CZ2004287A3 - Prostředky a způsoby pro léčení rakoviny - Google Patents

Description

Kompozice a způsoby pro léčení rakoviny

Oblast techniky

Tento vynález se týká oblastí molekulární biologie a onkologie. Konkrétněji tento vynález poskytuje kompozice a způsoby pro léčení proliferačních poruch, které vznikají jako následky aberantních událostí buněčné signalizace.

Tato patentová přihláška má právo přednosti z US předběžné patentové přihlášky č. 60/316 369 podané 31. srpna 2001, která se zde zahrnuje v plném znění formou odkazu.

Dosavadní stav techniky

V celém textu této patentové přihlášky se cituje několik odkazů na literaturu a patenty. Každý z těchto odkazů se zde zahrnuje formou citace tak, jako kdyby zde byl popsán v plném znění.

Nekontrolovaná proliferace je charakteristickým znakem rakovinových buněk. V průběhu posledních dvou desetiletí se stále více stává zřejmým, že v průběhu vzniku tumoru molekuly, které přímo ovládají průběh buněčného cyklu, hromadí defekty. Tyto defekty mohou mít za následek ztrátu řízené kontroly a/nebo nesprávnou aktivaci molekul řídících průběh buněčného cyklu {drivers), cyklin-dependentních kinas (CDK). Nesprávná regulace funkce CDK nastává velice často v hlavních typech solidních nádorů (včetně tumoru prsu, kolonu, NSCL, prostaty, žaludku, močového měchýře a vaječníků). Proto vykazují inhibitory cyklin-dependentních kinas a průběhu buněčného cyklu možnost schopnosti plnit značné terapeutické potřeby.

• · · · · ·

Cyklin-dependentní kinasy jsou serin/threonin protein kinasy, které převádějí signály, které řídí buněčný cyklus a proliferaci buněk. CDK jsou multisubjednotkové enzymy, které se skládají z alespoň jedné katalytické subjednotky a regulační (cyklinové) subjednotky (přehledný referát viz (1)). Dosud bylo identifikováno 9 CDK a více než 10 cyklinových subjednotek, které lze kombinovat s vytvořením více než 15 aktivních kinasovych komplexů. V normálních buňkách lze mnohé z těchto enzymů zařadit mezi enzymy fáze Gl, S nebo G2/M, které plní různé úlohy v průběhu buněčného cyklu. CDK zajišúují fosforylaci a modulují aktivitu různých buněčných proteinů, které zahrnují supresory tumoru (například RB, p53), transkripční faktory (například E2F-DP1, RNA pol II), replikační faktory (například DNA pol a, replikační protein A) a organizační faktory, které ovlivňují buněčné a chromátinové struktury (například histon Hl, lamin A, MAP4). Aktivita CDK se reguluje řadou koordinovaných mechanismů, které zahrnují transkripci a translaci závisející na buněčném cyklu, proteolýzu závisející na buněčném cyklu, subcelulární lokalizaci, posttranslační modifikace a interakci s CDK inhibítorovými proteiny (CKI). Bylo by velice vítané umožnit identifikaci prostředků, které modulují aktivitu CDK při způsobu léčby aberantní buněčné proliferace spojené s maligním růstem.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje způsob léčení proliferačnich onemocnění včetně rakoviny, který zahrnuje podávání savci, který potřebuje toto léčení, synergicky terapeuticky účinné množství (1) alespoň jednoho antiproliferačního prostředku a (2) sloučeniny obecného vzorce I • ·

(I) a její farmaceuticky přijatelné soli. Symboly, tak jak se používají v obecném vzorci I a v průběhu celého popisu, mají následující významy.

R a R jsou nezávisle na sobe atom vodíku, atom fluoru nebo

X 2 ^J alkylová skupina,

R₃ je arylová skupina nebo heteroarylová skupina,

R₄ je atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina nebo

CO-alkylová skupina, CO-cykloalkylová skupina,

CO-arylová skupina, CO-alkyl-cykloalkylová skupina, CO-alkyl-arylová skupina, CO-heteroarylová skupina, CO-alkyl-heteroarylová skupina, CO-heterocykloalkylová skupina, CO-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo • ·

CONH-alkylová skupina, CONH-cykloalkylová skupina, CONH-arylová skupina, CONH-alkyl-cykloalkýlová skupina, CONH-alkyl-arylová skupina, CONH-heteroarylová skupina, CONH-alkyl-heteroarylová skupina, CONH-heterocykloalkylová skupina, CONH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

COO-alkylová skupina, COO-cykloalkylová skupina, COO-arylová skupina, COO-alkyl-cykloalkylová skupina, C00-alkyl-arylová skupina, COO-heteroarylová skupina, COO-alkyl-heteroarylová skupina, COO-heterocykloalkylová skupina, COO-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

SO-alkylová skupina, SO₂-cykloalkylová skupina, S0₂-arylová skupina, SO₂-alkyl-cykloalkylová skupina, S0₂-alkyl-arylová skupina, S0₂-heteroarylová skupina, SO -alkyl-heteroarylová skupina, SO -heterocykloalkýlová skupina, S0_a~alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NCN)NH-alkylová skupina, C(NCN)NH-cykloalkylová skupina, C(NCN)NH-arylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-arylová skupina, C(NCN)NH-heteroarylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NCN)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C (NNO)NH-alkylová skupina, C (NNO)NH-cykloalkylová skupina, C(NNO)NH-arylová skupina, C (NNO) NH-alkyl -cykloalkylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-arylová skupina, C(NNO)NH-heteroarylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NNO)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo • · · · · ·

C (NH) NH-alkylová skupina, C(NH)NH-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-arylová skupina, C(NH)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkyl-arylová skupina, C(NH)NH-heteroarylová skupina, C(NH)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NH)NHCO-alkylová skupina, C(NH)NHCO-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-arylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-arylová skupina, C(NH)NHCO-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NOR_g)NH-alkylová skupina, C(NOR_g)NH-cykloalkylová skupina, C(NOR_g)NH-arylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-arylová skupina, C(NOR_g)NH-heteroarylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NOR_g)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina,

R_s je atom vodíku nebo alkylová skupina,

R_g je atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, m je celé číslo od 0 do 2 a • · n je celé číslo od 1 do 3.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou inhibitory protein kinasy a lze je použít při léčení a prevenci proliferačních onemocnění, například rakoviny, zánětu a artritidy. Lze je též použít při léčení neurodegenerativních onemocnění, jako jsou Alzheimerova choroba, kardiovaskulární onemocnění, virová onemocnění a plísňová onemocnění.

Tento vynález poskytuje sloučeniny obecného vzorce I, farmaceutické kompozice s obsahem těchto sloučenin a synergické způsoby používání těchto sloučenin pro léčení proliferačních poruch.

Níže se popisují definice různých pojmů používaných pro popis sloučenin podle tohoto vynálezu. Tyto definice se vztahují k pojmům tak, jak se zde používají v průběhu celého popisu (pokud se v konkrétních případech neomezují jiným způsobem), buď samostatně nebo jako části názvů větších skupin.

Je třeba poznamenat, že kterýkoliv heteroatom s nenasycenými valencemi má podle předpokladu atomy vodíku, které tyto valence nasycují.

Karboxylový anion se týká záporně nabité skupiny

-C00.

Pojem alkyl nebo alk se týká monovalentní skupiny odvozené od alkanu (uhlovodíku), která obsahuje od 1 do 12 atomů uhlíku, pokud se nedefinuje jinak. Alkylová skupina je uhlovodíková skupina s přímým, rozvětveným či cyklickým řetězcem, která může být případně substituovaná. V případě substituce může být tato alkylová skupina substituovaná až čtyřmi substitučními skupinami R podle definice ve kterékoliv dostupné poloze připojení. Pokud se popisuje, že je tato alkylová skupina substituovaná alkylovou skupinou, může se tento popis navzájem zaměňovat s pojmem rozvětvená alkylová skupina. Příklady nesubstituovaných skupin zahrnují methylovou skupinu, ethylovou skupinu, propylovou skupinu, isopropylovou skupinu, n-butylovou skupinu, terc-butylovou skupinu, isobutylovou skupinu, pentylovou skupinu, hexylovou skupinu, isohexylovou skupinu, heptylovou skupinu, 4,4-dimethylpentylovou skupinu, oktylovou skupinu, 2,2,4-trimethylpentylovou skupinu, nonylovou skupinu, decylovou skupinu, undecylovou skupinu, dodecylovou skupinu a podobně. Příklady substituentů mohou zahrnovat, avšak bez omezení, jednu či více z následujících skupin: atom halogenu (jako je atom fluoru, atom chloru, atom bromu, atom jodu), haloalkylová skupina (jako je trichlormethylová skupina nebo skupina CF), alkoxyskupina, alkylthioskupina, hydroxylová skupina, karboxylová skupina (-COOH), alkyloxykarbonylová skupina (-C(O)R), alkylkarbonyloxyskupina (-OCOR), aminoskupina (-NH), karbaraoylová skupina (-NHCOOR- nebo -OCONHR-), skupina močoviny (-NHCONHR-) nebo thioskupina (SH). Alkylové skupiny tak, jak se zde definují, mohou též obsahovat jednu Či více dvojných vazeb mezi atomy uhlíku nebo jednu či více trojných vazeb mezi atomy uhlíku.

Pojem alkenyl se týká uhlovodíkové skupiny, která je přímá, rozvětvená či cyklická a obsahuje od 2 do 12 atomů uhlíku a alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku. Pojem alkynylová skupina se týká uhlovodíkové skupiny, která je přímá, rozvětvená či cyklická a obsahuje od 2 do 12 atomů uhlíku a alespoň jednu trojnou vazbu mezi atomy uhlíku.

• · · • · · · · · · • · ·· · · · · • · · ··· ···· • · · · · · ·

Cykloalkýlová skupina je případ alkylové skupiny, která obsahuje od 3 do 15 atomů uhlíku bez střídavých či rezonujících dvojných vazeb mezi atomy uhlíku. Tato skupina může obsahovat od 1 do 4 kruhů. Příklady těchto nesubstituovaných skupin zahrnují cyklopropylovou skupinu, cyklobutylovou skupinu, cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, adamantylovou skupinu a tak dále. Příklady substituentů zahrnují jednu či více z následujících skupin: atom halogenu, alkylová skupina, alkoxyskupina, alkylhydroxylová skupina, aminoskupina, nitroskupina, kyanoskupina, thioskupina a/nebo alkylthioskupina.

Pojmy alkoxyskupina nebo ”alkylthioskupina, jak se zde používají, označují alkylovou skupinu, jak se popisuje výše, připojenou prostřednictvím atomu kyslíku (-0-) nebo prostřednictvím atomu síry (-S-).

Pojem alkyloxykarbonylová skupina, jak se zde používá, označuje alkoxyskupinu připojenou prostřednictvím karbonylové skupiny. Alkoxy-alkoxykarbonylová skupina se znázorňuje vzorcem -C(O)OR, ve kterém R je C_xg alkylová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem.

Pojem alkylkarbonylová skupina se týká alkylové skupiny připojené prostřednictvím karbonylové skupiny.

Pojem alkylkarbonyloxyskupina, jak se se používá, označuje alkylkarbonylovou skupinu, která se váže prostřednictvím atomu kyslíku.

Pojem arylalkylová skupina, jak se zde používá, označuje aromatický kruh připojený k některé z alkylových skupin popsaných výše.

• · · « * ·

Pojem arylová skupina se týká monocyklických či bicyklických aromatických kruhů, například v případě fenylové skupiny, substituované fenylové skupiny a podobně, stejně tak jako skupin, které jsou kondenzované, například naftylové skupiny, fenanthrenylové skupiny a podobně. Arylová skupina tedy obsahuje alespoň jeden kruh, který má alespoň 6 atomů, kde celkový počet kruhů je až pět a tyto kruhy obsahují až 22 atomů se střídavými (rezonujícími) dvojnými vazbami mezi sousedními atomy uhlíku nebo vhodnými heteroatomy. Arylové skupiny mohou být případně substituované jednou či více skupinami včetně, avšak bez omezení, atomu halogenu, alkylové skupiny, alkoxyskupiny, hydroxylové skupiny, karboxylové skupiny, karbamoylové skupiny, alkyloxykarbonylové skupiny, nitroskupiny, trifluormethylové skupiny, aminoskupiny, cykloalkylové skupiny, kyanoskupiny, skupiny alkyl-S(0) (m=0, 1, 2) nebo thiolové skupiny.

Pojem heteroarylová skupina se týká monocyklické aromatické uhlovodíkové skupiny, která obsahuje 5 nebo 6 atomů kruhu nebo bicyklické aromatické skupiny, která obsahuje 8 až 10 atomů kruhu a která obsahuje alespoň jeden heteroatom, jako je atom kyslíku, atom síry nebo atom dusíku, ve které je některý z atomů uhlíku nebo atomů dusíku bodem připojení a ve které se jeden či dva další atomy uhlíku případně nahrazují heteroatomem zvoleným z případů atom kyslíku nebo atom síry a ve které se případně nahrazuje od 1 do 3 dalších atomů uhlíku heteroatomy dusíku a tato heteroarylová skupiny může být případně substituovaná tak, jak se zde popisuje. Příklady heteroarylových skupin zahrnují následující skupiny: thienylová skupina, furylová skupina, pyrrolylová skupina, pyridylová skupina, imidazolylová skupina, pyrrolidinylová skupina, piperidinylová skupina, thiazolylová sku- 10 • · · · * · 9 · 9 • · · · · • · · • · 9 • · ·· · ·· ·· 99 9

9 9 9 9 9 9 • 9 99 9 9 9 9

99 999 9 9999

9 9 9 9 9 9

99 99 9 pina, oxazolylová skupina, triazolylová skupina, pyrazolylová skupina, isoxazolylová skupina, isothiazolylová skupina, pyrazinylová skupina, pyridazinylová skupina, pyrimidinylová skupina, triazinylazepinylová skupina, indolylová skupina, isoindolylová skupina, chinolylová skupina, isochinolylová skupina, benzothiazolylová skupina, benzoxazolylová skupina, benzimidazolylová skupina, benzoxadiazolylová skupina, benzofurazanylová skupina a tetrahydropyranylová skupina. Příklady substituentů zahrnují jeden substituent či více z následujících substituentů: atom halogenu, alkylová skupina, alkoxyskupina, hydroxylová skupina, karboxyskupina, karbamoylová skupina, alkyloxykarbonylová skupina, trifluormethylová skupina, cykloalkylová skupina, nitroskupina, kyanoskupina, aminoskupina, skupina alkyl-S(0)_m (m = 0, 1, 2) nebo thiolová skupina.

Pojem heteroarylium se týká heteroarylových skupin, které nesou některý kvartérní atom dusíku, takže mají kladný elektrický náboj.

Pojem heterocykloalkylová skupina se týká některé cykloalkylové skupiny (nearomatické skupiny), ve které se jeden či více atomů uhlíku v kruhu nahradí některým heteroatomem zvoleným z případů atom kyslíku, atom síry nebo atom dusíku a ve kterém lze nahradit až tři další atomy uhlíku těmito heteroatomy.

Pojem kvartérní dusík se týká elektricky kladně nabitého tetravalentního atomu dusíku včetně například elektricky kladně nabitého atomu dusíku v některé tetraalkylamonné skupině (jako je například tetramethylamonium, N-methylpyridinium), elektricky kladně nabitého atomu dusíku v protonované amoniové složce (jako je například trimethylhydro4* 4*44 • 4 • 4 9 ·

44 44 • 4 4 4 » «

4 · 4 4 4

4 444 44 4 *4 4

4 «444 4 4 4

444 44 44 44 4

- 11 4 4

444 amonium, N-hydropyridinium), elektricky kladně nabitého atomu dusíku v N-oxidech aminu {jako je například N-methylmorfolin-N-oxid, pyridin-N-oxid) a elektricky kladně nabitého atomu dusíku v některé N-aminoamoniové skupině (jako je například N-aminopyridinium) .

Pojem heteroatom znamená atom kyslíku, atom síry nebo atom dusíku, které se volí navzájem nezávisle.

Pojem halogen nebo halo se týká chloru, bromu, fluoru či jodu.

Jestliže se některá funkční skupina nazývá chráněnou, znamená to, že se tato skupina pozměňuje, aby se vyloučily nežádoucí vedlejší reakce na chráněném místě. Vhodné chránící skupiny pro sloučeniny podle tohoto vynálezu lze posoudit na základě této patentové přihlášky při úvaze úrovně zkušenosti v oboru a s odkazem na standardní monografie, jako je například T. W. Greene a kol., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, John Wiley & Sons, lne., N.Y. (1991) .

Vhodnými příklady solí sloučenin podle tohoto vynálezu s anorganickými či organickými kyselinami jsou hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, tartaráty a fosfáty. Soli sloučenin podle tohoto vynálezu zahrnují solváty, racemické směsi a veškeré stereoisomerní formy těchto sloučenin včetně enantiomerů a diastereomerů (například D-tartarátové soli a L-tartarátové soli). Solí, které jsou nevhodné pro farmaceutické použití, avšak které lze použít například pro izolaci nebo purifikaci volných sloučenin obecného vzorce I nebo jejich farmaceutické přijatelných solí se rovněž zahrnují do rámce tohoto vynálezu.

to* ···· to to • ··· •to ·· to* · to to* · · to · • · ·· · ♦ · · to · to · to · · · to to > ···« ·· ········ ·· toto· toto ·· ·· *

- 12 Příkladem sloučeniny obecného vzorce I je sloučenina obecného vzorce II znázorněného níže

a její enantiomery, diastereomery a farmaceuticky přijatelné soli, ve kterých

R_v je alkylová skupina,

R_e je atom vodíku nebo alkylová skupina,

X je skupina NR_g nebo skupina CHNR_sR_xo,

R_g a R jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, substituovaná alkylová skupina, cykloalkylová skupina nebo substituovaná cykloalkylová skupina a n j e 0, 1, 2 nebo 3.

Uvažují se veškeré stereoisomery sloučenin podle tohoto vynálezu, které jsou buď ve směsi nebo v čisté formě či ve formě, která je v podstatě čistá. Definice těchto sloučenin podle tohoto vynálezu zahrnuje veškeré možné stereoisomery a jejich směsi. Zejména zahrnuje racemické formy a izolované optické isomery, které mají udanou aktivitu. Racemic• · · · ké formy lze rozdělovat fyzikálními způsoby, jako je například frakční krystalizace, dělení nebo krystalizace diastereomerních derivátů nebo oddělení chirální sloupcovou chromatografií. Jednotlivé optické isomery lze obdržet z racemických směsí konvenčními způsoby, jako je například tvorba soli s některou opticky aktivní kyselinou s následující krystalizací.

Je třeba si uvědomit, že solváty {například hydráty) sloučenin obecného vzorce I rovněž patří do rámce tohoto vynálezu. Způsoby solvatace jsou obecně známé v oboru.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou zvláště použitelné jako vysoce účinné inhibitory protein kinasy a lze je použít ve způsobech léčení proliferačních onemocnění, jako je například rakovina, zánět a artritida. Mohou se též použít při léčení Alzheimerovy choroby, vypadávání vlasů souvisejícího s chemoterapií a kardiovaskulárního onemocnění.

Vhodné antiproliferační prostředky pro použití v synergických způsobech podle tohoto vynálezu zahrnují bez omezení alkylační prostředky (včetně bez omezení dusíkatých yperitů, ethyleniminových derivátů, alkylsulfonátů, nitrosomočovin a triazenů): Uracilový yperit, Chlormethin, Cyklofosfamid, Cytoxan^K, Ifosfamid, Melfalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylen-melamin, Triethylenthiofosforamin, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Streptozocin, Dakarbazin a Te~ mozolomid, antimetabolity (včetně bez omezení antagonistů kyseliny listové, pyrimidinových analogů, purinových analogů a inhibitorů adenosin deaminasy), Methotrexát, 5-Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, 6-Merkaptopurin, 6-Thioguanin, Fludarabin-fosfát, Pentostatin a Gemcitabin, přirozené produkty a jejich deriváty (například alkaloidy vinca, antitu- 14 • · ···· · · • · · · • · ··· · • · · · · • ♦ · · ·· ··· ·· morová antibiotika, enzymy, lymfokiny a epipodofylotoxiny): Vinblastin, Vinkristin, Vindesin, Bleomycin, Daktinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Ara-C, paklitaxel (paklitaxel je komerčně dostupný pod názvem Taxol^R), Mithramycin, Deoxyco-formycin, Mitomycin-C, L-Asparaginasa, Interferony {zejména IFN-a), Etoposid a Teniposid, navelben, CPT-11, anastrazol, letrazol, kapecitabin, reloxafin, cyklofosfamid, ifosamid a droloxafin, epothilon A, epothilon B, epothilon C, epothilon D, deoxyepothilon A, deoxyepothilon B, [1S-[IR*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-7,ll-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl~3-[l-methyl-2-(2-methyl-4-thiazolyl)ethenyl]-4-aza-17-azabicyklo[14.1.0]heptadekan-5,9-dion (popsaný v publikaci WO 99/02514), [1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3-[2-[2-(aminomethyl)-4-thiazolyl]-1-methylethenyl)-7,ll-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-4-17-dioxabicyklo-[14.1.0]heptadekan-5,9-dion (popsaný v US patentu č. 6 260 694, vydaném 17. července 2001) a jejich deriváty, další prostředky narušující mikrotubuly a záření.

Tento vynález dále poskytuje farmaceutický prostředek pro synergické léčení rakoviny, který obsahuje alespoň jeden antiproliferační prostředek a sloučeninu obecného vzorce I a některý farmaceuticky přijatelný nosič.

V jednom ztělesnění tohoto vynálezu se tento antiproliferační prostředek podává před působením sloučeniny obecného vzorce I. V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se tento antiproliferační prostředek podává současně se sloučeninou obecného vzorce I. V ještě dalším ztělesnění se sloučenina obecného vzorce I podává před podáním antiproliferačního prostředku.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1. Schéma řízené kontroly buněčného cyklu.

Obrázek 2. Schéma kontroly místa restrikce. CDK2 je klíčovým regulátorem místa restrikce, řízené kontroly buněčného cyklu řídící přechod z fáze G1 do fáze S buněčného cyklu.

Obrázek 3. Štěpení PARP se vyvolává po expozici sloučenině 1. Buňky A2780S se zpracují v průběhu 0, 1, 2, 4, a 24 h sloučeninou o koncentraci 20, 100 nebo 200 nm. Proteinové extrakty se poté vyšetřují Westernovým blotováním s použitím protilátky proti PARP (Clonetech). Šipka označuje proteinový fragment PARP odštěpený kaspasou.

Obrázek 4. Komparativní antitumorová aktivita sloučeniny 1, 5-FU a paklitaxelu na modelu lidského karcinomu kolonu Colo205. Sloučenina se podává při udaných dávkách při léčebných režimech intraperitoneálně jednou denně po dobu 8 d, intravenózně 7 krát denně po dobu 3 d respektive intravenózně 2 krát denně po dobu 5 d. Každý údaj znamená medián hmotnosti tumoru pro 8 myší. Horizontální úsečka označuje zpoždění růstu tumoru ekvivalentní 1 LCK.

Obrázek 5. Synergické působení sloučeniny 1 v kombinaci s inhibitorem farnesyl transferasy, sloučeninou 2 a sítovadlem DNA, cisplatinou, v klonogenní eseji in vitro s buňkami karcinomu ovarií A2780s. Různé koncentrace sloučeniny 2 nebo cisplatiny se kombinují se sloučeninou 1 o koncentraci 1,5 μΜ. Černé trojúhelníky znázorňují sloučeninu 2 nebo cisplatinu samotnou, červené kroužky představují kombinovanou cytotoxicitu sloučeniny 1 buď se sloučeninou 2 ne• ·

bo s cisplatinou a modrá čára představuje čáru multiplicity. Čára multiplicity znázorňuje úroveň cytotoxicity, jestliže dva kombinované prostředky poskytují aditivní cytotoxicitu a vyplývá z frakcí přežívání s každým prostředkem podávaným nezávisle. Sekvence a čas expozice léku jsou následující. A) Buňky se zpracují v průběhu časů 0 až 4 h sloučeninou 1 a následuje zpracování sloučeninou 2 po dobu 4 až 24 h nebo cisplatinou po dobu 24 až 28 h. B) Buňky se zpracují v průběhu 0 až 20 h sloučeninou 2 nebo v průběhu 0 až 4 h cisplatinou a poté se zpracovávají sloučeninou 1 po dobu 4 až 24 h nebo sloučeninou 2 a cisplatinou po dobu 24 až 28 h. C) Buňky se zpracují oběma prostředky současně v průběhu časů 0 až 4 h. Ve všech případech se hodnotí tvorba kolonií ve dnech 10 až 14.

Následuje podrobný popis vynálezu.

V souladu s tímto vynálezem se poskytují způsoby rozpisu podávání inhibitorů cyklin-dependentních kinas v synergické kombinaci (synergických kombinacích) s alespoň jedním antineoplastickým prostředkem nebo antiproliferačním prostředkem pro léčení a prevenci proliferačních onemocnění.

Příklad sloučeniny obecného vzorce I, sloučenina 1, je racionálně určený inhibitor CDK2. Účinnost a selektivní profil této sloučeniny se optimalizují pro poskytnutí maximálního protinádorového účinku při zachování zřetelného terapeutického intervalu. Sloučenina 1 inhibuje CDK2 s IC = 48 nM. Tato sloučenina je lOx a lOOx méně účinná proti velice příbuzným protein kinasam CDK1 respektive CDK4. Sloučenina 1 vykazuje význačnou selektivitu (více než 500 násobnou) proti 15 nepříbuzným serin/threonin a tyrosin protein kinasam. Sloučenina 1 je účinným a široce aktivním inhibito- 17 ·· · · ·· ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·· ··· ·· rem proliferace tumorových buněk in vitro. Léčení vede k náhlé inhibici pokračování buněčného cyklu s apoptickou odpovědí. Klonogenní eseje ukazují, že postačuje doba 8 h po expozici léku pro obdržení antiproliferační odpovědi in vitro. Při použití s klíčovou nádorovou terapií přední linie in vitro je aktivita sloučeniny 1 aditivní nebo synergická. Sloučenina 1 vykazuje široké spektrum antitumorové aktivity na četných modelech myších a lidských tumorů in vivo. Ty zahrnují myší leukémii P388, cyklin E transgenní myší karcinom mléčné žlázy, lidský karcinom ovarií A2780, lidský kolorektální karcinom Colo205 a lidský skvamózně buněčný karcinom A431. Sloučenina 1 vykazuje léčebnou účinnost při hladinách více dávek u xenotransplantátu lidského tumoru A2780 dávkovaného intraperitoneálně nebo v rozpisu denně po dobu 8 dnů. Aktivita je závislá na dávce a rozpisu s tím, že jednou denně po dobu 8 d = jednou denně po dobu 14 d »> 2 krát denně po dobu 5 d = 4 krát denně po dobu 3 d. Sloučenina 1 vykazuje mírný účinek na modelu xenotransplantátu A2780 při perorálním podávání v rozpisu jednou denně po dobu 8 d. Navíc léčba myší s tumorem A2780 jednou nepřetržitou infuzí sloučeniny 1 po dobu 24 h vede k léčebné účinnosti při maximálně tolerované dávce (MTD).

Proto v jednom preferovaném ztělesnění zahrnuje chemoterapeutický způsob podle tohoto vynálezu podávání inhibitoru CDK2 obecného vzorce I v kombinaci s jinými protinádorovými prostředky. Inhibitory CDK, které se zde popisují, vykazují při použití v kombinaci s alespoň jedním protinádorovým prostředkem mimořádnou cytotoxickou aktivitu.

V jednom preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu se podává sloučenina obecného vzorce I spolu s alespoň jedním antineoplastickým prostředkem.

• ··· ·· ·· ·

Pojem antineoplastický prostředek, jak se zde používá, je synonymem chemoterapeutického prostředku a/nebo antiproliferačního prostředku a týká se sloučenin, které brání růstu nádoru nebo hyperproliferačních buněk. Antiproliferační prostředky brání dělení buněk (1) zásahem do schopnosti buňky replikovat DNA a (2) indukcí buněčného zániku a/nebo apoptosy v rakovinových buňkách.

Skupiny sloučenin, které lze použít jako antiproliferační cytotoxické prostředky, zahrnují následující typy prostředků.

Alkylační prostředky {včetně avšak bez omezení dusíkatých yperitů, ethyleniminových derivátů, alkylsulfonátů, nitrosomočovin a triazenů): uracilový yperit, Chlormethin, Cyklofosfamid, Cytoxan^R, Ifosfamid, Melfalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylenmelamin, Triethylenthiofosforamin, Busulfan, Karmustin, Lomustin, Streptozocin, Dakarbazin a Temozolomid.

Antimetabolity {včetně avšak bez omezení antagonistů kyseliny listové, pyrimidinových analogů, purinových analogů a inhibitorů adenosin deaminasy): Methotrexát, 5-Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, 6-Merkaptopurin, 6-Thioguanin, Fludarabin-fosfát, Pentostatin a Gemcitabin.

Přirozené látky a jejich deriváty {například alkaloidy vinca, protinádorová antibiotika, enzymy, lymfokiny a epipodofylotoxiny): Vinblastin, Vinkristin, Vindesin, Bleomycin, Daktinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Ara-C, paklitaxel {paklitaxel je komerčně dostupný jako Taxol^R), Mithramycin, Deoxyco-formycin, epothilon • ·

A, epothilon B, epothilon C, epothilon D, deoxyepothilon A, desoxyepothilon B, [1S-[IR*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-7,ll-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3-[1-methyl-2-(2-methyl-4-thiazolyl)ethenyl]-4-aza-17-oxabicyklo[14.1.0]heptadekan-5,9-dion (popsaný v publikaci WO 99/02514), [1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3-[2-[2-(aminomethyl)-4-thiazolyl]-1-methylethenyl]-7-ll-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-4,17-dioxabicyklo[14.1.0]heptadekan-5,9-dion (popsaný v US patentu č. 6 260 694, vydaném 17. července 2001) a jejich deriváty, mitomycin-C, L-asparaginasa, interferony (zejména IFN-a), Etoposid a Teniposid.

Další antiproliferační cytotoxické prostředky jsou navelben, CPT-11, anastrazol, letrazol, kapecitabin, reloxafin, cyklofosfamid, ifosamid a droloxafin.

Pojem radiační terapie zahrnuje, avšak bez omezení, Rtg paprsky nebo paprsky gama, přicházející při vnějším ozáření z vnějšího zdroje ve formě svazku nebo po implantaci malých radioaktivních zdrojů.

Prostředky ovlivňující mikrotubuly zasahují do buněčné mitózy a jsou v oboru dobře známy díky své antiproliferační cytotoxické aktivitě. Prostředky ovlivňující mikrotubuly v rámci tohoto vynálezu zahrnují, avšak bez omezení, allokolchicin (NSC 406042), Halichondrin B (NSC 609395), kolchicin (NSC 757), kolchicinové deriváty (například NSC 33410), dolastin 10 (NSC 376128), maytansin (NSC 153858), rhizoxin (NSC 332598), paklitaxel (Taxol^R, NSC 125973), deriváty Taxolu^K (například NSC 608832), thiokolchicin NSC 361792), trityl-cystein (NSC 83265), vinblastin-sulfát (NSC 49842), vinkristin-sulfát (NSC 67574), přírodní a syntetické epothilony včetně, avšak bez omezení, epothilonu A, epothi• · · • · lonu B, epothilonu C, epothilonu D, deoxyepothilonu A, deoxyepothilonu B, flS-(IR*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]3-7,ll-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3-[l-methyl-2-(2-methyl-4-thiazolyl)ethenyl]-4-aza-l7-oxabicyklo[14.1.0]heptadekan-5,9-dion (popsaný v publikaci WO 99/02514), [1S-[1R*,3R’(E),7R*,1OS*,11R*,12R*_Í16S*33-3-[2-[2-(aminomethyl)-4-thiazolyl]-1-methylethenyl]-7,ll-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-4,17-dioxabicyklo[14.1.0]heptadekan-5,9-dion (popsaný v US patentu č. 6 260 694, vydaném 17. července 2001) a jejich deriváty a další prostředky narušující mikrotubuly. Další antineoplastické prostředky zahrnují diskodermolid [viz Service, 274, 2009 (1996)], estramustin, nokodazol, MAP4 a podobně. Příklady těchto prostředků se též popisují ve vědecké a patentové literatuře, viz například Bulinski, J. Cell Sci., 110, 3055-3064 (1997), Panda, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 24, 10560-10564 (1997), Muhlradt, Cancer Res., 57, 3344-3346 (1997), Nicolaou, Nátuře, 387, 268-272 (1997), Vasquez, Mol. Biol. Cell., 8, 973-985 (1997), Panda, J. Biol. Chem., 271, 29807-29812 (1996).

V případech, ve kterých je žádoucí uvést aberantně proliferující buňky do klidového stavu, lze též pacientovi podávat současně s podáváním nebo před podáváním chemoterapeutických prostředků podle tohoto vynálezu hormony a steroidy (včetně syntetických analogů): 17a-ethinylestradiol, diethylstilbestrol, testosteron, prednison, fluoxymesteron, dromostanolon-propionát, testolakton, megestrol-acetát, methylprednisolon, methyltestosteron, prednisolon, triamcinolon, chlortrianisen, hydroxyprogesteron, aminoglutethimid, estramustin, medroxyprogesteron-acetát, leuprolid, flutamid, toremifen, zoladex.

Pro použiti v kombinaci s chemoterapeutickými způsoby «·«· • · • ··· ·· » <

9 9 · <

• ·· 4 podle tohoto vynálezu jsou též vhodné antiangiogenní prostředky, jako jsou inhibitory metaloproteinasy matrice a další inhibitory VEGF, jako jsou protilátky proti VEGF a malé molekuly, jako jsou ZD6474 a SU6668. Lze též použít protilátky proti Her2 od Genetech. Vhodným inhibitorem EGFR je EKB-569 (irreverzibilní inhibitor). Rovněž lze zahrnout protilátku C225 Imclone imunospecifickou pro EGFR a inhibitory src.

Vhodným antiproliferačníra cytostatickým prostředkem je Casodex^R, který způsobuje, že androgen-dependentní karcinomy neproliferují. Dalším příkladem cytostatického prostředku je antiestrogen Tamoxifen, který inhibuje proliferaci či růst estrogen-dependentního karcinomu mléčné žlázy. Inhibitory převodu signálů buněčné proliferace jsou cytostatické prostředky. Příklady jsou inhibitory epidermálního růstového faktoru, inhibitory Her-2, inhibitory kinasy MEK-1, inhibitory kinasy MAPK, inhibitory PI3, inhibitory kinasy Src a inhibitory PDGF.

Jak se popisuje, určité antiproliferační prostředky j sou antiangiogenní a antivaskulární a přerušením dodávky krve do solidních tumorů způsobují, že nádorové buňky přecházejí do klidového stavu tím, že jsou zbavené výživy. Lze též použít kastraci, která rovněž způsobí, že androgen-dependentní karcinomy neproliferují. Hladovění buněk jinými prostředky, než je chirurgické přerušení dodávky krve, je jiným příkladem použití cytostatického prostředku. Zvláště preferovanou skupinou antivaskulárních cytotoxických prostředků jsou kombretastatiny. Ostatní příklady cytostatických prostředků zahrnují inhibitory MET kinasy, inhibitory MAP kinasy, inhibitory nereceptorových a receptorových tyrosin kinas, inhibitory integrinové signalizace a inhibitory receptorů růstového faktoru typu insulinu.

• · · · ·

4 4 4 ·

·· 9 • · 4 4 • · · · • · · · 4·· • · 4 ·

Tento vynález tedy poskytuje způsoby synergické léčby řady typů rakoviny včetně, avšak bez omezení, následujících:

karcinomu včetně karcinomu močového měchýře (včetně zrychleného a metastazujícího karcinomu močového měchýře), mléčné žlázy, kolonu (včetně kolorektálního karcinomu), ledvin, jater, plic (včetně malobuněčného nebo nemalobuněčného karcinomu plic a plicního adenokarcinomu), vaječníků, prostaty, varlat, urogenitálního traktu, lymfatického systému, rekta, hrtanu, pankreatu (včetně exokrinního pankreatického karcinomu) , jícnu, žaludku, žlučníku, děložního hrdla, štítné žlázy a kůže (včetně skvamózně buněčného karcinomu), hemopoetických tumorů lymfoidní řady včetně leukémie, akutní lymfocytární leukémie, akutní lymfoblastické leukémie, B-buněčného lymfomu, T-buněčného lymfomu, Hodgkinova lymfomu, nehodgkinského lymfomu, lymfomu s obrvenými buňkami, histiocytárního lymfomu a Burkettova lymfomu, hemopoetických tumorů myeloidní řady včetně akutních a chronických myelogenních leukémií, myelodysplastického syndromu, myeloidní leukémie a promyelocytární leukémie, tumorů centrální a periferní nervové soustavy včetně astrocytomu, neurobíastomu, gliomu a schwannomů, tumorů mesenchymálního původu včetně fibrosarkomu, rhabdomyosarkomu a osteosarkomu a dalších tumorů včetně melanomu, xenoderma pigmentosum, keratoaktanthomu, seminomu, folikulárního nádoru štítné žlázy a teratokarcinomu.

·· ···· ·· ·· ·· · • · · · · · · ··« • · ··· « · ·« · · · « • · · · · · · · · · · ··· • · · ···· · · · ♦ · ··· ·· ·· ·· ·

- 23 Nejvíce se preferuje použití tohoto vynálezu pro léčení zrychlených či metastazujících karcinomů močového měchýře, pankreatu, prostaty, nemalobuněčného karcinomu plic, kolorektálního karcinomu, karcinomu vaječníků a karcinomu mléčné žlázy.

V jednom preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu se poskytuje způsob synergického léčení rakovinových nádorů. Tento synergický způsob podle tohoto vynálezu výhodně potlačuje vývoj tumorů, snižuje zátěž způsobenou tumorem nebo poskytuje regresi tumoru u savců.

Způsoby bezpečného a účinného podávání většiny těchto chemoterapeutických prostředků znají ti, kteří mají zkušenost v oboru. Navíc se toto podávání popisuje ve standardní literatuře.

Například se podávání řady terapeutických prostředků popisuje v Physicians Desk Reference (PDR), například vydání 1996 (Medical Economics Company, Montvale, NJ 07645-1742, USA) a tento popis se zde zahrnuje formou odkazu.

Způsoby přípravy sloučenin obecného vzorce I poskytuje US patent č. 6 040 321, a celý tento popis se zde zahrnuje formou odkazu.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou použitelné v různých formách farmaceuticky přijatelných solí. Pojem farmaceuticky přijatelná sůl se týká těch forem solí, které jsou zřejmé farmaceutickému chemikovi, to jest těch forem, které udržují terapeutický účinek, zajišťují požadované farmakokinetické vlastnosti, chuťovou přijatelnost, absorpci, distri*· · • · ·· : í : · · · · ♦ · · · ···

........... ί

- 24 buci, metabolismus nebo vylučování. Další faktory, které jsou ve své povaze spíše praktické, avšak jsou též při volbě důležité, jsou cena surovin, snadnost krystalizace, výtěžek, stabilita, hygroskopické vlastnosti a tekutost výsledného léku. Farmaceutické kompozice lze vhodně připravit z účinných složek nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosiči.

Farmaceuticky přijatelné soli sloučenin obecného vzorce I, které lze použít ve způsobech a kompozicích podle tohoto vynálezu, zahrnují, avšak bez omezení, soli obdržené s řadou organických a anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina hydroxyraethansulfonová, kyselina bromovodíková, kyselina methansulfonová, kyselina sírová, kyselina octová, kyselina trifluoroctová, kyselina maleinová, kyselina benzensulfonová, kyselina toluensulfonová, kyselina sulfamová, kyselina glykolová, kyselina stearová, kyselina mléčná, kyselina jablečná, kyselina pamoová, kyselina sulfanilová, kyselina 2-acetoxybenzoová, kyselina fumarová, kyselina toluensulfonová, kyselina methansulfonová, kyselina ethandisulfonová, kyselina štavelová, kyselina 2-hydroxyethansulfonová a dále zahrnují různé další farmaceuticky přijatelné soli, jako jsou například nitráty, fosfáty, boráty, tartaráty, citráty, sukcináty, benzoáty, askorbáty, salicyláty a podobně. Kationty, jako jsou kvarterní amonné ionty, se uvažují jako farmaceuticky přijatelné protější ionty pro aniontové zbytky.

Preferované soli sloučenin obecného vzorce I zahrnují tartaráty, hydrochloridy, methansulfonáty a trifluoracetáty. Navíc lze farmaceuticky přijatelné soli sloučenin obecného vzorce I obdržet s alkalickými kovy, jako je sodík, draslík a lithium, s kovy alkalických zemin, jako je vápník nebo «I* «»«· * · • ··· • · • · « • ♦ * · · 9 * hořčík, s organickými bázemi, jako je dicyklohexylamin, tributylamin a pyridin a s aminokyselinami, jako je arginin, lysin a podobně.

Farmaceuticky přijatelné soli podle tohoto vynálezu lze připravit konvenčními chemickými způsoby. Obecně lze soli připravit reakcí volné báze či kyseliny se stechiometrickým množstvím nebo s přebytkem požadované anorganické či organické kyseliny nebo báze vytvářející sůl ve vhodném rozpouštědle nebo v kombinaci rozpouštědel.

Tento vynález též zahrnuje farmaceutickou kompozici použitelnou při léčení rakoviny, při kterém se podává terapeuticky účinné množství kombinací podle tohoto vynálezu za přítomnosti nebo bez přítomnosti farmaceuticky přijatelných nosičů či zřeďovacích prostředků. Synergické farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu obsahují protiproliferační prostředek nebo prostředky, sloučeninu obecného vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič. Tyto způsoby zahrnují použití antineoplastického prostředku v kombinaci se sloučeninou obecného vzorce I. Kompozice podle tohoto vynálezu mohou dále obsahovat alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou další složku, jako jsou kamence, stabilizátory, antimikrobiální prostředky, pufry, barviva, příchutě, adjuvantní prostředky a podobně. Antineoplastické prostředky, sloučeniny obecného vzorce I a kompozice podle tohoto vynálezu se mohou podávat perorálně nebo parenterálně včetně intravenózních, intramuskulárních, intraperitoneálních, subkutánních, rektálních a lokálních způsobů podávání.

Pro perorální podávání se mohou antineoplastické prostředky s obsahem sloučeniny obecného vzorce I a kompozice podle tohoto vynálezu podávat například ve formě tablet ·* ··»· • « • ··· » · 9 • · · ·· ·· «

Λ* • · * ' ’ · * · ·· • · · · • · · · ·* ··>

• t « • * · ♦ · · · • · ·♦« · • * · ·· « nebo tobolek, prášků, dispergovatelných granulí nebo oplatek s práškem nebo ve formě vodných roztoků či suspenzí. V případě tablet pro perorální užívání obsahují běžně užívané nosiče laktosu, kukuřičný škrob, uhličitan hořečnatý, mastek a cukr a přidávají se běžně maziva, jako je stearát hořečnatý. Pro perorální podávání ve formě tobolek obsahují použitelné nosiče laktosu, kukuřičný škrob, uhličitan hořečnatý, mastek a cukr. Při používání vodných suspenzí pro perorální podávání se běžně přidávají emulgační a/nebo suspenzační prostředky.

Navíc lze do perorálních kompozicí přidávat sladidla a/nebo příchutě. Pro intramuskulární, intraperitoneální, subkutánní a intravenózní podáváni se obvykle používají sterilní roztoky účinné složky (účinných složek) a pH těchto roztoků by se mělo vhodným způsobem upravovat a pufrovat.

Pro intravenózní podávání by celková koncentrace rozpuštěné složky (rozpuštěných složek) měla být kontrolovaná takovým způsobem, aby přípravek byl isotonický.

Pro zhotovení čípků podle tohoto vynálezu se nejprve připraví vosk o nízké teplotě tání, jako je směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaového másla v roztaveném stavu a účinná složka se ve vosku homogenně rozptýlí, například mícháním. Roztavená homogenní směs se poté vylije do forem vhodné velikosti a ponechá se ochladit, čímž ztuhne.

Kapalné přípravky zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Příklady těchto přípravků jsou roztoky ve vodě nebo ve směsi voda/propylenglykol pro parenterální injekce. Kapalné přípravky mohou též obsahovat roztoky pro intranasální podávání .

• ·

Aerosolové přípravky vhodné pro inhalaci mohou zahrnovat roztoky a tuhé látky v práškové formě, které mohou být v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je ztlačený inertní plyn.

Rovněž se používají tuhé přípravky určené pro přeměnu před použitím na kapalné přípravky pro perorální či parenterální podávání. Tyto kapalné formy zahrnují roztok, suspenze a emulze.

Sloučeniny obecného vzorce I, stejně tak jako antineoplastické prostředky, které se zde popisují, se též mohou podávat transdermálně. Transdermální kompozice mohou být ve formě krémů, pleťových vod, aerosolů a/nebo emulzí a mohou být obsažené v transdermální náplasti matricového či zásobníkového typu, jako jsou případy obvyklé v oboru pro tento účel.

Lze též použít kombinace tohoto vynálezu ve spojení s jinými dobře známými způsoby terapie, které se volí vzhledem k jejich konkrétní použitelnosti proti stavu, který se má léčit.

V případě formulace ve formě pevné dávky se používají kombinace kompozicí podle tohoto vynálezu v dávkových rozmezích, která se popisují níže. Alternativně lze podávat antineoplastický prostředek a sloučeninu obecného vzorce I odděleně v dávkových rozmezích, která se popisují níže. V jednom preferovaném ztělesnění tohoto vynálezu se podává antineoplastický prostředek v dávkovém rozmezí, které se popisuje níže, současně s podáním, před podáním nebo po podání sloučeniny obecného vzorce I. Tabulka I shrnuje preferované chemoterapeutické kombinace a příklady dávkování pro použití ve ···· ·· ·· ·· · ··· ···· · · · • · · · · · · · · · ··· • · · · · ·· · · · · ··· ·· · · · · · «« ··

- 28 způsobech podle tohoto vynálezu. Tam, kde se používá Sloučenina obecného vzorce I, se zamýšlejí jakákoliv pozměnění obecného vzorce I, která se zde popisují, včetně formy soli popisované výše pro použití při chemoterapeutických kombinacích. Přednostně se používá sloučenina I.

Tabulka i

Chemoterapeutická Dávkování kombinace mg/m² {na podanou dávku)

Sloučenina vzorce I + cisplatina	1,0 až 100 mg/m2 5 až 500 mg/m2
Sloučenina vzorce I + sloučenina 2	1,0 až 100 mg/m2 25 až 500 mg/m2
Sloučenina vzorce I + karboplatina	1,0 až 100 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Sloučenina vzořce I + záření	1,0 až 100 mg/m2 200 až 8000 cGy
Sloučenina vzorce I + CPT-11	1,0 až 100 mg/m2 5 až 400 mg/m2
Sloučenina vzorce I + paklitaxel	1,0 až 100 mg/m2 40 až 250 mg/m2
Sloučenina vzorce I + paklitaxel + karboplatina	1,0 až 100 mg/m2 40 až 250 mg/m2 5 až 1000 mg/m2

Sloučenina vzorce I + 5FU a případně + leukovorin	1,0 až 100 mg/m2 5 až 5000 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + epothilon	1,0 až 100 mg/m2 1 až 500 mg/m2
Sloučenina vzorce I + gemcitabin	1,0 až 100 mg/m2 100 až 3000 mg/nr
Sloučenina vzorce I + UFT a případně + leukovorin	1,0 až 100 mg/m2 50 až 800 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + gemcitabin + cisplatina	1,0 až 100 mg/m2 100 až 3000 mg/m: 5 až 150 mg/m2
Sloučenina vzorce I + UFT + leukovorin	1,0 až 100 mg/m2 50 až 800 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + cisplatina + paklitaxel	1,0 až 100 mg/m2 5 až 150 mg/m2 40 až 250 mg/m2
Sloučenina vzorce I + cisplatina + 5FU	1,0 až 100 mg/m2 5 až 150 mg/m2 5 až 5000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + oxaliplatina + CPT-11	1,0 až 100 mg/m2 5 až 200 mg/m2 4 až 400 mg/m2

• · ♦ ♦ • ·

Sloučenina vzorce I + 5FU + CPT-11 a případně + leukovorin	1,0 až 100 mg/m2 5 až 5000 mg/m2 4 až 400 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + 5FU + záření	1,0 až 100 mg/m2 5 až 5000 mg/m2 200 až 8000 cGy
Sloučenina vzorce I + záření + 5FU + cisplatina	1,0 až 100 mg/m2 200 až 8000 cGy 5 až 50Q0 mg/m2 5 až 150 mg/m2
Sloučenina vzorce I + oxaliplatina + 5FU a případně + leukovorin	1,0 až 100 mg/m2 5 až 200 mg/m2 5 až 5000 mg/m2 5 až 1000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + paklitaxel + CPT-11	1,0 až 100 mg/m2 40 až 250 mg/m2 4 až 400 mg/m2
Sloučenina vzorce I + paklitaxel + 5FU	1,0 až 100 mg/m2 40 až 250 mg/m2 5 až 5000 mg/m2
Sloučenina vzorce I + UFT	1,0 až 100 mg/m2 50 až 800 mg/m2
+ CPT-11 a případně + leukovorin	4 až 400 mg/m2 5 až 1000 mg/m2

• · · · · · • · · • · · · · • · · • · ·

- 31 - .....

• · · · «· · • · · * · · · * · ·· · · · · • ·· · · · ····· • · · » w · · ·· ·· *· ·

V tabulce I výše označuje 5FU 5-fluoruracil, leukovorin lze použít jako sodnou sůl leukovorinu, UFT je směs tegafur/uracil v molárním poměru 1:4 a epothilon” je přednostně sloučenina popsaná v publikací WO 99/02514 nebo v publikaci WO 00/50423, které se zde obě v plném znění zahrnují formou odkazu.

I když tabulka I poskytuje příklady dávkových rozmezí sloučenin obecného vzorce I a určitých protinádorových prostředků podle tohoto vynálezu, může klinik při formulaci farmaceutických prostředků podle tohoto vynálezu používat preferované dávky na základě stavu pacienta, který se má léčit. Například lze sloučeninu 1 přednostně podávat v množství 3 až 60 mg/m² každé 3 týdny. Sloučeninu 2 lze přednostně podávat v dávkovém rozmezí od 25 do 500 mg/m² každé 3 týdny po dobu tak dlouhou, jak vyžaduje léčení. Preferované dávky pro cisplatinu jsou 75 až 120 mg/m² každé 3 týdny. Preferované dávkování pro karboplatinu je v rozmezí 200 až 600 mg/m² nebo AUC {plocha pod křivkou) 0,5 až 8 mg/ml x min, nejpreferovanější AUC 4 až 6 mg/ml x min. Pokud používaný způsob využívá ozařování, jsou preferovaná dávkování v rozmezí 200 až 6000 cGy. Preferovaná dávkování CPT-11 jsou v rozmezí 100 až 125 mg/m² jednou týdně. Preferovaná dávkování paklitaxelu jsou 130 až 225 mg/m² každých 21 d. Preferovaná dávkování pro gemcitabín jsou v rozmezí 80 až 1500 mg/m² týdně. UFT se preferovaně používá v rozmezí 300 až 400 mg/m² denně při kombinaci s podáváním leukovorinu. Preferovaná dávkování leukovorinu jsou 10 až 600 mg/m² týdně.

Skutečné použité dávkování se může měnit v závislostech na požadavcích pacienta a závažnosti léčeného stavu. Stanovení správného dávkování v konkrétní situaci patří do • · · · • » • · • · · ···· · · · • ···· · » · · · · · ♦ • · ··· · · ·» · · · · · • · · ·· ·· ·» · · · rámce zkušenosti v oboru. Obecně se léčba zahajuje menšími dávkami, které jsou nižší, než je optimální dávka dané sloučeniny. Poté se dávkování zvyšuje po malých množstvích do dosažení optimálního účinku za daných okolností. Pro usnadnění lze celkovou denní dávku rozdělit a podávat v dílčích dávkách v průběhu dne, pokud je to vhodné. Lze též použít přerušovanou léčbu (například jeden týden ze tří týdnů nebo tři týdny ze čtyř týdnů).

Určité typy rakoviny lze účinně léčit sloučeninami obecného vzorce I a řadou protinádorových prostředků. Tyto kombinace tří nebo čtyř prostředků mohou zajistit vyšší účinnost. Při použití trojkombinace a čtyřkombinace lze použít výše popsaná dávkování. Další takové kombinace v tabulce I výše mohou tedy zahrnovat sloučeninu 1 v kombinaci s (1) mitoxantronem + prednisonem, (2) doxorubicinem + karboplatinou nebo (3) herceptinem + tamoxifenem. 5-FU lze nahradit UFT ve kterékoliv z výše popsaných kombinací.

Při použití způsobů nebo kompozicí podle tohoto vynálezu lze též podle požadavku podávat další prostředky používané při pozměňování růstu tumorů či metastáz v klinickém uspořádání, jako jsou antiemetika.

Tento vynález zahrnuje způsob synergické léčby rakoviny, při kterém se podává antineoplastický prostředek a sloučenina obecného vzorce I buď současně nebo postupně. Proto zatímco při jedné léčbě může být výhodné podáváni farmaceutické formulace obsahující antineoplastický prostředek (antineoplastické prostředky) a sloučeninu obecného vzorce I, při jiné léčbě může být výhodné podávat sloučeninu obecného vzorce I před podáním antineoplastického prostředku (antineoplastických prostředků). Je též třeba si uvědomit, « · • · • · · ·· ·· · • ··· • 0 že danou kombinaci antineoplastického prostředku (antineoplastických prostředků) a sloučeniny obecného vzorce I lze použít ve spojení s jinými způsoby léčení rakoviny (přednostně rakovinových nádorů) včetně, avšak bez omezení, radiační terapie a chirurgických zákroků. Dále je třeba si uvědomit, že cytostatický prostředek nebo prostředek uvádějící buňky do klidového stavu, pokud se používá, se může podávat postupně nebo současně se kteroukoliv jinou synergickou terapií nebo se všemi způsoby těchto terapií.

Kombinace podle tohoto vynálezu se též mohou podávat spolu s dalšími dobře známými terapeutickými prostředky, které se volí vzhledem k jejich zvláštní použitelnosti proti tomu stavu, který se má léčit. Kombinace podle tohoto vynálezu se mohou alternativně používat postupně spolu se známým farmaceuticky přijatelným prostředkem (se známými prostředky) pokud je kombinovaná formulace nevhodná.

Chemoterapeutický prostředek (prostředky) a/nebo terapie zářením se mohou používat podle terapeutických způsobů dobře známých v oboru. Tomu, kdo má zkušenost v oboru, bude zřejmé, že se podávání chemoterapeutického prostředku (chemoterapeutických prostředků) a/nebo radiační terapie mohou měnit v závislosti na nemoci, která se má léčit a na známých účincích chemoterapeutického prostředku (chemoterapeutických prostředků) a/nebo radiační terapie na tuto chorobu. V souladu se znalostí zkušeného klinického odborníka se rovněž způsoby terapie (například dávková množství a doby podávání) mohou měnit vzhledem k pozorovaným účinkům podaných terapeutických prostředků (to jest antineoplastického prostředku (prostředků) nebo záření) na pacienta a vzhledem k pozorovaným odpovědím onemocnění na podané terapeutické prostředky.

Ve způsobech podle tohoto vynálezu se podává sloučenina obecného vzorce I současně nebo postupně s některým antiproliferačním prostředkem a/nebo s ozářením. Není tedy nezbytné podávat chemoterapeutický prostředek (chemoterapeutické prostředky) a sloučeninu obecného vzorce I nebo ozařování a sloučeninu obecného vzorce I současně nebo v podstatě současně. Výhodu současného nebo v podstatě současného podávání určí zkušený klinický odborník.

Obecně se sloučenina obecného vzorce I a chemoterapeutický prostředek (chemoterapeutické prostředky) rovněž nemusí podávat ve stejné farmaceutické kompozici a mohou se vzhledem k různým fyzikálním á chemickým vlastnostem podávat různými cestami. Například lze sloučeninu obecného vzorce I podávat perorálně pro obdržení a udržování jejích vhodných hladin v krvi, zatímco chemoterapeutický prostředek {chemoterapeutické prostředky) se může (mohou) podávat intravenózně. Stanovení režimu podávání a vhodnosti podávání v případě možnosti ve stejné farmaceutické kompozici patří do rámce znalostí zkušeného klinického odborníka. Počáteční podávání lze provést podle dobře zavedených protokolů známých v oboru a dále na základě pozorovaných účinků, dávkování, režimů podávání a časů podávání může zkušený klinický odborník zavádět modifikace.

Konkrétní volba sloučeniny obecného vzorce I a protiproliferačního cytotoxického prostředku (cytotoxických prostředků) nebo ozařování bude záviset na diagnóze ošetřujících lékařů a na jejich posouzení stavu pacienta a na příslušném léčebném protokolu.

Pokud se sloučenina obecného vzorce I a antineoplastický prostředek (antineoplastícké prostředky) a/nebo ozařo-

• · · · · · • · · • · · · · • · · «· ··» vání nepoužívají současně nebo v podstatě současně, potom se může počáteční pořadí podávání sloučeniny obecného vzorce I a chemoterapeutického prostředku (chemoterapeutických prostředků) a/nebo záření měnit. Proto například lze sloučeninu obecného vzorce I podávat jako první s následujícím podáním antiproliferačního prostředku (antiproliferačních prostředků) a/nebo s následujícím ozářením nebo lze nejprve podat antiproliferační prostředek (antiproliferační prostředky) a/nebo použít ozařování jako první s následujícím podáním sloučeniny obecného vzorce I. Toto střídavé podávání se může opakovat v průběhu jednoho léčebného běhu. Stanovení pořadí podávání a počet opakování podávání každého terapeutického prostředku v průběhu jednoho léčebného běhu patří do rámce znalostí zkušeného klinického odborníka po vyhodnocení nemoci, která se má léčit a stavu daného pacienta. Například lze antineoplastícký prostředek (antineoplastické prostředky) a/nebo ozařování použít na počátku, zejména pokud se použije některý cytotoxický prostředek. Léčení poté pokračuje podáním sloučeniny obecného vzorce I a případně pokračuje podáním cytostatického prostředku, pokud se požaduje, do dokončení léčebného běhu.

Proto v souladu se zkušeností a znalostí praktického lékaře lze modifikovat každý léčebný protokol pro podávání některé složky (terapeutického prostředku, to jest sloučeniny obecného vzorce I, antineoplastického prostředku (prostředků) nebo záření) léčby podle individuálních potřeb pacienta tak, jak léčení pokračuje.

Ošetřující lékař při posouzení účinnosti léčby pro podávané dávkování bude uvažovat obecný prospěch pacienta stejně tak jako zřetelné příznaky, jako je ulehčení symptomů vztahujících se k onemocnění, inhibice růstu tumoru, skuteč-

· • 9 9 • · 9 9

9 9999

9 9

9 né zmenšení objemu tumoru nebo inhibice tvorby metastáz. Velikost tumoru se může měřit standardními způsoby, jako jsou radiologické způsoby, například snímání CAT nebo MRI a následná měření lze použít pro posouzení, zda se dosáhlo zpoždění nebo dokonce zvratu růstu tumoru. Ulehčení symptomů vztahujících se k onemocnění, jako je bolest a zlepšení celkového stavu lze rovněž použít, aby se napomohlo posouzení účinnosti léčby.

Pro ulehčení dalšího pochopení tohoto vynálezu se předkládají následující příklady především pro ilustraci jeho konkrétnějších podrobností. Nelze uvažovat, že by se rozsah tohoto vynálezu omezoval těmito příklady, nebot tento vynález zahrnuje úplný obsah definovaný nároky.

Příklady provedení vynálezu

Experimentální protokol - sloučeniny

Pro identifikaci zkoušených látek se používají v příkladech následující označení.

Sloučenina 1

N-[5-t[[5-(1,1-Dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]- 2 -thiaz olyl]-4-piperidinkarboxamid

Sloučenina 2

Hydrochlorid (R)-2,3,4,5-tetrahydro-l-(lH-imidazol-4-ylmethyl)-3-(fenylmethyl)-4-(2-thienylsulfonyl)-1H-1,4-benzodiazepin-7-karbonitrilu • ♦ 9 ·· ···* φ« «φ • · · 9 9 9 • · · 9· · 9 99 » · 9*9 99 • · 9 9 9 9

Následující látky a způsoby se poskytují pro usnadnění provádění způsobů podle tohoto vynálezu.

Studie in vitro

Sloučeniny

Veškeré sloučeniny připravuje skupina lékařské chemie při Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute. Sloučeniny se solubilizují ve 100% dimethylsulfoxidu při koncentraci 10 mM pro všechny experimenty. Zředění sloučenin se provádí do příslušných růstových médií.

Buněčná kultura

Buněčné linie se udržují v RPMI-1640 s 10 % fetálního bovinního séra.

Stanovení na základě inhibice CDKl/cyklin Bl kinasy

Kinasové reakční směsi obsahují 100 ng bakulovirem exprimovaného komplexu GST-CDKl/cyklin Bl, 1 /xg histonu H1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,2 /xCi ³³P gama-ATP, 25 μτα ATP v 50 μΐ kinasového pufru (koncentrace 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM chloridu hořečnatého, 1 mM EGTA, 0,5 mM DTT). Směsi se inkubují po dobu 45 min při teplotě 30 °C a reakce se zastaví přídavkem chladné kyseliny trichloroctové (TCA) do konečné koncentrace 15 %. Sraženiny obdržené kyselinou trichloroctovou se sbírají na unifiltrační mističky GF/C (Packard Instrument Co., Meriden, CT) s použitím univerzálního zařízení pro sběr Filtermate (Packard Instrument Co., Meriden, CT) a filtry se vyhodnotí kvantitativně s použitím kapalinového scintilačního počítače Top• 4 *4 4« 4

444 · 4 · · 44« • 4444 4 4 ·· 4 4«4 « 4 · 4 4 4« 444 4 4444 »4 444 44 4 4 ·· 4

- 38 Count pro 96 jamek (Packard Instrument Co., Meriden, CT) . Křivky dávka - odpověď se vynesou pro stanovení koncentrace požadované pro inhibici 50 % kinasové aktivity (IC ). Sloučeniny se rozpustí při koncentraci 10 mM v dimethylsulfoxidu a vyhodnotí pro šest koncentrací, pro každou třikrát. Konečná koncentrace dimethylsulfoxidu ve směsi je 2 %. Hodnoty IC_so se odvodí nelineární regresní analýzou a mají koeficient rozptylu (směrodatná odchylka/střední hodnota, n = 6) = 16 %.

Stanovení na základě inhibice CDK 2/cyklin E kinasy

Kinasové reakční směsi obsahují 5 ng bakulovirem exprimovaného komplexu GST-CDK2/cyklin E, 0,5 μ<3 GST-RB hybridního proteinu (aminokyseliny 776 až 928 proteinu retínoblastomu) , 0,2 /xCi ³³P gama-ATP, 25 μΜ ATP v 50 μΐ kinasového pufru (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM chloridu hořečnatého, mM EGTA, 2 mM DTT). Reakční směsi se inkubují po dobu 45 min při teplotě 30 °C a reakce se zastaví přidáním chladné kyseliny trichloroctové (TCA) do konečné koncentrace 15 %. Sraženiny vytvořené kyselinou trichloroctovou se sbírají na unifiltrační destičky GF/C (Packard Instrument Co., Meriden, CT) s použitím univerzálního zařízení pro sběr Filtermate (Packard Instrument Co., Meriden, CT) a filtry se vyhodnotí kvantitativně s použitím 96 jamkového zařízení scintilačního počítače TopCount (Packard Instrument Co., Meriden, CT). Křivky dávka-odpověď se vynesou pro stanovení koncentrace požadované pro inhibici 50 % kinasové aktivity (IC_so). Sloučeniny se rozpouštějí při koncentraci 10 nM v dimethylsulfoxidu a hodnotí se pro šest koncentrací, pro každou koncentraci třikrát. Konečná koncentrace DMSO ve směsi je 2 %. Hodnoty IC_so se odvodí nelineární regresní analýzou a mají koeficient rozptylu (směrodatná odchylka/střední hodnota, n = ·· ·« + · ·· ·· ·· · • » · ♦ · · · · · « • · · · · · «»· * · · · • · ♦·♦ · · · · · · *··· • » · · · · · « · · ····» · · ·» ♦ · *

- 39 6) = 14 %.

Stanovení na základě CDK4/cyklin Dl kínasy

Kinasové reakční směsi obsahují 150 ng bakulovirem exprimované GST-CDK4, 280 ng Stag-cyklin Dl, 0,5 ^g GST-RB hybridního proteinu (aminokyseliny 776 až 928 proteinu retinoblastomu, 0,2 μθί ³³P gama-ATP, 25 μΜ ATP v 50 μΐ kinasového pufru (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM chloridu horečnatého, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Reakční směsi se inkubují po dobu 45 min při teplotě 30 °C a reakce se zastaví přidáním chladné kyseliny trichloroctové (TCA) do konečné koncentrace 15 %. Sraženiny vytvořené kyselinou trichloroctovou se sbírají na unifiltrační destičky GF/C (Packard Instrument Co., Meriden, CT) s použitím univerzálního zařízení pro sběr Filtermate (Packard Instrument Co., Meriden, CT) a filtry se vyhodnotí kvantitativně s použitím 96 jamkového zařízení scintilačního počítače TopCount (Packard Instrument Co., Meriden, CT). Křivky dávka-odpověď se vynesou pro stanovení koncentrace požadované pro inhibici 50 % kinasové aktivity (IC_5O). Sloučeniny se rozpouštějí při koncentraci 10 nM v dimethylsulfoxidu a hodnotí se pro šest koncentrací, pro každou koncentraci třikrát. Konečná koncentrace DMSO ve směsi je 2 L Hodnoty IC_so se odvodí nelineární regresní analýzou a mají koeficient rozptylu (směrodatná odchylka/střední hodnota, n = =6) =18 %.

Analýza buněčného cyklu

Buňky A2780s log fáze se pěstují přes noc v 6 jamkových destičkách. Buňky se zpracují různými koncentracemi sloučeniny 1 po různé časy. Buňky se sbírají trypsinizací s následující centrifugací. Buněčné pelety se poté resuspen40 • 9 ···· ·· • · · · · · • φ φ · · φ » • » ♦ · φ φ φ • φ φ · · · • · · · · · · ·· ·· · • φ φ φ ·· φ · φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ *· φ· φ dují vířivým mícháním v 1 ml 80% methanolu a fixují se přes noc při teplotě -20 °C. Buňky se získají centrifugací a promyjí dvakrát 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem. Buňky se resuspendují v 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem s 2 % fetálního bovinního séra, 0,25 % Tritonu X-100 a inkubují se při teplotě 4 °C po dobu 10 min. Buňky se opět obdrží centrifugací a resuspendují v 50 μΐ fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem se 2 % fetálního bovinního séra a 0,1 % Tritonu X-100. Přidá se protilátka proti fosfo-threonin prolinu (IgM, New England Biolabs #93918) a buňky se inkubují po dobu 30 min při teplotě 4 °C. Promyjí se fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem se 2 % fetálního bovinního séra, 0,1 % Tritonu X-100 a resuspenduji v 50 μΐ fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem se 2 % fetálního bovinního séra a 0,1 % Tritonu X-100. Přidá se protilátka proti myšímu FITC (Pharmingen #12G64D) a směs se inkubuje po dobu 30 min při teplotě 4 °C ve tmě. Buňky se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem se 2 % fetálního bovinního séra a 0,1 % Tritonu X-100 a resuspendují se v propidium-jodid/RNase ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (10 jig/ml PI, 100 /zg/ml RNasy (prosté DNasy)) a inkubují se při teplotě 37 °C po dobu 30 min ve tmě. Vzorky se analyzují s použitím průtokového cytometru.

Westernovo blotování

Sloučeninami zpracované A2780S buňky se sbírají zhruba při 70% splynutí a celkový protein se získá cytolýzou buněk v pufru RIPA (koncentrace 50 mM Tris (pH 8) , 150 mM chloridu sodného, 1 % NP-40, 0,5 % natrium-deoxykolátu, 0,1 % SDS, 0,1 % vanadičnanu sodného, 0,1 mM fluoridu sodného, mM β-glycerofosfátu, plus proteasové inhibitory Complete³* (Boehringer Mannheim)]. Pelety buněk se resuspendují při ·· ««»♦ ·♦ *· 9* · • · · · · · · · · · • 9 999 9 9 ·♦ φ 9 φ φ • · · · · · · · · φ 9 9999 • .· · · · 9 9 · · · ·· ··· 99 99 99 9

- 41 hustotě nižší než 2 x 10⁷ buněk/ml a inkubují se po dobu 20 min na ledu s následující vysokorychlostní centrifugací při frekvenci otáčení 14000 min^-3-. Proteinový supernatant se odstraní ze zbytků buněk a obsah proteinu se vyhodnotí kvantitativně s použitím rozboru Micro-BCA (Pierce). Zpracované extrakty (25 pig/dráha) se poté oddělí s použitím 10% SDS-polyakrylamidového gelu (10,5 x 14 cm). Proteiny se poté přenesou z gelu na membránu PVDF (Millipore) při expozici 0,8 A/cm² v polosuchém blotovacím zařízení (Hoeffer). Skupiny proteinů PVDF se poté blokují 5% netučným mlékem v TTBS (0,1 % Tween 20 ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris) . Skvrny se poté sondují primární protilátkou v 5% netučném mléku v TTBS po dobu 1 až 2 h s následujícím trojnásobným promytím TTBS. Sekundární protilátka konjugovaná s HRP se poté inkubuje se skvrnami v TTBS po dobu 30 min. Skvrny se poté promyjí třikrát TTBS a vyvíjejí ECL s Westernovým blotovacím detekčním systémem (Amersham).

Stanovení na základě klonogenního růstu a studie s kombinacemi léků

Inhibice růstu kolonií se měří pro buňky karcinomu vaječníků A2780 s použitím standardního klonogenního rozboru. Ve stručnosti se 200 buněk/jamka nanáší na 6 jamkové destičky pro tkáňové kultury (Falcon, Franklin Lakes, MJ) a ponechají se, aby se připojily, po dobu 18 h. Prostředí pro rozbor obsahuje RPMI-1640 s 10 % fetálního bovinního séra. Buňky se poté zpracují ve dvojím provedení pro obdržení křivky dávka-odpověď pro šest koncentrací. Maximální koncentrace dimethylsulfoxidu nikdy nepřevyšuje 0,25 %. Buňky ve studiích kombinací se exponují sloučenině 1 po udaný čas, ta se poté odstraní a buňky se promyjí dvěma objemy fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem. Poté se obnoví normální «· ·**· «« ·« • · » · · · · • · ··· ♦ · ·· • · · · · · · · · • · · · a · · ·· ♦· · ·· ·· • · · • · · ♦ • · ···· • · · ·· · růstové médium nebo se buňky exponují sloučenině 2. Po konečné expozici sloučenině se buňky promyjí dvěma objemy fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem a opět se obnoví normální růstové médium. Kolonie se zásobují čerstvým médiem každý třetí den. Počet kolonií se hodnotí ve dnech 10 až 14 s použitím zobrazovacího zařízení Optimax. Koncentrace sloučeniny potřebná pro inhibici 50 % nebo 90 % tvorby kolonií (IC respektive IC ) se stanoví nelineární regresní analýzou. Koeficient rozptylu (směrodatná odchylka/střední hodnota, n =3) = 30 %. Účinky léčby kombinací se vyhodnotí s použitím multiplicitního způsobu popsaného Stephensem. a Steelem (2) . Tento způsob předpokládá jednoduchý lineární isobologram, což znamená, že každý jednotlivý prostředek vykazuje lineární křivku dávka/odpověď. Tento předpoklad umožňuje obdržení teoretické křivky nazývané čára multiplicity, která představuje očekávanou aditivní odpověď.

Testování protitumorového působení in vivo

Podání léku

Sloučenina 1 se nejprve rozpustí ve směsi Cremophor^R/ethanol (50 : 50). Konečné zředění na požadovanou sílu dávkování se provede vodou takovým způsobem, že roztoky pro podávání obsahují směs Cremophor^R/ethanol/voda v poměru 10 : 10 : 80. Paklitaxel se rozpustí ve směsi ethanolu a Cremophoru^R 50/50 a uchovává při teplotě 4 °C. Konečné zředění paklitaxelu se obdrží bezprostředně před podáním léku s použitím 0,9% roztoku chloridu sodného. 5-FU se rozpustí v normálním fyziologickém roztoku (0,9% roztok chloridu sodného) . Flavopiridol se rozpustí ve směsi Cremophor^R/ethanol/voda v poměru 10 : 10 : 80. Objem všech injekčně podávaných sloučenin je 0,01 ml/g hmotnosti myši.

• to ·*·· ·· to • to ·· ··· · ♦ · · to to to • · ··· · · ·· · · · · • · ··· ·· ··· · »··· ·· · ···· · · · ····· ·· · · ·· ·

- 43 Pokusná zvířata

Všichni hlodavci pocházejí od Harlan Sprague Dawley Co. (Indianpolis, Indiana) a udržují se v prostředí prostém amoniaku v definované kolonii prosté patogenních mikrobů. Program péče o zvířata Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute je plně akreditovaný sdružením American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) .

Xenotransplantáty solidních tumorů u athymických myší

Používají se následující tumory: lidský karcinom vaječníků A2780, myší karcinom mléčné žlázy Br-cycE, lidský skvamózně buněčný karcinom A431 a kolorektální karcinom Colo 205.

Veškeré solidní tumory se udržují na athymických myších Balb/c nu/nu. Tumory se přenášejí jako subkutánní transplantáty s použitím fragmentů tumorů od myších dárců. Veškeré transplantáty tumorů pro testování účinnosti jsou subkutánní (se).

Požadovaný počet zvířat potřebný pro detekci smysluplné odpovědi se rozdělí do skupin na počátku experimentu a každé zvíře obdrží subkutánní transplantát fragmentu tumoru {zhruba 50 mg) s použitím trokaru velikosti 13. Pro léčení tumorů v časné fázi se zvířata opět rozdělí do skupin před distribucí do různých léčených a kontrolních skupin.

Pro léčení zvířat s onemocněním v pokročilém stádiu se tumory ponechávají růst na předem určený interval velikostí (zvířata s tumory mimo toto rozmezí se vylučují) a poté se «« ··«· ♦· ·· Q# · • · ···* · · · • ··· · · ·· 9 9 9 9

999 99 999 9 9999

9 9999 99 9

99 9 9 9 9 9 9 9 9 zvířata rovnoměrně rozdělí do různých léčených a kontrolních skupin. Léčení každého zvířete se zakládá na individuální tělesné hmotnosti. Léčená zvířata se kontrolují denně ohledně toxicity/mortality vztahující se k léčbě. Každá skupina zvířat se váží před zahájením pokusu (Wtl) a poté opět po poslední léčebné dávce (Wt2). Rozdíl tělesných hmotností (Wt2 - Wtl) poskytuje měřítko toxicity vztahující se k léčbě.

Odpověď tumoru se stanoví měřením tumorů posuvným měřítkem dvakrát týdně tak dlouho, až tumory dosáhnou předem určenou cílovou velikost 1 g. Hmotnosti tumoru (mg) se stanoví ze vzorce hmotnost tumoru = (délka x šířka²)/2

Protinádorová aktivita se hodnotí pro maximální tolerovanou dávku (MTD), která se definuje jako hladina dávky bezprostředné pod výskytem nadměrné toxicity (to jest více než jeden úhyn). Maximální tolerovaná dávka je často ekvivalentní optimální dávce (OD). Když dojde k úhynu, zaznamená se den úhynu. Ošetřené myši, které uhynou dříve, než jejich tumory dosáhnou cílovou velikost, se považují za zvířata, která uhynula následkem toxicity léku. Žádná kontrolní myš s tumory neuhynula před dosažením cílové velikosti. Léčené skupiny s více než jedním úhynem způsobeným toxicitou léku se uvažují v tom smyslu, že obdržely nadměrně toxické léčby a jejich údaje se nezahrnují do hodnocení protitumorové účinnosti sloučeniny.

Konečný čas odpovědi tumoru se vyjádří jako zpoždění růstu tumoru (hodnota T - C) definovaná jako rozdíl času (d) požadovaného pro léčené tumory (T) k dosažení předem určené ·* ·**·

9» ·· ·· » • · · » » · · · « » • · · · · · ··« · ··· » 9 9 · · 9 9 9999999

9 9 9999 99 9

9 999 9» 99 9 9 9

- 45 cílové velikosti ve srovnání s velikostí kontrolní skupiny

C.

Pro určení usmrcení buněk se nejprve vypočítá čas zdvojnásobení objemu tumoru (TVDT) ze vzorce

TVDT = čas mediánu (d) pro kontrolní tumory pro dosažení cílové velikosti - čas mediánu (d) pro kontrolní tumory pro dosažení poloviny cílové velikosti a log usmrcení buněk = T - C/(3,32 x TVDT).

Statistické vyhodnocení údajů se provede s použitím Gehanova generálizováného Wilcoxonova testu.

Příklad 1

Další studie in vitro

Účinnost sloučeniny 1 se hodnotí na lidské rekombinantní CDK2 a na panelu protein kinas in vitro (3). Sloučenina 1 inhibuje s vysokou účinností fosforylaci RB proteinu protein kinasou CDK2 in vitro s IC_so 48 nM (tabulka 2). Mechanismus inhibice spočívá v přímé kompetici s ATP substrátem. Sloučenina 1 je méně účinná proti ostatním členům cyklin-dependentní kinasové skupiny s IC_so 480 a 925 nM vůči kinase CDK1 respektive CDK4.

Tabulka 2

Schopnosti sloučeniny 1 a flavopiridolu inhibovat kinasu in vitro

Protein kinasa	Flavopiridol IC (nm) s o	Sloučenina IC (nm) 50
CDKl/cyklin B	30	480
CDK2/cyklin E	170	48
CDK4/cyklin Dl	100	925

Účinek sloučeniny 1 na pokračování buněčného cyklu v době 8 a 24 h po léčení ukazuje tabulka 3. Koncentrace použitého léku v tomto experimentu je ekvivalentní IC_go pro zpracování po dobu 72 h (170 nM). Expozice léku po dobu 8 h je dostatečná pro pozměnění distribuce normálního buněčného cyklu. Tyto účinky jsou dokonce ještě silněji vyjádřeny při zpracování vzorkem léku po dobu 24 h. Sloučenina 1 způsobuje dramatický pokles populaci buněk ve fázi S i ve fázi M a dramatický vzrůst sub-Gl nebo apoptických buněk.

Tabulka 3

Sloučenina 1 pozměňuje distribuci buněčného cyklu a vyvolává apoptózu

Profil buněčného

cyklu, A2780S	G1 %	S %	G2 %	M %	Apo*
Kontrola	58	20	16,5	2,5	3
Expozice 8 h,
17 0 nM	56	15	22	1	6
Expozice 24 h,
170 nM	45	8	9,7	0,3	32+12

*Stupeň apoptózy se hodnotí barvením DNA buněk sub-Gl.

• 6	····			·»
• ·	•	• ·	• ·	• e	•
• ·	···	• ·	··	• ·	• ·
• ·	•	• · ·	• ·	• · ·	····
• ·	•	• ·	• ·	• ·	•
··		··	··	·«	c

Mechanismus apoptózy se dále ověřuje a definuje sledováním aktivace kaspas s následujícím zpracováním sloučeninou 1. Štěpení PARP slouží jako přijímaný markér pro aktivaci kaspasových kaskád (například kaspasy 3) . Po expozici buněk A2780s sloučeniny 1 se připraví proteinové extrakty a stav PARP se ověřuje Westernovým blotováním (obrázek 3).

Je zřejmé, že nativní protein PARP 110 kD se stráví již 6 h po expozici léku. To se signalizuje výskytem odštěpeného proteinového fragmentu PARP 85 kD. Rozsáhlé štěpení (to jest kaspasová aktivace) se vyskytuje v času 24 h konzistentně S výskytem výše diskutovaných buněk sub-Gl. Tato pozorování potvrzují, že zpracování sloučeninou 1 vede k apoptickému či programovanému zániku buněk.

Účinnost in vivo

Účinnost sloučeniny 1 in vivo se hodnotí na 5 preklinických nádorových modelech in vivo včetně myší leukémie ip/ip P388, lidského karcinomu vaječníků se A2780, myšího karcinomu mléčné žlázy Br-cycE, lidského skvamózně buněčného karcinomu A431 a lidského karcinomu kolonu Colo205 (6). Sloučenina 1 se porovnává v přímém srovnání s flavopiridolem na každém z těchto modelů. Navíc se pro sloučeninu 1 stanovuje cesta podávání, závislost na rozpisu podávání a minimální expozice (6). Obdržené údaje na linii rektálního karcinomu Colo205 ukazuje obrázek 4.

Lidský karcinom kolonu Colo205

Sloučenina 1 se hodnotí přímým porovnáním se dvěma referenčními prostředky (5-FU a paklitaxel) na lidském karcinomu kolonu Colo205. Sloučenina 1 vykazuje význačnou anti• · · · • · • ··· tumorovou aktivitu s obdržením více než 2,0 LCK a s regresí tumoru při MTD 36 mg/kg, intraperitoneálně, denně po dobu 8 d. Paklitaxel podávaný při své maximální tolerované dávce a při optimálním rozpisu (36 mg/kg, dvakrát denně po dobu 5 d, IV) poskytuje protinádorovou aktivitu srovnatelnou se sloučeninou 1 {obrázek 4). Avšak 5-FU byl zřetelně méně účinný a nedokázal v tomto modelu dosažení regrese tumoru.

Kombinace chemoterapie in vitro

Úspěch inhibitoru CDK2 sloučeniny 1 závisí nejen na jeho protinádorové aktivitě při jeho použití jako jednotlivého prostředku, avšak též na jeho schopnosti úspěšně se kombinovat s jinými antineoplastickými léky. Inhibitor buněčného cyklu by se mohl použít pro synchronizaci populace tumorových buněk, čímž by ji připravil pro následnou destrukci fázově specifickým cytotoxickým prostředkem. Ve skutečnosti se toto již prokázalo in vitro pro časné inhibitory CDK, flavopiridol a olomoucin. Výzkumní pracovníci prokázali, že flavopiridol může potenciovat působení řady prostředků včetně cisplatiny, mitomycinu C, paklitaxelu, cytarabinu, topotekanu, doxorubicinu, etoposidu a 5-fluoruracilu in vitro. Tyto nálezy ukazují, že by se mohly použít specifické prostředky pro buněčný cyklus pro zlepšení terapeutického rozmezí pro určité existující chemoterapie nebo pro senzibilizaci normálně rezistentních tumorů.

Stanovení tvorby kolonií se používá pro testování sloučeniny 1 v kombinaci s několika protinádorovými prostředky in vitro (5). Údaje se analyzují s použitím metody multiplicity, která předpokládá jednoduchý lineární isobologram, což znamená, že každý jednotlivý prostředek vykazuje lineární křivku dávka-odpověď. Tento předpoklad umožňuje

- 49 tvorbu teoretické křivky zvané čára multiplicity, která představuje očekávanou aditivní odpověď. Tato analýza ukazuje, že režim interakce mezi sloučeninou 1 a dalšími prostředky in vitro závisí na léku, na sekvenci a na dávce. Při kombinaci sloučeniny 1 buď se sloučeninou 2 nebo s cisplatinou (tabulka 4, obrázek 5) lze zřetelně pozorovat synergické působení. To je zřejmé z posunu křivky dávka-odpověď pro kombinované prostředky k levé straně teoretické čáry multiplicity. Tyto interakce jsou závislé na sekvenci. V obou případech léčení sloučeninou 1 před expozicí sloučenině 2 nebo cisplatině poskytuje synergickou interakci (obrázek 5, panel A). Střídavé sekvence vedou ke slabší synergii nebo k aditivní interakci (to jest křivka přežívání pro kombinované prostředky se shoduje s teoretickou čárou multiplicity) s výjimkou sloučeniny 2 následované sloučeninou 1 (obrázek 5, panel B). Tato kombinace je antagonistická (to jest s posunem k pravé straně teoretické čáry multiplicity) za těchto podmínek. Kombinace sloučeniny 1 s paklitaxelem, gemcitabinem nebo doxorubicinem je za těchto podmínek aditivní bez ohledu na sekvenci.

Tabulka 4

Účinek sekvence expozice lékům na cytotoxickou interakci mezi sloučeninou 1 a pěti dalšími antineoplastickými prostředky pro buněčnou linii lidského karcinomu vaječníků A2780s

Sekvence kombinace Typ interakce + sloučenina 2 (inhibitor farnesyl transferasy) sloučenina 1 následovaná sloučeninou 2 synergická sloučenina 2 následovaná sloučeninou 1 antagonistická současně ·· ·· ► · · « » · * , • · · ⁴ slabě synergická + Cisplatina (cisplatina) sloučenina 1 následovaná Cisplatinou cisplatina následovaná sloučeninou 1 současně + (Paklitaxel) sloučenina 1 následovaná Paklitaxelem Paklitaxel následovaný sloučeninou 1 současně + (Doxorubicin) sloučenina 1 následovaná Doxorubičinem Doxorubicin následovaný sloučeninou 1 současně + (Gemcitabin) sloučenina 1 následovaná Gemcitabinem Gemcitabin následovaný sloučeninou 1 současně synergická slabě synergická aditivní aditivní aditivní neprovádí se aditivní aditivní aditivní aditivní slabě synergická aditivní

V souhrnu působí sloučenina 1 synergicky se sloučeninou 2 a cisplatinou při zjišťování tvorby kolonií in vitro. Tato aktivita závisí na frekvenci. Kombinace sloučeniny 1 s Paklitaxelem, Gemcitabinem a Doxorubicinem poskytuje aditivní odpověď za podmínek hodnocených v této studii.

Tento vynález se neomezuje na ztělesnění, která se konkrétně popisují výše, avšak může se pozměňovat a modifikovat bez odchylky od obsahu připojených patentových nároků.

- 51 99 99

ROKY onemocněni vcetne rat i m, že se savci.

PATENTOVÉ NÁ

Claims (46)

1. Způsob léčby proliferačních koviny, vyznačující se který potřebuje toto léčení, podává terapeuticky účinné množství (1) alespoň jednoho antiproliferačního prostředku a (2) sloučeniny obecného vzorce I a jejích farmaceuticky přijatelných solí, ve kterých

R a R jsou nezávisle na sobě atom vodíku, atom fluoru nebo 1 2 alkylová skupina,

R_s je arylová skupina nebo heteroarylová skupina, je atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina nebo

CO-alkylová skupina, CO-cykloalkylová skupina, CO-arylová skupina, CO-alkyl-cykloalkylová skupina, > ♦ · · > · · * ·· ··

CO-alkyl-arylová skupina, CO-heteroarylová skupina,

CO-alkyl-heteroarylová skupina, CO-heterocykloalkylová skupina, CO-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

CONH-alkylová skupina, CONH-cykloalkýlová skupina, CONH-arylová skupina, CONH-alkyl-cykloalkylová skupina, CONH-alkyl-arylová skupina, CONH-heteroarylová skupina, CONH-alkyl-heteroarylová skupina, CONH-heterocykloalkylová skupina, CONH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

COO-alkylová skupina, COO-cykloalkylová skupina, COO-arylová skupina, COO-alkyl-cykloalkylová skupina, COO-alkyl-arylová skupina, COO-heteroarylová skupina, COO-alkyl-heteroarylová skupina, COO-heterocykloalkylová skupina, COO-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

S0₂-alkylová skupina, SO₂-cykloalkylová skupina, S0₂-arylová skupina, S0₂-alkyl-cykloalkylová skupina, S0₂-alkyl-arylová skupina, S0₂-heteroarylová skupina, S0₂-alkyl-heteroarylová skupina, S0₂-heterocykloalkylová skupina, SO -alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NCN)NH-alkylová skupina, C(NCN)NH-cykloalkylová skupina, C(NCN)NH-arylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-arylová skupina, C(NCN)NH-heteroarylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NCN)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NCN)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C (NNO) NH-alkylová skupina, C(NNO)NH-cykloalkylová ·· ···· ·· ··· skupina, C(NNO)NH-arylová skupina, C (NNO) NH-alkyl -cykloalkylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-arylová skupina, C(NNO)NH-heteroarylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NNO)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NNO)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NH)NH-alkylová skupina, C(NH)NH-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-arylová skupina, C(NH)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkyl-arylová skupina, C(NH)NH-heteroarylová skupina, C(NH)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NH-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NH)NHCO-alkylová skupina, C(NH)NHCO-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-arylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-arylová skupina, C(NH)NHCO-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heteroarylová skupina, C(NH)NHCO-heterocykloalkylová skupina, C(NH)NHCO-alkyl-heterocykloalkylová skupina nebo

C(NOR_s)NH-alkylová skupina, C(NOR_g)NH-cykloalkylová skupina, C(NOR_g)NH-arylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-cykloalkylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-arylová skupina, C(NOR)NH-heteroarylová skupina, C(NOR_g)NH-alkyl-heteroarylová skupina, C(NOR_s)NH-heterocykloalkylová skupina, C{NOR )NH-alkyl-heterocykloalkylová skupina,

R_s je atom vodíku nebo alkylová skupina,

R_g je atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, arylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, ·· ···· • · arylalkylová skupina, heteroarylová skupina, heteroarylalkylová skupina, heterocykloalkylalkylová skupina, heterocykloalkylová skupina, m je celé číslo od 0 do 2 a n je celé číslo od 1 do 3.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sloučeninou obecného vzorce I je a enantiomery, diastereomery a farmaceuticky přijatelné soli této sloučeniny, ve které

R₇ je alkylová skupina,

R_e je atom vodíku nebo alkylová skupina,

X je skupina NR_g nebo skupina CHNR_gR_xo,

R_g a R_xo jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, substituovaná alkylová skupina, cykloalkylová skupina nebo substituovaná cykloalkylová skupina a n j e 0, 1, 2 nebo 3.

·· · ·»·* • ·

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že sloučeninou obecného vzorce I je N-E5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že touto farmaceuticky přijatelnou solí je tartarát.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se tento antiproliferační prostředek podává před podáním sloučeniny obecného vzorce I.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že se tento antiproliferační prostředek podává po podání sloučeniny obecného vzorce I.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se tento antiproliferační prostředek podává současně s podáním sloučeniny obecného vzorce I.

8. Způsob podle nároku 1 pro léčení rakovinových solidních tumorů.

9. Způsob podle nároku 1 pro léčení refrakterních tumorů .

10. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t i m, že se antiproliferační prostředek volí ze skupiny zahrnující prostředek stabilizující mikrotubuly, prostředek narušující mikrotubuly, alkylační prostředek, antimetabolit, epidofyllotoxin, antineoplastický enzym, topisome♦ 444

4 4 · ·· » 4 » « • 4 • 4 • 4 4

4 4444 rasový inhibitor, prokarbazin, mitoxantron, záření a koordinační komplex platiny.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že se tento antiproliferační prostředek volí ze skupiny zahrnující antracyklinový lék, lék vinca, mitomycin, bleomycin, cytotoxický nukleosid, taxan, epothilon, diskodermolid, pteridinový lék, diynen, inhibitor aromatasy a podofyllotoxin.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje podávání sloučeniny obecného vzorce I a že antiproliferačním prostředkem je sloučenina 2.

13. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se t i m, že antiproliferačním prostředkem je sloučenina 2.

14. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se t i m, že antiproliferačním prostředkem je sloučenina 2.

15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání sloučeniny obecného vzorce I a antiproliferačním prostředkem je Cisplatina.

16. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se t i m, že antiproliferačním prostředkem je Cisplatina.

17. Způsob podle nároku 3, vyznačuj i c i se t i m, že antiproliferačním prostředkem je Cisplatina.

18. Způsob podle nároku 1, vyznačuj i c i ·« ···· ♦ ·

9 · · • ···

- 57 se t í m, že tento způsob zahrnuje podávání sloučeniny obecného vzorce I a antiproliferačním prostředkem je Karboplatina.

19. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se t í m, že antiproliferačním prostředkem je Karboplatina.

20. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se t í m, že antiproliferačním prostředkem je Karboplatína.

21. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že tento způsob zahrnuje podávání sloučeniny obecného vzorce I a antiproliferačním prostředkem je Gemcitabín.

22. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se t í m, že antiproliferačním prostředkem je Gemcitabin.

23. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se t í m, že antiproliferačním prostředkem je Gemcitabin.

24. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že se sloučenina obecného vzorce I volí z následujícího seznamu sloučenin

N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid, (±)-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl] thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, ·♦ · • · ·· »·· • ··· (+)-1-(2,3-dihydroxypropyl)-N-[5-f[(5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-1-(2-methylethyl)-4-piperidinkarboxamid,

1-cyklopropyl-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid,

N-[5-[t[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-1-(2-hydroxyethyl)-4-piperidinkarboxamid, (R)-N-[5-([[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiaz olyl]-3-piperidinkarboxamid, (S)-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, cis-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]cyklohexylkarboxamid, a trans-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]cyklohexylkarboxamid a jejich farmaceuticky přijatelných solí.

25. Způsob podle nároku 11, vyznačuj íci se t £ m, že se sloučenina obecného vzorce I volí z následujícího seznamu sloučenin

N-[5-t[[5-(l,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid, ·« «♦·♦ • · • ··· (±)-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, (±)-1- (2,3-dihydroxypropyl)-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid,

N-[5-[[[5-{1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-1-(2-methylethyl)-4-piperidinkarboxamid,

1-oyklopropyl-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-l-{2-hydroxyethyl)-4-piperidinkarboxamid, (R) -N-[5-[E[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, (S) -N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, cis-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]cyklohexylkarboxamid, a trans-4-amino-N-[5-[[[5-{1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]cyklohexylkarboxamid a jejich farmaceuticky přijatelných solí.

26. Farmaceutická kompozice pro léčení rakoviny, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antiproliferační prostředek a sloučeninu obecného vzorce I, jak se popisuje v nároku 1, a farmaceuticky přija·· ···· » · · » · · · · • · · • ···· • ♦

- SO telný nosič.

27. Farmaceutická kompozice pro léčení rakoviny, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antiproliferační prostředek a sloučeninu obecného vzorce I, jak se popisuje v nároku 2, a farmaceuticky přijatelný nosič.

28. Farmaceutická kompozice pro léčení rakoviny, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antiproliferační prostředek a sloučeninu obecného vzorce I, jak se popisuje v nároku 3, a farmaceuticky přijatelný nosič.

29. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 pro synergickou léčbu rakovinových solidních tumorů.

30. Farmaceutická kompozice podle nároku 27 pro synergickou léčbu rakovinových solidních tumorů.

31. Farmaceutická kompozice podle nároku 28 pro synergickou léčbu rakovinových solidních tumorů.

32. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 pro léčbu refrakterních tumorů.

33. Farmaceutická kompozice podle nároku 27 pro léčbu refrakterních tumorů.

34. Farmaceutická kompozice podle nároku 28 pro léčbu refrakterních tumorů.

35. Farmaceutická kompozice podle nároku 26, ·· ···· • · • ···

9 · • · «· ·· · «· ·· • * * • · ·· • · ♦ • · ···· vyznačující se tím, že antiproliferační prostředek představuje jeden či více prostředků zvolených ze skupiny zahrnující prostředek stabilizující mikrotubuly, prostředek narušující mikrotubuly, alkylační prostředek, antimetabolit, epidofylotoxin, antineoplastický enzym, inhibitor topoisomerasy, prokarbazin, mitoxantron, koordinační komplex platiny, antracyklinový lék, lék vinca, mitomycin, bleomycin, cytotoxický nukleosid, taxan, sloučeninu 2, epothilon, diskodermolid, pteridinový lék, diynen, inhibitor aromatasy a podofylotoxin.

36. Farmaceutická kompozice podle nároku 27, vyznačující se t í m, že antiproliferační prostředek představuje jeden či více prostředků zvolených ze skupiny zahrnující prostředek stabilizující mikrotubuly, prostředek narušující mikrotubuly, alkylační prostředek, antimetabolit, epidofylotoxin, antineoplastický enzym, inhibitor topoisomerasy, prokarbazin, mitoxantron, koordinační komplex platiny, antracyklinový lék, lék vinca, mitomycin, bleomycin, cytotoxický nukleosid, taxan, sloučeninu 2, epothilon, diskodermolid, pteridinový lék, diynen, inhibitor aromatasy a podofylotoxin.

37. Farmaceutická kompozice podle nároku 28, vyznačující se tím, že antiproliferační prostředek představuje jeden či více prostředků zvolených ze skupiny zahrnující prostředek stabilizující mikrotubuly, prostředek narušující mikrotubuly, alkylační prostředek, antimetabolit, epidofylotoxin, antineoplastický enzym, inhibitor topoisomerasy, prokarbazin, mitoxantron, koordinační komplex platiny, antracyklinový lék, lék vinca, mitomycin, bleomycin, cytotoxický nukleosid, taxan, sloučeninu 2, epothilon, diskodermolid, pteridinový lék, diynen, inhibitor «4 «··» • · • »·· • · • * ·« ♦ «· ·* • · · • ·· • · · • · · • ·* ··

4 4 • · · * ···· • · aromatasy a podofylotoxin.

38. Farmaceutická kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce I volí ze skupiny následujících sloučenin

N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid, (+)-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, (±)-1-(2,3-dihydroxypropyl)-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl] methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-1-{2-methylethyl)-4-piperidinkarboxamid,

1-cyklopropyl-N-[5-[[[5-{1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid,

N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-1-(2-hydroxyethyl)-4-piperidinkarboxamid, (R) -N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, (S) -N-[5-[[[5-{1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-3-piperidinkarboxamid, cis-4-amino-N-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl] methyl]thio]-2-thiazolyl]cyklohexylkarboxamid, • · ·»·· • · · ·· · trans-4-amino-N-[5-[[[5-(1,l-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]cyklohexylkarboxamid a jejich farmaceuticky přijatelných solí.

39. Farmaceutická kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že se tato farmaceuticky přijatelná sůl volí ze skupiny zahrnující tartarátovou sůl, hydrochloridovou sůl, sůl kyseliny methansulfonové a sůl kyseliny trifluoroctové.

40. Farmaceutická kompozice podle nároku 27, vyznačující se tím, že se tato farmaceuticky přijatelná sůl volí ze skupiny zahrnující tartarátovou sůl, hydrochloridovou sůl, sůl kyseliny methansulfonové a sůl kyseliny trifluoroctové.

41. Farmaceutická kompozice podle nároku 28, vyznačující se tím, že se tato farmaceuticky přijatelná sůl volí ze skupiny zahrnující tartarátovou sůl, hydrochloridovou sůl, sůl kyseliny methansulfonové a sůl kyseliny trifluoroctové.

42. Farmaceutická kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že sloučeninou obecného vzorce I je N-[5-[[[5-{l,l-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl a antiproliferačním prostředkem je sloučenina 2.

43. Farmaceutická kompozice podle nároku 26 vyznačující se tím, že tímto antiproliferačním prostředkem je cisplatina a sloučeninou obecného • · · · • · · · · · • · · · · • · · · • ♦ ·· · vzorce I je Ν-[5-[[[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl]methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

44. Farmaceutická kompozice podle nároku 26, vyznačující se tím, že tímto antiproliferačním prostředkem je gemcitabin a sloučeninou obecného vzorce I je N-[5- [ [[5-(1,1-dimethylethyl)-2-oxazolyl] methyl]thio]-2-thiazolyl]-4-piperidinkarboxamid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

45. Farmaceutická kompozice podle nároku 37, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu 1 a Karboplatinu.

46. Farmaceutická kompozice podle nároku 37, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu 1 a Doxorubicin.