ES2559312T3 - Multienzimas y su uso en la fabricación de ácidos grasos poliinsaturados - Google Patents

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Abstract

Una multienzima que comprende un único polipéptido que tiene al menos dos actividades enzimáticas independientes y separables, en donde dichas actividades enzimáticas comprenden al menos un ácido graso elongasa enlazado a al menos un ácido graso desaturasa, en donde dicha elongasa está enlazada a dicha desaturasa y dicho enlace se selecciona del grupo constituido por una ID de SEC Nº: 198, ID de SEC Nº: 200, ID de SEC Nº: 235, ID de SEC Nº: 438, ID de SEC Nº: 472, ID de SEC Nº: 445, y ID de SEC Nº: 504.

Description

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destino Yarrowia lipolytica Gateway® (véase también la ID de SEC Nº: 38); y (D) pBY-EgC20elo1 (véase también la ID de SEC Nº: 39).
La FIG. 8 proporciona mapas de plásmidos para los siguientes: (A) pY132 (véase también la ID de SEC Nº: 40); (B) pY161 (véase también la ID de SEC Nº: 41); (C) pY164 (véase también la ID de SEC Nº: 42); y (D) pY141 (véase también la ID de SEC Nº: 49).
La FIG. 9 proporciona mapas de plásmidos para los siguientes: (A) pY143 (véase también la ID de SEC Nº: 52); (B) pY149 (véase también la ID de SEC Nº: 55); (C) pY150 (véase también la ID de SEC Nº: 62); y (D) pY156 (véase también la ID de SEC Nº: 64).
La FIG. 10 proporciona mapas de plásmidos para los siguientes: (A) pY152 (véase también la ID de SEC Nº: 67); (B) pY157 (véase también la ID de SEC Nº: 69); (C) pY153 (véase también la ID de SEC Nº: 72); y (D) pY151 (véase también la ID de SEC Nº: 76).
La FIG. 11 es un mapa de pY160 (véase también la ID de SEC Nº: 77).
La FIG. 12 muestra un cromatograma del perfil lipídico de la un extracto de célula de Euglena anabaena como se describe en los Ejemplos.
Las FIG. 13A, 13B y 13C muestran una alineamiento Clustal W de las secuencias de aminoácidos para EaDHAsyn1 (ID de SEC Nº: 95), EaDHAsyn2 (ID de SEC Nº: 96), EaDHAsyn3 (ID de SEC Nº: 97) y EaDHAsyn4 (ID de SEC Nº: 98).
La FIG. 14 proporciona mapas de plásmidos para los siguiente: (A) pY165 (véase también la ID de SEC Nº: 99); (B) pY166 (véase también la ID de SEC Nº: 100); (C) pY167 (véase también la ID de SEC Nº: 101); y (D) pY168 (véase también la ID de SEC Nº: 102).
La FIG. 15 proporciona mapas de plásmidos para los siguientes: (A) pKR1061 (véase también la ID de SEC Nº: 111); (B) pKR973 (véase también la ID de SEC Nº: 128); (C) pKR1064 (véase también la ID de SEC Nº: 132); y (D) pKR1133 (véase también la ID de SEC Nº: 145).
FIG. 16 proporciona mapas de plásmidos para los siguientes: (A) pKR1105 (véase también la ID de SEC Nº: 156);
(B) pKR1134 (véase también la ID de SEC Nº: 161); (C) pKR1095 (véase también la ID de SEC Nº: 167); y (D) pKR1132 (véase también la ID de SEC Nº: 170.
La FIG. 17 es un mapa de KS373 (véase también la ID de SEC Nº: 179).
La FIG. 18 muestra los perfiles de ácidos grasos, % de elongación calculados, y % de desaturación calculados para los clones (excepto pBY-EgC20elo1) mostrados en la Tabla 24.
La FIG. 19 muestra los perfiles de ácidos grasos, % de elongación calculados, y % de desaturación calculados para alimentar EPA a vector sólo control, pY141, pY143, pY149, pY156, pY157 y pY160.
La FIG. 20 muestra los perfiles de ácidos grasos, % de elongación calculados, y % de desaturación calculados para alimentar DPA a vector sólo control, pY141, pY150, pY151, pY152, pY153, pY156, pY157 y pY160.
La FIG. 21 muestra un esquema de la estructura de dominio relativo para cada constructo descrito en la Tabla 25.
La FIG. 22 muestra los perfiles de ácidos grasos, % de elongación calculados, y % de desaturación calculados para alimentar EPA, ARA y DPA a células Yarrowia transformadas con pY141 (EgDHAsyn1; ID de SEC Nº: 49) y a un vector sólo control.
La FIG. 23 muestra los perfiles de ácidos grasos para embriones individuales a partir de un caso representativo de embriones somáticos de soja transformados con vectores de expresión de soja pKR973 y pKR1064 (véase Tabla 26).
La FIG. 24 muestra los perfiles de ácidos grasos para los cinco mejores casos de elongación en embriones de soja transformados con el vector KS373 de expresión de la soja.
La FIG. 25 resume BLASTP y los valores de identidad en porcentaje para EgC20elo1 (Ejemplo 3), EgDHAsyn1 (Ejemplo 4), y EgDHAsyn2 (Ejemplo 5).
La FIG. 26 muestra los perfiles de ácidos grasos de la alimentación de embriones de soja con EPA. Los embriones de soja fueron seleccionados a partir de las mejores actividades de la elongasa C20/delta-5 y de la delta-4 desaturasa en embriones de soja transformados con el vector pKR1105 de expresión de soja.
La FIG. 27 muestra un cromatograma del perfil lipídico de un extracto celular de Euglena gracilis como se describe en los Ejemplos.
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La FIG. 28 es un mapa de pKR1183 (véase también la ID de SEC Nº: 266).
La FIG. 29 resume las secuencias de dominio la sintasa de DHA de Euglena anabaena.
La FIG. 30 es un mapa de pKR1253 (véase también la ID de SEC Nº: 270).
La FIG. 31 es un mapa de pKR1255 (véase también la ID de SEC Nº: 275).
La FIG. 32 es un mapa de pKR1189 (véase también la ID de SEC Nº: 285).
La FIG. 33 es un mapa de pKR1229 (véase también la ID de SEC Nº: 296).
La FIG. 34 es un mapa de pKR1249 (véase también la ID de SEC Nº: 297).
La FIG. 35 es un mapa de pKR1322 (véase también la ID de SEC Nº: 314).
La FIG. 36 muestra los perfiles de ácidos grasos para cinco casos transformados con pKR1189 que tienen el promedio más bajo de contenido de ALA (promedio de 5 embriones somáticos de soja analizados) junto con un caso (2148-3-8-1) que tiene un típico perfil de ácidos grasos de embriones de tipo silvestre para este experimento. Los ácidos grasos son identificados como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA y ALA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales (% en peso).
La FIG. 37 muestra los perfiles de ácidos grasos de cinco casos transformados con pKR1183 que tienen el promedio más alto de contenido de DGLA (promedio de 5 embriones somáticos de soja analizados). Los ácidos grasos se identifican como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA y ETA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales.
La FIG. 38 muestra los perfiles promedio de ácidos grasos (promedio de 10 embriones somáticos de soja) para 20 casos transformados con pKR1249 y pKR1253 que tienen el mayor ARA. Los ácidos grasos se identifican como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA y EPA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales. Los ácidos grasos que se enumeran como "otros" incluyen: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) o 20:2 (8,11) y DPA.
La FIG. 39 muestra los perfiles de ácidos grasos reales para cada embrión somático de soja a partir de un caso (AFS 5416-8-1-1) que tiene un contenido de ARA promedio de 17,0% y un contenido de EPA promedio de 1,5%. Los ácidos grasos se identifican como 16:0(palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA y EPA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales. Los ácidos grasos que se enumeran como "otros" incluyen: 18:2 (5,9), 18:3 (5, 9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) o 20:2 (8,11) y DPA.
La FIG. 40 muestra los perfiles promedio de ácidos grasos (promedio de 9 o 10 embriones somáticos de soja) para 20 casos transformados con pKR1249 y pKR1255 que tienen el mayor ARA. Los ácidos grasos se identifican como
16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA y EPA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales. Los ácidos grasos que enumeran como "otros" incluyen: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) o 20:2 (8,11) y DPA.
La FIG. 41 muestra los perfiles de ácidos grasos para alimentar embriones con EPA. Los embriones de soja fueron seleccionados a partir de los casos con las mejores actividades de elongasa C20/delta-5 y delta-4 desaturasa en embriones de soja transformados con el vector pKR1134 de expresión de soja. Los ácidos grasos en la FIG. 41 son identificados como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EPA, 22:0 (ácido docosanoico), DPA, 24:0 (tetracosanoico ácido), DHA y 24:1 (ácido nervónico). Las composiciones de ácidos grasos que se enumeran en la FIG. 41 se expresan como porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales.
La FIG. 42 muestra los perfiles de ácidos grasos para alimentar embriones de soja con EPA. Los embriones de soja fueron seleccionados a partir de los casos con las mejores actividades de elongasa C20/delta-5 y delta-4 desaturasa de los 20 nuevos casos analizados para soja transformada con pKR1105. Los ácidos grasos en la FIG. 42 se identifican como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EPA, 22:0 (docosanoico ácido), DPA, 24:0 (tetracosanoico ácido), DHA y 24:1 (ácido nervónico). Las composiciones de ácidos grasos que se enumeran en la FIG. 42 se expresan como porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales.
La FIG. 43 muestra un gráfico que representa las actividades relativas de casos transformados con cualquier pKR1105 (elongasa C20 y delta-4 desaturasa expresadas individualmente) o pKR1134 (elongasa C20 y delta-4 desaturasa expresadas como una Fusión), cuando los embriones de soja fueron alimentados con EPA.
La FIG. 44 representa en un diagrama el desarrollo de la cepa Y4305U3 Yarrowia lipolytica.
La FIG. 45 proporciona mapas de plásmidos para los siguientes: (A) pZKLeuN-29E3 y (B) pY116.
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La FIG. 70 muestra los perfiles de ácidos grasos para los cinco casos transformados con pKR1200 que tienen el contenido medio de DGLA más alto (promedio de 5 embriones somáticos de soja analizados).
La FIG. 71 muestra los perfiles de ácidos grasos para los cinco casos transformados con pKR1184 que tienen el contenido medio de DGLA más alto (promedio de 5 embriones somáticos de soja analizados).
La FIG. 72 muestra una comparación de elongasas delta-9 con desaturasa s delta-8 expresadas individualmente frente a la Fusión equivalente de delta-9 elongasa-delta-8 desaturasa. Cada punto de dato representa el % de DGLA
o el % de EDA promedio para 5-6 embriones (como un % de ácidos grasos totales) para todos los casos analizados, y se registra el % de DGLA promedio frente al % de EDA promedio. En (A), EgTpom representa EgD9e coexpresado con TpomD8 (pKR1014), y EgTpomfus representa la Fusión EgD9e/TpomD8 (pKR1199). En (B), Egea representa EgD9e co-expresada con EaD8 (pKR1152) y EgEafus representa la Fusión EgD9e/EaD8 (pKR1200). En (C), EaTpom representa EaD9e co-expresada con TpomD8 (pKR1151), y EaTpomfus representa la Fusión EaD9e/TpomD8 (pKR1183). En la FIG. (D), EaEa representa EaD9e co-expresada con EaD8 (pKR1150) y EaEafus representa la Fusión EaD9e/EaD8 (pKR1200).
La FIG. 73 muestra los perfiles de ácidos grasos para los cinco casos transformados con pKR1322 (Experimento MSE2274) que tienen el más alto contenido medio de ARA y EPA (promedio de los 5 embriones analizados). Los ácidos grasos se identificaron como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), 18:2 (5,9), LA, ALA, EDA, ERA, SCI, DGLA, JUN (también denominado JUP), ETA, ARA y EPA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales. La actividad de elongación se expresa como % de elongación delta-9 de ácidos grasos C18 (% Elo), calculado según la siguiente fórmula: ([producto]/[sustrato+ producto]) * 100. Más específicamente, el porcentaje de elongación combinado para LA y ALA se determina como: ([DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA]) * 100. El porcentaje de desaturación delta-8 combinado de EDA y ERA se muestra como "% D8", determinado como: ([DGLA+ETA+EPA+ARA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA+EPA+ARA]) * 100. Esto también se conoce como el % de desaturación delta-8 global. El porcentaje desaturación delta-5 combinado de DGLA y ETA se muestra como "% D5", determinado como: ([EPA+ARA]/[DGLA+ETA+EPA+ARA]) * 100. Esto también se conoce como el % de desaturación delta-5 global.
La FIG. 74 muestra los perfiles de ácidos grasos para los cinco casos transformados con pKR1326 (Experimento MSE2275) que tienen el contenido medio mayor de DGLA y ETA (promedio de los 5 embriones analizados). Los ácidos grasos se identifican como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA y DGLA y ETA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como un porcentaje en peso (% en peso) de los ácidos grasos totales. La actividad de elongación se expresa como % de elongación delta-9 de los ácidos grasos C18 (% de elong. delta-9 de C18), calculado según la siguiente fórmula: ([producto]/[sustrato+producto]) *
100. Más específicamente, el porcentaje de elongación combinada para LA y ALA se determina como: ([DGLA+ETA+EDA+ERA]/[LA+ALA+DGLA+ETA+EDA+ERA])*100. El porcentaje de desaturación combinado para EDA y ERA se muestra como "% de desat. delta-8 de C20", determinado como: ([DGLA+ETA]/[DGLA+ETA+EDA+ERA])*100. Esto también se conoce como el % de desaturación global.
Las descripciones de las secuencias resumen el Listado de Secuencias adjunto al presente documento. El Listado de Secuencias contiene códigos de una letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos individuales y de tres letras para los aminoácidos como se definen en las Normas de la IUPAC-IUB descritas en Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219(2): 345-373 (1984).
Las ID de SEC Nº: 1-519 son cebadores, genes que codifican ORF, proteínas (o porciones de los mismos), o plásmidos, como se identifican en la Tabla 2.
Tabla 2
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Cebador universal M13F
1
Elongasa cCMP459 de ácido graso poliinsaturado de C20 Pavlova sp. (Nº AAV33630 de acceso al Banco de Genes)
- 2 (277 AA)
Secuencia 5’ del clon eeg1c.pk005.p14.f de Euglena gracilis
3 (608 pb) -
Secuencia de inserto completo del clon eeg1c.pk005.p14.f de Euglena gracilis
4 (1.327 pb) -
Secuencia de codificación del clon eeg1c.pk005.p14.f ("EgC20elo1") de Euglena gracilis
5 (897 pb) 6 (298 AA)
11
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Cebador SeqE
7 -
Cebador SeqW
8 -
Secuencia 5’ del clon eeg1c.pk016.e6.f de Euglena gracilis
9 (742 pb) -
Secuencia de inserto completo del clon eeg1c.pk016.e6.f de Euglena gracilis
10 (2.630 pb) -
Secuencia de codificación del clon eeg1c.pk016.e6.f (sintasa 1 de DHA o "EgDHAsyn1") de Euglena gracilis
11 (2.382 pb) 12 (793 AA)
Desaturasa delta-4 de ácido graso (Nº AAQ19605 de acceso al Banco de Genes) de Euglena gracilis
- 13 (541 AA)
Cebador M13rev
14 -
Cebador EUGel4-1
15 -
Cebador EgEloD4Mut-5
16 -
Cebador oEUGel4-2
17 -
Cebador EgDHAsyn5'
18 -
Cebador EgDHAsyn3'
19 -
Secuencia de inserto completo del clon eeg1c-1 de Euglena gracilis
20 (2.630 pb) -
Secuencia de codificación del clon eeg1c-1 (sintasa 2 de DHA o "EgDHAsyn2") de Euglena gracilis
21 (2.382 pb) 22 (793 AA)
Secuencia de ADNc de la delta-4 desaturasa de Euglena gracilis (Nº AY278558 de acceso al Banco de Genes)
23 (2.569 pb) -
Secuencia de codificación de delta-4 desaturasa de Euglena gracilis (Nº AY278558 de acceso al Banco de Genes)
24 (1.626 pb) -
Elongasa 2 de PUFA (Nº AAV67798 de acceso al Banco de Genes) de Ostreococcus tauri
- 25 (300 AA)
Elongasa 2 de PUFA (Nº AAV67800 de acceso al Banco de Genes)de Thalassiosira pseudonana)
- 26 (358 AA)
Desaturasa delta-4 (Nº AAN75707 de acceso al Banco de Genes)Thraustochytrium aureum
- 27 (515 AA)
Desaturasa delta-4 (publicación del PCT Nº. WO 2002/090493) de Schizochytrium aggregatum
- 28 (509 AA)
Desaturasa delta-4 de ácido graso (Nº AAX14506 de acceso al Banco de Genes) de Thalassiosira pseudonana
- 29 (550 AA)
Desaturasa delta-4 (Nº AAV33631 de acceso al Banco de Genes)de Isochrysis galbana
- 30 (433 AA)
Plásmido pDMW263
31 (9.472 pb) -
Plásmido pDMW237
32 (7.879 pb) -
Plásmido pY115
33 (7.783 pb) -
Plásmido pBY1
34 (8.704 pb) -
Cebador oYFBA1
35 -
Cebador oYFBA1-6
36 -
Plásmido pY158
37 (6.992 pb) -
Plásmido pY159
38 (8.707 pb) -
12
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Plásmido pBY-C20elo1
39 (8.425 pb) -
Plásmido pY132
40 (9.677 pb) -
Plásmido pY161
41 (9.680 pb) -
Plásmido pY164
42 (9.701 pb) -
Cebador EgEPAEloDom-5
43
Cebador oEUG el4-3
44 -
Plásmido pKR1062
45 (5.914 pb) -
Cebador EgEloD4Mut-5
46
Cebador EgEloD4Mut-3
47 -
Plásmido pLF115-7
48 (5.914 pb) -
Plásmido pY141
49 (9.373 pb) -
Cebador EgDPAEloDom-3
50 -
Plásmido pHD16
51 (4.443 pb) -
Plásmido pY143
52 (7.903 pb) -
Cebador oEUGsyn6-2
53 -
Plásmido pKR1071
54 (4.497 pb) -
Plásmido pY149
55 (8.005 pb) -
Cebador oEUGsyn6-3
56 -
Plásmido pKR1091
57 (4.498 pb) -
Plásmido pY155
58 (8.006 pb) -
Cebador oRIG6-1
59 -
Cebador oRIG6-2
60 -
Plásmido pKR1067
61 (4.827 pb) -
Plásmido pY150
62 (8.293 pb) -
Plásmido pKR1097
63 (5.795 pb) -
Plásmido pY156
64 (9.253 pb) -
Cebador oEGslne6-1
65 -
Plásmido pKR1069
66 (4.947 pb) -
Plásmido pY152
67 (8.413 pb) -
Plásmido pKR1099
68 (5.915 pb) -
Plásmido pY157
69 (9.373 pb) -
Cebador oEUGel4-4
70 -
Plásmido pKR1073
71 (5.151 pb) -
Plásmido pY 153
72 (8.617 pb) -
Cebador oRSA1-1
73 -
Cebador oRSA1-2
74 -
Plásmido pKR1068
75 (5.058 pb) -
Plásmido pY151
76 (8.524 pb) -
13
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Plásmido pY160
77 (9.484 pb) -
Cebador EaDHAsyn5'
78 -
Cebador EaDHAsyn5'2
79 -
Cebador EaDHAsyn5'3
80 -
Cebador EaDHAsyn5'4
81 -
Cebador EaDHAsyn3'
82 -
Cebador EaDHAsyn3'2
83 -
Cebador EaDHAsyn3'3
84 -
Cebador EaDHAsyn3'4
85 -
Cebador EaDHAsyn3'5
86 -
Plásmido pLF117-1
87 (5.582 pb) -
Plásmido pLF117-2
88 (5.607 pb) -
Plásmido pLF117-3
89 (5.608 pb) -
Plásmido pLF117-4
90 (5.557 pb) -
Secuencia de codificación (sintasa 1 de DHA o "EaDHAsyn1") de Euglena anabaena
91 (2.523 pb) 95 (841 AA)
Secuencia de codificación (Sintasa 2 de DHA o "EaDHAsyn2")de Euglena anabaena
92 (2.523 pb) 96 (841 AA)
Secuencia de codificación (sintasa 3 de DHA o "EaDHAsyn3") de Euglena anabaena
93 (2.523 pb) 97 (841 AA)
Secuencia de codificación (sintasa 4 de DHA o "EaDHAsyn4") de Euglena anabaena
94 (2.442 pb) 98 (814 AA)
Plásmido pY165
99 (10.133 pb) -
Plásmido pY166
100 (10.158 pb) -
Plásmido pY167
101 (10.159 pb) -
Plásmido pY168
102 (10.108 pb) -
Cebador oEGel2-1
103 -
Plásmido pKR1055
104 (5.916 pb) -
Plásmido pKR72
105 (7.085 pb) -
Cebador oCon-1
106 -
Cebador oCon-2
107 -
Plásmido pKR179
108 (4.480 pb) -
Plásmido pKR1057
109 (6.873 pb) -
Plásmido pKR328
110 (8.671 pb) -
Plásmido pKR1061
111 (12.844 pb) -
Delta-9 elongasa ("EgD9elo" o "EgD9e" o gD9E") Euglena gracilis
112 (777 pb) 513 (258 AA)
Cebador oEugEL1-1
113 -
Cebador oEugEL1-2
114 -
Plásmido pKR906
115 (4.311 pb) -
14
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Plásmido pKR132
116 (3.983 pb) -
Plásmido pKR953
117 (4.771 pb) -
Plásmido pKR287
118 (5.492 pb) -
Delta-5 desaturasa ("MaD5") de Mortierella alpina
119 (1.338 pb) -
Plásmido pKR277
120 (2.577 pb) -
Plásmido pKR952
121 (5.364 pb) -
Plásmido pKR457
122 (5.252 pb) -
Casete Kti/Notl/Kti3'Salb3' modificada
123 (2.635 pb) -
Delta-8 desaturasa ("PavD8")de Pavlova lutheri
124 (1.269 pb) -
Cebador PvDES5'Not-1
125 -
Cebador PvDES3'Not-1
126 -
Plásmido pKR970
127 (9.276 pb) -
Plásmido pKR973
128 (11.366 pb) -
Plásmido pKR271
129 (6.021 pb) -
Plásmido pKR226
130 (6.524 pb) -
Plásmido pKR886r
131 (9.892 pb) -
Plásmido pKR1064
132 (14.066 pb) -
Plásmido pZBL119
133 (8.503 pb) -
Cebador oSGly-2
134 -
Cebador oSGly-3
135 -
Plásmido pPSgly32
136 (3.673 pb) -
Plásmido pKR142
137 (4.509 pb) -
Plásmido pKR264
138 (4.171 pb) -
Plásmido pKR1128
139 (6.564 pb) -
Plásmido pKS129
140 (5.671 pb) -
Plásmido pKR606
141 (6.601 pb) -
Plásmido pKR804
142 (6.494 pb) -
Plásmido pKR1130
143 (10.349 pb) -
Plásmido pKR1131
144 (4.771 pb) -
Plásmido pKR1133
145 (12.430 pb) -
Plásmido pKS123
146 (7.048 pb) -
Cebador oKti5
147 -
Cebador oKti6
148 -
Plásmido pKR124
149 (4.990 pb) -
Plásmido pKR193
150 (4.474 pb) -
Plásmido pKR1103
151 (5.397 pb) -
Plásmido pKR1104
152 (9.226 pb) -
Plásmido pKR300
153 (8.649 pb) -
15
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Desaturasa* delta-4 (retirada del sitio AscI interno) de Schizochytrium aggregatum
154 (1.607 pb) -
Plásmido pKR1102
155 (6.851 pb) -
Plásmido pKR1105
156 (13.424 pb) -
Cebador oEUGsyn6-4
157 -
Plásmido pKR1107
158 (4.498 pb) -
Plásmido pKR1112
159 (4.461 pb) -
Plásmido pKR1115
160 (5.989 pb) -
Plásmido pKR1134
161 (10.807 pb) -
Delta-8 desaturasa CCMP1491 ("TpomD8") de Tetruetreptia pomquetensis
162 (1.260 pb) 514 (420 AA)
Cebador TpomNot-5
163 -
Cebador TpomNot-3
164
Plásmido pLF 114-10
165 (4.300 pb) -
Plásmido pKR1002
166 (5.754 pb) -
Plásmido pKR1095
167 (11.725 pb) -
Plásmido pKR1127
168 (5.445 pb) -
Plásmido pKR1129
169 (9.230 pb) -
Plásmido pKR1132
170 (11.311 pb) -
Enlazador de sintasa 1 de DHA de Euglena gracilis
171 (54 pb) -
Cebador MWG507
172 -
Cebador MWG509
173 -
Cebador MWG510
174 -
Cebador MWG511
175 -
EgD9elo-EgDHAsyn1Link
176 (839 pb) -
Plásmido KS366
177 (5.213 pb) -
KS366-EgD9elo-EgDHAsyn1Link
178 (5.559 pb) -
Plásmido KS373
179 (6.842 pb) -
Motivo conservado en el C-término para dominios de elongasa C20
- 180 (11 AA)
Cebador SMART IV
181 -
Cebador Adaptador del kit 3’-RACE de Invitrogen
182 -
Elongasa de C20 sintética derivada de Euglena gracilis, codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica ("EgC20ES")
183 (912 pb) 184 (303 AA)
Plásmido pEgC20ES
185 (3.632 pb) -
motivo NG situado en el C-término de cada uno de los dominios de EgDHAsyn1, EgDHAsyn2 y EgC20elo1 de elongasa C20
- 186
motivo PENGA situado en el C-término de cada uno de los dominios de EgDHAsyn1, EgDHAsyn2 y FgC20elo1 de elongasa C20
- 187
Elongasa de C20 sintética derivada de Euglena anabaena, codón optimizado ("EaC20ES") para expresión en Yarrowia lipolytica
188 (900 pb) 189 (299 AA)
16
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Plásmido pEaC20ES
190 (3.620 pb) -
motivo PCENGTV situado en el C-término de cada uno de los dominios EgDHAsyn1, FgDHAsyn2 y EgC20elo1 de elongasa C20
191
Desaturasa delta-4 sintética derivada de Euglena anabaena, codón optimizado ("EaD4S") para expresión en Yarrowia lipolytica
192 (1.752 pb) 193 (583 AA)
Dominio EaDHAsyn2 (es decir, correspondiente a aminoácidos 259841 de la ID DE SEC Nº: 96)del gen delta-4 desaturasa
194 (1.749 pb) 195 (583 AA)
Plásmido pEaD4S
196 (4.472 pb) -
Enlazador rico en prolina EgDHAsyn1 de Euglena gracilis
197 (54 pb) 198 (18 AA)
Enlazador rico en prolina EgDHAsyn2 de Euglena gracilis
199 (54 pb) 200 (18 AA)
Dominio EgDHAsyn1 de elongasa C20 de Euglena gracilis
201 (909 pb) 202 (303 AA)
Dominio EgDHAsyn2 de elongasa C20 de Euglena gracilis
203 (909 pb) 204 (303 AA)
EgDHAsyn1* (sitio Ncol interno eliminado) de Euglena gracilis
205 (2.379 pb) -
Dominio ("EgDHAsyn1C20EloDom1") de elongasa C20 de Euglena gracilis
206 (909 pb) -
Gen ("EgDHAsyn1C20EloDom2Linker") de fusión enlazador rico en prolina del dominio elongasa C20 EgDHAsyn1* de Euglena gracilis
207 (975 pb) 208 (325 AA)
Desaturasa delta-4 ("IgD4") de Isochrysis galbana
209 (1.299 pb) -
Desaturasa delta-4 ("IgD4*") (sitio SbfI interno introducido) de Isochrysis galbana
210 (1.299 pb) 211 (433 AA)
Fusión en marco entre EgDHAsyn1C20EloDom3Linker y IgD4*, separado por la región del enlazador rica en prolina ("EgDHAsyn1 C20EloDom3-IgD4*")
212 (2.259 pb) 213 (753 AA)
EgDHAsyn1D4Dom1 de Euglena gracilis
214 (1.416 pb) 215 (472 AA)
EgDHAsyn1D4Dom1* de Euglena gracilis
216 (1.419 pb) 217 (473 AA)
EgDHAsyn1C20EloDom3-EgD4Dom1 de Euglena gracilis
218 (2.379 pb) 219 (793 AA)
EgDHAsyn1D4Dom2 de Euglena gracilis
220 (1.623 pb) 221 (541 AA)
Desaturasa delta-4 ("SaD4") de Schizochytrium aggregatum
222 (1.530 pb) -
Desaturasa delta-4 ("SaD4*") (sitio sbfI interno introducido) de Schizochytrium aggregatum
223 (1.530 pb) 224 (510 AA)
Fusión en marco entre EgDHAsyn1C20EloDom3 y SaD4*, separados por la región del enlazador rico en prolina ("EgDHAsyn1C20EloDom3-SaD4*")
225 (2.490 pb) 226 (830 AA)
Dominio EaDHAsyn1 de elongasa C20 de Euglena anabaena
227 (897 pb) 231 (299 AA)
Dominio EaDHAsyn2 de elongasa C20 de Euglena anabaena
228 (897 pb) 232 (299 AA)
Dominio EaDHAsyn3 de elongasa C20 de Euglena anabaena
229 (897 pb) 233 (299 AA)
Dominio EaDHAsyn4 de elongasa C20 de Euglena anabaena
230 (897 pb) -
Enlazador EaDHAsyn1 rico en prolina de Euglena anabaena
234 (99 pb) 235 (33 AA)
Dominio 1 EaDHAsyn1 de delta-4 desaturasa de Euglena anabaena
236 (1.527 pb) 239 (509 AA)
Dominio 1 EaDHAsyn2 de la delta-4 desaturasa de Euglena anabaena
237 (1.527 pb) 240 (509 AA)
Dominio 1 EaDHAsyn4 de la delta-4 desaturasa de Euglena anabaena
238 (1.446 pb) 241 (482 AA)
17
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Dominio 2 EaDHAsyn1 de la delta-4 desaturasa (que comprende enlazador rico en prolina y una porción de extremo 3’ del dominio elongasa C20) de Euglena anabaena
242 (1.749 pb) 246 (583 AA)
Dominio 2 EaDHAsyn2 de la delta-4 desaturasa (que comprende enlazador rico en prolina y una porción de extremo 3’ del dominio elongasa C20) de Euglena anabaena
243 (1.749 pb) 247 (583 AA)
Dominio 2 EaDHAsyn3 de la delta-4 desaturasa (que comprende enlazador rico en prolina y una porción de extremo 3’ del dominio elongasa C20) de Euglena anabaena
244 (1.749 pb) 248 (583 AA)
Euglena anabaena dominio 2 EaDHAsyn4 de la delta-4 desaturasa (que comprende enlazador rico en prolina y una porción de extremo 3’ del dominio elongasa C20)
245 (1.668 pb) 249 (556 AA)
Plásmido pLF121-1
250 (3.668 pb) -
Plásmido pLF121-2
251 (3.684 pb) -
Elongasa 1 delta-9 ("EaD9Elo1"); también denominada en el presente documento como "EaD9E" y "EaD9e" de Euglena anabaena
252 (774 pb) 254 (258 AA)
Elongasa 2 delta-9 ("EaD9Elo2") de Euglena anabaena
253 (774 pb) 255 (258 AA)
Plásmido pLF119
256 (4.276 pb) -
Desaturasa 1 delta-5 ("EaD5Des1" o "EaD5") de Euglena anabaena
257 (1.362 pb) 258 (454 AA)
Cebador EaD9-5Bbs
259 25
Cebador EaD9-3Fusión
260 -
Cebador EgDHAsyn1Link-5fusion
261 -
EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link
262 (852 pb) -
Plásmido pLF124
263 (5.559 pb) -
Plásmido pKR1177
264 (5.559 pb) -
Plásmido pKR1179
265 (7.916 pb) -
Plásmido pKR1183
266. (9.190 pb) -
Delta-5 desaturasa ("EgD5") de Euglena gracilis
267 (1.350 pb) -
Plásmido pKR1237
268 (6.615 pb) -
Plásmido pKR1252
269 (6.464 pb) -
Plásmido pKR1253
270 (10.387 pb) -
Cebador oEAd5-1-1
271 -
Cebador oEAd5-1-2
272 -
Plásmido pKR1136
273 (4.899 pb) -
Plásmido pKR1139
274 (5.592 pb) -
Plásmido pKR1255
275 (13.293 pb) -
Plásmido pKR561
276 (7.497 pb) -
Desaturasa delta-15 de soja (fad3) (Nº L22964 de acceso al Banco de Genes; también denominada GmFAD3B)
277 (1.143 pb) -
Cebador HPfad3-1
278 -
Cebador HPfad3-2
279 -
18
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Amplicón HPfad3AB
280 (709 pb) -
Cebador HPfad3-3
281 -
Amplicón HPfad3A'-2
282 (709 pb) -
Amplicón HPfad3ABA'-2
283 (1.014 pb) -
Plásmido pLF129
284 (4.526 pb) -
Plásmido pKR1189
285 (8.503 pb) -
Plásmido pKR1209
286 (4.112 pb) -
GmFad3C (Nº AY204712 de acceso al Banco de Genes)
287 (1.143 pb) 288 (380 AA)
Cebador fad3c-5
289 -
Cebador fad3c-3
290 -
Plásmido pKR1213
291 (3.764 pb) -
Plásmido pKR1218
292 (4.353 pb) -
Plásmido pKR1210
293 (3.742 pb) -
Plásmido pKR1219
294 (3.983 pb) -
Plásmido pKR1225
295 (4.894 pb) -
Plásmido pKR1229
296 (8.979 pb) -
Plásmido pKR1249
297 (10.221 pb) -
Cebador oEAd9el1-1
298 -
Cebador oLINK-1
299 -
Plásmido pKR1298
300 (4.362 pb) -
Cebador oTPd8-1
301 -
Cebador oTPd8fus-1
302 -
Cebador oLINK-2
303 -
Cebador oLINK-1
304 304
TpomD8-EgDHAsyn1 Link
305 (1.335 pb) -
Plásmido pKR1291
306 (4.848 pb) -
Plásmido pKR1301
307 (4.284 pb) -
Plásmido pKR1301R
308 (4.284 pb) -
Plásmido pKR1311
309 (4.228 pb) -
Plásmido pKR1304
310 (3.201 pb) -
Plásmido pKR1309
311 (4.041 pb) -
Plásmido pKR1313
312 (5.604 pb) -
Plásmido pKR1315
313 (6.474 pb) -
Plásmido pKR1322
314 (10.627 pb) -
Plásmido pZKLeuN-29E3
315 (14.688 pb) -
Desaturasa delta-4 ("FmD12") de Fusarium moniliforme
316 (1.434 pb) 317 (477 AA)
Delta-9 elongasa sintética derivada de Euglena gracilis, codón ("EgD9eS") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
318 (777 pb) 319 (258 AA)
19
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Sitio de recombinación LoxP de Escherichia coli, reconocido por una enzima Cre recombinasa
320 (34 pb) -
Elongasa C16/18 sintética ELO3 derivada de Mortierella alpina, codón ("ME3S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
321 (828 pb) 322 (275 AA)
Plásmido pY116
323 (8.739 pb) -
Plásmido pKO2UF8289
324 (15.337 pb) -
Desaturasa delta-4 ("YID12") de Yarrowia lipolytica
325 (1.936 pb) 326 (419 AA)
Delta-8 desaturasa sintética mutante ("EgD8M"; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868, derivada de ("EgD8S"; publicación del PCT Nº WO 2006/012326) de Euglena gracilis
327 (1.272 pb) 328 (422 AA)
Delta-9 elongasa ("FgD9e") de Euglena gracilis
329 (777 pb) 330 (258 AA)
Plásmido pZKSL-555R
331 (13.707 pb) -
Delta-5 desaturasa sintética derivada de Euglena gracilis (publicación de patente de EE.UU. Nº US 2007/0292924), codón ("EgD5S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
332(1.350 pb) 333 (449 AA)
Delta-5 desaturasa sintética derivada de Peridinium sp. CCMP626 (publicación de patente de EE.UU. Nº US 2007/0271632), codón ("RD5S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
334 (1.392 pb) 335 (463 AA)
Delta-5 desaturasa (solicitud de patente de EE.UU. Nº 111748629) ("EgD5") de Euglena gracilis
336 (1.350 pb) 337 (449 AA)
Plásmido pZP3-Pa777U
338 (13.066 pb) -
Desaturasa delta-17 sintética derivada de Pythium aphanidermatum, codón ("PaD17S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica (publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0125326)
339 (1.080 pb) 340 (359 AA)
Desaturasa delta-17 (solicitud de patente de EE.UU. Nº 2008/0125326) ("PaD17") de Pythium aphanidermatum
341 (1.080 pb) 342 (359 AA)
Plásmido pY117
343 (9.570 pb) -
Gen mutante de sintasa de acetohidroxiácido (AHAS) de Yarrowia lipolytica que comprende una mutación W497L
344 (2.987 pb) -
Plásmido pZP2-2988
345 (15.743 pb) -
Desaturasa delta-4 sintética derivada de Fusarium moniliforme, codón ("FmD12S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
346 (1.434 pb) 347 (477 AA)
Plásmido pZKL2-5U89GC
348 (15.812 pb) -
Gen ("YICPT1") de diacilglicerol colinafosfotransferasa de Yarrowia lipolytica
349 (1.185 pb) 350 (394 AA)
Plásmido pZKUE3S
351 (6.303 pb) -
Plásmido pZKL1-2SP98C
352 (15.877 pb) -
Plásmido pZKUM
353 (4.313 pb) -
Gene Ura3 mutante sintético que comprende una eliminación de 33 pb desde +21 a +53, una eliminación de 1 pb a +376 y una eliminación de 3 pb desde +400 a +403 de la región codificante Ura3 (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes) de Yarrowia
354 (1.459 pb) -
Plásmido pZKD2-5U89A2
355 (15.966 pb) -
Diacilglicerol aciltransferasa (DGAT2) (publicación del PCT Nº WO 2005/003322; patente de EE.UU. Nº 7.267.976) de Yarrowia lipolytica
356 (2.119 pb) 357 (514 AA)
20
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Delta-9 elongasa sintética derivada de Eutreptiella sp. CCMP389 codón ("E389D9eS") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
358 (792 pb) 359 (263 AA)
Plásmido pZuFmEgC20ES
360 (7.904 pb) -
Plásmido pZuFmEaC20ES
361 (7.892 pb) -
Plásmido pZKL4-220EA4
362 (13.412 pb) -
Lipasa 4 como locus (Nº XM_503825 de acceso al Banco de Genes) de Yarrowia lipolytica
363 (1.221 pb) -
Plásmido pZuFmEaD4S
364 (8.744 pb) -
Plásmido pZuFmIgD9ES
365 (7.783 pb) -
Cebador YL921
366 -
Cebador YL922
367 -
Cebador YL923
368 -
Cebador YL924
369 -
Cebador YL925
370 -
Cebador YL926
371 -
Plásmido pZuFmEaD4S-M1
372 (8.746 pb) -
Plásmido pZuFmEaD4S-M2
373 (8.747 pb) -
Plásmido pZuFmEaD4S-M3
374 (8.744 pb) -
Plásmido pZuFmEaD4S-1
375 (8.636 pb) -
Plásmido pZuFmEaD4S-2
376 (8.576 pb) -
Plásmido pZuFmEaD4S-3
377 (8.531 pb) -
Plásmido pZKL4-220EA4-1
378 (13.304 pb) -
Plásmido pZKL4-220EA4-2
379 (13.244 pb) -
Plásmido pZKL4-220EA4-3
380 (13.199 pb) -
Desaturasa delta-4 sintética truncada derivada de Euglena anabaena, codón ("EaD4S-1") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
381 (1.644 pb) 382 (547 AA)
Desaturasa delta-4 sintética truncada derivada de Euglena anabaena codón ("EaD4S-2") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
383 (1.584 pb) 384 (527 AA)
Desaturasa delta-4 sintética truncada derivada de Euglena anabaena, codón ("EaD4S-3") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
385 (1.539 pb) 386 (512 AA)
Desaturasa delta-4 sintética derivada de Euglena gracilis, codón ("EgD4S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
387 (1.623 pb) 388 (540 AA)
Plásmido pEgD4S
389 (4.343 pb) -
Plásmido pZKL4-220Eg4
390 (13.283 pb) -
Cebador YL935
391 -
Cebador YL936
392 -
Cebador YL937
393 -
Cebador YL938
394 -
Cebador YL939
395 -
Cebador YL940
396 -
21
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Plásmido pEgD4S-M1
397 (4.344 pb) -
Plásmido pEgD4S-M2
398 (4.346 pb) -
Plásmido pEgD4S-M3
399 (4.346 pb) -
Plásmido pZKL4-220Eg4-1
400 (13.202 pb) -
Plásmido pZKL4-220Fq4-2
401 (13.133 pb) -
Plásmido pZKL4-220Eg4-3
402 (13.085 pb) -
Desaturasa delta-4 sintética truncada derivada de Euglena gracilis, codón ("EgD4S-1") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
403 (1.542 pb) 404 (513 AA)
Desaturasa delta-4 sintética truncada derivada de Euglena gracilis, codón ("EgD4S-2") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
405 (1.473 pb) 406 (490 AA)
Desaturasa delta-4 sintética truncada derivada de Euglena gracilis, codón ("EgD4S-3") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
407 (1.425 pb) 408 (474 AA)
Plásmido pZKLY-G204
409 (10.417 pb) -
Sintasa de DHA sintética derivada de Euglena gracilis, codón ("EgDHAsyn1S") optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
410 (2.382 pb) 411 (793 AA)
Plásmido pEgC20ES-K
412 (3.632 pb) -
Cebador YL973
413 -
Cebador YL974
414 -
Plásmido pYNTGUS1-CNP
415 (6.652 pb) -
Plásmido pZKLY
416 (9.045 pb) -
Locus (Nº AJ549519 de acceso al Banco de Genes) de lipasa 7 Yarrowia lipolytica
417 (2.173 pb) 418 (366 AA)
Delta-9 elongasa CCMP389 ("E389D9e") de Eutreptiella sp.
419 (792 pb) 420 (263 AA)
Delta-9 elongasa sintética derivada de Euglena anabaena ("EaD9eS") codón UTEX 373 optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
421 (774 pb) 422 (258 AA)
Delta-8 desaturasa ("Eg5" o "EgD8") Euglena gracilis
423 (1.271 pb) 424 (421 AA)
Delta-8 desaturasa sintética derivada de Euglena gracilis, codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica ("D8SF" o "EgD8S")
425 (1.272 pb) 426 (422 AA)
Delta-8 desaturasa ("EaD8Des3") Euglena anabaena UTEX 373; también denominada en el presente documento como "EaD8"
427 (1.260 pb) 428 (420 AA)
Delta-8 desaturasa sintética derivada de Euglena anabaena UTEX 373, codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica ("EaD8S")
429 (1.260 pb) 430 (420 AA)
Plásmido pZuFmEgD9ES
431 (7.769 pb) -
Plásmido pZuFmEgD9ES-Na
432 (7.778 pb) -
Cebador YL989
433 -
Cebador YL990
434 -
Cebador YL991
435 -
Cebador YL992
436 -
Plásmido pKO2UFm8A
437 (8.428 pb) -
Enlazador modificado GPARPAGLPPATYYDSLAV de Yarrowia
- 438 (19 AA)
Plásmido pZUFmG9G8fu
439 (9.098 pb) -
22
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
una fusión génica EgD9ES/FgD8M
440 (2.106 pb) 441 (701 AA)
Plásmido pZUFmG9G8fu-B
442 (9.104 pb) -
Cebador YL1043
443 -
Cebador YL1044
444 -
Enlazador GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS modificado de Yarrowia
- 445 (24 AA)
una fusión génica EgD9ES/EgD8M
446 (2.112 pb) 447 (703 AA)
Plásmido pEaD8S
448 (3.988 pb) -
Cebador YL1059
449 -
Cebador YL1060
450 -
Plásmido pEaD8S-B
451 (3.990 pb) -
Plásmido pZUFmG9A8
452 (9.101 pb) -
Fusión genes EgD9ES/EaD8S
453 (2.109 pb) 454 (702 AA)
Plásmido pZUFmEaD9ES
455 (7.769 pb) -
Plásmido pZUFmEaD9ES-Na
456 (7.775 pb) -
Cebador YL1049
457 -
Cebador YL1050
458 -
Plásmido pZUFmA9G8
459 (9.104 pb) -
una fusión génica EaD9ES/EgD8M
460 (2.112 pb) 461 (703 AA)
Plásmido pZUFmA9A8
462 (9.101 pb) -
una fusión génica EaD9ES/EaD8S
463 (2.109 pb) 464 (702 AA)
Plásmido pE389S
465 (3.523 pb) -
Plásmido pE389S-Na
466 (3.529 pb) -
Cebador YL1051
467 -
Cebador YL1052
468 -
Plásmido pZUFmR9G8
469 (9.119 pb) -
una fusión génica E389D9eS/EgD8M
470 (2.127 pb) 471 (708 AA)
Enlazador rico en prolina EgDHAsyn1 mas 4 aminoácidos
472 (22 AA)
Plásmido pKR1007
473 (6.267 pb)
Plásmido pKR1014
474 (11.459 pb)
Cebador EaD8-5
475 (34 pb)
Cebador EaD8-3
476 (30 pb)
Plásmido pLF120-3
477 (4.794 pb)
Plásmido pKR1138
478 (6.526 pb)
Plásmido pKR1152
479 (11.707 pb)
Cebador oEAd9el1-2
480 (26 pb)
Plásmido pKR1137
481 (4310 pb)
23
Resumen de los Números de ID de SEC de Ácidos nucleicos y Proteínas
Descripción y Abreviaturas
ID de SEC de ácido nucleico Nº ID de SEC de proteína Nº
Plásmido pKR1140
482 (7.872 pb)
Plásmido pKR1145
483 (6.526 pb)
Plásmido pKR1151
484 (11.706 pb)
Plásmido pKR1150
485 (11.706 pb)
Plásmido pKR1190
486 (5.559 pb)
Plásmido pKR1195
487 (6.833 pb)
Plásmido pKR1199
488 (9.190 pb)
Plásmido pKR1196
489 (6.833 pb)
Plásmido pKR1200
490 (9.190 pb)
Plásmido pKR1184
491 (9.190 pb)
Fusión EgD9e/TpomD8
492 (2.103 pb) 515 (700 AA)
Fusión EgD9e/EaD8
493 (2.103 pb) 516 (700 AA)
Fusión EaD9e/TpomD8
494 (2.103 pb) 517 (700 AA)
Fusión EaD9e/EaD8
495 (2.103 pb) 518 (70.0 AA)
Fusión EgD9e/PavD8
496 (2.192 pb) 519 (703 AA)
Plásmido pKR1303
497 (3.967 pb)
Plásmido pKR1308
498 (4.754 pb)
Plásmido pKR393
499 (5.250 pb)
Plásmido pKR407
500 (4.140 pb)
Plásmido pKR1018
501 (5.414 pb)
Plásmido pKR1312
502 (5.731 pb)
Plásmido pKR1321
503 (9.198 pb)
Enlazador rico en prolina EaDHAsyn1 mas 3 aminoácidos
504 (36 AA)
Cebador EaLink1
505 (35 pb)
Cebador EaLink2
506 (35 pb)
Cebador EaLink3
507 (19 pb)
EaD9e-EaDHAsyn1Link
508 (894 pb)
Plásmido pKR1305
509 (4.405 pb)
Plásmido pKR1317
510 (3.201 pb)
Plásmido pKR1320
511 (5.816 pb)
Plásmido pKR1326
512 (9.241 pb)
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a multienzimas, tales como sintasa de DHA. Estas son útiles para, entre otras cosas, la manipulación de las vías bioquímicas para la producción de los PUFA saludables y más específicamente para la producción de ácido docosahexaenoico (DHA). Así, la invención sujeto presenta muchas aplicaciones. Los PUFA, o derivados de los mismos, elaborados por la metodología descrita en el presente documento pueden ser utilizados como sustitutos dietéticos o suplementos, particularmente, los preparados infantiles, para pacientes sometidos a una alimentación intravenosa o para prevenir o tratar la malnutrición.
Alternativamente, los PUFA (o sus derivados) purificados se pueden incorporar en los aceites, grasas o margarinas para cocinar formuladas de modo que, en el uso normal, el receptor recibiría la cantidad deseada para como
24
imagen8
El término "enlazador" se refiere a la unión o enlace entre dos o mas polipéptidos que tienen cada uno actividades enzimáticas independientes y separables.
El enlace utilizado para formar una multienzima esta mínimamente comprendido por un único enlace polipéptido. Un enlace puede estar comprendido por un resto aminoácido, tal como prolina, o un polipéptido. Si el enlace es un 5 polipéptido, puede ser deseable que el enlace tenga al menos un resto de aminoácido prolina.
Un ejemplo de un enlazador se muestra en la ID de SEC Nº: 198 (enlazador EgDHAsyn1 rico en prolina).
El término "ácidos grasos" se refiere a ácidos alifáticos de cadena larga (ácidos alcanoicos) de longitudes de cadena variables, desde aproximadamente de C12 a C22 (aunque se conocen ácidos de longitudes de cadena más largas y más cortas). Las longitudes de cadena predominantes están entre C16 y C22. Los detalles adicionales concernientes
10 a la diferenciación entre "ácidos grasos saturados" frente a "ácidos grasos insaturados", "ácidos grasos monoinsaturados" frente a "ácidos grasos poliinsaturados" (o "PUFA") y “ácidos grasos omega-6” (ω-6 o n-6) frente a "ácidos grasos omega-3" (omega-3 o n-3) se proporcionan en la patente de EE.UU. 7.238.482.
Los ácidos grasos se describen en el presente documento mediante un sistema de notación sencillo de "X:Y", en donde X es el número total de átomos de carbono (C) en el ácido graso particularmente e Y es el número de dobles 15 enlaces. El número que sigue a la designación del ácido graso indica la posición del doble enlace del extremo carboxilo del ácido graso con el afijo "c" para la configuración cis del doble enlace (por ejemplo, ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1, 9c), ácido petroselínico (18:1, 6c), LA (18:2, 9c, 12c), GLA (18:3, 6c, 9c, 12c) y ALA (18:3, 9c, 12c, 15c)). A menos que se indique lo contrario, 18:1, 18:2 y 18:3 se refieren a los ácidos grasos oleico, LA y ALA, respectivamente. Si no se escribe específicamente de otro modo, se supone que los
20 dobles enlaces están en configuración cis. Por ejemplo, los dobles enlaces en 18:2 (9,12) se supone que estarían en configuración cis.
La nomenclatura utilizada para describir los PUFA en la presente divulgación se muestran más adelante en la Tabla
3. En la columna titulada "Notación Abreviada", el sistema omega-referencia se utiliza para indicar el número de carbonos, el número de dobles enlaces y la posición del doble enlace más cercano al carbono omega, contando
25 desde el carbono omega (que es el número 1 para este fin). El resto de la tabla resume los nombres comunes de ácidos grasos omega-3 y omega-6 y sus precursores, las abreviaturas que se utilizarán a lo largo del resto de la memoria descriptiva y el nombre químico de cada uno de los compuestos.
Tabla 3
Nomenclatura de ácidos grasos poliinsaturados y precursores
Nombre común
Abreviatura Nombre químico Notación Abreviada
mirístico
- tetradecanoico 14:0
palmítico
PA o Palmitato hexadecanoico 16:0
palmitoleico
- 9-hexadecenoico 16:1
esteárico
- octadecanoico 18:0
oleico
- cis-9-octadecenoico 18:1
linoleico
LA cis-9,12-octadecadienoico 18:2 ω-6
gamma-linolénico
GLA cis-6,9,12octadecatrienoico 18:3 ω-6
eicosadienoico
EDA cis-11,14-eicosadienoico 20:2 ω-6
dihomo-gamma-linolénico
DGLA o HGLA (usados indistintamente en el presente documento) cis-8,11,14-eicosatrienoico 20:3 ω-6
esciadónico
SCI cis-5,11,14-eicosatrienoico 20:3b ω-6
araquidónico
ARA cis-5,8,11,14eicosatetraenoico 20:4 ω-6
alfa-linolénico
ALA cis-9,12,15octadecatrienoico 18:3 ω-3
estearidónico
STA cis-6,9,12,15octadecatetraenoico 18:4 ω-3
26 5
10
15
20
25
30
Nomenclatura de ácidos grasos poliinsaturados y precursores
Nombre común
Abreviatura Nombre químico Notación Abreviada
eicosatrienoico
ETrA o ERA cis-11,14,17eicosatrienoico 20:3 ω-3
eicosatetraenoico
ETA cis-8,11,14,17eicosatetraenoico 20:4 ω-3
juniperónico
JUP cis-5,11,14,17eicosatrienoico 20:4b ω-3
eicosapentaenoico
EPA cis-5,8,11,14,17eicosapentaenoico 20:5 ω-3
docosatrienoico
DRA cis-10,13,16docosatrienoico 22:3 ω-3
docosatetraenoico
DTA cis-7,10,13,16docosatetraenoico 22:4 ω-3
docosapentaenoico
DPAn-6 cis-4,7,10,13,16docosapentaenoico 22:5 ω-6
docosapentaenoico
DPA cis-7,10,13,16,19docosapentaenoico 22:5 ω-3
docosahexaenoico
DHA cis-4,7,10,13,16,19docosahexaenoico 22:6 ω-3
Un vía metabólica, o biosintética, en un sentido bioquímico, pueden considerarse como una serie de reacciones químicas que ocurren dentro de una célula, catalizadas por enzimas, para lograr bien la formación de la un producto metabólico que se utilizará o almacenado por la célula, o el inicio de otra vía metabólica (entonces llamada una paso de generación de flujo). Muchas de estas vías son elaboradas, y suponen una modificación paso a paso de la sustancia inicial para darle forma en un producto que tenga la estructura química exacta deseada.
La expresión "vía biosintética PUFA" se refiere a la un proceso metabólico que transforma el ácido oleico en LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, DTA, DPAn-6, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA Y DHA. Este proceso está bien descrito en la bibliografía (por ejemplo, véase la publicación del PCT Nº WO 2006/052870). De forma simplista, este proceso implica la elongación de la cadena de carbono por la adición de átomos de carbono y desaturación de la molécula por la adición de dobles enlaces, a través de una serie de enzimas especiales de desaturación y elongación (es decir, "enzimas de la vía biosintética de PUFA") presentes en el membrana del retículo endoplasmático. Más específicamente, "enzima de la vía biosintética de los PUFA" se refiere a cualquiera de las siguientes enzimas (y los genes que codifican dichas enzimas) asociadas con la biosíntesis de un PUFA, que incluyen: una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una desaturasa delta-15, una desaturasa delta-17, una desaturasa delta-9, una delta-8 desaturasa, una delta-9 elongasa, una elongasa C14/16, una elongasa C16/18, una elongasa C18/20, una elongasa C20/22, una sintasa de DHA y/o una multienzima de la presente invención.
La expresión "vía biosintética de ácidos grasos omega-3/omega-6" se refiere a un conjunto de genes que, cuando se expresa en las condiciones apropiadas codifican enzimas que catalizan la producción de uno o ambos ácidos grasos omega-3 y omega-6. Típicamente, los genes implicados en la vía biosintética de los ácidos grasos omega-3/omega6 codifican enzimas de la vía biosintética de los PUFA. Una vía representativa se ilustra en la FIG. 1, que proporciona la transformación de ácido mirístico a través de varios intermedios de DHA, que demuestra cómo ambos ácidos grasos omega-3 y omega-6 pueden ser producidos a partir de una fuente común. La vía se divide de forma natural en dos porciones donde una porción generará ácidos grasos omega-3 y la otra porción, los ácidos grasos omega-6.
El término "funcional" como se utiliza en el presente documento en el contexto de la vía biosintética de los ácidos grasos omega-3/omega-6 significa que algunos (o la totalidad) de los genes en la vía expresan enzimas activas, lo que da como resultado la catálisis in vivo o la transformación del sustrato. Debe entenderse que "vía biosintética de ácido graso omega-3/omega-6" o " vía biosintética funcional de ácido graso omega-3/omega-6" no implica que se requieran todos los genes de enzimas de la vía biosintética de los PUFA, ya que cierto número de productos de ácido graso requerirán solo la expresión de un subconjunto de los genes de esta vía.
La expresión "vía de la delta-6 desaturasa/delta-6 elongasa" se refiere a una vía biosintética de PUFA que incluye como mínimo al menos una delta-6 desaturasa y al menos una elongasa C18/20, permitiendo de ese modo la biosíntesis de DGLA y/o ETA a partir de LA y ALA, respectivamente, con GLA y/o STA como ácidos grasos
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Identificación de secuencias de nuevas elongasas de C20 Las secuencias de nucleótidos que codifican elongasas de C20 se han aislado de Euglena gracilis y Euglena anabaena, tal como se resume a continuación en la Tabla 5. Tabla 5
Sumario de Elongasas C20 Euglena
Designación de Elongasa C20
Organismo ID de SEC de Nucleótido Nº ID de SEC de Aminoácido Nº
Dominio de elongasa C20 EgDHAsyn1
E. gracilis 201 202
Dominio de elongasa C20 EgDHAsyn1*
E. gracilis 206 -
Dominio de elongasa C20 EgDHAsyn2
E. gracilis 203 204
Dominio de elongasa C20 EaDHAsyn1
E. anabaena 227 231
Dominio de elongasa C20 EaDHAsyn2
E. anabaena 228 232
Dominio de elongasa C20 EaDHAsyn3
E. anabaena 229 233
Dominio de elongasa C20 EaDHAsyn4
E. anabaena 230 -
Dominio de elongasa C20 EgC20 ES (codón optimizado para expresión en Yarrowia)
Sintéticamente derivado de E. gracilis EgDHAsyn1 183 184 (idéntico a ID de SEC Nº:202)
Dominio de elongasa C20 EaC20 ES (codón optimizado para expresión en Yarrowia)
Sintéticamente derivado de E. anabaena EaDHAsyn2 188 189 (idéntico a ID de SEC Nº:232)
5 Se divulga un polinucleótido aislado que codifica una elongasa C20 que comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una actividad de elongasa C20, en la que el polipéptido tiene una identidad de aminoácidos de al menos 80%, basada en el procedimiento Clustal V de alineamiento, cuando se compara con una secuencia de aminoácidos como se expone en la ID de SEC Nº: 12, la ID de SEC Nº: 22, la ID de SEC Nº: 95, la ID de SEC Nº: 96, la ID de SEC Nº: 97; la ID de SEC Nº: 202, la ID de SEC
10 Nº: 204, la ID de SEC Nº: 231, la ID de SEC Nº: 232, o la ID de SEC Nº: 233;
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una actividad de elongasa C20 en la que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, basada en el procedimiento BLASTN de alineamiento, en comparación con una secuencia de nucleótidos como se expone en la ID de SEC Nº: 11, la ID de SEC Nº: 21, la ID de SEC Nº: 91, la ID de SEC Nº: 92, la ID de SEC Nº: 93, la ID de SEC Nº: 183, la ID de SEC
15 Nº: 188, la ID de SEC Nº: 201, la ID de SEC Nº: 206, la ID de SEC Nº: 203, la ID de SEC Nº: 227, la ID de SEC Nº: 228, la ID de SEC Nº: 229, o la ID de SEC Nº: 230;
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una actividad de elongasa C20, en la que la secuencia de nucleótidos se hibrida en condiciones astringentes con una secuencia de nucleótidos como se expone en la ID de SEC Nº: 11, la ID de SEC Nº: 21, la ID de SEC Nº: 91, la ID de SEC Nº: 92, la ID de SEC Nº: 93, la ID de
20 SEC Nº: 183, la ID de SEC Nº: 188, la ID de SEC Nº: 201, la ID de SEC Nº: 206, la ID de SEC Nº: 203, la ID de SEC Nº: 227, la ID de SEC Nº: 228, la ID de SEC Nº: 229 y la ID de SEC Nº: 230; o
(d) un complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), (b) o (c), en donde el complemento y la secuencia de nucleótidos consisten en el mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios.
Un polinucleótido aislado que codifica una elongasa C20 puede comprender la secuencia expuesta en cualquiera de 25 las ID de SEC Nº: 183, la ID de SEC Nº: 188, la ID de SEC Nº: 201, la ID de SEC Nº: 206, la ID de SEC Nº: 203, la ID de SEC Nº: 227, la ID de SEC Nº: 228, la ID de SEC Nº: 229, o la ID de SEC Nº: 230.
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Identificación de secuencias de nuevas desaturasa s delta-4 Las secuencias de nucleótidos que codifican desaturasa s delta-4 se han aislado de Euglena gracilis y Euglena anabaena, tal como se resume a continuación en la Tabla 6. Tabla 6
Sumario de Desaturasas Delta-4 Euglena
Designación* de Desaturasa Delta-4
Organismo ID de SEC de Nucleótido Nº ID de SEC de Aminoácido Nº
Dominio 1 de delta-4 desaturasa EgDHAsyn1
E. gracilis 214 215
Dominio 1* de delta-4 desaturasa EgDHAsyn1
Sintéticamente derivado de E. gracilis EgDHAsyn1 216 217
Dominio 2 de delta-4 desaturasa EgDHAsyn1*
E. gracilis 220 221
Dominio 1 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn1
E. anabaena 236 239
Dominio 1 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn2
E. anabaena 237 240
Dominio 1 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn4
E. anabaena 238 241
Dominio 2 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn1
E. anabaena 242 246
Dominio 2 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn2
E. anabaena 243 247
Dominio 2 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn3
E. anabaena 244 248
Dominio 2 de delta-4 desaturasa EaDHAsyn4
E. anabaena 245 249
EaD4S Dominio de delta-4 desaturasa (codón optimizado para expresión en Yarrowia)
Sintéticamente derivado de E. anabaena EaDHAsyn2 192 193
EgD4S Dominio de delta-4 desaturasa (codón optimizado para expresión en Yarrowia)
Sintéticamente derivado de E. gracilis EgDHAsyn1 387 388
*Nota: El dominio 1 de delta-4 desaturasa no incluye el enlazador rico en prolina de la sintasa del DHA de la que se deriva. Por el contrario, el dominio 2 de delta-4 desaturasa incluye el enlazador rico en prolina de la sintasa del DHA de la que se deriva.
5 Las presentes secuencias de dominio delta-4 desaturasa pueden ser de codón optimizado para expresión en un organismo anfitrión particular. Por ejemplo, el dominio delta-4 desaturasa Euglena anabaena EaDHAsyn2 era codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica. Por ejemplo, el dominio delta-4 desaturasa Euglena gracilis de EgDHAsyn1 era también codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica. Un experto en la técnica sería capaz de utilizar las enseñanzas del presente documento para crear otras diversas proteínas delta-4 desaturasa de
10 codón optimizado adecuadas para una óptima expresión en anfitriones alternativos, basados en las secuencias de dominio delta-4 desaturasa de tipo silvestre de EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 y/o EaDHAsyn3 como se describe anteriormente en la Tabla 6. En consecuencia, una proteína de codón optimizado delta-4 desaturasa puede derivarse de una secuencia de tipo silvestre descrita en el presente documento. Puede ser deseable modificar una porción de los codones que codifican las secuencias del dominio delta-4 desaturasa de
15 EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1 , EaDHAsyn2 y/o EaDHAsyn3 para mejorar la expresión del gen en un organismo anfitrión incluyendo, pero sin limitarse a una planta o parte de una planta.
Además, basado en la observación de que la porción C-término del dominio elongasa C20 de las sintasas del DHA parece superponerse con la porción N-término del dominio delta-4 desaturasa, se llevaron a cabo análisis funcionales para definir el dominio funcional óptimo de la delta-4 desaturasa. Como se describe en los Ejemplos 51 y 20 53 en lo sucesivo, se realizaron estudios de mutagénesis por eliminación utilizando las secuencias de proteínas con
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Descripción del plásmido pZKLeuN-29E3 (ID de SEC Nº: 315)
Sitios RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 315
Descripción de los componentes del fragmento y gen quimérico
Bgl II/Swa I (12559-10533)
EXP1::EgD9eS::Lip1, que comprende: • EXP1: promotor de proteína de exportación (EXP1) de Yarrowia lipolytica (etiquetada como "Exp pro" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0115881); • EgD9eS: delta-9 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 318), derivada de Euglena gracilis (etiquetada como "EgD9E" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2007/061742); • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
Pme I/Cla I (12577-1)
FBAINm::EgD9eS::Lip2, que comprende: • FBAINm: promotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD9eS: gen delta-9 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 318), derivado de Euglena gracilis (etiquetado como "EgD9ES" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2007/061742); • Lip2: secuencia de terminación Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
Cla I/EcoR I (1-1736)
LoxP Ura3 LoxP, que comprende:
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320);
• gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes);
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320)
EcoR I/Pac I (1736-3591)
YAT1::ME3S::Pex16, que comprende:
• YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT"
en la Figura; publicación de patente Nº U.S. 2006/0094102-A1);
• ME3S: gen elongasa C16/18 de codón optimizado (ID de SEC Nº:
321), derivado de M. alpina (publicación PCT Nº WO 2007/046817);
• Pex16: secuencia de terminación Pex16 del gen Pex16 de Yarrowia
(Nº U75433 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pZKLeuN-29E3 fue digerido con AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y2224 de Y. lipolytica (es decir, ATCC #20362 Ura3-) según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas sobre placas con Medio MMLeu, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias se recogieron y se sembraron en placas de selección con MM y MMLeu. Las colonias que crecieron en
5 placas MMLeu pero no en placas MM se seleccionaron como cepas Leu-. Las colonias individuales de las cepas Leu-se utilizaron para inocular MMLeu líquido, y los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de la CG mostraron la presencia de EDA en los transformantes que contenían los 4 genes quiméricos
10 de pZKLeuN-29E3, pero no en la cepa de control Yarrowia Y2224. La mayoría de las 36 cepas Leu-seleccionadas produjeron aproximadamente 12 a 16,9% EDA del total de lípidos. Tres cepas, designadas como cepas Y4001, Y4002 y Y4003 producían aproximadamente 174%, 17% y 17,5% de EDA del total de lípidos, respectivamente.
Las colonias individuales de las cepas Y4001, Y4002, y Y4003 se utilizaron para inocular MMLeu líquido, y los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se
15 volvieron a suspender en HGM, y después se agitaron a 250 rpm/min durante 5 días. Las células se recogieron por centrifugación, y los lípidos se extrajeron. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890. Los análisis de la GC mostraron que las cepas Y4001, Y4002 y Y4003 producían aproximadamente 24% EDA del total de lípidos.
Generación de la cepa Y4001U (Leu-, Ura-): La cepa Y4001U se creó por expresión temporal de la enzima
20 recombinasa Cre en el plásmido pY116 (FIG. 45B) dentro de la cepa Y4001 para producir un fenotipo Leu-y Ura-. El constructor pY116 contenía los siguientes componentes.
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Tabla 9
Descripción de Plásmido pY116 (ID de SEC Nº:323)
Sitios RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 323
Descripción de componentes de fragmento y de gen quimérico
1328-448
Plásmido ColE1 origen de replicación
2258-1398
Gen de resistencia a la Ampicilina (AmpR) para selección en E. coli
3157-4461
Secuencia de replicación autónoma de Yarrowia (ARS18; Nº A17608 de acceso al Banco de Genes)
SwaI/PacI 6667-4504
Gen Leu2 de Yarrowia (Nº AF260230 de acceso al Banco de Genes)
Swa I/Pme I (6667-218)
GPAT Cre XPR2, que comprende: • GPAT: promotor GPAT de Yarrowia lipolytica (patente de EE.UU. 7.264.949); • Cre: Gen P1 Cre de Enterobacteria phage para proteína recombinasa (Nº X03453 de acceso al Banco de Genes); • XPR2: ~100 pb de la región 3' del gen Xpr de Yarrowia (Nº M17741 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pY116 se utilizó para la transformación de células Y4001 recién cultivadas según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas que contenían MMLeuUra 280 μg/ml de sulfonilurea (etil clorimurón, E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE), y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 3 5 a 4 días. Se recogieron cuatro colonias y después se utilizaron para inocular 3 ml de YPD líquido. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 1 día a 30ºC. Los cultivos se diluyeron 1:50.000 con los Medios MMLeuUra líquido, y 100 μl se sembraron en nuevas placas de YPD. Las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 días. Las colonias se recogieron y sembraron en placas de selección MMLeu y MMLeuUra. Las colonias que podría n crecer en placas MMLeuUra pero no en placas MMLeu se seleccionaron y se analizaron por CG para confirmar la
10 presencia de C20:2 (EDA). Varias cepas, cada una con un fenotipo Leu-y Ura-, producían aproximadamente 17% EDA de los lípidos totales y colectivamente, se designaron como Y4001U. Una de estas cepas se designó como Y4001.
Generación de cepa Y4036 para producir aproximadamente 18% DGLA del total de lípidos: el constructo pKO2UF8289 (FIG. 46A; ID de SEC Nº: 324) se generó para integrar cuatro genes quiméricos (que comprenden una
15 delta-12 desaturasa, una delta-9 elongasa, y dos delta-8 desaturasas mutantes) en el loci delta-12 de la cepa Y4001U1, para permitir de ese modo la producción de DGLA. El constructo pKO2UF8289 contenía los siguientes componentes:
Tabla 10
Descripción de plásmido pKO2UF8289 (ID de SEC Nº: 324)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 324
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
AscI/BsiWI (10337-9600)
Porción 5’ del gen delta-12 desaturasa de Yarrowia (ID de SEC Nº: 325) (etiquetado como "YLD12-N" en la Figura; patente de EE.UU. 7.214.491)
EcoRI/SphI (13601-13045)
Porción 3’ del gen delta-12 desaturasa de Yarrowia (ID de SEC Nº: 325) (etiquetado como "YL12-C" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2004/104167; patente de EE.UU. 7,214,491)
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Descripción de plásmido pKO2UF8289 (ID de SEC Nº: 324)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 324
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
SwaI/BsiWI (7088-9600)
FBAINm::EgD8M::Pex20, que comprende: • FBAINm: promotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº: 327) (etiquetado como "D8S-23" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; patente de EE.UU. 7.256.033); • Pex20: secuencia de terminación Pex20 del gen Pex20 Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes)
SwaI/PmeI (7088-4581)
YAT1 FmD12 OCT, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente Nº US 2006/0094102-A1); • FmD12: gen delta-12 desaturasa Fusarium moniliforme (ID de SEC Nº: 316) (etiquetado como "F.D12" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2005/047485); • OCT: secuencia de terminación OCT del gen OCT de Yarrowia (Nº X69988 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/PacI (4581-2124)
EXP1::EgD8M::Pex16, que comprende: • EXP1: promotor de la proteína de exportación (EXP1) de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2006/052870 y publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0115881); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº: 327) (etiquetado como "D8-23" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; publicación PCT Nº WO 2006/012326; patente de EE.UU. 7.256.033); • Pex16: Pex16 secuencia de terminación del gen Pex16 de Yarrowia (Nº U75433 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/ClaI (2038-1)
GPAT::EgD9e::Lip2, que comprende: • GPAT: promotor GPAT de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2006/031937; patente de EE.UU. 7.264.949); • EgD9e: gen delta-9 elongasa de Euglena gracilis (ID de SEC Nº: 329) (etiquetado como "EgD9E" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2007/061742); • Lip2: secuencia de terminación Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/EcoRI (13601-1)
LoxP Ura3 LoxP, que comprende:
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320);
• gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes);
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320)
El plásmido pKO2UF8289 fue digerido con AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4001 U1 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MMLeu, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias se seleccionaron y se sembraron en placas de selección MMLeu a 30ºC durante 2 días. Estas células se utilizaron para inocular los medios MMLeu líquidos, y los cultivos
5 líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por transesteriicación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis mostraron la presencia de DGLA en los transformantes que contenían los genes quiméricos de 4 pKO2UF8289, pero no en la cepa Y4001 U1 madre. La mayoría de las 96 cepas producían entre 7% y 13% DGLA
10 del total de lípidos. Seis cepas, designadas como Y4034, Y4035, Y4036, Y4037, Y4038 e Y4039, producían aproximadamente 15%, 13,8%, 18,2%, 13,1%, 15,6% y 13,9% DGLA del total de lípidos, respectivamente.
Generación de la cepa Y4036U {Leu-, Ura3-): el constructo pY116 (FIG. 45B; ID de SEC Nº: 323) se utilizó para expresar temporalmente una enzima recombinasa Cre en la cepa Y4036. Esta liberó el gen Ura3 emparedado con LoxP del genoma.
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El plásmido pY116 se utilizó para transformar la cepa Y4036 según los Procedimientos Generales. Después de la transformación, las células se sembraron en placas sobre MMLeuUra, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias individuales cultivadas sobre placas MMLeuUra eran recogidas y rayadas en medio líquido de YPD. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 1 día a 30ºC para curar el plásmido pY116. Las células
5 de los cultivos desarrollados fueron rayadas en placas de MMLeuUra. Después de dos días a 30ºC, las colonias individuales se volvieron a rayar sobre placas con MMLeuUra, MMU y MMLeu. Se seleccionaron las colonias que podría n crecer en placas con MMLeuUra, pero no en las placas MMU o MMLeu. Una cepa con fenotipos Leu-y Urase designó como Y4036U (Ura-, Leu-).
Generación de cepas Y4069 Y Y4070 para producir aproximadamente 12% de ARA del total de lípidos: el constructo
10 pZKSL-555R (FIG. 46B; ID de SEC Nº: 331) se generó para integrar tres genes delta-5 desaturasa en el loci Lys de la cepa Y4036U para permitir de ese modo la producción de ARA. El plásmido pZKSL-555R contenía los siguientes componentes:
Tabla 11
Descripción de plásmido pZKSL-555R (ID de SEC Nº:331)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 331
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
AscI/BsiWI (3321-2601)
Porción 5’ de 720 pb del gen Lys5 de Yarrowia (Nº M34929 de acceso al Banco de Genes)
PacI/SphI (6716-6029)
Porción 3’ de 687 pb del gen Lys5 de Yarrowia (Nº M34929 de acceso al Banco de Genes)
BglI/BsiWI (15-2601)
EXP1::EgD5S::Pex20, que comprende: • EXP1: promotor de la proteína de exportación (EXP1) Yarrowia lipolytica (etiquetado como "EXP" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 200610115881); • EgD5S: delta-5 desaturasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 332), derivada de Euglena gracilis (publicación de patente de EE.UU. 2007-0292924-A1); • Pex20: secuencia de terminación Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/PmeI (11243-1)
YAT1 RD5S OCT, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • RD5S: delta-5 desaturasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 334), derivada de CCMP626 de Peridinium sp. (etiquetado como "RD5S(626)" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2007-0271632-A1); • OCT: secuencia de terminación OCT del gen OCT de Yarrowia (Nº X69988 de acceso al Banco de Genes)
EcoRI/PacI (9500-6716)
FBAIN::EgD5::Aco, que comprende: • FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD5: delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (ID de SEC Nº: 336) (etiquetado como "EgD5WT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2007-0292924-A1) con la eliminación de sitios de enzimas de restricción interna EcoRI, Bg/II, HindIII y NcoI [mutaciones etiquetadas como "M.EI", "M.BII", "M.H" y "M.N", respectivamente]; • Aco: secuencia de terminación Aco del gen Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
EcoRI/ClaI (9500-11243)
Gen Leu2 de Yarrowia (Nº M37309 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pZKSL-555R fue digerido con AscI/Sphl y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4036U
15 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MMLeuLys, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias individuales eran después re-rayadas en placas MMLeuLys, y las colonias resultantes se utilizaron para inocular MMLeuLys líquido. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG
20 Hewlett-Packard 6890.
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Los análisis de CG mostraron la presencia de ARA en los transformantes que contenían los 3 genes quiméricos de pZKSL-555R, pero no en la cepa Y4036U madre. La mayoría de las 96 cepas seleccionadas producían 10% de ARA del total de lípidos. Cuatro cepas, designadas como Y4068, Y4069, Y4070 e Y4071 producían aproximadamente 11,7%, 11,8%, 11,9% y 11,7% de ARA del total de lípidos, respectivamente. Análisis posteriores
5 mostraron que los tres genes quiméricos de pZKSL-555R no se integraron en el sitio Lys5 en las cepas Y4068, Y4069, Y4070 e Y4071. Todas las cepas poseían un fenotipo Lys+.
El genotipo final de la cepa Y4070, con respecto al tipo silvestre Yarrowia lipolytica ATCC #20362, fue Ura-, desconocido 1-, desconocido 3-, Leu+, Lys+, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20,
10 EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::RD5S::OCT.
Generación de cepa Y4086 para producir aproximadamente 14% de EPA del total de lípidos:
El constructo pZP3-Pa777U (FIG. 47A; ID de SEC Nº:338), se generó para integrar tres genes delta-17 desaturasa en el loci POX3 (Nº AJ001301 de acceso al Banco de Genes) de la cepa Y4070 para permitir de ese modo la producción de EPA. El plásmido pZP3-Pa777U contenía los siguientes componentes:
15 Tabla 12
Descripción de plásmido pZP3-Pa777U (ID de SEC Nº: 338)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº:338
Descripción de componentes de fragmentos y genes quiméricos
AscI/BsiWI (3527-4297)
Porción 5’ de 770 pb del gen Pox3 de Yarrowia (Nº AJ001301 de acceso al Banco de Genes)
PacI/SphI (1-827)
Porción 3’ de 827 pb del gen Pox3 de Yarrowia (Nº AJ001301 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/SwaWI (6624-4457)
YAT1::PaD17S::Lip1, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • PaD17S: de codón optimizado delta-17 desaturasa (ID de SEC Nº: 339), derivada de Pythium aphanidermatum (publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0125326); • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
EcoRI/PmeI (8359-10611)
EXP1::PaD17::Pex16, que comprende: • EXP1: promotor de la proteína de exportación (EXP1) de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "Exp" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0115881); • PaD17: gen delta-17 desaturasa de Pythium aphanidermatum (ID de SEC Nº: 341) (etiquetado como "PaD17WT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0125326); • Pex16: secuencia de terminación Pex16 del gen Pex16 de Yarrowia (Nº U75433 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/PacI (10611-1)
FBAINm::PaD17::Aco, que comprende: • FBAINm: promotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356); • PaD17: gen delta-17 desaturasa de Pythium aphanidermatum (ID de SEC Nº: 341) (etiquetado como "PaD17WT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0125326); • Aco: secuencia de terminación Aco del gen Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/EcoRI (6624-8359)
LoxP Ura3 LoxP, que comprende:
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320);
• gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes);
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320)
61
El plásmido pZP3-Pa777U fue digerido con AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4070 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MM, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias individuales se re-estriaron después en placas MM, y las colonias resultantes se utilizaron para inocular MMLeuLys líquido. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min de
5 durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron la presencia de EPA en los transformantes que contenían los 3 genes quiméricos de pZP3-Pa777U, pero no en la cepa madre Y4070. La mayoría de las 96 cepas seleccionadas producían 10 a 13% de
10 EPA del total de lípidos. Dos cepas, designadas como Y4085 y Y4086, producían aproximadamente 14,2% y 13,8% de EPA del total de lípidos, respectivamente.
El genotipo final de la cepa Y4086, con respecto al tipo silvestre Yarrowia lipolytica ATCC #20362, era Ura3+, Leu+, Lys+, desconocido 1-, desconocido 2-, YALI0F24167g-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20,
15 EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco.
Generación de la cepa Y4086U1 (Ura3-): la cepa Y4086U1 se creó por expresión temporal de la enzima recombinasa Cre en el constructo pY117 (FIG. 47B; ID de SEC Nº: 343) dentro de la cepa Y4086 para producir un fenotipo Ura-. Esto liberó el gen URA3 emparedado con LoxP del genoma. La enzima AHAS Yarrowia mutada en el
20 plásmido pY117 confirió SUR, que se utilizó como un etiquetador de cribado positivo.
El plásmido pY117 se obtuvo a partir del plásmido pY116 (descrito supra, y en la publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868) mediante la inserción del gen AHAS mutante flanqueado por sitios Pacl-SwaI en el Pacl-Swal digirió el pY116, reemplazando de ese modo al etiquetador seleccionable LEU con el etiquetador sulfonilurea. El constructo pY117 contenía de ese modo los siguientes componentes:
25 Tabla 13
Descripción del plásmido pY117 (ID de SEC Nº: 343)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 343
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
1328-448
Plásmido Co1E1 origen de replicación
2258-1398
Gen resistente a ampicilina (AmpR) para selección en E. coli
2438-2838
Origen de replicación f1 en E. coli
3157-4461
Secuencia de replicación autónoma Yarrowia (ARS18; Nº A17608 de acceso al Banco de Genes)
PacI/SwaI 4504-7498
Gen AHAS de Yarrowia lipolytica (Nº XP_501277 de acceso al Banco de Genes) que comprende una mutación W497L (ID de SEC Nº: 344; publicación PCT Nº WO 2006/052870)
SwaI/PmeI 7498-218
GPAT Cre XPR, que comprende: • GPAT: promotor GPAT de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2006/031937; patente de EE.UU. 7.264.949); • Cre: Gen Bacteriofago P1 Cre para proteína recombinasa (Nº X03453 de acceso al Banco de Genes) excepto para cambio de base individual (T4G) dando como resultado un cambio de aminoácido individual (S2A) para crear un sitio NcoI para conveniencia de la clonación; • XPR: ~100 pb de la región 3’ del gen Xpr de Yarrowia (Nº M17741 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pY117 se utilizó para transformar la cepa Y4086 según los Procedimientos Generales. Después de la transformación, las células se sembraron en placas con MMU+SU (280 μg/ml de sulfonilurea; también conocido como clorimurón etil, E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE), y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias individuales SUR cultivadas en placas MMU+SU eran recogidos y rayadas en medio 30 líquido de YPD, y se cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 1 día a 30ºC para curar el plásmido pY117. Las células de los cultivos desarrollados fueron rayadas en placas MMU. Después de dos días a 30ºC, las colonias individuales se volvieron a rayar sobre placas MM y MMU. Se seleccionaron aquellas colonias que podría n crecer
62
en MMU, pero no en las placas MM. Dos de estas cepas con fenotipos Ura-se designaron como Y4086U1 y Y4086U2 (Ura-).
Generación de la cepa Y4128 para producir aproximadamente 37% de EPA del total de lípidos:
El constructo pZP2-2988 (FIG. 48A; ID de SEC Nº: 345) se generó para integrar un gen delta-12 desaturasa, dos genes delta-8 desaturasa y uno gen delta-9 elongasa en los loci Pox2 (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes) de la cepa Y4086U1, para de este modo permitir una mayor nivel de producción de EPA. El plásmido pZP2-2988 contenía los siguientes componentes:
Tabla 14
Descripción del plásmido pZP2-2988 (ID de SEC Nº: 345)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 345
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
AscI/BiWI (3083-2273)
Porción 5’ de 803 pb del gen Pox2 de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
PacI/SphI (6446-5791)
Porción 3’ de 649 pb del gen Pox2 de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/BsiWI (347-2273)
FBA::EgD9eS::Pex20, que comprende: • FBA: promotor FBA de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD9eS: delta-9 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 318), derivada de Euglena gracilis (publicación PCT Nº WO 2007/061742); • Pex20: secuencia de terminación Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/PmeI (13318-347)
GPM/FBAIN FmD12S OCT, que comprende: • GPM/FBAIN: promotor GPM/FBAIN quimérico de Yarrowia lipolytica (separadamente etiquetado como “GPM" e "intrón FBA" en la Figura) (publicación PCT Nº WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356); • FmD12S: delta-12 desaturasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 346), derivada de Fusarium moniliforme (etiquetado como "F.D12S" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2005/047485); • OCT: secuencia de terminación OCT del gen OCT Yarrowia (Nº X69988 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/EcoRI (13318-11581)
LoxP Ura3 LoxP, que comprende:
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320);
• gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes);
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320)
EcoRII/SwaI (11581-8884)
GPDIN::EgD8M::Lip1, que comprende: • GPDIN: promotor GPDIN de Yarrowia lipolytica (publicación de patente de EE.UU. 2006/0019297-A1); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº: 327; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; patente de EE.UU. 7.256.033); • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
SwaI/PacI (8884-6446)
YAT1 EgD8M ACO, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº: 327; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; patente de EE.UU. 7.256.033); • Aco: secuencia de terminación Aco del gene Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
63 5
10
15
20
25
30
El plásmido pZP2-2988 fue digerido con AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4086U1 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MM, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 2 a 3 días. Las colonias individuales se rayaron en placas MM, y las colonias resultantes se utilizaron para inocular MMLeuLys líquido. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se volvieron a suspender en HGM, y después se agitaron a 250 rpm/min durante 5 días. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron que la mayoría de las 96 cepas seleccionadas producían 12% a 15,6% de EPA del total de lípidos. Dos cepas, designadas como Y4128 y Y4129, produjeron aproximadamente 37,6% a 16,3% de EPA del total de lípidos, respectivamente.
El genotipo final de la cepa Y4128, con respecto al tipo silvestre Yarrowia lipolytica ATCC #20362, era: YALI0F24167g-, Pex10-, desconocido 1-, desconocido 2-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco. La cepa Y4128 de Yarrowia lipolytica se depositó en la American Type Culture Collection el 23 de agosto de 2007 y lleva la designación ATCC PTA-8614.
Generación de cepas Y4128U: con el fin de interrumpir el gen Ura3 en la cepa Y4128, el constructo pZKUE3S (FIG. 48B; ID de SEC Nº: 351) fue creado para integrar un gen quimérico EXP1::ME3S::Pex20 en el gen Ura3 de la cepa Y4128. El plásmido pZKUE3S contenía los siguientes componentes:
Tabla 15
Descripción del plásmido pZKUE3S(ID de SEC Nº: 351)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 351
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
BsiWI/PacI (318-1038)
Porción 5’ de 721 pb del gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes)
SphI/PmeI (3915-4594)
Porción 3’ de 729 pb del gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes)
EcoRI/BsiWI (4628-318)
EXP1::ME3S::Pex20, que comprende: • EXP1: promotor de la proteína de exportación (EXP1) de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "Exp" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 200610115881); • ME3S: gen elongasa C16/18 de codón optimizado (ID de SEC Nº: 321), derivada de Mortierella alpina (publicación PCT Nº WO 2007/046817); • Pex20: secuencia de terminación Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes)
2149-1269
Plásmido Co1E1 origen de replicación
3079-2219
Gen resistente a la ampicilina (AmpR) para selección en E. coli
3659-3259
Origen f1
El plásmido pZKUE3S fue digerido con /PacI/SphI y después se utilizó para transformar la cepa Y4128 según los Procedimientos Generales. Después de la transformación, las células se sembraron en placas de selección MM+5-FOA, y las placas se mantuvieron durante a 30ºC durante 2 a 3 días.
Un total de 24 transformantes cultivados en placas de selección MM+5-FOA se recogieron y se volvieron a rayar sobre placas MM+5-FOA recién preparadas. Las células fueron retiradas de las placas, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron la presencia de entre 10-15% de EPA en todos los transformantes con pZKUE3S de las placas. Las cepas designadas como Y4128U1, Y4128U2, Y4128U3, Y4128U4, Y4128U5 e Y4128U6 producían 12,9%, 14,4%, 15,2%, 15,4%, 14% y 10,9% de EPA, respectivamente (colectivamente, Y4128U).
La discrepancia en el% de EPA cuantificado en Y4128 (37,6%) frente a Y4128U (promedio 13,8%) se basa en diferentes condiciones de cultivo. Específicamente, el cultivo anterior era analizado después de dos días de
64
desarrollo en cultivo líquido, mientras que el segundo cultivo era analizado después de cultivo sobre una placa de agar. Los solicitantes han observado un aumento de 2-3 veces en el % de EPA, al comparar Los resultados de las placas de agar con los del cultivo líquido. Así, aunque Los resultados no son directamente comparables, ambas cepas Y4128 e Y4128U muestran alta producción de EPA.
5 Generación de la cepa Y4217 para producir aproximadamente 42% de EPA del total de lípidos: el constructo pZKL25U89GC (FIG. 49A; ID de SEC Nº: 348) se generó para integrar solo un gen delta-9 elongasa, un gen delta-8 desaturasa, una delta 5 desaturasa y el gen diacilglicerol colinafosfotransferasa (CPT1) de Yarrowia lipolytica en los loci Lip2 (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes) de la cepa Y4128U3 para permitir con ello un mayor nivel de producción de EPA. El plásmido pZKL2-5U89GC contenía los siguientes componentes:
10 Tabla 16
Descripción del plásmido pZKL2-5U89GC (ID de SEC Nº: 348)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº:348
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
AscI/BsiWI (730-1)
Porción 5’ de 722 pb del gen Lip2 de Yarrowia (etiquetado como "Lip2.5N" en la Figura; (Nº A012632 de acceso al Banco de Genes)
PacI/SphI (4141-3438)
Porción 3’ de 697 pb del gen Lip2 de Yarrowia (etiquetado como "Lip2.3N" en la Figura; Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
SwaI/BsiWI (13382-1)
YAT1 YICPT1 Aco, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • YICPT1: Gen diacilglicerol-colinafosfotransferasa de Yarrowia lipolytica (ID de SEC Nº: 349) (etiquetado como "CPT1" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2006/052870); • Aco: secuencia de terminación Aco del gen Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/SwaI (10745-13382)
FBAINm::EgD8M::Lip1 que comprende: • FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº: 327) (etiquetado como "D8S-23" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; patente de EE.UU. 7.256.033); • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/ClaI (10745-8650)
GPD::EgD9eS::Lip2, que comprende: • GPD: promotor GPD de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "GPD Pro" en la Figura; patente de EE.UU. 7.259.255); • EgD9eS: gen delta-9 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 318), derivada de Euglena gracilis (etiquetado como "EgD9ES" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2007/061742); • Lip2: secuencia de terminación Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/EcoRI (8650-6581)
Yarrowia gen Ura3 (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes)
EcoRI/PacI (6581-4141)
YAT1 EgDD5S ACO, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • EgD5S: delta-5 desaturasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 332), derivada de Euglena gracilis (publicación de patente de EE.UU. 2007-0292924-A1); • Aco: secuencia de terminación Aco del gen Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pZKL2-5U89GC fue digerido AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4128U3 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MM, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 3 a 4 días. Las colonias individuales se volvieron a rayar sobre placas de MM, y las
65
imagen36
Descripción del plásmido pZKL1-2SP98C (ID de SEC Nº: 352)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº:352
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
PmeI/SwaI (13241-1)
FBAINm::EgD8M::Lip1 que comprende: • FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº:327; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; patente de EE.UU. 7.256.033); • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/ClaI (13241-11385)
YAT1 EgD9eS Lip2, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • EgD9eS: gen delta-9 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 318), derivada de Euglena gracilis (etiquetado como "EgD9ES" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2007/061742); • Lip2: secuencia de terminación Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/EcoRI (11385-9648)
LoxP Ura3:LoxP, que comprende:
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320);
• gen Ura3 Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes);
• secuencia LoxP (ID de SEC Nº: 320)
EcoRI/PacI (9648-6951)
EXP1 FmD12S ACO, que comprende: • EXP 1: promotor de la proteína de exportación (EXP1) de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "Exp" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0115881); • FmD12S: delta-12 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 346), derivada de Fusarium moniliforme (etiquetado como "FD12S" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2005/047485); • Aco: secuencia de terminación Aco del en Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pZKL1-2SP98C fue digerido con AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4217U2 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MM, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 3 a 4 días. Las colonias individuales se volvieron a rayar sobre placas de MM, y las colonias resultantes se utilizaron para inocular MM líquido. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min
5 durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se volvieron a suspender en HGM, y después se agitaron a 250 rpm/min durante 5 días. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron que la mayoría de las 72 cepas seleccionadas producían 40-44% de EPA del total de
10 lípidos. Seis cepas, designadas como Y4259, Y4260, Y4261, Y4262, Y4263 e Y4264, producían aproximadamente 46,5%, 44,5%, 44,5%, 44,8%, 44,5% y 44,3% de EPA del total de lípidos, respectivamente.
El genotipo final de la cepa Y4259 con respecto al tipo silvestre Yarrowia lipolytica ATCC #20362 era: YALI0C18711g-, Pex10-, YALI0F24167g-, desconocido 1-, desconocido 3-, desconocido 8-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, EXP1::FmD12S::Aco, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20
15 (2 copias), GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1 (2 copias), EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco, YAT1::YICPT1::ACO, GPD::YICPT1::ACO.
20 Generación de la cepa Y4259U2 (Ura3-): con el fin de interrumpir el gen Ura3 en la cepa Y4259, el constructo pZKUM (FIG. 50A; ID de SEC Nº: 353) se utilizó para integrar un gen mutante Ura3 en el gen Ura3 de la cepa Y4259. El plásmido pZKUM contenía los siguientes componentes:
67 Tabla 18
Descripción del plásmido pZKUM (ID de SEC Nº: 353)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº:353
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
SalI/PacI (32845-1)
Gen Ura3 mutante sintético (ID de SEC Nº: 354, en donde el fragmento de ADN de 1459 pb contiene una eliminación de 33 pb de +21 a +53, una eliminación de 1 pb de +376 y una eliminación de 3 pb de +400 a +403 de la región codificante Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes))
1112-232
Plásmido Co1E1 origen de replicación
2042-1182
Gen resistente a la ampicilina (AmpR) para selección en E. coli
Se recogieron un total de de 3 de transformantes cultivados en placas MM+5-FOA y se volvieron a rayar en placas MM y placas MM+5-FOA. Todas las 3 cepas tenían un fenotipo Ura (es decir, las células podrían crecer en placas MM+5-FOA, pero no en las placas MM). Las células se rasparon de las placas MM+5-FOA, y los lípidos se
5 extrajeron. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron la presencia de 31,4%, 31% y 31,3% de EPA en los transformantes #1, #2 y #3 con pZKUM cultivado en placas MM+5-FOA. Estas tres cepas eran cepas designadas como Y4259U1, Y4259U2 e Y4259U3, respectivamente (colectivamente, Y4259U).
10 Generación de la cepa Y4305 para producir aproximadamente 53% de EPA del total de lípidos:
El constructo pZKD2-5U89A2 (FIG. 50B; ID de SEC Nº: 355), se ha generado para integrar solo un gen delta-9 elongasa, un gen delta-5 desaturasa, un gen delta 8 desaturasa y un gen delta-12 desaturasa en los loci diacilglicerol aciltransferasa (DGAT2) de la cepa Y4259U2, para permitir de ese modo un mayor nivel de producción de EPA. El plásmido pZKD2-5U89A2 contenía los siguientes componentes:
15 Tabla 19
Descripción del plásmido pZKD2-5U89A2 (ID de SEC Nº: 355)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 355
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
AscI/BsiWI (1-736)
Porción 5’ de 728 pb del gen DGAT2 de Yarrowia (ID de SEC Nº: 356) (etiquetado como "YLDGAT5"' en la Figura; patente de EE.UU. 7.267.976)
PacI/SphI (4164-3444)
Porción 3’ de 714 pb del gen DGAT2 de Yarrowia (ID de SEC Nº: 356) (etiquetado como "YLDGAT3’“ en la Figura; patente de EE.UU. 7.267.976)
SwaI/BsiWI (13377-1)
YAT1 FmD12S Lip2, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • FmD12S: delta-12 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 346), derivada de Fusarium moniliforme (etiquetado como "F.D12S" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2005/047485); • Lip2: secuencia de terminación Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/SwaI (10740-13377)
FBAINm::EgD8M::Lip1 que comprende: • FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD8M: delta-8 desaturasa mutante sintética (ID de SEC Nº: 327; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868), derivada de Euglena gracilis ("EgD8S"; patente de EE.UU. 7.256.033); • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
68 5
Descripción del plásmido pZKD2-5U89A2 (ID de SEC Nº: 355)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 355
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
ClaI/PmeI (8846-10740)
YAT1 E389D9eS OCT, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (etiquetado como "YAT" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1); • E389D9eS: delta-9 elongasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 358), derivada de CCMP389 de Eutreptiella sp. (etiquetado como "D9ES-389" en la Figura; publicación PCT Nº WO 2007/061742); • OCT: secuencia de terminación OCT del gen OCT de Yarrowia (Nº X69988 de acceso al Banco de Genes)
ClaI/EcoRI (8846-6777)
Gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes)
EcoRI/PacI (6777-4164)
EXP1 EgD5S ACO, que comprende: • EXP1: promotor de la proteína de exportación (EXP1) Yarrowia lipolytica (etiquetado como "Exp" en la Figura; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0115881); • EgD5S: delta-5 desaturasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 332), derivada de Euglena gracilis (publicación de patente de EE.UU. 2007-0292924-A1); • Aco: secuencia de terminación Aco del gen Aco de Yarrowia (Nº AJ001300 de acceso al Banco de Genes)
10
15
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30
El plásmido pZKD2-5U89A2 fue digerido con AscI/SphI y después se utilizó para la transformación de la cepa Y4259U2 según los Procedimientos Generales. Las células transformadas se sembraron en placas de MM, y las placas se mantuvieron a 30ºC durante 3 a 4 días. Las colonias individuales se rayaron en placas MM, y las colonias resultantes se utilizaron para inocular MM líquido. Los cultivos líquidos se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se volvieron a suspender en HGM, y después se agitaron a 250 rpm/min durante 5 días. Las células se recogieron por centrifugación, y se extrajeron los lípidos. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron que la mayoría de las 96 cepas seleccionadas producían 40-46% de EPA del total de lípidos. Cuatro cepas, designadas como Y4305, Y4306, Y4307 e Y4308, produjeron aproximadamente 53,2%, 46,4%, 46,8% y 47,8% de EPA del total de lípidos, respectivamente. El perfil de lípidos completo de Y4305 es el siguiente: 16:0 (2,8%), 16:1 (0,7%), 18:0 (1,3%), 18:1 (4,9%), 18:2 (17,6%), ALA (2,3%), EDA (3,4%), DGLA (2,0%), ARA (0,6%), ETA (1,7%) y EPA (53,2%). El % en peso de células secas (dcw) de los lípidos totales era de 27,5.
El genotipo final de la cepa Y4305 con respecto al tipo silvestre Yarrowia lipolytica ATCC SCP2-era #20362 (YALI0E01298g), YALI0C18711g-, Pex10-, YALI0F24167g-, desconocido 1-, desconocido 3-, desconocido 8, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, EXP1::FmD12S::Aco, YAT1::FrpD12S::Lip2, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20 (3 copias), GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, YAT1::E389D9eS::OCT, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1 (2 copias), EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, EXP1::EgD5S::ACO, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco, YAT1::YICPT1::ACO, GPD::YICPT1::ACO.
Generación de la cepa Y4305U3 (Ura3-): con el fin de interrumpir el gen Ura3 en la cepa Y4305, el constructo pZKUM (FIG. 50A; ID de SEC Nº: 353) se utilizó para integrar un gen mutante Ura3 en el gen Ura3 de la cepa Y4305. Se recogieron un total de 8 transformantes cultivados en placas MM+5-FOA y se volvieron a rayar sobre placas MM y placas MM+5-FOA, por separado. Todas las 8 cepas tenían un fenotipo Ura (es decir, las células podrían crecer en placas MM+5-FOA, pero no en las placas MM). Las células se rasparon de las placas MM+5-FOA, y los lípidos se extrajeron. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron la presencia de 37,6%, 37,3% y 36,5% de EPA en los transformantes #1, #6 y #7 de pZKUM cultivados en placas MM+5-FOA. Estas tres cepas se designaron como cepas Y4305U1, Y4305U2 e Y4305U3, respectivamente (colectivamente, Y4305U).
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Tabla 23
Genes de las vías biosintéticas de los PUFA
Gen
Organismo Referencias
Delta-6 desaturasa
Saprolegnia diclina WO 2002/081668
Delta-6 desaturasa
Mortierella alpina Patente de EE.UU. Nº. 5,968,809
Elongasa
Mortierella alpina WO 2000/12720 Patente de EE.UU. Nº 6.403.349
Delta-5 desaturasa
Mortierella alpina Patente de EE.UU. Nº 6.075.183
Delta-5 desaturasa
Saprolegnia diclina WO 2002/081668
Delta-5 desaturasa
Peridinium sp. publicación de patente de EE.UU. Nº US 2007/0271632
Delta-5 desaturasa
Euglena gracilis publicación de patente de EE.UU. Nº US 2007/0292924
Delta-15 desaturasa
Fusarium moniliforme WO 2005/047479
Delta-17 desaturasa
Saprolegnia diclina WO 2002/081668
elongasa
Thraustochytrium aureum WO 2002/08401 Patente de EE.UU. Nº 6,677,145
elongasa
Pavlova sp. Pereira et al., Biochem. J. 384:357-366 (2004)
Delta-4 desaturasa
Schizochytrium aggregatum WO 2002/090493 Patente de EE.UU. Nº 7.045.683
Delta-4 desaturasa
Isochrysis galbana WO 2002/090493 Patente de EE.UU. Nº 7.045.683
Delta-4 desaturasa
Thraustochytrium aureum WO 2002/090493 Patente de EE.UU. Nº 7.045.683
Delta-4 desaturasa
Euglena gracilis publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0218668
Delta-9 elongasa
Isochrysis galbana WO 2002/077213
Delta-9 elongasa
Euglena gracilis publicación de patente de EE.UU. Nº US 2007/0118929
Delta-9 elongasa
CCMP389 de Eutreptiella sp. publicación de patente de EE.UU. Nº US 2007/0117190
Delta-9 elongasa
Euglena anabaena Pendiente
Delta-8 desaturasa
Euglena gracilis WO 2000/34439 Patente de EE.UU. Nº 6.825.017 WO 2004/057001 WO 2006/012325
Delta-8 desaturasa
Acanthamoeba castellanii Sayanova et al., FEBS Lett. 580: 1946-1952 (2006)
Delta-8 desaturasa
Pavlova salina WO 2005/103253
Delta-8 desaturasa
Pavlova lutheri publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0118623
Delta-8 desaturasa
CCMP1491 de Tetruetreptia pomquetensis publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0095915
Delta-8 desaturasa
CCMP389 de Eutreptiella sp. publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0095915
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Regeneración de embriones somáticos de soja en plantas:
Con el fin de obtener plantas completas a partir de cultivos embriogénicos en suspensión, el tejido debe ser regenerado. Los embriones son madurados como se describe en el Ejemplo 25. Después de subcultivar en medio SB103 durante 3 semanas, los embriones individuales pueden ser retirados de los agrupamientos y cribados para alteraciones en sus composiciones de ácidos grasos como se describe en el presente documento. Cabe señalar que cualquier fenotipo detectable, resultante de la expresión de los genes de interés, podría ser cribado en esta etapa. Esto incluiría pero no se limitaría a las alteraciones en el perfil de ácidos grasos, perfil de proteínas y contenido, contenido de hidratos de carbono, tasa de crecimiento, viabilidad o capacidad de desarrollarse normalmente en una planta de soja.
Los embriones individuales madurados son desecados colocándolos en una pequeña placa de Petri vacía (35 x 10 mm) durante aproximadamente 4 a 7 días. Las placas son selladas con cinta de fibra (creando una pequeña cámara de humedad). Los embriones desecados son plantados en medio SB71-4 donde se dejan germinar en las mismas condiciones de cultivo descritas anteriormente. Las plántulas germinadas se retiran del medio de germinación y se enjuagan a fondo con agua y después son plantadas en Redi-Earth en bandeja con un paquete de 24 celdas, cubierta con una cúpula de plástico transparente. Después de 2 semanas se retira la cúpula, y las plantas se dejan endurecer durante una semana más. Si las plantas parecen resistentes, se trasplantan a tarros de 25,4 cm (10”) de Redi-Earth con hasta 3 plántulas por tarro. Después de 10 a 16 semanas, las semillas maduras se cosechan, se hacen astillas y se analizan los ácidos grasos.
Ejemplo 27
Análisis funcional de sintasas DHA de Euglena gracilis y de Euglena anabaena en Yarrowia lipolytica
Cada uno de los vectores de expresión descritos a continuación en la Tabla 24 se transformó en la cepa Y2224 de Yarrowia lipolytica (una cepa auxotrófica de uracilo ura3 de Yarrowia lipolytica) descrita en los Procedimientos Generales anteriores.
Las colonias individuales de Yarrowia lipolytica transformante que contienen un vector de expresión Yarrowia adecuado (véase la Tabla 24) se cultivaron en 3 ml de MM que carece de uracilo suplementado con 0,2% de tergitol a 30ºC durante 1 día. Después de esto, 0,05 ml se transfirieron a 3 ml del mismo medio suplementado bien sin ácido graso o bien con EPA hasta 0,175 mM. Estos se incubaron durante 16 horas a 30ºC, 250 rpm y después los sedimentos se obtuvieron por centrifugación. Las células se lavaron una vez con agua, se sedimentaron por centrifugación y se secaron al aire. Los sedimentos fueron transesterificados (Roughan, G. y Nishida, I., Arch Biochem Biophys 276 (1): 38-46 (1990)) con 500 l de metóxido de sodio al 1% durante 30 min a 50ºC después de lo cual se añadieron 500 l de cloruro de sodio 1 M y 100 l de heptano. Después de mezclar a fondo y centrifugación, ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) se analizaron por GC como se ha descrito supra (véanse los Procedimientos Generales).
Tabla 24
Compendio de vectores transformados en Yarrowia lipolytica
Vector
Cadena principal del Vector Gen expresado (ID de SEC Nº:) Ej. Nº FIG. Nº ID de SEC Nº: Observaciones
pBY-EgC20elo1
pBY1 EgC20elo1 (ID de SEC Nº: 5) 9 7D 39 EgC20elo1 expresado como proteína de fusión
pY132
pBY1 EgDHAsyn1 (ID de SEC Nº: 11) 9 8A 40 EgDHAsyn1 expresado como proteína de fusión
pY161
pY159 EgDHAsyn1 (ID de SEC Nº: 11) 9 8B 41 EgDHAsyn1 expresado del sitio de inicio de la traducción del gen
pY164
pY159 EgDHAsyn2 (ID de SEC Nº: 21) 9 8C 42 EgDHAsyn2 expresado del sitio de inicio de la traducción del gen
pY141
pY115 EgDHAsyn1* (ID de SEC Nº: 205) 10 8D 49 El sitio interno NcoI de EgDHAsyn1 era eliminado para producir EgDHAsyn1*; no se hicieron cambios adicionales de nucleótidos
96
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Sumario de vectores expresado en Yarrowia lipolytica
Vector
Gen expresado (ID de SEC Nº:) Ej. Nº FIG. Nº ID de SEC Nº: Observaciones
pY143
EgDHAsyn1C 10 9A 52 Contiene el dominio N-término de
20EloDom1 (ID
EgDHAsyn1* EgDHAsyn1C20EloDom1) y
de SEC Nº: 206)
no incluye el enlazador rico en prolina o el dominio delta-4 desaturasa
pY149
EgDHAsyn1C 20EloDom2Linker (ID de SEC Nº: 207) 10 9B 55 Contiene el dominio N-término de EgDHAsyn1* así como el enlazador rico en prolina, pero no contiene el dominio delta-4 desaturasa; también contiene 4 aminoácidos adicionales (es decir, SCRT) después de la región enlazadora
pY150
IgD4* (ID de SEC Nº: 210) 11 9C 62 Delta-4 desaturasa Isochrysis galbana con el sitio SbfI en el extremo 5' después del codón de inicio
pY156
EgDHAsyn1C 20EloDom3-IgD4 ("IgFus") (ID de SEC Nº: 211) 11 9D 64 Contiene fusión en marco entre el EgDHAsyn1C20EloDom3Linker e IgD4*, separada por la región de enlazador rico en prolina
pY152
EgDHAsyn1D 4Dom1 ("EgD4Dom1") (ID de SEC Nº: 216) 11 10A 67 Contiene el dominio C-término de EgDHAsyn1* (es decir, el dominio delta-4 desaturasa, empezando justo después del extremo de la región del enlazador rico en prolina); también contiene un codón de iniciación ATG en el extremo 5’ del producto de la PCR seguido por un sitio SbfI
pY157
EgDHAsyn1C 20EloDom3-EgD4Dom1 ("EgFus") (ID de SEC Nº: 218) 11 10B 69 Contiene una fusión en marco entre EgDHAsyn1C20EloDom y EgDHAsyn1 D4Dom1, separada por la región del enlazador rico en prolina (llamada EgDHAsyn C20EloDom3-EgD4Dom1); casi idéntica a EgDHAsyn1 excepto que es cambiado un aminoácido (es decir, G323L) debido al sitio SbfI de clonación y la unión de fusión
PY153
EgDHAsyn1D 11 10C 72 Contiene la región del C-término de
4Dom2 (ID de
EgDHAsyn1 que contiene el dominio
SEC Nº: 220)
Delta-4 desaturasa y algo del dominio
"EgD4Dom2"
elongasa C20
pY151
SaD4* (ID de SEC Nº: 223) 11 10D 76 Delta-4 desaturasa de Schizochytrium aggregatum con el sitio SbfI en el extremo 5' después del codón de inicio
pY160
EgDHAsyn1C 20EloDom3-SaD4 ("SaFus") (ID de SEC Nº: 225) 11 11 77 Contiene la fusión en marco entre EgDHAsyn1C20EloDom3 y SaD4, separada por la región del enlazador rico en prolina
Los perfiles de los ácidos grasos de las células transformantes se analizaron posteriormente como se describe en el Ejemplo 27.
Los resultados para alimentar con EPA un vector solo de control, pY141, pY143, pY149, pY156, pY157 y pY160 se muestran en la FIG. 19. Los perfiles de ácidos grasos para Yarrowia que expresan pY150, pY151, pY152 y pY153 no mostraron elongación de EPA a DPA y no se muestran en la FIG. 19.
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Ejemplo 34
Síntesis y análisis funcional de un gen delta-4 desaturasa de codón optimizado (EaD4S) de Euglena anabaena en Yarrowia lipolytica
El uso de codón del dominio delta-4 desaturasa de EaDHAsyn2 (ID de SEC Nº: 243) de Euglena anabaena (es decir, 5 correspondiente a los aminoácidos 259-841 de la ID de SEC Nº: 96) se ha optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica, de una forma similar a la descrita en la publicación PCT Nº WO 2004/101753, la patente de EE.UU.
7.125.672 y anteriormente en los Ejemplos 32 y 33. Específicamente, se diseñó un gen delta-4 desaturasa de codón optimizado (designado "EaD4S" y que tiene la secuencia de nucleótidos como se establece en la ID de SEC Nº: 192 y en la secuencia de aminoácidos como se expone en la ID de SEC Nº: 193), basada en la secuencia de codificación 10 del dominio delta-4 desaturasa de EaDHAsyn2 (ID de SEC Nº: 92), que también se proporciona como ID de SEC Nº: 194 (nucleótido) y como ID de SEC Nº: 195 (aminoácido). Además de la modificación del sitio de iniciación de la traducción, se modificaron 307 pb de la región de codificación de 1.752 pb (incluyendo el codón de parada TAA) (17,5%) y se optimizaron 285 codones (48,8%). Adicionalmente, un sitio NcoI se introdujo en torno al codón de iniciación de la traducción cambiando el segundo aminoácido del dominio delta-4 desaturasa de tipo silvestre (es
15 decir, el resto 260 de aminoácidos de la ID de SEC Nº: 96 o el resto 2 de aminoácidos de la ID de SEC Nº: 195) a partir de un resto leucina hasta un resto valina en el gen EaD4S sintético; así, la secuencia de aminoácidos de EaD4S se expone en la ID de SEC Nº: 193. El gen EaD4S diseñado (ID de SEC Nº: 192) era sintetizado por GenScript Corporation (Piscataway, NJ) y se clonó en pUC57 (Nº Y14837 de acceso al Banco de Genes) para generar pEaD4S (ID de SEC Nº: 196).
20 Para analizar la función del gen EaD4S de codón optimizado, se construyó el plásmido pZKL4-220EA4 (FIG. 52B; ID de SEC Nº: 362) para integrar dos genes quiméricos de elongasa C20 y el gen quimérico de EaD4S en la lipasa 4 como locus (Nº XM_503825 de acceso al Banco de Genes) de la cepa Y4184U4 de Yarrowia lipolytica. El plásmido pZKL4-220EA4 contenía los siguientes componentes:
Tabla 28
Componentes del plásmido pZKL4-220EA4 (ID de SEC Nº: 362)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 362
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
Asc I/BsiW I (4875-4123)
Porción 5’ de 745 pb de Lipasa 4 de Yarrowia como gen (ID de SEC Nº: 363; Nº XM 503825 de acceso al Banco de Genes)
PacI/SphI (8371-7583)
Porción 3’ de 782 pb de Lipasa 4 de Yarrowia como gen (ID de SEC Nº: 363; Nº XM 503825 de acceso al Banco de Genes)
Swa I/BsiW I (1980-4123)
FBAINm EaC20ES Pex20, que comprende: • FBAINm: promotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356); • EaC20ES: gen elongasa C20 de codón optimizado (ID de SEC Nº: 188; Ejemplo 33), derivada de Euglena anabaena; • Pex20: secuencia de terminación Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes)
Pme I/Swa I (1-1980)
YAT1 EgC20ES Lip1, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (publicación de patente Nº U.S. 2006/0094102-A1); • EgC20ES: gen elongasa C20 de codón optimizado (ID de SEC Nº: 183; Ejemplo 32), derivada de Euglena gracilis; • Lip1: Lip1 secuencia de terminación del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
Cla I/Pme I (1-10472)
EXP1 EaD4S Lip2, que comprende: • EXP1: promotor de exportación de proteína de Yarrowia lipolytica (publicación PCT Nº WO 2006/052870 y publicación de patente de EE.UU. Nº US 2006/0115881); • EaD4S: gen delta-4 desaturasa de codón optimizado (ID de SEC Nº: 192), derivada de Euglena anabaena; • Lip2: secuencia de terminación Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (Nº AJ012632 de acceso al Banco de Genes)
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Estos datos demostraban que el N-terminal de 28 aminoácidos de EgD4S* eran prescindibles (es decir, véase pZKL4-220Eg4-1, donde los primeros 28 aminoácidos de EgD4S estaban truncados y la proteína truncada expuesta como ID de SEC Nº: 404 retenía toda la actividad delta-4 desaturasa). La actividad reducida delta-4 desaturasa se midió en transformantes con pZKL4-220EgD4-2 y pZKL4-220EgD4-3, cuando los aminoácidos adicionales estaban truncados desde la porción 5’ de las proteínas EgD4S, dando como resultado ID de SEC Nº: 406 e ID de SEC Nº:
408.
Ejemplo 54
Síntesis y análisis funcional de un gen EgDHAsyn1 de codón optimizado (EgDHAsyn1S) de Euglena gracilis en Yarrowia lipolytica
El plásmido pZKLY-G204 (FIG. 54A; ID de SEC Nº: 409) fue diseñado para integrar un gen quimérico que contiene una región de codificación EgDHAsyn1 de codón optimizado (es decir, EgDHAsyn1S, expuesta como ID de SEC Nº: 410 y 411) en la lipasa 7 locus (Nº AJ549519 de acceso al Banco de Genes) de la cepa Y4305U3 de Yarrowia lipolytica. Además de la modificación del sitio de iniciación de la traducción, fueron modificadas 417 pb (17, 5%) de la región codificante de 2.382 pb, y 391 codones de 794 codones totales fueron optimizados (49,2%). La secuencia de aminoácidos de EgDHAsyn1S de codón optimizado (ID de SEC Nº: 411) es 100% idéntica a la secuencia de EgDHAsyn1 (ID de SEC Nº: 12).
Para generar pZKLY-G204, se introdujo un sitio NotI en pEgC20ES (ID de SEC Nº: 185; véase la FIG. 51 B, Ejemplo 32) para generar pEgC20ES-K (ID de SEC Nº: 412; FIG. 54B) por mutagénesis dirigida al sitio utilizando oligonucleótidos YL973 e YL974 (ID de SEC Nº: 413 y 414, respectivamente) como cebadores y pEgC20ES como molde. Un fragmento Pme//NcoI de 732 pb que contiene el promotor YAT1 (publicación de patente de EE.UU. 2006/0094102-A1) de pYNTGUS1-CNP (FIG. 54C; ID de SEC Nº: 415), el fragmento NcoI/KpnI de 873 pb de pEgC20ES-K que contiene la porción N-terminal de codón optimizado de EgDHAsyn1S y el fragmento KpnI/NcoI de
1.512 pb de pEgD4S (ID de SEC Nº: 389; Ejemplo 52) que contiene la porción C-terminal de codón optimizado de EgDHAsyn1S fueron aislados, y después se utilizaron para reemplazar el fragmento PmeI/NotI de pZKLY (FIG. 54D; ID de SEC Nº: 416) para generar pZKLY-G204 (FIG. 54A). Así, pZKLY-G204 contenía los siguientes componentes:
Tabla 31
Componentes del plásmido pZKLY-G204 (ID de SEC Nº: 409)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº: 409
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
Asc I/BsiW I (1383-489)
Porción 5’ de 887 pb del gen Lipasa 7 de Yarrowia (ID de SEC Nº: 417) (etiquetado como "LipY-5"' en la Figura; Nº AJ549519 de acceso al Banco de Genes)
PacI / SphI (4853-4091)
Porción 3’ de 756 pb del gen Lipasa 7 de Yarrowia (ID de SEC Nº: 417) (etiquetado como "LipY-3'" en la Figura; Nº AJ549519 de acceso al Banco de Genes)
PmeI/BsiWI (7301-333)
YAT1 EgDHAsyn1S Lip1, que comprende: • YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (publicación de patente Nº US 2006/0094102-A1); • EgDHAsyn1S: sintasa DHA de codón optimizado (ID de SEC Nº: 410), derivada de Euglena gracilis; • Lip1: secuencia de terminación Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (Nº Z50020 de acceso al Banco de Genes)
Sal I/EcoR I (6504-4885)
• gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes)
El plásmido pZKLY-G204 fue digerido con AscI/Sphl, y después se transformó en la cepa Y4305U3 de Yarrowia lipolytica, como se describe en los Procedimientos Generales. Los transformantes se seleccionaron en placas de MM. Después de 5 días de cultivo a 30ºC, 8 transformantes cultivados en las placas de MM fueron recogidos y se volvieron a rayar sobre placas de MM recién preparadas. Una vez desarrolladas, estas cepas se inocularon individualmente en 3 ml de MM líquido a 30ºC y se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días. Las células se recogieron por centrifugación, se volvieron a suspender en HGM y después se agitaron a 250 rpm/min durante 5 días. Las células se recogieron por centrifugación, se extrajeron los lípidos, y se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos por trans-esterificación, y posteriormente se analizaron con un CG Hewlett Hewlett-Packard 6890.
Los análisis de CG mostraron que había aproximadamente 5,0% de DHA, 13,5% de DPA y 26,5% de EPA de los lípidos totales producidos en los 8 transformantes. La eficiencia de transformación de EPA a DPA y DHA se determinó que era de aproximadamente 41%; y la eficiencia de la transformación de DPA a DHA se determinó que
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era de aproximadamente 27% en estas ocho cepas (calculado como se describe en el Ejemplo 27). Así, estos datos experimentales demostraron que la Euglena gracilis DHA sintasa de codón optimizado sintética para expresión en Yarrowia lipolytica (es decir, EgDHAsyn1S como se expone en la ID de SEC Nº: 410) contenía tanto actividad C20 elongasa como actividad delta-4 desaturasa. EgDHAsyn1S podría utilizar EPA como sustrato para producir DHA.
5 Ejemplo 55
Creación de genes de fusión delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa para expresión en Yarrowia lipolytica
Ccon el fin de mejorar la actividad de la enzima delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa en Yarrowia lipolytica, una serie de seis fusiones génicas delta-9 elongasa/delta-8 (multienzimas) son creadas en el presente Ejemplo, utilizando dos secuencias variantes del enlazador (es decir, ID de SEC Nº: 438 [GPARPAGLPPATYYDSLAV] e ID
10 de SEC Nº: 445 [GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS]) derivada del enlazador rico en prolina EgDHAsyn1 (ID de SEC Nº: 198; PARPAGLPPATYYDSLAV).
Este trabajo requería: identificación de las apropiadas delta-9 elongasas y delta-8 desaturasas para expresión en Yarrowia lipolytica; y, construcción de plásmido pZUFmG9G8fu (que comprende una fusión génica EgD9ES/EgD8M), plásmido pZuFmG9G8fu-B (que comprende una fusión génica EgD9ES/EgD8M), plásmido
15 pZUFmG9A8 (que comprende una fusión génica EgD9ES/EaD8S), plásmido pZUFmA9G8 (que comprende una fusión génica EaD9ES/EgD8M), plásmido pZUFmA9A8 (que comprende una fusión génica EaD9ES/EaD8S) y plásmido pZUFmR9G8 (que comprende una fusión génica E389D9eS/EgD8M). Todos los plásmidos compartían una cadena principal vector común y así fueron distinguidos sólo por la fusión génica que cada uno comprendía.
El análisis funcional de la actividad de cada fusión génica se prueba infra, en el Ejemplo 56.
20 Descripción de los genes sintéticos delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa de codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica
Los solicitantes han realizado considerables Análisis de varias delta-9 elongasas y delta-8 desaturasas, para determinar aquellas enzimas que tienen óptima especificidad por el sustrato y/o selectividad por el sustrato cuando se expresa en Yarrowia lipolytica. Basado en estos análisis, los genes descritos más adelante en la Tabla 32, y los
25 genes de codón optimizado derivados de ellos (basado en la metodología de la patente de EE.UU. 7.125.672), se identificaron como preferidos para expresión en Y. lipolytica. Esos genes resaltados en texto en negrita fueron utilizados posteriormente para crear fusiones génicas de delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa.
Tabla 32
Desaturasas y elongasas preferidas para la creación de fusiones de genes delta-9/delta-8 en Yarrowia
ORF
Organismo Referencias de solicitudes de patente en trámite con la presente Abreviatura del tipo silvestre y Nº de ID de SEC Abreviatura del codón optimizado y Nº de ID de SEC Abreviatura mutante y Nº de ID de SEC
Delta-9 elongasa
Euglena gracilis publicación de patente de EE.UU. 20070117190 A1; véase también el Ejemplo 16 del presente documento "EgD9e"* (ID de SEC Nº: 112) "EgD9eS" (ID de SEC Nº: 318 y 319) -
Eutreptiella sp. CCMP389
publicación de patente de EE.UU. 20070117190 A1; "E389D9e" (ID de SEC Nº: 419 y 420) "E389D9eS" (ID de SEC Nº: 358 y 359) -
Euglena anabaena UTEX 373
Ejemplo 36 del presente documento "EaD9e"* (ID de SEC Nº: 252 y 254) "EaD9eS" (ID de SEC Nº: 421 y 422) -
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Desaturasas y elongasas preferidas para la creación de fusiones de genes delta-9/delta-8 en Yarrowia
ORF
Organismo Referencias de solicitudes de patente en trámite con la presente Abreviatura del tipo silvestre y Nº de ID de SEC Abreviatura del codón optimizado y Nº de ID de SEC Abreviatura mutante y Nº de ID de SEC
Delta-8 desaturasa
Euglena gracilis patente de EE.UU. 7.256.033; publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868 "EgD8"* (ID de SEC Nº: 423 y 424) "EgD8S"* (ID de SEC Nº:425 y 426) "EgD8M"* (ID de SEC Nº: 327 y 328)
Euglena anabaena UTEX 373
"EaD8"* (ID de SEC Nº: 427 y 428) "EaD8S" (ID de SEC Nº: 429 y 430) -
* Notas: • EgD9e se describió como "EgD9elo" en el Ejemplo 16 del presente documento. • EaD9e se identificó como "EaD9Elo1" en el Ejemplo 36 del presente documento. • EgD8 se identificó como "Eg5" en la patente de EE.UU. 7.256.033. • EgD8S se identificó como "D8SF" en la patente de EE.UU. 7.256.033. • EgD8M se identificó como "EgD8S-23" en la publicación de patente de EE.UU. Nº US 2008/0138868.
La eficiencia de transformación de LA a EDA de EgD9eS, E389D9eS y EaD9eS se informa en Cada una de las solicitudes citadas anteriormente. Brevemente, sin embargo, cuando cada delta-9 elongasa era expresada como un gen quimérico en la cepa Y2224 de Yarrowia lipolytica, bajo el control de una promotor FBAINm Yarrowia (publicación PCT Nº WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356) (FIG. 44) y una secuencia terminadora Pex20
5 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes), se midieron de forma independiente las siguientes transformaciones de sustrato: EgD9eS (20,1%); EaD9eS (13%); y E389D9eS (12%) Todos los genes sintéticos de codón optimizado funcionaban con mayor eficiencia de transformación de sustrato que el gen de tipo silvestre correspondiente.
La patente de EE.UU. 7.256.033 describe una E. gracilis delta-8 desaturasa ("EgD8") capaz de desaturar EDA y
10 ETRA a DGLA y ETA, respectivamente, así como una delta-8 desaturasa sintética derivada de EgD8 y de codón optimizado para expresión en Yarrowia lipolytica ("EgD8S"). A pesar de la utilidad de EgD8 y EgD8S, una delta-8 desaturasa mutante diseñada sintéticamente identificada en el presente documento como EgD8M (ID de SEC Nº: 327 y 328) se utiliza en realizaciones más preferidas para expresión en Yarrowia lipolytica. Como se describió en la publicación de patente de EE.UU. Nº 2008/0138868, "EgD8M" (identificada allí como "EgD8S-23") se creó haciendo
15 múltiples rondas de mutaciones dirigidas dentro de EgD8S. El efecto de cada mutación sobre la actividad de delta-8 desaturasa del mutante resultante se cribó para garantizar la equivalencia funcional con la actividad de delta-8 desaturasa de EgD8S (ID de SEC Nº: 426). Como resultado de este trabajo, EgD8M mutante (ID de SEC Nº: 328) comprende las siguientes mutaciones de 24 aminoácidos con respecto a la secuencia sintética EgD8S de codón optimizado expuesta como ID de SEC Nº: 426: 4S a A, 5K a S, 12T a V, 16T a K, 17T a V, 66P a Q, 67S a A, 108S a
20 L, 117G a A, 118Y a F, 120L a M, 121M a L, 125Q a H, 126Ma L, 132V a L, 133 L a V, 162L a V, 163V a L, 293L a M, 407A a S, 408V a Q, 418A a G, 419G a A y 422L a Q. El alineamiento de pares adecuados de las secuencias de proteínas EgD8M y EgD8S utilizando parámetros por defecto del programa AlignX de Vector NTI® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), reveló 94,3% de identidad de secuencia y 97,9% de consenso entre las dos proteínas sobre una longitud de 422 aminoácidos. La transformación promedio de sustrato de EDA a DGLA mediante esta
25 delta-8 desaturasa mutante se determinó que era de 37%, cuando EgD8M se expresaba en la cepa Y4001 de Yarrowia lipolytica (FIG. 44), bajo el control de un promotor FBAINm de Yarrowia (publicación PCT Nº WO 2005/049805; Patente de EE.UU. 7.202.356) y una secuencia de terminador Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes).
Cuando EaD8S se expresaba en la cepa Y4001U de Yarrowia lipolytica (FIG. 44), bajo el control de un promotor
30 FBAINm de Yarrowia (Patente de EE.UU. 7.202.356) y una secuencia terminadora Pex20 a partir del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes), había una eficiencia de transformación de 41% a DGLA con EDA endógena como sustrato.
Generación de constructo pZUFmEgD9ES-Na,.que comprende EgD9ES
El plásmido PZuFmEgD9ES (ID de SEC Nº: 431), que fue descrito previamente en la publicación de patente de 35 EE.UU. 2007-0117190 A1, comprende un gen quimérico FBAINm::EgD9ES::Pex20, un plásmido CoIE1 origen de
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replicación, un gen con resistencia a la ampicilina (AmpR) para selección en E. coli, una secuencia de replicación autónoma de Yarrowia (ARS18; Nº A17608 de acceso al Banco de Genes), y un gen Ura 3 Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes).
Un sitio Nar I se introdujo en pZuFmEgD9ES para generar pZuFmEgD9ES-Na (ID de SEC Nº: 432) utilizando oligonucleótidos YL989 y YL990 (ID de SEC Nº: 433 y 434, respectivamente) como cebadores y pZuFmEgD9ES como molde. El sitio Nar I introducido (es decir, GGCGCC) está situado justo antes del codón de parada de la traducción de EgD9ES; por lo tanto, la región de codificación del EgD9ES se amplió con dos aminoácidos adicionales (es decir, una glicina y una alanina).
Generación de constructo pZUFmG9G8fu, que comprende una fusión génica EgD9ES/EgD8M
La porción N-terminal de EgD8M (ID de SEC Nº: 327) se amplificó por PCR utilizando oligonucleótidos YL991 y YL992 (ID de SEC Nº: 435 y 436, respectivamente) como cebadores y pK02UFm8A. (ID de SEC Nº: 437) como molde. El oligonucleótido YL991 contenía un sitio Nar I en su extremo 5’ y secuencia de ADN que codifica una variante modificada del enlazador rico en prolina EgDHAsyn1 (es decir, GPARPAGLPPATYYDSLAV, como se expone en la ID de SEC Nº: 438 frente a PARPAGLPPATYYDSLAV, como se expone en La ID de SEC Nº: 198) Este enlazador poseía una glicina adicional en el extremo 5’, con respecto al enlazador rico en prolina EgDHAsyn1 (ID de SEC Nº: 198).
El NarI/BgIIl digirió el producto de PCR que comprende la porción 5’ de EgD8M y el BglII/NotI digirió el fragmento de pKO2UFm8A que comprende la porción 3’ de EgD8M se utilizó para reemplazar el fragmento NarI/NotI de pZUFmEgD9ES-Na para generar pZUFmG9G8fu (FIG. 55A), que de ese modo contenía los siguientes componentes:
Tabla 33
Componentes del plásmido pZUFmG9G8fu (ID de SEC Nº: 439)
Sitios de RE y nucleótidos dentro de la ID de SEC Nº:439
Descripción de los componentes de fragmentos y genes quiméricos
Swa I/BsiW I (6067-318)
FBAINm EgD9ES/EgD8M Pex20, que comprende: • FBAINm: promotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (WO 2005/049805; patente de EE.UU. 7.202.356); • EgD9ES/EgD8M: fusión de genes que comprende delta-9 elongasa (EgD9ES) de codón optimizado de Euglena gracilis, un enlazador modificado derivado de EgDHAsyn1, y la delta-8 desaturasa mutante sintética derivada de Euglena gracilis (EgD8M) (EgD8M es etiquetado como "EgD8-23" en the Figura) (la secuencia de nucleótidos de l fusión de genes de longitud completa se expone en ID de SEC Nº: 440, mientras que la secuencia de aminoácidos traducida se expone como ID de SEC Nº: 441); • Pex20: secuencia de terminación Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (Nº AF054613 de acceso al Banco de Genes);
1354-474
Plásmido Co1E1 origen de replicación
2284-1424
Gen resistente a la ampicilina (AmpR) para selección en E. coli
3183-4487
Secuencia de replicación autónoma de Yarrowia (ARS18; Nº A17608 de acceso al Banco de Genes)
6020-4533
Gen Ura3 de Yarrowia (Nº AJ306421 de acceso al Banco de Genes)
Generación de constructo pZuFmG9G8fu-B, que comprende una fusión génica EgD9ES un/EgD8M
Un sitio BamHI (es decir, GGATCC) se introdujo en pZUFmG9G8fu para generar pZUFmG9G8fu-B (ID de SEC Nº: 442) utilizando los oligonucleótidos y YL1043 e YL1044 (ID de SEC Nº: 443 y 444, respectivamente) como cebadores y pZuFmG9G8fu como molde. El sitio BamHI está situado justo después del codón de iniciación de la traducción ATG y estaba en el marco de lectura de EgD8M, que dio como resultado una inserción de dos aminoácidos (es decir, glicina y serina) entre el resto de aminoácido metionina y la porción restante del polipéptido EgD8M. Esta modificación hizo que la región enlazadora entre EgD9ES y EgD8M se transformara en un péptido que tiene la secuencia expuesta como ID de SEC Nº: 445 (es decir, GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS); el nucleótido y la secuencia de aminoácidos traducida de la longitud completa de la fusión génica EgD9ES/EgD8M se expone como ID de SEC Nº: 446 y 447, respectivamente.
Generación de constructo pZUFmG9A8, que comprende una fusión génica EgD9ES/EaD8S
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El plásmido pKR1183 (ID de SEC Nº: 266) que comprende la fusión de Euglena anabaena delta-9 elongasa-Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 delta-8 desaturasa (Híbrido1-HGLA sintasa; también denominada EaD9e/TpomD8) fue descrito en el Ejemplo 38.
Otros plásmidos descritos en el presente Ejemplo incluyen: pKR1014 (descrito en la publicación de patente de
5 EE.UU. Nº US 2008/0095915 (presentada el 22 de octubre de 2007; Expediente Fiscal Nº BB-1574; que comprende EgD9e y TpomD8 expresados de forma individual), pKR1152 (que comprende un EgD9e y EaD8 expresados de forma individual), pKR1151 (que comprende un EaD9e y TpomD8 expresados de forma individual), pKR1150 (que comprende un EaD9e y EaD8 expresados de forma individual), pKR1184 (que comprende una fusión génica EaD9e/EaD8), pKR1199 (que comprende una fusión génica EgD9e/TpomD8) y pKR1200 (que comprende una
10 fusión génica EgD9e/EaD8). Un compendio de los constructos elaborados y de los respectivos genes ensayados junto con las ID de SEC Nº para el nucleótido y las secuencias de aminoácidos producidos se muestra en la Tabla
35.
El análisis funcional de la actividad de cada fusión génica se ensaya infra, en el Ejemplo 60.
Tabla 35
Desaturasas y elongasas preferidas para la creación de fusiones génicas Delta-9/Delta-8 en soja
Vector
Vector ID de SEC Nº Gen (o genes) expresados ID de SEC Nº para secuencia (o secuencias) de nucleótidos ID de SEC Nº para secuencias de aminoácidos
pKR1014
ID de SEC Nº: 474 EgD9e TpomD8 ID de SEC Nº: 112 ID de SEC Nº: 162 ID de SEC Nº: 513 ID de SEC Nº: 514
pKR1152
ID de SEC Nº: 479 EgD9e EaD8 ID de SEC Nº: 112 ID de SEC Nº: 427 ID de SEC Nº: 513 ID de SEC Nº: 428
pKR1151
ID de SEC Nº: 484 EaD9e TpomD8 ID de SEC Nº: 252 ID de SEC Nº: 162 ID de SEC Nº: 254 ID de SEC Nº: 514
pKR1150
ID de SEC Nº: 485 EaD9e EaD8 ID de SEC Nº: 252 ID de SEC Nº: 427 ID de SEC Nº: 254 ID de SEC Nº: 428
pKR1199
ID de SEC Nº: 488 fusión EgD9e/TpomD8 ID de SEC Nº: 492 ID de SEC Nº: 515
pKR1200
ID de SEC Nº: 490 fusión EgD9e/EaD8 ID de SEC Nº: 493 ID de SEC Nº: 516
pKR1183
ID de SEC Nº: 266 fusión EaD9e/TpomD8 ID de SEC Nº: 494 ID de SEC Nº: 517
pKR1184
ID de SEC Nº: 491 fusión EaD9e/EaD8 ID de SEC Nº: 495 ID de SEC Nº: 518
KS373
ID de SEC Nº: 179 fusión EgD9e/PavD8 ID de SEC Nº: 496 ID de SEC Nº: 519
15 Construcción de pKR1014
Vector pKR123r, que fue descrito previamente en la publicación PCT Nº WO 2004/071467 (publicado el 26 de agosto de 2004), contiene un sitio NotI flanqueado por el promotor inhibidor de tripsina de soja Kunitz (KTi3) (Jofuku et al., Plant Cell 1:1079-1093 (1989)) y región de terminación KTi3', cuyo aislamiento se describe en la patente de EE.UU. Nº 6.372.965 (casete KTi3/NotI/KTi3’). TpomD8 (ID de SEC Nº: 162; Ejemplo 21) se liberó a partir de
20 pLF114-10 (ID de SEC Nº: 165; Ejemplo 21) por digestión con NotI y se clonó en el sitio NotI de pKR123r para producir pKR1007 (ID de SEC Nº: 473).
El vector pKR912, que se describió anteriormente en el documento US-2007-0118929-A1 y publicado el 24 de mayo de 2007, contiene el gen higromicina B fosfotransferasa, flanqueado por el promotor 35S (Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985)) y terminador de la transcripción NOS 3’ (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:561-570 (1982))
25 (casete 35S/HPT/NOS3') para la selección en plantas tal como soja. El vector pKR912 contiene también EgD9e (ID de SEC Nº: 112), flanqueado por el promotor para la subunidad ’ de β-conglicinina (Beachy et al., EMBO J. 4: 3047-3053 (1985)) y la región 3’ de terminación de la transcripción del gen de la faseolina (Doyle et al., J. Biol. Chem. 261:9228-9238 (1986)), permitiendo así fuerte expresión específica de tejido de EgD9e en las semillas de soja.
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Claims (1)

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