TW202326134A - 用於破壞細胞內微管的方法及平台 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於破壞細胞內微管的方法及平台。本發明的方法及平台可藉由加入特定化學小分子或是特定波長的光照方式，精準快速地破壞細胞內特定區域的微管結構。除了在基礎科學上可提供重要試劑去進行微管相關研究外，甚至有可能發展成精準化療的嶄新技術。

Description

用於破壞細胞內微管的方法及平台
本發明是有關於一種用於破壞細胞內微管(microtubule)的方法及平台。
微管(microtubule)為主要的細胞骨架，在各種細胞中調控多種細胞生理功能。為了研究微管的功能，傳統方法為加入諾考達唑(nocodazole)、可利欣錠(colchicine)等微管結合藥物去破壞微管，再探討其對細胞影響為何。甚至因為這類藥物可破壞微管而抑制細胞生長，已被大量用於化療藥物。但此類藥物破壞微管的速度非常慢(諾考達唑(3.3 µM)需106.86±12.11分鐘去破壞細胞中一半的微管，可利欣錠(500 µM)需94.28±8.63分鐘去破壞細胞中一半的微管)，且無法專一性破壞特定區域的微管結構(諸如初級纖毛(primary cilia)、中心體(centrosome)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)及細胞間橋(intercellular bridge))，因此局限其使用方法及療效。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎、更快速且可專一性破壞細胞內微管結構的方法及平台以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於破壞細胞內微管(microtubule)的方法，包含以下步驟：(a)將一人工改造的微管切割酵素表現於細胞質，及將一微管結合蛋白質表現於微管上；以及(b)以至少一化學組分令該人工改造的微管切割酵素移動至該微管以與該微管結合蛋白質進行二聚化，藉此使該人工改造的微管切割酵素聚集到該微管上，專一性破壞該微管的結構。
在本發明的一實施例中，該至少一化學組分是巨環內酯類化合物或四環二萜化合物。
在本發明的一實施例中，該巨環內酯類化合物是雷帕黴素(rapamycin)。
在本發明的一實施例中，該四環二萜化合物是赤黴素(gibberellin)。
在本發明的一實施例中，當該至少一化學組分是雷帕黴素時，該人工改造的微管切割酵素包含FK506-結合蛋白(FK506-binding protein, FKBP)。
在本發明的一實施例中，當該至少一化學組分是雷帕黴素時，該微管結合蛋白質為FKBP-雷帕黴素結合域(FKBP-rapamycin binding domain, FRB)。
在本發明的一實施例中，當該至少一化學組分是赤黴素時，該微管結合蛋白質為赤黴素不敏感蛋白質(Gibberellin insensitive protein, GAIs)。
在本發明的一實施例中，當該至少一化學組分是赤黴素時，該人工改造的微管切割酵素包含哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1, mGID1)。
在本發明的一實施例中，該人工改造的微管切割酵素進一步包含一人工改造的spastin。
在本發明的一實施例中，該人工改造的spastin藉由定點突變將其中三個胺基酸殘基突變為連續三個麩醯胺酸(glutamine)，且該spastin是缺少N端1~140個胺基酸的一截短spastin。
在本發明的一實施例中，該微管的結構為初級纖毛(primary cilia)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)或細胞間橋(intercellular bridge)。
在本發明的一實施例中，該初級纖毛包含一軸絲及一纖毛膜，當該初級纖毛被破壞時，該纖毛膜是呈一膨脹及分支表現型。
在本發明的一實施例中，用於破壞細胞內微管的方法破壞時間在一小時內完成。
在本發明的一實施例中，該細胞內微管是以可逆的方式被破壞。
在本發明的一實施例中，該微管是一酪胺酸化微管。
在本發明的一實施例中，該FRB對一A1AY1蛋白質進行標籤化。
本發明之另一目的為提供一種用於破壞細胞內微管的方法，包含以下步驟：將一光照刺激一人工改造的微管切割酵素及複數個微管結合蛋白質，並將該些微管結合蛋白質表現於該細胞內，其中該光照引發該些微管結合蛋白質的二聚化，藉此將該人工改造的微管切割酵素聚集到該微管上，專一性破壞該微管的結構。
在本發明的一實施例中，該光照是藍光。
在本發明的一實施例中，該些微管結合蛋白質是隱花色素二號蛋白質(cryptochrome 2, Cry2)及鈣整合素結合蛋白1的N端170個胺基酸(N-terminal 170 amino acids of calcium and integrin-binding protein 1 (C1B1), CIBN)。
在本發明的一實施例中，該人工改造的微管切割酵素是spastin。
在本發明的一實施例中，該微管的結構為初級纖毛(primary cilia)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)或細胞間橋(intercellular bridge)。
在本發明的一實施例中，該初級纖毛包含一軸絲及一纖毛膜，當該初級纖毛被破壞時，該纖毛膜是呈一膨脹及分支表現型。
在本發明的一實施例中，用於破壞細胞內微管的方法破壞時間在一小時內完成。
在本發明的一實施例中，該人工改造的微管切割酵素是在一光照區域內專一性破壞該微管的結構。
在本發明的一實施例中，該細胞內微管是以可逆的方式被破壞。
本發明之另一目的為提供一種用於破壞細胞內微管的平台，其是藉由一如前所述的方法而被建立。
綜上所述，本發明用於破壞細胞內微管的方法及平台的功效在於：可藉由加入特定化學小分子或是特定波長的光照方式，精準快速地破壞細胞內特定區域的微管結構。除了在基礎科學上可提供重要試劑去進行微管相關研究外，甚至有可能發展成精準化療的嶄新技術。與諾考達唑及可利欣錠此兩種常見傳統微管結合藥物相比，本發明能夠更加快速破壞細胞微管(快8.53至9.67倍)，並在一小時內清除更多細胞微管(3.3 µM諾考達唑清除31%微管；500 µM可利欣錠清除49%微管；本發明清除93%微管)；並且本發明可以精準破壞特定微管結構，諸如初級纖毛、有絲分裂紡錘體及細胞間橋，解決傳統微管結合藥物無法專一破壞微管結構的技術限制。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
以下實施例的統計學分析首先使用F-檢定(F-test)確定變異數是否相等，然後使用未配對的雙尾學生t-檢定(unpaired two-tailed Student’s t-test)經由PRISM 6軟體計算p值。P值小於0.05表示有顯著差異，及p值小於0.01表示有高度顯著差異。
如本文中所用的，術語“人工改造的微管切割酵素”包含一人工改造的spastin及一選自於FK506-結合蛋白(FK506-binding protein, FKBP)或哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1, mGID1)的蛋白質。
如本文中所用的，術語“轉形(transformation)”可與術語“轉染(transfection)”交替地使用，並且泛指將一核酸分子引入一選定的宿主細胞內的方式。依據本技藝中已知的技術，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構物或一重組型載體)可藉由多種技術而被引入至一選定的宿主細胞內，例如磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用(transfection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞擊法(particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用(liposome-mediated transfection)、利用細菌噬菌體的轉染作用或其他方法。
如本文中所用的，術語“DNA建構物(DNA construct)”與“核酸建構物(nucleic acid construct)”及“指定建構物(indicated construct)”可被互換地使用，並且意指能夠進行基因組整合(genomic integration)的DNA分子，包含一或多個轉基因DNA序列(transgene DNA sequences)，這些序列已使用詳知的重組DNA技術以功能性操作方式連接。
如本文中所使用的，術語“二聚化域(dimerizing domain) ”包含三種組合：FK506-結合蛋白(FK506-binding protein, FKBP)與FKBP-雷帕黴素結合域(FKBP-rapamycin binding domain, FRB)、赤黴素不敏感蛋白質(Gibberellin insensitive protein, GAIs)與哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1, mGID1)，及隱花色素二號蛋白質(cryptochrome 2, Cry2)與鈣整合素結合蛋白1的N端170個胺基酸(N-terminal 170 amino acids of calcium and integrin-binding protein 1 (C1B1), CIBN)。
在以下實施例中所用的細胞培養及轉染的操作流程如下。非洲綠猴腎細胞株COS7 (CRL-1651)、子宮頸癌細胞株HeLa (CCL-2)、人骨肉瘤细胞株U2OS (HTB-96)、人胚胎腎細胞株HEK293T (CRL-3216)及小鼠胚胎成纖維株NIH3T3細胞(CRL-1658)在補充有10%胎牛血清(FBS)、青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin)(Corning)的杜貝可氏改良的依格氏培養基(DMEM)中維持在37°C、5% CO 2及95%濕度下。為了誘發纖毛生長(ciliogenesis)，NIH3T3細胞被血清飢餓歷時24小時。COS7細胞用TurboFect轉染試劑(Thermo Fisher)轉染質體DNA。HeLa、U2OS、HEK293T及NIH3T3細胞用FuGENE HD (Promega)轉染。在顯影及其他實驗之前，將轉染的細胞培養24~48小時。
在以下實施例中所用的DNA建構物的操作流程如下。獲得編碼前述細胞中表現最豐富的spastin同型異構物的建構物(58 kDa；從小鼠spastin序列中的 M85位置開始，序列識別號：17)，一種dNSpastin的截短形式，缺少N端1~140個胺基酸(spastin最短的活性截短版本)及酵素失活版本SpastinFLED及dNSastinED，每種版本都帶有增強的黃色螢光蛋白(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP)(SpastinFL-YFP、dNSastin-YFP、SpastinFLED-YFP及dNSastinED-YFP)標籤，來自Dr. Carsten Janke (Institut Curie)。為了去除dNSpastin的MT結合域，藉由以PCR為基礎的方法擴增dNSpastin的催化AAA域(dNSpstinCD)。藉由定點突變將spastin的三個胺基酸殘基突變為連續三個麩醯胺酸(glutamine)(dNSpastin3Q)，然後將編碼以下種類的dNSpastin (dNSpastin、dNSpastinED、dNSpastinCD及dNSpastin3Q)的DNA選殖到YFP-FKBP載體(pEGFP-C1骨架，購自於Clontech公司)中以生成dNSpastin-YFP-FKBP、dNSpastinCD-YFP-FKBP及dNSpastin3Q-YFP-FKBP。使用這種方法，也生成酵素失活的dNSpastin3QED-YFP-FKBP建構物。dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact (乳凝集素的C2域(C2 domain of Lactadherin)的縮寫)是藉由在dNSpastin-YFP-FKBP的HindIII及BamHI限制性位點之間插入C2Lact序列生成的。A1AY1、TagRFP (序列識別號：18)及TagCFP的DNA片段透過密碼子優化合成並亞選殖到FRB及FKBP載體。將每個建構物轉形為勝任細胞並分離出單個選植株用於DNA 純化。所有DNA建構物均藉由DNA定序驗證。
在以下實施例中所用的免疫螢光染色的操作流程如下。在硼矽酸鹽(borosilicate)玻璃Lab-Tek八孔室(Nunc)中培養的細胞在室溫下固定在4%三聚甲醛(paraformaldehyde)(Electron Microscopy Sciences)中15分鐘。固定細胞用0.1% Triton X-100通透化，然後在封阻溶液(含2%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽水)中室溫培育30分鐘。為了標記細胞質微管、初級纖毛膜及軸絲微管，將細胞在室溫下與抗α-微管蛋白的小鼠抗體(1:500；Sigma Aldrich，T6199)、抗Arl13b的兔子抗體(1:500；Proteintech , 17711-1-AP)、抗谷胺醯化微管蛋白小鼠抗體(1:100; Adipogen, AG-20B-0020-C100)、抗乙醯化微管蛋白小鼠抗體(1:500; Sigma Aldrich, T7451)、抗酪胺酸化微管蛋白大鼠抗體(1:100; Sigma Aldrich, MAB1864)及抗去酪胺酸化微管蛋白小鼠抗體(1:100; MERCK, AB3201)(均在封阻溶液中稀釋)培育1小時。然後用PBS清洗細胞，並用適當的二級抗體(1:1000稀釋；Thermo Fisher)室溫下培育1小時。
在以下實施例中所用的西方墨點法(Western blotting)的操作流程如下。將HEK293T細胞與EMTB-CFP-FRB及YFP-FKBP、dNSpastin3Q-YFP-FKBP或dNSpastin3QED-YFP-FKBP共轉染。轉染兩天後，將細胞與50 μM MG132 (一種有效的、可逆的及可滲透細胞的蛋白酶體抑制劑)(Sigma Aldrich)培育30分鐘，然後在細胞收集前用100 nM雷帕黴素或0.1% DMSO (載體對照組)處理30分鐘。對於冷處理(4 )，未轉染的HEK293T細胞置於冰上40分鐘以解聚微管。在含有蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA裂解緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.6；2 mM EGTA；9% NaCl；1% Triton X-100)中裂解細胞。蛋白質濃度用Bio-Rad蛋白質分析測定。細胞裂解物用2×Laemmli樣品緩衝液(Bio-Rad)稀釋，在95°C下煮沸10分鐘，然後進行西方墨點分析。轉移程序後，將PVDF膜(Bio-Rad)與封阻緩衝液(配於含Tween 20的Tris緩衝鹽水(TBST)中的5%脫脂牛奶)在室溫下反應1小時，然後用抗α-微管蛋白(1:1000; Sigma Aldrich, T6199)及GAPDH (1:5000; Cell Signaling, 2118)的一級抗體(用封阻緩衝液稀釋)染色，在4°C下過夜。用TBST清洗膜，然後與辣根過氧化酶綴合的二級抗體(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)(抗兔子，1:10000；抗小鼠，1:5000)(於封阻緩衝液中稀釋)室溫反應1小時。使用Amersham TMECL Select TM(GE Healthcare)偵測生物發光訊號，並使用iBright TMFL1500儀器(Thermo Fisher)獲取墨點影像。
在以下實施例中所用的活細胞顯影的操作流程如下。在顯影過程中用100 nM雷帕黴素快速誘導微管結合蛋白質的二聚化及聚集或微管結合藥物(10 µM諾考達唑(nocodazole)或500 µM可利欣錠(colchicine))處理在聚(D-賴胺酸)塗佈的玻璃蓋玻片(Hecht Assistant)上培養的活轉染細胞。活細胞顯影在 Nikon T1倒置螢光顯微鏡(Nikon)上進行，顯微鏡具有60倍油鏡(Nikon)、Prime相機(Photometrics)及37°C、5% CO 2熱台(Live Cell In strument)。以5或10秒的間隔對感興趣的蛋白質(proteins of interest, POIs)的快速聚集進行顯影，而以1分鐘的間隔對微管破壞過程進行顯影。影像使用Nikon NIS-Elements AR軟體獲得，並使用Huygens Deconvolution軟體(Scientific Volume Imaging)進行處理。影像分析主要使用Nikon NIS-Elements AR軟體進行。
在以下實施例中所用的光刺激的操作流程如下。COS7細胞被置於聚(D-賴胺酸)塗佈的蓋玻片上，並在六孔盤(Thermo Scientific)中培養48小時。在顯影之前，將細胞與SPY650-微管蛋白(1000倍稀釋；Spirochrome)在37°C下培育1小時。使用配備數位微鏡裝置(digital micromirror device)、polygon 400 (MIGHTEX)及488 nm光源的螢光顯微鏡(Nikon)進行局部光刺激。在指定的持續時間內用藍光(波長488 nm)(5秒開/1秒關；1.6 nW/µm 2)照射細胞。mCherry及SPY650-微管蛋白在光刺激期間使用Nikon element AR軟體同時顯影。
在以下實施例中所用的微管絲面積測量的操作流程如下。活細胞中的微管絲用EMTB-CFP-FRB標記並即時顯影(RAW影像)。滾球校正用於從RAW影像中去除細胞質背景，這是使用Nikon NIS-Elements AR軟體進行的。經由Otsu閾值處理影像以生成二元微管絲圖案，並藉由Fiji軟體進行分析。
在以下實施例中所用的追蹤囊泡(vesicle)及溶酶體(lysosome)的操作流程如下。溶酶體關聯性膜醣蛋白3 (lysosome-associated membrane glycoprotein, LAMP3)-YFP/跨高基氏體網絡膜主體蛋白38 (trans-Golgi network integral membrane protein 38, TGN38)-YFP的位移及速度由Fiji軟體插件Trackmate中的DoG偵測器及Simple LAP追蹤器進行追蹤及分析。估計的斑點(blob)直徑設置為 0.8-1 m，連接最大距離為2 microns，間隙關閉距離為 2 m，間隙關閉最大幀間隙為0。
在以下實施例中所用的細胞同步(cell synchronization)的操作流程如下，在細胞周期同步前 20~24小時進行質體DNA (即DNA建構物)轉染。為了同步，HeLa細胞用2 mM胸腺嘧啶(thymidine)(Sigma)處理16~18小時以誘導在G1/S期停滯，然後用2.5 ng/ml RO3306 (一種CDK1的選擇性ATP競爭型抑制劑，Sigma)處理 12小時以誘導在G2/M期停滯階段。用溫熱的DMEM清洗後，將細胞與DMEM及10% FBS在37°C、5% CO 2中培育30~60分鐘，以將集中期(metaphase)及末期(telophase)細胞群富集。 實施例 1. 將感興趣的蛋白質 (proteins of interest, POIs) 快速聚集到微管 (microtubule, MT) 上
化學誘導二聚化(chemically inducible dimerization, CID)系統已被用於在空間及時間上操控細胞訊號及分子組成(參見R. DeRose, T. Miyamoto, T. Inoue, Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pfl{ü}gers Arch.  Eur. J. Physiol. 465, 409–417 (2013); S.-R. R. Hong et al., Spatiotemporal manipulation of ciliary glutamylation reveals its roles in intraciliary trafficking and Hedgehog signaling. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018); C.-H. H. Fan et al., Manipulating Cellular Activities Using an Ultrasound-Chemical Hybrid Tool. ACS Synth. Biol. 6, 2021–2027 (2017))。這是藉由將感興趣的蛋白質(proteins of interest, POIs)(參見圖1A的dNSpastin-二聚化域-C2Lact及dNSpastin3Q-二聚化域)快速聚集到特定亞細胞位址(subcellular site)(參見圖1A的目標MT)或其反應物(substrate)(即微管(MT))上來實現的。利用一小的化學組分(即雷帕黴素(rapamycin))觸發微管結合蛋白質(即FK506-結合蛋白(FK506-binding protein, FKBP)與FKBP-雷帕黴素結合域(FKBP-rapamycin binding domain, FRB))的二聚化是一種已被良好建立的CID系統。為了快速聚集感興趣的蛋白質(POIs)到微管上，本實施例用微管(microtubule, MT)-結合序列(參見圖1A的MAP)、上皮細胞微管關聯蛋白質(ensconsin)的MT-結合域(EMTB)(它是圖1A所示MAP的一種)及藍綠色螢光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)標籤化FRB以顯示其分布(參見圖1A)。圖1A是顯示將人工改造的微管切割酵素(即spastin)聚集到微管上並導致微管快速分解的示意圖，例示說明可誘導的微管分解系統，其中PM表示細胞膜(plasma membrane)。由圖1A可見，其中一種二聚化蛋白質(即FKBP或FRB)與兩個人工改造的spastin酵素(即dNSpastin3Q及C2Lact-標籤化dNSpastin)其中一者融合，另一者(即FKBP或FRB)與微管關聯蛋白質(MT-associated protein, MAP)融合。在特定刺激(例如，化學處理或光照)下的二聚化誘導人工改造的spastin聚集到MAP標記的MT上。Spastin在MT上的急性累積會迅速誘導目標MT的分解。
線掃描分析(linescan analysis)顯示，由此產生的建構物(construct) EMTB-CFP-FRB與由抗 -微管蛋白( -tubulin)抗體標記的細胞質微管共定位(參見圖1B及圖1C)。圖1B及圖1C顯示EMTB-CFP-FRB定位到細胞質微管。由圖1B可見，表現抗 -微管蛋白抗體(紅色)的HeLa細胞以EMTB-CFP-FRB (綠色)固定及染色，比例尺為10 m。由圖1C可見， -微管蛋白(紅色)及EMTB-CFP-FRB (綠色)沿圖1B虛線繪製的正規化強度分布。接著，將雷帕黴素添加到HeLa細胞導致黃色螢光蛋白標籤化的FKBP (yellow fluorescent protein–tagged FKBP, YFP-FKBP)快速聚集到EMTB-CFP-FRB標記的MT上，這可以藉由MT上的螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)訊號增加來證明(聚集的T 1/2：5.73 0.54秒)(參見圖1D及1E)。圖1D顯示添加雷帕黴素(rapamycin, Rapa)將黃色螢光蛋白標籤化的FKBP (yellow fluorescent protein–tagged FKBP, YFP-FKBP)快速聚集到EMTB-CFP-FRB標記的MT上，並增加螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)訊號，其中共轉染以EMTB-CFP-FRB及YFP-FKBP的HeLa細胞被處理以100 nM雷帕黴素，比例尺為10 m，細胞中同時表現EMTB-CFP-FRB及YFP-FKBP，所以為共轉染的結果，EMTB-CFP-FRB在細胞中會持續位在在微管上(絲狀結構)，YFP-FKBP則是自由流動在細胞質中，加入雷帕黴素，會讓FRB跟FKBP形成二聚化，因此讓YFP-FKBP快速聚集在EMTB-CFP-FRB所在的微管上，因此加入雷帕黴素後，YFP-FKBP會馬上變成EMTB-CFP-FRB的絲狀圖案。此外，CFP跟YFP距離靠近時會讓FRET訊號增強，此處FRET訊號低用冷色調表示，訊號高用熱色調表示，色標則是表示各種顏色所代表的訊號強度。圖1E顯示雷帕黴素(Rapa)及0.1%二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)(對照組)處理前後細胞中FRET/CFP的正規化強度(normalized intensity)，其中經由三個獨立實驗，雷帕黴素組及DMSO組中細胞量分別為n = 6及10。
本實施例的結果顯示細胞質POIs透過可誘導的蛋白質二聚化可被快速聚集至微管上，對應到圖1A是指dNSpastin3Q-二聚化域蛋白質本來在細胞質，加入雷帕黴素，可以快速聚集在微管上。圖1A顯示兩種二聚化的實例，第一種為dNSpastin3Q-二聚化域(位在細胞質中)，其在加入化學分子及光照下，可以快速聚集到MAP-二聚化域所在的微管上並破壞微管結構。第二種為dNSpastin-二聚化域-C2Lact (嵌在細胞膜上)，其在加入化學分子及光照下，可以快速聚集到MAP-二聚化域所在的微管上並破壞微管結構。 實施例 2. 利用人工改造的微管切割酵素來實現精準的微管破壞
Spastin是一種微管切割酵素，幾乎存在於所有真核細胞中。在HeLa細胞中表現全長spastin (SpastinFL-YFP，其中spastin的胺基酸序列是序列識別號：1)及沒有N端1~140個胺基酸的截短spastin (dNSpastin-YFP)去除大量的細胞質微管，分別為47.45%及42.86%，相對於YFP-轉染的對照組細胞(參見圖2A至圖2C)，這表示全長spastin及沒有N端1~140個胺基酸的截短spastin皆具有破壞微管的效用。圖2A至圖2C顯示人工改造的spastin酵素的微管切割活性，其中圖2A顯示被轉染以YFP-標籤化全長spastin (SpastinFL-YFP；綠色)及截短spastin (dNSpastin-YFP；綠色)的HeLa細胞以 -微管蛋白抗體(紅色)固定及染色；單獨的YFP及以下酵素(SpastinFLED及dNSpastinED (序列識別號：4))的ED (死酵素，不具活性)形式是陰性對照組，其中SpastinED (即SpastinFLED)的胺基酸序列是序列識別號：3；比例尺為10 m，右邊虛線表示有表現Spastin的細胞外圍；此圖表明表現不同Spastin蛋白質是否能破壞掉細胞中微管(紅色)，SpastinFL表現在細胞中會破壞掉微管，而讓此蛋白質位於細胞質中，截短Spastin也會破壞掉細胞中微管，所以同樣會位於細胞質中，由此實驗顯示全長跟截短Spastin同樣具有切割能力，能夠破壞細胞中微管，因此後續的實驗都會使用截短的Spastin；圖2B顯示以EMTB-CFP-FRB及指定建構物共轉染的HeLa細胞被處理以0.1% DMSO或100 nM雷帕黴素(Rapa)歷時1小時，接而以抗 -微管蛋白抗體固定及染色，比例尺為10 m，虛線標示經轉染的細胞；由圖2B可知，添加雷帕黴素確實可促使FRB及FKBP的二聚化，並使spastin破壞微管；圖2C顯示用0.1% DMSO或雷帕黴素處理表現指定建構物的細胞中 -微管蛋白的正規化強度，從左到右n = 103、39、33、123、41、175、144、88、79、82、90、134、104、81及97細胞，三至五個獨立實驗；數據以平均值 S.E.M表示；執行學生t-檢定並顯示p值。由圖2C可知，全長與截短N端的Spastin都可以破壞微管，與YFP控制組相比，SpastinFL-YFP及dNSpastrin-YFP都可以破壞掉約40%的微管。因此，N端片段(1~140個胺基酸)對於spastin介導的微管切割是不重要。
為了在spastin聚集到微管之前使微管切割反應最小化，本實施例接下來嘗試藉由三種策略將dNSpastin與微管分離，並用YFP-FKBP標籤化spastin，其中FKBP的胺基酸序列是序列識別號：10：(1)從dNSpastin中去除MT-結合域(保留其催化區域(catalytic domain)；dNSpastinCD-YFP-FKBP (其中dNSpastinCD的胺基酸序列是序列識別號：5))；(2) Spastin結合微管所需的關鍵殘基的突變(dNSpastin3Q-YFP-FKBP)，其中dNSpastin3Q的胺基酸序列是序列識別號：6；及(3)用細胞膜-結合序列(plasma membrane-binding sequence) C2Lact標籤化spastin，將spastin錯誤定位到細胞皮層(cell cortex)，在那裡很少發現微管(dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact)(其中C2Lact的胺基酸序列是序列識別號：8)。然後本實施例探討上述建構物在被聚集到微管之前及之後的酵素活性。dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact及dNSpastin3Q-YFP-FKBP在雷帕黴素處理前表現出低微管切割活性，並在雷帕黴素處理後強烈破壞微管。dNSpastinCD-YFP-FKBP未顯示切割活性(參見圖2A至2C)。
活細胞顯影顯示雷帕黴素處理快速觸發dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact (T 1/2= 55.44 ± 8.38秒)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (T 1/2= 60.35 ± 5.30秒)從細胞質到微管上的聚集(參見圖2D及圖2E)。圖2D及圖2E顯示人工改造的spastin被快速聚集到微管上，其中圖2D顯示以EMTB-CFP-FRB (藍色，其中EMTB的胺基酸序列是序列識別號：9，FRB的胺基酸序列是序列識別號：11)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP或dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以100 nM雷帕黴素(Rapa)；細胞的螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)訊號藉由活細胞顯影被即時監控，比例尺為10 m，上面三層為同時表現EMTB-CFP-FRB及dNSpastin3Q-YFP-FKBP的細胞，下面三層為同時表現EMTB-CFP-FRB及dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact的細胞，右邊色標為FRET訊號顏色所相對應的訊號數值；圖2E顯示在雷帕黴素處理下細胞中FRET/藍綠色螢光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)的正規化強度；關於dNSpastin3Q-YFP-FKBP及dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact的細胞量分別為n = 23及25細胞，四個獨立實驗。數據以平均值 S.E.M表示。值得注意的是，雷帕黴素處理下dNSpastin3Q-YFP-FKBP觸發的微管破壞(T 1/2= 11.05 ± 1.52 分鐘)比雷帕黴素處理下dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact觸發的微管破壞(T 1/2= 53.08 ± 8. 分鐘)快得多，且也比兩種常見的微管結合藥物(MT-targeting agent, MTA)的處理，包括諾考達唑(10 µM；T 1/2= 54.02 ± 10.29 分鐘)及可利欣錠(500 µM；T 1/2= 94.28 ± 8.63 分鐘)觸發的微管破壞要快得多，參見圖2F至圖2J。圖2F顯示將人工改造的微管切割酵素(即spastin)聚集到微管上並導致微管快速分解，並顯示將指定的酵素聚集到微管上後微管的影像框架；以指定建構物共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)，比例尺為10 m。圖2G顯示將人工改造的微管切割酵素(即spastin)聚集到微管上並導致微管快速分解，其中使用不同微管破壞處理的細胞中正規化的微管絲面積，以MG132 (一種有效的、可逆的及可滲透細胞的蛋白酶體抑制劑)(50 μM)預處理的諾考達唑(3.3 µM)、可利欣錠(500 µM)、dNSpastin-C2Lact、dNSpastin3Q、dNSpastin3QED (其中dNSpastin3QED的胺基酸序列是序列識別號：7)及dNSpastin3Q+MG132的細胞量分別為n = 30、45、19、20、14及6細胞，三個獨立實驗，數據以平均值 S.E.M表示。圖2H至圖2J顯示微管結合藥物(MTAs)及本發明微管破壞系統的微管破壞效率，其中圖2H以指定建構物轉染的HeLa細胞被處理以諾考達唑(3.3 µM)、可利欣錠(500 µM)或雷帕黴素(100 nM)，比例尺為10 m；圖2I顯示由指定微管破壞系統觸發的微管分解的半數時間(half time)；從左到右n = 30、45、19、30及6細胞，三至五個獨立實驗；圖2J顯示不同微管破壞處理1小時後，經轉染的HeLa細胞中剩餘微管面積的相對比例，從左到右n = 34、30、45、19、20、6及14細胞，三至五個獨立實驗；數據以平均值 S.E.M表示；執行學生t-檢定並顯示p值。此外，與其它處理相比，將dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到微管上顯著去除更多的微管絲(參見圖2H及圖2J)。將酵素失活的dNSpastin3QED-YFP-FKBP捕獲到微管上沒有顯示微管破壞，這表示急性微管破壞是酵素依賴性事件(參見圖2G至圖2J)。
此可誘導的微管破壞發生在其他細胞類型(參見圖2K至圖2N)且也可以由雷帕黴素正交系統(rapamycin-orthogonal system)控制，諸如具有類似微管破壞動力學赤黴素(gibberellin)為基礎的系統(參見圖2O至圖2R)。圖2K及圖2L顯示在COS7細胞中快速破壞微管，其中圖2K以dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)及EMTB-CFP-FRB (藍色)轉染的COS7細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)且進行顯影，比例尺為10 µm，合併指螢光影像合併；圖2L顯示如圖2K中轉染及處理的細胞中正規化微管絲面積；n = 12細胞，四個獨立實驗，數據以平均值±S.E.M表示。圖2M及圖2N顯示在U2OS細胞中快速破壞微管，其中圖2M以dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)及EMTB-CFP-FRB (藍色)轉染的U2OS細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)且進行顯影，比例尺為10 µm；圖2N顯示如圖2M中轉染及處理的細胞中正規化微管絲面積；n = 16細胞，四個獨立實驗，數據以平均值±S.E.M表示。
圖2O及圖2P顯示利用以赤黴素(gibberellin)為基礎的系統來將感興趣的蛋白質快速聚集到微管上，其中圖2O以EMTB-CFP-mGID1 (藍色，其中mGID1的胺基酸序列是序列識別號：13，其為哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1)的縮寫，赤黴素系統的二聚化配偶體(dimerizing partner))及YFP-GAIs (綠色，其中GAIs的胺基酸序列是序列識別號：12，其為赤黴素不敏感蛋白質(Gibberellin insensitive protein)的縮寫，赤黴素系統的二聚化配偶體(dimerizing partner))共轉染的HeLa細胞被處理以GA3-AM (一種赤黴素系統的化學二聚物(chemical dimerizer)(100 µM)，mGID1及GAIs是赤黴素系統的二聚化配偶體(dimerizing partner)；利用活細胞顯影來監測細胞中FRET/CFP訊號，比例尺為10 µm；圖2P顯示GA3-AM (藍色)及0.1% DMSO (紅色)處理後細胞中FRET/CFP的正規化比例，關於DMSO及GA3-AM處理的細胞量分別為n = 10及6細胞，三個獨立實驗，數據以平均值±S.E.M表示。圖2Q及圖2R顯示利用以赤黴素為基礎的系統來快速分解微管，其中圖2Q以dNSpastin3Q-YFP-GAIs (綠色)及EMTB-CFP-mGID1 (黑與藍色)共轉染的HeLa細胞被處理以GA3-AM (100 µM)，比例尺為10 µm；圖2R顯示在GA3-AM處理下以圖2Q中顯示的建構物轉染的細胞中正規化微管絲面積，n = 8細胞，三個獨立實驗，數據以平均值±S.E.M表示。
另一方面，作為spastin抑制劑的斯帕唑啉(spastazoline)，則可迅速逆轉雷帕黴素介導的急性微管破壞(參見圖2S至圖2U)。圖2S至圖2U顯示spastin活性的抑制逆轉微管破壞，其中圖2S以EMTB-CFP-FRB (黑色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的HeLa細胞被預處理以雷帕黴素歷時28分鐘以誘導急性微管分解，斯帕唑啉(10 µM)被添加至培養物中以停止微管破壞系統，箭頭表示中心體(centrosome)衍生的微管，比例尺為10 µm；圖2T顯示如圖2S中共轉染及處理的細胞的正規化微管絲面積，n = 3細胞，兩個獨立實驗，數據以平均值±S.E.M表示；圖2U顯示從細胞質(cytosol)(非中心體(acentrosome))及中心體中由spastin消化的微管片段再生的微管的聚合速率，細胞質組及中心體組的微管數量分別為n = 147及74微管，X軸說明微管從非中心體(acentrosome)及中心體組別生長的速度(Ｙ軸)。數據(紅色)以平均值±SD顯示。執行學生t-檢定以產生p值。
有趣的是，衍生自dNspastin3Q介導的裂解片段的新生微管以0.92 ± 0.04 µm/秒的聚合速率組裝，這比來自中心體的微管的再生速率1.17 ± 0.07 µm/秒稍慢(參見圖2U)。以上結果表明急性微管破壞是透過微管絲分解而不是微管降解發生的。特別地，微管絲由微管分子組成，若只是分解成微管分子，原料還在，則還有機會快速組合回來。但若是微管分子降解掉，原料沒有了，則無法再快速重組回來。因此，dNSpastin3Q-YFP-FKBP快速聚集到微管上有效地觸發二聚化誘導下活細胞中的微管分解。 實施例 3. 急性微管分解抑制囊泡運輸 (vesicular trafficking) 及溶酶體動力學 (lysosome dynamics)
本實施例接下來評估急性微管分解是否在功能上擾亂囊泡及細胞器動力學(organelle dynamics)。為此，使用YFP標記的高基氏體後囊泡標記(YFP-labeled post-Golgi vesicle marker)--跨高基氏體網絡膜主體蛋白38 (trans-Golgi network integral membrane protein 38, TGN38)及溶酶體標記--溶酶體關聯性膜醣蛋白3 (lysosome-associated membrane glycoprotein, LAMP3)來分別觀察急性微管分解下的囊泡及溶酶體的即時動力學(參見圖3A至圖3H)。
圖3A至圖3D顯示急性微管分解減弱囊泡運輸，其中圖3A以EMTB-CFP-FRB (藍色)、dNSpastin3Q-mCherry-FKBP (dNSpastin3Q-mCh-FKBP)(紅色)及TGN38-YFP (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)來誘發微管破壞，虛線表示細胞邊界(cell boundary)，比例尺為10 µm；圖3B顯示圖3A中所示細胞中微管絲面積；圖3C顯示每個TGN38-YFP-標記的囊泡在不同微管破壞水平下的軌跡，插圖顯示由虛線框指示的區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm；圖3D顯示圖3C中顯示的每個標記囊泡的位移(左)及速度(右)，微管100、50及0%組的囊泡量n = 312、319及111囊泡，數據(紅色)以平均值±SD顯示。執行學生t-檢定以產生p值。
圖3E至圖3H顯示急性微管分解減弱溶酶體動力學，其中圖3E以EMTB-CFP-FRB (藍色)、dNSpastin3Q-mCh-FKBP (紅色)及LAMP3-YFP (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)來誘發微管破壞，虛線表示細胞邊界(cell boundary)，比例尺為10 µm；圖3F顯示圖3E中所示細胞中微管絲面積；圖3G顯示每個LAMP3-YFP-標記的溶酶體在不同微管破壞水平下的軌跡，插圖顯示由虛線框指示的區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm；圖3H顯示圖3G中顯示的每個標記溶酶體的位移(左)及速度(右)，微管100、50及0%組的溶酶體量n = 2893、2618及2315溶酶體，數據(紅色)以平均值±SD顯示。執行學生t-檢定以產生p值。
急性微管分解減弱高基氏體後囊泡(post-Golgi vesicle)及溶酶體在移動距離及速度方面的移動(參見圖3A至圖3H)。因此，本發明方法不僅破壞微管結構，而且還迅速阻止囊泡運輸及溶酶體動力學。 實施例 4. 酪胺酸化微管的快速破壞
微管經歷各種轉譯後修飾(post-translational modification, PTM)以空間及時間特定的方式調節微管特性及功能。接下來，本實施例轉向使用特定PTM精準破壞微管。目前已建立一種蛋白質A1AY1 (序列識別號：16)，專門結合到活細胞中的酪胺酸化微管。為了將A1AY1應用於本發明，A1AY1使用FRB及紅色螢光蛋白TagRFP被標籤化。免疫染色結果證實，建構物TagRFP-FRB-A1AY1優先標靶一般微管及酪胺酸化微管，而不是去酪胺酸化微管(參見圖4A及圖4B)。
圖4A及圖4B顯示酪胺酸化微管的破壞，其中圖4A以TagRFP-FRB-A1AY1 (紅色)轉染的COS7細胞是分別藉由抗- -微管蛋白抗體(綠色，上方區塊)、抗-酪胺酸化微管蛋白抗體(綠色，中間區塊)或抗-去酪胺酸化微管蛋白抗體(綠色，下方區塊)被標記；圖4B顯示沿圖4A中繪製的虛線之帶有指定PTM (綠色)的TagRFP-FRB-A1AY1 (紅色)及微管蛋白的強度分布，實線表示TagRFP-FPB-A1AY1，由上到下虛線分別表示α-微管蛋白、酪胺酸化微管蛋白及去胺酸化微管蛋白。添加雷帕黴素快速聚集藍綠色螢光蛋白TagCFP、標籤化FKBP (TagCFP-FKBP)至結合微管的TagRFP-FRB-A1AY1上(T 1/2= 64.71 ± 16.08秒)。此外，將dNSpastin3Q-TagCFP-FKBP聚集到A1AY1標記的微管上破壞A1AY1陽性微管絲並顯著減少約41.4%的酪胺酸化微管(參見圖4C及圖4D)。圖4C及圖4D顯示酪胺酸化微管的破壞，其中圖4C以TagRFP-FRB-A1AY1 (紅色)及dNSpastin3Q-TagCFP-FKBP (藍綠色)共轉染的COS7細胞被處理以0.1% DMSO或雷帕黴素(100 nM)歷時1小時，接而以抗-酪胺酸化微管蛋白抗體(綠色)進行免疫染色，虛線標示經轉染的細胞，比例尺為20 µm；圖4D顯示在0.1% DMSO或雷帕黴素處理1小時後，TagRFP-FRB-A1AY1及dNSpastin3Q-TagCFP-FKBP共轉染細胞中酪胺酸化微管的正規化強度，DMSO及雷帕黴素處理組的細胞量n = 31及26細胞，三個獨立實驗，數據(藍色)以平均值±S.E.M表示。執行學生t-檢定以產生p值。以上結果表示，使用針對酪胺酸化微管的特定微管蛋白PTM生物感測器，本發明方法能夠精準地分解經酪胺酸化修飾的微管。 實施例 5. 特定破壞以微管為基礎的結構
除了細胞質微管，許多以微管為基礎的結構，包括初級纖毛(primary cilia)、中心體(centrosome)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)及細胞間橋(intercellular bridge)，以定義的空間及時間特定的方式調節各種細胞活動。本實施例接下來測試將dNSpastin3Q聚集到這些以微管為基礎不同的結構上是否可以專一性地分解這些以微管為基礎不同的結構。微管關聯性蛋白質4 (microtubule associate protein 4, MAP4m)(序列識別號：19)的截短MT-結合域優先結合G0細胞中的纖毛軸絲(ciliary axoneme)，並在中期(metaphase)轉變為有絲分裂紡錘體，在末期(telophase)轉變為細胞間橋(參見圖5A至圖5C)。
圖5A至圖5C顯示CFP-FRB-MAP4m在細胞周期不同階段的亞細胞分布，其中圖5A以CFP-FRB-MAP4m (綠色)轉染的NIH3T3細胞被血清飢餓以促進纖毛生長(ciliogenesis)，纖毛細胞被固定並用GT335標記，GT335是一種特異性針對纖毛軸絲的谷胺醯化微管蛋白(glutamylated tubulin)(Glu-tub；紅色)的抗體；圖5B及圖5C顯示表現CFP-FRB-MAP4m (綠色)的HeLa細胞在中期(圖5B)及末期(圖5C)同步，然後以 -微管蛋白抗體(紅色)進行固定及染色，虛線表示細胞邊界，比例尺為10 µm。
在G0細胞中，雷帕黴素的添加迅速在CFP-FRB-MAP4m標記的纖毛軸絲上捕獲FKBP標籤化的dNSpastin3Q。dNSpastin3Q在纖毛軸絲上的局部累積導致軸絲及初級纖毛在約15分鐘內快速分解(參見圖5D至圖5F)。
圖5D及圖5E顯示初級纖毛(primary cilia)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)及細胞間橋(intercellular bridge)的快速破壞，其中圖5D以5-羥色胺6 (5-hydroxytryptamine 6, 5HT6)-mCherry (5HT6-mCh，一種纖毛膜標記(ciliary membrane marker)，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的NIH3T3纖維母細胞被血清飢餓歷時24小時以促進纖毛生長，纖毛細胞接著被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到軸絲微管，比例尺為5 µm；圖5E顯示雷帕黴素處理後纖毛(dNSpastin3Q-YFP-FKBP組)中軸絲(軸絲組)、初級纖毛(纖毛膜組)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP的正規化長度，n = 6細胞，三個獨立實驗。
圖5F顯示初級纖毛的快速分解，其中以5HT6-mCh (一種纖毛膜標記，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (一種軸絲標記，藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (上方區塊，綠色)共轉染的NIH3T3細胞或死酵素dNSpastin3QED-YFP-FKBP (下方區塊，綠色)被血清飢餓歷時24小時以促進纖毛生長，纖毛細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin蛋白質聚集到軸絲上，藉由活細胞顯影監測在雷帕黴素處理後spastin蛋白質的聚集、纖毛軸絲的形態及纖毛膜，虛線表示細胞邊界，比例尺為5 µm。
在纖毛軸絲上捕獲酵素失活的dNSpastin3QED-YFP-FKBP不會擾亂纖毛結構(參見圖5F)。儘管軸絲被稱為初級纖毛的主要骨架，但軸絲急性破壞偶爾與整個纖毛結構的分解無關，並在纖毛中誘導膨脹及分支表現型(參見圖5G及圖5H)。
圖5G及圖5H顯示軸絲破壞後，纖毛的結構偶爾不會塌陷，其中圖5G以5HT6-mCh (纖毛膜，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (軸絲微管，藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的NIH3T3細胞被血清飢餓歷時24小時以促進纖毛生長，纖毛細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)以將dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到軸絲上，藉由活細胞顯影監測在雷帕黴素添加後spastin蛋白質的聚集、軸絲的形態及纖毛膜，比例尺為5 µm；圖5H測量並繪製圖5G中顯示的格中指定結構的長度，圖上方的灰色橫線顯示纖毛膜膨脹及/或分支的時間段。
以上結果顯示其他與微管無關的因素也可能有助於維持纖毛結構。這可以解釋為何少有細胞顯示出沒有軸絲的纖毛膜(參見圖5I及圖5J)。
圖5I及圖5J顯示細胞可以在沒有軸絲的情況下自發形成纖毛膜，其中圖5I顯示NIH3T3細胞被血清飢餓以促進纖毛生長，纖毛細胞以抗Arl13b (一種纖毛膜標記，紅色)及抗乙醯化微管蛋白(acetylated tubulin)(acetylated tub，一種纖毛軸絲標記，綠色)抗體進行固定及標記，虛線表示細胞邊界，插圖顯示由虛線框指示的區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm；圖5J顯示自發形成具有短軸絲或無軸絲或正常軸絲的纖毛膜的細胞百分比，n = 391細胞。
圖5K至圖5N顯示有絲分裂紡錘體及細胞間橋的快速破壞，其中圖5K顯示快速聚集dNSpastin3Q-YFP-FKBP到有絲分裂紡錘體上，且快速分解其紡錘體的微管結構；以H2B-mCherry (H2B-mCh，一種染色體標記，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (一種有絲分裂紡錘體的標記，藍色)以及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的HeLa細胞在中期同步並被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到有絲分裂紡錘體，比例尺為10 µm；圖5L以H2B-mCherry (紅色)、CFP-FRB-MAP4m (細胞間橋，藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到細胞間橋，箭頭表示細胞間橋，比例尺為10 µm；圖5M顯示雷帕黴素處理下有絲分裂紡錘體的正規化面積及有絲分裂紡錘體(dNSpastin3Q-YFP-FKBP組)中dNSpastin3Q-YFP-FKBP的強度，n = 6細胞，三個獨立實驗；圖5N顯示雷帕黴素處理下細胞間橋的正規化面積及細胞間橋(dNSpastin3Q-YFP-FKBP)處dNSpastin3Q-YFP-FKBP的強度，n = 5細胞，三個獨立實驗，數據以平均值 S.E.M表示；虛線表示細胞邊界。
在有絲分裂細胞中，dNSpastin3Q聚集到CFP-FRB-MAP4m標記的有絲分裂紡錘體(參見圖5K)及細胞間橋(參見圖5L)上，迅速破壞這些以微管為基礎的結構(參見圖5K至圖5N)。
令人驚訝的是，dNSpastin3Q沒有破壞中心體(或G0細胞中的基體)，如在微管破壞處理1小時後保留PACT (一種pericentrin蛋白質的保守中心體標靶模體)-標記的中心體的細胞影像所示(參見圖5O及圖5P)。
圖5O及圖5P顯示spastin不會破壞中心體，其中圖5O以EMTB-CFP-FRB (藍色)、dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)及PACT-mCh (一種中心體標記，紅色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)並顯影，虛線表示細胞邊界，插圖顯示中心體區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm；圖5P顯示細胞質(細胞質微管組)及中心體中微管絲的正規化面積，n = 8細胞，四個獨立實驗，數據以平均值 S.E.M表示。 實施例 6. 利用光照來時空破壞微管
本實施例接下來嘗試使用光遺傳學系統(optogenetic system)在特定時間段內在感興趣的亞細胞區域中觸發微管分解。隱花色素二號蛋白質(cryptochrome 2, Cry2)(序列識別號：14)及鈣整合素結合蛋白1的N端170個胺基酸(N-terminal 170 amino acids of calcium and integrin-binding protein 1 (C1B1), CIBN)(序列識別號：15)，這兩種藍光敏感二聚物被用於本實施例的微管操控系統。用紅色螢光蛋白mCherry (mCh-Cry2)標籤化的Cry2，僅在光照區域(T 1/2= 34.6 ± 7.58 秒)迅速聚集到EMTB-YFP-CIBN標記的微管上，並在關燈時從微管解離到細胞質(T 1/2= 28.2 ± 4.88秒，參見圖6A及圖6B)。
圖6A及圖6B顯示利用光照以可逆及特定位置的方式分解微管，其中圖6A以EMTB-YFP-CIBN及mCh-Cry2 (紅色)共轉染的COS7細胞以SPY650-微管蛋白(SPY650-tub)培育以顯影微管，在指定的時間段內，細胞在指定區域(由虛線圓圈表示)內被藍光照射，比例尺為10 µm；圖6B顯示mCh-Cry2在照明區域(光照區域)及非照明區域(黑暗區域)中的微管處的正規化強度，n = 6細胞，三個獨立實驗。
然後，本實施例使用光照以空間及時間特定的方式控制spastin介導的微管分解。用mCh-Cry2標籤化的dNSpastin3Q在COS7細胞中與EMTB-YFP-CIBN共表現。在這些實驗中，微管用SPY650-微管蛋白標記。藍光局部照明將dNSpastin3Q-mCh-Cry2強力聚集到微管上，導致微管僅在照明區域分解。當細胞放回黑暗中時，dNSpastin3Q-mCh-Cry2恢復到細胞質及微管產生重組(參見圖6C及圖6D)。
圖6C及圖6D顯示利用光照以可逆及特定位置的方式分解微管，其中圖6C以EMTB-YFP-CIBN及dNSpastin3Q-mCh-Cry2共轉染的COS7細胞以SPY650-微管蛋白培育來顯影微管，細胞被藍光照明，如圖6A，比例尺為10 µm；圖6D顯示照明區域及非照明區域中dNSpastin3Q-mCh-Cry2及mCh-Cry2在微管處的正規化強度及SPY650-微管蛋白的正規化面積，dNSpastin3Q-mCh-Cry2及mCh-Cry2組中細胞量n = 6及6細胞，三個獨立實驗，數據以平均值 S.E.M表示。
藉由相同的光刺激程序將不含spastin的mCh-Cry2聚集到微管上不會導致微管分解，確認光誘導的微管分解不是由光毒性引起的(參見圖6E)。
圖6E顯示聚集不含spastin的光敏感二聚化蛋白質不會破壞微管，其中以EMTB-YFP-CIBN及mCh-Cry2 (紅色)共轉染COS7細胞，及以SPY650-微管蛋白(SPY650-tub，黑色)標記微管，在指定的時間段內用藍光照射會觸發mCh-Cry2快速聚集到光照射區域(虛線圓圈)中的微管上，然而，在聚集mCh-Cry2後，微管仍然完好無損，比例尺為10 µm。
綜上所述，本發明用於破壞活細胞內微管的方法及平台可藉由加入特定化學小分子或是特定波長的光照方式，精準快速地破壞細胞內特定區域的微管結構。除了在基礎科學上可提供重要試劑去進行微管相關研究外，甚至有可能發展成精準化療的嶄新技術。與諾考達唑及可利欣錠此兩種常見傳統微管結合藥物相比，本發明能夠更加快速破壞細胞微管(快8.53至9.67倍)，並在一小時內清除更多細胞微管(3.3 µM諾考達唑清除31%微管；500 µM可利欣錠清除49%微管；本發明清除93%微管)。並且本發明可以精準破壞特定微管結構，諸如初級纖毛、有絲分裂紡錘體及細胞間橋，解決傳統微管結合藥物無法專一破壞微管結構的技術限制。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1A是顯示將人工改造的微管切割酵素(即spastin)聚集到微管上並導致微管快速分解的示意圖，例示說明可誘導的微管分解系統；PM表示細胞膜(plasma membrane)；MT表示微管(microtubule)；MAP表示微管關聯蛋白質(MT-associated protein)；二聚化域(dimerizing domain)包含三種組合：FK506-結合蛋白(FK506-binding protein, FKBP)與FKBP-雷帕黴素結合域(FKBP-rapamycin binding domain, FRB)、赤黴素不敏感蛋白質(Gibberellin insensitive protein, GAIs)與哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1, mGID1)，及隱花色素二號蛋白質(cryptochrome 2, Cry2)與鈣整合素結合蛋白1的N端170個胺基酸(N-terminal 170 amino acids of calcium and integrin-binding protein 1 (C1B1), CIBN)。 圖1B顯示上皮細胞微管關聯蛋白質(ensconsin)的MT-結合域(EMTB)-藍綠色螢光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)-FRB (FKBP-雷帕黴素結合域(FKBP-rapamycin binding domain)的縮寫)定位到細胞質微管(microtubule, MT)。 圖1C顯示 -微管蛋白(紅色)及EMTB-CFP-FRB (綠色)沿圖1B虛線繪製的正規化強度分布。 圖1D顯示添加雷帕黴素(rapamycin, Rapa)將黃色螢光蛋白標籤化的FKBP (yellow fluorescent protein–tagged FKBP, YFP-FKBP)快速聚集到EMTB-CFP-FRB標記的微管(microtubule, MT)上，並增加螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)訊號，其中共轉染以EMTB-CFP-FRB及YFP-FKBP的HeLa細胞被處理以100 nM雷帕黴素，比例尺為10 m，右邊色標表示FRET訊號顏色所代表的亮度數值。 圖1E顯示雷帕黴素(Rapa)及0.1%二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)(對照組)處理前後細胞中FRET/CFP的正規化強度(normalized intensity)，其中經由三個獨立實驗，雷帕黴素組及DMSO組中細胞量分別為n = 6及10，實線表示DMSO，虛線表示Rapa。 圖2A顯示被轉染以YFP-標籤化全長spastin (SpastinFL-YFP；綠色)及截短spastin (dNSpastin-YFP；綠色，其中dNSpastin的胺基酸序列是序列識別號：2)的HeLa細胞以 -微管蛋白抗體(紅色)固定及染色；單獨的YFP及以下酵素(SpastinFLED及dNSpastinED)的ED (死酵素)形式是陰性對照組；比例尺為10 m。 圖2B顯示以EMTB-CFP-FRB及指定建構物共轉染的HeLa細胞被處理以0.1% DMSO或100 nM雷帕黴素(Rapa)歷時1小時，接而以抗 -微管蛋白抗體固定及染色，比例尺為10 m，虛線標示經轉染的細胞；從dNSpastin中去除MT-結合域(保留其催化區域(catalytic domain)；dNSpastinCD-YFP-FKBP (其中dNSpastinCD的胺基酸序列是序列識別號：5))；Spastin結合微管所需的關鍵殘基的突變(dNSpastin3Q-YFP-FKBP)，其中dNSpastin3Q的胺基酸序列是序列識別號：6；及用細胞膜-結合序列(plasma membrane-binding sequence) C2Lact標籤化spastin。 圖2C顯示用0.1% DMSO或雷帕黴素處理表現指定建構物的細胞中 -微管蛋白的正規化強度，從左到右n = 103、39、33、123、41、175、144、88、79、82、90、134、104、81及97細胞，三至五個獨立實驗；數據以平均值 S.E.M表示；執行學生t-檢定並顯示p值。 圖2D顯示人工改造的spastin被快速聚集到微管上，其中以EMTB-CFP-FRB (藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP或dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact (乳凝集素的C2域(C2 domain of Lactadherin)的縮寫)(綠色)轉染的HeLa細胞被處理以100 nM雷帕黴素(Rapa)；細胞的FRET訊號藉由活細胞顯影被即時監控，比例尺為10 m。 圖2E顯示人工改造的spastin被快速聚集到微管上，並顯示在雷帕黴素處理下細胞中FRET/CFP的正規化強度；關於dNSpastin3Q-YFP-FKBP及dNSpastin-YFP-FKBP-C2Lact的細胞量分別為n = 23及25細胞。 圖2F顯示將人工改造的微管切割酵素(即spastin)聚集到微管上並導致微管快速分解，並顯示將指定的酵素聚集到微管上後微管的影像框架；以指定建構物共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)，比例尺為10 m。 圖2G顯示將人工改造的微管切割酵素(即spastin)聚集到微管上並導致微管快速分解，其中使用不同微管破壞處理的細胞中正規化的微管絲面積，以MG132 (一種有效的、可逆的及可滲透細胞的蛋白酶體抑制劑)(50 μM)預處理的諾考達唑(3.3 µM)、可利欣錠(500 µM)、dNSpastin-C2Lact、dNSpastin3Q、dNSpastin3QED及dNSpastin3Q+MG132的細胞量分別為n = 30、45、19、20、14及6細胞，三個獨立實驗，數據以平均值 S.E.M表示。 圖2H顯示微管結合藥物(MT-targeting agents, MTAs)及本發明微管破壞系統的微管破壞效率，其中以指定建構物轉染的HeLa細胞被處理以諾考達唑(Noc, 3.3 µM，一種MTA)、可利欣錠(Col, 500 µM，一種MTA)或雷帕黴素(Rapa, 100 nM)，比例尺為10 m。 圖2I顯示微管結合藥物(MTAs)及本發明微管破壞系統的微管破壞效率，並顯示由指定微管破壞系統觸發的微管分解的半數時間(half time)；從左到右n = 30、45、19、30及6細胞，三至五個獨立實驗，Nocodazole表示諾考達唑，Colchicine表示可利欣錠。 圖2J顯示微管結合藥物(MTAs)及本發明微管破壞系統的微管破壞效率，並顯示不同微管破壞處理1小時後，經轉染的HeLa細胞中剩餘微管面積的相對比例，從左到右n = 34、30、45、19、20、6及14細胞，三至五個獨立實驗，Nocodazole表示諾考達唑，Colchicine表示可利欣錠。 圖2K顯示在COS7細胞中快速破壞微管，其中以dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)及EMTB-CFP-FRB (藍色)轉染的COS7細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)且進行顯影，比例尺為10 µm。 圖2L顯示在COS7細胞中快速破壞微管，並顯示如圖2K中轉染及處理的細胞中正規化微管絲面積；n = 12細胞。 圖2M顯示在U2OS細胞中快速破壞微管，其中以dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)及EMTB-CFP-FRB (藍色)轉染的U2OS細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)且進行顯影，比例尺為10 µm。 圖2N顯示在U2OS細胞中快速破壞微管，並顯示如圖2M中轉染及處理的細胞中正規化微管絲面積；n = 16細胞。 圖2O顯示利用以赤黴素(gibberellin)為基礎的系統來將感興趣的蛋白質快速聚集到微管上，其中以EMTB-CFP-mGID1 (mGID1是哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1)的縮寫，赤黴素系統的二聚化配偶體(dimerizing partner))(藍色)及YFP-GAIs (GAIs是赤黴素不敏感蛋白質(Gibberellin insensitive protein)的縮寫，赤黴素系統的二聚化配偶體(dimerizing partner))(綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以GA3-AM (一種赤黴素系統的化學二聚物(chemical dimerizer)(100 µM)，mGID1及GAIs是赤黴素系統的二聚化配偶體(dimerizing partner)；利用活細胞顯影來監測細胞中FRET/CFP訊號，比例尺為10 µm。 圖2P顯示利用以赤黴素(gibberellin)為基礎的系統來將感興趣的蛋白質快速聚集到微管上，並顯示GA3-AM (藍色)及 0.1% DMSO (紅色)處理後細胞中FRET/CFP的正規化比例，關於DMSO及GA3-AM處理的細胞量分別為n = 10及6細胞。 圖2Q顯示利用以赤黴素為基礎的系統來快速分解微管，其中以dNSpastin3Q-YFP-GAIs (綠色)及EMTB-CFP-mGID1 (黑與藍色)共轉染的HeLa細胞被處理以GA3-AM (100 µM)，比例尺為10 µm。 圖2R顯示利用以赤黴素為基礎的系統來快速分解微管，並顯示在GA3-AM處理下以圖2Q中顯示的建構物轉染的細胞中正規化微管絲面積，n = 8細胞。 圖2S顯示spastin活性的抑制逆轉微管破壞，其中以EMTB-CFP-FRB (黑色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的HeLa細胞被預處理以雷帕黴素歷時28分鐘以誘導急性微管分解，斯帕唑啉(10 µM)被添加至培養物中以停止微管破壞系統，箭頭表示中心體(centrosome)衍生的微管，比例尺為10 µm。 圖2T顯示spastin活性的抑制逆轉微管破壞，並顯示如圖2S中共轉染及處理的細胞的正規化微管絲面積，n = 3細胞，兩個獨立實驗。 圖2U顯示spastin活性的抑制逆轉微管破壞，並顯示從細胞質(cytosol)(acentrosome)及中心體中由spastin消化的微管片段再生的微管的聚合速率，細胞質組及中心體組的微管數量分別為n = 147及74微管。 圖3A顯示急性微管分解減弱囊泡運輸，其中以EMTB-CFP-FRB (藍色)、dNSpastin3Q-mCherry-FKBP (dNSpastin3Q-mCh-FKBP)(紅色)及跨高基氏體網絡膜主體蛋白38 (trans-Golgi network integral membrane protein 38, TGN38)-YFP (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)來誘發微管破壞，虛線表示細胞邊界(cell boundary)，比例尺為10 µm。 圖3B顯示急性微管分解減弱囊泡運輸，並顯示圖3A中所示細胞中微管絲面積。 圖3C顯示急性微管分解減弱囊泡運輸，並顯示每個TGN38-YFP-標記的囊泡在不同微管破壞水平下的軌跡，插圖顯示由虛線框指示的區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm。 圖3D顯示急性微管分解減弱囊泡運輸，並顯示圖3C中顯示的每個標記囊泡的位移(左)及速度(右)，微管100、50及0%組的囊泡量n = 312、319及111囊泡。 圖3E顯示急性微管分解減弱溶酶體動力學，其中以EMTB-CFP-FRB (藍色)、dNSpastin3Q-mCh-FKBP (紅色)及LAMP3-YFP (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)來誘發微管破壞，虛線表示細胞邊界(cell boundary)，比例尺為10 µm。 圖3F顯示急性微管分解減弱溶酶體動力學，並顯示圖3E中所示細胞中微管絲面積。 圖3G顯示急性微管分解減弱溶酶體動力學，並顯示每個LAMP3-YFP-標記的溶酶體在不同微管破壞水平下的軌跡，插圖顯示由虛線框指示的區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm。 圖3H顯示急性微管分解減弱溶酶體動力學，並顯示圖3G中顯示的每個標記溶酶體的位移(左)及速度(右)，微管100、50及0%組的溶酶體量n = 2893、2618及2315溶酶體。 圖4A顯示酪胺酸化微管的破壞，其中以TagRFP-FRB-A1AY1 (紅色)轉染的COS7細胞是分別藉由抗- -微管蛋白抗體(綠色，上方區塊)、抗-酪胺酸化微管蛋白抗體(綠色，中間區塊)或抗-去酪胺酸化微管蛋白抗體(綠色，下方區塊)被標記。 圖4B顯示酪胺酸化微管的破壞，並顯示沿圖4A中繪製的虛線之帶有指定PTM (綠色)的TagRFP-FRB-A1AY1 (紅色)及微管蛋白的強度分布，實線表示TagRFP-FPB-A1AY1，由上到下虛線分別表示α-微管蛋白、酪胺酸化微管蛋白及去胺酸化微管蛋白。 圖4C顯示酪胺酸化微管的破壞，其中以TagRFP-FRB-A1AY1 (紅色)及dNSpastin3Q-TagCFP-FKBP (藍綠色)共轉染的COS7細胞被處理以0.1% DMSO或雷帕黴素(100 nM)歷時1小時，接而以抗-酪胺酸化微管蛋白抗體(綠色)進行免疫染色，虛線標示經轉染的細胞，比例尺為20 µm。 圖4D顯示酪胺酸化微管的破壞，並顯示在0.1% DMSO或雷帕黴素處理1小時後，TagRFP-FRB-A1AY1及dNSpastin3Q-TagCFP-FKBP共轉染細胞中酪胺酸化微管的正規化強度，DMSO及雷帕黴素處理組的細胞量n = 31及26細胞。 圖5A顯示CFP-FRB-MAP4m在細胞周期不同階段的亞細胞分布，其中以CFP-FRB-MAP4m (綠色)轉染的NIH3T3細胞被血清飢餓以促進纖毛生長(ciliogenesis)，纖毛細胞被固定並用GT335標記，GT335是一種特異性針對纖毛軸絲的谷胺醯化微管蛋白(glutamylated tubulin)(Glu-tub；紅色)的抗體。 圖5B顯示CFP-FRB-MAP4m在細胞周期不同階段的亞細胞分布，並顯示表現CFP-FRB-MAP4m (綠色)的HeLa細胞在中期(圖5B)及末期(圖5C)同步，然後以 -微管蛋白抗體(紅色)進行固定及染色，虛線表示細胞邊界，比例尺為10 µm 圖5C顯示CFP-FRB-MAP4m在細胞周期不同階段的亞細胞分布，並顯示表現CFP-FRB-MAP4m (綠色)的HeLa細胞在中期(圖5B)及末期(圖5C)同步，然後以 -微管蛋白抗體(紅色)進行固定及染色，虛線表示細胞邊界，比例尺為10 µm。 圖5D顯示初級纖毛(primary cilia)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)及細胞間橋(intercellular bridge)的快速破壞，其中以5-羥色胺6 (5-hydroxytryptamine 6, 5HT6)-mCherry (5HT6-mCh，一種纖毛膜標記(ciliary membrane marker)，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的NIH3T3纖維母細胞被血清飢餓歷時24小時以促進纖毛生長，纖毛細胞接著被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到軸絲微管，比例尺為5 µm。 圖5E顯示初級纖毛、有絲分裂紡錘體及細胞間橋的快速破壞，並顯示雷帕黴素處理後纖毛(dNSpastin3Q-YFP-FKBP組)中軸絲(軸絲組)、初級纖毛(纖毛膜組)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP的正規化長度，n = 6細胞。 圖5F顯示初級纖毛的快速分解，其中以5HT6-mCh (一種纖毛膜標記，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (一種軸絲標記，藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (上方區塊，綠色)共轉染的NIH3T3細胞或死酵素dNSpastin3QED-YFP-FKBP (下方區塊，綠色)被血清飢餓歷時24小時以促進纖毛生長，纖毛細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin蛋白質聚集到軸絲上，藉由活細胞顯影監測在雷帕黴素處理後Spastin蛋白質的聚集、纖毛軸絲的形態及纖毛膜，虛線表示細胞邊界，比例尺為5 µm，shifted overlap表示移位重疊。 圖5G顯示軸絲破壞後，纖毛的結構偶爾不會塌陷，其中以5HT6-mCh (纖毛膜，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (軸絲微管，藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的NIH3T3細胞被血清飢餓歷時24小時以促進纖毛生長，纖毛細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)以將dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到軸絲上，藉由活細胞顯影監測在雷帕黴素添加後spastin蛋白質的聚集、軸絲的形態及纖毛膜，比例尺為5 µm。 圖5H顯示軸絲破壞後，纖毛的結構偶爾不會塌陷，其中測量並繪製圖5G中顯示的格中指定結構的長度，圖上方的灰色橫線顯示纖毛膜膨脹及/或分支的時間段。 圖5I顯示細胞可以在沒有軸絲的情況下自發形成纖毛膜，並顯示NIH3T3細胞被血清飢餓以促進纖毛生長，纖毛細胞以抗Arl13b (一種纖毛膜標記，紅色)及抗乙醯化微管蛋白(acetylated tubulin)(acetylated tub，一種纖毛軸絲標記，綠色)抗體進行固定及標記，虛線表示細胞邊界，插圖顯示由虛線框指示的區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm。 圖5J顯示細胞可以在沒有軸絲的情況下自發形成纖毛膜，並顯示自發形成具有短軸絲或無軸絲或正常軸絲的纖毛膜的細胞百分比，n = 391細胞，來自四盤。 圖5K顯示有絲分裂紡錘體的快速破壞，並顯示快速聚集dNSpastin3Q-YFP-FKBP到有絲分裂紡錘體上，且快速分解其紡錘體的微管結構；其中以H2B-mCherry (H2B-mCh，一種染色體標記，紅色)、CFP-FRB-MAP4m (一種有絲分裂紡錘體的標記，藍色)以及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的HeLa細胞在中期同步並被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到有絲分裂紡錘體，比例尺為10 µm。 圖5L顯示細胞間橋的快速破壞，其中以H2B-mCherry (紅色)、CFP-FRB-MAP4m (細胞間橋，藍色)及dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)以誘導dNSpastin3Q-YFP-FKBP聚集到細胞間橋，箭頭表示細胞間橋，比例尺為10 µm。 圖5M顯示有絲分裂紡錘體的快速破壞，並顯示雷帕黴素處理下有絲分裂紡錘體的正規化面積及有絲分裂紡錘體(dNSpastin3Q-YFP-FKBP組)中dNSpastin3Q-YFP-FKBP的強度，n = 6細胞。 圖5N顯示細胞間橋的快速破壞，並顯示雷帕黴素處理下細胞間橋的正規化面積及細胞間橋(dNSpastin3Q-YFP-FKBP)處dNSpastin3Q-YFP-FKBP的強度，n = 5細胞。 圖5O顯示spastin不會破壞中心體，其中以EMTB-CFP-FRB (藍色)、dNSpastin3Q-YFP-FKBP (綠色)及PACT-mCh (一種中心體標記，紅色)共轉染的HeLa細胞被處理以雷帕黴素(100 nM)並顯影，虛線表示細胞邊界，插圖顯示中心體區域的更高放大率影像，比例尺為10 µm。 圖5P顯示spastin不會破壞中心體，並顯示細胞質(細胞質微管組)及中心體中微管絲的正規化面積，n = 8細胞。 圖6A顯示利用光照以可逆及特定位置的方式分解微管，其中以EMTB-YFP-CIBN及mCh-Cry2 (紅色)共轉染的COS7細胞以SPY650-微管蛋白(SPY650-tub)培育以顯影微管，在指定的時間段內，細胞在指定區域(由虛線圓圈表示)內被藍光照射，比例尺為10 µm。 圖6B顯示利用光照以可逆及特定位置的方式分解微管，並顯示mCh-Cry2在照明區域(光照區域)及非照明區域(黑暗區域)中的微管處的正規化強度，n = 6細胞。 圖6C顯示利用光照以可逆及特定位置的方式分解微管，其中以EMTB-YFP-CIBN及dNSpastin3Q-mCh-Cry2共轉染的COS7細胞以SPY650-微管蛋白培育來顯影微管，細胞被藍光照明，如圖6A，比例尺為10 µm。 圖6D顯示利用光照以可逆及特定位置的方式分解微管，並顯示照明區域及非照明區域中dNSpastin3Q-mCh-Cry2及mCh-Cry2在微管處的正規化強度及SPY650-微管蛋白的正規化面積，dNSpastin3Q-mCh-Cry2及mCh-Cry2組中細胞量n = 6及6細胞，light表示光照，dark表示黑暗。 圖6E顯示聚集不含spastin的光敏感二聚化蛋白質不會破壞微管，其中以EMTB-YFP-CIBN及mCh-Cry2 (紅色)共轉染COS7細胞，及以SPY650-微管蛋白(SPY650-tub，黑色)標記微管，在指定的時間段內用藍光照射會觸發mCh-Cry2快速聚集到光照射區域(虛線圓圈)中的微管上，然而，在聚集mCh-Cry2後，微管仍然完好無損，比例尺為10 µm。
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Claims (26)

  1. 一種用於破壞細胞內微管(microtubule)的方法，包含以下步驟： (a) 將一人工改造的微管切割酵素表現於細胞質，及將一微管結合蛋白質表現於微管上；以及 (b) 以至少一化學組分令該人工改造的微管切割酵素移動至該微管以與該微管結合蛋白質進行二聚化，藉此使該人工改造的微管切割酵素聚集到該微管上，專一性破壞該微管的結構。
  2. 如請求項1的方法，其中該至少一化學組分是巨環內酯類化合物或四環二萜化合物。
  3. 如請求項2的方法，其中該巨環內酯類化合物是雷帕黴素(rapamycin)。
  4. 如請求項3的方法，其中當該至少一化學組分是雷帕黴素時，該人工改造的微管切割酵素包含FK506-結合蛋白(FK506-binding protein, FKBP)。
  5. 如請求項4的方法，其中當該至少一化學組分是雷帕黴素時，該微管結合蛋白質為FKBP-雷帕黴素結合域(FKBP-rapamycin binding domain, FRB)。
  6. 如請求項2的方法，其中該四環二萜化合物是赤黴素(gibberellin)。
  7. 如請求項6的方法，其中當該至少一化學組分是赤黴素時，該微管結合蛋白質為赤黴素不敏感蛋白質(Gibberellin insensitive protein, GAIs)。
  8. 如請求項7的方法，其中當該至少一化學組分是赤黴素時，該人工改造的微管切割酵素包含哺乳動物優化赤黴素不敏感倭體1 (mammalian optimized Gibberellin insensitive dwarf1, mGID1)。
  9. 如請求項4或8的方法，其中該人工改造的微管切割酵素進一步包含一人工改造的spastin。
  10. 如請求項9的方法，其中該人工改造的spastin藉由定點突變將其中三個胺基酸殘基突變為連續三個麩醯胺酸(glutamine)，且該spastin是缺少N端1~140個胺基酸的一截短spastin。
  11. 如請求項1的方法，其中該微管的結構為初級纖毛(primary cilia)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)或細胞間橋(intercellular bridge)。
  12. 如請求項11的方法，其中該初級纖毛包含一軸絲及一纖毛膜，當該初級纖毛被破壞時，該纖毛膜是呈一膨脹及分支表現型。
  13. 如請求項1的方法，其破壞時間在一小時內完成。
  14. 如請求項1的方法，其中該細胞內微管是以可逆的方式被破壞。
  15. 如請求項5的方法，其中該微管是一酪胺酸化微管。
  16. 如請求項15的方法，其中該FRB對一A1AY1蛋白質進行標籤化。
  17. 一種用於破壞細胞內微管的方法，包含以下步驟： 將一光照刺激一人工改造的微管切割酵素及複數個微管結合蛋白質，並將該些微管結合蛋白質表現於該細胞內， 其中，該光照引發該些微管結合蛋白質的二聚化，藉此將該人工改造的微管切割酵素聚集到該微管上，專一性破壞該微管的結構。
  18. 如請求項17的方法，其中該光照是藍光。
  19. 如請求項17的方法，其中該些微管結合蛋白質是隱花色素二號蛋白質(cryptochrome 2, Cry2)及鈣整合素結合蛋白1的N端170個胺基酸(N-terminal 170 amino acids of calcium and integrin-binding protein 1 (C1B1), CIBN)。
  20. 如請求項17的方法，其中該人工改造的微管切割酵素是spastin。
  21. 如請求項17的方法，其中該微管的結構為初級纖毛(primary cilia)、有絲分裂紡錘體(mitotic spindle)或細胞間橋(intercellular bridge)。
  22. 如請求項21的方法，其中該初級纖毛包含一軸絲及一纖毛膜，當該初級纖毛被破壞時，該纖毛膜是呈一膨脹及分支表現型。
  23. 如請求項17的方法，其破壞時間在一小時內完成。
  24. 如請求項17的方法，其中該人工改造的微管切割酵素是在一光照區域內專一性破壞該微管的結構。
  25. 如請求項18的方法，其中該細胞內微管是以可逆的方式被破壞。
  26. 一種用於破壞細胞內微管的平台，其是藉由一如請求項1至25中任一項的方法而被建立。
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