SK1102004A3 - Liečivo na liečenie proliferačných ochorení a farmaceutická kompozícia na liečenie rakoviny - Google Patents

Description

LIEČIVO ΝΑ LIEČENIE PROLIFERAČNÝCH OCHORENÍ A FARMACEUTICKÁ KOMPOZÍCIA NA LIEČENIE RAKOVINY

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka použitia (1) aspoň jedného antiproliferačného prostriedku a (2) zlúčeniny ďalej uvedeného všeobecného vzorca I na výrobu liečiva na liečenie proliferačných ochorení vrátane rakoviny. Vynález sa tiež týka farmaceutickej kompozície na liečenie rakoviny obsahujúcej aspoň jeden antiproliferačný prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I uvedenú vyššie.

Táto patentová prihláška má právo prednosti z US predbežnej patentovej prihlášky č. 60/316 369 podanej 31. augusta 2001, ktorá sa tu zahrňuje v plnom znení formou odkazu.

Doterajší stav techniky

V celom texte tejto patentovej prihlášky sa cituje niekoľko odkazov na literatúru a patenty. Každý z týchto odkazov sa tu zahrňuje formou citácie tak, ako keby tu bol opísaný v plnom znení.

Nekontrolovaná proliferácia je charakteristickým znakom rakovinových buniek. V priebehu posledných dvoch desaťročí sa stále viac stáva zrejmým, že v priebehu vzniku tumoru, molekuly ktoré priamo ovládajú priebeh bunkového cyklu hromadia defekty. Tieto defekty môžu mať za následok stratu riadenej kontroly a/alebo nesprávnu aktiváciu molekúl riadiacich priebeh bunkového cyklu (drivers”), cyklíndependentných kináz (CDK). Nesprávna regulácia funkcie CDK nastáva veľmi často v hlavných typoch solidných nádorov (vrátane tumoru prsníka, hrubého čreva, NSCL, prostaty, žalúdka, močového mechúra a vaječníkov). Preto vykazujú inhibítory cyklíndependentných kináz a priebehu bunkového cyklu možnosť schopnosti plniť značné terapeutické potreby.

Cyklín-dependentné kinázy sú serín/treonín proteínkinázy, ktoré prevádzajú signály, ktoré riadia bunkový cyklus a proliferáciu buniek. CDK sú multisubjektové enzýmy, ktoré sa skladajú z aspoň jednej katalytickej subjednotky a regulačnej (cyklínovej) subjednotky (prehľadný referát pozri (1)). Dosiaľ bolo identifikovaných 9 CDK a viac ako 10 cyklínových subjednotiek, ktoré možno kombinovať za vytvorenia viac ako 15 aktívnych kinázových komplexov. V normálnych bunkách možno mnohé z týchto enzýmov zaradiť medzi enzýmy fázy G1, S alebo G2/M, ktoré plnia rôzne úlohy v priebehu bunkového cyklu. CDK zaisťujú fosforyláciu a modulujú aktivitu rôznych bunkových proteinov, ktoré zahrňujú supresory tumoru (napríklad RB, p53), transkripčné faktory (napríklad E2F-DP1, RNA, pol II), replikačné faktory (napríklad DNA pol a, replikačný proteín A) a organizačné faktory, ktoré ovplyvňujú bunkové a chromatínové štruktúry (napríklad histón H1, lamín A, MAP4). Aktivita CDK sa reguluje množstvom koordinovaných mechanizmov, ktoré zahrňujú transkripciu a transláciu závisiacu od bunkového cyklu, proteolýzu závisiacu od bunkového cyklu, subcelulárnu lokalizáciu, posttranslačné modifikácie a interakciu s CDK inhibítorovými proteínmi (CKI). Bolo by veľmi vítané umožniť identifikáciu prostriedkov, ktoré modulujú aktivitu CDK pri spôsobe liečby aberantnej bunkovej proliferácie spojenej s malígnym rastom.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je použitie (1) aspoň jedného antiproliferačného prostriedku a (2) zlúčeniny všeobecného vzorca I

(D

a ich farmaceutický prijateľných solí, v ktorom

R-ι a R₂ sú nezávisle od seba atóm vodíka, atóm fluóru alebo alkylová skupina,

R₃ je arylová skupina alebo heteroarylová skupina,

R₄ je atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina alebo

CO-alkylová skupina, CO-cykloalkylová skupina, CO-arylová skupina, COalkyl-cykloalkylová skupina, CO-alkyl-arylová skupina, CO-heteroarylová skupina, CO-alkyl-heteroarylová skupina, CO-heterocykloalkylová skupina, CO-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

CONH-alkylová skupina, CONH-cykloalkylová skupina, CONH-arylová skupina, CONH-alkyl-cykloalkylová skupina, CONH-alkyl-arylová skupina, CONH-heteroarylová skupina, CONH-alkyl-heteroarylová skupina, CONHheterocykloalkylová skupina, CONH-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

COO-alkylová skupina, COO-cykloalkylová skupina, COO-arylová skupina, COO-alkyl-cykloalkylová skupina, COO-alkyl-arylová skupina, COOheteroarylová skupina, COO-alkyl-heteroarylová skupina, COOheterocykloalkylová skupina, COO-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

SO₂-alkylová skupina, SO2-cykloalkylová skupina, SO2-arylová skupina, SO₂alkyl-cykloalkylová skupina, SO₂-alkyl-arylová skupina, SO2-heteroarylová skupina, SO₂-alkyl-heteroarylová skupina, SO₂-heterocykloalkylová skupina, SO₂-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NCN)NH-alkylová skupina, C(NCN)NH-cykloalkylová skupina, C(NCN)NHarylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NCN)NH-alkylarylová skupina, C(NCN)NH-heteroarylová skupina, C(NCN)NH-alkylheteroarylová skupina, C(NCN)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NCN)NHalkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NNO)NH-alkylová skupina, C(NNO)NH-cykloalkylová skupina, C(NNO)NH arylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NNO)NH-alkylarylová skupina, C(NNO)NH-heteroarylová skupina, C(NNO)NH-alkylheteroarylová skupina, C(NNO)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NNO)NHalkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NH)NH-alkylová skupina, C(NH)NH-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-arylová skupina, C(NH)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkyl-arylová skupina, C(NH)NH-heteroarylová skupina, C(NH)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkylheterocykloalkylová skupina alebo

C(NH)NHCO-alkylová skupina, C(NH)NHCO-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-arylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-cykloalkylová skupina,

C(NH)NHCO-alkyl-arylová skupina, C(NH)NHCO-heteroarylová skupina,

C(NH)NHCO-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NORe)NH-alkylová skupina, C(NOR₆)NH-cykloalkylová skupina, C(NOR₆)NH-arylová skupina, C(NOR6)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NOR6)NH-alkyl-arylová skupina, C(NOR6)NH-heteroarylová skupina, C(NOR₆)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NOR6)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NOR6)NH-alkyl-heterocvkloalkylová skupina,

R₅ je atóm vodíka alebo alkylová skupina,

R₆ je atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, m je celé číslo od 0 do 2 a n je celé číslo od 1 do 3, na výrobu liečiva na liečenie proliferačných ochorení, vrátane rakoviny.

Predmetom tohto vynálezu je tiež farmaceutická kompozícia na liečenie rakoviny, ktorej podstata spočíva vtom, že obsahuje aspoň jeden antiproliferačný prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I opísanú vyššie a farmaceutický prijateľný nosič.

Ďalej sa uvádza podrobnejší opis predmetného vynálezu v širších súvislostiach.

Tento vynález umožňuje spôsob liečenia proliferačných ochorení, vrátane rakoviny, ktorý zahrňuje podávanie cicavcovi, ktorý potrebuje takéto liečenie, synergicky terapeuticky účinného množstva (1) aspoň jedného antiproliferačného prostriedku a (2) zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktorá je definovaná vyššie.

Substituenty a premenné, tak ako sa používajú vo všeobecnom vzorci I, majú uvedené významy v celom opise.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú inhibítory proteínkinázy a možno ich použiť pri liečbe a prevencii proliferačných ochorení, napríklad rakoviny, zápalu a artritídy. Možno ich tiež použiť pri liečbe neurodegeneratívnych ochorení, ako sú Alzheimerova choroba, kardiovaskulárne ochorenia, vírusové ochorenia a plesňové ochorenia.

Tento vynález opisuje zlúčeniny všeobecného vzorca I a poskytuje farmaceutické kompozície s obsahom týchto zlúčenín a synergické spôsoby používania týchto zlúčenín na liečenie proliferačných porúch.

Nižšie sa opisujú definície rôznych pojmov používaných na opis zlúčenín podľa tohto vynálezu. Tieto definície sa vzťahujú k pojmom tak, ako sa tu používajú v priebehu celého opisu (pokiaľ sa v konkrétnych prípadoch neobmedzujú iným spôsobom), buď samostatne alebo ako časti názvov väčších skupín.

Je potrebné poznamenať, že ktorýkoľvek heteroatóm s nenasýtenými

5a valenciami má podľa predpokladu atómy vodíka, ktoré tieto valencie nasycujú.

Karboxylový anión sa týka záporne nabitej skupiny -COO~.

Pojem alkyl” alebo ”alk sa týka monovalentnej skupiny odvodenej od alkánu (uhľovodíka), ktorá obsahuje od 1 do 12 atómov uhlíka, pokiaľ sa nedefinuje inak. Alkylová skupina je uhľovodíková skupina s priamym, rozvetveným či cyklickým reťazcom, ktorá môže byť pripadne substituovaná. V prípade substitúcie môže byť táto alkylová skupina substituovaná až štyrmi substitučnými skupinami R podľa definície v ktorejkoľvek dostupnej polohe pripojenia. Pokiaľ sa opisuje, že je táto alkylová skupina substituovaná alkylovou skupinou, môže sa tento opis navzájom zamieňať s pojmom rozvetvená alkylová skupina”. Príklady nesubstituovaných skupín zahrňujú metylovú skupinu, etylovú skupinu, propylovú skupinu, izopropylovú skupinu, n-butylovú skupinu, terc-butylovú skupinu, izobutylovú skupinu, pentylovú skupinu, hexylovú skupinu, izohexylovú skupinu, heptylovú skupinu, 4,4dimetylpentylovú skupinu, oktylovú skupinu, 2,2,4-trimetylpentylovú skupinu, nonylovú skupinu, decylovú skupinu, undecylovú skupinu, dodecylovú skupinu a podobne. Príklady substituentov môžu zahrňovať, avšak bez obmedzenia, jednu alebo viaceré z nasledujúcich skupín: atóm halogénu (ako je atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu, atóm jódu), halogénalkylové skupina (ako je trichlórmetylová skupina alebo skupina CF), alkoxyskupina, alkyltioskupina, hydroxylová skupina, karboxylová skupina (-COOH), alkyloxykarbonylová skupina (-C(O)R), alkylkarbonyloxyskupina (-OCOR), aminoskupina (-NH), karbamoylová skupina (-NHCOOR- alebo -OCONHR-), skupina močoviny (-NHCONHR-) alebo tioskupina (SH). Alkylové skupiny tak, ako sa tu definujú, môžu tiež obsahovať jednu alebo viac dvojitých väzieb medzi atómami uhlíka alebo jednu alebo viac trojitých väzieb medzi atómami uhlíka.

Pojem alkenyl” sa týka uhľovodíkovej skupiny, ktorá je priama, rozvetvená alebo cyklická a obsahuje od 2 do 12 atómov uhlíka a aspoň jednu dvojitú väzbu medzi atómami uhlíka. Pojem alkinylová skupina” sa týka uhľovodíkovej skupiny, ktorá je priama, rozvetvená alebo cyklická a obsahuje od 2 do 12 atómov uhlíka a aspoň jednu trojitú väzbu medzi atómami uhlíka.

Cykloalkylová skupina je prípad alkylovej skupiny, ktorá obsahuje od 3 do 15 atómov uhlíka bez striedavých alebo rezonujúcich dvojitých väzieb medzi atómami uhlíka. Táto skupina môže obsahovať od 1 do 4 kruhov. Príklady týchto nesubstituovaných skupín zahrňujú cyklopropylovú skupinu, cyklobutylovú skupinu, cyklopentylovú skupinu, cykohexylovú skupinu, adamantylovú skupinu a tak ďalej. Príklady substituentov zahrňujú jednu alebo viaceré z nasledujúcich skupín: atóm halogénu, alkylová skupina, alkoxyskupina, alkylhydroxylová skupina, aminoskupina, nitroskupina, kyanoskupina, tioskupina a/alebo alkyltioskupina.

Pojmy alkoxyskupina” alebo alkyltioskupina”, ako sa tu používajú, označujú alkylovú skupinu, ako sa opisuje vyššie, pripojenú prostredníctvom atómu kyslíka (-O-) alebo prostredníctvom síry (-S-).

Pojem alkyloxykarbonylová skupina”, ako sa tu používa, označuje alkoxyskupinu pripojenú prostredníctvom karbonylovej skupiny. Alkoxyalkoxykarbonylová skupina sa znázorňuje vzorcom -C(O)OR, v ktorom R je Ci_₆ alkylová skupina s priamym alebo rozvetveným reťazcom.

Pojem alkylkarbonylová skupina” sa týka alkylovej skupiny pripojenej prostredníctvom karbonylovej skupiny.

Pojem alkylkarbonyloxyskupina”, ako sa používa, označuje alkylkarbonylovú skupinu, ktorá sa viaže prostredníctvom atómu kyslíka.

Pojem arylalkylové skupina”, ako sa tu používa, označuje aromatický kruh pripojený k niektorej z alkylových skupín opísaných vyššie.

Pojem arylová skupina” sa týka monocyklických alebo bicyklických aromatických kruhov, napríklad v prípade fenylovej skupiny, substituovanej fenylovej skupiny a podobne, rovnako tak ako skupín, ktoré sú kondenzované, napríklad naftylové skupiny, fenantrenylové skupiny a podobne. Arylová skupina teda obsahuje aspoň jeden kruh, ktorý má aspoň 6 atómov, kde celkový počet kruhov je až päť a tieto kruhy obsahujú až 22 atómov so striedavými (rezonujúcimi) dvojitými väzbami medzi susednými atómami uhlíka alebo vhodnými heteroatómami. Arylové skupiny môžu byť prípadne substituované jednou alebo viacerými skupinami vrátane, avšak bez obmedzenia, atómu halogénu, alkylovej skupiny, alkoxyskupiny, hydroxylovej skupiny, karboxylovej skupiny, karbamoylovej skupiny, alkyloxykarbonylovej skupiny, nitroskupiny, trifluórmetylovej skupiny, aminoskupiny, cykloalkylovej skupiny, kyanoskupiny, skupiny alkyl -S(O)_m (m=0, 1,2) alebo tiolovej skupiny.

Pojem heteroarylová skupina” sa týka monocyklickej aromatickej uhľovodíkovej skupiny, ktorá obsahuje 5 alebo 6 atómov kruhu alebo bicyklickej aromatickej skupiny, ktorá obsahuje 8 až 10 atómov kruhu a ktorá obsahuje aspoň jeden heteroatóm, ako je atóm kyslíka, atóm síry alebo atóm dusíka, v ktorej je niektorý z atómov uhlíka alebo atómov dusíka bodom pripojenia a v ktorej sa jeden alebo dva ďalšie atómy uhlíka prípadne nahrádzajú heteroatómom zvoleným z prípadov atóm kyslíka alebo atóm síry a v ktorej sa prípadne nahrádza od 1 do 3 ďalších atómov uhlíka heteroatómami dusíka a táto heteroarylová skupina môže byť pripadne substituovaná tak, ako sa tu opisuje. Príklady heteroarylových skupín zahrňujú nasledujúce skupiny: tienylová skupina, furylová skupina, pyrolylová skupina, pyridylová skupina, imidazolylová skupina, pyrolidinylová skupina, piperidinylová skupina, tiazolylová skupina, oxazolylová skupina, triazolylová skupina, pyrazolylová skupina, izoxazolylová skupina, izotiazolylová skupina, pyrazinylová skupina, pyridazinylová skupina, pyrimidinylová skupina, triazinylazepinylová skupina, indolylová skupina, izoindolylová skupina, chinolylová skupina, izochinolylová skupina, benzotiazolylová skupina, benzoxazolylová skupina, benzimidazolylová skupina, benzoxadiazolylová skupina, benzofurazanylová skupina a tetrahydropyranylová skupina. Príklady substituentov zahrňujú jeden substituent alebo viac z nasledujúcich substituentov: atóm halogénu, alkylová skupina, alkoxyskupina, hydroxylová skupina, karboxyskupina, karbamoylová skupina, alkyloxykarbonylová skupina, trifluórmetylová skupina, cykloalkylová skupina, nitroskupina, kyanoskupina, aminoskupina, skupina alkyl-S(O)_m (m = 0, 1,2) alebo tiolová skupina.

Pojem heteroarýlium” sa týka heteroarylových skupín, ktoré nesú niektorý kvartérny atóm dusíka, takže majú kladný elektrický náboj.

Pojem heterocykloalkylová skupina” sa týka niektorej cykloalkylovej skupiny (nearomatickej skupiny), v ktorej sa jeden alebo viac atómov uhlíka v kruhu nahradí niektorým heteroatómom zvoleným z prípadov atóm kyslíka, atóm síry alebo atóm dusíka, a v ktorom možno nahradiť až tri ďalšie atómy uhlíka týmito heteroatómami.

Pojem kvartérny dusík” sa týka elektricky kladne nabitého tetravalentného atómu dusíka vrátane napríklad elektricky kladne nabitého atómu dusíka v niektorej tetraalkylamónnej skupine (ako je napríklad tetrametylamónium, N-metylpyridínium), elektricky kladne nabitého atómu dusíka v protónovej amóniovej zložke (ako je napríklad trimetylhydroamónium, N-hydropyridinium), elektricky kladne nabitého atómu dusíka v N-oxidoch amínu (ako je napríklad N-metylmorfolín-N-oxid, pyridín-Noxid) a elektricky kladne nabitého atómu dusíka v niektorej N-aminoamóniovej skupine (ako je napríklad N-aminopyridínium).

Pojem heteroatóm” znamená atóm kyslíka, atóm síry alebo atóm dusíka, ktoré sa volia navzájom nezávisle.

Pojem halogén” alebo halo” sa týka chlóru, brómu, fluóru alebo jódu.

Ak sa niektorá funkčná skupina nazýva chránenou”, znamená to, že sa táto skupina zmení, aby sa vylúčili nežiaduce vedľajšie reakcie na chránenom mieste. Vhodné chrániace skupiny pre zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno posúdiť na základe tejto patentovej prihlášky pri úvahe úrovne skúsenosti v odbore a s odkazom na štandardné monografie, ako je napríklad T. W. Greene a kol., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydanie, John Wiley & Sons, Inc., N. Y. (1991).

Vhodnými príkladmi solí zlúčenín podľa tohto vynálezu s anorganickými alebo organickými kyselinami sú hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, tartaráty a fosfáty. Soli zlúčenín podľa tohto vynálezu zahrňujú solváty, racemické zmesi a všetky stereoizomérne formy týchto zlúčenín vrátane enantiomérov a diastereomérov (napríklad D-tartarátové soli a L-tartarátové soli). Soli, ktoré sú nevhodné na farmaceutické použitie, avšak ktoré možno použiť napríklad na izoláciu alebo purifikáciu voľných zlúčenín všeobecného vzorca I alebo ich farmaceutický prijateľných solí sa taktiež zahrňujú do rámca tohto vynálezu.

Príkladom zlúčeniny všeobecného vzorca I je zlúčenina všeobecného vzorca II znázorneného nižšie

(II) a jej enantioméry, diastereoméry a farmaceutický prijateľné soli, v ktorých

R₇ je alkylová skupina,

R₈ je atóm vodíka alebo alkylová skupina,

X je skupina NR₉ alebo skupina CHNRgRw,

R_g a R-ιο sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, substituovaná alkylová skupina, cykloalkylová skupina alebo substituovaná cykloalkylová skupina a n je 0, 1,2 alebo 3.

Uvažujú sa všetky stereoizoméry zlúčenín podľa tohto vynálezu, ktoré sú buď v zmesi alebo v čistej forme alebo vo forme, ktorá je v podstate čistá. Definícia týchto zlúčenín podľa tohto vynálezu zahrňuje všetky možné stereoizoméry a ich zmesi. Predovšetkým zahrňuje racemické formy a izolované optické izoméry, ktoré majú udanú aktivitu. Racemické formy možno rozdeľovať fyzikálnymi spôsobmi, ako je napríklad trakčná kryštalizácia, delenie alebo kryštalizácia diastereomérnych derivátov alebo oddelenie chirálnou stĺpcovou chromatografiou. Jednotlivé optické izoméry možno získať z racemických zmesí konvenčnými spôsobmi, ako je napríklad tvorba soli s niektorou opticky aktívnou kyselinou s nasledujúcou kryštalizáciou.

Je potrebné si uvedomiť, že solváty (napríklad hydráty) zlúčenín všeobecného vzorca I taktiež patria do rámca tohto vynálezu. Spôsoby solvatácie sú všeobecne známe v odbore.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú obzvlášť použiteľné ako vysoko účinné inhibítory proteínkinázy a možno ich použiť v spôsoboch liečenia proliferačných ochorení, ako je napríklad rakovina, zápal a artritída. Môžu sa tiež použiť pri liečení Alzheimerovej choroby, vypadávaní vlasov súvisiacom s chemoterapiou a kardiovaskulárneho ochorenia.

Vhodné antiproliferačné prostriedky na použitie v synergických spôsoboch podľa tohto vynálezu zahrňujú bez obmedzenia alkylačné prostriedky (vrátane bez obmedzenia dusíkatých yperitov, etylénimínových derivátov, alkylsulfonátov, nitrózomočovin a triazénov): Uracilový yperit, Chlormethin, Cyklofosfamid, Cytoxan®, Ifosfamid, Melfalan, Chlorambucil, Pipobroman, Trietyl-melamín, Trietyléntiofosforamín, Busulfán, Carmustín, Lomustín, Streptozocín, Dekarbazín a Temozolomid, antimetabolity (vrátane bez obmedzenia antagonistov kyseliny listovej, pyrimidínových analógov, purínových analógov a inhibítorov adenozíndeaminázy), Metotrexat, 5-Fluóruracil, Floxuridin, Cytarabin, 6-Merkaptopurín, 6-Tioguanín,

Fludarabin-fosfát, Pentostatín a Gemcitabín, prirodzené produkty a ich deriváty (napríklad alkaloidy vinea, antitumorové antibiotiká, enzýmy, lymfokíny a epipodofylotoxíny): Vinblastín, Vinkristín, Vindesín, Bleomycín, Daktinomycín, Daunorubicín, Doxorubicín, Epirubicín, Idarubicín, Ara-C, paklitaxel (paklitaxel je komerčne dostupný pod názvom Taxol®), Mitramycín, Deoxyco-formycín, MitomycínC, L-Asparagináza, Interferóny (najmä IFN-a), Etopozid a Tenipozid, navelben, CPT11 .anastrazol, letrazol, kapecitabín, reloxafín, cyklofosfamid, ifosamid a droloxafín, epotilón A, epotilón B, epotilón C, epotilón D, deoxyepotilón A, deoxyepotilón B, [1S[1 R*,3R*(E),7R*, 10S*, 11 R*, 12R*, 16S*]]-7,11 -dihydroxy-8,8,10,12,16-pentametyl-3[1-metyl-2-(2-metyl-4-tiazolyl)etenyl]-4-aza-17-azabicyklo[14.1.0]heptadekán-5,9-dión (opísaný v publikácii WO99/02514), [1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3[2-[2-(aminometyl)-4-tiazolyl]-1 -metyletenyl]-7,11 -dihydroxy-8,8,10,12,16-pentametyl4,17-dioxabicyklo[14.1.0]-heptadekán-5,9-dión (opísaný v US patente č. 6 260 694, vydanom 17. júla 2001) a ich deriváty, ďalšie prostriedky narušujúce mikrotubuly a žiarenie.

Tento vynález ďalej poskytuje farmaceutický prostriedok na synergické liečenie rakoviny, ktorý obsahuje aspoň jeden antiproliferačný prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I a niektorý farmaceutický prijateľný nosič.

V jednom uskutočnení tohto vynálezu sa tento antiproliferačný prostriedok podáva pred pôsobením zlúčeniny všeobecného vzorca I. V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu sa tento antiproliferačný prostriedok podáva súčasne so zlúčeninou všeobecného vzorca I. V ešte ďalšom uskutočnení sa zlúčenina všeobecného vzorca I podáva pred podaním antiproliferačného prostriedku.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1. Schéma riadenej kontroly bunkového cyklu.

Obrázok 2. Schéma kontroly miesta reštrikcie. CDK2 je kľúčovým regulátorom miesta reštrikcie, riadenej kontroly bunkového cyklu riadiacej prechod z fázy G1 do fázy S bunkového cyklu.

Obrázok 3. Štiepenie PARP sa vyvoláva po expozícii zlúčenine 1. Bunky

A2780S sa spracujú v priebehu 0, 1, 2, 4, 6 a 24 h zlúčeninou s koncentráciou 20,

100 alebo 200 nm. Proteínové extrakty sa potom vyšetrujú Westemovým blotovaním s použitím protilátky proti PARP (Clonetech). Šípka označuje proteínový fragment

PARP odštiepený kaspázou.

Obrázok 4. Komparatívna antitumorová aktivita zlúčeniny 1, 5-FU a paklitaxelu na modeli ľudského karcinómu kolónu Colo205. Zlúčenina sa podáva pri udaných dávkach pri liečebných režimoch intraperitoneálne jedenkrát denne počas 8 d, intravenózne 7 krát denne počas 3 d respektíve intravenózne 2 krát denne počas 5 d. Každý údaj znamená medián hmotnosti tumoru 8 myší. Horizontálna úsečka označuje oneskorenie rastu tumoru ekvivalentné 1 LCK.

Obrázok 5. Synergické pôsobenie zlúčeniny 1 v kombinácii s inhibítorom farnezyltransferázy, zlúčeninou 2 a sieťovadlom DNA, cisplatinou, v klonogénnom teste in vitro s bunkami karcinómu ovárií A2780s. Rôzne koncentrácie zlúčeniny 2 alebo cisplatiny sa kombinujú so zlúčeninou 1 s koncentráciou 1,5 μΜ. Čierne trojuholníky znázorňujú zlúčeninu 2 alebo cisplatinu samotnú, červené krúžky predstavujú kombinovanú cytotoxicitu zlúčeniny 1 buď so zlúčeninou 2 alebo s cisplatinou a modrá čiara predstavuje čiaru multiplicity. Čiara multiplicity znázorňuje úroveň cytotoxicity, pokiaľ dva kombinované prostriedky poskytujú aditívnu cytotoxicitu a vyplýva z frakcií prežívania s každým prostriedkom podávaným nezávisle. Sekvencia a čas expozície lieku sú nasledujúce. A) Bunky sa spracujú v priebehu časov 0 až 4 h zlúčeninou 1 a nasleduje spracovanie zlúčeninou 2 počas 4 až 24 h alebo cisplatinou počas 24 až 28 h. B) Bunky sa spracujú v priebehu 0 až 20 h zlúčeninou 2 alebo v priebehu 0 až 4 h cisplatinou a potom sa spracovávajú zlúčeninou 1 počas 4 až 24 h alebo zlúčeninou 2 a cisplatinou počas 24 až 28 h. C) Bunky sa spracujú oboma prostriedkami súčasne v priebehu časov 0 až 4 h. Vo všetkých prípadoch sa hodnotí tvorba kolónií v dňoch 10 až 14.

Nasleduje podrobný opis vynálezu.

V súlade s týmto vynálezom sa poskytujú spôsoby rozpisu podávania inhibítorov cyklín-dependentných kináz v synergickej kombinácii (synergických kombináciách) s aspoň jedným antineoplastickým prostriedkom alebo antiproliferačným prostriedkom na liečenie a prevenciu proliferačných ochorení.

Príklad zlúčeniny všeobecného vzorca I, zlúčenina 1, je racionálne určený inhibítor CDK2. Účinnosť a selektívny profil tejto zlúčeniny sa optimalizujú na poskytnutie maximálneho protinádorového účinku pri zachovaní zreteľného terapeutického intervalu. Zlúčenina 1 inhibuje CDK2 s IC₅o = 48 nM. Táto zlúčenina je 10x a 100x menej účinná proti veľmi príbuzným proteínkinázam CDK1 respektíve CDK4. Zlúčenina 1 vykazuje významnú selektivitu (viac ako 500 násobnú) proti 15 nepríbuzným serín/treonín a tyrozín proteínkinázam. Zlúčenina 1 je účinným a široko aktívnym inhibítorom proliferácie tumorových buniek in vitro. Liečenie vedie k náhlej inhibícii pokračovania bunkového cyklu s apoptickou odpoveďou. Klonogénne testy ukazujú, že postačuje čas 8 h po expozícii lieku na získanie antiproliferačnej odpovede in vitro. Pri použití s kľúčovou nádorovou terapiou prednej línie in vitro je aktivita zlúčeniny 1 aditívna alebo synergická. Zlúčenina 1 vykazuje široké spektrum antitumorovej aktivity na mnohých modeloch myších a ľudských tumorov in vivo. Tie zahrňujú myšiu leukémiu P388, cyklín E transgénny myší karcinóm mliečnej žľazy, ľudský karcinóm ovárií A2780, ľudský kolorektálny karcinóm Colo205 a ľudský skvamózne bunkový karcinóm A431. Zlúčenina 1 vykazuje liečebnú účinnosť pri hladinách viacerých dávok u xenotransplantátu ľudského tumoru A2780 dávkovaného intraperitoneálne alebo v rozpise denne počas 8 dni. Aktivita je závislá od dávky a rozpisu s tým, že jedenkrát denne počas 8 d = jedenkrát denne počas 14 d »> 2 krát denne počas 5 d = 4 krát denne počas 3 d. Zlúčenina 1 vykazuje mierny účinok na modeli xenotransplantátu A2780 pri perorálnom podávaní v rozpise jedenkrát denne počas 8 d. Navyše liečba myší s tumorom A2780 jednou nepretržitou infúziou zlúčeniny 1 počas 24 hodín vedie k liečebnej účinnosti pri maximálne tolerovanej dávke (MTD).

Preto v jednom preferovanom uskutočnení zahrňuje chemoterapeutický spôsob podľa tohto vynálezu podávanie inhibítora CDK2 všeobecného vzorca I v kombinácii s inými protinádorovými prostriedkami. Inhibítory CDK, ktoré sa tu opisujú, vykazujú pri použití v kombinácii s aspoň jedným protinádorovým prostriedkom mimoriadnu cytotoxickú aktivitu.

V jednom preferovanom uskutočnení tohto vynálezu sa podáva zlúčenina všeobecného vzorca I spolu s aspoň jedným antineoplastickým prostriedkom.

Pojem antineoplastický prostriedok”, ako sa tu používa, je synonymom chemoterapeutického prostriedku a/alebo antiproliferačného prostriedku” a týka sa zlúčenín, ktoré bránia rastu nádoru alebo hyperproliferačných buniek. Antiproliferačné prostriedky bránia deleniu buniek (1) zásahom do schopnosti bunky replikovať DNA a (2) indukciou bunkového zániku a/alebo apoptózy v rakovinových bunkách.

Skupiny zlúčenín, ktoré možno použiť ako antiproliferačné cytotoxické prostriedky, zahrňujú nasledujúce typy prostriedkov.

Alkylačné prostriedky (vrátane avšak bez obmedzenia dusíkatých yperitov, etylénimínových derivátov, alkylsulfonátov, nitrózomočovín a triazénov): uracilový yperit, Chlormethin, Cyklofosfamid, Cytoxan®, Ifosfamid, Melfalan, Chlorambucil, Pipobroman, Trietylénmelamín, Trietyléntiofosforamín, Busulfán, Karmustín, Lomustín, Streptozocín, Dekarbazín a Temozolomid.

Antimetabolity (vrátane avšak bez obmedzenia antagonistov kyseliny listovej, pyrimidínových analógov, purínových analógov a inhibítorov adenozíndeaminázy): Metotrexat, 5-Fluóruracil, Floxuridin, Cytarabin, 6-Merkaptopurín, 6-Tioguanín, Fludarabin-fosfát, Pentostatín a Gemcitabín.

Prirodzené látky a ich deriváty (napríklad alkaloidy vinea, protinádorové antibiotiká, enzýmy, lymfokíny a epipodofylotoxíny): Vinblastín, Vinkristín, Vindesín, Bleomycín, Daktinomycín, Daunorubicín, Doxorubicín, Epirubicín, Idarubicín, Ara-C, paklitaxel (paklitaxel je komerčne dostupný ako Taxol®), Mitramycín, Deoxycoformycín, epotilón A, epotilón B, epotilón C, epotilón D, deoxyepotilón A, deoxyepotilón B, [1 S-[1 R*,3R*(E),7R*, 10S*, 11R*. 12R*, 16S*]]-7,11 -dihydroxy8,8,10,12,16-pentametyl-3-[1 -metyl-2-(2-metyl-4-tiazolyl)etenyl]-4-aza-17oxabicyklo[14.1.0]heptadekán-5,9-dión (opísaný v publikácii WO 99/02514), [1S[1 R*,3R*(E),7R*, 10S*, 11 R*, 12R*,16S*]]-3-[2-[2-(aminometyl)-4-tiazolyl]-1 metyletenyl]-7,11 -dihydroxy-8,8,10,12,16-pentametyl-4,17-dioxabicyklo[14.1.0] heptadekán-5,9-dión (opísaný v US patente č. 6 260 694, vydanom 17. júla 2001) a ich deriváty, mitomycín-C, L-asparagináza, interferóny (predovšetkým IFN-a), Etopozid a Tenipozid.

Ďalšie antiproliferačné cytotoxická prostriedky sú navelben, CPT-11, anastrazol, letrazol, kapecitabín, reloxafín, cyklofosfamid, ifosamid a droloxafín.

Pojem radiačná terapia” zahrňuje, avšak bez obmedzenia, Rtg lúče alebo lúče gama, prichádzajúce pri vonkajšom ožiarení z vonkajšieho zdroja vo forme zväzku alebo po implantácii malých rádioaktívnych zdrojov.

Prostriedky ovplyvňujúce mikrotubuly zasahujú do bunkovej mitózy a sú v odbore dobre známe vďaka svojej antiproliferačnej cytotoxickej aktivite. Prostriedky ovplyvňujúce mikrotubuly v rámci tohto vynálezu zahrňujú, avšak bez obmedzenia alokolchicín (NSC 406042), Halichondrín B (NSC 609395), kolchicín (NSC 757), kolchicinové deriváty (napríklad NSC 33410), dolastín 10 (NSC 376128), maytanzín (NSC 153858), rhizoxin (NSC 332598), paklitaxel (Taxol®, NSC 125973), deriváty Taxolu® (napríklad NSC 608832), tiokolchicín (NSC 361792), trityl-cysteín (NSC 83265), vinblastín-sulfát (NSC 49842), vinkristin-sulfát (NSC 67574), prírodné a syntetické epotilóny vrátane, avšak bez obmedzenia, epotilónu A, epotilónu B, epotilónu C, epotilónu D, deoxyepotilónu A, deoxyepotilónu B, 1S[1 R*,3R*(E),7R*, 10S*, 11 R*, 12R*, 16S*]]-7,11 -dihydroxy-8,8,10,12,16-pentametyl-3[1-metyl-2-(2-metyl-4-tiazolyl)etenyl]-4-aza-17-oxabicyklo[14.1.0]heptadekán-5,9-dión (opísaný v publikácii WO 99/02514), [1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3[2-[2-(aminometyl)-4-tiazolyl]-1 -metyletenyl]-7,11 -dihydroxy-8,8,10,12,16-pentametyl4,17-dioxabicyklo[14.1.0]heptadekán-5,9-dión (opísaný v US patente č. 6 260 694, vydanom 17. júla 2001) a ich deriváty a ďalšie prostriedky narušujúce mikrotubuly. Ďalšie antineoplastické prostriedky zahrňujú diskodermolid [pozri Service, 274, 2009 (1996)], estramustín, nokodazol, MAP4 a podobne. Príklady týchto prostriedkov sa tiež opisujú vo vedeckej a patentovej literatúre, pozri napríklad Bulinski, J. Celí Sci., 110, 3055-3064 (1997), Panda, Prac. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10560-10564 (1997), Muhlradt, Cancer Res„ 57, 3344-3346 (1997), Nicolaou, Náture, 387, 268-272 (1997), Vasquez, Mol. Biol. Celí., 8, 973-985 (1997), Panda, J. Biol. Chem., 271,

29807-29812 (1996).

V prípadoch, v ktorých je žiaduce uviesť aberantne proliferujúce bunky do kľudového stavu, možno tiež pacientovi podávať súčasne s podávaním alebo pred podávaním chemoterapeutických prostriedkov podľa tohto vynálezu hormóny a steroidy (vrátane syntetických analógov): 17a-etinylestradiol, dietylstilbestrol, testosterón, prednizon, fluoxomesteron, dromostanolon-propionát, testolaktón, megestrol-acetát, metylprednizolon, metyltestosterón, prednizolon, triamcinolon, chórtrianisen, hydroxyprogesterón, aminoglutetimid, estramustin, medroxyprogesterón-acetát, leuprolid, flutamid, toremifen, zoladex.

Na použitie v kombinácii s chemoterapeutickými spôsobmi podľa tohto vynálezu sú tiež vhodné antiangiogénne prostriedky, ako sú inhibítory metaloproteinázy matrice a ďalšie inhibítory VEGF, ako sú protilátky proti VEGF a malé molekuly, ako sú ZD6474 a SU6668. Možno tiež použiť protilátky proti Her2 od Genetech. Vhodným inhibítorom EGFR je EKB-569 (ireverzibilný inhibítor). Rovnako možno zahrnúť protilátku C225 Imclone imunošpecifickú pre EGFR a inhibítory src.

Vhodným antiproliferačným cytostatickým prostriedkom je Casodex®, ktorý spôsobuje, že androgén-dependentné karcinómy neproliferujú. Ďalším príkladom cytostatického prostriedku je antiestrogén Tamoxifén, ktorý inhibuje proliferáciu alebo rast estrogén-dependentného karcinómu mliečnej žľazy. Inhibítory prevodu signálu bunkovej proliferácie sú cytostatické prostriedky. Príkladom sú inhibítory epidermálneho rastového faktoru, inhibítory Her-2, inhibítory kinázy MEK-1, inhibítory kinázy MAPK, inhibítory PI3, inhibítory kinázy Src a inhibítory PDGF.

Ako sa opisuje, určité antiproliferačné prostriedky sú antiangiogénne a antivaskulárne a prerušením dodávky krvi do solidných tumorov spôsobujú, že nádorové bunky prechádzajú do kľudového stavu tým, že sú zbavené výživy. Možno tiež použiť kastráciu, ktorá taktiež spôsobí, že androgén-dependentné karcinómy neproliferujú. Hladovanie buniek inými prostriedkami, než je chirurgické prerušenie dodávky krvi, je iným príkladom použitia cytostatického prostriedku. Obzvlášť preferovanou skupinou antivaskulárnych cytotoxických prostriedkov sú kombretastatíny. Ostatné príklady cytostatických prostriedkov zahrňujú inhibítory

MET kinázy, inhibítory MAP kinázy, inhibítory nereceptorových a receptorových tyrozínkináz, inhibítory integrínovej signalizácie a inhibítory receptorov rastového faktora typu inzulínu.

Tento vynález teda poskytuje spôsoby synergickej liečby rôznych typov rakoviny vrátane, avšak bez obmedzenia, nasledujúcich:

karcinómu vrátane karcinómu močového mechúra (vrátane zrýchleného a metastázujúceho karcinómu močového mechúra), mliečnej žľazy, kolónu (vrátane kolorektálneho karcinómu), obličiek, pečene, pľúc (vrátane malobunkového alebo nemalobunkového karcinómu pľúc a pľúcneho adenokarcinómu), vaječníkov, prostaty, semenníkov, urogenitálneho traktu, lymfatického systému, rekta, hrtanu, pankreasu (vrátane exokrinného pankreatického karcinómu), pažeráka, žalúdka, žlčníka, krčka maternice, štítnej žľazy a kože (vrátane skvamózneho bunkového karcinómu), hemopoetických tumorov lymfoidného radu vrátane leukémie, akútnej lymfocytárnej leukémie, akútnej lymfoblastickej leukémie, B-bunkového lymfómu, T-bunkového lymfómu, Hodgkinovho lymfómu, nehodgkinského lymfómu, lymfómu obrvených buniek, histiocytámeho lymfómu a Burkettovho lymfómu, hemopoetických tumorov myeloidného radu vrátane akútnych a chronických myelogénnych leukémií, myelodysplastického syndrómu, myeloidnej leukémie a promyelocytárnej leukémie, tumorov centrálnej a periférnej nervovej sústavy vrátane astrocytómu, neuroblastómu, gliómu a schwannómov, tumorov mezenchymálneho pôvodu vrátane fibrosarkómu, rabdomyosarkómu a osteosarkómu a ďalších tumorov vrátane melanómu, xenoderma pigmentosum, keratoaktantómu, seminómu, folikulárneho nádoru štítnej žľazy a teratokarcinómu.

Najviac sa preferuje použitie tohto vynálezu na liečenie zrýchlených alebo metastázujúcich karcinómov močového mechúra, pankreasu, prostaty, nemalobunkového karcinómu pľúc, kolorektálneho karcinómu, karcinómu vaječníkov a karcinómu mliečnej žľazy.

V jednom preferovanom uskutočnení tohto vynálezu sa poskytuje spôsob synergického liečenia rakovinových nádorov. Tento synergický spôsob podľa tohto vynálezu výhodne potláča vývoj tumorov, znižuje záťaž spôsobenú tumorom alebo poskytuje regresiu tumoru u cicavcov.

Spôsoby bezpečného a účinného podávania väčšiny týchto chemoterapeutických prostriedkov poznajú ti, ktorí majú skúsenosti v odbore. Navyše sa toto podávanie opisuje v štandardnej literatúre.

Napríklad sa podávanie mnohých terapeutických prostriedkov opisuje v Physicians Desk Reference (PDR), napríklad vydanie 1996 (Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, USA) a tento opis sa tu zahrňuje formou odkazu.

Spôsoby prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I poskytuje US patent č. 6 040 321, a celý tento opis sa tu zahrňuje formou odkazu.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú použiteľné v rôznych formách farmaceutický prijateľných solí. Pojem farmaceutický prijateľná soľ” sa týka tých foriem solí, ktoré sú zrejmé farmaceutickému chemikovi, to jest tých foriem, ktoré udržiavajú terapeutický účinok, zaisťujú požadované farmakokinetické vlastnosti, chuťovú prijateľnosť, absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo vylučovanie. Ďalšie faktory, ktoré sú vo svojej povahe skôr praktické, avšak sú tiež pri voľbe dôležité, sú cena surovín, ľahkosť kryštalizácie, výťažok, stabilita, hygroskopické vlastnosti a tekutosť výsledného lieku. Farmaceutické kompozície možno vhodne pripraviť z účinných zložiek alebo ich farmaceutický prijateľných solí v kombinácii s farmaceutický prijateľnými nosičmi.

Farmaceutický prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca I, ktoré možno použiť v spôsoboch a kompozíciách podľa tohto vynálezu, zahrňujú, avšak bez obmedzenia, soli získané s množstvom organických a anorganických kyselín, ako je kyselina chlorovodíková, kyselina hydroxymetánsulfónová, kyselina bromovodíková, kyselina metánsulfónová, kyselina sírová, kyselina octová, kyselina trifluóroctová, kyselina maleínová, kyselina benzénsulfónová, kyselina toluénsulfónová, kyselina sulfámová, kyselina glykolová, kyselina steárová, kyselina mliečna, kyselina jablčná, kyselina pamóová, kyselina sulfanilová, kyselina 2-acetoxybenzoová, kyselina fumárová, kyselina toluénsulfónová, kyselina metánsulfónová, kyselina etándisulfónová, kyselina šťavelová, kyselina 2-hydroxyetánsulfónová a ďalej zahrňujú rôzne ďalšie farmaceutický prijateľné soli, ako sú napríklad nitráty, fosfáty, boráty, tartaráty, citráty, sukcináty, benzoáty, askorbáty, salicyláty a podobne. Katióny, ako sú kvartérne amónne ióny, sa uvažujú ako farmaceutický prijateľné opačné ióny pre aniónové zvyšky.

Preferované soli zlúčenín všeobecného vzorca I zahrňujú tartaráty, hydrochloridy, metánsulfonáty a trifluóracetáty. Navyše možno farmaceutický prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca I získať s alkalickými kovmi, ako je sodík, draslík a lítium, s kovmi alkalických zemín, ako je vápnik alebo horčík, s organickými bázami, ako je dicyklohexylamín, tributylamín a pyridín a s aminokyselinami, ako je arginín, lyzin a podobne.

Farmaceutický prijateľné soli podľa tohto vynálezu možno pripraviť konvenčnými chemickými spôsobmi. Všeobecne možno soli pripraviť reakciou voľnej bázy alebo kyseliny so stechiometrickým množstvom alebo s nadbytkom požadovanej anorganickej alebo organickej kyseliny alebo bázy vytvárajúcej soľ vo vhodnom rozpúšťadle alebo v kombinácii rozpúšťadiel.

Tento vynález tiež zahrňuje farmaceutickú kompozíciu použiteľnú pri liečbe rakoviny, pri ktorej sa podáva terapeuticky účinné množstvo kombinácií podľa tohto vynálezu za prítomnosti alebo bez prítomnosti farmaceutický prijateľných nosičov alebo zrieďovacích prostriedkov. Synergické farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu obsahujú protiproliferačný prostriedok alebo prostriedky, zlúčeninu všeobecného vzorca I a farmaceutický prijateľný nosič. Tieto spôsoby zahrňujú použitie antineoplastického prostriedku v kombinácii so zlúčeninou všeobecného vzorca I. Kompozície podľa tohto vynálezu môžu ďalej obsahovať aspoň jednu farmaceutický prijateľnú ďalšiu zložku, ako sú kamence, stabilizátory, antimikrobiálne prostriedky, pufre, farbivá, príchute, adjuvantné prostriedky a podobne. Antineoplastické prostriedky, zlúčeniny všeobecného vzorca I a kompozície podľa tohto vynálezu sa môžu podávať perorálne alebo parenterálne vrátane intravenóznych, intramuskulárnych, intraperitoneálnych, subkutánnych, rektálnych a lokálnych spôsobov podávania.

Na perorálne podávanie sa môžu antineoplastické prostriedky s obsahom zlúčeniny všeobecného vzorca I a kompozície podľa tohto vynálezu podávať napríklad vo forme tabliet alebo toboliek, práškov, dispergovateľných granúl alebo oplátok s práškom alebo vo forme vodných roztokov alebo suspenzií. V prípade tabliet na perorálne užívanie obsahujú bežne užívané nosiče laktózu, kukuričný škrob, uhličitan horečnatý, mastenec a cukor a pridávajú sa bežne mazivá, ako je stearát horečnatý. Na perorálne podávanie vo forme toboliek obsahujú použiteľné nosiče laktózu, kukuričný škrob, uhličitan horečnatý, mastenec a cukor. Pri používaní vodných suspenzií na perorálne podávanie sa bežne pridávajú emulgačné a/alebo suspenzačné prostriedky.

Navyše možno do perorálnych kompozícií pridávať sladidlá a/alebo príchute. Na intramuskulárne, intraperitoneálne, subkutánne a intravenózne podávanie sa obvykle používajú sterilné roztoky účinnej zložky (účinných zložiek) a pH týchto roztokov by sa malo vhodným spôsobom upravovať a pufrovať. Na intravenózne podávanie by celková koncentrácia rozpustenej zložky (rozpustených zložiek) mala byť kontrolovaná takým spôsobom, aby prípravok bol izotonický.

Na zhotovenie čapíkov podľa tohto vynálezu sa najprv pripraví vosk s nízkou teplotou topenia, ako je zmes glyceridov mastných kyselín alebo kakaového masla v roztavenom stave a účinná zložka sa vo vosku homogénne rozptýli, napríklad miešaním. Roztavená homogénna zmes sa potom vyleje do foriem vhodnej veľkosti a nechá sa ochladiť, čím stuhne.

Kvapalné prípravky zahrňujú roztoky, suspenzie a emulzie. Príklady týchto prípravkov sú roztoky vo vode alebo v zmesi voda/propylénglykol na parenterálne injekcie. Kvapalné prípravky môžu tiež obsahovať roztoky na intranazálne podávanie.

Aerosólové prípravky vhodné na inhaláciu môžu zahrňovať roztoky a tuhé látky v práškovej forme, ktoré môžu byť v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom, ako je stlačený inertný plyn.

Rovnako sa používajú tuhé prípravky určené na premenu pred použitím na kvapalné prípravky na perorálne alebo parenterálne podávanie. Tieto kvapalné formy zahrňujú roztok, suspenzie a emulzie.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, rovnako tak ako antineoplastické prostriedky, ktoré sa tu opisujú, sa tiež môžu podávať transdermálne. Transdermálne kompozície môžu byť vo forme krémov, pleťových vôd, aerosólov a/alebo emulzií a môžu byť obsiahnuté v transdermálnej náplasti matricového alebo zásobníkového typu, ako sú prípady obvyklé v odbore na tento účel.

Možno tiež použiť kombinácie tohto vynálezu v spojení s inými dobre známymi spôsobmi terapie, ktoré sa volia vzhľadom na ich konkrétnu použiteľnosť proti stavu, ktorý sa má liečiť.

V prípade formulácie vo forme pevnej dávky sa používajú kombinácie kompozícií podľa tohto vynálezu v dávkových rozmedziach, ktoré sa opisujú nižšie. Alternatívne možno podávať antineoplastický prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I oddelene v dávkových rozmedziach, ktoré sa opisujú nižšie. V jednom preferovanom uskutočnení tohto vynálezu sa podáva antineoplastický prostriedok v dávkovom rozmedzí, ktoré sa opisuje nižšie, súčasne s podaním, pred podaním alebo po podaní zlúčeniny všeobecného vzorca I. Tabuľka I zhrňuje preferované chemoterapeutické kombinácie a príklady dávkovania na použitie v spôsoboch podľa tohto vynálezu. Tam, kde sa používa Zlúčenina všeobecného vzorca I”, sa myslia akékoľvek pozmenenia všeobecného vzorca I, ktoré sa tu opisujú, vrátane formy soli opisovanej vyššie na použitie pri chemoterapeutických kombináciách. Prednostne sa používa zlúčenina I.

Tabuľka I

Chemoterapeutická kombinácia	Dávkovanie mg/m2 (na podanú dávku)
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ cisplatina	5 až 500 mg/m2
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ zlúčenina 2	25 až 500 mg/m2
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ karboplatina	5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ žiarenie	200 až 8000 cGy
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ CPT-11	5 až 400 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ paklitaxel	40 až 250 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ paklitaxel	40 až 250 mg/m2
+ karboplatina	5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ 5FU a prípadne	5 až 5000 mg/m2
+ leukovorin	5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ epotilón	1 až 500 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ gemcitabín	100 až 3000 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ UFT a prípadne	50 až 800 mg/m2
+ leukovorin	5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ gemcitabín	100 až 3000 mg/m2
+ cisplatina	5 až 150 mg/m2

Zlúčenina vzorca 1 + UFT + leukovorin	1,0 až 100 mg/m2 50 až 800 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ cisplatina	5 až 150 mg/m2
+ paklitaxel	40 až 250 mg/m2
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ cisplatina	5 až 150 mg/m2
+ 5FU	5 až 5000 mg/m2
Zlúčenina vzorca 1	1,0 až 100 mg/m2
+ oxaliplatina	5 až 200 mg/m2
+ CPT-11	4 až 400 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ 5FU	5 až 5000 mg/m2
+ CPT-11 a prípadne	4 až 400 mg/m2
+ leukovorin	5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ 5FU	5 až 5000 mg/m2
+ žiarenie	200 až 8000 cGy
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ žiarenie	200 až 8000 cGy
+ 5FU	5 až 5000 mg/m2
+ cisplatina	5 až 150 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ oxaliplatina	5 až 200 mg/m2
+ 5FU a prípadne	5 až 5000 mg/m2
+ leukovorin	5 až 1000 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ paklitaxel	40 až 250 mg/m2
+ CPT-11	4 až 400 mg/m2
Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ paklitaxel	40 až 250 mg/m2
+ 5FU	5 až 5000 mg/m2

Zlúčenina vzorca I	1,0 až 100 mg/m2
+ UFT	50 až 800 mg/m2
+ CPT-11 a prípadne	4 až 400 mg/m2
+ leukovorin	5 až 1000 mg/m2

Vo vyššie uvedenej tabuľke I označuje ”5FU” 5-fluóruracil, ”leukovorin možno použiť ako sodnú soľ leukovorinu, ”UFT” je zmes tegafur/uracil v molárnom pomere 1:4 a ”epotilón” je prednostne zlúčenina opísaná v publikácii WO 99/02514 alebo v publikácii WO 00/50423, ktoré sa tu obe v plnom znení zahrňujú formou odkazu.

Aj keď tabuľka I poskytuje príklady dávkových rozmedzí zlúčenín všeobecného vzorca I a určitých proti nádorových prostriedkov podľa tohto vynálezu, môže kliník pri formulácii farmaceutických prostriedkov podľa tohto vynálezu používať preferované dávky na základe stavu pacienta, ktorý sa má liečiť. Napríklad možno zlúčeninu 1 prednostne podávať v množstve 3 až 60 mg/m² každé 3 týždne. Zlúčeninu 2 možno prednostne podávať v dávkovom rozmedzí od 25 do 500 mg/m² každé 3 týždne po také dlhé obdobie, ako to vyžaduje liečenie. Preferované dávky pre cisplatinu sú 75 až 120 mg/m² každé 3 týždne. Preferované dávkovanie pre karboplatinu je v rozmedzí 200 až 600 mg/m² alebo AUC (plocha pod krivkou) 0,5 až 8 mg/ml x min, najpreferovanejšie AUC 4 až 6 mg/ml x min. Pokiaľ používaný spôsob využíva ožarovanie, sú preferované dávkovania v rozmedzí 200 až 600 cGy. Preferované dávkovania CPT-11 sú v rozmedzí 100 až 125 mg/m² jedenkrát týždenne. Preferované dávkovania paklitaxelu sú 130 až 225 mg/m² každých 21 d. Preferované dávkovania pre gemcitabín sú v rozmedzí 80 až 1500 mg/m² týždenne. UFT sa preferovane používa v rozmedzí 300 až 400 mg/m² denne pri kombinácii s podávaním leukovorinu. Preferované dávkovania leukovorinu sú 10 až 600 mg/m² týždenne.

Skutočné použité dávkovanie sa môže meniť v závislosti od požiadaviek pacienta a závažnosti liečeného stavu. Stanovenie správneho dávkovania v konkrétnej situácii patrí do rámca skúseností v odbore. Všeobecne sa liečba začína menšími dávkami, ktoré sú nižšie, než je optimálna dávka danej zlúčeniny. Potom sa dávkovanie zvyšuje po malých množstvách po dosiahnutie optimálneho účinku za daných okolností. Na uľahčenie možno celkovú dennú dávku rozdeliť a podávať v čiastkových dávkach v priebehu dňa, pokiaľ je to vhodné. Možno tiež použiť prerušovanú liečbu (napríklad jeden týždeň z troch týždňov alebo tri týždne zo štyroch týždňov).

Určité typy rakoviny možno účinne liečiť zlúčeninami všeobecného vzorca I a množstvom protinádorových prostriedkov. Tieto kombinácie troch alebo štyroch prostriedkov môžu zaistiť vyššiu účinnosť. Pri použití trojkombinácie a štvorkombinácie možno použiť vyššie opísané dávkovania. Ďalšie takéto kombinácie vo vyššie uvedenej tabuľke I môžu teda zahrňovať zlúčeninu 1” v kombinácii s (1) mitoxantronom + prednizonom, (2) doxorubicínom + karboplatinou alebo (3) herceptínom + tamoxifénom. 5-FU možno nahradiť UFT v ktorejkoľvek z vyššie opísaných kombinácií.

Pri použití spôsobov alebo kompozícií podľa tohto vynálezu možno tiež podľa požiadavky podávať ďalšie prostriedky používané pri pozmeňovaní rastu tumorov alebo metastáz v klinickom usporiadaní, ako sú antiemetiká.

Tento vynález zahrňuje spôsob synergickej liečby rakoviny, pri ktorom sa podáva antineoplastický prostriedok a zlúčenina všeobecného vzorca I buď súčasne alebo postupne. Preto, zatiaľ čo pri jednej liečbe môže byť výhodné podávanie farmaceutickej formulácie obsahujúcej antineoplastický prostriedok (antineoplastické prostriedky) a zlúčeninu všeobecného vzorca I, pri inej liečbe môže byť výhodné podávať zlúčeninu všeobecného vzorca I pred podaním antineoplastického prostriedku (antineoplastických prostriedkov). Je tiež potrebné si uvedomiť, že danú kombináciu antineoplastického prostriedku (antineoplastických prostriedkov) a zlúčeniny všeobecného vzorca I možno použiť v spojení s inými spôsobmi iiečenia rakoviny (prednostne rakovinových nádorov) vrátane, avšak bez obmedzenia, radiačnej terapie a chirurgických zákrokov. Ďalej je potrebné si uvedomiť, že cytostatický prostriedok alebo prostriedok uvádzajúci bunky do kľudového stavu, pokiaľ sa používa, sa môže podávať postupne alebo súčasne s ktoroukoľvek inou synergickou terapiou alebo so všetkými spôsobmi týchto terapií.

Kombinácie podľa tohto vynálezu sa tiež môžu podávať spolu s ďalšími dobre známymi terapeutickými prostriedkami, ktoré sa volia vzhľadom na ich zvláštnu použiteľnosť oproti tomu stavu, ktorý sa má liečiť. Kombinácie podľa tohto vynálezu sa môžu alternatívne používať postupne spolu so známym farmaceutický prijateľným prostriedkom (so známymi prostriedkami) pokiaľ je kombinovaná formulácia nevhodná.

Chemoterapeutický prostriedok (prostriedky) a/alebo terapia žiarením sa môžu používať podľa terapeutických spôsobov dobre známych v odbore. Tomu, kto má skúsenosti v odbore, bude zrejmé, že sa podávanie chemoterapeutického prostriedku (chemoterapeutických prostriedkov) a/alebo radiačnej terapie môže meniť v závislosti od ochorenia, ktoré sa má liečiť a od známych účinkov chemoterapeutického prostriedku (chemoterapeutických prostriedkov) a/alebo radiačnej terapie na túto chorobu. V súlade so znalosťou skúseného klinického odborníka sa rovnako spôsoby terapie (napríklad dávkové množstvá a časy podávania) môžu meniť vzhľadom na pozorované účinky podávaných terapeutických prostriedkov (t.j. antineoplastického prostriedku (prostriedkov) alebo žiarenia) na pacienta a vzhľadom na pozorované odpovede ochorenia na podané terapeutické prostriedky.

V spôsoboch podľa tohto vynálezu sa podáva zlúčenina všeobecného vzorca I súčasne alebo postupne s niektorým antiproliferačným prostriedkom a/alebo s ožiarením. Nie je teda nevyhnutné podávať chemoterapeutický prostriedok (chemoterapeutické prostriedky) a zlúčeninu všeobecného vzorca I alebo ožarovanie a zlúčeninu všeobecného vzorca I súčasne alebo v podstate súčasne. Výhodu súčasného alebo v podstate súčasného podávania určí skúsený klinický odborník.

Všeobecne sa zlúčenina všeobecného vzorca I a chemoterapeutický prostriedok (chemoterapeutické prostriedky) taktiež nemusia podávať v rovnakej farmaceutickej kompozícii a môžu sa vzhľadom na rôzne fyzikálne a chemické vlastnosti podávať rôznymi spôsobmi. Napríklad možno zlúčeninu všeobecného vzorca I podávať perorálne na získanie a udržiavanie jej vhodných hladín v krvi, zatiaľ čo chemoterapeutický prostriedok (chemoterapeutické prostriedky) sa môže (môžu) podávať intravenózne. Stanovenie režimu podávania a vhodnosti podávania v prípade možnosti v rovnakej farmaceutickej kompozícii patrí do rámca znalostí skúseného klinického odborníka. Počiatočné podávanie možno uskutočniť podľa dobre zavedených protokolov známych v odbore a ďalej na základe pozorovaných účinkov, dávkovania, režimov podávania a časov podávania môže skúsený klinický odborník zavádzať modifikácie.

Konkrétna voľba zlúčeniny všeobecného vzorca I a protiproliferačného cytotoxického prostriedku (cytotoxických prostriedkov) alebo ožarovania bude závisieť od diagnózy ošetrujúcich lekárov a od ich posúdenia stavu pacienta a od príslušného liečebného protokolu.

Pokiaľ sa zlúčenina všeobecného vzorca I a antineoplastický prostriedok (antineoplastické prostriedky) a/alebo ožarovanie nepoužívajú súčasne alebo v podstate súčasne, potom sa môže počiatočné poradie podávania zlúčeniny všeobecného vzorca I a chemoterapeutického prostriedku (chemoterapeutických prostriedkov) a/alebo žiarenia meniť. Preto napríklad možno zlúčeninu všeobecného vzorca I podávať ako prvú s nasledujúcim podaním antiproliferačného prostriedku (antiproliferačných prostriedkov) a/alebo s nasledujúcim ožiarením alebo možno najprv podať antiproliferačný prostriedok (antiproliferačné prostriedky) a/alebo použiť ožarovanie ako prvé s nasledujúcim podaním zlúčeniny všeobecného vzorca I. Toto striedavé podávanie sa môže opakovať v priebehu jedného liečebného cyklu. Stanovenie poradia podávania a počtu opakovaní podávania každého terapeutického prostriedku v priebehu jedného liečebného cyklu patrí do rámca znalostí skúseného klinického odborníka po vyhodnotení ochorenia, ktoré sa má liečiť a stavu daného pacienta. Napríklad možno antineoplastický prostriedok (antineoplastické prostriedky) a/alebo ožarovanie použiť na počiatku, predovšetkým pokiaľ sa použije niektorý cytotoxický prostriedok. Liečenie potom pokračuje podaním zlúčeniny všeobecného vzorca I a prípadne pokračuje podaním cytostatického prostriedku, pokiaľ sa požaduje, do dokončení liečebného cyklu.

Preto v súlade so skúsenosťou a znalosťou praktického lekára možno modifikovať každý liečebný protokol na podávanie niektorej zložky (terapeutického prostriedku, to jest zlúčeniny všeobecného vzorca I, antineoplastického prostriedku (prostriedkov) alebo žiarenia) liečby podľa individuálnych potrieb pacienta tak, ako liečenie pokračuje.

Ošetrujúci lekár posudzujúc účinnosť liečby pri podávanom dávkovaní bude zvažovať všeobecný prospech pacienta, rovnako tak ako zreteľné príznaky, ako je uľahčenie symptómov vzťahujúcich sa na ochorenie, inhibícia rastu tumoru, skutočné zmenšenie objemu tumoru alebo inhibícia tvorby metastáz. Veľkosť tumoru sa môže merať štandardnými spôsobmi, ako sú rádiologické spôsoby, napríklad snímanie CAT alebo MRI a následné merania možno použiť na posúdenie, či sa dosiahlo oneskorenie alebo dokonca zvrat rastu tumoru. Uľahčenie symptómov vzťahujúcich sa na ochorenie, ako je bolesť a zlepšenie celkového stavu možno tiež použiť, aby sa napomohlo posúdeniu účinnosti liečby.

Na uľahčenie ďalšieho pochopenia tohto vynálezu sa predkladajú nasledujúce príklady predovšetkým na ilustráciu jeho konkrétnejších podrobností. Nemožno uvažovať, že by sa rozsah tohto vynálezu obmedzoval týmito príkladmi, pretože tento vynález zahrňuje úplný obsah definovaný nárokmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Experimentálny protokol - zlúčeniny

Na identifikáciu skúšaných látok sa používajú v príkladoch nasledovné označenia.

Zlúčenina 1

N-[5-[[[5-(1,1-Dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid

Zlúčenina 2

Hydrochlorid (R)-2,3,4,5-tetrahydro-1 -(1 H-imidazol-4-ylmetyl)-3-(fenylmetyl)-4-(2tienylsulfonyl)-1 H-1,4-benzodiazepín-7-karbonitrilu

Nasledujúce látky a spôsoby sa poskytujú na uľahčenie uskutočnenia spôsobov podľa tohto vynálezu.

Štúdia in vitro

Zlúčeniny

Všetky zlúčeniny pripravuje skupina lekárskej chémie pri Bristol-Myers Squibb

Pharmaceutical Research Inštitúte. Zlúčeniny sa solubilizujú v 100 % dimetylsulfoxide pri koncentrácii 10 mM pre všetky experimenty. Zriedenie zlúčenín sa uskutočňuje do príslušných rastových médií.

Bunková kultúra

Bunkové línie sa udržiavajú v RPMI-1640 s 10 % fetálneho bovinného séra.

Stanovenie na základe inhibície CDK1/cyklín B1 kinázy

Kinázové reakčné zmesi obsahujú 100 ng bakulovírusom exprimovaného komplexu GST-CDK1/cyklín B1, 1 pm histónu H1 (Boehringer Mannheim,

Indianapolis, IN), 0,2 pCi ³³P gama-ATP, 25 pm ATP v 50 pl kinázového pufra (koncentrácia 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM chloridu horečnatého, 1 mM EGTA, 0,5 mM DTT). Zmesi sa inkubujú počas 45 min pri teplote 30 °C a reakcia sa zastaví pridaním chladnej kyseliny trichlóroctovej (TCA) do konečnej koncentrácie 15 %. Zrazeniny získané kyselinou trichlóroctovou sa zbierajú na unifiltračné doštičky GF/C (Packard Inštrument Co., Meriden, CT) s použitím univerzálneho zariadenia na zber Filtermate (Packard Inštrument Co., Meriden, CT) a filtre sa vyhodnotia kvantitatívne s použitím kvapalinového scintilačného počítača Top-Count pre 96 jamiek (Packard Inštrument Co., Meriden, CT). Krivky dávka - odpoveď sa vynesú na stanovenie koncentrácie požadovanej na inhibíciu 50 % kinázovej aktivity (IC₅₀). Zlúčeniny sa rozpúšťajú pri koncentrácii 10 mM v dimetylsulfoxide a vyhodnotia sa pre šesť koncentrácií, pre každú koncentráciu trikrát. Konečná koncentrácia dimetylsulfoxidu v zmesi je 2 %. Hodnoty IC₅o sa odvodia nelineárnou regresnou analýzou a majú koeficient rozptylu (smerodajná odchýlka/stredná hodnota, n = 6) = 16 %.

Stanovenie na základe inhibície CDK 2/cyklín E kinázy

Kinázové reakčné zmesi obsahujú 5 ng bakulovírusom exprimovaného komplexu GST-CDK2/cyklín E, 0,5 pg GST-RB hybridného proteínu (aminokyseliny

776 až 928 proteínu retinoblastómu), 0,2 pCi ³³P gama-ATP, 25 μΜ ATP v 50 μΙ kinázového pufra (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM chloridu horečnatého, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Reakčné zmesi sa inkubujú počas 45 min pri teplote 30 °C a reakcia sa zastaví pridaním chladnej kyseliny trichlóroctovej (TCA) do konečnej koncentrácie 15 %. Zrazeniny vytvorené kyselinou trichlóroctovou sa zbierajú na unifiltračné doštičky GF/C (Packard Inštrument Co., Meriden, CT) s použitím univerzálneho zariadenia na zber Filtermate (Packard Inštrument Co., Meriden, CT) a filtre sa vyhodnotia kvantitatívne s použitím 96 jamkového zariadenia scintilačného počítača TopCount (Packard Inštrument Co., Meriden, CT). Krivky dávka - odpoveď sa vynesú na stanovenie koncentrácie požadovanej na inhibíciu 50 % kinázovej aktivity (IC50). Zlúčeniny sa rozpúšťajú pri koncentrácii 10 nM v dimetylsulfoxide a hodnotia sa pre šesť koncentrácií, pre každú koncentráciu trikrát. Konečná koncentrácia DMSO v zmesi je 2 %. Hodnoty IC₅₀ sa odvodia nelineárnou regresnou analýzou a majú koeficient rozptylu (smerodajná odchýlka/stredná hodnota, n = 6) = 14 %.

Stanovenie na základe CDK4/cyklín D1 kinázy

Kinázové reakčné zmesi obsahujú 150 ng bakulovírusom exprimovanej GSTCDK4, 280 ng Stag-cyklín D1, 0,5 pg GST-RB hybridného proteínu (aminokyseliny 776 až 928 proteínu retinoblastómu, 0,2 pCi ³³P gama-ATP, 25 μΜ ATP v 50 μΙ kinázového pufra (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM chloridu horečnatého, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Reakčné zmesi sa inkubujú počas 45 min pri teplote 30 °C a reakcia sa zastaví pridaním chladnej kyseliny trichlóroctovej (TCA) do konečnej koncentrácie 15 %. Zrazeniny vytvorené kyselinou trichlóroctovou sa zbierajú na unifiltračné doštičky GF/C (Packard Inštrument Co., Meriden, CT) s použitím univerzálneho zariadenia na zber Filtermate (Packard Inštrument Co., Meriden, CT) a filtre sa vyhodnotia kvantitatívne s použitím 96 jamkového zariadenia scintilačného počítača TopCount (Packard Inštrument Co., Meriden, CT). Krivky dávka - odpoveď sa vynesú na stanovenie koncentrácie požadovanej na inhibíciu 50 % kinázovej aktivity (IC₅₀). Zlúčeniny sa rozpúšťajú pri koncentrácii 10 nM v dimetylsulfoxide a hodnotia sa pre šesť koncentrácií, pre každú koncentráciu trikrát. Konečná koncentrácia DMSO v zmesi je 2 %. Hodnoty IC₅₀ sa odvodia nelineárnou regresnou analýzou a majú koeficient rozptylu (smerodajná odchýlka/stredná hodnota, n = 6) = 18 %.

Analýza bunkového cyklu

Bunky A2780s log fázy sa pestujú cez noc v 6 jamkových doštičkách. Bunky sa spracujú rôznymi koncentráciami zlúčeniny 1 pre rôzne časy. Bunky sa zbierajú trypsinizáciou s nasledujúcou centrifugáciou. Bunkové pelety sa potom resuspendujú vírivým miešaním v 1 ml 80 % metanolu a fixujú sa cez noc pri teplote -20 °C. Bunky sa získajú centrifugáciou a premyjú sa dvakrát 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom. Bunky sa resuspendujú v 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom s 2 % fetálneho bovinného séra, 0,25 % Tritonu X-100 a inkubujú sa pri teplote 4 °C počas 10 min. Bunky sa opäť získajú centrifugáciou a resuspendujú v 50 μΙ fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom s 2 % fetálneho bovinného séra a 0,1 % Tritonu X-100. Pridá sa protilátka proti fosfo-treonín prolínu (IgM, New England Biolabs #9391 S) a bunky sa inkubujú počas 30 min pri teplote 4 °C. Premyjú sa fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom s 2 % fetálneho bovinného séra, 0,1 % Tritonu X-100 a resuspendujú v 50 μΙ fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom s 2 % fetálneho bovinného séra a 0,1 % Tritonu X-100. Pridá sa protilátka proti myšiemu FITC (Pharmingen #12064D) a zmes sa inkubuje počas 30 min pri teplote 4 °C v tme. Bunky sa premyjú fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom s 2 % fetálneho bovinného séra a 0,1 % Tritonu X-100 a resuspendujú sa v propídium-jodid/RNáze vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (10 pg/ml PI, 100 μg/ml RNázy (bez DNázy) a inkubujú sa pri teplote 37 °C počas 30 min v tme. Vzorky sa analyzujú s použitím prietokového cytometra.

Westernovo blotovanie

Zlúčeninami spracované A2780S bunky sa zbierajú približne pri 70 % splynutí a celkový proteín sa získa cytolýzou buniek v pufri RIPA [koncentrácia 50 mM Tris (pH 8), 150 mM chloridu sodného, 1 % NP-40, 0,5 % nátrium-deoxykolátu, 0,1 % SDS, 0,1 % vanadičnanu sodného, 0,1 mM fluoridu sodného, 10 mM βglycerofosfátu, plus proteázové inhibítory Complete® (Boehringer Mannheim)]. Pelety buniek sa resuspendujú pri hustote nižšej než 2 x 10⁷ buniek/ml a inkubujú sa počas 20 min na ľade s nasledujúcou vysokorýchlostnou centrifugáciou pri frekvencii otáčania 14000 min'¹. Proteínový supernatant sa odstráni zo zvyškov buniek a obsah proteínu sa vyhodnotí kvantitatívne s použitím rozboru Micro-BCA (Pierce). Spracované extrakty (25 pg/dráha) sa potom oddelia s použitím 10 % SDSpolyakrylamidového gélu (10,5 x 14 cm). Proteiny sa potom prenesú z gélu na membránu PVDF (Millipore) pri expozícii 0,8 A/cm² v polosuchom blotovacom zariadení (Hoeffer). Skupiny proteinov PVDF sa potom blokujú 5 % netučným mliekom v TTBS (0,1 % Tween 20 vo fyziologickom roztoku pufrovanom Tris). Škvrny sa potom sondujú primárnou protilátkou v 5 % netučnom mlieku v TTBS počas 1 až 2 h s nasledujúcim trojnásobným premytím TTBS. Sekundárna protilátka konjugovaná s HRP sa potom inkubuje škvrnami v TTBS počas 30 min. Škvrny sa potom premyjú trikrát TTBS a vyvíjajú ECL s Westernovým blotovacím detekčným systémom (Amersham).

Stanovenie na základe klonogénneho rastu a štúdie s kombináciami liekov

Inhibícia rastu kolónií sa meria pre bunky karcinómu vaječníkov A2780 s použitím štandardného klonogénneho rozboru. V stručnosti sa 200 buniek/jamka nanáša na 6 jamkové doštičky pre tkanivové kultúry (Falcon, Franklin Lakes, NJ) a nechajú sa, aby sa pripojili, počas 18 h. Prostredie pre rozbor obsahuje RPMI-1640 s 10 % fetálneho bovinného séra. Bunky sa potom spracujú v dvojitom uskutočnení na získanie krivky dávka - odpoveď pre šesť koncentrácii. Maximálna koncentrácia dimetylsulfoxidu nikdy neprevyšuje 0,25 %. Bunky v štúdiách kombinácií sa exponujú zlúčenine 1 po udaný čas, tá sa potom odstráni a bunky sa premyjú dvoma objemami fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom. Potom sa obnoví normálne rastové médium alebo sa bunky exponujú zlúčenine 2. Po konečnej expozícii zlúčenine sa bunky premyjú dvoma objemami fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom a opäť sa obnoví normálne rastové médium. Kolónie sa zásobujú čerstvým médiom každý tretí deň. Počet kolónii sa hodnotí v dňoch 10 až 14 s použitím zobrazovacieho zariadenia Optimax. Koncentrácia zlúčeniny potrebná na inhibíciu 50 % alebo 90 % tvorby kolónií (IC50 respektíve IC90) sa stanoví nelineárnou regresnou analýzou. Koeficient rozptylu (smerodajná odchýlka/stredná hodnota, n = 3) = 30 %. Účinky liečby kombináciou sa vyhodnotia s použitím multiplicitného spôsobu opísaného Stephensom a Steelom (2). Tento spôsob predpokladá jednoduchý lineárny izobologram, čo znamená, že každý jednotlivý prostriedok vykazuje lineárnu krivku dávka/odpoveď. Tento predpoklad umožňuje získanie teoretickej krivky nazývanej čiara multiplicity, ktorá predstavuje očakávanú aditívnu odpoveď.

Testovanie protitumorového pôsobenia in vivo

Podanie lieku

Zlúčenina 1 sa najprv rozpustí v zmesi Cremophor®/etanol (50 : 50). Konečné zriedenie na požadovanú silu dávkovania sa uskutoční vodou takým spôsobom, že roztoky na podávanie obsahujú zmes Cremophor®/etanol/voda v pomere 10 : 10 : 80. Paklitaxel sa rozpustí v zmesi etanolu a Cremophoru® 50/50 a uchováva sa pri teplote 4 °C. Konečné zriedenie paklitaxelu sa získa bezprostredne pred podaním lieku s použitím 0,9 % roztoku chloridu sodného. 5-FU sa rozpustí v normálnom fyziologickom roztoku (0,9 % roztok chloridu sodného). Flavopiridol sa rozpustí v zmesi Cremophor®/etanol/voda v pomere 10 : 10 : 80. Objem všetkých injekčné podávaných zlúčenín je 0,01 ml/g hmotnosti myši.

Pokusné zvieratá

Všetky hlodavce pochádzajú od Harlan Sprague Dawley Co. (Indianapolis, Indiana) a udržiavajú sa v prostredí bez amoniaku v definovanej kolónii bez patogénnych mikróbov. Program starostlivosti o zvieratá Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Inštitúte je plne akreditovaný združením Američan Association for Accreditation of Laboratory Animal Čare (AAALAC).

Xenotransplantáty solidných tumorov u atymických myší

Používajú sa nasledujúce tumory: ľudský karcinóm vaječníkov A2780, myší karcinóm mliečnej žľazy Br-cycE, ľudský skvamózny bunkový karcinóm A431 a kolorektálny karcinóm Colo 205.

Všetky solidné tumory sa udržiavajú na atymických myšiach Balb/c nu/nu.

Tumory sa prenášajú ako subkutánne transplantáty s použitím fragmentov tumorov od myších darcov. Všetky transplantáty tumorov na testovanie účinnosti sú subkutánne (sc).

Požadovaný počet zvierat potrebný na detekciu zmysluplnej odpovede sa rozdelí do skupín na začiatku experimentu a každé zviera získa subkutánny transplantát fragmentu tumoru (približne 50 mg) s použitím trokára veľkosti 13. Na liečenie tumorov v rannej fáze sa zvieratá opäť rozdelia do skupín pred distribúciou do rôznych liečených a kontrolných skupín. Na liečenie zvierat s ochorením v pokročilom štádiu sa tumory ponechávajú rásť na vopred určený interval veľkostí (zvieratá s tumormi mimo toto rozmedzie sa vylučujú) a potom sa zvieratá rovnomerne rozdelia do rôznych liečených a kontrolných skupín. Liečenie každého zvieraťa sa zakladá na individuálnej telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o toxicitu/mortalitu vzťahujúcu sa k liečbe, liečené zvieratá sa kontrolujú denne. Každá skupina zvierat sa váži pred začatím pokusu (Wt1) a potom opäť po poslednej liečebnej dávke (Wt2). Rozdiel telesných hmotností (Wt2 - Wt1) poskytuje mieru toxicity vzťahujúcu sa k liečbe.

Odpoveď tumoru sa stanoví meraním tumorov posuvným meradlom dvakrát týždenne tak dlho, až tumory dosiahnu vopred určenú cieľovú” veľkosť 1 g. Hmotnosti tumoru (mg) sa stanovia zo vzorca hmotnosť tumoru = (dĺžka x šírka²) / 2

Protinádorová aktivita sa hodnotí pre maximálnu tolerovanú dávku (MTD), ktorá sa definuje ako hladina dávky bezprostredne pod výskytom nadmernej toxicity (to jest viac ako jeden úhyn). Maximálne tolerovaná dávka je často ekvivalentná optimálnej dávke (OD). Keď dôjde k úhynu, zaznamená sa deň úhynu. Ošetrené myši, ktoré uhynú skôr, než ich tumory dosiahnu cieľovú veľkosť, sa považujú za zvieratá, ktoré uhynuli následkom toxicity lieku. Žiadna kontrolná myš s tumormi neuhynula pred dosiahnutím cieľovej veľkosti. Liečené skupiny s viac ako jedným úhynom spôsobeným toxicitou lieku sa uvažujú v tom zmysle, že obdržali nadmerne toxické liečby a ich údaje sa nezahrňujú do hodnotenia protitumorovej účinnosti zlúčeniny.

Konečný čas odpovede tumoru sa vyjadri ako oneskorenie rastu tumoru (hodnota T - C) definovaná ako rozdiel času (d) požadovaného pre liečené tumory (T) na dosiahnutie vopred určenej cieľovej veľkosti v porovnaní s veľkosťou kontrolnej skupiny C.

Na určenie usmrtenia buniek sa najprv vypočíta čas zdvojnásobenia objemu tumoru (TVDT) zo vzorca

TVDT = čas mediánu (d) pre kontrolné tumory na dosiahnutie cieľovej veľkosti - čas mediánu (d) pre kontrolné tumory na dosiahnutie polovice cieľovej veľkosti a log usmrtenia buniek = T - C/(3,32 x TVDT).

Štatistické vyhodnotenie údajov sa uskutoční s použitím Gehanovho generalizovaného Wilcoxonovho testu.

Príklad 1

Ďalšia štúdia in vitro

Účinnosť zlúčeniny 1 sa hodnotí na ľudskej rekombinantnej CDK2 a na paneli proteínkináz in vitro (3). Zlúčenina 1 inhibuje s vysokou účinnosťou fosforyláciu RB proteinu proteínkinázou CDK2 in vitro s IC₅₀ 48 nM (tabuľka 2). Mechanizmus inhibície spočíva v priamej kompetícii s ATP substrátom. Zlúčenina 1 je menej účinná oproti ostatným členom cyklín-dependentnej kinázovej skupiny s IC50 480 a 925 nM voči kináze CDK1 respektíve CDK4.

Tabuľka 2 - Schopnosti zlúčeniny 1 a flavopiridolu inhibovať kinázu in vitro

Proteínkináza	Flavopiridol IC5o(nm)	Zlúčenina 1 IC5o(nm)
CDK1/cyklín B	30	480
CDK2/cyklín E	170	48
CDK4/cyklín D1	100	925

Účinok zlúčeniny 1 na pokračovanie bunkového cyklu v čase 8 a 24 h po liečení ukazuje tabuľka 3. Koncentrácia použitého lieku v tomto experimente je ekvivalentná IC90 pre spracovanie počas 72 h (170 nM). Expozícia lieku počas 8 h je dostatočná na pozmenenie distribúcie normálneho bunkového cyklu. Tieto účinky sú dokonca ešte silnejšie vyjadrené pri spracovaní vzorkou lieku počas 24 h. Zlúčenina spôsobuje dramatický pokles populácií buniek vo fáze S i vo fáze M a dramatický vzrast sub-G1 alebo apoptických buniek.

Tabuľka 3 - Zlúčenina 1 pozmeňuje distribúciu bunkového cyklu a vyvoláva apoptózu

Profil bunkového cyklu, A2780S	G1 %	S %	G2 %	M %	Apo*
Kontrola	58	20	16,5	2,5	3
Expozícia 8 h, 170 nM	56	15	22	1	6
Expozícia 24 h, 170 nM	45	8	9,7	0,3	32±12

* Stupeň apoptózy sa hodnotí farbením DNA buniek sub-G1.

Mechanizmus apoptózy sa ďalej overuje a definuje sledovaním aktivácie kaspáz s nasledujúcim spracovaním zlúčeninou 1. Štiepenie PARP slúži ako prijímaný marker na aktiváciu kaspázových kaskád (napríklad kaspázy 3). Po expozícii buniek A2780s zlúčenine 1 sa pripravia proteínové extrakty a stav PARP sa overuje Westernovým blotovaním (obrázok 3). Je zrejmé, že natívny proteín PARP 100 kD sa štiepi už 6 h po expozícii lieku. To sa signalizuje výskytom odštiepeného proteínového fragmentu PARP 85 kD. Rozsiahle štiepenie (to jest kaspázová aktivácia) sa vyskytuje v čase 24 h konzistentne s výskytom vyššie diskutovaných buniek sub-G1. Tieto pozorovania potvrdzujú, že spracovanie zlúčeninou 1 vedie k apoptickému alebo programovanému zániku buniek.

Účinnosť in vivo

Účinnosť zlúčeniny 1 in vivo sa hodnotí na 5 preklinických nádorových modeloch in vivo vrátane myšej leukémie ip/ip P388, ľudského karcinómu vaječníkov sc A2780, myšieho karcinómu mliečnej žľazy Br-cycE, ľudského skvamózneho bunkového karcinómu A431 a ľudského karcinómu kolónu Colo205 (6). Zlúčenina 1 sa porovnáva v priamom porovnaní s flavopiridolom na každom z týchto modelov. Navyše sa pre zlúčeninu 1 stanovuje cesta podávania, závislosť od rozpisu podávania a minimálna expozícia (6). Získané údaje na línii rektálneho karcínómu

Colo205 ukazuje obrázok 4.

Ľudský karcinóm kolónu Colo205

Zlúčenina 1 sa hodnotí priamym porovnaním s dvoma referenčnými prostriedkami (5-FU a paklitaxel) na ľudskom karcinóme kolónu Colo205. Zlúčenina 1 vykazuje významnú antitumorovú aktivitu s obdržaním viac než 2,0 LCK a s regresiou tumoru pri MTD 36 mg/kg, intraperitoneálne, denne počas 8 d. Paklitaxel podávaný pri svojej maximálnej tolerovanej dávke a pri optimálnom rozpise (36 mg/kg, dvakrát denne počas 5 d, IV) poskytuje protinádorovú aktivitu porovnateľnú so zlúčeninou 1 (obrázok 4). Avšak 5-FLI bol zreteľne menej účinný a nedokázal v tomto modeli dosiahnuť regresiu tumoru.

Kombinácia chemoterapie in vitro

Úspech inhibítora CDK2 zlúčeniny 1 závisí nielen od jeho protinádorovej aktivity pri jeho použití ako jednotlivého prostriedku, avšak tiež od jeho schopnosti úspešne sa kombinovať s inými antineoplastickými liekmi. Inhibítor bunkového cyklu by sa mohol použiť na synchronizáciu populácie tumorových buniek, čím by ju pripravil na následnú deštrukciu fázovo špecifickým cytotoxickým prostriedkom. V skutočnosti sa toto už preukázalo in vitro pre skoré inhibítory CDK, flavopiridol a olomoucín. Výskumní pracovníci preukázali, že flavopiridol môže potenciovať pôsobenie mnohých prostriedkov vrátane cisplatiny, mitomycínu C, paklitaxelu, cytarabínu, topotekanu, doxorubicínu, etopozidu a 5-fluóruracilu in vitro. Tieto nálezy ukazujú, že by sa mohli použiť špecifické prostriedky pre bunkový cyklus na zlepšenie terapeutického rozmedzia pre určité existujúce chemoterapie alebo na senzibilizáciu normálne rezistentných tumorov.

Stanovenie tvorby kolónií sa používa na testovanie zlúčeniny 1 v kombinácii s niekoľkými protinádorovými prostriedkami in vitro (5). Údaje sa analyzujú s použitím metódy multiplicity, ktorá predpokladá jednoduchý lineárny izobologram, čo znamená, že každý jednotlivý prostriedok vykazuje lineárnu krivku dávka-odpoveď. Tento predpoklad umožňuje tvorbu teoretickej krivky zvanej čiara multiplicity, ktorá predstavuje očakávanú aditívnu odpoveď. Táto analýza ukazuje, že režim interakcie medzi zlúčeninou 1 a ďalšími prostriedkami in vitro závisí od lieku, sekvencie a dávky. Pri kombinácii zlúčeniny 1 buď so zlúčeninou 2 alebo s cisplatinou (tabuľka 4, obrázok 5) možno zreteľne pozorovať synergické pôsobenie. To je zrejmé z posunu krivky dávka-odpoveď pre kombinované prostriedky k ľavej strane teoretickej čiary multiplicity. Tieto interakcie sú závislé od sekvencie. V oboch prípadoch liečenie zlúčeninou 1 pred expozíciou zlúčenine 2 alebo cisplatine poskytuje synergickú interakciu (obrázok 5, panel A). Striedavé sekvencie vedú k slabšej synergii alebo k aditívnej interakcii (to jest krivka prežívania pre kombinované prostriedky sa zhoduje s teoretickou čiarou multiplicity) s výnimkou zlúčeniny 2 nasledovanej zlúčeninou 1 (obrázok 5, panel B). Táto kombinácia je antagonistická (to jest s posunom k pravej strane teoretickej čiary multiplicity) za týchto podmienok. Kombinácia zlúčeniny 1 s paklitaxelom, gemcitabínom alebo doxorubicínom je za týchto podmienok aditívna bez ohľadu na sekvenciu.

Tabuľka 4 - Účinok sekvencie expozície liekom na cytotoxickú interakciu medzi zlúčeninou 1 a piatimi ďalšími antineoplastickými prostriedkami pre bunkovú líniu ľudského karcinómu vaječníkov A2780s

Sekvencia kombinácie	Typ interakcie
+ zlúčenina 2 (inhibítor farnezyltransferázy) zlúčenina 1 nasledovaná zlúčeninou 2 zlúčenina 2 nasledovaná zlúčeninou 1 súčasne	synergická antagonistická slabo synergická
+ Cisplatina (cisplatina) zlúčenina 1 nasledovaná Cisplatinou cisplatina nasledovaná zlúčeninou 1 súčasne	synergická slabo synergická aditívna
+ (Paklitaxel) zlúčenina 1 nasledovaná Paklitaxelom Paklitaxel nasledovaný zlúčeninou 1 súčasne	aditívna aditívna neuskutočňuje

+ (Doxorubicín) zlúčenina 1 nasledovaná Doxorubicínom Doxorubicín nasledovaný zlúčeninou 1 Súčasne	aditívna aditívna aditívna
+ (Gemcitabín)
zlúčenina 1 nasledovaná Gemcitabínom	aditívna
Gemcitabín nasledovaný zlúčeninou 1	slabo synergická
súčasne	aditívna

V súhrne pôsobí zlúčenina 1 synergicky so zlúčeninou 2 a cisplatinou pri zisťovaní tvorby kolónií in vitro. Táto aktivita závisí od frekvencie. Kombinácie zlúčeniny 1 s Paklitaxelom, Gemcitabínom a Doxorubicínom poskytuje aditívnu odpoveď za podmienok hodnotených v tejto štúdii.

Tento vynález sa neobmedzuje na uskutočnenia, ktoré sa konkrétne opisujú vyššie, avšak môže sa pozmeňovať a modifikovať bez odchýlky od obsahu pripojených patentových nárokov.

Claims (28)

1. Použitie (1) aspoň jedného antiproliferačného prostriedku a (2) zlúčeniny všeobecného vzorca I (D a ich farmaceutický prijateľných solí, v ktorom

Ri a R2 sú nezávisle od seba atóm vodíka, atóm fluóru alebo alkylová skupina,

R₃ je arylová skupina alebo heteroarylová skupina,

R₄ je atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina alebo

CO-alkylová skupina, CO-cykloalkylová skupina, CO-arylová skupina, COalkyl-cykloalkylová skupina, CO-alkyl-arylová skupina, CO-heteroarylová skupina, CO-alkyl-heteroarylová skupina, CO-heterocykloalkylová skupina, CO-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

CONH-alkylová skupina, CONH-cykloalkylová skupina, CONH-arylová skupina, CONH-alkyl-cykloalkylová skupina, CONH-alkyl-arylová skupina, CONH-heteroarylová skupina, CONH-alkyl-heteroarylová skupina, CONHheterocykloalkylová skupina, CONH-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

COO-alkylová skupina, COO-cykloalkylová skupina, COO-arylová skupina,

COO-alkyl-cykloalkylová skupina, COO-alkyl-arylová skupina, COOheteroarylová skupina, COO-alkyl-heteroarylová skupina, COOheterocykloalkylová skupina, COO-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

SO2-alkylová skupina, SO₂-cykloalkylová skupina, SO2-arylová skupina, SO2alkyl-cykloalkylová skupina, SO₂-alkyl-arylová skupina, SO₂-heteroarylová skupina, SO₂-alkyl-heteroarylová skupina, SO₂-heterocykloalkylová skupina, SO₂-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NCN)NH-alkylová skupina, C(NCN)NH-cykloalkylová skupina, C(NCN)NHarylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NCN)NH-alkylarylová skupina, C(NCN)NH-heteroarylová skupina, C(NCN)NH-alkylheteroarylová skupina, C(NCN)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NCN)NHalkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NNO)NH-alkylová skupina, C(NNO)NH-cykloalkylová skupina, C(NNO)NHarylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NNO)NH-alkylarylová skupina, C(NNO)NH-heteroarylová skupina, C(NNO)NH-alkylheteroarylová skupina, C(NNO)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NNO)NHalkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NH)NH-alkylová skupina, C(NH)NH-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-arylová skupina, C(NH)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkyl-arylová skupina, C(NH)NH-heteroarylová skupina, C(NH)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkylheterocykloalkylová skupina alebo

C(NH)NHCO-alkylová skupina, C(NH)NHCO-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-arylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-arylová skupina, C(NH)NHCO-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heterocykloalkylová skupina alebo

C(NOR6)NH-alkylová skupina, C(NOR₆)NH-cykloalkylová skupina, C(NOR₆)NH-arylová skupina, C(NOR₆)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NOR6)NH-alkyl-arylová skupina, C(NOR₆)NH-heteroarylová skupina, C(NOR6)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NOR₆)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NOR₆)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina,

R5 je atóm vodíka alebo alkylová skupina,

R6 je atóm vodíka, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, m je celé číslo od 0 do 2 a n je celé číslo od 1 do 3, na výrobu liečiva na liečenie proliferačných ochorení, vrátane rakoviny.

2. Použitie podľa nároku 1, pričom zlúčeninou všeobecného vzorca Ije zlúčenina vzorca II a enantioméry, diastereoméry a farmaceutický prijateľné soli tejto zlúčeniny, v ktorom

R7 je alkylová skupina,

Rs je atóm vodíka alebo alkylová skupina,

X je skupina NRg alebo skupina CHNR₉R₁₀,

R_g a R10 sú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylová skupina, substituovaná alkylová skupina, cykloalkylová skupina alebo substituovaná cykloalkylová skupina a n je 0, 1, 2 alebo 3.

3. Použitie podľa nároku 2, pričom zlúčeninou všeobecného vzorca I je N-[5[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidín-karboxamid, alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

4. Použitie podľa nároku 3, pričom farmaceutický prijateľnou soľou je tartarát.

5. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva s antiproliferačným prostriedkom podávaným pred podaním zlúčeniny všeobecného vzorca I.

6. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva s antiproliferačným prostriedkom podávaným po podaní zlúčeniny všeobecného vzorca I.

7. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva s antiproliferačným prostriedkom podávaným súčasne s podaním zlúčeniny všeobecného vzorca I.

8. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečenie rakovinových solidných tumorov.

9. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečenie refraktérnych tumorov.

10. Použitie podľa nároku 1, pričom antiproliferačný prostriedok je zvolený zo súboru zahrňujúceho prostriedok stabilizujúci mikrotubuly, prostriedok narušujúci mikrotubuly, alkylačný prostriedok, antimetabolit, epidofylotoxín, antineoplastický enzým, topizomerázový inhibítor, prokarbazín, mitoxantron, žiarenie a koordinačný komplex platiny.

11. Použitie podľa nároku 1, pričom antiproliferačný prostriedok je zvolený zo súboru zahrňujúceho antracyklínový liek, liek vinea, mitomycín, bleomycín, cytotoxický nukleozid, taxán, epotilón, diskodermolid, pteridínový liek, diynen, inhibítor aromatázy a podofylotoxín.

12. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva na podávanie zlúčeniny všeobecného vzorca I, pričom antiproliferačným prostriedkom je zlúčenina 2.

13. Použitie podľa nároku 2, pričom antiproliferačným prostriedkom je zlúčenina 2.

14. Použitie podľa nároku 3, pričom antiproliferačným prostriedkom je zlúčenina 2.

15. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva na podávanie zlúčeniny všeobecného vzorca I, pričom antiproliferačným prostriedkom je Cisplatina.

16. Použitie podľa nároku 2, pričom antiproliferačným prostriedkom je

Cisplatina.

17. Použitie podľa nároku 3, pričom antiproliferačným prostriedkom je

Cisplatina.

18. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva na podávanie zlúčeniny všeobecného vzorca I, pričom antiproliferačným prostriedkom je Karboplatina.

19. Použitie podľa nároku 2, pričom antiproliferačným prostriedkom je

Karboplatina.

20. Použitie podľa nároku 3, pričom antiproliferačným prostriedkom je

Karboplatina.

21. Použitie podľa nároku 1 na výrobu liečiva na podávanie zlúčeniny všeobecného vzorca I, pričom antiproliferačným prostriedkom je Gemcitabín.

22. Použitie podľa nároku 2, pričom antiproliferačným prostriedkom je

Gemcitabín.

23. Použitie podľa nároku 3, pričom antiproliferačným prostriedkom je

Gemcitabín.

24. Použitie podľa nároku 10, pričom zlúčenina všeobecného vzorca Ije zvolená z nasledujúcich zlúčenín

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid, (±)-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, (±)-1-(2,3-dihydroxypropyl)-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-

4-piperidínkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-1-(2-metyletyl)-4piperidínkarboxamid,

1-cyklopropyl-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4piperidínkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-1-(2-hydroxyetyl)-4piperidínkarboxamid, (R) -N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, (S) -N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, cis-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]cyklohexylkarboxamid, a trans-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]cyklohexyl46 karboxamid a ich farmaceutický prijateľných solí.

25. Použitie podľa nároku 11, pričom zlúčenina všeobecného vzorca I je zvolená z nasledujúcich zlúčenín

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidinkarboxamid, (±)-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, (±)-1-(2,3-dihydroxypropyl)-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-

4-piperidínkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-1-(2-metyletyl)-4-piperidínkarboxamid,

1 -cyklopropyl-N-[5-[[[5-(1,1 -dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-1-(2-hydroxyetyl)-4piperidínkarboxamid, (R) -N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, (S) -N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, cis-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]cyklohexylkarboxamid, a trans-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]cyklohexylkarboxamid a ich farmaceutický prijateľných solí.

26. Farmaceutická kompozícia na liečenie rakoviny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jeden antiproliferačný prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I, ako sa opisuje v nároku 1, a farmaceutický prijateľný nosič.

27. Farmaceutická kompozícia na liečenie rakoviny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jeden antiproliferačný prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I, ako sa opisuje v nároku 2, a farmaceutický prijateľný nosič.

28. Farmaceutická kompozícia na liečenie rakoviny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jeden antiproliferačný prostriedok a zlúčeninu všeobecného vzorca I, ako sa opisuje v nároku 3, a farmaceutický prijateľný nosič.

29. Farmaceutická kompozícia rakovinových solidných tumorov. podľa nároku 26 na synergickú liečbu 30. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 27 na synergickú liečbu rakovinových solidných tumorov. 31. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 28 na synergickú liečbu rakovinových solidných tumorov.

32. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26 na liečbu refraktérnych tumorov. 33. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 27 na liečbu refraktérnych tumorov. 34. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 28 na liečbu refraktérnych

tumorov.

35. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že antiproliferačný prostriedok predstavuje jeden alebo viac prostriedkov zvolených zo skupiny zahrňujúcej prostriedok stabilizujúci mikrotubuly, prostriedok narušujúci mikrotubuly, alkylačný prostriedok, antimetabolit, epidofylotoxín, antineoplastický enzým, inhibítor topoizomerázy, prokarbazín, mitoxantron, koordinačný komplex platiny, antracyklínový liek, liek vinea, mitomycín, bleomycín, cytotoxický nukleozid, taxán, zlúčeninu 2, epotiión, diskodermolid, pteridínový liek, diynen, inhibítor aromatázy a podofylotoxín.

36. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že antiproliferačný prostriedok predstavuje jeden alebo viac prostriedkov zvolených zo skupiny zahrňujúcej prostriedok stabilizujúci mikrotubuly, prostriedok narušujúci mikrotubuly, alkylačný prostriedok, antimetabolit, epidofylotoxín, antineoplastický enzým, inhibítor topoizomerázy, prokarbazín, mitoxantron, koordinačný komplex platiny, antracyklínový liek, liek vinea, mitomycín, bleomycín, cytotoxický nukleozid, taxán, zlúčeninu 2, epotiión, diskodermolid, pteridínový liek, diynen, inhibítor aromatázy a podofylotoxín.

37. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 28, vyznačujúca sa tým, že antiproliferačný prostriedok predstavuje jeden alebo viac prostriedkov zvolených zo skupiny zahrňujúcej prostriedok stabilizujúci mikrotubuly, prostriedok narušujúci mikrotubuly, alkylačný prostriedok, antimetabolit, epidofylotoxín, antineoplastický enzým, inhibítor topoizomerázy, prokarbazín, mitoxantron, koordinačný komplex platiny, antracyklínový liek, liek vinea, mitomycín, bleomycín, cytotoxický nukleozid, taxán, zlúčeninu 2, epotiión, diskodermolid, pteridínový liek, diynen, inhibítor aromatázy a podofylotoxín.

38. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca I volí zo skupiny nasledujúcich zlúčenín

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid, (±)-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, (±)-1-(2,3-dihydroxypropyl)-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]49

4-piperidínkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-1-(2-metyletyl)-4-piperidínkarboxamid,

1-cyklopropyl-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-1-(2-hydroxyetyl)-4piperidínkarboxamid, (R) -N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, (S) -N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-3-piperidínkarboxamid, cis-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]cyklohexylkarboxamid, a trans-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1 -dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]cyklohexylkarboxamid a ich farmaceutický prijateľných solí.

39. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že sa táto farmaceutický prijateľná soľ volí zo skupiny zahrňujúcej tartarátovú soľ, hydrochloridovú soľ, soľ kyseliny metánsulfónovej a soľ kyseliny trifluóroctovej.

40. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že sa táto farmaceutický prijateľná soľ volí zo skupiny zahrňujúcej tartarátovú soľ, hydrochloridovú soľ, soľ kyseliny metánsulfónovej a soľ kyseliny trifluóroctovej.

41. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 28, vyznačujúca sa tým, že sa táto farmaceutický prijateľná soľ volí zo skupiny zahrňujúcej tartarátovú soľ, hydrochloridovú soľ, soľ kyseliny metánsulfónovej a soľ kyseliny trifluóroctovej.

42. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou všeobecného vzorca I je N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ a antiproliferačným prostriedkom je zlúčenina 2.

43. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že týmto antiproliferačným prostriedkom je cisplatina a zlúčeninou všeobecného vzorca I je N-[5-[[ [5-( 1,1 -dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

44. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 26, vyznačujúca sa tým, že týmto antiproliferačným prostriedkom je gemcitabín a zlúčeninou všeobecného vzorca I je N-[5-[[[5-(1,1-dimetyletyl)-2-oxazolyl]metyl]tio]-2-tiazolyl]-4-piperidínkarboxamid alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.

45. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 37, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu 1 a Karboplatinu.

46. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 37, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu 1 a Doxorubicín.