CZ305799B6

CZ305799B6 - Kombinace analogů epothilonu a chemoterapeutických činidel pro léčení proliferačních nemocí

Info

Publication number: CZ305799B6
Application number: CZ2003-2376A
Authority: CZ
Inventors: Francis Y. F. Lee
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2016-03-23
Also published as: HU230273B1; CA2440555A1; IL157443A; RU2321400C2; WO2002072085A1; CN1496256A; HK1060843A1; US20040214871A1; IS6950A; US8598215B2; US8569347B2; RU2003130377A; TWI330530B; CZ20032376A3; EE05417B1; US7312237B2; BRPI0207961B8; US20030073677A1; KR20040025904A; US20110033457A1

Abstract

Jsou popsány farmaceutické kombinace sloučeniny 1 a látky vybrané z cisplatiny, protilátky C225 imunospecifické pro EGFR, anti-VEGF, ZDG474, SU6668 a capecitabinu a způsoby vhodné pro léčení a prevenci proliferačních poruch.

Description

Kombinace analogů epothilonu a chemoterapeutických činidel pro léčení proliferačních nemocí

Oblast techniky

Předmětný vynález se týká oblasti onkologie a zlepšených chemoterapeutických režimů.

Dosavadní stav techniky

Všechny odkazy na články v odborné literatuře, jakož i na zveřejněné patentové dokumenty uvedené v následujících odstavcích jsou v celém svém rozsahu zahrnuty v tomto textu jako odkazový materiál.

Národní institut pro rakovinu (National Cancer Institute) odhaduje, že jen ve Spojených státech amerických jsou během svého života 1 až 3 milióny lidí postiženy rakovinovým onemocněním. Kromě toho přibližně 50 až 60 procent lidí postižených rakovinovým onemocněním nakonec této nemoci podlehne. Rozšířený výskyt této choroby jen podtrhuje potřebu po zlepšených protirako20 vínových léčebných režimech sloužících pro léčení maligního onemocnění.

Díky širokému spektru různých druhů rakovinových onemocnění, které se je možné v současné době pozorovat, bylo vyvinuto mnoho různých protirakovinových činidel sloužících pro likvidaci rakoviny uvnitř těla. Tyto sloučeniny se podávají pacientům postiženým rakovinovým bujením, 25 přičemž cílem tohoto podávání je likvidace nebo jakákoli inhibice růstu maligních buněk při současném zachování normálních, zdravých buněk bez poškození. Protirakovinová činidla se klasifikují na základě mechanismu jejich účinku.

Jeden typ chemoterapeutika se označuje jako koordinační komplex kovu. Předpokládá se, že 30 tento typ chemoterapeutika tvoří v jádrech buněk především spojovací vazby mezi dvěma řetězci DNA, čímž brání buněční replikaci. Výsledkem tohoto mechanismu je skutečnost, že dochází nejprve k potlačení růstu nádoru a následně ke zvrácení tohoto růstu. Další typ chemoterapeutika se označuje jako alkylační činidlo. Tyto sloučeniny účinkují prostřednictvím inzerce cizorodých kompozic nebo molekul do DNA dělících se rakovinových buněk. Výsledkem přítomnosti těchto 35 cizorodých skupin je skutečnost, že dochází k porušení normální funkce rakovinových buněk a k zabránění proliferaci. Další typ chemoterapeutika se označuje jako antineoplastické činidlo. Tento druh činidla brání, zabíjí nebo blokuje růst a šíření rakovinových buněk. Skupina dalších typů protirakovinových činidel zahrnuje nesteroidní inhibitory aromatázy, bifúnkční alkylační činidla atd.

Paclitaxel představuje jednu z hlavních tříd antimikrotubulových činidel, která podporují polymerizaci tubulinu a pravděpodobně mitotickou zástavu během dělení buněk. Bylo prokázáno, že taxol7 (paclitaxel) vykazuje in vivo vynikající protinádorovou aktivitu a tato látka se používá při léčení různých druhů rakoviny, včetně rakoviny prsu, rakoviny vaječníků a rakoviny plic. Na45 neštěstí dochází u mnoha nádorů k vyvinutí rezistence vůči paclitaxelu.

Při vývoji tohoto vynálezu bylo zjištěno, že analogy epothilonu při použití v kombinaci s některými běžnými chemoterapeutickými činidly vykazují synergický účinek. Cílem tohoto vynálezu je popsat účinnou kombinaci chemoterapeutických režimů pro léčení proliferačních nemocí, při 50 kterých se analogy epothilonu kombinují s jinými antineoplastickými činidly.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu jsou kombinace pro použití při léčbě proliferačních onemocnění, včetně rakoviny. Uvedené kombinace zahrnují (1) alespoň jedno antiproliferační činidlo, jak je definováno v patentových nárocích a (2) sloučeninu 1

o OH o (I)

Předmětný vynález dále poskytuje farmaceutickou kompozici pro synergickou léčbu rakoviny, která zahrnuje alespoň jedno antiproliferační činidlo, jak je definována v patentových nárocích, a sloučeninu 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

Uvedené antiproliferační činidlo se podává simultánně nebo před nebo po podání sloučeniny 1.

Popis obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je znázorněno spektrum cytotoxicity sloučeniny 1 proti různým liniím nádorových buněk, které bylo stanoveno Testem různých onkologických buněk (Oncology Diverse Cell Assay). Sloupcové grafy v pravé části obrázku znázorňují hodnoty IC₅₀ pro buněčné linie uvedené v levé části obrázku (ve směru shora dolů).

Na obrázku 2 je znázorněn časový průběh mitotické blokády vyvolané inkubací buněk HCT116 v přítomnosti 7,5 nM sloučeniny 1.

Na obrázku 3 je graf znázorňující srovnání protinádorového účinku sloučeniny 1 a paclitaxelu u modelu lidského karcinomu vaječníků scPat-7.

Na obrázcích 4A a 4B jsou grafy znázorňující srovnání protinádorového účinku orálního podávání sloučeniny 1 a intravenózního podávání paclitaxelu u modelu lidského karcinomu vaječníků Pat-7.

Na obrázku 5 je graf znázorňující závislost protinádorového účinku sloučeniny 1 na režimu podávání u modelu lidského karcinomu vaječníků A2780.

Epothilony napodobují biologické účinky taxolu (viz publikace Bollag a spolupracovníci, Cancer Research, 1995, 55, 2325) a v kompetičních studiích se chovají jako kompetitivní inhibitory vázání taxolu k mikrotubulům. Nicméně výraznou výhodou epothilonu oproti taxolu je, že epothilony vykazují v porovnání s taxolem mnohem nižší pokles účinnosti proti buněčné linii odolné vůči různým léčivům (viz publikace Bollag a spolupracovníci (1995)). Kromě toho jsou epothilony exportovány P-glykoproteinem z buněk s výrazně nižší účinností než taxol (viz publikace Gerth a spolupracovníci (1996)).

Analog epothilonu popsaný v tomto textu vykazuje při použití v kombinaci s alespoň jedním protirakovinovým činidlem, jak je definováno v patentových nárocích, vynikající cytotoxické účinky.

-2CZ 305799 B6

Analogem epothilonu pro použití podle tohoto vynálezu je [1S-[1R*,3R*(E),7R*,1OS*,11R*,12R*, 16S * ]]- 7,1 l-dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3-[ 1 -methyl-2-(2-methyl-4-thiazolyl)ethenyl]-4-aza-17-oxabicyklo[14,l,0]heptadekan-5,9-dion (sloučenina 1). Strukturu této výhodné sloučeniny (sloučeniny 1) je možné vyjádřit následujícím strukturním vzorcem:

Sloučenina 1, která je analogem epothilonu podle předmětného vynálezu, je semisyntetickým analogem epothilonu a má podobný mechanismus účinku jako paclitaxel (tj. stabilizuje mikrotubul). Nicméně při preklinických farmakologických studiích vykázala sloučenina 1 výrazné zlepšení oproti paxlitaxelu v některých rozhodujících aspektech. Sloučenina 1 vykazuje velmi výrazný a širokospektrý protinádorový účinek proti modelům lidských střevních nádorů, které jsou citlivé na paclitaxel (A2780, HCT116 a LS174T) a, což je důležitější, rovněž proti modelům lidských střevních nádorů, které jsou rezistentní kpaclitaxelu (HCT116/VM46), proti modelu karcinomu vaječníků (Pat-7 a A2780Tax) a proti modelu karcinomu prsu (Pat-21). Sloučenina 1 je orálně účinná, přičemž protinádorový účinek, kterého je dosaženo po orálním podání sloučeniny 1, je srovnatelný s účinkem, kterého je dosaženo po parenterálním podání uvedeného léčiva. Tato preklinická data týkající se účinnosti jsou známkou toho, že sloučenina 1 vykazuje zlepšenou klinickou účinnost u nemocí necitlivých i citlivým k taxolu®.

Sloučenina 1 se podává ve spojení s alespoň jedním antineoplastickým činidlem, jak je definováno v patentových nárocích.

Výraz „antineoplastické činidlo“ se v tomto textu používá jako synonymum k výrazu „chemoterapeutické činidlo“ a/nebo k výrazu „anti-proliferační činidlo“ a označuje sloučeniny, které brání množení rakovinových nebo hyperproliferačních buněk. Anti-proliferační činidla brání množení rakovinových buněk tím, že (1) interferují s buněčnou schopností replikovat DNA a (2) tím, že vyvolávají smrt a/nebo apoptózu rakovinových buněk.

Antiproliferační cytotoxickými činidly, která se používají v souladu s tímto vynálezem, jsou: cisplatina; capecetabin; inhibitory VEGF vybrané z anti-VEGF (vaskulámí endoteliální růstový faktor) protilátek, ZD6474 a SU6668; a protilátka C225 imunospecifická pro EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor).

Kombinace podle tohoto vynálezu tak mohou být použity pro synergické léčení různých druhů rakoviny, včetně:

karcinomů, jejichž skupina zahrnuje rakovinu močového měchýře (včetně zrychlené a metastatické rakoviny močového měchýře), rakovinu prsu, rakovinu střeva (včetně rakovinu kolorektálního traktu), rakovinu ledvin, rakovinu jater, rakovinu plic (včetně malobuněčné a ne-malobuněčné rakoviny plic a plicního adenokarcinomu), rakovinu vaječníků, rakovinu prostaty, rakovinu varlat, rakovinu genotourinámího traktu, rakoviny lymfatického systému, rakovinu konečníku, rakovinu hrtanu, rakovinu slinivky (včetně exokrinního karcinomu slinivky), rakovinu jícnu,

-3CZ 305799 B6 rakovinu žaludku, rakovinu žlučového měchýře, rakovinu děložního čípku, rakovinu štítné žlázy a rakovinu kůže (včetně rakoviny plochých buněk);

hematopoietických nádorů lymfatického systému, jejichž skupina zahrnuje leukemie, akutní lymfocytovou leukémii, akutní lymfoblastickou leukémii, lymfom B-buněk, lymfom T-buněk, Hodginsův lymfom, ne-Hodginsův lymfom, lymfom vlasových buněk a Burkettův lymfom;

hematopoietických nádorů myeloidního systému, jejichž skupina zahrnuje akutní a chronickou myelogenní leukémii, myelodysplastický syndrom, myeloidní leukémii a promyelocytickou leukémii;

nádorů centrálního a periferního nervového systému, jejichž skupina zahrnuje astrocytom, neuroblastom, gliom a schwannom;

nádorů mezenchymálního původu, jejichž skupina zahrnuje fibrosarkon, rhabdomyosarkom a osteosarkom; a dalších nádorů, jejichž skupina zahrnuje melanom, xenoderma pigmentosum, keratoakantom, seminom, folikulámí rakovinu štítné žlázy a teratokarcinom, bez omezení na tyto příklady.

V nej výhodnějším provedení se předmětný vynález používá pro léčení zrychlené nebo metastatické rakoviny močového měchýře, rakoviny slinivky, rakoviny prostaty, nemalobuněčné rakoviny plic, rakoviny kolorektálního traktu a rakoviny prsu.

Odborníkovi v dané oblasti techniky jsou známy způsoby bezpečného a účinného podávání většiny shora popsaných chemoterapeutických činidel. Kromě toho je podávání uvedených chemoterapeutických činidel popsáno ve standardní odborné literatuře.

Podávání mnoha z výše uvedených chemoterapeutických činidel je popsáno například v publikaci Physicians' Desk Reference (označované zkratkou PDR), například ve vydání z roku 1996 (Medical Economics Compny, Montvale, NJ 07645-1742, USA).

Sloučeninu 1 podle tohoto vynálezu je možné připravit postupy popsanými ve zveřejněné mezinárodní přihlášce WO 99/02514.

Do rozsahu předmětného vynálezu spadá také farmaceutická kompozice, jak je definována v patentových nárocích, která je vhodná pro léčení rakoviny, které zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství kombinací podle tohoto vynálezu spolu s nebo bez farmaceuticky přijatelných nosičů nebo ředidel. Synergické farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu zahrnují anti-proliferační činidlo nebo činidla, sloučeninu 1 a farmaceuticky přijatelný nosič, jak je definováno v patentových nárocích.

Kompozice podle předmětného vynálezu mohou dále zahrnovat jednu nebo více dalších farmaceuticky přijatelných složek, jako jsou kamenec, stabilizační činidla, antimikrobiální činidla, pufry, barvicí činidla, ochucovací činidla, adjuvans apod. Antineoplastická činidla, sloučenina 1 a kompozice podle tohoto vynálezu se mohou podávat orálně nebo parenterálně, včetně intravenózního podávání, intramuskulámího podávání, intraperitoneálního podávání, subkutánního podávání, rektálního podávání a topického podávání.

V případě orálního podávání se uvedená antineoplastická činidla, sloučenina 1 a kompozice podle tohoto vynálezu mohou podávat například ve formě tablet nebo kapslí, prášků, dispersibilních granulí nebo tobolek nebo ve formě vodných roztoků nebo suspenzí. V případě tablet pro orální použití zahrnuje skupina nosičů, jež se v těchto tabletách běžně používají, laktózu, kukuřičný škrob, uhličitan hořečnatý, mastek a cukr, a dále se do těchto tablet běžně přidávají lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý. V případě orálního podávání ve formě kapsle zahrnuje skupina vhodných nosičů laktózu, kukuřičný škrob, uhličitan hořečnatý, mastek a cukr. Pokud se pro orální podávání používají vodné suspenze, přidávají se do nich běžně emulgační a/nebo suspendační činidla.

-4CZ 305799 B6

Dále je do uvedených orálních kompozic možné přidávat sladící a/nebo ochucovací činidla. Pro intramuskulámí, intraperitoneální, subkutánní a intravenózní podávání se obvykle používají sterilní roztoky jedné nebo více aktivních složek, přičemž by měla být vhodně upravena hodnota pH těchto roztoků a tato by měla být pufrována. V případě intravenózního podávání by celková koncentrace rozpuštěných látek měla být regulována tak, aby daný přípravek byl izotonický.

Při přípravě čípků podle tohoto vynálezu se nejprve roztaví vosk o nízké teplotě tání, jako je směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaové máslo, a v takto roztaveném vosku se homogenně, například pomocí míchání, disperguje aktivní složka. Vzniklá roztavená homogenní směs se poté nalije do vhodně velkých forem a ponechá se zchladnout, čímž dojde k jejímu ztuhnutí.

Skupina kapalných přípravků podle tohoto vynálezu zahrnuje roztoky, suspenze a emulze. Příkladem takovýchto přípravků jsou vodné nebo vodně/propylenglykolové roztoky pro parenterální injekční podávání. Skupina kapalných přípravků podle tohoto vynálezu může rovněž zahrnovat roztoky pro intranasální podávání.

Skupina aerosolových přípravků vhodných pro inhalaci může zahrnovat roztoky a pevné látky v práškové formě, které mohou být kombinovány s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je stlačený inertní plyn.

Do rozsahu předmětného vynálezu spadají rovněž pevné přípravky, které jsou určené pro přeměnu na kapalné přípravky pro orální nebo parenterální podávání, přičemž k uvedené přeměně dochází krátce před vlastním použitím. Skupina takovýchto kapalných forem zahrnuje roztoky, suspenze a emulze.

Sloučenina 1, jakož i zde popsaná antineoplastická činidla, mohou být do organismu dodávána rovněž transdermálně. Transdermální kompozice mohou mít formu krémů, pleťových roztoků, aerosolů a/nebo emulzí a mohou být obsaženy v transdermální náplasti matricového nebo rezervoárového typu, které se v dané oblasti techniky běžně používají pro tento účel.

Kombinace podle předmětného vynálezu mohou být rovněž použity ve spojení s dalšími dobře známými terapiemi, jejichž aplikace je zvolena z důvodů jejich zvláštní vhodnosti proti léčenému stavu.

V případě formulace ve formě pevných dávek se aktivní složky kombinovaných kompozic podle tohoto vynálezu používají v níže popsaných dávkových rozmezích. V alternativním případě je možné antineoplastické činidlo a sloučeninu 1 podávat odděleně v níže popsaných dávkových rozmezích. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu se dané antineoplastické činidlo podává v níže uvedeném dávkovém rozmezí po nebo simultánně s podáním sloučeniny 1, jejíž dávka se rovněž pohybuje v níže uvedeném dávkovém rozmezí.

V následující tabulce 1 jsou popsány výhodné chemoterapeutické kombinace a příklady dávek pro použití podle tohoto vynálezu.

-5CZ 305799 B6

Tabulka 1

Chemoterapeutická kombinace	Dávka (miligram/m² (na dávku)*)
sloučenina 1	0,1-100 mg/m²
+ cisplatina	5-150 mg/m²
sloučenina 1	0,1-100 mg/m²
+ gemcitabin	100-3000 mg/m²
+ cisplatina	5-150 mg/m²
sloučenina 1	0,1-100 mg/m²
+ cisplatina	5-150 mg/m²
+ paclitaxel	40-250 mg/m²
sloučenina 1	0,1-100 mg/m²
+ cisplatina	5-150 mg/m²
+ 5FU	5-5000 mg/m²
sloučenina 1	0,1-100 mg/m²
+ ozařování	200-8000 cGy
+ 5FU	5-5000 mg/m²
+ cisplatina	5-150 mg/m²

Ve výše uvedené tabulce 1 zkratka „5FU“ označuje 5-fluorouracil.

Ačkoli jsou v tabulce 1 uvedeny konkrétní příklady dávkových rozsahů sloučeniny 1 a některých protirakovinových činidel podle tohoto vynálezu, při formulování farmaceutických kompozic podle tohoto vynálezu může klinický lékař použít výhodné dávky dané stavem pacienta, jenž má být léčen. Tak například sloučenina 1 může být výhodně podávána každé 3 týdny v dávce od 25 do 60 miligramů/m². Sloučenina 2 může být výhodně podávána každé 3 týdny po celou potřebnou dobu pro cisplatinu je v rozmezí od 75 do 120 miligramů/m², přičemž tato dávka se pacientovi podává každé tři týdny. Výhodná dávka pro carboplatin je v rozmezí od 200 do 600 mg/m²nebo dávka odpovídající rozmezí velikosti plochy pod křivkou (AUC) od 0,5 do 8 miligramů/mililitr x minuta; nejvýhodnější je dávka odpovídající rozmezí velikosti plochy pod křivkou (AUC) od 4 do 6 miligramů/mililitr x minuta. Pokud se při použitém způsobu využívá ozařování, pohybuje se výhodná dávka záření v rozmezí od 200 do 6000 cGy. Výhodná dávka CPT-11 se pohybuje v rozmezí od 100 do 125 miligramů/m², přičemž tato dávka se podává jednou týdně. Výhodná dávka pro paclitaxel se pohybuje v rozmezí od 130 do 225 miligramů/m², přičemž tato dávka se podává každých 21 dní. Výhodná dávka pro gemcitabin se pohybuje v rozmezí od 80 do 1500 miligramů/m², přičemž tato dávka se podává každý týden. UFT se při kombinovaném užívání s leucovorinem používá výhodně v dávce od 300 do 400 miligramů/m² denně. Výhodná dávka pro leucovorin se pohybuje v rozmezí od 10 do 600 miligramů/m², přičemž tato dávka se podává každý týden.

Velikost skutečně použité dávky se může měnit v závislosti na požadavcích pacienta a podle závažnosti léčeného stavu.

Správnou dávku pro konkrétní situaci je schopen určit odborník v dané oblasti techniky. Obvykle se postupuje tak, že se léčba zahájí s použitím nižších dávek, než optimální dávky dané sloučeniny. Poté se uvedená dávka pomalu zvyšuje až do dosažení optimálního účinku za daných okol- 6 CZ 305799 B6 ností. V případě potřeby je pro větší pohodlí možné celkovou denní dávku rozdělit a podávat během dne v dílčích dávkách. Dále je rovněž možné použít intermitentní terapii (například provádění léčby po dobu 1 týdne ze 3 týdnů nebo po dobu 3 týdnů ze 4).

Některé druhy rakoviny je možné účinně léčit pomocí sloučeniny 1 a více protirakovinových činidel. Takovéto třísložkové a čtyřsložkové kombinace mohou zajistit vyšší účinnost. Při použití v uvedených třísložkových a čtyřsložkových kombinacích mohou být použity výše uvedené dávky.

Při použití kompozic podle tohoto vynálezu je v případě potřeby možné podávat další činidla, která se používají v klinické praxi při modulaci růstu nádoru nebo metastáze, jako jsou antiemetika.

Antineoplastická činidla, jak jsou definována v patentových nárocích, a sloučenina 1 se podávají simultánně nebo postupně. Zatímco tedy při jedné léčbě může být výhodné podávat farmaceutický prostředek zahrnující jedno nebo více antineoplastických činidel a sloučeninu 1, může být při jiné léčbě výhodné podávat pacientovi nejprve jedno nebo více antineoplastických činidel. Je rovněž zřejmé, že kombinace jednoho nebo více antineoplastických činidel a sloučeniny 1 podle tohoto vynálezu může být použita ve spojení s dalšími metodami léčby rakoviny (výhodně rakovinových nádorů), jejichž skupina zahrnuje ozařovací terapii a chirurgické zákroky, bez omezení na uvedené příklady. Dále je zřejmé, že pokud se při dané léčbě používají cytostatická nebo uklidňující činidla, mohou být tato podávána po skončení nebo simultánně sjakoukoli nebo se všemi dalšími synergickými terapiemi.

Kombinace podle předmětného vynálezu mohou být rovněž podávány společně s dobře známými terapeutickými činidly, jejichž použití je zvoleno kvůli jejich zvláštní vhodnosti proti léčenému stavu. V případě, že použití vícesložkové kombinace je nevhodné, mohou se alternativně kombinace podle předmětného vynálezu používat po podání známých farmaceuticky přijatelných činidel.

Chemoterapeutická činidla a/nebo ozařování mohou být aplikovány v souladu s postupy, které jsou v dané oblasti techniky dobře známé. Odborníkovi v dané oblasti techniky je zřejmé, že způsob aplikace chemoterapeutických činidel a/nebo ozařovací terapie se může měnit podle toho, jaká konkrétní nemoc má být léčena a podle známých účinků uvedených chemoterapeutických činidel a/nebo ozařovací terapie na tuto nemoc. Rovněž v souladu se znalostmi zkušeného klinického lékaře je možné měnit terapeutický postup (např. velikost dávky a doby podání), a to na základě účinků pozorovaných po podání terapeutických činidel (tj. antineoplastických činidel nebo ozařování) na pacienta a na základě pozorované odezvy dané nemoci na podaná terapeutická činidla.

Sloučenina 1 se podává simultánně nebo postupně s antiproliferačním činidlem, jak je definováno v patentových nárocích. Není tedy nezbytně nutné, aby se jedno nebo více chemoterapeutických činidel a sloučenina 1 podávaly simultánně nebo v podstatě simultánně. Stanovení výhodnosti simultánního nebo v podstatě simultánního podávání je plně ve schopnostech zkušeného klinického lékaře.

Dále je obecně možné uvést, že sloučenina 1 a jedno nebo více chemoterapeutických činidel, jak jsou definována v patentových nárocích, se nemusejí podávat ve stejné farmaceutické kompozici, ale naopak někdy musí být, díky různým fyzikálním a chemickým vlastnostem, podávány různými cestami. Tak například sloučenina 1 se může podávat orálně za účelem vytvoření a udržení dobré hladiny této sloučeniny v krvi, zatímco jedno nebo více shora uvedených chemoterapeutických činidel se může podávat intravenózně. Stanovení režimu podávání a vhodnost podávání ve stejné farmaceutické kompozici, pokud je to vůbec možné, je plně ve schopnostech zkušeného klinického lékaře. Podávání může být zahájeno v souladu se zavedenými postupy, které jsou

-7 CZ 305799 B6 v dané oblasti techniky známé, a poté může zkušený klinický lékař na základě pozorovaných účinků provést změny ve velikosti dávky, režimu podávání a době podávání.

Výběr konkrétní kombinace sloučeniny 1 a jednoho nebo více anti-proliferačních cytotoxických činidel, jak jsou definovány v patentových nárocích, nebo ozařování je závislé na diagnóze stanovené ošetřujícími lékaři a na jejich posouzení stavu pacienta a příslušného postupu léčby.

Pokud se sloučenina 1 a jedno nebo více antineoplastických činidel nepodávají simultánně nebo v podstatě simultánně, může se počáteční pořadí podávání sloučeniny 1 a jednoho nebo více antineoplastických činidel měnit. Tak je například možné nejprve podávat sloučeninu 1 s následným podáním jednoho nebo více antineoplastických činidel; nebo je možné nejprve podávat jedno nebo více antineoplastických činidel s následným podáním sloučeniny 1. Toto alternativní pořadí podávání se může opakovat během jednoho postupu léčby. Stanovení pořadí podávání a počtu opakování podávání každého terapeutického činidla během postupu léčby je plně ve schopnostech zkušeného klinického lékaře a může být provedeno po posouzení nemoci, která má být léčena a stavu pacienta. Tak například jedno nebo více antineo-plastických činidel se mohou podávat na počátku léčby zejména v případech, kdy se používá cytotoxické činidlo. Uvedená léčba poté pokračuje až do jejího skončení podáváním sloučeniny 1 a, v případě potřeby, případným následným podáním cytostatického činidla.

V souladu se svými zkušenostmi a znalostmi tak může praktický lékař modifikovat každý postup podávání složky (terapeutického činidla, tj. sloučeniny 1, jednoho nebo více antineoplastických činidel) daného léčebného postupu, a to podle individuálních potřeb pacienta, jež se mění s pokračující léčbou.

Praktický lékař při posuzování, jestli je daná léčba účinná při podávaných dávkách zvažuje celkový prospěch pacienta a konkrétnější znaky, jako je úleva od symptomů souvisejících s danou nemocí, inhibice růstu nádoru, skutečná míra zmenšení daného nádoru nebo inhibice metastáze. Velikost nádoru je možné měřit standardními metodami, jako jsou radiologické studie, jejímiž příklady jsou sken CAT nebo MRI, přičemž pro posouzení, jestli růst nádoru byl nebo nebyl zpomalen nebo dokonce zvrácen je možné použít doplňující měření. Úleva od symptomů souvisejících s danou nemocí, jako je bolest, a zlepšení celkového stavu pacienta mohou být rovněž použity pro posouzení účinnosti léčby.

Příklady uskutečnění vynálezu

Pro usnadnění dalšího pochopení podstaty tohoto vynálezu jsou v dalším textu popsány konkrétní příklady provedení vynálezu, které slouží jen pro ilustraci. Rozsah předmětného vynálezu však nelze považovat za omezený na níže uvedené příklady, ale naopak je třeba mít na zřeteli, že rozsah tohoto vynálezu je definovaný dále uvedenými patentovými nároky.

Experimentální protokol

Sloučeniny

Ve všech níže uvedených příkladech se používají následující označení:

Sloučenina 1: [lS-[lR*,3R*(E),7R*,10S*,HR*,12R*,16S*]]-7,ll^dihydroxy-8,8,10,12,16pentamethyl-3-[ 1-methy l-2-(2-methyM-thiazolyl)ethenyl]-4-aza-l 7-oxabicyklo[ 14,1,0]heptadekan-5,9-dion.

-8CZ 305799 B6

Chemikálie a roztoky

Pokud není uvedeno jinak, byly chemikálie a roztoky používané pro udržování buněčných kultur získány od společnosti GIBCO/BRL. Sterilní tkáňové kultury byly získány od společnosti Corning, NY, USA. Všechna ostatní reakční činidla byla získána od společnosti Sigma nebo Fisher a byla použita v maximální dostupné čistotě.

Podávání léčiva

Pro podávání sloučeniny 1 (epothilon) hlodavcům byly použity dvě různé pomocné látky: (1) směs ethanol/voda (v objemovém poměru 1:9) a (2) směs cremophor®/ethanol/voda (v objemovém poměru 1:1:8). Sloučenina 1 byla nejprve rozpuštěna v ethanolu nebo ve směsi cremophor®/ethanol (50:50). Konečné ředění na požadovanou sílu dávky bylo prováděno méně než 1 hodinu před podáním léčiva. Pro parenterální podávání (iv) se ředění provádělo vodou tak, aby dávkové roztoky obsahovaly výše popsané složení pomocných látek. Pro orální podávání (po) se ředění provádělo 0,25molámím pufrovacím roztokem fosforečnanu sodného (pH = 8) v objemovém poměru 30:70. Paclitaxel byl rozpuštěn ve směsi ethanol/cremophor® (50:50) a skladován při teplotě 4 °C; konečné zředění paclitaxelu bylo provedeno bezprostředně před podáním léčiva, a to 0,9procentním roztokem chloridu sodného. Objem všech injikovaných sloučenin byl 0,01 mililitru/gram hmotnosti myši a 0,005 mililitru/gram hmotnosti krysy.

Linie nádorových buněk

Linie buněk lidského karcinomu HCT116 a buněk HCT116/VM46, varianta MDR [1], byly udržovány v médiu McCoy 5A (které bylo získáno od společnosti GIBCO) a v lOprocentním tepelně deaktivovaném telecím plodovém séru (GIBCO). Buňky lidského karcinomu vaječníků A2780 a buňky A2780Tax, získané od Dr. Antonia Fojo (NCI, Bethesda, MD, USA) byly udržovány v médiu IMEM (které bylo získáno od společnosti GIBCO) a lOprocentním tepelně deaktivovaném telecím plodovém séru (Gibco). Tato buněčná linie, rezistentní k paclitaxelu, neexprimovala nadměrné množství P-glykoproteinu, však byly u ní pozorovány mutace v isotypu M40 βglobulinu [2]. Přečištěný tubulin, který byl izolován z těchto rezistentních buněk, byl odolný vůči polymeraci vlivem paclitaxelu, což bylo přičteno právě uvedené rezistenci k tomuto léčivu a kolaterální citlivosti k mikrotubulovým depolymeračním činidlům, jako je vinblastin.

Test cytotoxicity

In vitro cytotoxicita byla testována v nádorových buňkách kolorimetrickým testem na bázi tetrazolia, který využívá výhody metabolické přeměny MTS (tj. vnitřní soli 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-5-(3-karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfenyl)-2H-tetrazolia) na redukovanou formu, která absorbuje záření o vlnové délce 492 nanometrů [3]. Buňky byly vysazeny 24 hodin před podáním léčiva. Po uplynutí 72 hodin inkubace při teplotě 37 °C spolu se sériově zředěnou testovanou sloučeninou, byla k buňkám přidána kombinace MTS a činidla pro zachytávání elektronů, kterým byl fenazinmethosulfát. Inkubace pokračovala další 3 hodiny a poté byla pomocí spektrofotometru měřena absorbance uvedeného média při vlnové délce 492 nanometrů, čímž byl zjištěn počet přeživších buněk, který byl vztažen ke srovnávací populaci buněk. Získané výsledky byly vyjádřeny ve formě středních cytotoxických koncentrací (IC₅₀).

Test vytváření kolonie klonogenních buněk

Účinnost, se kterou sloučenina 1 a paclitaxel zabíjejí klonogenní nádorové buňky (tj. buňky, které jsou schopny se neomezeně dělit za vzniku kolonie) in vitro, byla stanovena testem vytváření kolonie. Byla stanovena koncentrace potřebná k usmrcení 90 procent klonogenních buněk lidského karcinomu střev HCT116 (tj. koncentrace IC₉₀). Analýza účinků kombinované léčby in vitro byla provedena pomocí isobologramu a multiplikačních metod popsaných Stephensem a Steelem [4].

-9CZ 305799 B6

Test polymerace tubulinu

Účinnost, se kterou sloučenina 1 a paclitaxel polymerují tubulin izolovaný z telecího mozku, byla stanovena publikovaným postupem [5, 6].

Zvířata

Všichni hlodavci byli získáni od společnosti Harlan Sprague Dawley Co. (Indianapolis, Indiana, USA) a drženi v prostředí bez amoniaku v definované a nepatogenní kolonii. Program péče o zvířata společnosti Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute je plně akreditován institucí American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

In vivo testy protinádorových účinků

Při těchto testech byly použity následující lidské nádory: nádor vaječníků A2780, nádor vaječníků A2780Tax (získaný z buněk získaných od Dr. Antonia Fojo, Medicine Branch, NCI, Bethesda, MD, USA), nádor střeva HCT116/VM46, nádor vaječníků Pat-7 (získaný biopsií nádoru, provedenou Dr. Thomasem Hamiltonem, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA, od pacienta, u něhož se vyvinula rezistence k taxolu®). Dále byl při tomto testu rovněž použit myší fibrosarkom M5076.

Uvedené lidské nádory byly udržovány v Balb/c nu/nu holých myších. Nádor M5076 byl udržován v myších C57BL/6. Nádory byly propagovány jako subkutánní transplantáty provedené u příslušného druhu myší, přičemž při této propagaci byly použity fragmenty nádorů získaných od dárcovských myší.

Do uvedených hostitelských druhů myší byly pasážovány následující nádory: myší fibrosakrom M5076 (M5076). Do myší C57B1/6; lidské karcinomy vaječníků A278 a Pat-7, lidské karcinomy střeva HCT116, HCT116/VM46 a LS174T, lidský karcinom prsa Pat-21 do holých myší. Nádor byl pasážován jednou za dva týdny v případě myších nádorů a přibližně každých dva až osm týdnů v případě různých lidských nádorových linií. Co se týče testování účinnosti, byly nádory M5076 implantovány do hybridních myší (C57B1/6 x DBA/2) Fl a lidské nádory byly implantovány do holých myší. Všechny implantáty pro testování účinnosti byly subkutánní (sc).

Na počátku experimentu byla vytvořena skupina zvířat, která byla tvořena takovým počtem jedinců, který byl potřeba pro detekci smysluplné odezvy na léčbu, a každému zvířeti byl pomocí kalibrovaného trokaru 13 subkutánně implantován fragment nádoru (o hmotnosti přibližně 50 miligramů). Pro testování léčení nádorů v raném stádiu byla zvířata opět sloučena a následně rozdělena do různě léčených skupin a na srovnávací skupinu. Pro testování léčení nádorů v pokročilém stádiu byly nádory ponechány narůst do předem definovaného rozmezí velikosti nádoru (zvířata s nádory mimo toto rozmezí byla ze studie vyloučena) a nakonec byla zvířata rozdělena do různě léčených skupin a na srovnávací skupinu. Léčba každého zvířete byla založena na jeho tělesné hmotnosti. Léčená zvířata byla denně kontrolována za účelem stanovení toxicity/mortality související s léčbou. Každá skupina zvířat byla zvážena před začátkem léčby (Hml) a znovu po podání poslední léčebné dávky (Hm2). Rozdíl v tělesné hmotnosti (Hm2-Hml) poskytl měřítko toxicity související s léčbou.

Odezva nádoru na léčbu byla stanovena měřením nádoru posuvným měřítkem, které se provádělo dvakrát týdně až do okamžiku, kdy nádor dosáhl předem stanovené „cílové“ hmotnosti, jež činila 1 gram. Hmotnost nádoru byla stanovována podle vzorce:

Hmotnost nádoru = (délka x šířka²) 4- 2

Protinádorový účinek byl stanovován při maximální tolerované dávce (MTD), která je definována jako dávka těsně pod dávkou, při které je pozorována nadměrná toxicita (tj. více než jedno

- 10CZ 305799 B6 úmrtí ve skupině zvířat). Velikost MTD byla velmi často shodná s optimální dávkou (OD). Pokud došlo k úmrtí zvířete, byl zaznamenán den, kdy došlo k této události. Léčená zvířata, která uhynula před tím, než jejich nádory dosáhly cílové velikosti, byla považována za uhynulá v důsledku toxicity léčiva. Nedošlo k úmrtí žádného zvířete ze srovnávací skupiny, které neslo nádor o menší velikosti, než byla jeho cílová velikost. Skupiny léčených zvířat, ve kterých došlo k více než jednomu uhynutí zvířete v důsledku toxicity léčiva, byly považovány za skupiny podrobené příliš toxické léčbě a údaje pro tyto skupiny nebyly zahrnuty do stanovení protinádorového účinku dané sloučeniny.

Mezní odezva nádoru na léčbu byla vyjádřena jako zpomalení růstu nádoru (T-C hodnota), které je definováno jako rozdíl v době (v počtu dní), kterou potřebují léčené nádory (T) k dosažení předem stanovené cílové velikosti v porovnání s dobou (v počtu dní), kterou potřebují k dosažení cílové velikosti nádory ve srovnávací skupině (C).

Pro stanovení množství zabitých buněk byla nejprve vypočtena doba potřebná ke zdvojnásobení objemu nádoru (TVDT), a to podle vzorce:

TVDT = střední doba (v počtu dní), kterou potřebují srovnávací nádory pro dosažení cílové velikosti - střední doba (v počtu dní), kterou potřebují léčené nádory k dosažení poloviny z cílové velikosti.

Množství zabitých buněk pak bylo vypočteno podle vzorce:

log (množství zabitých buněk) = T-C + (3,32 x TVDT).

Statistické vyhodnocení získaných údajů bylo provedeno pomocí Wilcoxonova testu zobecněného Gehanem [7].

Příklad 1

Sloučenina 1 vykazuje in vitro cytotoxicitu proti rakovinovým buňkám

Sloučenina 1 vykazuje in vitro široké spektrum účinků proti různým liniím nádorových buněk. Z 21 testovaných buněčných linií (viz přiložený obrázek 1) byla v případě 18 buněčných linií hodnota IC50 mezi 1,6 a 6 nM. V případě tří buněčných linií byla hodnota IC₅o větší než 6 nM viz dvě linie nádorových buněk HCT116/VN46 (IC₅₀ = 24,5 nM) a MIP (IC₅₀ = 24,8 nM), které byly vysoce rezistentní k více léčivům (MDR), a linie normálních myších plicních fibroblastových buněk MLF (IC50 = 34,5 nM). V této souvislosti je třeba uvést, že sloučenina 1 v podstatě „nepřekonala“ uvedenou rezistenci k více léčivům, která je těmto buněčným liniím vlastní. Tak byly v případě paclitaxelu hodnoty poměru koncentrace potřebné k inhibici růstu buněk u těchto rezistentních linií o 50 procent ku koncentraci potřebné k inhibici růstu buněk o 50 procent u citlivé linie HCT116 (R/S, neboli poměr rezistence) 155 pro HCT116/VM46, respektive »55 pro MIP. Pro srovnání hodnoty poměru R/S pro sloučeninu 1 byly pouze 9,4, respektive 9,5 (viz tabulka 2).

-11CZ 305799 B6

Tabulka 2

In vitro cytotoxicita sloučeniny 1 a paclitaxelu u buněčných linii citlivých a rezistentních k paclitaxelu
	IC50, nM (poměr rezistence)
Sloučenina	HCT116	HCT116/VM46	NIP
paclitaxel	2,1	326 (155)	»112 (>>53)
sloučenina 1	2,6	24,5 (9,4)	24,8 (9,5)

Mechanismus cytotoxicity - polymerace tubulinu

Cytotoxické účinky epothilonů, podobně jako cytotoxické účinky taxanů, související se stabilizací mikrotubulů, které vedou k mitotické zástavě při G2/M přeměně. V tomto ohledu je potenciál sloučeniny 1 podobný potenciálu jejích dvou přírodních analogů, kterými jsou epothilon A a epothilon B (viz tabulka 3).

Tabulka 3

Srovnáni potenciálu polymerovat tubulin tři epothilonů a paclitaxelu
Analog	Polymeračni potenciál, ECo.oi (μΜ)	Poměr polymeračniho potenciálu analogu a paclitaxelu
sloučenina 1	3, 5	0, 4
(epothilon A)	2,0	0,4
(epothilon B)	1,8	0,3
paclitaxel	8,5, 5,0, 6,0	1,0

Příklad 2 (Referenční)

Sloučenina 1 inhibuje progresi buněčného cyklu

Podobně jako paclitaxel, blokuje sloučenina 1 buňky v mitotické fázi cyklu dělení buněk. Kromě toho v případě sloučeniny 1 koncentrace potřebná pro zastavení mitózy buněk odpovídá koncentraci potřebné k usmrcení buněk během stejné doby léčení. Jak je tedy znázorněno na přiloženém obrázku 2, sloučenina 1 při koncentraci blízké IC₅o (tj. přibližně 7,5 nM) téměř úplně zablokovala buněčnou mitózu během 8 hodin.

Příklad 3

Kombinovaná chemoterapie in vitro

- 12CZ 305799 B6

Úspěšnost protirakovinového činidla je závislá nejen na jeho protinádorovém účinku jakožto jediného činidla, ale rovněž na jeho schopnosti úspěšné kombinace s dalšími antineoplastickými léčivy. Podobně jako paclitaxel, vyvolává sloučenina 1 výrazné poruchy buněčného cyklu tím, že vyvolává zástavu buněčné mitózy. Z tohoto důvodu je zvlášť vhodné prozkoumat chování sloučeniny 1 při použití v kombinované chemoterapii. Pro vyzkoušení cytotoxicity sloučeniny 1 v kombinaci s některými vybranými protirakovinovými činidly s různými mechanismy účinku in vitro byly použity testy vytváření kolonie.

Isobologramové analýzy ukázaly, že způsob interakce mezi sloučeninou 1 a dalšími cytotoxickými činidly in vitro je závislý na druhu léčiva, sekvenci podávání a na velikosti dávky, přičemž typ této interakce se může měnit od synergického účinku až po antagonismu (viz tabulka 4). V případě sloučeniny 2, což je inhibitor ras famesyltransferasy, který je v současné době v I. fázi klinického testování, byl synergický účinek pozorován, pouze pokud sloučenina 1 byla podána před sloučeninou 1. Pokud byly buňky léčeny simultánně sloučeninou 1 a 2 nebo nejprve sloučeninou 2 a potom sloučeninou 1 (tj. sekvencí sloučenina 2 -> sloučenina 1), byl pozorován pouze aditivní účinek. V případě sloučeniny 3, což je inhibitor CDK, byl synergický účinek pozorován opět jen když byla sloučenina 1 podána jako první, avšak v případě zbývajících dvou sekvencí byl pozorován antagonismus.

V případě paclitaxelu byly v případě všech tří léčebných sekvencí pozorovány jen aditivní účinky. V případě cisplatiny byl aditivní účinek pozorován při postupném podání uvedených dvou činidel, avšak pokud byla uvedená činidla podána simultánně, byl pozorován synergický účinek.

Tabulka 4

Účinek sekvence podáváni léčiv na cytostatickou interakci mezi sloučeninou 1 a pěti různými dalšími antineoplastickými činidly u buněčné linie lidského karcinomu střeva HCT116
Sekvence kombinování	Způsob interakce
+ cisplatina (poškozuje DNA) sloučenina 1 —► cisplatina cisplatina —► sloučenina 1 simultánně	aditivní účinek aditivní účinek synergický účinek

Příklad 4 (Referenční)

Protinádorový účinek při parenterálním podávání

Sloučenina 1 byla hodnocena proti souboru osmi modelů lidského a myšího nádoru. Pět těchto modelů bylo vybráno kvůli jejich rezistenci k paclitaxelu (viz tabulka 5) a tři z uvedených modelů, citlivé na paclitaxel, byly zařazeny do testu za účelem úplného stanovení spektra protinádorových účinků sloučeniny 1.

Modely nádorů rezistentních k paclitaxelu

1. Klinicky odvozený model karcinomu vaječníku rezistentní k taxolu® Pat-7

- 13CZ 305799 B6

Tento model nádoru byl vytvořen z biopsie nádoru provedené u pacienty trpící rakovinou vaječníků (Pat-7), přičemž tato pacienta nejprve reagovala na léčbu taxolem®, ale nakonec u ní po devíti monoterapiích taxolem® došlo k vyvinutí rezistence k této látce. Před léčbou taxolem® byl nádor Pat-7 podroben působení několika dalších chemoterapeutických činidel, včetně carboplatinu, cytoxanu, VP-16, ifosamidu a altretaminu. Biopsie nádoru byla provedena po vyvinutí rezistence k taxolu®.

Sloučenina 1 byla podávána holým myším, které nesly nádory, s použitím režimu každé 2 dny x 5. Při optimálním dávce byla sloučenina 1 velmi účinná a jejím použitím bylo ve dvou oddělených testech dosaženo hodnot LCK 2,1 a 4,5 (viz tabulka 6 a přiložený obrázek 3). Při léčbě souběžně hodnoceným, intravenózně (iv) podávaným paclitaxelem bylo při jeho optimální dávce a v optimálním režimu podávání dosaženo hodnot LCK 0,6, respektive 1,3.

Pro zjištění účinku sloučeniny 1 v jiných druzích byl nádor Pat-7 implantován do holých krys, u nichž byla potlačena imunita, a těmto krysám byla intravenózně (iv) podávána sloučenina 1 v režimu každých 8 dnů x 2 (viz tabulka 6). Při optimální dávce, která činila 3 mg/kg/injekci byla sloučenina 1 vysoce účinná a vedla k uzdravení 4 krys ze 6. Pro srovnání je možné uvést, že při podávání optimální dávky paclitaxelu bylo dosaženo hodnoty LCK 2,2, přičemž nedošlo k uzdravení žádné krysy (n = 6).

2. Xenoimplantát lidského karcinomu vaječníku A2780Tax (mutovaný tubulin)

A2780Tax je model lidského karcinomu vaječníků rezistentní k paclitaxelu. Tento model byl získán z mateřské buněčné linie A2780, jež je citlivá na paclitaxel, a to koinkubací buněk s paclitaxelem a verapamilem, což je činidlo pro zvrácení MDR. Bylo prokázáno, že mechanismus rezistence tohoto modelu nesouvisí s MDR, aleje možné jej přisoudit mutaci v genu kódujícím protein β-tubulin [2].

Při podávání sloučeniny 1 myším nesoucím nádory v režimu každé 2 dny x 5 v maximální tolerované dávce (MTD) (která byla 6,3 mg/kg/injekci) bylo dosaženo hodnoty LCK 2,5. Pro srovnání je možné uvést, že při intravenózním (iv) podávání maximální tolerované dávky (MTD) paclitaxelu bylo dosaženo hodnoty LCK 0,8. V tomto testu tedy byly pro sloučeniny 1 získaný výrazné lepší výsledky než pro paclitaxel (viz tabulka 6).

3. Xenoimplantát lidského karcinomu střeva HCT116/VM46 (rezistentní k více léčivům (MDRrezistentní))

HCT116/VM46 je model MDR-rezistentního lidského karcinomu střeva, který byl vyvinut z mateřské citlivé linie HCT116. In vivo, při růstu v holých myších vykazoval HCT116/VM46 konzistentně vysokou rezistenci k paclitaxelu (viz tabulka 5). Ve 12 po sobě jdoucích studiích bylo při podávání paclitaxelu v jeho maximální tolerované dávce (MTD) dosaženo nízkých hodnot LCK, které se pohybovaly v rozmezí od 0 do 0,9 (střední hodnota LCK = 0,35).

Při podávání sloučeniny 1 myším nesoucím nádory HCT116/VM46 v režimu každé 2 dny x 5 bylo dosaženo výrazných protinádorových účinků. Při optimální dávce sloučeniny 1 (která byla v rozmezí od 4,8 do 6,3 mg/kg/injekci) bylo ve třech oddělených studiích dosaženo hodnot LCK 3,1, 1,3 a 1,8. Pro srovnání je možné uvést, že při intravenózním (iv) podávání paclitaxelu bylo v souběžných testech dosaženo hodnot LCK 0,4, respektive 0,7, přičemž paclitaxel byl v prvním z uvedených dvou testů podáván v jeho maximální tolerované dávce (MTD).

4. Klinicky odvozený model rakoviny prsu rezistentní k paclitaxelu Pat-21

Pat-21 je čerstvě pasážovaný model nádoru rezistentní k paclitaxelu, který byl získán biopsií nádoru od pacienta trpícího rakovinou prsu s metastatickým onemocněním, kterému byla aplikována, aniž by bylo dosaženo odezvy, experimentální terapie skládající se z pěti cyklů podávání

- 14CZ 305799 B6 taxolu® v kombinaci s dexverapamilem, což je činidlo pro zvrácení MDR. Před uvedenou taxolovou® terapií byl pacient podroben rovněž chemoterapii, která se skládala z podávání adriamycinu, cytoxanu, methotraxátu a 5-FU. Biopsie nádoru byly provedeny po uvedeném selhání taxolové® terapie.

Pat-21 roste v holých myších relativně pomalu, přičemž zdvojnásobuje svůj objem přibližně každé 3 týdny. Za účelem vyhodnocení protinádorového účinku byla myším nesoucím nádory Pat-21, narostlé na velikost přibližně 100 miligramů, ve dvou cyklech podávána sloučenina 1 nebo paclitaxel. Uvedené dva cykly byly od sebe odděleny 3týdenním intervalem. Každý cyklus se skládal ze 3 dávek, které byly podány každé 4 dny. Paclitaxel byl proti tomuto modelu zcela neúčinný a při podávání v jeho maximální tolerované dávce (MTD), která činila 36 mg/kg injekce, bylo dosaženo hodnoty LCK 0,3. Na druhé straně sloučenina 1 byla výrazně účinná a při podávání její optimální dávky, která činila 10 mg/kg/injekci, bylo dosaženo hodnoty LCK >1,5.

5. Model myšího sarkomu M5076

M5076 je myší fibrosarkom, který je přirozeně in vivo rezistentní k paclitaxelu. Sloučenina 1, která byla ve dvou oddělených experimentech intravenózně (iv) testována v režimu podávání každé 2 dny x 5 proti sc nádorům, byla při maximální tolerované dávce (MTD), která činidla 8,4 mg/kg/injekci, neúčinná, přičemž při uvedených experimentech bylo dosaženo hodnot LCK 0,5, respektive 0,7 (viz tabulka 6). Souběžně testovaný paclitaxel, jenž byl podáván v obvyklém režimu, byl rovněž neúčinný, přičemž bylo dosaženo hodnot LCK 0,1, respektive 0,5.

V oddělené studii byla sloučenina 1 podávána s menší frekvencí (tj. každé 4 dny x 3) a vykázala zlepšený protinádorový účinek, který vedl k hodnotě LCK 1,0 při maximální tolerované dávce, jež činila 24 mg/kg/injekci.

Tabulka 5

Charakteristiky modelů nádorů
Nádor	Histologie	Citlivost k paclitaxelu	Mechanismus rezistence
Lidský
Pat-7	vaječnik	rezistentní¹	MDR, MRP²
A2780Tax	vaječnik	rezistentní	mutace tubulinu
HCT116/VM46	střevo	rezistentní	MDR
Pat-21	prsa	rezistentní¹	neznámý
Ά2780	vaječnik	citlivý	-
HCT116	střevo	citlivý	—
LS174T	střevo	citlivý	-
Myši
M5076	fibrosarkom	rezistentní	neznámý, ne-MDR

¹ Klinická rezistence k taxolu® ² MRP = protein související s rezistencí k více léčivům

- 15 CZ 305799 B6

Tabulka 6

Preklinické testy účinku sloučeniny 1 a paclitaxelu proti nádorům rezistentním k paclitaxelu
		Sloučenina 1	Paclitaxel
Nádor	Experiment číslo	Způsob podávání, režim podávání	OD¹(mg/kg)	LCK²(uzdraveno /celkem)	LCK²' ³
Lidské nádory - v holých myších
Pat-7	R403 8 12	iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q2dx5	4,8 6, 3 6, 3	2,1 4,5 2,1	0, 6 1,3
A2780Tax	12	iv, q2dx5	6,3 ^Ί	2,5	0,8
HCT116/ VM4 6	32 33 35 35	iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q4dx3	4,8 4,8 6,3 16	3,1 1,3 1,8 2,0	0,4 0, 7 NP⁴NP⁴
	Starší odezvy na paclitaxel zjištěné ve 12 po sobě následujících studiích	(0, 4 0,7 0,4 0, 3 0,3 0,0 0,2 0,1 0, 9 0,9 0,3 0,3)

- 16CZ 305799 B6

Tabulka 6 - pokračování

Preklinické testy účinku sloučeniny 1 a paclitaxelu proti nádorům rezistentním k paclitaxelu
		Sloučenina 1	Paclitaxel
Pat-21	R667	iv, q4dx3 41,6 8	10	>1, 5⁵	0,3
Lidské nádory - v holých krysách
Pat-7	15	iv, q8dx2	3	>5 (4/6)	2,2 (0/6)
Myši nádory
M5076	159 162 172	iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q4dx3	8,4 8,4 24	0, 5 0,7 1,0	0,1 0,5 NP

¹ OD, optimální dávka nebo maximální tolerovaná dávka (MTD).

² LCK, log (množství zabitých buněk). Pokud došlo k uzdravení 50 nebo více procent zvířat, byla hodnota LCK vypočtena na základě posledního měření velikosti nádoru před deklarovaným uzdravením a tato hodnota je udána jako stanovené minimum (>). V těchto případech jsou rovněž popsány poměry uzdravených jedinců.

³ LCK jsou udávány pro optimální dávku (dávka v rozmezí od 24 do 36 mg/kg/injekci), nebo pro nejvyšší testovanou dávku v případě, že paclitaxel nebyl účinný.

⁴ NP, neprováděno.

⁵ Studie nebyla v době sepisování tohoto textu dokončena. Prozatímní výsledky na základě měření velikosti nádoru, které byly k dispozici (z 8. 6. 1999) ukazují na zpomalení růstu nádoru, jež odpovídá hodnotě LCK 1,5.

Modely nádorů citlivé na paclitaxel

1. Model lidského karcinomu vaječníků A2780

A2780 je model rychle rostoucího lidského karcinomu vaječníků, který je velice citlivý na paclitaxel (viz tabulka 6). Holé myši nesoucí vyvinuté nádory byly léčeny sloučeninou 1 s použitím „režimu optimalizovaného pro paclitaxel“, kdy sloučenina 1 byla intravenózně (iv) podávána každé 2 dny v celkovém počtu 5 injekcí (každé 2 dny x 5). Při maximální tolerované dávce (6,3 mg/kg/injekci) vykazovala sloučenina 1 vysokou aktivitu, která se projevila tím, že ve třech oddělených experimentech bylo dosaženo hodnoty LCK >4,8, 2, respektive 3.1. Při souběžných testech intravenózně podávaného paclitaxelu, které byly prováděny v prvních dvou studiích, bylo dosaženo při optimální dávce hodnoty LCK 2, respektive 3,5.

Byl rovněž použit A2780 narostlý v holých krysách. Sloučenina 1, jež byla testována při maximální tolerované dávce (MTD) (která činila 1,2 mg/kg/injekci) a která byla podávána každé 2 dny x 5, byla podle výsledků testu neúčinná (hodnota LCK byla 0,3). Souběžně testovaný paclitaxel vykázal vysoký účinek, když při této studii došlo k uzdravení 5 krys ze 7. Následně provedené studie u myší s nádory A2780 prokázaly, že menší frekvence dávek sloučeniny 1 je lépe tolerována a vede k zlepšení účinku této sloučeniny (viz tabulka 6). Proto mohl být nedostatečný

- 17CZ 305799 B6 účinek sloučeniny 1 u holých krys způsobem tím, že při této studii byl použit nižší než optimální léčebný režim. Například v dalších studiích, při kterých se používaly nádory Pat-7 rezistentní k paclitaxelu, vykázala sloučenina 1 výrazný protinádorový účinek pokud byla podávána méně často v režimu každých 8 dnů x 2 (viz tabulka 6).

2. Model lidského karcinomu střeva HCT116

HCT116 je model lidského karcinomu střeva, u kterého bylo prokázáno, že je in vivo velice citlivý na paclitaxel. Sloučenina 1 byla při podávání holým myším nesoucím vyvinutý nádor (o hmotnosti přibližně 100 miligramů) HCT116 vysoce účinná, přičemž při třech různých léčebných režimech - každé 2 dny x 5 dávek, každé 4 dny x 3 a každých 8 dnů x 2 - bylo dosaženo hodnot LCK >6,3 a vysokého počtu uzdravených myší. Ačkoli jsou tyto výsledky velice působivé, byly srovnatelné, ale ne lepší, než v minulosti dosažené výsledky pro paclitaxel podávaný v jeho optimální dávce a v optimálním režimu.

3. LS174T

LS174T je model lidského karcinomu, střev, o kterém je známé, že je citlivý na paclitaxel. Při použití sloučeniny 1, která byla podávána v režimu každé 4 dny x 3, v maximální tolerované dávce (MTD) (16 mg/kg/injekci), bylo dosaženo hodnoty LCK 2,3. Pro srovnání byl souběžně testován paclitaxel, který byl intravenózně podáván v režimu každé 2 dny x 5 dávek, v optimální dávce 36 mg/kg/injekci, a při tomto testu bylo dosaženo hodnoty LCK 2,0 (viz tabulka 7).

Tabulka 7

Preklinické testy účinku sloučeniny 1 a paclitaxelu proti nádorům citlivým na paclitaxel
		Sloučenina 1	Paclitaxel
Nádor	Experiment číslo	Způsob podávání, režim podávání	OD¹(mg/kg)	LCK²(uzdraveno /celkem)	LCK²' ³
Lidské nádory - v holých myších
A2780	89 92 111 115 115	iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q2dx5 iv, q4dx3	6, 3 6, 3 4,8 6,3 16	>4,8 (3/7) 2 3,1 2,4 >5, 3	2 3, 5 NP⁴NP NP
HCT116	52 52 52	iv, q2dx5 iv, q4dx3 iv, q8dx2	6, 3 10 24	>6,3 (4/8) >6,3 (5/8) >6,3 (8/8)	NP NP NP
LS174T	R578	iv, q4dx3	16	2, 3	2,0

¹ OD, optimální dávka nebo maximální tolerovaná dávka (MTD).

² LCK, log (množství zabitých buněk). Pokud došlo k uzdravení 50 nebo více procent zvířat, byla hodnota LCK vypočtena na základě posledního měření velikosti nádoru před deklarovaným uz-18CZ 305799 B6 dravením a tato hodnota je udána jako stanovené minimum (>). V těchto případech jsou rovněž popsány poměry uzdravených jedinců.

⁴ NP, neprováděno.

Příklad 5 (Referenční)

Protinádorový účinek při orálním podávání

Skutečnost, že sloučenina 1 je výrazně stabilnější při neutrálním pH než při nízkém pH byla impulzem pro testování sloučeniny 1 při orálním podávání (po) ve vehikulu pufrujícím pH (0,25molámí roztok fosforečnanu draselného, pH 8,0). Při použití režimu dávkování každé 2 dny x 5 byla sloučenina 1 vysoce orálně účinná proti modelu lidského karcinomu vaječníků Pat-7 (viz tabulka 8). Ve dvou oddělených experimentech bylo při orálním podávání sloučeniny 1 v její maximální tolerované dávce dosaženo hodnoty LCK 3,1, respektive 2,5 (viz přiložené obrázky 4A a 4B a tabulka 8). Pro srovnání byl souběžně testovaná paclitaxel, který byl intravenózně (iv) podáván v optimální dávce a optimálním režimu, přičemž při tomto testu bylo dosaženo hodnoty LCK 1,3, respektive 1,2.

U modelu lidského karcinomu střeva HCT116 došlo při orálním podávání sloučeniny 1 k uzdravení sedmi myší z osmi, a to při podávání sloučeniny v dávce 90 mg/kg/podání, přičemž tato dávka byla podávána každé 2 dny a jejich celkový počet byl roven 5. Na tomto místě je třeba poznamenat, že dosažený stupeň protinádorového účinku byl stejný jako v případě souběžně testovaného intravenózního (iv) režimu podávání, při kterém bylo dosaženo nejlepších výsledků (režim každých 8 dnů x 2, viz tabulka 6).

Tabulka 8

Protinádorové účinky orálně podávané sloučeniny 1 a intravenózně (iv) podávaného paclitaxelu
		Sloučenina 1	Paclitaxel
Nádor	Experiment číslo	Způsob podávání, režim podávání	OD¹(mg/kg)	LCK²(uzdraveno /celkem)	LCK²- ³
Pat-7	8 9	po, q2dx5 po, q2dx5	60 80	3,1 2,5	1,3 1,2
HCT116	52	po, q2dx5	90	>6,3 (7/8)	NP⁴

' OD, optimální dávka nebo maximální tolerovaná dávka (MTD).

LCK, log (množství zabitých buněk). Pokud došlo k uzdravení 50 nebo více procent zvířat, byla hodnota LCK vypočtena na základě posledního měření velikosti nádoru před deklarovaným uzdravením a tato hodnota je udána jako stanovené minimum (>). V těchto případech jsou rovněž popsány poměry uzdravených jedinců.

LCK jsou udávány pro optimální dávku (dávka v rozmezí od 24 do 36 mg/kg/injekci), nebo pro nejvyšší testovanou dávku v případě, že paclitaxel nebyl účinný.

⁴ NP, neprováděno.

-19CZ 305799 B6

Závislost na režimu podávání

Bylo provedeno několik studií pro otestování účinnosti sloučeniny 1 v závislosti na režimu jejího podávání. Při první studii, při níž byly použity A2780 nádory, byla sloučenina 1 podávána myším ve dvou různých režimech: (1) v tradičním (optimalizovaném pro paclitaxel) režimu každé 2 dny x 5 a (2) v režimu podávání s menší frekvencí každé 4 dny x 3. Ačkoli byla sloučenina 1 při obou režimech podávání účinná (s dosaženou hodnotou LCK 2,4, respektive >5,3), umožňoval režim s nižší frekvencí podávání dávek sloučeniny 1 použití vyšších dávek této sloučeniny (maximální tolerovaná dávka (MTD) v tomto případě činila 16 mg/kg/injekci) a dosažená účinnost byla mnohem lepší než v případě režimu s častějším podáváním sloučeniny 1 (kdy maximální tolerovaná dávka (MTD) činila 6,3 mg/kg/injekci) (viz přiložený obrázek 5 a tabulka 9).

Při druhé studii, při níž byl použit model lidského karcinomu střeva HCT116, byly zkoumány tři různé režimy podávání sloučeniny 1: q2dx5, q4dx3 a q8dx2. Ve všech případech byla sloučenina 1 podávána íntravenózně (iv) a nádory byly na počátku léčby ponechány vyrůst na velikost 100 miligramů. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při režimu léčby q8dx2. Při optimální dávce sloučeniny 1 o velikosti 24 mg/kg/injekci došlo k uzdravení 100 procent myší (8 z 8). Při režimech podávání q4dx3 a q2dx5 došlo k uzdravení 5 myší z 8, respektive 4 myší z 8 (viz tabulka 9).

Ve dvou dalších studiích, při nichž byly použity nádory Pat-7 a HCT116/VM46, byla porovnávána účinnost sloučeniny 1 podávané ve dvou režimech: q2dx5 a q4dx3. V obou případech bylo dosaženo v podstatě stejných protinádorových účinků (viz tabulka 9).

Tabulka 9

Závislost protinádorového účinku sloučeniny 1 na režimu podáváni
		Sloučenina 1
Nádor	Experiment číslo	Způsob podávání, režim podávání	OD¹(mg/kg)	LCK²(uzdraveno /celkem)
A2780	115 115	iv, q2dx5 iv, q4dx3	6,3 16	2,4 (0/8) >5,3 (3/7)
HCT116	52 52 52	iv, q2dx5 iv, q4dx3 iv, q8dx2	6, 3 10 24	>6,3 (4/8) >6,3 (5/8) >6,3 (8/8)
Pat-7	12 12	iv, q2dx5 iv, q4dx3	6,3 15	1
HCT116/VM46	35 35	iv, q2dx5 iv, q4dx3	6,3 16	1,8 2,0

¹ OD, optimální dávka nebo maximální tolerovaná dávka (MTD).

² LCK, log (množství zabitých buněk). Pokud došlo k uzdravení 50 nebo více procent zvířat, byla hodnota LCK vypočtena na základě posledního měření velikosti nádoru před deklarovaným uz-20CZ 305799 B6 dravením a tato hodnota je udána jako stanovené minimum (>). V těchto případech jsou rovněž popsány poměry uzdravených jedinců.

Sloučenina 1 zcela jasně vykázala lepší protinádorový účinek než paclitaxel u pěti nádorů rezistentních k paclitaxelu - čtyř lidských nádorových xenotransplantátů a jednoho myšího nádoru, kterými byly: klinicky odvozený karcinom vaječníků rezistentní k paclitaxelu Pat-7; karcinom vaječníků A2780, který je rezistentní k paclitaxelu kvůli tubulinové mutaci; karcinom střeva HCT116/VM46, který je rezistentní kviče léčivům (MDR); klinicky odvozený karcinom prsa rezistentní k paclitaxelu Pat-21; a myší fibrosarkom M5076. Proti třem lidským xenoimplantátům citlivým na paclitaxel vykazovala sloučenina 1 stejný účinek jako paclitaxel, přičemž těmito xenoimplantáty byly: lidský karcinom vaječníků A2780; a lidské karcinomy střeva HCT116 a LS174T. Kromě toho je sloučenina 1 orálně aktivní, přičemž v případě dvou různých lidských nádorových xenoimplantátů bylo orálním podáním sloučeniny 1 dosaženo protinádorového účinku, který je shodný s účinkem, kterého bylo dosaženo při intravenózním podání léčiva.

Příklad 6 (Referenční)

Farmakologické studie sloučeniny 1 použité samostatně a v kombinaci s dalšími antineoplastickými činidly u pacientů s rakovinou v pokročilém stádiu

Díky in vivo a in vitro cytotoxickým účinkům sloučeniny 1 byla sloučenina 1 zařazena do I. fáze klinických testů, které slouží pro otestování toxicity této sloučeniny u pacientů s rakovinou v pokročilém stádiu.

Pacienti, respektive pacientky trpící peritoneální rakovinou vaječníků, ne-malobuněčnou rakovinou plic, melanomem a neznámým typem primárního rakovinového onemocnění byli testováni za účelem zjištění objektivní odezvy. Pacientům byla ve zvyšujících se dávkách podávána sloučenina 1, přičemž velikost dávky se pohybovala v rozmezí od 7,4 mg/m² do 65 mg/m². Při těchto studiích byla stanovena maximální tolerovaná dávka (MTD) sloučeniny 1. Velikost dávky, jež byla doporučena pro použití během II. fáze klinických testů, byla 50 mg/m² s použitím týdenního režimu q3.

Sloučenina 1 je rovněž testována v I. fázi klinických testů v kombinaci s dalšími chemoterapeutickými činidly. Sloučenina 1 bude podávána ve výchozí dávce 30 mg/m² v kombinaci s cisplatinou při velikosti plochy pod křivkou (AUC) 6 a s použitím týdenního režimu q3. Další studie se provádějí za účelem otestování účinností kombinovaného podávání sloučeniny 1 v dávce 30 mg/m² a doxorubicinu v dávce 50 mg/m², opět s použitím týdenního režimu q3. Dále probíhá testování chemoterapeutických režimů, při kterých se sloučenina 1, podávaná v dávce 30 mg/m², kombinuje s činidlem CPT-11, jež se podává v dávce 150 mg/m².

Sloučenina 1 je rovněž testována ve II. fázi klinických testů, které se provádějí na pacientech, u kterých nebyla pozorována odezva na léčebné režimy zahrnující podávání taxanů, anthracyklinů, platiny a 5-FU v kombinací s činidlem CPT-11. Při těchto studiích bude sloučenina 1 podávána s použitím dávkovacího režimu, který se skládá z intravenózní infůze sloučeniny 1 v dávce 50 mg/m², jež trvá 1 hodinu a je podávána každé tři týdny, přičemž daný pacient je podroben celkem 18 léčebným cyklům (PR a SD) nebo 4 léčebných cyklům po CR.

Ve výše uvedených příkladech byly uvedeny číselné odkazy na následující publikace:

1. Long, Β. H. a spolupracovníci, „Mechanism of resistance to etoposide and teniposide in acquired resistant human colon and lung carcinoma cell lines“, Cancer Research, 1991, 51, 5275.

2. Giannakakou, P. a spolupracovníci, „Paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells have mutant beta-tubulins that exhibit impaired paclitaxel-driven polymerization“, J. Biol. Chem., 1997, 272(27), 17118.

-21 CZ 305799 B6

3. Riss, T. L. a spolupracovníci, „Comparison of MTT, XTT, and novel tetrazolium compound MTS for in vitro proliferation and chemosensitivity assays“, Molecular Biology of the Cell, 1992, 3 (suppl.), 184a.

4. Stephens, T. C.; Steel, G. G., „The evaluation of combinations of cytotoxic drugs and radiati5 on: Isobolograms and therapeutic synergism“ v publikaci Rodent tumor models in experimental cancer therapy, str. 248, Ed. Robert F. Kaliman, Pergamon Press, NY, USA.

5. Long, Β. H.; Fairchild, C. R., „Paclitaxel inhibits progression of mitotic cells to G(l) phase by interference with spindle formation without affecting other microtubule functions during anahpase and telophase“, Cancer Research, 1994, 54(16), 4355.

io 6. Williams, R. C.; Lee, J. C., „Preparation of tubulin from brain“, Methods in Enzymology, 1992, 85(Part D),376.

7. Gehan, G. A., „A generalized Wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples“, Biometrika, 1995, 52, 203.

Claims

1. Kombinace cisplatiny a sloučeniny 1

25 pro použití jako léčivo.

2. Kombinace cisplatiny a sloučeniny 1

. 30 pro použití při léčbě karcinomu.

-22CZ 305799 B6

3. Použití kombinace cisplatiny a sloučeniny 1

5 pro výrobu léčiva pro léčbu karcinomu.

4. Kombinace protilátky C225 imunospecifické pro EGFR a sloučeniny 1

5. Kombinace protilátky C225 imunospecifické pro EGFR a sloučeniny 1

pro použití při léčbě karcinomu.

-23 CZ 305799 B6

6. Kombinace protilátky C225 imunospecifické pro EGFR a sloučeniny 1

(1) pro použití při léčbě urychleného nebo metastatického karcinomu močového měchýře, karcinomu slinivky, karcinomu prostaty, nemalobuněčného karcinomu plic, kolorektálního karcinomu nebo karcinomu prsa.

7. Použití protilátky C225 imunospecifické pro EGFR a sloučeniny 1

pro výrobu léčiva pro léčbu karcinomu.

8. Použití podle nároku 7, při kterém je karcinomem urychlený nebo metastatický karcinom močového měchýře, karcinom slinivky, karcinom prostaty, nemalobuněčný karcinom plic, kolorektální karcinom nebo karcinom prsa.

9. Kombinace inhibitoru VEGF vybraného z anti-VEGF protilátky, ZD6474 nebo SU6668, a sloučeniny 1

(1) pro použití jako léčivo.

10. Kombinace inhibitoru VEGF vybraného z anti-VEGF protilátky, ZD6474 nebo SU6668, a sloučeniny 1

-24CZ 305799 B6

pro použití při léčbě karcinomu.

5

11. Použití kombinace inhibitoru VEGF inhibitor vybraného zanti-VEGF protilátky, ZD6474 nebo SU6668, a sloučeniny 1

o OH o (1)

10 pro výrobu léčiva pro léčbu karcinomu.

12. Kombinace capecitabinu a sloučeniny 1

o OH o (1) pro použití jako léčivo.

13. Kombinace capecitabinu a sloučeniny 1

-25CZ 305799 B6

Me

o oh o (1) pro použití při léčbě karcinomu.

14. Použití kombinace capecitabinu a sloučeniny 1

Mc

O OH O (I) pro výrobu léčiva pro léčbu karcinomu.

15. Farmaceutická kompozice pro léčbu karcinomu, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu 1

a chemoterapeutickou látku vybranou z cisplatiny, protilátky C225 imunospecifické pro EGFR, inhibitoru VEGF vybraného z anti-VEGF protilátky, ZD6474 nebo SU6668, nebo capecitabinu.