6,201,3,213, 3; LRMS (ESI) calc, para C24H4o04SiNa [M+Na+] 443,3, encontrado 443,2.

Composto 35: A uma solução de LDA preparado de fresco (18 mL de uma solução de 0,5 M en Et20, 9,0 mmol) em Et20 (20 mL) foi adicionado acetato de t-butilo (1,16 mL, 8,61 mmol) a -78 °C. Após agitação durante 50 min adicionou-se gota a gota CpTiCI(OR)2 (100 mL de uma solução 0,1 M em Et20, 10,0 mmol) ao longo de 65 min por uma bomba de seringa. Após agitação durante 20 min a mistura reaccional foi aquecida a -30 °C, agitada durante 50 min e novamente arrefecida a -78 °C. Uma solução de 34 (2,42 g, 5,75 mmol) em Et20 (9 mL) foi adicionada gota a gota ao longo de 10 min e a mistura resultante foi agitada a -78 °C. Após agitação durante 2 h, a reacção foi temperada com THF aquoso (H20 5 M, 37 mL) e agitada à ta durante 2 h. de acordo com adição de água (40 mL) a mistura foi agitada durante mais 1 h. O precipitado 95 formado foi separado por filtração por Celite (enxaguado com Et20) e o filtrado foi lavado com água (40 mL) . A camada aquosa foi extraída com Et20 (100 mL x 2) , as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (40 mL) , secas sobre Na2S04 e concentradas. Purificação por cromatografia em coluna flash (SiCq, hexano/EtOAc = 10:1) produziu 35 (2,65 g, 4,94 mmol, 86%) sob a forma de um óleo amarelo pálido: [a]D25 -20.3 (c 1.0, CHC13) ; IR (película) v 3523, 2957, 2930, 2856, 1732, 1700, 1472, 1368, 1252, 1152, 1091, 1042, 986, 834, 774 cm'1; NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,07 (3H, s), 0,07 (3H, s) , 0,90 (9H, s) , 0,99 (3H, d, J= 7.0 Hz), 1,07 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,10 (3H, s) , 1,14 (3H, s), 1,47 (9H, s), 1,77-1,83 (1H, m), 2,26 (1H, dd, J= 16,0, 10.0 Hz), 2,34 (1H, dd, J= 15,9, 2,7 Hz), 3,23 (1H, dd, J= 9,2, 7,1 Hz), 3,35 (1H, d, J= 2,7 Hz, -OH), 3,36 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,61 (1H, dd, J= 9,2, 5,9 Hz), 3,88 (1H, dd, J= 7,6, 2,0 Hz), 4,17 (1H, dt, J= 10,0, 2,7 Hz), 4,48 (2H, s), 7,27-7,36 (5H, m) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 -3,5, -3, 4, 16, 3, 16, 7, 18,7, 20,1, 21,6, 26, 4 (3C), 28,3 (3C) , 38,0, 39,1, 45,8, 51,8, 72,2, 72,9, 73,5, 76,7, 81,4,

127,7, 128,0 (2C), 128,5 (2C), 138,8, 172,7, 219,6; LRMS (ESI) calc, para C3oH5206SiNa [M+Na+] 559,3, encontrado 559,4.

Composto 35a (não representado): A uma mistura de álcool 35 (10,2 g, 18,9 mmol) e imidazol (2,70 g, 39,7 mmol) em DMF (25 mL) foi adicionado TESCI (3,3 mL, 19,8 mmol) a 0 °C e a mistura foi agitada à ta durante 2 h. A reacção foi temperada com NaHC03 sat. aq. (50 mL) . Após extracção com hexano (500 mL + 120 mL x 2), as camadas orgânicas 96 combinadas foram lavadas sucessivamente com água (30 mL x 2) e salmoura (30 mL) , secas sobre Na2S04 e concentradas. Purificação por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 40:1) produziu 35a (12,1 g, 18,5 mmol, 98%) sob a forma de um óleo incolor: [a]D25 -38,0 (c 0,46, CHC13) ; IR (película) v 2955, 2877, 1733, 1697, 1456, 1367, 1298, 1251, 1155, 1099, 988, 835, 742 cm'1; 1NMR (400 MHz, CDCI3) 5 0,05 (6H, s), 0,57-0, 68 (6H, m) , 0,89 (9H, s) , 0,95 (9H, t, J= 7,9 Hz), 0,99 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,02 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,04 (3H, s) , 1,18 (3H, s) , 1,45 (9H, s) , 1,70-1, 79 (1H, m), 2,16 (1H, dd, J =17,0, 7,0 Hz), 2,40 (1H, dd, J= 17,0, 3,1 Hz), 3,22 (1H, dd, J= 9,1, 7,5 Hz), 3,31 (1H, quint, J= 6,9 Hz), 3,61 (1H, dd, J= 9,1, 5,4 Hz), 3,83 (1H, dd, J= 7,3, 2,3 Hz), 4,30 (1H, dd, J= 6,9, 3,1 MHz), 4,48 (2H, s) , 7,27-7,36 (5H, m) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 -3,5, -3,4, 5,3 (3C) , 7,3 (3C) , 15,3, 16,9, 18,7, \—1 0 CM 23,4, 26,4 (3C), 28,3 (3C), 39,1 i—1 1—1 46,2, 53,4, 72,2, 73,4, 74,3, 76,7, 80,6, 127,6, 127, 9 (2C), 128,5 (2C), 138,9, 171,5, 218,4; LRMS (ESI) calc, para C36H6606SÍ2Na [M+Na+] 673, 4, encontrado 673,5.

OTES

35b

OH

Composto 35b (não representado) : A uma solução agitada de 35a (4,37 g, 6,72 mmol) em THF (67 mL) adicionou-se Pd/C (adquirido junto da Acros, 10 % em peso, 437 mg) e a mistura foi agitada sob atmosfera de H2. Após agitação durante 2,2 h, a mistura foi filtrada através de um chumaço de Celite, o qual foi enxaguado com THF (120 mL). O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 30:1 a 10:1) para produzir 35b (3,53 g, 6,28 mmol, 94%) sob a forma de um 97 óleo incolor: [oí]d25 -16,1 (c 0,62, CHCI3); IR (película) v 3543, 2956, 1732, 1696, 1472, 1368, 1299, 1252, 1155, 1100, 988, 837, 775, 742 cm'1; XH NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,10 (3H, s), 0,12 (3H, s), 0, 60-0, 68 (6H, m) , 0,93 (9H, s) , 0,96 (9H, t, J= 8,0 Hz), 0,99 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,10 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,14 (3H, s), 1,20 (3H, s), 1,45 (9H, s) , 1,46-1,55 (1H, m) , 2,21 (1H, dd, J = 17,2, 7,1 Hz), 2,39 (1H, dd, J = 17,2, 2,8 Hz), 2,54 (1H, t, J= 5,8 Hz, -OH), 3,30 (1H, quint, J= 6,9 Hz), 3,58 (1H, dt, J= 11,5, 5,5 Hz), 3,66 (1H, dt, J= 11,3, 5,4 Hz), 3,92 (1H, dd, J= 8,0, 2,1

Hz), 4,32 (1H, dd, J= 7,1, 2,9 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ -3,6, -3,5, 5,3 (3C), 7,2 (3C), 16,0, 16,1, 18,6, 20,0, 23, 4, 26, 4 (3C), 28,3 (30 , 40,0, 40, 9, 46, 9, 53, 7, 64,8, 73,3, 78,1, 80,9, 171,7, 218,5; LRMS (ESI) calc, para C29H6o06Si2Na [M+Na+] 583, 4, encontrado 583,5.

Composto 35c (não representado): A uma mistura agitada de álcool 35b (3,53 g, 6,28 mmol) e MS4A em pó (activado de fresco, 2,50 g) em CH2CI2 (32 mL) adicionaram-se NMO (1,17 g, 10,0 mmol) seguido de TPAP (132 mg, 0,377 mmol). Após agitação à ta durante 35 min, a mistura foi filtrada através de uma coluna de gel de sílica (hexano/Et20 = 8:1) para se obter 35 (3,34 g, 5,98 mmol, 95%) sob a forma de um óleo incolor: [a]D25-69, 6 (c 0,25, CHCI3); IR (película) v 2955, 2878, 1732, 1696, 1472, 1368, 1253, 1155, 1097, 989, 837 cm"1; ΧΗ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,09 (3H, s) , 0,10 (3H, s), 0,59-0, 68 (6H, m) , 0,89 (9H, s), 0,95 (9H, t, J = 8,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,11 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,14 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,24 (3H, s), 1,45 (9H, s), 2,19 (1H, dd, J= 17,0, 6,7 Hz), 2,33 (1H, qt, J= 7,1, 2,2 Hz), 2,41 (1H, dd, J= 98 17,0, 3,3 Hz), 3,28 (1H, quint, J= 7,5 Hz), 4,07 (1H, dd, J= 7,9, 2,2 Hz), 4,32 (1H, dd, J= 6,7, 3,2 Hz), 9,74 (1H, d, J= 2,0 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ -3,8, -3,5, 5,3 (3C) , 7,2 (3C) , 12,6, 15,6, 18,5, 20,5, 23,3, 26,2 (3C) , 28,3 (3C), 41,1, 46, 9, 51, 1, 53,5, 74,0, 76, 5, 80, 7, 171, 1, 204.3, 218,0; LRMS (ESI) calc, para C29H5806Si2Na [M+Na+] 581.3, encontrado 581,3.

Composto 36: MePPh3I (2,56 g, 7,18 mmol) em THF (40,0 mL) foi tratado com t-BuOK (6,57 mL de uma solução a 1,0 M em THF, 6,57 mmol) a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 20 min, a suspensão resultante foi arrefecida a -78 °C e foi adicionada uma solução de aldeido 35c (3,34 g, 5,98 mmol) em THF (14 mL) . Após agitação a -78 °C durante 15 min, a mistura foi agitada a 0 °C durante 15 min e à ta durante 15 min. A reacção foi temperada com NH4C1 sat. aq. (20 mL) e extraída com Et20 (120 mL + 50 mL x 2) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com salmoura (20 mL), secos sobre Na2S04 e concentrados. O residuo foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2~80 g, hexano/Et20 = 40:1) para se obter 36 (125,3 mg, 0,225 mmol, 78%) sob a forma de um óleo incolor: [a]D25 -33, 6 (c 0,250, CHC13) ; IR (película) v 2956, 2878, 1733, 1696, 1472, 1367, 1299, 1253, 1156, 1100, 988, 837, 774 cm'1; ΧΗ NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,08 (3H, s) , 0,08 (3H, s) , 0, 60-0, 68 (6H, m) , 0,93 (9H, s), 0,96 (9H, t, J= 8,0 Hz), 1,04 (6H, d, J= 7,0 Hz), 1,09 (3H, s), 1,20 (3H, s) , 1,45 (9H, s) , 2,08-2,15 (1H, m), 2,29 (1H, dd, J= 17,0, 7,0 Hz), 2,41 (1H, dd, J= 17.0. 3.1 Hz), 3,08 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,84 (1H, dd, J= 7.0, 2,1 Hz), 4,32 (1H, dd, J= 7,0, 3,1 Hz), 5,02 (1H, dd, J=17,9, 1,0 Hz), 5,06 (1H, dd, J=10,5, 1,0 Hz), 5,93 (1H, 99 ddd, J=17,9, 10,5, 7,7 Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDCI3) δ -3,6, -3,3, 5,4 (3C), 7,2 (30), 15,2, 1 8,7, 19,0, 20,2, 23,6, 26,4 (30 , 28,3 (3C), 41,1, - 43,8, 46,4, 53,5, 73, 9, 76, 6, O OO 115,5, 140,2, 171,5, 218,5; LRMS (ESI) calc, para C3oH6o05SÍ2Na [M+Na+] 579, 4, encontrado 579,4.

Composto 25: A uma solução de éster t-butílico 36 (4,87 g, 8,74 mmol) e 2,6-lutidina (destilada de fresco, 4,1 mL, 35,0 mmol) em CH2CI2 (58 mL) adicionou-se TESOTf (4,0 mL, 17,5 mmol) a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 25 min, a mistura foi agitada à ta durante 3,2 h. A mistura foi diluída com Et20 (600 mL), lavada sucessivamente com KHSO4 aquoso a 5% (60 mL x 2) e salmoura (60 mL), seca sobre Na2S04 e concentrada. O resíduo foi seco sob alto vácuo durante 1,5 h para produzir ácido em bruto 25 (6,30 g, contaminado com TESOH). O produto bruto (6,30 g) foi dissolvido em THF aquoso (87,5 mL, THF/H20 = 6:1) e foi tratado com NaHC03 sat. aq. (12,5 mL) . Após agitação à ta durante 20 min, a suspensão resultante fio diluída com Et20 (500 mL) e acidificada com KHSO4 aquoso a 5% (55 mL) .

Depois da separação das camadas, a camada aquosa foi extraída com Et20 (100 mL x 2), as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (50 mL x 2), secas sobre Na2S04 e concentradas. O resíduo foi seco sob alto vácuo de um dia para o outro para produzir ácido em bruto (5,60 g, contaminado com TESOH) sob a forma de um óleo incolor, o qual foi empregue na reacção seguinte sem mais purificação. 100

Purificado para caracterização por cromatografia em coluna flash sobre gel de sílica, eluindo com hexano/EtOAc = 4/1.

[a] D25 -30,7 (c 0, 985, CHC13) ; IR (película) v 2956, 2936, 2879, 1712, 1472, 1417, 1303, 1253, 1107, 1046, 1003, 988, 872, 837, 775, 741 cm"1; 2H NMR (400 MHz, CDC13) 5 0, 08 (3H, s), 0,09 (3H, s), 0,59-0, 67 (6H, m) , 0,93 (9H, s) , 0,96 (9H, t, J= 8,1 Hz), 1,05 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,05 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,20 (3H, s), 1,21 (3H, s), 2,06-2,13 (1H, m), 2,34 (11-1, dd, J= 16,4, 7,4 Hz), 2,50 (1H, dd, J= 16,4, 3,0 Hz), 3,06 (11-1, quint, J= 7,3 Hz), 3,87 (1H, dd, J= 7,5, 1,8 Hz), 4,40 (1H, dd, J= 7,3, 2,9 Hz), 5,01 (11-1, dd, J= 18,0, 0,9 Hz), 5,07 (1H, dd, J= 10,4, 1,2 Hz), 5,93 (1H, ddd, J= 18,0, 10,4, 7,8 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 -3,6, -3,3, 5,3 (3C) , 7,1 (3C) , 15,6, 18,7, 19,1, 19,2, 24,1, 26, 4 (3C), 39,8, 43, 6, 46,4, 53, 5, 73, 7, 76, 6, 115, 6, 140, 0, 177, 9, 218,7; LRMS (ESI) calc, para C26H5205Si2Na [M+Na+] 523,3, encontrado 522,9.

Composto 45: O ácido protegido 3-0-TES-6-0-TBS 25 foi seco por meio de destilação azeotrópica a partir de benzeno. Álcool seco de fresco 43 (200 mg, 1,19 mmol) é dissolvido em DCM (10 mL) e arrefecido a 0 °C, altura em que são adicionados DMAP sólido (167 mg, 1,37 mmol) e EDC1 sólido (261 mg, 1,37 mmol). Após agitação da mistura reaccional a 0 °C durante 15 min, adiciona-se gota a gota uma solução de ácido 25 (425 mg, 0,85 mmol) em DCM (2 mL) . O banho de arrefecimento é removido e prossegue-se a agitação durante mais 2 horas. A mistura reaccional em bruto é diluída com 101 DCM (10 mL) e purificada por cromatografia em gel de sílica, empregando 10% EtOAc/hexanos como o eluente para se produzir éster 45 (380 mg, 81 % de rendimento, duas fases a partir de 36) sob a forma de um óleo transparente: [a]D- 15,1 (c 1,2 , CDC13) ; IR (puro) 2955, 2932, 2877, 1743, 1732, 1694, 1474, 1461, 1417, 1380 , 1360, 1295, 1252, 1169, 1094, 1043, 988,3, 912,9, 871,4, 836,5, 774,8, 741,6 cm'1; XH NMR (500 MHz, CDCI3) 0,08 (3H, s) , 0,08 (3H, s) , 0,60- 0, 68 (6H, m) , 0,93 (9H, s), 0,95 (9H, t, J= 8,0 Hz), 1,04 (3H, d, J, 6,9 Hz), 1,05 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,10 (3H, s), 1,25 (3H, s), 1,69 (3H, s) , 2,08-2,15 (2H, m) , 2,16 (3H, s), 2,38 (1H, dd, J= 17,0, 7,0 Hz), 2,48 (2H, t, J= 6,5 Hz), 2,57 (1H, dd, J= 17,0, 2,7 Hz), 2,71-2,76 (2H, m) , 3,07 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,83 (1H, d, J = 7,2 Hz), 4,36 (1H, dd, J = 7,0, 2,7 Hz), 4,97-5,07 (4H, m), 5,19 (1H, t, J= 7,0), 5,73 (1H, td, J= 15,4, 5,9 Hz), 5,92 (1H, dd, J= 15,7, 8,0 Hz); 13C NMR (500 MHz, CDCI3) δ 218,4, 205,4 172,1, 140,1, 137,4, 135,4, 119,1, 115 ,8, 115,6, 78,7 76,5, 73, 9, 53, 3; 46,3, 43,7, 39, 6, 36, 6, 29,2; 26,7, 26,4 23, 8, 23, 7, 19, 9, 18, 9, 18, 7, 15, 4, 7,06, 5, 30, -3,29; -3,62; LRMS (ESI) calc, para C36H6606Si2Na [M+Na+] 673,4, encontrado 673,5 .

Composto 47: A uma solução do composto 45 (20 mg, 0,031 mmol) em tolueno seco (60 mL) sob refluxo foi adicionada numa porção uma solução de dicloridrato de triciclo-hexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-di-hidroimidazol-2-ilideno][benzilideno]ruténio (IV) (5,2 mg, 102 0,0061 mmol) em tolueno seco (2 mL) e a mistura foi aquecida durante 10 minutos. A mistura reaccional foi arrefecida imediatamente num banho de gelo e foi sujeita a stripping sobre sílica e purificada com cromatografia em gel de sílica, empregando gradiente 4-10% EtOAc/pentano como eluente para produzir o composto 47 (15 mg, 78% de rendimento) sob a forma de um óleo: [a] -28,6 (c 1,2, CHC13) ; IR (puro) 2955, 2933, 2878, 1745, 1731, 1695, 1471, 1462, 1380, 1361, 1251, 1159, 1104, 1080, 1019, 985,0, 876,1, 835, 5, 774,7, 743,1, 670,1 cm"1; 2H NMR (500 MHz, CDC1 3) 0, 07 (3H, s), 0, 10 (3H, 5), 0,59-0 ,68 (6H, m) F 0,91 (9H, t, J= 8,0 Hz), 0, 93 (9H, s) , 1,04 (3H, d, J= 7, 0 Hz) , 1,10 (3H , S), 1,11 (3H , cl , J= 7,0 Hz), 1 ,17 (3H, s) F 1,71 (3H, s) , 2,21 (3H, s) , 2, -27-2 , 32 d H), 2,38 (1H, dd, J= 14, 6 , 6, 8 Hz), 2,51 -2, 61 (2 H, m) , 2,57 (1H, dd, J, 15,5, 3,3 Hz) , 2,93-3,1 ( 3H, m) , 3, 94 l :ih, d, J, 8,5 : Hz) F 4,28 (1H, dd, J, 8,6, 3,0 Hz ), 5,04 (1H , dd, J = 8 ,7, 2 ,4) F 5,16 (1H, t, J = 7,5) , 5 ,73 (1H, tdd, J = 12 8, 9,94, 6, 9 Hz), 5,92 (1H , ddd, J = 18, 0, 10,3 , 7, 8 Hz); 13C NMR (125 MHz, CDC13) 5 215,9, 204 ,8, 171,3, 140 ,0, 132 ,7, 129, 2, 118,6, 79,1 , 78, ,2, 75,4, 54 ,0, 48 ,2, ‘ 41,7 , 40,3, 35, 0, 29 ,2, 26, 6, 26,5 , 23 ,5, 22,8, 20,í 5, 18,8, 17 ,5, 14, 3, 7,19, 5 ,53, - 3,36; LRMS (ESI) calc. para C34H6206SÍ2 645, 4, encontrado 645,4 (M+Na+) .

Composto 39a: A uma solução de reagente de Wittig (19,1 mg, 54,7 pmol) em THF (0,4 mL) adicionou-se KHMDS (109 μΐ de 103

uma solução a 0,5 M em tolueno, 54,7 μιηοΐ) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 °C durante 0,5 h e depois foi arrefecida a -78 °C. A mistura foi adicionada gota a gota a uma solução da cetona 47 (5,7 mg, 9,12 pmol) em THF (0,3 mL) e a mistura resultante foi deixada aquecer a -20 °C ao longo de 1,5 h. A reacção foi temperada com NH4C1 sat. aq. (2 mL) e extraída com Et20 (7 mL x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04 e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/Et20 = 10:1) para se obter 5,6 mg de uma mistura inseparável de olefinas E/Z (E/Z = 9:1). A mistura foi purificada por TLC preparatório (hexano/Et20 = 4:1) para se obter 39a puro (5,0 mg, 6,96 pmol, 76%) sob a forma de um óleo incolor: [a]D25 -41,5 (c 0,715, CHC13); IR (película) v 2955, 2884, 1737, 1690, 1467, 1378, 1249, 1179, 1102, 1014, 979, 879, 826, 773 cm"1; XH NMR (400 MHz, CDCla) 5 0, 08 (3H, s) , 0,12 (3H, s) , 0,57 (6H, q, J= 7,8

Hz), 0,89 (9H, t, J= 8,0 Hz), 0,93 (9H, s) , 1,04 (3H, s) , 1.06 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,12 (3H, s), 1,17 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,68 (3H, s), 2,15 (3H, d, J = 0,8 Hz), 2,14-2,27 (2H, m), 2,45 (1H, dd, J= 14,0, 4,8 Hz), 2,50 (1H, dd, J= 14,9, 3,2 Hz), 2, 64-2, 74 (2H, m) , 2,72 (3H, s) , 3,02 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,10 (1H, dd, J= 14,4, 7,3 Hz), 3,96 (1H, d, J= 8.7 Hz), 4,43 (1H, dd, J= 8,3, 2,9 Hz), 5,22 (1H, dd, J, 9,8, 5,7 Hz), 5,33-5,42 (2H, m), 5,69 (1H, dd, J, 15,8, 8,2 Hz), 6,57 (1H, s), 6,96 (1H, s) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 -3,3, -3,2, 5,6 (3C), 7,1 (30, 15,0, 17,2, 18,8, 19,4, 21,4, 21,7, 23,8, 24,3, 26,5 (30 , 33,2, 35, 6, 41, 3, 41,8, 48,2, 54,0, 74,4, 77,4, 79,3, 116,4, 120,5, 121,0, 129,3, 132,1, 137,8, 138,0, 152,7, 164,8, 170,7, 216,8; LRMS (ESI) calc, para C39H68N05SSi2 [M+H+] 718,4, encontrado 718,3. 104

Composto 28 (Epo 3): A uma solução de 39a (298,8 mg, 0,416 mmol) em THF (6,5 mL) foi adicionada piridina HF (3,2 mL) a 0 aC e a mistura foi agitada à ta durante 3 h. A reacçâo foi temperada por meio da adição gota a gota de TMSOMe (30 mL) a 0 °C. Após concentração e secagem sob alto vácuo, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/Et20 = 1:1) para se obter 28 (196, 6 mg, 0,402 mmol, 97%) sob a forma de um sólido branco: [a]o25 —96, 6 (c 0,235, CHC13); IR (película) v 3502, 2970, 2927, 1733, 1685, 1506, 1456, 1375, 1251, 1152, 1040, 977 cm'1; NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,06 (3H, s) , 1,11 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,22 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,28 (3H, s) , 1,72 (3H, s) , 2,10 (3H, s), 2,31-2,40 (2H, m) , 2,43 (1H, dd,J= 16,0, 3,7 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 16,0, 9,2 Hz), 2,55-2, 68 (2H, m) , 2,71 (3H, s), 2,98 (1H, dd, J= 14,4, 6,4 Hz), 3,16 (1H, quint, J= 6,2 Hz), 3,76 (1H, dd, J= 5,9, 3,2 Hz), 4,30 (1H, dd, J= 9,2, 3,7 Hz), 5,18 (1H, brt, J= 7,3 Hz), 5,32 (1H, dd, J= 8,4, 2,5 Hz), 5,63 (1H, dd, J= 15,7, 6,4 Hz), 5,60 (1H,

ddd, J= 15,7, 6,9, 5,1 Hz), 6,60 (1H, s) , 6,98 (1H, s) ; 13C NMR (100 MHz, CDCI3) δ 15,1, 16,0, 17,7, 19,2, 19,5, 22,5, 23,6, 32,0, 35,0, 39,6, 40,3, 44,8, 53,3, 71,8, 75,6, 78,3, 116,1, 119,6, 120,5, 129,9, 131,3, 137,5, 138,2, 152,2, 165,0, 170,7, 218,8; LRMS (ESI) calc, para C27H40NO5S [M+H+] 490,3, encontrado 490,2. 105

105 -il N

1 s dEpoB (1, Epo 1): A uma solução de 28 (1,2 mg, 2,5 pmol) e TrisNHNH2 (29,3 mg, 98 pmol) em C1CH2CH2C1 (0,7 mL) a 50 °C adicionou-se Et2N (13,7 pL, 98 mol). A reacção foi supervisionada por HPTLC (hexano/EtOAc/CH2Cl2 = 1/1/2) .

Após agitação durante 7 h, a mistura foi arrefecida à ta, diluída com EtOAc e filtrada através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com EtOAc. Após concentração o resíduo foi purificado por TLC preparatório (hexano/EtOAc/CH2Cl2 = 1/1/2) para se obter 1 (1:1 mg, 2,2 pmol, 91 %) sob a forma de um sólido branco.

Os dados espectrais de 1 eram idênticos aos descritos para dEpoB.

27

Composto 27: Ácido 25 e álcool 24 foram azeotropizados com benzeno seco (5 mL x 2) e secos sob alto vácuo antes da reacção. A uma solução de álcool 24 (639 mg, 2,63 mmol) em CH2CL2 (13 mL) adicionou-se EDC1 (576 mg, 3,09 mmol) e DMAP (366 mg, 3,09 mmol) a 0 °C. À mistura foi adicionada uma solução de ácido 25 (1,11 g, como 1,88 mmol) em CH2C12 (5 106 mL + 2 mL enxaguamento) gota a gota ao longo de 16 min a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 1,5, a mistura foi agitada à ta durante 3,5 h. Após concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 30:1 a 20:1) para produzir 27 (1,20 g, 1,61 mmol, 86% a partir de éster t-butílico) sob a forma de um óleo incolor; [a]D24 -25,1 (c 1,30, CHC13) ; IR (película) v 2955, 2925, 2872, 1732, 1696, 1461, 1378, 1290, 1243, 1173, 1091, 985, 873, 773 cm"1; ΧΗ NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,06 (3H, s) , 0,06 (3H, s), 1 co LO 0 0,66 (6H, m) , 0,92 (9H, s) , o, ,95 (9H, t, J= O co Hz) , 1,02 (3H, d, J= 6,5 Hz), 1,03 (3H, d, J= = 6,5 Hz ), 1,07 (3H, s) , 1,21 (3H, s), 1,67 (3H, s) , 2,07 (3H, , s ), 2,05 -2,12 (1H, m) , , 2,30 (1H , dd, J= 16 ,9, 7,5 Hz) , 2, 39 (1H, dt, J= 14 ,8, 6,7 Hz ), 2 ,49 (1H, dd, J= 17,0, 3,0 Hz ), 2,50 (1H, dt, J = 14,8, 6,7 Hz), 2,70 (3H, s), 2,74 -2, 30 (2H, m) , 3,07 (1H, dd, J = 7 ,0 Hz) , 3,83 (1H , dd, J = 7, 1, 2,0 Hz) , 4,35 (1H, dd, J: = 7, 4, 2,8 Hz) , 4, 98 -5,07 (4 H , m) , 5,16 (1H, brt, J= 7,0 Hz), 5,23 ( 1H, t, J= 6, 9 Hz) , 5, 74 (1H, ddt, J= 1 6,7, , 10,2, 6,5 j Hz) , 5,91 (1H, ddd, J= 1 7, 8, LO O i—1 , 7,8 Hz) , 6, í 50 (1H, - s) , 6,95 (1H, s); 13C 1 SIMR d 00 MHz, CDC1 3) δ -3,7 , -3,3 , 5, 3 (3C) , 7,2 (3C), 14 ,8, 15, 2, 18,7 , 18, 9, 19 ,4, 20,3, i 23, 6 , 23,7 , 26,4 (3C), 31 ,7, 36, 7, \—1 0 , 43, 8, 41 5,4, 53, 3, 74, 2, 76 ,5, 79 ',6, 115, 5, 1 15, 6, 116,5, 120,5, 121,3, 135,8, 136,1, 137,4, 140,2, 152,9, 164,7, 171,5, 218,4; LRMS (ESI) calc, para C41H71NO5SSÍ2 [M+Na+] 768,5, encontrado 768,5. 107

Composto 39a: Uma solução de 27 (26, 9 mg, 36,1 pmol) em tolueno (70 mL) foi aquecida sob refluxo e tratada com uma solução de catalisador de Grubbs (3,1 mg, 3,61 pmol) em tolueno (2 mL) . A mistura foi agitada durante 25 min, arrefecida a 0 °C e filtrada através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com hexano/EtOAc = 2/1. Os filtrados foram concentrados e purificados por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/Et20 = 40:1 a 5:1) para produzir 39a (9,9 mg, 13,8 pmol, 38%) sob a forma de um óleo incolor; [a] d25 -41,5 (c 0,715, CHC13) ; IR (película) v 2955, 2884, 1737, 1690, 1467, 1378, 1249, 1179, 1102, 1014, 979, 879, 826, 773 cm-1; 3H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,08 (3H, s) , 0,12 (3H, s), 0,57 (6H, q, J= 7,8 Hz), 0,89 (9H, t, J= 8,0 Hz), 0,93 (9H, s), 1,04 (3H, s) , 1,06 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,12 (3H, s), 1,17 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,68 (3H, s) , 2,15 (3H, d, J= 0,8 Hz), 2,14-2,27 (2H, m) , 2,45 (1H, dd, J= 14,0, 4,8 Hz), 2,50 (1H, dd, J= 14,9, 3,2 Hz), 2,64-2,74 (2H, m), 2,72 (3H, s), 3,02 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,10 (1H, dd, J= 14.4, 7,3 Hz), 3,96 (1H, d, J= 8,7 Hz), 4,43 (1H, dd, J= 8,3, 2,9 Hz), 5,22 (1H, dd, J= 9,8, 5,7 Hz), 5,33-5,42 (2H, m) , 5,69 (1H, dd, J= 15,8, 8,2 Hz), 6,57 (1H, s) , 6,96 (1H, s); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ -3,3, -3,2, 5,6 (3C) , 7,1 (3C), 15,0, 17,2, 18,8, 19,4, 21,4, 21,7, 23,8, 24,3, 26,5 (3C), 33,2, 35,6, 41,3, 41,8, 48,2, 54,0, 74,4, 77,4, 79,3, 116.4, 120,5, 121,0, 129,3, 132,1, 137,8, 138,0, 152,7, 108 164, 8, 170,7, 216,8; LRMS (ESI) calc, para C39H68NO5SS12 [M+H+] 718,4, encontrado 718,3.

Composto 28: A uma solução de 39a (298,8 mg, 0,416 mmol) em THF (6,5 mL) adicionou-se piridina HF (3,2 mL) a 0 °C e a mistura foi agitada à ta durante 3 h. A reacção foi temperada com adição gota a gota de TMSOMe (30 nL) a 0 °C e a mistura foi agitada à ta durante 3 h. Após concentração e secagem sob alto vácuo, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 1:1) para produzir 28 (196,6 mg, 0,402 mmol, 97%) sob a forma de um sólido branco: [a]D25 -96,6 (c 0,235, CHCI3) ; IR (película) v 3502, 2970, 2927, 1733, 1685, 1506, 1456, 1375, 1251, 1152, 1040, 977 cm-1; NMR (400 MHz, CDCI3) 5 1,06 (3H, s), 1,11 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,22 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,28 (3H, s), 1,72 (3H, s) , 2,10 (3H, s) , 2,31-2,40 (2H, m), 2,43 (1H, dd, J= 16,0, 3,7 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 16.0, 9,2 Hz), 2,55-2, 68 (2H, m) , 2,71 (3H, s) , 2,98 (1H, dd, J= 14,4, 6,4 Hz), 3,16 (1H, quint, J= 6,2 Hz), 3,76 (1H, dd, J= 5,9, 3,2 Hz), 4,30 (1H, dd, J= 9,2, 3,7 Hz), 5,18 (1H, brt, J= 7,3 Hz), 5,32 (1H, dd, J = 8,4, 2,5 Hz), 5,63 (1H, dd, J = 15,7, 6,4 Hz), 5,60 (1H, ddd, J= 15,7, 6,9, 5,1 Hz), 6,60 (1H, s), 6,98 (1H, s); 130 NMR (100 MHz, CDCI3) δ 15, 1, 16, 0, 17,7, 19, 2, 19, 5, 22, 5, 23, 6, 32,0, 35.0, 39,6, 40,3, 44,8, 53,3, 71,8, 75,6, 78,3, 116,1, 119,6, 120,5, 129,9, 131,3, 137,5, 138,2, 152,2, 165,0, 109 170,7, 218,8; LRMS (ESI) calc, para C27H40NO5S [M+H+] 490,3, encontrado 490,2.

Composto 26: Ácido 25 e álcool 21 foram azeotropizados com benzeno seco (5 mL x 2) e secos sob alto vácuo antes da reacção. A uma solução de álcool 21 (240 mg, 0,756 mmol) em CH2CL2 (5 mL) adicionou-se EDC1 (192,7 mg, 1,01 mmol) e DMAP (122,8 mg, 1,01 mmol) a 0 °C. À mistura foi adicionada uma solução de ácido 25 (314,6 mg, como 0,628 mmol) em CH2C12 (2 mL + 1 mL enxaguamento) gota a gota ao longo de 15 min a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 2, a mistura foi agitada à ta durante 2 h. Após concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 20:1 a 15:1) para produzir 26 (340,1 mg, 0,425 mmol, 68% baseado em ácido) sob a forma de um óleo incolor; [a] d24 -27, 5 (c 0,28, CHC13); IR (película) v 2956, 2878, 1740, 1692, 1472, 1378, 1317, 1253, 1174, 1118, 988, 915, 872, 837, 775 cm'1; 1 H NMR (400 MHz, CDC13) 5 0,06 (6H, s) , 0,57-0,65 (6H, m) , 0,92 (9H, s) , 0,94 (9H, t, J= 7,9 Hz), 1,02 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,03 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,07 (3H, s), 1,22 (3H, s), 2,07-2,10 (1H, m) , 2,09 (3H, s) , 2,31 (1H, dd, J = 16,9, 7,3 Hz), 2,51 (1H, dd, J= 16,8, 3,0 Hz), 2,49-2,65 (2H, m) , 2,71 (3H, s) , 2, 96-2, 99 (2H, m) , 3,06 (1H, quint, J= 7,1 Hz), 3,83 (1H, dd, J= 7,3, 2,1 Hz), 4,35 (1H, dd, J= 7,2, 3,0 Hz), 4,98-5,12 (4H, m) , 5,30 (1H, t, 110 J= 6 ,7 Hz), 5,76 (1H, ddt, J= 16,7, 10,2, 6, 2 Hz) , 5,92 (1H, ddd, J= = 17,8, 9,9, 7,8 Hz) 1, 6,19 (1H, t, J= 7,0 Hz), 6,51 (1H, s), 6,97 (1H, s) ; LRMS (ESI) calc, para C4iH68F3N05SSÍ2Na [M+Na+] 822,4, encontrado 822,4.

Composto 40a (via RCM de 26): Uma solução de 26 (57, 6 mg, 72,0 μιηοΐ) em tolueno (142 mL) foi aquecida sob refluxo e tratada com uma solução de catalisador de Grubbs (6,1 mg, 7,20 pmol) em tolueno (2 mL). A mistura foi agitada durante 28 min, arrefecida a 0 °C e filtrada através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com hexano/EtyOAc = 2/1 (300 mL). Os filtrados combinados foram concentrados e purificados por cromatografia em coluna flash (SiCt, hexano/Et20 = 40:1 a 15:1) para produzir 40a (12,0 mg, 15,5 pmol, 22%) sob a forma de um óleo incolor; IR (película) v 2955, 2884, 1743, 1690, 1472, 1320, 1173, 1114, 1038, 1008, 873, 832, 773 cm'1; XH NMR (400 MHz, CDC1 3) δ 0, 09 (3H, s) , 0, 12 (3H, s) , 0, 55 (6H, q, , J= 7,7 Hz) , 0,88 (9H, t, J: = 8,0 Hz), 0,96 (9H, s), 1,01 (3 H, s), 1,06 (3H, d, J= = 7,1 Hz), : 1,12 (3H , s) , 1 ,20 (3H, d ·, J= 7,1 Hz) , 2,07 -2,17 (1H, m) , 2,19 (3H, s), 2,38 (1H, dd, , J= 14,3 , 3,5 Hz) , 2,39 -2,49 (1H, m) , 2,50 (1H, dd, J= 14,3, 7,3 Hz) , 2,73 (3H, s) , 2 , 77-2,91 (2H, m) , 2,96-3 ,09 (2H, m) , 3, 98 (1H, dd, J= 8,9 Hz), 4, ,54 (1H , dd, J= 7,3, 3,4 Hz) , 5,28- -5,38 (1H, m) , 5, 63 (1H, dd, J= 9,6, 2,3 Hz) , 5,77 (1H, dd, . J= 15, 9, 8, 5 Hz) , 6,21-6, 28 (1H, m) , 6,60 (1H, s), 111 6,99 (1Η, s); LRMS (ESI) calc, para C39H65F3NO5SSÍ2 [M+H+] 772,4, encontrado 772,4.

Composto 29: A uma solução de 40a (1,78 g, 2,31 mmol) em THF (25 mL) adicionou-se lentamente piridina HF (12,5 mL) a 0 °C e a mistura foi agitada à ta durante 4 h. A reacçâo foi temperada com adição gota a gota de TMSOMe (80 mL) ao longo de 10 min a 0 °C. A mistura foi vigorosamente agitada à ta durante 2,5 h. Após concentração e secagem sob alto vácuo durante 2 h, o residuo foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiC>2~50 g, hexano/EtOAc = 1:1) para produzir 29 (1,20 g, 2,21 mmol, 96%) sob a forma de um pó incolor: [a]D25 -54 , 6 (c 0,28, CHC13) ; IR (película) v 3478, 2974, 2929, 1736, 1689, 1449, 1381, 1318, 1247, 1169, 1113, 1039, 983, 867, 736 cm'1; ΧΗ NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,05 (3H, s) , 1,12 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,23 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,37 (3H, s), 2,04 (1H, brd, J= 3,8 Hz, -OH), 2,12 (3H, s), 2,25-2,33 (1H, m) , 2,38 (1H, dd, J= 15,3, 3,0 Hz), 2,48 (1H, dd, J= 15,4, 9,8 Hz), 2,54-2,61 (1H, m), 2, 66-2,76 (1H, m), 2,71 (3H, s), 2,96 (1H, dd, J= 16,5, 4,5 Hz), 3,02 (1H, dd, J= 16,3, 6,5 Hz), 3,11 (1H, quint, J= 6,7 Hz), 3,19 (1H, brs, =OH), 3,74 (1H, brs), 4,35 (1H, brd, J= 9,5 Hz), 5,42 (1H, dd, J= 6,2, 4,1 Hz), 5,60 (1H, ddd, J= 15,8, 5,6, 4,5 Hz), 5,66 (1H, dd, J= 15,8, 5,8 Hz), 6,24 (1H, t, J= 7,2 Hz), 6,64 (1H, s), 7,00 (1H, s) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 15,1, 112 16,1, 17,7, 18,5, 19,3, 22,5, 28,8, 31,1, 39,6, 39,7, 45,0, 53,7, 71,4, 75,3, 76,8, 116,7, 120,2, 124,3 [q, 1J(C,F) = 273,4 Hz], 127, 9, 130,2 [q, 3J(C,F) = 6,0 Hz], 130,6 [q, 2J(C,F) = 28,4 Hz], 132,5, 136,7, 152,0, 165,4, 170,2, 218,4; LRMS (ESI) calc, para C27H37F3NO5S [M+H+] 544,2, encontrado 544,1.

Composto 2: A uma solução de 29 (1,22 mg, 2,24 pmol) e

TrisNHNH2 (26,7 mg, 89,6 pmol) em C1CH2CH2C1 (1 mL) a 50 °C adicionou-se Et3N (12,5 pL, 89,6 pmol). A reacção foi controlada por HPTLC (hexano/EtOAc/CH2Cl2 = 1/1/2). Após agitação durante 6,5 h, adicionou-se mais TrisNHNH2 (26,7 mg, 89,6 pmol) e Et3N (12,5 pL, 89,6 pmol) à mistura. Após agitação durante 14 h, a mistura foi arrefecida à ta, diluída com EtOAc e filtrada através de um chumaço de gel de silica, o qual foi enxaguado com EtOAc. Após concentração, o resíduo foi purificado por TLC preparatório (hexano/EtOAc/CH2Cl2 = 1/1/2) para se obter 2 (1,16 mg, 2,13 pmol, 94%) sob a forma de um sólido branco: XH NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,03 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,08 (3H, s) , 1,19 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,25-1,35 (2H, m) , 1,37 (3H, s) , 1,42-1,55 (2H, m) , 1,65-1,82 (2H, m), 2,10 (3H, d, J= 0,8

Hz), 2,21-2,47 (2H, m) , 2,27 (1H, dd, J= 14,2, 2,6 Hz), 2,48 (1H, dd, J= 14,3, 10,8 Hz), 2,70 (3H, 5), 2,70-2,28 (1H, m) , 3,02 (1H, d, J= 2,0 Hz, -OH), 3,19 (1H, qd, J=6,9,2,2 Hz), 3,65 (1H, d, J= 6,2 Hz, -OH), 3,69-3,72 (1H, 113 m), 4,34 (1H, ddd, J= 10,8, 6,2, 2,6 Hz), 5,28 (1H, dd, J= 10,2, 2,2 Hz), 6,12 (1H, dd, J= 10,2, 5,2 Hz), 6,61 (1H, s), 6,98 (1H, s) ; LRMS (ESI) calc, para C27H39F3NO5S [M+H+] 546,3, encontrado 546,2.

Composto 54: Ácido 25 e álcool 53 foram azeotropizados com benzeno seco (3 mL x 2) e secos sob alto vácuo antes da reacção. A uma solução de álcool 53 (68,0 mg, 0,173 mmol) em CH2CL2 (1,3 mL) adicionou-se EDC1 (37,8 mg, 0,197 mmol) e DMAP (24,1 mg, 0,197 mmol) a 0 °C. À mistura foi adicionada uma solução de ácido 25 (72,6 mg, como 0,123 mmol) em CH2C12 (0,7 mL) gota a gota ao longo de 5 min a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 1, a mistura foi agitada à ta durante 2,5 h. Após concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 30:1) para produzir 54 (99,5 mg, 0,114 mmol, 92% a partir de éster t-butílico) sob a forma de um óleo incolor; [a] D25 -23, 4 (c 0,56, CHC13) ; IR (película) v 2955, 2931, 2880, 1735, 1696, 1506, 1472, 1386, 1362, 1294, 1254, 1174, 1104, 988, 878, 776, 742 cm'1; 2H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,06 (3H, s), 0,06 (3H, s) , 0,14 (6H, s) , 0,63 (6H, q, J= 8,0 Hz), 0,92 (9H, s) , 0,94 (9H, t, J= 8,0 Hz), 0,97 (9H, s), 1,02 (3H, d, J= 6,6 Hz), 1,05 (3H, d, J= 6,5 Hz), 1,07 (3H, s), 1,21 (3H, s), 1,67 (3H, s) , 2,06 (3H, d, J= 0,8

Hz), 2,05-2,14 (1H, m) , 2,30 (1H, dd, J= 16,9, 7,5 Hz), 114 2,33-2,53 (2Η, m) , 2,50 (1H, dd, J= 16,9, 2,7 Hz), 2,76-2,80 (2H, m) , 3,07 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,83 (1H, dd, J= 7,0, 2,2 Hz), 4,35 (1H, dd, J= 7,4, 2,8 Hz), 4,97 (2H, s), 4,97-5,07 (4H, m), 5,16 (1H, t, J= 7,2 Hz), 5,24 (1H, t, J= 6,9 Hz), 5,74 (1H, ddt, J= 16,6, 10,0, 6,5 Hz), 5,91 (1H, ddd, J= 1 7,6, 9,9, 7,7 Hz), 6,50 (1H, s) , 7,06 (1H, s) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ -5,2 (2C) , -3,7, -3,3, 5,3 (3C) , 7,2 (3C), 14,7, 15,2, 18,5, 18,7, 18,9, 20,3, 23,6, 23,7, 26,0 (3C), 26,4 (3C), 31,7, 36,7, 40,1, 43,8, 46,4, 53,3, 63, 4, 74,2, 76,5, 79, 6, 115, 5, 115, 6, 116, 6, 120,5, 121,3, 135,8, 136,1, 137,4, 140,1, 153,0, 171,5, 172,2, 218,4; LRMS (ESI) calc, para C47H86N06SSi3 [M+H+] 876, 6, encontrado 876,5.

Composto 55: Uma solução de 54 (69,7 mg, 79,5 pmol) em tolueno (158 mL) foi aquecida sob refluxo e tratada com uma solução de catalisador de Grubbs (6,7 mg, 7,95 pmol) em tolueno (2 mL) . A mistura foi agitada durante 11 min, arrefecida a 0 °C e filtrada através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com hexano/EtyOAc = 3/1 (280 mL) . Os filtrados combinados foram concentrados e purificados por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/Et20 = 20:1 a 15:1) para produzir 55 (18,4 mg, 21,7 pmol, 27%) sob a forma de um óleo incolor; [a] d24 -40, 4 (c 0,26, CHC13) ; IR (película) v 2955, 2930, 2879, 1740, 1694, 1472, 1387, 1362, 1253, 1200, 1107, 1007, 115 838, 776, 742 cm 1; ΧΗ NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,08 (3H, s), 0,12 (3H, s), 0,15 (6H, s) , 0,57 (6H, q, J= 7,9 Hz), 0,88 (9H, t, J = 8,0 Hz), 0,95 (9H, s), 0,97 (9H, s), 1,04 (3H, s), 1,06 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,12 (3H, s), 1,17 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,69 (3H, s), 2,06-2,30 (2H, m) , 2,14 (3H, s), 2,45 (1H, dd, J= 15,6, 3,6 Hz), 2,50 (1H, dd, J= 14,9,3,1 Hz), 2,63-2,75 (2H, m), 2,97-3,06 (1H, m), 3,10 (1H, dd, J= 14,6, 7,7 Hz), 3,97 (1H, d, J= 8,5 Hz), 4,44 (1H, dd, J= 8,4, 2,9 Hz), 4,97 (2H, s), 5,22 (1H, dd, J = 8,7, 5,2 Hz), 5, 33-5,44 (2 H, m), 5,70 (1H, dd, J = 15,6, 8,1 Hz), 6,57 (1H, s), 7,07 (1H, s); LRMS (ESI) calc, para C45H82N06SSÍ3 [M+H+] 848,5, encontrado 848,5.

Composto 57: A uma solução de 55 (61,8 mg, 72,8 pmol) em THF (2 mL) adicionou-se piridina HF (1 mL) a 0 °C e a mistura foi agitada à ta durante 3,2 h. A reacção foi temperada com adição gota a gota de TMSOMe (15 mL) a 0 °C. A mistura foi agitada à ta durante 2 h. Após concentração e secagem sob alto vácuo, o residuo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02, hexano/EtOAc = 1:3) para produzir 57 (32,4 mg, 64,1 pmol, 88%) sob a forma de um sólido branco: [a]D25 -108,4 (c 0,285, CHC13); IR (film) v 3422, 2968, 2919, 2729, 1689, 1449, 1377, 1252, 1152, 1064, 978 cm'1; 2H NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,05 (3H, s) , 1,12 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,22 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,32 (3H, s), 1,72 (3H, s), 2,08 (3H, s) , 2,31-2,40 (3H, m) , 2,43 (1H, 116 dd, J= 15,5, 3,5 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 15,5, 9,5 Hz), 2,55-2,67 (2H, m), 2,95 (11-1, dd, J = 14,6, 6,3 Hz), 3,13 (1H, quint, J= 6,6 Hz), 3,34 (1H, brs, -OH), 3,75 (1H, dd, J = 6,6, 2,4 Hz), 4,06 (1H, brs, -OH), 4,33 (1H, dd, J= 9,4, 3,0 Hz), 4,92 (2H, s), 5,18 (1H, t, J= 6,9 Hz), 5,33 (1H, dd, J = 8,0, 2,5 Hz), 5,52 (1H, dd, J= 15,8, 6,4 Hz), 5,59 (1H, ddd, J= 15,8, 6,6, 5,0 Hz), 6,63 (1H, s) , 7,13 (1H, s); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 15,3, 16,3, 17,8, 19,2, 22,8, 23,7, 31,9, 35,1, 39,7, 40,2, 45,0, 53,4, 61,8, 71,7, 75,8, 78,1, 116,7, 119,0; 120,5, 130,0, 131,2; 137,6, 138,9, 152,5, 170,0, 170,7, 218,7; LRMS (ESI) calc, para C27H39N06SNa [M+Na+] 528,2, encontrado 528,0.

O

Composto 46: Ácido em bruto 25 (4,65 g, como 7,27 mmol) e álcool 44 (2,18 g, 9,84 mmol) foram azeotropizados com benzeno seco e secos sob alto vácuo antes da reacção. A uma solução de álcool 44 (2,18 g, 9,84 mmol) em CH2CL2 (65 mL) adicionou-se EDC1 (2,09 g, 10,9 mmol) e DMAP (1,33 g, 10,9 mmol) a 0 °C. À mistura foi adicionada uma solução de ácido em bruto 25 (4,65 g, como 7,27 mmol) em CH2C12 (20 mL + 5 mL enxaguamento) gota a gota ao longo de 20 min a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 4, a mistura foi agitada à ta durante 4 h. Após concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash (SiO2~160 g, hexano/EtOAc = 20:1) para produzir 46 (4,85 g, 6,87 mmol, 94% a partir de éster t-butílico) sob a forma de um óleo incolor; 117 XH NMR (400 ΜΗζ, CDC13) δ 0,08 (3Η, s), 0,08 (3Η, s) , 0,60 (6Η, q, J= 7,8 Hz), 0,93 (9H, s), 0,94 (9H, t, J= 8,0 Hz), 1,04 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,04 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,11 (3H, s), 1,23 (3H, s), 2,05-2,14 (1H, m) , 2,17 (3H, s) , 2,40 (1H, dd, J= 16,9, 7,0 Hz), 2,59 (1H, dd, J= 17,0, 3,6 Hz), 2,56-2,64 (2H, m) , 2,90-3,01 (2H, m), 3,06 (1H, quint, J= 7,0 Hz), 3,85 (1H, dd, J= 7,3, 2,0 Hz), 4,38 (1H, d, J= 7,0, 3,4 Hz), 4,97-5,14 (5H, m) , 5,75 (1H, ddt, J= 16,0, 9,9, 6,2 Hz), 5,92 (1H, ddd, J= 17,8, 10,5, 7,8 Hz), 6,21 (1H, td, J= 7,2, 1,5 Hz); LRMS (ESI) calc, para C36H63F306SÍ2Na [M+Na+] 727, 4, encontrado 727,3.

Composto 48: Uma solução de 46 (510,0 mg, 72,0 μιηοΐ) em tolueno (500 mL) foi aquecida sob refluxo e tratada com uma solução de catalisador de Grubbs (92,1 mg, 7,20 pmol) em tolueno (10 mL) . A mistura foi agitada durante 17 min sob refluxo e imediatamente arrefecida a 0 °C e mantida a 0 °C antes de filtração através de um chumaço de gel de sílica. Um segundo lote de dieno (510,0 mg, 0,723 mmol) foi processado de forma idêntica e simultaneamente. As misturas reaccionais combinadas foram filtradas através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com hexano/EtyOAc = 3/1 (1,4 L) . Os filtrados combinados foram concentrados e purificados por cromatografia em coluna flash (Si02~65 g, hexano/Et20 = 10:1 a 5:1) para produzir 48 (742,4 mg, 1,10 mmol, 76%) sob a forma de um óleo incolor; 118 XH NMR (4 00 MHz, CDC13) δ 0, 08 (3H), 0,10 (3H, s) , 0,60 (6H, q, J , 7,8 Hz) , 0, 93 (9H, s) , 0, 94 (9H, t, J , 7,8 Hz) , 1,03 (3H, d, J , 7,1 Hz) , 1,08 (3 H, s) , 1,13 (3H, d, J , 7,0 Hz) , 1,17 (3H, s) , 2,26 (3H, s) , 2,25 -2,34 (1H, m) , 2,64 (1H, dd, J = 15,5, 5,0 Hz) , 2, 68- -2,75 (2H, m) , 2,76 (1H, dd, J, 15 ,6,6, 4 Hz) , 2,85 (1E [, dd , J, 15,6, 5,7 Hz) , 2,97 (1H, dq, J, 8, 3, 6, 9 Hz) , 3,04 (1H, dd, J= 15,6, , 6,3 Hz) , 3, 92 (1H, dd, J= 8 ,3, 1 , 2 Hz ,36 (1H, t, J= = 5,3 Hz) , 5,30 -5,39 (2H, m), 5, 58 (1H, dd, J, : 15,5, 8,0 Hz) , 6,13 (1H, brt, J= 7, ,2 Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDCI3 ) δ - 3,6, -3,6, 5,4 (30) , 7,0 (3C) , 17, ,5, 18,5, 19,C l, 21 ,6, 23,5, 26,3 (3C) , 26,! 5, 28, ,6, 2í ),1, 4 11,0, 42,3 , 47, 3, 54 ,1, 74,2, 76,8, 77,7, 124,0 [1J (C,F) = 273,7 Hz], 126,0, 128,7 [3J (C,F) = 5,9 Hz], 132,2 [2J (C,F) = 28,1 Hz], 133,8, 170,5, 204,1, 216,1; LRMS (ESI) calc, para C34H59F306SÍ2Na [M+Na+] 699,4, encontrado 699,4.

Composto 40a (via reacção de Wittig da cetona 48): A cetona 48 foi azeotropizada com benzeno (5 mL x 2) e depois foi seca sob alto vácuo durante 0,5 h. A uma solução de sal de Wittig (907 mg, 2,59 mmol) em THF (19 mL) foi adicionado t-BuOK (2,4 mL de uma solução de 1,0 em THF, 2,43 mmol) gota a gota ao longo de 5 min a 0 aC. A mistura foi agitada a 0 °C durante 0,5 h e depois foi arrefecida a -78 °C. A mistura foi adicionada gota a gota a uma solução 119 de cetona 48 (1,10 g, 1,62 mmol) em THF (13 mL) ao longo de 10 min e a mistura resultante foi deixada aquecer até -20 °C ao longo de 2 h. A reacção foi temperada com NH4C1 sat. aquoso (50 mL) e extraído com EtOAc (50 mL x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (20 mL), secas sobre Na2S04 e concentradas. O resíduo foi purificado em cromatografia flash (Si02, hexano/Et20 = 20:1 a 10:1) para se obter o isómero 16 (E) desejado 40a (940 mg, 1,22 mmol, 75%) em conjunto com o isómero 16 (Z) 40b indesejado (140,9 mg, 0,182 mmol, 11 %) , ambos sob a forma de óleos incolores:

[oí] D2 :6-17, 1 (c 0,14, CHCla); 1 H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 05 O O (3H, s) , 0,12 (3H, s) , 0,55 (6H, q, J= 7,7 Hz) , 0,88 (9H, t, J = 8,0 Hz) , 0, 96 (9H, s), 1, 01 (3H, s) , 1 -,0( 5 (3H, d, J= 7,1 Hz) , 1,12 (3H, s), 1,20 (3H, d, J= 7,1 Hz) 1, 2,07 -2,17 (1H, m) , 2,19 (3H, s) , 2,38 (1H, dd, J = 14, 3, 3,5 Hz) , 2,39 -2,49 (1H, m) , 2,50 (1H, dd, J = 14,3, 7, 3 Hz), 2,73 (3H, s), 2,77- -2, 91 (2H, m), 2,96 -3,09 (2H, m) , 3,98 (1H, dd, J= 8, 9 Hz) i , 4,54 (1H, dd, J= : 7,3, 3,4 Hz) , 5,28 -5,38 (1H, m) , 5,63 (1H, dd, J= 9, 6, 2 ,3 Hz) , 5, 77 (1H, dd, J= 15, 9 , 8,5 Hz) , 6,21 -6,28 (1H, r m) , 6, 60 (1H, s) , 6, 99 (1H, s) ; 13C NMR (1 00 ME Iz, CDC13) δ - 3,4, - 3,3, 5, 5 (3C), , 7,0 (3C) , 14, 6, 17 ,1, 18,7, 19,4, 19, 9, 21, 3, 24 1,8, . 26,4 (3C) , 29, 6 , 32, ,8, 4 2,0, 42,1, 48 ,2, 54,1, 73,4 r 76,9, 77,8, 120 117,0, 121,6, 124,3 [1J (C,F) = 273,5 Hz], 127,2, 130,6 [2J (C, F) = 28,2 Hz], 130,8 [3J (C, F) = 6,1 Hz], 133, 2, 136,5, 152,3, 165,0, 170,1, 217,1; HRMS (ESI) calc. para

CagHgsFaNOsSSis [M+H+] 772,4074, encontrado 772,4102. f3c

40b [Oí] d: -5 62 ,7 (c 0,33, CHCI3) ; 3H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,09 (3H, s) , 0,13 (3H, s), 0,49 (6H, q, J= 7,8 Hz), 0,85 (9H, t, J '= 7, 8 Hz) , 0,97 (9H , s) , 0,99 (3H, : 3), 1 ,06 (3H, d, J= 7,1 Hz) , 1,11 (3H, s) , 1,20 (3H, d, J= 7,1 Hz), 2,00 (3H, s) , 2,03 -2,13 (1H, 1 n) , : 2,35 (1H, dd, J= 14,3, 3, 0 Hz), 2,46 \—1 dd, J = 14,3, 7,8 Hz) , . 2,41-2,50 (1H, m) , 2,73 (3H, s), 2,71 -2,90 (2H, m) 2, 98- 3,12 (2H, m) , 3, 99 (1H, d, J= 9,2 Hz) , 4,56 (1H, dd, J= 7 ,7, 2,8 Hz), 5,33 (1H, ddd, J= 15, 6 , 8, 9, 4, 1 Hz) ! - 5, 82 (1H, dd, J= 15,6, 8,4 Hz), 6,29 (1H, s) , 6, 33- -6,40 (1H, m) , 6, 94 (1H, m) , 7,09 (1H, brd, J= co Hz) ; 13C NMR (100 MHz, CDCI3) δ -3, 2, - 3,2, 5,5 (3C) , 7,0 (3C) , 17, 2, 18 ,7, 19,3, 19,6, 20,0 , 22, ,3, 24,9, 26,4 (3C) , 29 ,7, 32,9, 41,9, 42,0 , 48,6, 54,0 , 72, 2, 73,3, 77,0, 116, 7, 120,7, 124,5 [1J (C,F) = 273,3 Hz], 127,9, 129, 7 [ 2 J (C, F) = 28,0 : Hz], 131,9 [ 3 J (C,F) = 6,1 Hz] , 132,9, 136,6, 152, 1, 165, 4 , 170,2, 217 ,4; LRMS (ESI) calc, para C39H65F3NC 'sSSi2 [M+H+] 772 ,4, encontrado 772,4. 121

Composto 58 (via reacção de Wittig da cetona 48): A cetona 48 foi azeotropizada com benzeno (5 mL x 2) e depois foi seca sob alto vácuo durante 0,5 h. A uma solução de sal de Wittig (1,19 g, 2,27 mmol) em THF (18 mL) foi adicionado t-BuOK (2,2 mL de uma solução de 1,0 em THF, 2,20 mmol) gota a gota ao longo de 5 min a 0 aC. A mistura foi agitada a 0 °C durante 20 min e depois foi arrefecida a -78 °C. À mistura foi adicionada gota a gota uma solução de cetona (1,06 g, 1,51 mmol) em THF (10 mL + 2 mL enxaguamento) ao longo de 10 min e a mistura resultante foi deixada aquecer até -20 °C ao longo de 2 h. A reacção foi temperada com NH4C1 sat. aquoso (50 mL) e extraído com EtOAc (50 mL x 3) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (20 mL), secas sobre Na2S04 e concentradas. O resíduo foi purificado em cromatografia em coluna flash (Si02~65 g, hexano/Et20 = 30:1 a 20:1) para se obter o isómero 16 (E) 58 desejado (1,01 g, 1,11 mmol, 74%) em conjunto com o isómero 16 (Z) 58a indesejado (154,5 mg, 0,182 mmol, 11%), ambos sob a forma de óleos incolores:

XH NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,09 (3H, s) , 0,12 (3H, s) , 0,15 (6H, s), 0,55 (6H, q, J= 7,8 Hz), 0,87 (9H, t, J= 8,0 Hz), 0,96 (9H, s), 0,97 (9H, s) , 1,01 (3H, s) , 1,06 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,12 (3H, s) , 1,20 (3H, d, J= 7,1 Hz), 2,07-2,16 122 T-1 m) , 2 ,18 (3H, d, J= O T-1 Hz) , 2,38 τ—1 dd, J= T—1 3,3 Hz), 2, , 34-2,46 (1H, m) , 2, • 49 ( ]1H, dd, J= 14,4, 7, 4 Hz), 2,78 -2,90 (2H, m) , 2,97- -3, 09 (2H, m) , 3, 98 (1H, d F J, 8,9 Hz) , 4,54 (1H, dd, J = 7 ,3, 3,3 Hz) , 4 ,97 (2H, s) , 5,33 τ—1 ddd, co LO T-1 •o 3,6,4, 9 Hz) , 5, 63 (1H, dd, , J= 9, 6, 2,4 Hz) , 5,78 (1H, dd, , J= 15 ,8, 8,2 Hz) , 6 , 22- 6,27 (1H, m) , 6, 60 (1H, s), 7,09 (1H, s) ; 13C NMR (100 MHz, CDC1; 3) δ -5,3 (2 C) , -3,4 , -3,3, 5, 5 (3C) , 7,0 (3C) , 14,6 , 17, 1, 18,4, 18, 7 , 19,8 , 21,3, 24,8, 25, 9 (3C) , 26,4 (3C) , 29, 6, 32,9, O CM 'vt1 , 42,1 , 48,2, 54,1 F 63, 4, 73,4, 76,9, 77,8 F 117,2, 121, 7, 124 ,3 [q, 1J(C,F) = = 273,6 Hz], 127,2, 130, 7 [q, 2 J (C, F) = 27,5 Hz], 130, 8 [q, 3 J (C, F) - 6, 2 Hz] F 133,2, 136, 4, 152 ,6, 170, 1, 172, 4, 217, 1; LRMS (ESI) calc . para C45H78F3N06SSi3Na [M+Na+] 924,5, encontrado 924,5.

(6H, s), 0,48 (6H, q, J= 7,8 Hz), 0,84 (9H, t, J= 7,9 Hz), 0,97 (18H, s), 0,98 (3H, s), 1,06 (3H, d, J= 7,1 Hz), 1,11 (3H, s), 1,20 (3H, d, J= 7,2 Hz), 2,00 (3H, s) , 2,03-2,11 (1H, m) , 2,33 (1H, dd, J= 14,1, 2,8 Hz), 2,43 (1H, dd, J= 14,0, 7,8 Hz), 2,40-2,48 (1H, m) , 2,76-2,89 (2H, m) , 2,97-3,10 (2H, m) , 3,99 (1H, d, J= 9,3 Hz), 4,57 (1H, dd, J= 7,8, 2,6 Hz), 4,95 (1H, d, J= 14,6 Hz), 5,00 (1H, d, J= 14,6 Hz), 5,33 (1H, ddd, J=15,6, 9,1, 3,8 Hz), 5,82 (1H, dd, J= 15,6, 8,3 Hz), 6,30 (1H, s), 6,32-6, 38 (1H, m) , 7,04 123 (1Η, s), 7,11 (1H, dd, J= 11,0, 2,3 Hz); LRMS (ESI) calc, para C45H78F3N06SNa [M+Na+] 924,5, encontrado 924,5.

A uma solução de 58 (1,04 g, 2,25 mmol) em THF (22 mL) foi adicionada lentamente piridina HF (11 mL) a 0 °C e a mistura foi agitada à ta durante 4,3 h. A reacção foi temperada por meio da adição gota a gota de TMSOMe (75 mL) ao longo de 10 min a 0 °C. A mistura foi vigorosamente agitada à ta durante 4,2 h. Após concentração e secagem sob alto vácuo durante 1 h, o residuo foi purificado por cromatografia em coluna flash (Si02~25 g, hexano/EtOAc = 3:4 a 1:2) para se obter 59 (615,7 mg, 1,00 mmol, 96%) sob a forma de um pó incolor: [a] d25 -57,7 (c 1,20, CHC13) ; 2Η NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,04 (3H, s), 1,12 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,25 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,36 (3H, s), 1,90 (1H, d, J= 6,6 Hz, OH), 2,08 (3H, s) , 2,23-2,32 (1H, m) , 2,34 (1H, dd, J= 15,7, 2,4 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 15,7, 10,1 Hz), 2,59-2, 69 (2H, m) , 2,95-3,01 (2H, m), 3,04 (1H, quintet, J= 6,8 Hz), 3,72 (1H, td, J= 7,0, 3,0 Hz), 3,78 (1H, d, J= 5,7 Hz, OH), 4,38 (1H, ddd, J= 10,1, 5,7, 2,4 Hz), 4,90 (2H, d, J= 6,1 Hz), 5,10 (1H, t, J= 6,1 Hz, OH), 5,44 (1H, t, J= 4,7 Hz), 5,60 (1H, dd, J= 15,9, 4,4 Hz), 5,66 (1H, dd, J= 15,9, 5,0 Hz), 6,28 (1H, 124 t, J= 6,7 Hz), 6,73 (1H, s), 7,16 (1H, s); LRMS (ESI) calc, para C27H37F3N06SNa [M+H+] 560,2, encontrado 560,1.

Compostos 49 e 50: Uma solução de 28 (12,2 mg, 24,9 pmol) em CH2C12 (1,25 mL) foi arrefecida a -78 °C e tratada com uma solução arrefecida de DMDO (-78 °C, 0,06 M em acetona, 914 pL, 54,8 pmol). A mistura foi deixada aquecer a -50 °C e foi agitada a -50 °C durante 2,7. O DMDO excedentário foi temperado a -50 °C por meio da adição de sulfureto de dimetilo (117 pL) e a mistura foi agitada a esta temperatura durante 0,5 h. O solvente foi removido sob vácuo. A purificação por meio de cromatografia em camada fina preparatória (ehxano/EtOAc= 1/2) produziu β-epóxido 49 (3,0 mg, 5,93 pmol, 24%) e a-epóxido 50 (7,9 mg, 15,6 pmol, 63%), ambos como sólidos incolores.

Composto 49: NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,03 (3H, s) , 1,11 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,14 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,34 (3H, s), 1,36 (3H, s), 2,00 (1H, ddd, J= 15,1, 7,3, 4,0 Hz), 2,14 (1H, dt, J= 15,1, 5,2 Hz), 2,14 (3H, s), 2,21 (1H, dd, 125 J = T—1 8,0 Hz) , 2,33 τ—1 dd, J T—1 II 7,4,8 Hz), 2,47 τ—1 dd, J = 13,8, 3, 3 Hz) , 2,59 (1H, dd, J = 13,8, 9,4 Hz) , 2,73 (3H, s) , 2,77 (1H, brs, OH) , 2,93 (1H, dd, J= = 7,3 , 4,8 Hz) , 3,34 (1H , qd , J= 6,9, 3,7 Hz) , 3,75-3,82 (1H, m) , Cs] τ—1 -4,24 (2 H, m, incluindo OH) , 5,54 (1H, ddd, J= 15,7, 7,4, 5,0 Hz), 5, 54- -5, 60 (1H, m) , ! 5, 64 (1H, dd, J= =15,7 , 5,6 Hz) , 6,94 (1H , s) , 7,( 01 (1H, s) ; LRMS (ESI) calc, para C27H4oN06S [M+H+] 506,3, encontrado 506, 3.

Composto 50: XH NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,00 (3H, s) , 1,04 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,12 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,35 (3H, s), 1,35 (3H, s), 1,87 (1H, dt, J= 15,0, 9,2 Hz), 2,03 (1H, dd, J= 13,9,9,2 Hz), 2,13 (3H, s), 2,13-2,19 (1H, m), 2,36 (1H, dd, J= 13,9, 3,4 Hz), 2,39 (1H, dd, J= 12,2,2,1 Hz), 2,42-2,51 (1H, m), 2,49 (1H, dd, J= 12,4, 10,9 Hz), 2,69 (1H, d, J=2,7 Hz), 2,72 (3H, s) , 3,06 (1H, dd, J= 9,7, 3,1 Hz), 3,54 (1H, qd, J= 7,0, 2,0 Hz), 3, 76-3, 80 (1H, m) , 4,07-4,14 (1H, m) , 4,31 (1H, d, J= 4,1 Hz), 5,52 (1H, dd, J= 15,5, 8,7 Hz), 5,60 (1H, ddd, J= 15,1, 9,4, 3,4 Hz), 5,71 (1H, d, J= 8,4 Hz), 6,63 (1H, s) , 6,99 (1H, s) ; LRMS (ESI) calo, para C27H39N06SNa [M+Na+] 528,2, encontrado 528,2. 126

Composto 52: A uma solução de 50 (1,7 mg, 3,4 μιηοΐ) e TrisNHNH2 (40,1 mg, 0,134 mmol) em C1CH2CH2C1 (0,8 mL) a 50 °C adicionou-se Et2N (18,7 pL, 0,134 mmol). A reacção foi controlada por HPTLC (hexano/EtOAc = 1/2) . Após agitação durante 4 h, a mistura foi arrefecida à ta, diluída com EtOAc e filtrada através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com EtOAc. Após concentração, o resíduo foi purificado por TLC preparatório (hexano/EtOAc = 1/2) para se obter 52 (1,2 mg, 2,4 pmol, 70%) sob a forma de um sólido branco. NMR (4 100 MHz, CDCI3) O LO 95 (3H, d , J= 7,1 Hz) , 1,04 (3H, s), 1,11 (3H, d, J= = 7,0 Hz), 1,28 (3H, s) , 1,37 (3H, s) , 1, 35- 1,44 (1H, - m) , 1,45- 1,59 (4H, m) , 1,71- 1,82 (2H, m) , 1,86 (1H, dt, J= 15, 3, 9, 5 Hz) , . 2,10 (1H, dd, J= 15,3, 3,6 Hz) , 2,13 (3H, s), 2 ,40 (1H, dd , J= 12,5, r 2,5 Hz) , 2,49 (1H, dd, J= 12,5, 11,0 Hz), 2, 74 (3h, s) , 2,80 (1H, brs, OH), 3,07 (1H, dd, J= 10 ',3, 3 ,3 Hz) , 3, 34 (1H, qd, J= 7,0, 0 1 1 Hz), 3,89 (1H, - brs, OH) , 4,03- •4,09 (1H, m) , 4,12 -4,17 (1H, m), 5,69 (1H, d, J= = 9,1 Hz) , 6, 63 (1H, s) , 7,00 (1H, S); LRMS (ESI) calc, para c27h 4iN06SNa [M+Na’ h] 530,3, encontrado 530,2. 127

Composto 51: A uma solução de 49 (0,7 mg, 1,38 μιηοΐ) e

TrisNHNH2 (20,6 mg, 69 pmol) em C1CH2CH2C1 (0,4 mL) a 50 °C adicionou-se Et2N (9,6 pL, 69 μιηοΐ) . A reacção foi controlada por HPTLC (hexano/EtOAc = 1/2). Após agitação durante 6 h, a mistura foi arrefecida à ta, diluída com EtOAc e filtrada através de um chumaço de gel de sílica, o qual foi enxaguado com EtOAc. Após concentração, o resíduo foi purificado por TLC preparatório (hexano/EtOAc = 1/2) para se obter 51 (0,5 mg, 0,985 pmol, 71%) sob a forma de um sólido branco. Os dados espectrais de 51 eram idênticos aos descritos para EpoB.

Exemplo 2: Estratégias de síntese alternativas para a síntese de intermediários das epotilonas

Os exemplos seguintes oferecem métodos de preparação dos vários intermediários na síntese dos análogos da epotilona.

Optimização da síntese de 9,10-de-hidro-epotilonas

Exemplo 1: 128 Η'

Zn, í-Bu0‘ X^Br -40 °C, 87%

-*· f-BuO

ITBS

34 60,1:1 mist. de diastereómeros

Exemplo 2. Reduções Noyori f-BuO'

61 64{10mol%) OBn -► í-BuO' MeOH/HCI H2,1200psi

OBn 69%

Exemplo 3. Reduções Noyori

129 i- Ρι j-PrO Ή 1. TrocCI, pyr.,92% 'Bn -► H' 2. p-Ts0H H20, 76% iTroc V^OBn 32 67 í-BuO' λ LDA, 80% <-BuO'

'Bn

Periodinano de D ess-Martin -► 74% 68,1:1 mist. de diastereómeros

TESCI, imidaz. J | fí Ψ™ 1. Zn, AcOH/THF, 99% -»► NBuO-^^rN^y^OBn-► f-BuO‘ 51% (77% bosm) ' ' · = 2. TBSOTf,2,6-lutidina OTES i

TBS OBn 36

OTES

Exemplo 4. Síntese alternativa da dicetona principal

EtO

72 73 LDA, THF -v 90%

TBSOTf 2.6-lutidine —2,6-lutidina ► βΟ' 95%

TBS LDA, vODBn......*- f-BuO' 76 ITBS V~0Bn

f-BuíX 61

Exemplo 5.

Abordagem 1. Migração do grupo sililo - descarboxilação

Abordagem 2. Desacrboxilação - incorporação do grupo sililo 130 130

Di-hidroxilação assimétrica de Sharpless 80a 81a

0°Ctnrt à ta

NaH, THF O O 0 °c; X JL, D 1 eq TESOTf _^ ' γ ot-Bu J nr

78a fl i)iou. :h2ci2

Jv.. 2) TESCI, pyr ' CH2CI2 79a, 50% vield de rendimento

Exemplo 6. Abordagem auxiliar de Evans à síntese de 2-hidroxicetona

DIBAL, CHjClj -78°Cà ta

(H 99% F3C' > 85

Exemplo 7. Kowalsky - Abordagem de Sharpless à síntese de

2-hidroxicetona X/a 1JLHMDS .........."► 2) t-BuLi, I OSÍR3 Di-hidroxilação JL H assimétrica de ^ Sharpless 91 r,A 86 A 92 A 3) R3S1CI

,0H f3C' Ί 90 S-

Experiências 131

Éster 1- (2-benziloxi-l-metiletil)-5,5-diisopropoxi-2,4,4-trimetil-3-oxopentilo e éster 2,2,2-tricloroetilo do ácido carbónico (32a) A uma solução de 7-benziloxi-5-hidroxi-l,1-diisopropoxi- 2.2.4, 6-tetrametil-heptan-3-ona 32 (1,0 g, 2,4 mmol e

piridina (0,8 mL, 7,3 mmol) em CH2C12 (10,0 mL) a 0 °C adicionou-se cloroformato de 2,2,2-tricloroetilo (668,0 pL, 4,9 mmol) e a mistura foi depois deixada aquecer à ta. Passada 1 h, a mistura reaccional foi temperada com salmoura e depois foi extraída com CH2C12. As camadas orgânicas combinadas foram secas MgS04 e concentradas sob uma pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 93:7) para produzir 32a (1,285 g, 92%) sob a forma de um óleo transparente: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,03-1,09 (m, 12H), 1,15 (d, J= 1,8 Hz, 3H) , 1,17 (d, J= Hz, 3H) , 1,19-1,21 (m, 6H), 1,97-2,11 (m, 1H) , 3,2 (dd, J = 6,2 and 9,0

Hz, 1H) , 3,54 (dd, J = 4,8 and 9,1 Hz, 1H) 3,57-3, 60 (m, 1H), 3,82 (qd, J = 3,6 and 5,9 Hz, 2H), 4,47 (s, 2H), 4,57 (s, 1H), 4,72 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 11,9 Hz,

1H) , 5,08 (t, J= 6,0 Hz, 1H) , 7,29-7,35 (m, 5H) ; 13C NMR (100 MHz, CDCI3) δ 11,9, 15,0, 18,8, 21,4, 21,7 22,3, 23,2,

23.4, 35,7, 42,5, 53,4, 53,9, 69,4, 70,9, 71,4, 73,3, 81,3, 94,7, 103,4, 127,5, 127,6, 128,2, 138,2, 154,0 215,6; IR (película, NaCI, cm'1) 2966, 1760, 1698, 1247; LRMS (ESI) calc, para C27H41O7CI3N a [M+Na+] 605,2, encontrado 605,2 [a] 23d = -20,4 (c = 1,0, CHCI3, 132

Éster 1- (2-benziloxi-l-metiletil)-2,4,4-trimetil-3,5- dioxopentilo e éster 2,2,2-tricloroetilo do ácido carbónico (67) A uma solução de 32a (1,28 g, 2,25 mmol) em 4:1 THF/H20 (25 mL) adicionou-se p-TsOH (111,0 mg, 0,6 mmol). Após aquecimento a 70 °C, 5 h, a mistura reaccional foi vertida em solução aq de NaHC03 frio (0 °C) sat. (12 mL) e depois extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas MgS04 e concentradas sob uma pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 84:16) para produzir 67 (793,2 mg, 76%) sob a forma de um óleo transparente: 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,90 (d, J= 5,8 Hz, 3H), 1,0 (d, J, 6,9 Hz, 3H) , 1,24 (s, 6H) , 1,97- 2,04 (m, 1 H) , 3,24 (dd, J, CO 'RT1 and 9 ,2 Hz , 1 H) , 3,34 (m, 1 H) , 3,42 (dd , J, 5,8 and 9,2 Hz, 1 H), 4,35 (d, 05 i—1 \—1 "O Hz, IH), 4 ,39 (d, J, 11,9 Hz, IH) , 4, 64 (d, J, 11,9 Hz, IH) , 4,69 (d, J, 11,9 Hz, IH) , 4,96 (t, J, 6,0 Hz, IH) , 05 1—1 r- 1 oo co (m, 5H) , 9,4 9 (s, , IH) ; 13C NMR ( ;ioo MHz , CDC13)- 12,0 , 14,8 , i 9,5, 05 \—1 35,4, 43,3 , 60 ,9, 71, 1, 73,3, 80,37, 94, 5, 127, 7, 127,8 , 128,3, 137,9 , 154,1 , 201,0, 210,1; IR (film, NaCI, cm'1) 2973, 2880, 1758, 1701, 1453, 1380, 1248; LRMS (ESI) calc, para C2iH2706Cl3Na [M+Na+] 503,0, encontrado 503, 0; [a]23D = -18,5 (c = 0,8, CHC13) . 133

9-Benziloxi-4,4,6,8-tetrametil-3,5-dioxo-7-(2,2,2-tricloroetoxicarboniloxi)-nonanoato de terc-butilo (69) A uma solução de LDA (1,17 mmol, 0,3 M em Et20) a -78 °C adicionou-se acetato de t-butilo (1,0 mmol, 135,0 pL). Passados 30 min, uma solução de 67 (464,0 mg, 1 mmol) em Et20 (2 mL) foi lentamente adicionada ao longo de 15 min. Após agitação durante 1 h, a reacção foi temperada com uma solução aq de NH4CI sat. e depois foi extraída com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas MgS04 e concentradas sob uma pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 86:14) para produzir 68 (mistura epimérica 1:1, 461,4 mg, 80%) sob a forma de um óleo transparente: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,87 (d, J= 5,3 Hz, 3H) , 0,89 (d, J, 5,5 Hz, 3H) , 1,02-1,10 (m, 18H) , 1,38 (s, 18H) , 1,97- -2,2 (m, 2H) , 2,27-2 ,31 (m, 2H) , 3, 22- 3,27 (m, 3H) , 3,39-3 ,48 (m, 5H) , 4 ,03-4, 06 ( m, 1 H), 4, 11- 4,14 (m, 1 H), 4,38- -4,4 5 (m, 4H) , 4,58- 4,73 (m , 4H) , 4 ,97 (t, J , 5, 8 Hz, IH) , 5,02 (t, J, 5, 8 Hz, 1H) , 7, 18-7, 27 (m, 10H) ; 13c NMF (100 I HHz, CDCI3) δ 11,9, 12,7, 14,9, 15 ,2, 18,7, 19, 3, 21 ,4, 21 ,6, 28,0, 35, 6, - 37,4, - 41, 7, 42,0, 51 ,8, 51,9, 71, 3, 71 ,3, 72 ,5, 73,0, 73,3, , 73,3, , 80, 6, 81,2, 81 ,3, 94,6, 127,5, 127,7, 127,8, 128,3, 138,0, 138,1, 154,0, 154,1, 172,3, 172,4, 216,0, 216,3; IR (película, NaCI, cm" 3) 3509, 2975, 1759, 1707, 1368, 1248, 1152; LRMS (ESI) calc, para C27H3908Cl3Na [M+Na+] 619,1, encontrado 619,2. 134 A uma solução a 0 °C de 68 (350,0 mg, 0,6 mmol) em CH2CI2 (10 mL) adicionou-se periodinado de Dess-Martin (398,0 mg, 0,9 mmol). A mistura foi agitada à ta durante lhe depois foi vertida numa mistura bem agitada de Na2S203 sat./NaHC03 sat. 1:1. As camadas foram separadas passados 30 min. A camada aquosa foi extraída três vezes com Et20. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com NaHC03 sat., salmoura, secos sobre MgS04 e concentrados sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 91:9) para produzir 69 (258,4 mg, 74%) sob a forma de um óleo transparente: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 0,80 (d, J, 6,9 Hz, 3H) , 0,87 (d, J, 6,9 Hz, 3H), 1,13 (s, 3H) , 1,19 (s, 3H) , 1,23 (s, 9H) , 2,04-2,12 (m, IH), 3,09-3,28 (m, 5H), 4,23 (s, 2H) , 4,48 (d, J = 11,9 Hz, IH), 4,55 (d, J = 11,9 Hz, IH), 4,79 (dd, J= 4,6 e 7,3 Hz, IH), 7,04-7,13 (m, 5H) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 11,7, 14,6, 20,7, 21,5, 27,9, 35,5, 42,2, 43,4, 63,3, 71,3, 73,3, 79,9, 81,5, 90,5, 94,5, 127,6, 127,7, 128,2, 138,0, 154,0, 166,2, 202, 9, 210,0; IR (film, NaCI, cm-1) 2977, 1758, 1697, 1368, 1248, 1154; LRMS (ESI) calc, para C27H3708Cl3Na [M+Na+] 617,1, encontrado 617,1; [a] 23D = -49,1 (c = 0,9, CHC13.

9-Benziloxi-3-hidroxi-4,4,6,8-tetrametil-5-oxo-7-(2,2,2-tricloroetoxicarboniloxi)-nonanoato de terc-butilo (70)

Uma cuba da bomba foi carregada com catalisador (R)-RuBlNAP (16,8 mg, 10,0 μπιοί) . HC1 (555 pL, 0,2N em MeOH) foi adicionado e a mistura foi depois sonicada duranet 15 seg. Depois, foi adicionada uma solução de 69 (59, 4 mg, 0,1 135 mmol) em MeOH (555 pL) e a mistura foi transferida para um aparelho Parr. 0 recipiente foi purgado com H2 durante 5 min e depois foi pressurizado a 1200 psi. Passadas 17 h a reacção foi devolvida à pressão atmosférica e vertida numa solução aq NaHC03 sat. A camada aquosa foi extraída três vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas MgS04 e concentradas sob uma pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 88:12) para produzir 70 (dr >20:1 conforme avaliação por análise XH NMR) (47,6 mg, 80%) sob a forma de um óleo transparente: XH NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,06 (d, J= 6,9 Hz, 3H) , 1,11 (d, J= 6,8 Hz, 3H) , 1,14 (s, 3H), LO OO 1—1 1—1 , 3H), 1, 47 (s, 9H) , 2,05- 2,12 (m 1H) , 2,35-2,40 (m , 1H) , 3,31 -3, 37 (m, 2H) , 3,51- 3,54 (m 2H) , 4,11-4,14 (m, 1H) , 4,46 (s, 2H) , 4,72 (d, J= 11,9 Hz 1H) , 4,80 (d, J= 11, 9 Hz, 1 H) , 5 , 05 (dd, J= 5,0 and 6,' Hz, 1 H), 7,27-7, 35 (: m, 5H) ; 13C NMR (100 MHz, cdci3; ) 12,0 , 15,0, 19, 3, 21,7, 28,0, 35 ,6, 37, 5, 41 ,7, 51, 8, 71 ,3 73,0 , 73,3, 80 ,6, 81,3 , 94,7, , 127, 5, 127,7, 128,3 , 138 ,2 154, 1, 172,4, 216; IR (film, NaCI, cm' 3) 3849, 2974, 2879 1758, 1701, 1454, 1368, 1248, 1152, 926, 734; LRMS (ESI) calc, para C27H3908Cl3Na [M+Na+] 619,1, encontrado 619,2; [a] 23d = -13,0 (c = 0,4, CHCI3) .

9-Benziloxi-4,4,6,8-tetrametil-5-oxo-7-(2,2,2-tricloroetoxicarboniloxi)-3-(trietilsilaniloxi)-nonanoato de terc-butilo (71) A uma solução de 70 (37,6 mg, 6,3 pmol) e imidazol (9,4 mg, 13,8 pmol) em DMF (0,4 mL) a 0 °C adicionou-se TESC1 (11,6 pL, 69,3 pmol). Passadas 3 h a mistura foi diluída com 136

NaHC03 aq sat. A camada aquosa foi extraída três vezes com hexanos. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre MgS04 e concentrados sob uma pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 93:7) para produzir, por ordem de eluição, 71 (22,9 mg, 51%) e recuperado 70 (12,9 mg, 34%) sob a forma de óleos transparentes. 7: 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ 0,66 (q, J= 7,9 Hz, 6H), 0,96 (t, J= 7,9 Hz, 9H), 1,01 (s, 3H), 1,05 (d, J= 5,2 Hz, 3H), 1,07 (d, J= 5,3 Hz, 3H) , 1,35 (s, 3H) , 1,44 (s, 9H), 2,05-2,11 (m, 2H), 2,50 (dd, J= 3,5 and 17,2 Hz, 1 H) , 3,35 (dd, J= 5,9 and 9,0 Hz, 1 H), 3,49 (dd, J= 4,0 and 9,0 Hz, 1 H), 3,53 (dd, J= 3,8 and 6,7 Hz, 1 H), 4,18 (dd, J= 3,5 and 6,5 Hz, 1 H), 4,45 (s, 2H), 4,65 (d, J= 11,9 Hz, 1 H), 4,79 (d, J= 11,9 Hz, 1 H), 4,97 (dd, J= 3,7 and 8,1 Hz, 1 H), 7,29-7,52 (m, 5H) ; 13C NMR (125 MHz, CDC13) δ 5,3, 7,3, 10, 9, 14, 9, 21,3, 22,6, 28,4, 35,9, 41, 1, 42,7, 53, 7, 71,9, 73,7, 75,7, \—1 O OO 05 O OO 95,1, 127,9, 128 ,0, 128,7, 138,6, 154,3, 171, 7, 215 ,7; IR (película, NaCI, cm"1) 2956, 2876, 1732, 1694, 1456, 1366, 1257, 1154, 1098, 988 , 835, 774, 741; LRMS (ESI) calc, para C33H5308SiCl3Na [M+Na+] 733,2, encontrado 733,3, [oí] 23d = -16,1 (c = 0,1, CHC1 3) ·

9-Benziloxi-3-(dietilmetilsilaniloxi)-7-hidroxi-4, 4,6,8 — tetrametil-5-oxo-nonanoato de terc-butilo (71a) A uma solução de 71 (22,9 mg, 3,2 pmol) em 1:1 THF/AcOH (1,4 mL) adicionou-se Zn (5,0 mg, 7,8 pmol, nano). A mistura foi sonicada durante 15 min. Foi adicionado mais Zn (5,0 mg, 7,8 pmol, nano), seguido de sonicação durante mais 137 15 min. A suspensão foi filtrada através de um chumaço de Celite, lavagem com EtOAc por várias vezes. Os filtrados foram lavados com NaHC03 sat., salmoura, secos sobre MgS04 e concentrados sob vácuo. 0 resíduo em bruto foi passado através de um tampão curto de gel de sílica, eluindo com hexano/EtOAc 4:1 para produzir 17,1 mg (99% de rendimento) de 71a sob a forma de óleo incolor: 1H NMR (400 MHz, CDC13) δ (m, 6H), 0,96 (t, J= 7,9 Hz, 9H) , 0,97 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,05 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,11 3H), 1,26 (s, 3H), 1,44 (s, 9H), 1,84-1,90 (m, 1H), 2,21 (dd, J = 6,7 and 17,0 Hz, 1H), 2,36 (dd, J = 6,7 and 17,0 Η 1 H), 3,24-3,29 (m, 1 H) , 3, 44-3, 52 (m, 2H), 3,67 (dd, J= 3,9 and 8,9 Hz, 1 H) , 4,36 (dd, J= 3,5 and 6,5 Hz, 1 H), 4,50 J=12,0 Hz, 1H), 4,54 (d, J= 12,0 Hz, 1H) , 7, 32-7,36 (m, 5H) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 5, 0, 6, 9, 9, 7, 13, 9, 20, 21, 8, 28,0, 3 6,3, 40,8, 41,5, 53,7, 72,5, 72,9, 73,2, 73,6, 80,7, 127,4, 127,5, 128,2, 138,6, 1 71,0, 221,4; IR (película, Na ( cm'1) 3502, 2959, 2875, 1731, 1683, 1456, 1366, 1154, 1098, 996, 739; LRMS (ESI) calc, para C3oH5206SiCl3Na [M+Na+] 559,3, encontrado 559,3; [a]23D = -41,0 (c = 0,4, CHC13) .

9-Benziloxi-7-(terc-butildimetilsilaniloxi)-3-(dietilmetilsilaniloxi)-4,4,6,8-tetrametil-5-oxo-nonanoato de terc-butilo (36) A uma solução de 71a (4,1 mg, 7,6 pmol) e 2,6-lutidina (10,0 pL, 43,5 mmol) em CH2C12 (0,2 mL) a -78 °C adicionou-se TBSOTf (10,0 pL, 85,8 mmol). Passadas 2 h, adicionaram-se mais ,6-lutidina (10,0 pL, 43,5 mmol) e TBSOTf (10,0 pL, 85,8 mmol). Passadas 6 h a mistura foi diluída com NaHC03 138 aq sat. A camada aquosa foi extraída três vezes com EtOAc. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre MgS04 e concentrados sob uma pressão reduzida. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia flash (gradiente hexano para hexano/EtOAc 91:9) para produzir 36 (5,4 mg, 82%) sob a forma de um óleo transparente. Os dados espectroscópicos coincidiram bem com os valores registados.

Álcool 83. A uma solução de 4,4,4-trifluoroacetato de etilo (24,0 mL, 0,164 mol) em THF-água (3:1 = V:V, 320 mL) à temperatura ambiente foram adicionados brometo de alilo (20,0 mL, 1,4 equiv) e índio (pó, -100 mesh, 25 g, 1,3 equiv) e a mistura resultante foi agitada a 48 °C durante 15 h. A mistura reaccional foi arrefecida à temperatura ambiente, temperada com HC1 aq. 2n (400 mL) e extraída com CH2CI2 (400 mL + 2 x 200 mL) . Os produtos orgânicos combinados foram secos (MgS04) , filtrados e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (hexanos -> hexanos-éter 10:1 8:1 6:1 4:1) produziu álcool 83 sob a forma de um óleo transparente (31,64 g, 85% rendimento): IR (película) 3426 (br m) , 2986 (m) , 1713 (s), 1377 (m) , 1345 (m) , 1301 (m) ,

1232 (m) , 1173 (s) , 1095 (m) , 1023 (m) , 927 (m) cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 5,82 (m, 1 H) , 5,15 (m, 3 H) , 4,17 (m, 2 H), 2 CJó LO (m, 1 H), 2,58 (d, J= 3,4 Hz, 2 H), 2,29 (dd, J= 14,2, 8,6 Hz, 1 H), 1,24 (t, J= 7,2 Hz, 3 H); : 13C NMR (100 MHz, CDC1 3) 5 172 r 08, 130, 89, 125,65 (q, J= 280 Hz), 139 120,27, 73,79 (q, J= 28 Hz), 61,55, 38,97, 35,65, 13,82; espectrometria de massa de alta resolução m/z 227,0895 [(M+H)+; calc, para C9H14O3F3: 227,0895].

Éster 84. Uma mistura de álcool 83 (16,71 g, 0,07386 mol) e piridina (15,0 mL, 2,5 equiv) foi arrefecida a -10 °C e tratada com cloreto de tionilo (11,3 mL, 2,1 equiv) lentamente ao longo de 11 min. A mistura resultante foi aquecida a 55 °C e agitada durante 12 h. A mistura reaccional foi arrefecida -5 °C, temperada com água (200 mL) e extraída com CH2CI2 (2 x 200 mL, 2 x 150 mL) . Os produtos orgânicos combinados foram lavados com NaHC03 saturado (2 x 200 mL) e salmoura (200 mL), secos (MgS04) e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (pentano/éter 15:1) rendeu o éster 84 (11, 90 g, 77% de rendimento) sob a forma de um óleo amarelo: IR (película) 2986 (w), 1731 (s), 1308 (s), 1265 (w), 1227 (m), 1197 (s), 1133 (s), 1025 (m), 920 (w), 896 (w) cm"1; NMR (400MHz, CDCI3) δ 6,36 (s, 1 H), 5,79 (ddt, J= 16,9, 10,2,6,6 Hz, 1 H) , 5,15 (dd, J, 17,1, 1,5 Hz, 1 H), 5,08 (dd, J= 10,0, 1,4 Hz, 1 H) , 4,22 (q, J = 7,1 Hz, 2 H), 3,44 (d, J = 6,5 Hz, 2 H), 1,29 (t, J = 7,1 Hz, 3 H) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 164,22, 143,37 (q, J= 29 Hz), 132,71, 123,21 (q, J, 274 Hz), 122,60 (q, J, 6 Hz), 117,32, 60,85, 30,54, 13,85; espectrometria de massa de alta resolução m/z 209,0788 [(M+H)+; calc, para C9H12O2F3: 209, 0789] . 140

85 Álcool 85. A uma solução arrefecida (-75 °C) de éster 84 (7,12 g, 0,0342 mol) em CH2C12 (120 mL) adicionou-se uam foi adicionado de DIBAL-H (75 mL, 2,2 equiv) em CH2C12 (1,0 M) e a mistura resultante foi aquecida à temperatura ambiente ao longo de 3 h. A mistura reaccional foi arrefecida a 0 °C, temperada com NH4C1 saturado (12 mL) e agitada à temperatura ambiente durante 20 min. A mistura reaccional foi diluída com éter (200 mL) , seca (MgS04) e concentrada sob vácuo. Cromatografia flash (pentano/éter 3:1 -> 1:1) rendeu o álcool 85 (5,68 g, 99% de rendimento) sob a forma de um óleo transparente: IR (película) 3331 (br s), 2929 (m), 1642 (m), 1445 (m), 1417 (w), 1348 (s), 1316 (s), 1217 (s), 1175 (s) , 1119 (s) , 1045 (m) , 985 (s) , 921 (m) , 831 (w) cm-1; 3H NMR (400 MHz, CDC13) 5 6.33 (td, J= 6.1, 1.6 Hz, 1 H) , 5.75 (ddt, J= 17.2, 10.0, 6.2 Hz, 1 H) , 5.07 (m, 2 H), 4.29 (ddd, J= 6.3, 4.3, 2.1 Hz, 2 H) , 2.95 (d, J= 6.2 Hz, 2 H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ 134.45 (q, J= 6 Hz), 133.38, 127.97 (q, J= 29 Hz), 123.76 (q, J= 271 Hz), 116.25, 57.87, 29.79

F3C

86 141

Iodeto 86. Uma solução arrefecida (0 °C) de álcool 85 (5,97 g, 0,0358 mol) em CH2CL2 (50 mL) foi tratada com PPH3 (11,17 g, 1,2 equiv) , imidazol (3,55 g, 1,5 equiv) e 12 (9,10 g, 1,1 equiv) e a mistura resultante foi agitada a 0 °C durante 10 min. A mistura reaccional foi temperada com Na2S203 saturado -NaHC03 saturado (1:1 = V:V, 200 mL) e extraído com pentano (3 x 200 mL) . Os produtos orgânicos combinados foram lavados com Na2S203 saturado -NaHC03 saturado (1:1 = V:V, 200 mL) e salmoura (100 mL), secos (MgSCL) e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (pentano) produziu o iodeto 86 (6,69 g, 68%) sob a forma de um óleo vermelho pálido: (IR Ipelícula) 3083 (w), 2982 (w), 1636 (w), 1558 (w) , 1456 (w), 1367 (w), 1317 (s), 1216 (m) , 1181 (s), 1151 (s), 1120 (s) , 989 (m) , 921 (m) , 896 (m) cm'1; 3Η NMR (400MHz, CDC13) δ 6,45 (td, J= 8,9, 1,5 Hz, 1 H) , 5,79 (ddt, J= 16,8, 10,3, 6,2 Hz, 1 H), 5,12 (m, 2 H), 3,85 (ddd, J= 8,9, 2,9, 1,4 Hz, 2 H), 3,00 (dt, J = 6,1, 1,4 Hz, 2 H) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) 132,42, 131,64 (q, J= 6 Hz), 129,63 (q, J= 29 Hz), 123,64 (q, J= 272 Hz), 117,00, 29,32, -4,27; espectrometria de massa de alta resolução m/z 298,7 [(M+Na)+; calc. para C7H8F3INa: 299, 0].

a-Hidroxioxazolidinona 88. A uma 4-benzil-3-hidroxi acetil-oxazolidin-2-ona 7 (16,28 g, 1,92 equiv) em THF (160 mL) arrefecida (-78 °C), protegida com TES, foi adicionada uma solução de LHMDS (42,0 mL, 1,73 equiv) em THF (1,0 M) gota a gota ao longo de 51 min e a mistura resultante foi 142 agitada a -78 aC ao longo de 35 min. A mistura reaccional foi tratada com uma solução do iodeto 86 (6, 69 g, 24,2 mmol) em THF (10 mL) e a mistura resultante foi deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reaccional foi temperada com NaHC03 saturado (200 mL) e extraída com EtOAc (3 x 200 mL) . Os produtos orgânicos combinados foram lavados com NH4C1 saturado (150 mL), salmoura (150 mL), secos (MgS04) e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (hexanos/EtOAc 6:1 - 3:1) produziu uma mistura de produtos da alquilação (13,6 g) que forma utilizados na reacção seguinte sem mais purificação. Uma solução de produtos da alquilação em HOAc-água-THF (3:1:1 = V:V:V, 200 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h. A mistura reaccional foi concentrada sob vácuo para remover o HOAc, temperada com NaHC03 saturado (400 mL) e extraída com EtOAc (3 x 200 mL) . Os produtos orgânicos combinados foram secos (MgS04) e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (hexanos/EtOAc 3:1 -> 2:1) rendeu a a-hidroxioxazolidinona 88 (7,55 g, 81% de rendimento para duas fases) sob a forma de um óleo transparente: [a]D25 -48,2 (c 1,08, CHC13) ; IR (película) 3486 (br s) , 3030 (m) , 2983 (s), 2925 (m) , 1790 (s) , 1682 (s), 1481 (m), 1393 (m), 1360 (m), 1217 (m), 1171 (m), 1113 (m) , 992 (m), 919 (m) , 847 (w) cm 1; 3H NMR (400 MHz, CDC1 3) δ 7,32 (m, 3 H) , 7 ,17 (m , 2H) , 6, ,33 (td, J= 7,2, 1,5 Hz, 1 H), 5, 77 (ddt, J= 16, 6, 10,1. , 6, 2 Hz , 1H), 5,08 (m, 3H) , 4 ,74 (ddt, J= =4,8, 3, 7, 4,4 i Hz, 1H) , 4, 33 (dd , J= 8,6, CO Hz , 1H), 4, 26 (dd, • J= = 9,2, 3,4 Hz, 1H), 3,42 (br d , J= 6,4 Hz , 1H), 3, 24 (dd, J= 13,5, 3,4 Hz, 1H) , 2, 99 (m, 2 H), 2,79 (dd, J= 13 ,5, 9,4 Hz , 1H), 2,70 (m , 1H) , 2,50 (m, 1H) ; 13C NMR (125 MHz, CDC13) δ 173, 93, 153, 05, 134,43, , 133 , 64, 129, 98 (q, J= = 6 : Hz), : L29, 82 (q, J= 28 Hz), 129,29 , 120 ,01, 127, 58 , 124,00 (q, J= 272 Hz), 116,34, 69, 6C 1, 67,31, 54 ,95, 143 37,78, 32,29, 29,84; espectrometria de massa de alta resolução m/z 384,1421 [(M+H)+; calc, para C19H21NO4F3: 384,1423] .

a-Hidroxiamida 89. Uma suspensão de (MeO)NHMe*HC1 (10,1 g, 5,25 equiv) em THF (100 mL) a 0 °C foi tratada com uma solução de AIMe3 (50 mL, 5,1 equiv) em tolueno (2,0 M) gota a gota e a solução transparente resultante doi agitada à temperatura ambiente durante 34 min, depois foi adicionada a uma solução arrefecida (0 °C) de a-hidoxioxazolidinona 88 (7,55 g, 19,7 mmol) em THF (70 mL) . A mistura reaccional foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 12 min. A mistura reaccional foi arrefecida a 0 °C, temperada por meio de adição lenta de ácido tartárico IN aq. (100

mL), agitada à temperatura ambiente durante 25 min e extraída com EtOAc (3 x 200 mL) . Os produtos orgânicos combinados foram secos (MgS04) e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (hexanos/EtOAc 2:1 -> 1:1) rendeu a a-hidroxiamida 89 (5,12 g, 97% de rendimento) sob a forma de um óleo transparente: [a]D25 -57.2 (c 1.03, CHCI3); IR (película) 3432 (br s), 3084 (w) , 2980 (m), 2943 (m), 1652 (s), 1464 (m), 1373 (m), 1318 (m), 1214 (m) , 1171 (m) , 1112 (m) , 991 (m) , 919 (m) , 818 (w) cm-1; ΧΗ NMR (400 MHz, CDCI3) δ 6,32 (td, J, 7,3, 1,5 Hz, 1 H) , 5,74 (ddt, J 16,9, 10,3, 6,1 Hz, 1 H), 5,05 (m, 2 H) , 4,43 (dd, J, 7,6, 3,5 Hz, 1 H), 3,70 (s, 3 H), 3,35 (br s, 1 H) , 3,24 (s, 3 H) , 2,94 144 (d, J, 6,1 Hz, 2 H), 2,59 (m, 1 H) , 2,36 (m, 1 H) ; 13C NMR (100 MHz, CDCla) δ 173, 43, 133, 68, 130 59 (q, J, 6 Hz), 129,25 (q, J, 28 Hz), 124,05 (q, J, 271 Hz), 116,17, 67,57, 61,44, 32,56, 32,38, 29,75; espectrometria de massa de alta resolução m/z 268,1161 [(M+H)+; calo, para C11H17NO3F3: 268,1161].

a-Hidroxicetona 90. A uma solução arrefecida (0 °C) de a-hidroxiamida 89 (4,87 g 18,2 mmol) em THF (150 mL) foi adicionada uma solução de MeMgBr (75 mL, 12 equiv) em éter (3,0 M) . Passadoas 5 min, a mistura reaccional foi temperada com NH4C1 saturado (250 mL) e extraída com EtOAc (5 x 200 mL). Os produtos orgânicos combinados foram secos (MgS04) e concentrados sob vácuo. Cromatografia flash (hexanos:EtOAc 4:1 -> 2:1 -> 1:2) produziu a-hidroxicetona 90 (2,16 g, 53%, 73% rendimento baseado no material de partida recuperado) sob a form de óleo transparente e o material de partida a-hidroxiamida 89 (1,30 g, 27%): [a]D25 +58,5 (c 1,30, CHCI3) ; IR (película) 3460 (br s), 3085 (w), 2984 (m), 2926 (m), 1716 (s), 1679 (m), 1641 (m), 1417 (m), 1361 (m), 1319 (s), 1247 (m), 1216 (s), 1172 (s), 1113 (s), 1020 (m) , 994 (m) , 968 (w) , 919 (m) cm-1; 3H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 6,21 (t, J, 7,0 Hz, 1 H), 5,75 (ddt, J,16,7, 10,4, 6,2 Hz, 1 H), 5,07 (m, 2 H) , 4,26 (dt, J, 7,1, 4,5 Hz, 1 H), 3,51 (d, J, 4,7 Hz, 1 H) , 2,96 (d, J, 6,1 Hz, 2 H) , 2,66 (m, 1 H), 2,42 (m, 1 H) , 2,19 (s, 3 H) ; 13C NMR (100 145 ΜΗζ, CDCla) δ 208,53, 133,43, 129,80 (q, J, 28 Hz), 129,76 (q, J, 6 Hz), 123,85 (q, J, 271 Hz), 116,32, 75,36, 31,22, 29,81, 25,11; espectrometria de massa de alta resolução m/z 223,0945 [ (M+H)+; calc, para CioH14N02F3: 223, 0946].

Exemplo 8: Abordagem da oxidação assimétrica catalítica

2) TFA, 0 °C à ta 3) benzeno, refluxo 81% para três fases 8S

OA NaH, THF 82 Ot-Bu * 1) HMPA, TMSI, CH2CI2 -20 °C to r.t --► 2) 10 mol% 0sO4, AD Miix-a MeS02NIH2l t-BuOH-H20 38 % para duas fases

90 (79%βθ)

Exemplo 9: Síntese de 21-amino-26-trifluoro-(E)-9,10-de-hidro-dEpoB 146

PMsj, H2O THF 79¾

A uma solução de 59 (50,4 mg, 90,1 μιηοΐ) em THF (1 mL) adicionou-se (PhO)2PON3 (27,2 pmol, 126 μmol) a 0 °C. Após agitação a 0 °C durante 5 min, adicionou-se DBU (16,2 pL, 108 μιηοΐ) . Após agitação a 0 °C durante 2 h, a mistura foi agitada à ta durante 20,5 h. A mistura reaccional foi diluída com EtOAc e temperada por meio de adição de água (2 mL) . Depois da separação das camadas, a camada aquosa foi extraída com EtOAc (três vezes) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04. Após concentração, o 147 resíduo foi resíduo sob alto vácuo durante 10 min para remover o DBU. Purificação por cromatografia em coluna flash (S1O2, hexano/EtOAc = 3:2) produziu azida 98 (45,6 mg, 78,0 μιηοΐ, 87%) sob a forma de um sólido incolor: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,05 (3H, s) , 1,12 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,23 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,33 (3H, s), 2,01 (1H, d, J= 5,5 Hz, OH), 2,17 (3H, s), 2,25-2,35 (1H, m), 2,41 (1H, dd, J= 15,5, 3,2 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 15,5, 9,5 Hz), 2,54-2,60 (1H, m), 2,66 (1H, d, J= 6,0 Hz), 2, 65-2,76 (1H, m) , 2,96 (1H, dd, J= 16,0, 4,2 Hz), 3,03 (1H, dd, J= 16,1, 6,7 Hz), 3,11 (1H, quintet, J= 6,8 Hz), 3,71-3,76 (1H, m) , 4,31 (1H, ddd, J= 9,2, 5,9, 3,2 Hz), 4,65 (2H, s), 5,43 (1H, dd, J = 6,0, 4,3 Hz), 5,58 (1H, ddd, J= 15,8, 6,4, 4,6 Hz), 5,66 (1H, dd, J= 15,8, 6,1 Hz), 6,23 (1H, t, J= 7,3 Hz), 6,63 (1H, s), 7,18 (1H, s) ; LRMS (ESI) calc, para C27H35F3N405SNa [M+Na+] 607,2, encontrado 607,2.

Composto 96: A uma solução da azida 98 (21,0 mg, 35,9 mol) em THF (0,6 mL) adicionou-se PMe3 (1,0 M em THF, 43,1 pL, 43,1 pmol). Após agitação à ta durante 2 min, foi adicionada água (0,1 mL) e a mistura foi agitada à ta durante 3 h. Adicionou-se PMe3 (1,0 M em THF, 7,2 pL, 7,2 pmol) e a mistura foi agitada à ta durante 1,5 h. Adicionou-se à mistura 28 % NH4OH (aq.) (54,5 pL). Após agitação durante 1 h, a mistura 148 foi purificada directamente por meio de TLC preparatório (CH2Cl2/MeOH = 100:7,5) para produzir a amina 96 (15,9 mg, 28,5 pmol, 79%), sob a forma de um sólido incolor: 148 /

2Η NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1, 05 (3H, s), 1,12 (3H, d, J= 7,0 Hz) , 1,23 (3H, d , J= 6, 8 Hz) , 1,34 (3H, s), 2,12 (3H , d ., j= 0,7 Hz) , 2,24-2, 35 (1H, m) , 2,39 (1H, dd, J= 15,4, 3 ,0 Hz) , 2,49 (1H, dd, J: = 15,4, 9,8 Hz), 2,54- 2,63 (1H, m) , 2 , 66- 2,76 (1H, m) , 2, 97 (1H, dd, J= 16,2, 4, 2 Hz), 3,03 ( 1H, dd, J= 1 6,3, 6,5 Hz) , 3,10 (1H, quintet, J: =6,8 Hz), 3, 74 (1H, dd, J= 6, 7, 3,5 Hz), 4 ,18 (2H, s), 4, 34 (1H, dd, J= 9,8, 2,9 Hz) , 5,43 (1H, dd, J= 6 ,0, 4,3 Hz) , 5,55-5,64 ( 1H, m), 5, 67 (1H, dd, J= : 15,9, 5,8 Hz), 6,24 ( 1H, brt, J= 7 ,3 Hz) , 6, 66 (1H , s) , 7,10 (1H, s) ; LRMS (ESI) calc r para C27H3 8F3N20 5S [M+H4 '] 559,2 , encontrado 559,2.

Composto 97 :

A uma solução de amina 96 (15,9 mg, 28,5 pmol) em CH3CN (0,78 mL) foi adicionado 37% HCHO (ag.) (31,4 pL, 0,143 mmol) seguido de NaBH3CN (1,0 M em THF, 85,5 pmol) e a mistura foi agitada à ta durante 20 min. AcOH (1 gota) foi adicionado e a mistura foi agitada à ta durante 40 min. A mistura foi purificada por TLC preparatório (CH2Cl2/MeOH = 100:8) para se obter o produto em bruto 97 (15,6 mg, 26,6 pmol, 93%) sob a forma de um sólido incolor: 149 XH NMR (400 ΜΗζ, CDC13) δ 1,05 (3Η, s) , 1,12 (3Η, d, J= 6,9 Hz), 1,23 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,33 (3H, s) , 2,17 (3H, s) , 2,24-2,35 (1H, m), 2,43 (1H, dd, J = 15,7, 3,6 Hz), 2,49 (1H, dd, J = 15,6, 9,1 Hz), 2,55-2, 64 (2H, m, including OH), 2,68-2,77 (1H, m) , 2,80 (3H, s) , 2,81 (3H, s) , 2,92-3,06 (2H, m) , 3,10 (1H, quintet, J = 6,8 Hz), 3,69-3,76 (1H, m) , 4,25-4,34 (1H, m) , 4,33 (2H, s) , 5,42 (1H, t, J= 5,5 Hz), 5,57 (1H, dt, J= 15,8, 6,3 Hz), 5,66 (1H, dd, J= 15,7, 6,4 Hz), 6,22 (1H, brt, J= 7,2 Hz), 6,64 (1H, s) , 7,30 (1H, s); LRMS (ESI) cale, para C29H42F3N2O5S [M+H+] 580,2, encontrado 580,2.

Compostos 94 e 95: A uma mistura de 59 (18,9 mg, 33,8 pmol) e Et3N (18,8 pL, 0,135 mmol) em CH2CI2 (1 mL) adicionou-se TsCl (12,9 mg, 67,5 pmol) e DMAP (2,1 mg, 16,9 pmol) a 0 °C. Após agitação durante 1,5 h, a mistura foi diluída com EtOAc e filtrada através de um chumaço de gel de sílica (enxaguamento com EtOAc). Após concentração, o resíduo foi purificado por TLC preparatório (hexano/EtOAc = 1/1) para se obter o tosilato 94 (8,5 mg, 11,9 pmol, 35%) e o cloreto 95 (4,3 mg, 7,44 pmol, 22%), ambos sob a forma de sólidos brancos. 150

Hz), 1,23 (3H, d, J= 6,7 Hz), 1,33 (3H, s), 1,99 (1H, d, J= 5,5 Hz), 2,10 (3H, s) , 2,25-2,34 (1H, m) 2,41 (1H, dd, J= 15,5, 3,3 Hz), 2,47 (3H, s) , 2,48 (1H, dd, J= 15,7, 9,4 Hz), 2,51-2,63 (1H, m), 2,63 (1H, d, J= 6,1 Hz, OH), 2,64-2,75 (1H, m), 2,91-3,05 (2H, m), 3,10 (1H, quintet, J = 6,8 Hz), 3,70-3, 75 (1H, m) , 4,30 (1H, ddd, J = 9,3, 6,1, 3,2 Hz), 5,32 (2H, s) , 5,41 (1H, dd, J = 5,8, 4,5 Hz), 5,57 (1H, ddd, J= 15,8, 6,4, 4,6 MHz), 5,65 (1H, dd, J= 15,8, 6, 0 Hz), 6,21 (1H, t, J= 7,1 Hz), 6,59 (1H, s), 7,18 (1H, s) , 7,37 (2H, d, J= 8,1 Hz), 7,84 (2H, d, J= 8,3 Hz); LRMS (ESI) calc, para C34H42F3N08S2Na [M+Na+] 736,2, encontrado 736,3.

Hz), 1,23 (3H, d, J= 6,7 Hz), 1,34 (3H, s), 2,00 (1H, d, J= 5,6 Hz, OH), 2,15 (3H, s), 2,25-2,35 (1H, m), 2,41 (1H, dd, J= 15,5, 3,2 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 15,5, 9,4 Hz), 2,53-2,62 151 (1Η, m), 2,69 (1H, d, J = 6,1 Hz, OH), 2, 66-2,76 (1H, m), 2,92-3,05 (2H, m), 3,11 (1H, quintet, J= 6,4 Hz), 3,70-3,76 (1H, m), 4,32 (1H, ddd, J= 9,2, 5,9, 3,1 Hz), 4,85 (2H, s), 5,43 (1H, dd, J= 6,0, 4,4 Hz), 5,59 (1H, ddd, J= 15,9, 6,4, 4,5 Hz), 5,66 (1H, dd, J= 15,9, 6,1 MHz) , 6,23 (1H, t, J= 6,8 Hz), 6,63 (1H, s), 7,20 (1H, s); LRMS (ESI) calc, para C27H35ClF3N05SNa [M+Na+] 600,2, encontrado 600,2.

Composto 99: A uma solução de 59 (6,9 mg, 12,3 mmol) em CH2C12 (0,4 mL) adicionou-se Mn02 activado (adquirido junto da Acros, 26,8 mg, 0,308 mmol). Após agitação vigorosa à ta durante 4 h, a mistura foi filtrada através de um chumaço de Celite, o qual foi enxaguado com EtOAc. Após concentração, o resíduo foi purificado por TLC preparatório (hexano/EtOAc = 1:1) para se obter 99 (2,7 mg, 4,84 pmol, 39%) sob a forma de um sólido incolor. NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,06 (3H, s) , 1,13 (3H, d, J= 7,2 Hz), 1,24 (3H, d, J= 6,9 Hz), 1,35 (3H, s), 1,96 (1H, d, J= 5,6 Hz, OH), 2,22 (3H, d, J= 0,7 Hz), 2,25-2,35 (1H, m) , 2,44 (1H, dd, J= 15,4, 3,5 Hz), 2,46 (1H, d, J= 5,9 Hz, OH), 2,51 (1H, dd, J= 15,7, 9,3 Hz), 2,57-28 (1H, m), 2,68-2,79 (1H, m), 2,96-3,03 (2H, m), 3,10 (1H, quintet, J= 6,8 Hz), 3,71-3,76 (1H, m), 4,31 (1H, ddd, J = 9,4, 6,3, 3,5

Hz), 5,45 (1H, t, J= 5,0 Hz), 5, 53-5, 63 (1H, m) , 5,67 (1H, 152 dd, J= 15,7, 6,2 Hz), 6,24 (1H, t, J= 6,6 Hz), 6,72 (1H, s), 7,57 (1H, d, J= 0,9 Hz), 10,01 (1H, d, J= 1,2 Hz).

Composto 100: A uma solução do aldeído 99 (4,6 mg, 8,25 pmol) em CH3CN (0,5 mL) a 0 °C adicionou-se MeNH2 (2,0 M em THF, 41,3 pL, 41,3 pmol). Após agitação a 0 °C durante 15 min, adicionou-se NaBH3CN (1,0 M em THF, 25 pL, 25 pmol). Após agitação a 0 °C durante 5 h, adicionou-se AcOH (3 gotas) . Após agitação a 0 °C durante 2 h, adicionou-se NH4OH 28% (aq.) (40 pL) e a mistura foi agitada à ta durante 10 min. A mistura foi purificada directamente, duas vezes, por TLC preparatório (CH2Cl2/MeOH = 100:9) para se obter 100 (2,4 mg, 4,19 pmol, 51 %) sob a forma de um sólido incolor: XH NMR (4( D0 MH: Z, CDC1; d δ 1,05 (3H, s), 1,12 (3H, d, J= = 7,0 Hz) , 1,23 (3H, d, J= 6,8 Hz) r 1,34 (3H, s), 2,13 (3H, s) , 2,25 -2,34 (1H, m) , 2 ,39 (1H r dd, i J= 15,3, 3,0 Hz), 2,49 (1H, dd, J= 15 ,3, 9,7 Hz) , 2, 56 (3H, s), 2,54 -2,64 (1H, m) , 2,66 -2,75 (1H, m) , 2, 89 (1H, d , J= 5,1 Hz) , 2,94-3,05 (2H, m) , 3,11 (1H, quintet, J = 6, , 8 Hz) , 3,74 (1H , dd, J= 6,6, 3,5 Hz) , 4,08 (2 H, s) , 4, 34 (1H, dd , J= 9, 6, 2,9 Hz), 5,43 (1H, dd, J= 6, 2, 4,1 Hz) , 5, 56- -5, 63 (1H, m), 5,66 (1H, dd, J= 15,9, 5,7 Hz), 6,24 (1H, t, J= 7,3 Hz), 6,66 (1H, s) , 7,11 (1H, s); LRMS (ESI) calc, para C28H40F3N2O5S [M+H+] 573,3, encontrado 573,3. 153

Exemplo 10: Análogos de epotilona que extraem tumors xenoenxertados até um estado não reíncidível

Por meio de uma combinação de síntese química, modelação molecular e análise espectroscópica, descobrimos que a introdução de uma ligação dupla E-9,10 (ver composto 28 seguinte) atinge uma intensificação de cerca de 10 vezes da potência do fármaco em experiências com xenoenxertos de tumores MX-1 resistentes aos fármacos (A. Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2899; incluído por referência). Na sequência da correlação de experiências in vitro e in vivo orientadas para tipos de tumor MX-1, tornou-se evidente que 28 é inerentemente mais citotóxico que 2b. No entanto, outro factor que contribui para esta observação consiste na fracção lactona na série 9,10-de-hidro, que é significativamente mais estável no ratinho e plasma humano do que os congéneres 9,10-de-hidro. A soma destes dois efeitos complementares tornou 28 capaz de conseguir uma supressão completa do tumor numa variedade de xenoenxertos a 3 mg/kg, em oposição ao regime de 30 mg/kg para 1.

EpoB (2b) 12,13-desoxiEpoB (E)-9,10-de-hidro-

(1) 12,13-desoxiEpoB (28) 26-F3-12,13- 26-F3 (E) -9,10-de- desoxiEpoB (2) hidro-12,13- desoxiEpoB (29)

Com a suspensão do tratamento reapareceram tumores palpáveis numa fracção de animais. Assim, pelo menos 154 actualmente, 28 completamente sintético não cumpriu completamente os exigentes padrões do indice terapêutico efectivo muito favorável e eliminação de tumoresa até um estado não reincidivel.

Estas descoebrtas chamaram a nossa atenção para as consequências de substituir os três hidrogénios do grupo 26-metilo de 28 por três átomos de flúor. A incorporação dos átomos de flúor neste local conduziu a uma estabilidade aperfeiçoada da ligação dupla 12,13 no sentido da oxidação (Smart, B. E. J. Fluorine Chem. 2001, 109, 3; incluído por referência). Experiências anteriores apontavam no sentido de uma atenuação da citotoxicidade por colocação de grupos polares na área da ligação dupla C12-C13 (A. Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2899; incorporado por referência) . Nesta divulgação, divulgamos a descoberta, através de síntese completamente química, das 9,10-de-hidro-26-trifluoroepotilonas, particularmente centrada no desempenho biológico único da estrutura progenitora 29. A eficácia terapêutica de dEpoB (30 mg/kg), paclitaxel (20 mg/kg) e F3-deH-dEpoB (29, 20 and 30 mg/kg) contra xenoenxertos do carcinoma da mama humano MX-1, em termos de desaparecimento do tumor e reincidência foram estudados de perto, e os resultados são apresentados no quadro 10-1. Cada grupo de dose consistia em quatro ou mais ratinhos nude. O peso corporal refere-se ao peso corporal total menos o peso do tumor. Todos os três compostos atingiram o desaparecimento do tumor. O dia 10, após a suspensão do tratamento 5/10 (dEpoB), 2/7 (Paclitaxel) e 0/4 (composto 29) dos ratinhos sofreram reincidências. O prolongamento da observação após a suspensão do tratamento com doses de 20 mg/kg de 29 revelou uma ausência alongo prazo de tumores até ao dia 27, altura em que houve reinciência de 2 em 4 155 tumores de ratinhos. Foi notável observar que o tratamento com doses de 30 mg/kg de 29 tiveram como resultado o total desaparecimento do tumor e ausência de qualquer reincidência durante mais de dois meses após a suspensão do tratamento.

Quadro 10-1. Efeito terapêutico de dEpoB, Paclitaxel e F3-deH-dEpoB contra xenoenxerto de MX-1 em ratinhos nude[al fármaco Dose (mg/kg ) Alterações do peso corporal (%) Ausência de tumor após perfusão 6 h iv Q2Dx6 Reaparecimento do tumor ao dia 10 após a administração Ao dia 4 após fim da administração Ao dia 8 após fim da administração dEpoB (1) 30 -25 3+21 - 9,1 ± 4,1 10/10 5/10 Paclitaxel 20 - 23,9 ± 37 - 8,7 ± 0,7 7/7 2/7 F3-deH- dEpoB 20 - 22,4 ± 0,6 - 7,3 ± 0,7 4/4 0/4[b] (29) 30 -27,1 ± 2,7 - 17,4 ± 5,5 4/4 0/4 [b] a tecido de xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano de 50 mg foi implantado subcutaneamente no dia 0. O tratamento com perfusão iv Q2Dx6 foi iniciado no dia 6 e parado no dia 18.

[bl Reaparecimento detectável do tumor ao dia 2/4 e 27° após a paragem do tratamento. Não houve mais reaparecimentos do tumor durante os dias 28, 64 após a paragem do tratamento [cl Não houve reincidência do tumor no espaço de 64 dias após a paragem do tratamento com a conclusão da experiência.

Baixar a dose do agente 29 para 10 mg/kg (Q2D) conduziu também ao desaparecimento do tumor MX-1, mas foram 156 necessárias nove doses para atingir este resultado (figuras 57, 58 e59A). Como desafio adicional, o tratamento por quimioterapia foi prolongado até o tamanho do tumor atingir 0,5 g (-2,3% do peso corporal). O tratamento com doses de 25 mg/kg (Q2Dx7) de 29, povocou 4/4 do desaparecimento do tumor em ratinhos. Em contraste para dEpoB, foram necessárias doses de 30 mg/kg (Q2Dx8) para induzir o desaparecimento de tumores em 3 de 4 ratinhos. No entanto, ao contrário do caso com 29, os desaparecimentos aparentes que ocorreram na sequência do tratamento com dEpoB sofreram reincidências com o tempo, (figura 59B). 0 facto de o agente 29 ter completamente suprimido o crescimento do xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano, ter diminuído os tumores e tê-los feito desaparecer por até 64 dias é impressionante. Além disso, na sequência das curas comseguidas por 29 (20 mg/kg ou 30 mg/kg de Q2Dx6, perfusão iv durante 6 h, quadro 1, anterior) o peso corporal do xenoenxertos regressou ao nível anterior ao tratamento no espaço de 12-18 dias após a suspensão do tratamento. Esta descoberta sugere ausência de lesões nos órgãos vitais. A uma dose baixa curativa de 10 mg/kg, Q2Dxl2 (figura 59B) a diminuição máxima de peso corporal foi de apenas 12%, com um aumento de peso corporal de 6% durante as três últimas doses. O peso corporal regressou ao nível do controlo anterior ao tratamento apenas três dias após o fim do tratamento. O quadro 1 anterior revela que os animais puderam subreviver a perdas de peso corporal até 27%. A margem de segurança terapêutica observada neste caso é notavelmente ampla para um agente terapêutico curativo do cancro. A eficiência terapêutica de 29 contra o xenoenxerto do carcinoma do pulmão humano (A549) e contra os xenoenxertos 157 do carcinoma do pulmão humano resistente a paclitaxel A549/Taxol foi também avaliada (figura 59C e 59D). Os xenoenxertos A54 9 do carcinoma do pulmão de crescimento lento foram tratados com 29 (25 mg/kg, Q2Dx6 duas vezes com intervalo de oito dias), o que resultou em supressão de 99,5% do tumor, com eventual erradicação total de 4 dos 4 tumores após mais duas doses (figura 59C) . É interessante verificar que o peso corporal dos ratinhos diminuiu até 35% sem qualquer letalidade e a suspensão do tratamento conduziu a uma rápida recuperação do peso corporal até quase ao nível de controlo anterior ao tratamento (figura 59C). Em contraste, um estudo paralelo com dEpoB (30 mg/kg, Q2Dx6) teve como resultado 97,6% de supressão do tumor, mas não conduziu a erradicação do tumor. Num estudo adicional de 29 (dose de 20 mg/kg) contra um xenoenxerto resistente a A549/Taxol (figura 59D) o crescimento do tumor foi totalmente suprimido e o tumor eventualmente diminuiu em 24,4% do controlo anterior ao tratamento. Durante este estudo, o peso corporal máximo diminuiu em 24%, no entanto, com a suspensão do tratamento com o fármaco, o peso corporal recuperou para 90% do controlo anterior ao tratamento. Num estudo comparativo de (E)-9,10-de-hidro-dEpoB (grupo de 28,4 mg/kg) o crescimento do tumor foi suprimido em 41,6%. Os dados pertinentes para a análise dos factores que conferem ao composto 29 o seu notável índice terapêutico em conjunto com dados comparativos pertinentes para congéneres relacionados de perto são apresentados no quadro 10-2. Pode-se notar que, em termos de citotoxicidade inerente na passagem de EpoB(2b) para dEpoB (1), se perde toda uma ordem de grandeza. Cerca de 60% desta perda é recuperada no caso de 9,10-de-hidro-dEpoB (28). Alguma desta citotoxicidade inerente é anulada na passagem para 158 29, o que pelo menos na célula é - 1,8 vezes tão citotóxico quanto o composto de referência dEpoB.

Notámos que entre as 12,13-de-hidroepotilonas, o 29 apresenta de longe a melhor estabilidade no plasma de ratinho e é também o mais estável em plasma S9 hepático humano. Notámos também que, nos dois conjuntos de isómeros 12,13-de-hidro, o padrão 26-trifluoro implica uma menor lipofilia e uma hidrossolubilidade algo aumentada (quadro 10-2, seguinte). De momento, parece que a grande vantagem do 29 advém dos aperfeiçoamentos na estabilidade no soro e biodisponibilidade.

Quadro 10-2: Perfil dos derivados dEpoB.

Com pos to Eficiê ncia da citoto xicida de p. C . máxi mo % Semi- vida estab ilida de Solub ilida de em água Lipof ilia octan ol/ág ua (pg/m L) Divis ão do regim e de doses terap êutic as (POW) Terap êutic a relat iva para perfu são iv Q2D 6h (mg/k g) ín di ce a MT D[b ] IC50 Dimi Plasm Fracç (nM) nuiç a de ão S9 [a] ão ratin hepát sem ho ico mort (min) human 159 e o (h) Epo 0.53+0 15 57 15.8 ND ND 0.6- ++ B .2 0.8 + (2b ) dEp 5.6+ 32 46 1.0+0 9.4 4.4 25-30 ++ oB 2.8 .1 ++ (D deH 0.90+ 29 84 ± 4.9+0 27 3.3 34 ++ - 0.40 6 .7 ++ dEp oB (28 ) f3- 9.3± 22 66 ± 1.6+0 8 4.1 15-20 ++ dEp 5.2 7 .4 OB (2) f3- 3.2+0. 33 212 + 10.5 + 20 3.3 10-30 ++ dEp 3 88 2.3 ++ OB + (29 ) [a] valores IC 50 SãO para células leucémicas CCRF-CEM. Os valores são o intervalo das duas experiências; todos os valores são obtidos a partir de sete pontos de concentração; ND = Não Determinado • [bl índice terapêutico relativo graduado (TI) a MTD (maximal 160 tolerated dose - dose máxima tolerada): + crescimento do tumor suprimido entre 25-50%. ++ crescimento do tumor suprimido entre 50-100%. +++ Diminuição do tumor sem desaparecimento do tumor. ++++ desaparecimento do tumor nalguns ou todos os ratinhos nude com lenta recuperação do peso corporal e/ou com reincidência nalguns ratinhos no espaço de uma semana após paragem do tratamento. +++++ desaparecimento do tumor em todos os ratinhos nude, peso corporal recuperado rapidamente e/ou sem reincidência.

As experiências terapêuticas de epotilonas contra xenoenxertos humanos em ratinhos nude, tal como MX-1, foram estudadas em Chou, T. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998, 95, 15798 e em 2001, 98, 8113.

Todos os agentes, 1-2 e 28-29, foram inicialmente descobertos através de síntese total. Foi anteriormente descrita uma síntese prática de 1 (Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2899; White et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5407; Yoshimura et al. Angew. Chem. 2003, 42, 2518; Rivkin et al. J. Org. Chem. 2002, 124, 7737; cada incluído por referência). Foram também descritas as vias do nivel da descoberta ad primeira geração para 28 e 29. Uma redução selectiva da ligação dupla 9,10 de 29 produziu 2. Os notáveis resultados obtidos a partir dos estudos dos xenoenxertos anteriormente descritos com o composto 29, actualmente o mais promissor, incitou enfaticamente um avanço para uma toxicologia mais pormenorizada e estudos farmacocinéticos em animais superiores e, a partir daí se apropriado, passagem aos ensaios clínicos em seres humanos. 161

Estas perspectivas alteraram completamente a natureza do desafio da síntese da preparação de amostras para a produção de quantidades multigramas destes novos agentes epotilona. Foi conseguida uma grande renovação das nossas vias anteriores, inicialmente concebidas e demonstradas num contexto de descoberta. Em particular, os nossos novos protocolos conseguiram grandes simplificações nas elaborações estereoespecíficas dos carbonos 3 e 26. 0 álcool 32 é preparado como anteriormente descrito (Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2899; incluído por referência) . Será evidente que nas novas sínteses, os estereocentros 6, 7 e 8 são derivados da cetona 30, trivialmente disponível e aldeído 31. Com protecção do álcool e hidrólise de acetal, o aldeído correspondente foi condensado com acetato de t-butilo para produzir um produto tipo aldol. Uma vez que esta condensação não é controlada por diastereómeros foi necessária e encontrada uma medida para solucionar este problema. A oxidação desta mistura 1:1 de epímeros C3 produziu a cetona 69. Segundo uma redução Noyori cheia de êxito (Noyori et al. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5856; incluído por referência), nas condições apresentadas, estava disponível álcool 70. A preparação do ácido 25 foi então conseguida nalgumas fases adicionais muito simples, como se mostra.

Esquema 12 Síntese do sector acilo 25. 162

25

Reagentes e condições: (a) (i)TrocCl, pir., 92%; (ii) p-Ts0H»H20, 76%; (Hi) LDA, acetato de t-butilo, THF, 80%; (iv) periodinano de Dess-Martin, 74%; (b) catalisador de

Noyori (10 mol%), MeOH/HCl, H2, 1200psi, 80%. (c) (i) TESC1, imidazol, 77%; (ii) Zn, AcOH, THF, 99%; (Hi) TBSOTf, 2,6-lutidina, 82%; quanto às fases restantes consultar Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2899.

Foi também desenvolvida uma síntese simples e facilmente escalonada para 90 (esquema 13). A síntese tem início com a reacção do cetoéster trifluoro 82 com brometo de ali'l-índio. A fase principal na síntese é a desidratação específica da posição e estereoespecífica do álcool terciário resultante para produzir 84 (com rendimento geral de 65% em duas fases) . O estereocontrolo desta reacção tem origem num "efeito dipolar", em que os grupos CF3 e C02Et são melhor representados trans relativametne à ligação dupla emergente. O iodeto 86 necessário foi obtido em duas fases a partir de 84. A alquilação do enolato de lítio, inicialmente descrito, de 7 com iodeto 86 em THF produziu 88 com rendimento de 81 % e elevada diastereosselectividade (>25:1 de). Na sequência da desprotecção do álcool secundário, o composto 88 foi avançado em três etapas até 90 como se mostra.

Esquema 13 Síntese do sector alquilo 17. 163

Reagentes e condições: (a) (i) brometo de água (3:1) 48 °C, 85%; SOCI2, pir 55 °C alilo, In, THF-, 77%; (b) (i) DIBAL-H , CH2CI2, -78°C à ta 99%; (ii) 12, CH2CI2, 74%; (c) (i) LHMDS, THF, -78 °C í THF-H2O (3:1:1) , 81% para duas fases; MeONHMe , THF, 0 °C à ta, 97 %; (ϋ ) MeMgBr (73% borsm) PPh3, imidazol, ta; (ii) HOAc-(d) (i) AlMe3, THF, 0 °C, 53%

Com 25 e 90 à disposição graças a química de fácil processamento, a via até 29 era evidente cumprindo os protocolos desenvolvidos inicialmente na nossa fase de descoberta (A. Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2899; incluído por referência) . A reacção de metátese de fecho do anel de 25 foi efectuada, utilizando o catalisador de Grubbs de segunda geração (Grubbs, R. H.; Miller, S. J.; Fu, G. C. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446; Trnka, T. M.;

Grubbs, R. H. Acc. Chem. Res. 2001, 34, 18; Alkene

Metathesis in Organic Chemistry Ed. : Furstner, A.; Springer, Berlin, (1998); Furstner, A. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000, 39, 3012; Schrock, R. R. Top. Organomet. Chem. 1998, 1, 1; cada incluído por referência). A reacção produziu em exclusivo o isómero trans 48 com 71 % de rendimento. A instalação da fracção tiazol segundo o protocolo apresentado no esquema 14 foi seguida da remoção 164 dos dois grupos de protecção sililo com piridina HF, conduzindo a 29, que foi depois convertido em 2 com elevado rendimento pela via da redução da 9,10-olefina. Quantidades grama das epotilonas estruturalmente novas foram preparadas por sintese total no contexto de um laboratório académico.

Esquema 14 Fases finais da sintese de 26-CF3-(E)-9,10-de-hidro-dEpoB (29).

Reagentes e condições: (a) EDC1, DMAP, CH2C12, 25, 0 °C à ta, 86% a partir de éster t-butílico; (b) catalisador de Grubb, tolueno, 110 °C, 20 min, 71 %; (c) (i) KHMDS, 101, THF, -78 °C to -20 °C, 70%; (ii) piridina HF, THF, 98%. Métodos gerais: Foram utilizados reagentes obtidos junto de fornecedores comerciais sem submeter a purificação adicional excepto quando indicado em contrário. Cloreto de metileno foi obtido a partir de um sistema de solvente seco (passado através de uma coluna de alumina previamente cheia) e foram utilizados sem secagem adicional. Todas as reacções sensíveis ao ar e água foram executadas em vidraria seca à chama, sob uma pressão positiva de gás de árgon pré-purifiçado. Foram registados os espectros de NMR (1H e 13C) em Bruker AMX-400 MHz ou Bruker Advance DRX-500 MHz como indicado individualmente, referenciado em relação a CDCI3 (7.27 ppm para 3H e 77,0 ppm para 13C) ou CD2CI2 165 (5,32 ppm para 1H e 53,5 ppm para 13C) . Foram obtidos espectros infravermelhos (IR) num espectrómetro Perkin-Elmer FT-IR, modelo 1600. As rotações ópticas foram obtidas num polarimetro digital JASCO, modelo DIP-370. Foi executada cromatografia em camada fina analítica em placas gel de sílica E. Merck 60 F254 . Os compostos que não eram activos aos UV foram visualizados por meio de imersão das placas em solução de para-anisaldeído e aquecimento. Foi efectuada cromatografia em camada fina preparatória utilizando o solvente indicado em placa TLC Whatman® (gel de sílica LK6F 60A)

Produtos químicos. Todas as epotilonas foram sintetizadas no laboratório (C. R. Harris, S. J. Danishefsky, J. Org. Chem. 1999, 64, 8434; D.-S. Su et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2093; Smart, B. E. J. Fluorine Chem. 2001, 109, 3; F. Yoshimura, et al. Angew. Chem. 2003, 42, 2518; Rivkin et al. J. Org. Chem. 2002, 124, 7737; cada incluído por referência) . Paclitaxel (Taxol®) e sulfato de vinblastina (VBL) foram adquiridos junto da Sigma. Todos estes compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido para as análises in vitro (excepto VBL em soro fisiológico). Para os estudos in vivo, todas as epotilonas e paclitaxel foram dissolvidos em veículo de cremofor/etanol (1:1) e depois diluídos com soro fisiológico para perfusão iv durante 6 h, pela veia caudal com um mini-cateter feito de encomenda (T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001, 98, 8113-8118; T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1998, 95, 15798-15802; cada incluído por referência). Linhas de células e tumorais. As células de leucemia linfoblástica humanas CCRF-CEM foram obtidas junto de Dr William Beck, da Universidade do Ilinóis, Chicago. As células do carcinoma da mama humano (MX-1) e carcinoma do 166 pulmão humano (A549) foram obtidas junto de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . As células A549/taxol resistentes ao paclitaxel (44 vezes resistentes) foram desenvolvidas com o método descrito anteriormente (T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001, 98, 8113-8118; incluídos por referência).

Animais. Ratinhos nude atímicos com o gene nu/nu foram obtidos em NCI, Frederick, MD e utilizados para todos os xenoenxertos de tumores humanos. Foram utilizados ratinhos nude machos com 6 semanas ou mais, pesando 20-22 g ou mais. Os fármacos foram administrados pela veia caudal durante 6 horas por perfusão i.v., utilizando um mini-cateter feito manualmente e tubo de contenção (T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001, 98, 8113-8118; incluídos por referência) . Foi utilizada uma bomba de seringa Harvard PHD2000 programável com multivia para perfusão i.v. Um volume de perfusão típico de 6 horas para cada fármaco em cremofor/etanol (1; 1) em 2,0 ml de soro fisiológico. O volume do tumor foi avaliado por medição comprimento x largura x altura (ou largura) com um compasso de calibre. Para os ratinhos nude com tumor durante a experiência, o peso corporal refere-se ao peso total menos o peso do tumor. Todos os estudos animais conduzidos de acordo com as directrizes do National Institute of Health Guide for the Care and Use of Animais e protocolo aprovado pelo Memorial Sloan-Kettering Câncer Center's Institutional Animal Care and Use Committee.

Análises de citotoxicidade. Na preparação de análises da citotoxicidade in vitro, foram cultivadas células a uma densidade inicial de 2-5 x 104 células por mililitro. Estas foram mantidas numa atmosfera humidificada de C02 a 5%, a 37 °C em meio de RPMI 1640 (GIBCO/BRL), contendo penicilina 167 (100 unidades/mL), estreptomicina (100 yg/mL, GIBCO/BRL) e 5% de FBS inactivado termicamente. Para células tumorais sólidas em monocamada (tal como A549), a citotoxicidade do fármaco foi determinada em placas de microtitulação de 96 poços, utilizando o método sulforodamina B (P. Skehan et al. J Natl. Câncer. Inst. 1990, 82, 1107-1112; incluído por referência). Foi medida da citotoxicidade para células desenvolvidas em suspensão (tal como CCRF-CEM e respectivas sublinhas) em duplicado, utilizando o método de microcultura de hidróxido de 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida)-2H-terazódio (XTT) (D. A. Scudiero et al. Câncer Res. 1988, 48, 4827-4833; incluído por referência) em placas de microtitulação de 96 poços. Para ambos os métodos, a absorvência de cada poço foi medida com um leitor de microplaca (Power Wave XS, Bio-Tek, Winooski, VT). Os dados da relação dose-efeito de 6 para 7 concentrações de cada fármaco, em duplicado, foram analisados com o gráfico de efeito médio, reocrrendo a um programa informático (T.-C. Chou, M. Hayball. CalcuSyn for Windows, Multiple-drug dose effect analyzer and manual. Biosoft, Cambridge Place, Cambridge, UK (1997); incluído por referência) .

Estabilidade das epotilonas em ratinho e fracção S9 hepática humana. O estudo de estabilidade foi efectuado com um sistema HPLC completamente automático, que consistia num sistema de preparação da amostra (Prospekt-2 (Spark Holland, Holanda) e um sistema HPLC Agilent 1100. Resumidamente, o Prospekt 2 recolheu um cartucho de extração C8 e lavou-o com acetonitrilo e água. O amostrador automático Agilent, regulado para 37 °C, recolheu 20 μΐ da amostra, carregou-se no cartucho, lavou com água, depois o Prospekt-2 separou o fluxo da fase móvel através do 168 cartucho de extracção até à coluna analítica Reliance Stable Bond C84x80 mm com pré-coluna e o eluente foi controlado a 250 nm. A fase móvel consistia em 53 ou 65% de acetonitrilo/0,1 % de ácido fórmico a 0,4 ml/min, de forma que o tempo de retenção do composto de interesse foi cerca de 6 minutos. A preparação da amostra envolveu a adição de voluems iguais de plasma ao PBS para um volume total de 300-400 μΐ, filtrado e a adição de 0,5-2 μΐ do substrato (20 mM) para atingir cerca de 30-50 mAU a 250 nm na análise HPLC. Para a fracção S9 microssoma hepático humano reunido (Xeno Tech, Lenex, KS), 20 μΐ (400 fig) ou fracção S9 foi misturada com 280 μΐ de PBS, depois foi processada como anteriormente. O período de amostragem foi controlado pelo amostrador automático e os dados da área do pico foram recolhidos para comparar a velocidade de desaparecimento da substância activa.

Determinação da partição do número de octanol-água (POW). Foi utilizado um método HPLC para estimar a partição octanol-água. Foi utilizado um sistema HPLC 1100 Agilent com uma coluna eclipse XDB C18 de 4,6x250 nm, com uma fase móvel de 60% de acetonitrilo/40% de tampão de fosfato de potássio 25 mM a pH 7,4 com um caudal de 0,8 ml por min e o eluente é controlado a 250 nm. Os padrões utilizados são álcool benzílico, acetofenona, benzofenona, naftaleno, éter difenílico e dibenzilo com POW conhecido de 1,1, 1,7, 3,2, 4,2 e 4,8 respectivamente. É utilizado dicromato de sódio para avaliar a hora zero que é 2,5 min e os tempos de retenção dos padrões são 3,9, 5,4, 10,6, 14, 18,7 e 19,8 min, respectivamente. O índice k é calculado pela fórmula k= (trt-to)/to. A regressão linear de log k vs. log POW revela uma linha recta com r2=0,966. Este gráfico é 169 utilizado para avaliar o valor POW dos análogos de epotilona.

Dados espectroscópicos para 29 (26-trifluoro-(E)-9,10-de-hidro-dEpoB): [a]D25 -54.6 (c 0.28, CHC13) ; IR (película) v 3478, 2974, 2929, 1736, 1689, 1449, 1381, 1318, 1247, 1169, 1113, 1039, 983, 867, 736 cm'1; 2H NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,05 (3H, s) , 1,12 (3H, d, J= 7,0 Hz), 1,23 (3H, d, J= 6,8 Hz), 1,37 (3H, s), 2,04 (1H, brd, J, 3,8 Hz, -OH), 2,12 (3H, s), 2,25-2,33 (1H, m), 2,38 (1H, dd, J = 15,3 and 3,0 Hz), 2,48 (1H, dd, J= 15,4 and 9,8 Hz), 2,54-2,61 (1H, m), 2,66-2,76 (1H, m), 2,71 (3H, s), 2,96 (1H, dd, J= 16,5 and 4,5 Hz), 3,02 (1H, dd, J = 16,3 and 6,5 Hz), 3,11 (1H, quintet, J = 6,7 Hz), 3,19 (1H, brs, =OH), 3,74 (1H, brs), 4,35 (1H, brd, J= 9,5 Hz), 5,42 (1H, dd, J = 6,2 and 4,1 Hz), 5,60 (1H, ddd, J = 15.8, 5,6, and 4,5 Hz), 5,66 (1H, dd, J = 15,8 and 5,8 Hz),

6,24 (1H, t, J, 7,2 Hz), 6,64 (1H, s) , 7,00 (1H, s) ; 13C NMR (100 MHz, CDC13) 5 15,1, 16,1, 17,7, 18,5, 19,3, 22,5, 28.8, 31,1, 39,6, 39,7, 45,0, 53,7, 71,4, 75,3, 76,8, 116,7, 120,2, 124,3 [q, 1J (C, F) = 273,4 Hz], 127,9, 130,2 [q, 3 J (C, F) = 6,0 Hz], 130,6 [q, 2 J(C,F) = 28,4 Hz], 132,5, 136,7, 152,0, 165,4, 170,2, 218,4; LRMS (ESI) calc, para C27H37F3N05S [M+H+] 544,2, encontrado 544,1.

Exemplo 11: Estudos in vitro

Uma experiência típica envolve o cultivo de células (por exemplo CCRF-CEM) a uma densidade inicial de 2-5xl04 células por ml. Estas são mantidas numa atmosfera humidificada de C02 a 5%, a 37 °C em meio de RPMI 1640 (GIBCO/BRL), contendo penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 pg/mL, GIBCO/BRL) e 5% de soro fetal de bovino inactivado termicamente. Para as células que foram desenvolvidas em suspensão (tal como CCRF-CEM e respectivas 170 sublinhas) a citotoxicidade foi medida utilizando o método tetrazónio de microcultura de hidróxido de 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida)-2H-terazódio (XTT) em duplicado em placas de microtitulação de 96 poços.

Para ambos os métodos, a absorvência de cada poço foi medida com um leitor de microplaca (EL- -340, Bio-Tek, Burlington, VT) . Cada passagem inclui seis ou sete concentrações dos fármacos em ensaio. Os dados sobre a relação dose-efeito são analizados com o gráfico de efeito médio.

As células T humanas CCRF-CEM, células leucémicas linfoblásticas agudas, respectivas sublinhas resistentes ao teniposido (CCRF-CEM/VM!) e sublinhas resistentes à vinblastina (CCRF-CEM/VBLioo) foram obtidas junto de W.T. Beck (Universidade de Illinois, Chicago, II).

Numa experiência típica, como anteriormente indicado, alguns dos compostos da invenção (pex. 9,10-de-hidro-EpoD) demonstraram actividade em linhas de células CCRF-CEM e linhas de células CCRF-CEM resistentes ao Taxol. Alguns destes compostos exibem IC50S entre 0,0015 e cerca de 0,120 para linhas de células CCRF-CEM. Alguns outros compostos exibem IC50 entre 0,0015 e cerca de 10,5. ALguns destes compostos apresentam também IC50s entre 0,011 a cerca de 0,80 para linhas de células CCRF-CEM/resistentes ao Taxol e alguns outros compostos exibem IC5oS entre 0,011 e cerca de 13,0 μΜ. Nalgumas formas de realização, 26F-EpoD apresenta actividades cerca de 0,0015 μΜ para linhas de células CCRF-CEM e cerca de 0,011 μΜ para linhas de células CCRF-CEM/resistentes ao Taxol (figuras 11).

Exemplo 12: Estudos ín vivo

Ratinhos nude atímicos com o gene nu/nu são tipicamente utilizados para xenoenxertos de tumor. Ratinhos suíços não 171 consanguíneos foram obtidos junto dos Laboratórios Charles River. Foram utilizados para a maioria das experiências ratinhos machos de 8 semanas de idade ou mais, pesando 22 g ou mais. 0 fármaco foi administrado pela veia caudal com perfusão iv de 6 horas. Cada ratinho individual foi confinado num tubo Falcon de restrição em polipropileno perfurado para administração do fármaco. 0 volume do tumor foi avaliado por medição comprimento x largura x altura (ou largura) com um compasso de calibre. Foi utilizada a bomba de seringa Harvard PHD2000 programável (Harvard Apparatus) com multivia para perfusão i.v. Todos os estudos animais foram conduzidos de acordo com com as directrizes do National Institute of Health Guide for the Care and Use of Animais e protocolo aprovado pelo Memorial Sloan-Kettering Câncer Center's Institutional Animal Care and Use Committee. De acordo com a política deste comité para o tratamento humano de animais com tumores, os ratinhos foram eutanaziados quando os tumores atingiram 10% do seu peso corporal total.

Como descrito na figura 8, 9,10-de-hidro-EpoB foi testado em ratinhos nude com carcinoma MX-1 da mama humano. Em geral, 9,10-de-hidro-EpoB foi formulado da seguinte forma: 9,10-de-hidro-EpoB foi dissolvido em etanol e foi adicionado cremofor (1:1) a uma concentração de 20 mg/ml. Esta solução foi diluída com soro fisiológico para perfusão i.v. A solução diluída foi utilizada para perfusão i.v. no espaço de 1 hora. O tamanho do tumor e peso corporal foram então medidos, utilizando doses de 10 mg/kg, 20 mg/kg e 30 mg/kg ao ongo de 15 dias. Foram também medidos o tamanho do tumor e peso corporal, utilizando um regime de dosagem de 0,4 mg/kg Q3Dx2, 0,5 mg/kg Q3Dx2 e 0,6 mg/kg Q3Dx5 (ver figuras 33, 34, 55 e 56) . Cada terceiro dia do regime de 172 dosagem foi utilizado para reduzir a toxicidade. Outros estudos terapêuticos de 9,10-de-hidro-EpoB são apresentados nas figuras 70 e 71 (CCRF-CEM/Taxol Q3Dx5) e nas figuras 23 e 24 (HCT-116, Q2Dx7). O composto 9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B (iso-490 epotilona) é três vezes mais eficaz do que dEpoB. A 9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona D revelou travar o crescimento do tumor após duas ou três perfusões de 10 mg/kg ou 20 mg/kg, cada uma das quais administrada dia sim, dia não. Foram obtidos melhores resultados em ratinhos utilizando uma dose de 30 mg/kg de 9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B, utilizando perfusão de 6 horas iv dia sim, dia não. 9,10-de-hidro-dEpoB a 5 mg/kg, Q3Dx9, perfusão iv purante 6 horas, demonstrou também atingir o desaparecimento do tumor em ratinhos nude com xenoenxerto MX-1, sem mortalidade dos ratinhos e apenas com perda moderada de peso corporal (figuras 74 e 75) . Este facto parece ter sido atingido por meio da administração de análogos de epotilona a cada 3 dias para reduzir a toxicidade (ver figuras 53 e 54). Em resumo, 9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B revela uma menor toxicidade em comparação com outras epotilonas, maior potência na travagem do desenvolvimento do tumor e maior estabilidade no soro. Outros estudos terapêuticos são apresentados nas figuras 17 e 18 (HCT-116, Q2Dx5 e Q3Dx5); nas figuras 19 e 20 (A549/Taxol, Q3Dx7) e nas figuras 21 e 22 (A549/Taxol, Q2Dx7). 9,10-de-hidro-EpoB, quando administrado a cada três dias 9-11 vezes, perfusão iv durante 6 h, a 0,4-0,6 mg/kg, conduziu à regressão e desaparecimento do tumor em ratinhos nude com xenoenxertos MX-1 do carcinoma da mama humano implantados (figuras 68 e 69). A administração dia sim, dia 173 não para 8 doses conduziu à supressão do crescimento do tumor, mas sem regressão do tumor. Com a administração de 9,10-de-hidro-EpoB dia sim, dia não, para 9 doses, o tumor implantado continuou a regredir moderadamente a partir do segundo até ao oitavo dia, mas o peso corporal recuperou muito lentamente a partir de 76% a 82% do controlo durante o mesmo periodo. No décimo dia, um quarto do tumor tinha desaparecido. Quando foi administrada uma dose de 0,6 mg/kg de 9,10-de-hidro-EpoB Q2Dx6, perfusão de 6 horas, a ratinhos nude com xenoenxertos HCT-116, quatro em quatro ratinhos morreram devido à toxicidade no espaço de três dias após a sexta dose. O 9,10-de-hidro-dEpoB aboliu o crescimento do tumor contra CCRF-CEM/Taxol, utilizando 0,6 mg/kg, programa Q3Dx5,x2 (figuras 70 e 71). 26-trifluoro-9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B (F3-deH-dEpoB), como se mostra nas figuras, é curativo a 20 mg/kg e 30 mg/kg, Q2Dx6, perfusão durante 6 horas, num modelo de ratinho nude implantado com xenoenxertos MX-1 do carcinoma da mama humano. Os dados sugerem também que 30 mg/kg Q2Dx6 é aproximadamente a dose m]axima tolerada. A 20 mg/kg, Q2Dx6, perfusão durante 6 horas, 26-trifluoro-9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B conduziu à diminuição do tumor e desaparecimento em quatro em quatro ratinhos nude com xenoenxertos MX-1 do carcinoma da mama humano. Não houve reincidência do tumor ao 20° dia após a parageo do tratamento. Ao 27° dia após a paragem do tratamento 2/4 reapareceram. Não houve mais reaparecimentos do tumor durante os dias 28 a 64 após a paragem do tratamento. Em comapração dEpoB a 30 mg/kg atigiu o desaparecimento do tumor no mesmo modelo de ratinho em sete de sete ratinhos, no entanto o tumor reapareceu em 2 de cinco ratinhos ao 8o dia após a paragem do tratamento. A administração de 26- 174 trifluoro-9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B a 20 mg/kg, Q2Dx6, perfusão iv durante 6 horas conduziu a uma diminuição transitória no peso corporal dos ratinhos até 26%. Esta queda do peso corporal não conduziu à morte, sugerindo ausência de toxicidade grave nos órgãos vitais. Dois dias após o último tratamento, o peso corporal começou a recuperar. No 16 dia após o tratamento, o peso corporal regressou a 109% do controlo anterior ao tratamento, sugerindo que a toxicidade, se existia, é completamente reversível. Em comparação, o dEpoB administrado a 30 mg/kg conduziu a uma diminuição de 31% do peso corporal sem letalidade.

Quando 26-trifluoro-9,10-de-hidro-12,13-desoxiepotilona B foi administrada a 30 mg/kg, Q2Dx6, perfusão iv durante 6 horas, o desaparecimento do tumor foi 2 a 3 dias mais cedo do que com a dose de 20 mg/kg. O peso corporal diminuiu 27% com esta dose superior e persistiu 4 dias sem provocar letalidade, confirmando ausência de toxicidade grave para os órgãos vitais. Quatro dias após o último tratamento a 30 mg/kg, o peso corporal começou a recuperar. No 16 dia após o tratamento, o peso corporal regressou a 98% do controlo anterior ao tratamento, confirmando novamente a reversibilidade da toxicidade. 0 tratamento com 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB a 20 mg/kg e 30 mg/kg conduziu ao desaparecimento total do tumor e não foi observada reincidência passados 62 dias com a dose de 30 mg/kg. O desaparecimento do tumor foi também conseguido a lOmg/kg, por meio da administração de 9 doses com mais três doses adicionais (figura 57) . Foi observada apenas uma perda de peso corporal mínima a 10 mg/kg de 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB (figura 58). Não foi observada mais perda de peso corporal com a continuação do tratamento. 175 A figura 59 resume o efeito de 26-F3-9,10-deH-dEpo B (e outras epotilonas) contra o xenoenxerto MX-1, A. A baixa dosagem; B. contra um tumor grande; contra xenoenxerto A549 do carcinoma do pulmão, C; e contra xenoenxerto A549/Taxol do carcinoma do pulmão resistente ao Taxol, D. A figura 61 enumera a potência in vitro de epotilonas modificadas C-21 contra CCRF-CEM, CCRF-CEMNBL e CCRF-CEM/Taxol. A figura 62 mostra o efeito terapêutico de 26-F3-9,10-deH-dEpoB (15mg/kg e 30mg/kg) e Taxol (20mg/kg) Q2Dx8, perfusão iv durante 6 horas contra xenoenxerto CCRF-CEM da leucemia linfoblástica das células T humana. Foram observadas diminuições do peso corporal semelhantes em todos os três grupos de tratamento (figura 63) .

Tratamento de xenoenxerto CCRF-CEM/Taxol (resistente ao Taxol) com 26-F3-9,10-deH-dEpo B, 15mg/kg atingiu 1/3 de desaparecimento do tumor e 30mg/kg atingiu ¾ de desaparecimento do tumor. 0 mesmo tratamento com Taxol, 20mg/kg proporcionou apenas supressão parcial do crescimento do tumor e não conseguiu atingir a regressão do tumor (figura 64) . As alterações do peso corporal durante esta experiência encontram-se na figura 65. 0 tratamento do xenoenxerto HCT-116 do carcinoma do cólon humano com 26-F3-9,10-deH-dEpo B (20mg/kg) atingiu uma eficácia semelhante à do Taxol (20mg/kg). Contudo, F3-deH-dEpo B a 30mg/kg proporcionou melhor efeito terapêutico com 2/4 de desaparecimento do tumor após 5 doses (figura 66). As alterações do peso corporal durante esta experiência encontram-se na figura 67. Os efeitos terapêuticos de F3-9,10-dehydro-dEpoF contra xenoenxertos MX-1 a doses diferentes (5-30mg/kg) com perfusão iv durante 6 horas e injecção iv encontram-se nas figuras 76 e 77. 176

Conclusão. A modificação 9,10-de-hidro, a 26-trifluoro ou ambas de dEpoB têm como resultado um aumento 1,5 a 5 vezes da citotoxicidade in vitro e um aumento 2 a 5 vezes na semi-vida em plasma de ratinho in vitro. Utilizando modelos de xenoenxerto de tumor sólido humano em ratinhos nude e utilizando a técnica de perfusão iv durante 6 horas Q2Dx5-9 pela veia caudal às doses máximas toleradas, foi avaliada a eficácia anti-tumor e toxicidade de 9,10-de-hidroepotilonas. A capacidade de atingir uma supressão completa do crescimento do tumor, regressão do tumor e desaparecimento permitiu que investigação mais aprofundada determinasse a taxa de reincidências e taxa de cura após paragem do tratamento. 9,10-de-hidro-dEpoB, a mais potente epotilona conhecida in vitro, embora muito eficaz revelou uma estreita margem de segurança terapêutica in vivo. 9,10-de-hidro-dEpoB a 4 mg/kg, 9,10-de-hidro-EpoB a 0,4 mg/kg e 21-hidroxi-9,10-de-hidro-dEpoB a 3 mg/kg todos suprimiram intensamente o crescimento do tumor durante um período e atingiram alguma regressão do tumor e alguns atingiram o desaparecimento do tumor. dEpoB a 30 mg/kg, 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB a 20 mg/kg e paclitaxel a 20 mg/kg revelaram todos uma forte supressão do crescimento do tumor e atingiram a regressão do tumor e desapaercimento do xenoenxerto MX-1 do carcinoma da mama humano em todos os ratinhos testados. 26-trifluoro-9,10-de-hidro-dEpoB, em comparação com dEpoB ou paclitaxel atingiram uma cura a longo prazo sem reincidência do tumor e revelaram uma recuperação igualmente rápida do peso corporal para o nível de controlo anterior ao tratamento.

Exemplo 13. Síntese de análogos da ciclopropil-epotilona 177

^(R^Me.R^H), 103 (R1=CF3 R^H), 104(R1=Me,R^OTBS), 105(R'^CF3, R2=OTBS)

110(R1=We,Rz=H) 111 (R1=CF3, R2 = H) IttíR^e,^ = OTBS) 113 (R1=CF3, R^TBS) R1 = Me,R2 =H, (106) R1 = CF3, R2=H(10^ R1 = Me,R2 =OTBS{108) R1=CF3, R^TBS (109)

THF(1:3) ' I 0 "C à ta |

R1 = Me, RZ = H,( 114) R1 = CF3, F^ = H(115) R1 = Me, R? = OH (116) R1=CFs,R2=OH(117) R1=Me.R2=H(118) R1 =CF3, R? ~ H (119) R1 = Me, R2= OH (120) R^CFj, R^OH (121) 178

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não é parte integrante do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: us 6242469 B [0003] [0043] us 6284781 B [0003] [0043] us 6300355 B [0003] [0043] us 6369234 B [0003] [0043] us 6204388 B [0003] [0043] us 6316630 B [0003] [0043] us 797027 A [ 0043] us 09796959 A [0043] us 10236135 A [0043] wo 9901124 A [0043] wo 9943653 A [0043] wo 0164650 A [0043] us 5977163 A [0057]

Literatura, não relacionada com patentes, citada na descrição: 179 • Hõfle et al. Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1996, vol. 35, 1567 • Bioreversible Carriers in Drug Design. American

Pharmaceutical Association and Pergamon Press, J. Antibiot, 1996, vol. 49, 560 1987 • Bollag et al. Câncer Res., 1995, vol. 55, 2325 • Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1975

Essayan et al. J. Allergy Clin. Immunol., 1996, vol. 97, 42 • The Merck Manual. 1999 • Giannakakou et al. J. Biol. Chem, 1997, vol. 272, 17118 • Ojima, I.; Inoue, T. ; Chakravarty, S. J. Fluorine

Chem., 1999, vol. 97

Kowalski et al. Mol. Biol. Cell, 1995, vol. 6, 2137 • Newman, R. A. ; Yang, J. ; Finlay, M. R. V. ; Cabral, F. ; Vourloumis, D. ; Stephens, L. C. ; Troncoso, P. ; Wu, X. ; Logothetis, C. J. ; Nicolaou, K. C. Câncer Chemother. Pharmacol., 2001, vol. 48, 319-326 • Su et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, vol. 36, 1093 • Harris et al. J. Org. Chem, 1999, vol. 64, 8434 • Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1998, vol. 95, 9642, 15798 • Biswas, K. ; Lin, H. ; Njardarson, J. T. ; Chappell, M.D. ; Chou, T.C. ; Guan, Y. ; Tong, W. P. ; He, L.; Horwitz, S.B. ; Danishefsky, S.J. J. Am. Chem. Soc., 2002, vol. 124 (33), 9825-9832 180 • Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 2001, vol. 98, 8113 • Scudiero et al. Câncer Res, 1988, vol. 46, 4827-4833 • Rivkin, A. ; Njardarson, J. T. ; Biswas, K ; Chou, T.C. ; Danishefsky, S. J. J. Org. Chem, 2002, vol. 67, 7737-7740 • Chou et al. Adv. Enzyme Regul., 1984, vol. 22, 27-55 • Chappell, M. D. ; Stachel, S. J. ; Lee, C. B. ; Danishefsky, S. J. Org. Lett., 2000, vol. 2 (11), 1633-1636 • Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, vol. 95, 15798-15802 • Su, D.-S. et al. Angew. Chem. Int. Ed., 1997, vol. 36, 2093 • Biswas, K. ; Lin, H. ; Njardarson, J. T. ; Chappell, M.D. ; Chou, T.C. ; Guan, Y. ; Tong, W. P. ; He, L. ; Horwitz, S.B. ; Danishefsky, S.J. J. Am. Chem. Soc. 2002, vol. 124 (33), 9825-9832 • Chou, T. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 1998, vol. 95, 15798 • Thomas Sorrell. Organic Chemistry. University Science Books, 1999 • Grubbs, R. H. ; Miller, S. J. ; Fu, G. C. Acc. Chem. Res, 1995, vol. 28, 446 • Protective Groups in Organic Synthesis. John Wiley & Sons, 1999 • Trnka, T. M. ; Grubbs, R. H. Acc. Chem. Res., 2001, vol. 34, 18 • Bayley, H. Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier, 1983 181 • Alkene Metathesis in Organic Chemistry. Springer, 1998 • S. M. Berge et al. J. Pharmaceutical Sciences, 1977, vol. 66, 1-19 • Furstner, A. Angew. Chem. Int Ed. Engl., 2000, vol. 39, 3012 • T. Higuchi ; V. Stella. Pro-drugs as Novel Delivery Systems. A.C.S. Symposium Series, vol. 14 • Schrock, R. R. Top. Organomet. Chem., 1998, vol. 1, 1

Keck, G. E. ; Yates, J. B. J. Am. Chem. Soc., 1982, vol. 104, 5829 • Rivkin et al. J. Org. Chem, 2002, vol. 124, 7737 • Curran, D. P. Synthesis, 1988, 417-439 • Noyori et al. J. Am. Chem. Soc, 1987, vol. 109, 5856 • SYNTHESIS, 489 • Newman, R. A. ; Yang, J. ; Finlay, M. R. V. ; Cabral, F. ; Vourloumis, D. ; Stephens, L. C. ; Troncoso, P. ; Wu, X. ; Logothetis, C. J. ; Nicolaou, K. C. Câncer Chemother. PharmacoL, 2001, vol. 48, 319-326 • Grubbs, R. H. ; Miller, S. J. ; Fu, G. C. Acc. Chem. Res., 1995, vol. 28, 446 • C. R. Harris ; S. J. Danishefsky. J. Org. Chem., 1999, vol. 64, 8434 • D.-S. Su et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, vol. 36, 2093 • Meng, D. ; Bertinato, P. ; Balog, A. ; Su, D.-S. ;

Kamenecka, T. ; Sorensen, E. J. ; Danishefsky, S. J. J. Am. Chem. Soc, 1997, vol. 119, 10073 • F. Yoshimura et al. Angew. Chem, 2003, vol. 42, 2518 182 • A. Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc, 2003, vol. 125, 2899 • Rivkin et al. J. Org. Chem., 2002, vol. 124, 7737 • Smart, B. E. J. Fluorine Chem., 2001, vol. 109, 3 • T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 2001, vol. 98, 8113-8118 • A. Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc., 2003, vol. 125, 2899 • T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1998, vol. 95, 15798-15802 • PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., 2001, vol. 98, 8113 • T.-C. Chou et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001, vol. 98, 8113-8118 • Rivkin et al. J. Am. Chem. Soc, 2003, vol. 125, 2899 • P. Skehan et al. J Natl. Câncer. Inst., 1990, vol. 82, 1107-1112 • White et al. J. Am. Chem. Soc., 2001, vol. 123, 5407 • D. A. Scudiero et al. Câncer Res, 1988, vol. 48, 4827-4833 • Yoshimura et al. Angew. Chem, 2003, vol. 42, 2518 • CalcuSyn for Windows. T.-C. Chou ; M. Hayball.

Multiple-drug dose effect analyzer and manual. 1997

Lisboa, 16/02/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1· Método para a preparação de um composto de fórmula:

em que R4 é hidrogénio ou um alquilo-Ci-6 de cadeia curta; R2 é um grupo arilo-C3-i4, heteroarilo-C3-i4, aril-C3-i4-alquilo-Ci-20 ou heteroaril-C3-i4alquilo-Ci-2o substituído ou não substituído; R5 e R6 são cada um independentemente do outro hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C(R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquiloCi-6 de cadeia curta; Rb é independentemente para cada ocorrência hidrogénio; halogénio; -0RB; -SRB·; -N(RB.)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y, em que Y é F, Br, Cl, I, 0Rb., NHRb., N(Rb.)2 ou SRb.; - C(0)0RB-; -C (0) Rb· ; -C0N-HRb. ; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB·; NRB. (C=0) RB. ; N3; N2Rb·; acetal cíclico; ou alifático C3 _2o, heteroalifático C1-20, arilo C3-i4 ou heteroarilo C3-i4, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB·; -SRB>; -N(RB0 2; - C (0) 0RB'; -C(0)Rb·; -C0NHRb.; -0(C=0)Rb.; -0(C-0)0Rb.; NRb1 (C=0) RB'; N3; N2RB’; acetal cíclico; ou grupo alifático Ci-2(u heteroalifático Ci_2(u arilo C3-i4 ou heteroarilo C3-i4, cíclico ou acíclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de 2 fotoafinidade ou radioactivos; em que cada ocorrência de Rb· é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo alifático Ci-20, heteroalifático Ci-20, arilo C3-14, heteroarilo C3-i4, arilC3-i4alquiloCi-20, arilC3-i4alceniloCi-2o, arilC3-i4alciniloCi-2o, heteroarilC3-i4alquiloCi-2o, heteroarilC3-i4alceniloCi-2o ou heteroarilC3-14alciniloCi-2o linear ou ramificado, substituído ou não substituído, cíclico ou acíclico e m é 1, 2, 3 ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: submeter um composto de fórmula:

a condições de uma reacção de metátese de fecho do anel.

2. Método para a preparação de um composto de fórmula:

em que Ri é hidrogénio ou um alquilo-Ci-6 de cadeia curta; R2 é um grupo arilo-C3-i4, heteroarilo-C3_i4, aril-C3_i4-alquilo-Ci-2o ou heteroaril-C3-i4alquilo-Ci-2o substituído ou não substituído; R5 e Rê são cada um independentemente do outro hidrogénio ou um grupo de protecção; 3 X é 0, S, C (R7) 2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquiloCi-6 de cadeia curta; Rb é, independentemente para cada ocorrência, hidrogénio, halogénio -0RB.; -SRB-; -N(Rb,)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y em que Y é F, Br, Cl, I, 0RB·, NHRB·, N(RB.)2 ou SRb·; -C(0)0Rb·; -C(0)Rb.; -CON-HRb. ; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB.; -NRb. (C=0)Rb·; N3; N2Rb·; acetal cíclico; ou alifático Cibo, heteroalifático Ci-20, arilo C3-14 ou heteroarilo C3-14, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0Rb·; -SRb·; -N(Rb<)2; -C(0)0RB',· -C(0)Rb.; -CONHRb· ; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0Rb·; NRb· (C=0) Rb· ; N3; N2Rb·; acetal cíclico ou grupo alifático Ci_20, heteroalifático Ci_20, arilo C3-14 ou heteroarilo C3-i4, cíclica ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de Rb> é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, uma grupo alifático Ci-20, heteroalifático Cibo, arilo C3-14, heteroarilo C3-14, arilC3-i4alquiloCi-2o, arilC3-i4alceniloCi-2o, arilC3-i4alciniloCi-2o, heteroarilC3-14alquiloCi-2o, heteroarilC3-i4alceniloCi-20 ou heteroarilC3-i4alciniloCi_2o linear ou ramificado, substituído ou não substituído, cíclico ou aciclico e m é 1, 2, 3 ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: submeter um composto de fórmula: 4

a condições de uma reacção de metátese de fecho do anel.

3. Método da reivindicação 1, em que as condições de uma reacção de metátese de fecho do anel incluem um catalisador de Grubbs.

4. Método da reivindicação 3, em que o catalisador de Grubbs é cloreto de triciclo-hexilfosfina[1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-4,5-di-hidroimidazol-2- ilideno][benzilideno]ruténio (IV)

5. Método para a preparação de um composto de fórmula:

em que Ri é hidrogénio ou um alquilo-Ci-6 de cadeia curta; R2 é um grupo arilo-C3-i4, heteroarilo-C3_i4, aril-C3-i4-alquilo-Ci-2o ou heteroaril-C3-i4alquilo-Ci_2o substituído ou não substituído; Rs e R6 são cada um independentemente do outro hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C(R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquiloCi-6 de cadeia curta; -CHY2, -CH2Y em Rb é, independentemente para cada ocorrência, hidrogénio, halogénio -0RB·; -SRB·; -N(RB-)2; -CY3, 5 que Y é F, Br, Cl, I, 0RB-, NHRb., N(RB.)2 OU SRB-; -C (O) ORB'; -C (0) RB'; -C0NHRb.; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB.; - NRb· (C=0) Rb. ; N3; N2Rb.; acetal cíclico; ou alifático C2-20r heteroalifatico Ci-2o, arilo C3-14 ou heteroarilo C3-14, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0Rb·; -SRb>; -N(RBr)2; -C (0) 0RB'; -C (0) Rb-; -C0NHRb,; -0(C=0)Rb.; -0 (C=0) 0Rb. ; NRB' (C=0)Rb>; N3; N2Rb>; acetal cíclico ou grupo alifático Ci-20, heteroalifático Ci-20, arilo C3-14 ou heteroarilo C3-14, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de Rb- é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo alifático C1-20, heteroalifátici Ci-20, arilo C3-14, heteroarilo C3-14, arilC3-i4alquiloCi-2(u arilC3-i4alceniloCi-2o, arilC3-i4alciniloCi-2o, heteroarilC3-i4alquiloCi-20f heteroarilC3-i4alceniloCi-2o ou heteroarilC3-i4alciniloCi-2o linear ou ramificado, substituído ou não substituído, cíclico ou aciclico e m é 1, 2, 3 ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: redução de um composto de fórmula:

6. Método para a preparação de um composto de fórmula: 6

em que Ri é hidrogénio ou um alquilo-Ci-6 de cadeia curta; R2 é um grupo arilo-C3-i4, heteroarilo-C3-i4, arilo-C3-i4-alquilo-Ci-20 ou heteroaril-C3-i4alquilo-Ci-2o substituído ou não substituído; R5 e R6 são cada um independentemente do outro hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C(R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquiloCi-6 de cadeia curta; Rb é, independentemente para cada ocorrência, hidrogénio, halogénio -0RB.; -SRB.; -N(RB-)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y em que Y é F, Br, Cl, I, 0RB-, NHRB·, N(RB.)2 ou SRB·; -C (0) 0RB'; -C (0) Rb. ; -C0N-HRB,; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB·; NRb> (C=0) RB'; N3; N2RB',· acetal cíclico; ou alifático Ci-20/ heteroalifático Ci-2o^ arilo C3-i4 ou heteroarilo C3-14, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -ORb-; -SRB'; -N(RB')2; - C (0) 0RB'; -C(0)Rb·; -C0NHRb.; -0(C=0)Rb-; -0 (C=0) 0RB. ; NRb> (C=0) RB'; N3; N2RB',· acetal cíclico; ou grupo alifático C1-20, heteroalifático C1-20, arilo C3-14 ou heteroarilo C3-14, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de Rb- é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo alifático C1-20; heteroalifático Ci- 7 20, arilo C3-14, heteroarilo ¢3-14, arilC3-i4alquiloCi-20, arilC3-i4alceniloCi-2o, arilC3-i4alciniloCi-2o, heteroarilC3-i4alquiloCi-2o, heteroarilC3-i4alceniloCi-2o ou heteroarilC3-i4alciniloCi-2o linear ou ramificado, substituído ou não substituído, cíclico ou acíclico e m é 1, 2, 3 ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: oxidação de um composto de fórmula:

7. Método para a preparação de um composto de fórmula:

em que Ri é hidrogénio ou um alquilo-Ci-6 de cadeia curta; R2 é um grupo arilo-C3-i4, heteroarilo-C3-i4, aril-C3_i4-alquilo-Ci-2o ou heteroaril-C3-i4alquilo-Ci-2o substituído ou não substituído; R5 e R6 são cada um independentemente do outro hidrogénio ou um grupo de protecção; X é 0, S, C (R7)2 ou NR7, em que cada ocorrência de R7 é independentemente hidrogénio ou alquiloCi-6 de cadeia curta; RB é, independentemente para cada ocorrência, hidrogénio, halogénio -0RB·; -SRB·; -N(RB-)2; -CY3, -CHY2, -CH2Y em 8 que Y é F, Br, Cl, I, 0RB-, NHRB', N(RB.)2 ou SRB-; C (O) ORb- ; -C (O) Rb- ; -CONHRB>; -0(C=0)RB-; -0(C=0)0Rb.; - NRB' (C=0)Rb·; N3; N2Rb·; acetal cíclico; ou alifático Ci_ 20, heteroalifático Ci_2o, arilo C3_i4 ou heteroarilo C3_ i4, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, opcionalmente substituído por um ou mais do que um de entre hidrogénio; halogénio; -0RB·; -SRB>; -N(RB02; -C (0) 0RB-; -C (0) RB-; -C0NHRB·; -0(C=0)RB.; -0(C=0)0RB.; NRB' (C=0)Rb>; N3; N2Rb·; acetal cíclico: ou grupo alifático Ci-2o, heteroalifático Ci-20, arilo C3-i4 ou heteroarilo C3-14, cíclico ou aciclico, linear ou ramificado, substituído ou não substituído; ou é uma epotilona, desoxiepotilona ou respectivos análogos, ou é um polímero; hidrato de carbono; marcador de fotoafinidade ou radioactivo, em que cada ocorrência de Rb· é independentemente hidrogénio, um grupo de protecção, um grupo alifático Ci-2o, heteroalifático Ci-2o, arilo C3-i4, heteroarilo C3-i4, arilC3-i4alquiloCi-20, arilC3-i4alceniloCi-2o, arilC3-i4alciniloCi-2o, heteroarilC3-i4alquiloCi-2o, heteroarilC3-i4alceniloCi-2o ou heteroarilC3-i4alciniloCi-2o linear ou ramificado, substituído ou não substituído, cíclico ou aciclico e m é 1, 2, 3 ou 4, método esse que inclui as seguintes etapas: condensação de um óxido de fosfina ou reagente de Witting com a estrutura: R”

o em que R' e R" são independentemente alquilo-Ci-e de cadeia linear ou ramificada ou um fenilo, arilo, alcoxi ou ariloxi substituído ou não substituído e X é um contra-anião tal como cloro ou bromo com uma cetona, com a estrutura:

Lisboa 16/02/2010