JP2010523113A - マルチザイム（ｍｕｌｔｉｚｙｍｅ）および多価不飽和脂肪酸の製造におけるその使用 - Google Patents

マルチザイム（ｍｕｌｔｉｚｙｍｅ）および多価不飽和脂肪酸の製造におけるその使用 Download PDF

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Abstract

単離核酸断片およびマルチザイム（すなわち少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチド）をコードするかかる断片を含む組換えコンストラクトと、植物および油性酵母内で長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）をこれらのマルチザイムを用いて製造する方法が開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００７年４月３日に出願された米国仮特許出願第６０／９０９７９０号明細書および２００８年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／０２７８９８号明細書の優先権を主張するものであり、これらの開示内容はそれら全体が本明細書中に援用される。
本発明はバイオテクノロジーの分野に含まれる。より詳細には、本発明はマルチザイムをコードするポリヌクレオチド配列および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の合成におけるその使用に関する。
ＰＵＦＡの重要性については議論の余地がない。例えば、特定のＰＵＦＡは、健常細胞の重要な生物学的成分であり、哺乳類において新規に合成できず、その代わりに食餌中に得られるか、あるいは、リン脂質またはトリアシルグリセロールなどの形態で見出されうる場合での細胞の原形質膜の構成物質であり、適切な発生（特に乳児脳の発生）や組織形成および修復にとって必要であり、かつ哺乳類において重要な数種の生物活性のあるエイコサノイド（例えば、プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン）に対する前駆体であるリノール酸（ＬＡ；１８：２ ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ；１８：３ ω−３）のさらなる伸長および脱飽和により誘導される必要がある「必須」脂肪酸として理解されている。さらに、長鎖ω−３ ＰＵＦＡの高摂取により、心血管保護効果がもたらされる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。極めて多数の他の研究では、種々の症状および疾患（例えば、喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対する、ω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡの投与により得られる広範囲の健康上の利益についての記載がなされている。
今日、植物、藻、真菌、および酵母を含む種々の異なる宿主が、極めて多種多様な効果を通じた商業的なＰＵＦＡ生成のための手段として検討されつつある。宿主生物の天然のＰＵＦＡ生成能が時として所与の方法にとって必須であるが、遺伝子工学により一部の宿主が天然に有する能力（ＬＡおよびＡＬＡといった脂肪酸の生成に元来限定されるものであっても）を実質的に改変する結果、様々な長鎖ω−３／ω−６ ＰＵＦＡが高レベルに生成されうることが判明している。この効果が天然の能力であるかまたは組換え技術の結果であるかにかかわらず、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４ ω−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５ ω−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６ ω−３）の全部が、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（一部の生物内、例えばユーグレナ種内で機能し、かつエイコサジエン酸（ＥＤＡ；２０：２ ω−６）および／またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ；２０：３ ω−３）の生成により特徴づけられる）あるいはΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路（主に藻、コケ、真菌、線虫およびヒトにおいて見出され、かつγ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３ ω−６）および／またはステアリドン酸（ＳＴＡ；１８：４ ω−３）の生成により特徴づけられる）のいずれかの発現を必要とする（図１）。Δ６エロンガーゼはＣ１８／２０エロンガーゼとしても知られる。
これまで同定されたΔ８デサチュラーゼ酵素は、ＥＤＡからジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ（ＨＧＬＡとしても知られる）；２０：３、ｎ−６）およびＥｔｒＡからエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４、ｎ−３）の双方を変換する能力を有する。次いで、ＡＲＡおよびＥＰＡが、Δ５デサチュラーゼとの反応後、それぞれＤＧＬＡおよびＥＴＡから合成される。しかし、ＤＨＡの合成には、それに続く追加的なＣ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼの発現が必要である。これまで同定された大部分のＣ２０／２２エロンガーゼが、ＥＰＡからＤＰＡに変換する一次的能力をアラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４ ω−６）からドコサテトラエン酸（ＤＴＡ；２２：４ ω−６）への変換における二次的活性とともに有する一方、これまで同定された大部分のΔ４デサチュラーゼ酵素はＤＰＡからＤＨＡに変換する一次的能力をドコサテトラエン酸（ＤＴＡ；２２：４ ω−６）からω−６ドコサペンタエン酸（ＤＰＡｎ−６；２２：５ ω−６）への変換における二次的活性とともに有する。
Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ酵素がＤＨＡの合成に関与するという役割に基づき、様々な供給源に由来するこれらの酵素を同定しかつ特徴づけるために多大な努力がなされている。そのようなものとして、極めて多数のＣ２０／２２エロンガーゼが広範な文献および特許文献の双方で開示されている（例えば、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＶ３３６３０）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＶ６７７９８）およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＶ６７８００））。同様に、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ１９６０５；Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２（３２）：９７７９−９７８８頁（２００３年））；タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（配列番号２９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６；非特許文献５）；スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）（配列番号２７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＮ７５７０７）；スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＤ４２４９６；特許文献１）；シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）（配列番号２８；特許文献２）；パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ９８７９３）；およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（配列番号３０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＶ３３６３１；非特許文献６；特許文献３）といったΔ４デサチュラーゼが開示されている。
出願人は、油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））内でのＰＵＦＡの生成に関する多数の特許出願を有し、それには、例えば特許文献４および５；特許文献６；特許文献７；特許文献８が含まれる。
それに関連し、特許文献９が植物内でのＰＵＦＡの生成に関する一方、特許文献１０はアネキシンプロモーターおよび植物内でのトランス遺伝子の発現におけるその使用に関する。いずれも出願人同時係属出願である。
米国特許第７，０８７，４３２号明細書 ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット 米国特許第７，２３８，４８２号明細書 米国特許第７，１２５，６７２号明細書 米国特許出願第１１／２６５，７６１号明細書（２００５年１１月２日出願） 米国特許出願第１１／２６４，７８４号明細書（２００５年１１月１日出願） 米国特許出願第１１／２６４，７３７号明細書（２００５年１１月１日出願） ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット（２００４年８月２６日公開） ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレット（２００４年８月２６日公開）
Ｄｙｅｒｂｅｒｇら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２８：９５８−９６６頁（１９７５年） Ｄｙｅｒｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ．２（８０８１）：１１７−１１９頁（１９７８年） Ｓｈｉｍｏｋａｗａ Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ ８８：１００−１０８頁（２００１年） ｖｏｎ Ｓｃｈａｃｋｙら、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ ８８：９０−９９頁（２００１年） Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２（１３）：３４０１−３４１２頁（２００５年） Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８４（２）：３５７−３６６頁（２００４年）
本発明は、少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチドを含むマルチザイムに関する。
第２の実施形態では、マルチザイムの酵素活性は、脂肪酸エロンガーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡシンターゼ、およびチオエステラーゼからなる群から選択されうる。より詳細には、酵素活性は少なくとも１つの脂肪酸デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸エロンガーゼを含みうる。
第３の実施形態では、マルチザイムは第２の酵素活性に連結された第１の酵素活性を含む可能性があり、前記連結はポリペプチド結合、配列番号１９８（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号２００（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２リンカー）、配列番号２３５（ＥａＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号４３８、配列番号４４５、配列番号４７２、および配列番号５０４からなる群から選択される。
第４の実施形態では、本発明は、
（ａ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、ＤＨＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第５の実施形態では、本発明は、ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここでヌクレオチド配列は配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０を含む、ポリヌクレオチドに関する。
第６の実施形態では、本発明は、ＤＨＡシンターゼ活性を有する本発明のポリペプチドであって、ここでポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７を含む、ポリペプチドに関する。
第７の実施形態では、本発明は、
（ａ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２０２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０４（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２３１（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２３２（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、または配列番号２３３（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０６（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２７（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２８（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２９（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、または配列番号２３０（ＥａＤＨＡｓｙｎ４ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０６（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２７（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２８（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２９（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）または配列番号２３０（ＥａＤＨＡｓｙｎ４ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、Ｃ２０エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第８の実施形態では、本発明は、
（ａ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１９３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４０４、配列番号４０６または配列番号４０８で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１９２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５；配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、Δ４デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第９の実施形態では、本発明は、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０のいずれかで示される配列を含む、ＤＨＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第１０の実施形態では、本発明は、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０６（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２７（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２８（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２９（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、または配列番号２３０（ＥａＤＨＡｓｙｎ４ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）のいずれかで示される配列を含む、Ｃ２０エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第１１の実施形態では、本発明は、配列番号１９２、配列番号２１４、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示される配列を含む、Δ４デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第１２の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された本発明の単離ポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えコンストラクトに関する。
第１３の実施形態では、本発明は、宿主細胞であって、そのゲノム内に本発明の組換えコンストラクトを含む、宿主細胞に関する。より詳細には、宿主細胞は、本発明のマルチザイムを含む組換え微生物宿主細胞であり、ここで第１の酵素活性はΔ９エロンガーゼでありかつ第２の酵素活性はΔ８デサチュラーゼである。別の態様では、第１の酵素活性はＣ２０エロンガーゼでありかつ第２の酵素活性はΔ４デサチュラーゼである。
第１４の実施形態では、本発明は、本発明の組換えコンストラクトを含む形質転換ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）に関する。
第１５の実施形態では、本発明は、細胞を形質転換するための方法であって、細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換するステップと、前記組換えコンストラクトで形質転換された細胞を選択するステップと、を含む、方法に関する。
第１６の実施形態では、本発明は、形質転換植物を生成するための方法であって、植物細胞を本発明のポリヌクレオチドのいずれかで形質転換するステップと、植物を形質転換植物細胞から再生するステップと、を含む、方法に関する。
第１７の実施形態では、本発明は、酵母を生成するための方法であって、酵母細胞を本発明のポリヌクレオチドのいずれかで形質転換するステップと、酵母を形質転換酵母細胞から成長させるステップと、を含む、方法に関する。
第１８の実施形態では、本発明は、植物であって、そのゲノム内に本発明の組換えコンストラクトを含む、植物に関する。また、かかる植物から得られる種子、かかる種子から得られるオイル、かかるオイルを含有する食料または飼料、および本発明のオイルを含有する飲料は興味深い。
第１９の実施形態では、本発明は、少なくとも１４７個のコドンがヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）内での発現のためにコドン最適化される、配列番号１８３で示されるＣ２０エロンガーゼをコードする単離核酸分子に関する。
第２０の実施形態では、本発明は、少なくとも１３４個のコドンがヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）内での発現のためにコドン最適化される、配列番号１８８で示されるＣ２０エロンガーゼをコードする単離核酸分子に関する。
第２１の実施形態では、本発明は、少なくとも２８５個のコドンがヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）内での発現のためにコドン最適化される、配列番号１９２で示されるΔ４デサチュラーゼ酵素をコードする単離核酸分子に関する。
第２２の実施形態では、本発明は、マルチザイムを製造するための方法であって、
（ａ）第１のポリペプチドを少なくとも第２のポリペプチドと連結させるステップと、ここで各ポリペプチドは独立しかつ分離可能な酵素活性を有し；
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物の独立しかつ分離可能な酵素活性について評価するステップと、
を含む、方法に関する。
第２３の実施形態では、本発明は、油料種子植物の脂肪酸特性を改変するための方法であって、
（ａ）油料種子植物細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の形質転換された油料種子植物細胞から植物を再生するステップと、
を含み、ここで植物は改変された脂肪酸特性を有する、方法に関する。
第２４の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号４４１、配列番号４５４、配列番号４６１、配列番号４６４、配列番号４７１、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、または配列番号５１９で示される、ＤＧＬＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４４０、配列番号４４６、配列番号４５３、配列番号４６０、配列番号４６３、配列番号４７０、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、または配列番号４９６で示される、ＤＧＬＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号４４０、配列番号４４６、配列番号４５３、配列番号４６０、配列番号４６３、配列番号４７０、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、または配列番号４９６で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＤＧＬＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、ＤＧＬＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
第２５の実施形態では、本発明は、リノール酸をジホモγ−リノレン酸に変換するための方法であって、
ａ）組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、
ｉ）１）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
２）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
３）Δ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
を含むＤＧＬＡシンターゼと、
ｉｉ）リノール酸の供給源と、
を含むステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をジホモγ−リノレン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
を含む、方法に関する。
第２６の実施形態では、本発明は、α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換するための方法であって、
ａ）組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、
ｉ）１）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
２）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
３）Δ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
を含むＤＧＬＡシンターゼと、
ｉｉ）α−リノレン酸の供給源と、
を含むステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をエイコサトリエン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
を含む、方法に関する。
第２７の実施形態では、本発明は、エイコサペンタエン酸をドコサヘキサエン酸に変換するための方法であって、
ａ）組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、
ｉ）１）Ｃ２０エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
２）Δ４デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
３）Ｃ２０エロンガーゼとΔ４デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
を含むＤＨＡシンターゼと、
ｉｉ）エイコサペンタエン酸の供給源と、
を含むステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をドコサヘキサエン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
を含む、方法に関する。
第２８の実施形態では、本発明は、アラキドン酸をドコサペンタエン酸に変換するための方法であって、
ａ）組換え微生物宿主細胞を提供するステップであって、
ｉ）１）Ｃ２０エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
２）Δ４デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
３）Ｃ２０エロンガーゼとΔ４デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
を含むＤＨＡシンターゼと、
ｉｉ）アラキドン酸の供給源と、
を含むステップと、
ｂ）（ａ）の宿主細胞をドコサペンタエン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
を含む、方法に関する。
第２９の実施形態では、本発明は、改善されたΔ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドを同定するための方法であって、
ａ）ベースラインのΔ４デサチュラーゼ活性を有するユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離される野生型Δ４デサチュラーゼポリペプチドを提供するステップと、
ｂ）（ａ）の野生型ポリペプチドから約１〜約２００個のアミノ酸を切断し、ベースラインのΔ４デサチュラーゼ活性よりも増大したΔ４デサチュラーゼ活性を有する切断型突然変異ポリペプチドを製造するステップと、
を含む、方法に関する。
第３０の実施形態では、本発明は、多価不飽和脂肪酸を生成し、かつ連続経路内で
１）Δ９デサチュラーゼ、
２）Δ１２デサチュラーゼ、
３）Δ９エロンガーゼ、
４）Δ８デサチュラーゼ、
５）Δ５デサチュラーゼ、
６）Δ１７デサチュラーゼ、
７）Ｃ２０／２２エロンガーゼ、および
８）Δ４デサチュラーゼ；
といった酵素をコードするポリペプチドを発現する微生物宿主細胞であって、ここでポリペプチドは少なくとも１つのマルチザイムを含み、融合体は少なくとも１つの連続的な酵素対の間での融合体を含む、微生物宿主細胞に関する。
生物学的寄託
以下の生物学的材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ） ２０１１０−２２０９に寄託されており、以下の名称、登録番号および寄託日を有する（表１）。
Figure 2010523113
図面および配列表の簡単な説明
本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明および添付の図面ならびに配列表からより十分に理解されうる。
様々な中間体を介するミリスチン酸からＤＨＡへの変換をもたらす代表的なω−３およびω−６脂肪酸経路である。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２１）のコード配列の一部、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２３）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＹ２７８５５８（ＧＩ３３４６６３４５）、遺伝子座ＡＹ２７８５５８、Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（３２）：９７７９−９７８８頁（２００３年））のｃＤＮＡ配列、およびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２４）（Ｍｅｙｅｒら、上記）のコード配列の間でのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）、およびＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号６）のアミノ酸配列の間でのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）、およびＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号６）のアミノ酸配列の間でのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）のＮ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）のＮ末端と、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号６）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）ＰＵＦＡエロンガーゼ２（配列番号２５）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ６７７９８（ＧＩ５５８５２３９６）、遺伝子座ＡＡＶ６７７９８、ＣＤＳ ＡＹ５９１３３６；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｄ Ｒｅｓ．４５（１０）：１８９９−１９０９頁（２００４年））、およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＰＵＦＡエロンガーゼ２（配列番号２６）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ６７８００（ＧＩ５５８５２４４１）、遺伝子座ＡＡＶ６７８００、ＣＤＳ ＡＹ５９１３３８；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｄ Ｒｅｓ．４５（１０）：１８９９−１９０９頁（２００４年））のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）のＮ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）のＮ末端と、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号６）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）ＰＵＦＡエロンガーゼ２（配列番号２５）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ６７７９８（ＧＩ５５８５２３９６）、遺伝子座ＡＡＶ６７７９８、ＣＤＳ ＡＹ５９１３３６；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｄ Ｒｅｓ．４５（１０）：１８９９−１９０９頁（２００４年））、およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＰＵＦＡエロンガーゼ２（配列番号２６）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ６７８００（ＧＩ５５８５２４４１）、遺伝子座ＡＡＶ６７８００、ＣＤＳ ＡＹ５９１３３８；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｄ Ｒｅｓ．４５（１０）：１８９９−１９０９頁（２００４年））のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＣＴ；配列番号１２のアミノ酸２５３〜７９３；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＴ；配列番号２２のアミノ酸２５３〜７９３、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端と、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２７）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＮ７５７０７（ＧＩ２５９５６２８８）、遺伝子座ＡＡＮ７５７０７、ＣＤＳ ＡＦ３９１５４３）、シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２８）（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２９）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＸ１４５０６（ＧＩ６０１７３０１７）、遺伝子座ＡＡＸ１４５０６、ＣＤＳ ＡＹ８１７１５６；Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（１３）：３４０１−３４１２頁（２００５年））、およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号３０）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３１（ＧＩ５４３０７１１０）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３１、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７４；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８４（２）：３５７−３６６頁（２００４年）およびＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＣＴ；配列番号１２のアミノ酸２５３〜７９３；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＴ；配列番号２２のアミノ酸２５３〜７９３、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端と、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２７）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＮ７５７０７（ＧＩ２５９５６２８８）、遺伝子座ＡＡＮ７５７０７、ＣＤＳ ＡＦ３９１５４３）、シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２８）（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２９）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＸ１４５０６（ＧＩ６０１７３０１７）、遺伝子座ＡＡＸ１４５０６、ＣＤＳ ＡＹ８１７１５６；Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（１３）：３４０１−３４１２頁（２００５年））、およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号３０）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３１（ＧＩ５４３０７１１０）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３１、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７４；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８４（２）：３５７−３６６頁（２００４年）およびＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＣＴ；配列番号１２のアミノ酸２５３〜７９３；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＴ；配列番号２２のアミノ酸２５３〜７９３、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端と、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２７）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＮ７５７０７（ＧＩ２５９５６２８８）、遺伝子座ＡＡＮ７５７０７、ＣＤＳ ＡＦ３９１５４３）、シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２８）（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２９）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＸ１４５０６（ＧＩ６０１７３０１７）、遺伝子座ＡＡＸ１４５０６、ＣＤＳ ＡＹ８１７１５６；Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（１３）：３４０１−３４１２頁（２００５年））、およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号３０）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３１（ＧＩ５４３０７１１０）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３１、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７４；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８４（２）：３５７−３６６頁（２００４年）およびＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＣＴ；配列番号１２のアミノ酸２５３〜７９３；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＴ；配列番号２２のアミノ酸２５３〜７９３、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のＮ末端は示されず、「…」で示される）のＣ末端と、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２７）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＮ７５７０７（ＧＩ２５９５６２８８）、遺伝子座ＡＡＮ７５７０７、ＣＤＳ ＡＦ３９１５４３）、シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２８）（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２９）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＸ１４５０６（ＧＩ６０１７３０１７）、遺伝子座ＡＡＸ１４５０６、ＣＤＳ ＡＹ８１７１５６；Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（１３）：３４０１−３４１２頁（２００５年））、およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号３０）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３１（ＧＩ５４３０７１１０）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３１、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７４；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３８４（２）：３５７−３６６頁（２００４年）およびＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 （相同性に基づいて）Ｃ２０エロンガーゼ領域およびΔ４デサチュラーゼドメインの双方に及ぶＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＮＣＴ；配列番号１２のアミノ酸２５３〜３６５）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＮＣＴ；配列番号２２のアミノ酸２５３〜３６５）の内部断片と、Ｃ２０エロンガーゼのＣ末端（ＥｇＣ２０ｅｌｏ１_ＣＴ、配列番号６のアミノ酸２４６〜２９８；ＰａｖＣ２０ｅｌｏ_ＣＴ、配列番号２のアミノ酸２４０〜２７７；ＯｔＰＵＦＡｅｌｏ２_ＣＴ、配列番号２５のアミノ酸２５６〜３００；ＴｐＰＵＦＡｅｌｏ２_ＣＴ、配列番号２６のアミノ酸２７９〜３５８）およびΔ４デサチュラーゼのＮ末端（ＥｇＤ４_ＮＴ、配列番号１３のアミノ酸１〜１１６；ＴａＤ４_ＮＴ、配列番号２７のアミノ酸１〜４７；ＳａＤ４_ＮＴ、配列番号２８のアミノ酸１〜４７；ＴｐＤ４_ＮＴ、配列番号２９のアミノ酸１〜８２；ＩｇＤ４_ＮＴ、配列番号３０のアミノ酸１〜４３）とのアラインメントを示す。 （Ａ）ｐＹ１１５（配列番号３３も参照）；（Ｂ）ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターｐＢＹ１（配列番号３４も参照）；（Ｃ）ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターｐＹ１５９（配列番号３８も参照）；および（Ｄ）ｐＢＹ−ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号３９も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＹ１３２（配列番号４０も参照）；（Ｂ）ｐＹ１６１（配列番号４１も参照）；（Ｃ）ｐＹ１６４（配列番号４２も参照）；および（Ｄ）ｐＹ１４１（配列番号４９も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＹ１４３（配列番号５２も参照）；（Ｂ）ｐＹ１４９（配列番号５５も参照）；（Ｃ）ｐＹ１５０（配列番号６２も参照）；および（Ｄ）ｐＹ１５６（配列番号６４も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＹ１５２（配列番号６７も参照）；（Ｂ）ｐＹ１５７（配列番号６９も参照）；（Ｃ）ｐＹ１５３（配列番号７２も参照）；および（Ｄ）ｐＹ１５１（配列番号７６も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 ｐＹ１６０（配列番号７７も参照）のマップである。 実施例に記載のユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）細胞抽出物の脂質特性のクロマトグラムを示す。 ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）におけるアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）におけるアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）におけるアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。 （Ａ）ｐＹ１６５（配列番号９９も参照）；（Ｂ）ｐＹ１６６（配列番号１００も参照）；（Ｃ）ｐＹ１６７（配列番号１０１も参照）；および（Ｄ）ｐＹ１６８（配列番号１０２も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＫＲ１０６１（配列番号１１１も参照）；（Ｂ）ｐＫＲ９７３（配列番号１２８も参照）；（Ｃ）ｐＫＲ１０６４（配列番号１３２も参照）；および（Ｄ）ｐＫＲ１１３３（配列番号１４５も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＫＲ１１０５（配列番号１５６も参照）；（Ｂ）ｐＫＲ１１３４（配列番号１６１も参照）；（Ｃ）ｐＫＲ１０９５（配列番号１６７も参照）；および（Ｄ）ｐＫＲ１１３２（配列番号１７０も参照）におけるプラスミドマップを提供する。 ＫＳ３７３（配列番号１７９も参照）のマップである。 表２４に示されるクローン（ｐＢＹ−ＥｇＣ２０ｅｌｏ１以外）における脂肪酸特性、計算されたパーセント伸長、および計算されたパーセント脱飽和を示す。 ＥＰＡをｐＹ１４１、ｐＹ１４３、ｐＹ１４９、ｐＹ１５６、ｐＹ１５７、およびｐＹ１６０のベクターのみ（対照）（ｖｅｃｔｏｒ ｏｎｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）に供給するための脂肪酸特性、計算されたパーセント伸長、および計算されたパーセント脱飽和を示す。 ＤＰＡをｐＹ１４１、ｐＹ１５０、ｐＹ１５１、ｐＹ１５２、ｐＹ１５３、ｐＹ１５６、ｐＹ１５７、およびｐＹ１６０のベクターのみ（対照）に供給するための脂肪酸特性、計算されたパーセント伸長、および計算されたパーセント脱飽和を示す。 表２５に示される各コンストラクトにおける相対的なドメイン構造の略図を示す。 ＥＰＡ、ＡＲＡ、およびＤＰＡを、ｐＹ１４１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１；配列番号４９）で形質転換されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞と、ベクターのみ（対照）とに供給するための脂肪酸特性、計算されたパーセント伸長、および計算されたパーセント脱飽和を示す。 大豆発現ベクターｐＫＲ９７３およびｐＫＲ１０６４（表２６を参照）で形質転換された大豆不定胚内での代表的事象からの各胚における脂肪酸特性を示す。 大豆発現ベクターＫＳ３７３で形質転換された大豆胚内での５つの最高の伸長事象からの脂肪酸特性を示す。 ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（実施例３）、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（実施例４）、およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（実施例５）についてのＢＬＡＳＴＰおよび同一性パーセント値をまとめる。 大豆胚へのＥＰＡの供給から得られる脂肪酸特性を示す。大豆胚は、大豆発現ベクターｐＫＲ１１０５で形質転換された大豆胚内での最高のＣ２０／Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性から選択された。 実施例に記載のようにユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）細胞抽出物の脂質特性のクロマトグラムを示す。 ｐＫＲ１１８３（配列番号２６６も参照）のマップである。 ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＤＨＡシンターゼドメイン配列をまとめる。 ｐＫＲ１２５３（配列番号２７０も参照）のマップである。 ｐＫＲ１２５５（配列番号２７５も参照）のマップである。 ｐＫＲ１１８９（配列番号２８５も参照）のマップである。 ｐＫＲ１２２９（配列番号２９６も参照）のマップである。 ｐＫＲ１２４９（配列番号２９７も参照）のマップである。 ｐＫＲ１３２２（配列番号３１４も参照）のマップである。 この実験における野生型胚に特有の脂肪酸特性を有する事象（２１４８−３−８−１）とともに最低の平均ＡＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１８９で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、およびＡＬＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。 最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１８３で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。 最高のＡＲＡを有するｐＫＲ１２４９およびｐＫＲ１２５３で形質転換された２０の事象における平均脂肪酸特性（１０の大豆不定胚の平均）を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。「その他」として挙げられる脂肪酸は、１８：２（５，９）、１８：３（５，９，１２）、ＳＴＡ、２０：０、２０：１（１１）、２０：２（７，１１）または２０：２（８，１１）、およびＤＰＡを含む。 １７．０％の平均ＡＲＡ含量および１．５％の平均ＥＰＡ含量を有する１つの事象（ＡＦＳ５４１６−８−１−１）から得られる各大豆不定胚における実際の脂肪酸特性を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。「その他」として挙げられる脂肪酸は、１８：２（５，９）、１８：３（５，９，１２）、ＳＴＡ、２０：０、２０：１（１１）、２０：２（７，１１）または２０：２（８，１１）、およびＤＰＡを含む。 最高のＡＲＡを有するｐＫＲ１２４９およびｐＫＲ１２５５で形質転換された２０の事象における平均脂肪酸特性（９または１０の大豆不定胚の平均）を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。「その他」として挙げられる脂肪酸は、１８：２（５，９）、１８：３（５，９，１２）、ＳＴＡ、２０：０、２０：１（１１）、２０：２（７，１１）または２０：２（８，１１）、およびＤＰＡを含む。 胚へのＥＰＡの供給から得られる脂肪酸特性を示す。大豆胚は、大豆発現ベクターｐＫＲ１１３４で形質転換された大豆胚内での最高のＣ２０／Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性を伴う事象から選択された。図４１における脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＰＡ、２２：０（ドコサン酸）、ＤＰＡ、２４：０（テトラコサン酸）、ＤＨＡ、および２４：１（ネルボン酸）として同定される。図４１中に挙げられる脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。 大豆胚へのＥＰＡの供給から得られる脂肪酸特性を示す。大豆胚は、ｐＫＲ１１０５で形質転換された大豆について分析された２０の新しい事象からの最高のＣ２０／Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性を伴う事象から選択された。図４２における脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＰＡ、２２：０（ドコサン酸）、ＤＰＡ、２４：０（テトラコサン酸）、ＤＨＡ、および２４：１（ネルボン酸）として同定される。図４２中に挙げられる脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。 大豆胚へのＥＰＡの供給時、ｐＫＲ１１０５（個別に発現されたＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ）またはｐＫＲ１１３４（融合体として発現されたＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ）のいずれかで形質転換された事象の相対的活性を図示したグラフを示す。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３の作成を図示する。 （Ａ）ｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３および（Ｂ）ｐＹ１１６におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＫＯ２ＵＦ８２８９および（Ｂ）ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒにおけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕおよび（Ｂ）ｐＹ１１７におけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＰ２−２９８８および（Ｂ）ｐＺＫＵＥ３Ｓにおけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣおよび（Ｂ）ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃにおけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＫＵＭおよび（Ｂ）ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２におけるプラスミドマップを提供する。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕの作成を図示する。 ｐＥｇＣ２０ＥＳにおけるプラスミドマップを提供する。 ｐＺＵＦｍＥｇＣ２０ＥＳにおけるプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４におけるプラスミドマップを提供する。 ＥａＣ２０Ｅドメイン（配列番号２３１）の３’領域とＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）内のＥａＤ４ドメイン（配列番号２４６）の５’領域との重なりを示す略図である。 ＥａＤ４Ｓ（配列番号１９３）、ＥａＤ４Ｓ−１（配列番号３８２）、ＥａＤ４Ｓ−２（配列番号３８４）、およびＥａＤ４Ｓ−３（配列番号３８６）のＮ末端間でのアラインメントを示す。 ＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８８）、ＥｇＤ４Ｓ−１（配列番号４０４）、ＥｇＤ４Ｓ−２（配列番号４０６）、およびＥｇＤ４Ｓ−３（配列番号４０８）のＮ末端間でのアラインメントを示す。 （Ａ）ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４、（Ｂ）ｐＥｇＣ２０ＥＳ−Ｋ、（Ｃ）ｐＹＮＴＧＵＳ１−ＣＮＰ、および（Ｄ）ｐＺＫＬＹにおけるプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕおよび（Ｂ）ｐＺＵＦｍＧ９Ａ８におけるプラスミドマップを提供する。 ｐＫＲ１０１４のマップである。 ｐＫＲ１１５２のマップである。 ｐＫＲ１１５１のマップである。 ｐＫＲ１１５０のマップである。 ｐＫＲ１１９９のマップである。 ｐＫＲ１２００のマップである。 ｐＫＲ１１８４のマップである。 ｐＫＲ１３２１のマップである。 ｐＫＲ１３２６のマップである。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１０１４で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１５２で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１５１で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１５０で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１９９で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１２００で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定され、脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。さらに、伸長活性は式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示され、全パーセント脱飽和とも称される。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５つの大豆不定胚の平均）を有するｐＫＲ１１８４で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性を示す。 個別に発現されたΔ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼを、それに対応するΔ９エロンガーゼ−Δ８デサチュラーゼ融合体と比較したものを示す。各データポイントは分析された全事象における５〜６の胚での（全脂肪酸の％としての）平均％ＤＧＬＡまたは％ＥＤＡを示し、平均％ＤＧＬＡは平均％ＥＤＡに対してプロットされる。（Ａ）では、ＥｇＴｐｏｍはＴｐｏｍＤ８（ｐＫＲ１０１４）と同時発現されたＥｇＤ９ｅを示し、ＥｇＴｐｏｍｆｕｓはＥｇＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８融合体（ｐＫＲ１１９９）を示す。（Ｂ）では、ＥｇＥａはＥａＤ８（ｐＫＲ１１５２）と同時発現されたＥｇＤ９ｅを示し、ＥｇＥａｆｕｓはＥｇＤ９ｅ／ＥａＤ８融合体（ｐＫＲ１２００）を示す。（Ｃ）では、ＥａＴｐｏｍはＴｐｏｍＤ８（ｐＫＲ１１５１）と同時発現されたＥａＤ９ｅを示し、ＥａＴｐｏｍｆｕｓはＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８融合体（ｐＫＲ１１８３）を示す。図（Ｄ）では、ＥａＥａはＥａＤ８（ｐＫＲ１１５０）と同時発現されたＥａＤ９ｅを示し、ＥａＥａｆｕｓはＥａＤ９ｅ／ＥａＤ８融合体（ｐＫＲ１２００）を示す。 最高の平均ＡＲＡおよびＥＰＡ含量（分析された５つの胚の平均）を有するｐＫＲ１３２２で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性（実験ＭＳＥ２２７４）を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（５，９）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＪＵＮ（ＪＵＰとも称される）、ＥＴＡ、ＡＲＡおよびＥＰＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。伸長活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（％Ｅｌｏ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセントΔ８脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］）×１００として決定される「％Ｄ８」で示される。これは全％Δ８脱飽和とも称される。ＤＧＬＡおよびＥＴＡにおける総パーセントΔ５脱飽和は、（［ＥＰＡ＋ＡＲＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］）×１００として決定される「％Ｄ５」で示される。これは全％Δ５脱飽和とも称される。 最高の平均ＤＧＬＡおよびＥＴＡ含量（分析された５つの胚の平均）を有するｐＫＲ１３２６で形質転換された５つの事象における脂肪酸特性（実験ＭＳＥ２２７５）を示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡおよびＥＴＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。伸長活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示される。これは全％脱飽和とも称される。
配列記述では、それに添付される配列表がまとめられる。配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：３０２１−３０３０頁（１９８５年）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ２１９（２）：３４５−３７３頁（１９８４年）の中に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ規準において定義されたヌクレオチド配列文字をコードする１文字ならびにアミノ酸をコードする１文字および３文字を含む。
配列番号１〜５１９は、表２で同定されているように、プライマー、ＯＲＦコード遺伝子、タンパク質（またはその一部）、またはプラスミドである。
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本明細書中に示される各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本発明は、マルチザイム、例えばＤＨＡシンターゼに関する。これらは、特に健康的なＰＵＦＡの生成、より詳細にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の生成のための生化学的経路の操作にとって有用である。したがって、本発明では多数の用途が見出される。本明細書で開示される方法により製造されるＰＵＦＡまたはその誘導体は、経静脈栄養を受けている患者のためかまたは栄養失調を予防または治療するため、代用食品またはサプリメント、特に乳児用調乳（ｉｎｆａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａ）として用いられうる。
あるいは、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、常用でのレシピエントであれば栄養補助にとって望ましい量を受けることになるように調合された調理油、油脂、またはマーガリンに含有されうる。ＰＵＦＡはまた、乳児用調乳、栄養補給食品、または他の食品に含有され、抗炎症剤またはコレステロール低下剤としての用途が見出されうる。場合により、組成物は医薬用途（ヒトまたは獣医）に用いられうる。この場合、ＰＵＦＡは、一般に経口投与されるが、それがうまく吸収されうる任意の経路により、例えば非経口（例えば、皮下、筋肉内または静脈内）で、直腸、膣、または局所（例えば皮膚軟膏剤またはローションとして）を介して投与されうる。
ヒトまたは動物に組換え手段により生成されたＰＵＦＡを補助する結果、添加されたＰＵＦＡおよびその代謝子孫（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｇｅｎｙ）のレベルが上昇しうる。例えば、ＥＰＡでの治療の結果、ＥＰＡだけでなくエイコサノイド（すなわち、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）などのＥＰＡの下流生成物のレベルが上昇しうる。複雑な調節機構により、個体内でかかる機構を阻止、制御、または克服し、所望のレベルの特定のＰＵＦＡを得るため、様々なＰＵＦＡを結合させるかまたはＰＵＦＡの異なる複合体を添加することが望ましくなりうる。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈的に単数が明示されない限り複数の参照を含む。したがって、例えば、「ａ ｐｌａｎｔ（植物）」については複数のかかる植物が含まれ、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」については当業者に既知の１つ以上の細胞およびその等価物が含まれる。
本明細書で用いられる「発明」または「本発明」という用語は、本発明のいずれかの特定の一実施形態に限定することを意味せず、一般に特許請求の範囲および明細書に記載の本発明のあらゆる実施形態に適用される。
本開示と関連し、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が提供される。
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略される。
「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」はＡＴＣＣと略される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略される。
本明細書で用いられる「下方制御するまたは下方制御」という用語は、遺伝子ポリヌクレオチドの発現のレベルにおける低減または低下を示す。
「マルチザイム」という用語は、少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチドを示す。好ましくは、マルチザイムは、第２の酵素活性に連結された第１の酵素活性を含む。
「融合タンパク質」という用語は、「マルチザイム」という用語と同義的に用いられる。したがって、「融合タンパク質」は少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチドを示す。
「融合遺伝子」という用語は、マルチザイムをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子を示す。融合遺伝子は、少なくとも２つのＤＮＡ断片を連結することにより作成可能であり、ここで各ＤＮＡ断片は独立でかつ別々の酵素活性をコードする。融合遺伝子の一例が、本明細書中、下記の実施例３８において記載され、そこではＨｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡシンターゼ融合遺伝子が、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（ＥａＤ９Ｅｌｏ１；配列番号２５２）とテトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８；配列番号１６２）をユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１プロリンリッチリンカー（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ；配列番号１９７）を用いて連結することにより作成された。
「ドメイン」または「機能ドメイン」は、機能（例えば酵素活性）に関連しうるポリペプチドの不連続部分、連続部分または部分配列である。本明細書で用いられる「ドメイン」という用語は、限定はされないが、酵素活性を保持する脂肪酸生合成酵素および脂肪酸生合成酵素の一部を含む。
「ＤＨＡシンターゼ」はマルチザイムの一例である。詳細には、ＤＨＡシンターゼは、本明細書中に記載のリンカーのいずれかを用いてΔ４デサチュラーゼに連結されたＣ２０エロンガーゼを含む。マルチザイムの別の例が、下で考察のΔ８デサチュラーゼに連結されたΔ９エロンガーゼを含む単一のポリペプチドである。
「連結する」という用語は、独立しかつ分離可能な酵素活性を有する少なくとも２種のポリペプチドの連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）または結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）を示す。
「リンカー」という用語は、独立しかつ分離可能な酵素活性を個別に有する２種以上のポリペプチドの間での結合（ｂｏｎｄ）または連結（ｌｉｎｋ）を示す。
マルチザイムの形成に用いられる連結は、最低限、単一のポリペプチド結合からなる。別の態様では、連結は１個のアミノ酸残基、例えばプロリン、またはポリペプチドからなりうる。連結がポリペプチドである場合、少なくとも１つのプロリンアミノ酸残基を有することが連結にとって望ましい場合がある。
リンカーの一例が、配列番号１９８（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー）で示される。
「脂肪酸」という用語は、（鎖長が長い酸および短い酸はいずれも既知であるが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の可変鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を示す。主な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「モノ不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「ω−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）対「ω−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の間での区別に関するさらなる詳細が、米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に示されている。
脂肪酸は、「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは特定の脂肪酸内での炭素（Ｃ）原子の総数であり、かつＹは二重結合の数である）という簡単な表記により本明細書中に記載される。脂肪酸の名称に準じる数は、二重結合のシス型立体配置として添付される「ｃ」を伴う脂肪酸のカルボキシル末端からの二重結合の位置を示す（例えば、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１，９ｃ）、ペトロセリン酸（１８：１，６ｃ）、ＬＡ（１８：２，９ｃ，１２ｃ）、ＧＬＡ（１８：３，６ｃ，９ｃ，１２ｃ）およびＡＬＡ（１８：３，９ｃ，１２ｃ，１５ｃ））。他に規定されない限り、１８：１、１８：２および１８：３はそれぞれオレイン、ＬＡおよびＡＬＡ脂肪酸を示す。他のように詳細に記載されない限り、二重結合はシス型立体配置であると仮定される。例えば、１８：２（９，１２）での二重結合であれば、シス型立体配置であると仮定されることになる。
本開示におけるＰＵＦＡの記述に用いられる命名法は下の表３に示される。「簡単な表記法」という表題の列には、ω−参照系が（この目的において１と番号付けされた）ω炭素から数えてω炭素に最も近い炭素の番号、二重結合の番号および二重結合の位置を示すように用いられる。表の残りでは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆体の一般名、本明細書の残り全体で用いられることになる略語、および各化合物の化学名がまとめてある。
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生化学的な意味での代謝または生合成経路は、細胞により使用または保存されるべき代謝生成物の形成あるいは別の代謝経路（ここではフラックス生成ステップと称される）の開始のいずれかが生じるという酵素により触媒されて細胞内で生じる一連の化学反応として見なされうる。これらの経路の多数は複雑であり、初期物質を段階的に修飾し、それを所望の正確な化学構造を有する生成物に形成するステップを含む。
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡに変換する代謝プロセスを示す。このプロセスは文献において十分な記載がなされている（例えばＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照）。単純化すると、このプロセスは、小胞体膜内に存在する一連の特定の脱飽和および伸長酵素（すなわち「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」）を介する、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長および二重結合の付加による分子の脱飽和を含む。より詳細には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ、ＤＨＡシンターゼおよび／または本発明のマルチザイムを含む、ＰＵＦＡの生合成に関連した酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを示す。
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現される場合、ω−３およびω−６脂肪酸の一方または両方の生成を触媒する酵素をコードする遺伝子セットを示す。典型的には、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子はＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。ミリスチン酸の様々な中間体を介したＤＨＡへの変換をもたらす代表的な経路が図１に図示され、それはω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の供給源からいかに生成されうるかを示す。経路は、一方の部分がω−３脂肪酸を生成しかつ他方の部分がω−６脂肪酸を生成することになる場合の２つの部分に必然的に分かれる。
ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路と関連して本明細書で用いられる「機能的」という用語は、経路内の遺伝子の一部（または全部）が活性酵素を発現し、インビボでの触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能的ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」が、多数の脂肪酸生成物がこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要となることから、すべてのＰＵＦＡ生合成経路酵素遺伝子が必要とされることを示唆しないことは理解されるべきである。
「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」という用語は、最低限、少なくとも１つのΔ６デサチュラーゼおよび少なくとも１つのＣ１８／２０エロンガーゼを含むＰＵＦＡ生合成経路を示し、それによりＬＡおよびＡＬＡ由来のＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡとそれぞれ中間体脂肪酸としてのＧＬＡおよび／またはＳＴＡとの生合成が可能になる。他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現に伴い、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡも合成されうる。
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、最低限、少なくとも１つのΔ９エロンガーゼおよび少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを含むＰＵＦＡ生合成経路を示し、それによりＬＡおよびＡＬＡ由来のＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡとそれぞれ中間体脂肪酸としてのＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡとの生合成が可能になる。他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現に伴い、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡも合成されうる。この経路は、一部の実施形態ではＧＬＡおよび／またはＳＴＡの生合成が除外されることから有利でありうる。
「中間体脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路内で生成される、この経路において意図される生成物脂肪酸に他の代謝経路酵素の作用によりさらに変換可能な任意の脂肪酸を示す。例えば、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を用いてＥＰＡが生成される場合、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡおよびＡＲＡが生成可能であり、これらの脂肪酸は他の代謝経路酵素の作用を介してＥＰＡにさらに変換されうることから「中間体脂肪酸」と考えられる。
「副産物脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路内で生成される、経路で意図された脂肪酸生成物でも経路の「中間体脂肪酸」でもない任意の脂肪酸を示す。例えば、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を用いてＥＰＡが生成される場合、シアドン酸（ＳＣＩ）およびジュニペロン酸（ＪＵＰ）もまたΔ５デサチュラーゼのＥＤＡまたはＥｔｒＡのいずれかに対する作用によりそれぞれ生成されうる。それらは、いずれも他の代謝経路酵素の作用によりＥＰＡにさらに変換され得ないことから「副産物脂肪酸」と考えられる。
「トリアシルグリセロール」、「オイル」および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基からなる中性脂質を示す（またかかる用語は本明細書中の本開示全体を通じて同義的に用いられることになる）。かかるオイルは、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸およびより長い鎖の飽和脂肪酸を含有しうる。したがって、「オイル生合成」は一般に細胞内でのＴＡＧの合成を示す。
「全脂質およびオイル画分におけるパーセント（％）ＰＵＦＡ」は、それら画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを示す。「全脂質画分」または「脂質画分」という双方の用語は、油性生物内での全脂質（すなわち中性および極性）、ここではホスファチジルコリン（ＰＣ）画分中、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分中およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたはオイル）画分中に位置する脂質などの合計を示す。しかし、「脂質」および「オイル」という用語は、全明細書を通じて同義的に用いられることになる。
「変換効率」および「パーセント基質変換」という用語は、特定の酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換可能な効率を示す。変換効率は、（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００（式中、「生成物」はそれに由来する経路内での中間生成物および全生成物を含む）という式に従って判定される。
「デサチュラーゼ」は、１種以上の脂肪酸内で脱飽和する、すなわち二重結合を導入し、目的の脂肪酸または前駆体を生成しうるポリペプチドである。特定の脂肪酸を示すために本明細書全体を通じてω−参照系を用いるのに対し、デサチュラーゼの活性をΔ系を用いて基質のカルボキシル末端から数えることによって示すことがより便利である。例えば、Δ８デサチュラーゼは、分子のカルボキシル末端から数えて８番目および９番目の炭素原子の間の脂肪酸を脱飽和することになり、かつ、例えばＥＤＡからＤＧＬＡへの変換および／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒しうる。他の有用な脂肪酸デサチュラーゼとして、例えば（１）ＤＧＬＡからＡＲＡへの変換および／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ；（２）ＬＡからＧＬＡへの変換および／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ；（３）ＤＰＡからＤＨＡへの変換および／またはＤＴＡからＤＰＡｎ−６への変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ；（４）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ；（５）ＬＡからＡＬＡへの変換および／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ；（６）ＡＲＡからＥＰＡへの変換および／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ；ならびに（７）パルミチン酸からパルミトオレイン酸（１６：１）への変換および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼは、場合により、ω−６脂肪酸をそのω−３相当物に変換するそれらの能力（例えば、それぞれＬＡからＡＬＡへの変換およびＡＲＡからＥＰＡへの変換）に基づき、「ω−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ｎ−３デサチュラーゼ」とも称される。一部の実施形態では、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を、適切な宿
主を脂肪酸デサチュラーゼにおける遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸特性に対するその効果を測定することにより、実験的に判定することが最も望ましい。
「Δ４デサチュラーゼ」という用語は、分子のカルボキシル末端から数えられる４番目および５番目の炭素原子の間の脂肪酸を脱飽和し、かつ、例えばＤＰＡからＤＨＡへの変換および／またはＤＴＡからＤＰＡｎ−６への変換を触媒しうる酵素を示す。本明細書の目的として、「ＥｇＤＨＡｓｙｎ１」という用語は、本明細書中の配列番号１１でコードされるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるＤＨＡ合成酵素（配列番号１２）を示す。「ＥｇＤＨＡｓｙｎ２」という用語は、本明細書中の配列番号２１でコードされるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるＤＨＡ合成酵素（配列番号２２）を示す。「ＥａＤＨＡｓｙｎ１」という用語は、本明細書中の配列番号９１でコードされるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されるＤＨＡ合成酵素（配列番号９５）を示す。「ＥａＤＨＡｓｙｎ２」という用語は、本明細書中の配列番号９２でコードされるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されるＤＨＡ合成酵素（配列番号９６）を示す。「ＥａＤＨＡｓｙｎ３」という用語は、本明細書中の配列番号９３でコードされるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されるＤＨＡ合成酵素（配列番号９７）を示す。「ＥａＤＨＡｓｙｎ４」という用語は、本明細書中の配列番号９４でコードされるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離される酵素（配列番号９８）を示す。
「エロンガーゼ系」という用語は、エロンガーゼ系が作用する脂肪酸基質よりも２炭素長い脂肪酸を生成するための脂肪酸炭素鎖の伸長に関与する４種の酵素群を示す。より詳細には、伸長のプロセスは、ＣｏＡがアシル担体である場合の脂肪酸シンターゼとの関連で生じる（Ｌａｓｓｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１−２９２頁（１９９６年））。基質特異的でかつ律速であることが見出されている第１のステップでは、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合され、二酸化炭素（ＣＯ２）およびβ−ケトアシル−ＣｏＡ（ここではアシル部分は２個の炭素原子により伸長されている）が得られる。後続する反応にはβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水および第２の還元が含まれ、それにより伸長されたアシル−ＣｏＡが得られる。エロンガーゼ系により触媒される反応の例として、ＧＬＡからＤＧＬＡへの変換、ＳＴＡからＥＴＡへの変換、ＬＡからＥＤＡへの変換、ＡＬＡからＥｔｒＡへの変換およびＥＰＡからＤＰＡへの変換が挙げられる。
本明細書の目的として、第１の縮合反応（すなわち、マロニル−ＣｏＡおよび長鎖アシル−ＣｏＡからβ−ケトアシル−ＣｏＡへの変換）を触媒する酵素は、一般に「エロンガーゼ」と称されることになる。一般に、エロンガーゼの基質選択性はやや広範であるが、鎖長および不飽和度の双方により分けられる。したがって、エロンガーゼは異なる特異性を有しうる。例えば、Ｃ１４／１６エロンガーゼではＣ１４基質（例えばミリスチン酸）が用いられ、Ｃ１６／１８エロンガーゼではＣ１６基質（例えばパルミチン酸塩）が用いられ、Ｃ１８／２０エロンガーゼではＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）が用いられ、またＣ２０／２２エロンガーゼではＣ２０基質（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ）が用いられることになる。同様に、「Δ９エロンガーゼ」は、ＬＡからＥＤＡへの変換および／またはＡＬＡからＥＴｒＡへの変換を触媒可能である。
一部のエロンガーゼが広範な特異性を有することから、単一の酵素が数種のエロンガーゼ反応を触媒可能でありうることに注目することは重要である。したがって、例えばΔ９エロンガーゼはまた、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼとして作用し、ＥＰＡおよび／またはＧＬＡなどのΔ５およびΔ６脂肪酸の各々に対して代替性があっても好ましくない特異性を有する場合がある。
本明細書で用いられる「Ｃ２０エロンガーゼ」という用語は、例えばＥＰＡまたはＡＲＡなどのＣ２０基質を用いる酵素を示す。「Ｃ２０／Δ５エロンガーゼ」という用語は、Δ５二重結合を有するＣ２０基質を用いる酵素を示す。
同様に本明細書の目的として、「ＥｇＤ９ｅｌｏ」または「ＥｇＤ９ｅ」という用語は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるΔ９エロンガーゼ（配列番号１１２を参照；米国特許出願第１１／６０１，５６３号明細書（２００６年１１月１６日出願、２００７年５月２４日に米国特許出願公開第２００７−０１１８９２９−Ａ１号明細書として公開）も参照）を示す。
本明細書で用いられる「核酸」はポリヌクレオチドを意味し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」という用語は同義的に用いられ、一本鎖または二本鎖であり、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸塩形態内で見出される）は、アデニレートまたはデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対応）に対する「Ａ」、シチジレートまたはデオキシシチジレートに対する「Ｃ」、グアニレートまたはデオキシグアニレートに対する「Ｇ」、ウリジレートに対する「Ｕ」、デオキシチミジレートに対する「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対する「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対する「Ｙ」、ＧまたはＴに対する「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対する「Ｈ」、イノシンに対する「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対する「Ｎ」のように、その一文字名称により参照される。
「機能的に等価であるサブ断片」および「機能的に等価なサブ断片」という用語は、本明細書中で同義的に用いられる。これらの用語は、遺伝子発現を改変するかまたは特定の表現型を生成する能力が断片またはサブ断片が活性酵素をコードするか否かに無関係に保持される単離核酸断片の一部または部分配列を示す。例えば、断片またはサブ断片をキメラ遺伝子の設計に用い、形質転換植物内での所望の表現型の生成が可能である。キメラ遺伝子は、核酸断片またはそのサブ断片を植物プロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス方向に活性酵素をコードするか否かに無関係に連結することにより抑制的な使用のために設計されうる。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整列された配列に沿う特定の位置に保存されたアミノ酸セットを意味する。他の位置でのアミノ酸が相同タンパク質間で異なりうる一方、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示す。「相同性」、「相同な」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という用語は、本明細書中で同義的に用いられる。それらは、１つ以上のヌクレオチド塩基における変化が核酸断片における遺伝子発現を媒介するかまたは特定の表現型を生成する能力に作用しない場合の核酸断片を示す。これらの用語はまた、得られる核酸断片の機能的特性を初期の未修飾断片に対して実質的に改変しない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾を示す。したがって、本発明が特定の典型的配列以上のものを包含することは、当業者が理解することとして理解されている。
さらに、当業者は、本発明により包含される実質的に類似の核酸配列が、本明細書中に例示される配列または本明細書中に開示されかつ本明細書中に開示される核酸配列のいずれかに機能的に等価なヌクレオチド配列の任意の部分に（中等度のストリンジェントな条件、例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の下で）ハイブリダイズするその能力によっても定められることを理解している。ストリンジェンシー条件を調節することで、中等度に類似の断片、例えば遠縁生物由来の相同配列から高度に類似の断片、例えば近縁生物由来の機能的酵素を複製する遺伝子についてのスクリーニングが可能である。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定づける。
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での核酸配列と特異的な核酸標的配列との、非標的核酸配列に対するそのハイブリダイゼーションよりも検出できる位に大きい程度（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍超）に至るまでの、また非標的核酸が実質的に除外されるまでのハイブリダイゼーションへの言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、互いに少なくとも約８０％の配列同一性または９０％の配列同一性、１００％を含むまでの配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズすることになる条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境下で異なることになる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件を制御することにより、標的配列はプローブに対して１００％相補的である（相同プロービング）と同定されうる。あるいは、ストリンジェンシー条件を調節し、配列において低度の類似性が検出される（異種プロービング）程度での一部の不一致が許容されうる。一般に、プローブは約１０００個未満のヌクレオチド長、場合により５００個未満のヌクレオチド長である。
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、かつ温度が短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）において少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば５０超のヌクレオチド）において少なくとも約６０℃である場合の条件となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により得られうる。典型的な低いストリンジェンシー条件は、３７℃で３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２× ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄を含む。典型的な中等度のストリンジェンシー条件は、３７℃で４０〜４５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣでの洗浄を含む。典型的な高いストリンジェンシー条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣでの洗浄を含む。
特異性は典型的にハイブリダイゼーション後の洗浄の機能であり、その重要な要素は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおいては、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４頁（１９８４年）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌ（式中、Ｍは一価陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、かつＬはハイブリッドの塩基対長である）の方程式から概算可能である。Ｔｍは相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨの下での）温度である。Ｔｍは、不一致の１％ごとに約１℃低下することから、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節し、所望の同一性を有する配列へのハイブリダイズが可能である。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が探索される場合、Ｔｍは１０℃低下しうる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特異的配列およびその相補体における熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件では熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、もしくは４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が用いられ、中等度のストリンジェントな条件では熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、もしくは１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が用いられ、低いストリンジェンシー条件では熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、もしくは２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が用いられうる。当業者は、方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを用いると、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるばらつきが本質的に説明されることを理解するであろう。所望の不一致度が４５℃（水溶液）未満または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高温が使用できるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する多数の指針については、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ」、ＰａｒｔＩ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９３年）、および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｈａｐｔｅｒ２、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９５年）に見出される。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０、もしくは２４０分間適用されうる。
核酸またはポリペプチド配列との関連での「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウインドウにわたって最大に一致するように整列される場合に相当する、２つの配列内での核酸塩基またはアミノ酸残基を示す。
したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することにより決定される値を示し、ここで２つの配列の最適なアラインメントにおいては、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は（付加または欠失を含まない）参照配列に対して付加または欠失（すなわちギャップ）を含みうる。百分率は、一致した位置の数を比較ウインドウ内での位置の総数で除し、配列同一性の百分率を得るために結果に１００を掛けて、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を得ることにより計算される。パーセント配列同一性の有用な例として、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数の百分率が挙げられる。これらの同一性は、本明細書中に記載のプログラムのいずれかを用いて決定されうる。
配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは類似性パーセントの計算値は、限定はされないが、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を含む、相同配列を検出するように設計された種々の比較方法を用いて決定されうる。本願との関連で配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、他に規定されない限り、分析の結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で用いられる「デフォルト値」は、最初に初期化される場合に最初にソフトウェアに読み込まれる任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。
「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメント」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）と称され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））において見出されるアラインメント法に対応する。複数のアラインメントにおいては、デフォルト値は、ギャップペナルティ＝１０およびギャップ長ペナルティ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法を用いる、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの計算におけるデフォルトパラメータが、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸においては、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ギャップペナルティ＝５、ウインドウ＝４およびダイアゴナルズセイブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメント」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、上記；Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、上記で記載）と称され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））において見出されるアラインメント法に対応する。複数のアラインメントにおけるデフォルトパラメータは、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイ・ディバージェン配列（Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジション・ウェイト（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質重み行列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡ重み行列（Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢに対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
「ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメント」は、デフォルトパラメータを用い、ヌクレオチド配列を比較するための、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により提供されるアルゴリズムである。
多数のレベルの配列同一性が、同一または類似の機能または活性を有するポリペプチドを他の種から同定するのに有用であることは、当業者により十分に理解されている。同一性パーセントの有用な例として、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または５０％〜１００％の百分率の任意の整数が挙げられる。実際、５０％〜１００％の任意の整数、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸同一性は、本発明を記述するのに有用でありうる。また、この単離ヌクレオチド断片の任意の完全長のまたは部分的な相補体は重要である。
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を示し、コード領域単独またはコード配列の上流の調節配列（５’非コード配列）および下流の調節配列（３’非コード配列）を加えたコード領域のいずれかを含みうる。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然に見出されない調節およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来の調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが天然に見出される場合とは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含みうる。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内の天然の位置に存在する天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されないが、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物に導入される天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム内に導入されている遺伝子である。
「ゲノム」という用語は、植物細胞に適用される際、核内に見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えばミトコンドリア、色素体）内に見出されるオルガネラＤＮＡも包含する。
「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度を再現するように設計されたコドン使用の頻度を有する遺伝子である。
「対立遺伝子」は、染色体上での所与の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形態の中の１つである。染色体上での所与の遺伝子座に存在するすべての対立遺伝子が同一である場合、その植物はその遺伝子座でホモ接合性である。染色体上での所与の遺伝子座に存在する対立遺伝子が異なる場合、その植物はその遺伝子座でヘテロ接合性である。
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に作用するヌクレオチド配列を示す。調節配列は、限定はされないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。プロモーター配列は、近接しかつより末端の上流因子、エンハンサーと称されることが多い下流因子からなる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激しうるＤＮＡ配列であり、かつプロモーターの固有因子またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるのに挿入される異種因子でありうる。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来しうるか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なる因子からなり得るか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含みうる。異なるプロモーターが、異なる組織内もしくは細胞種内で、または発生の異なるステージで、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を誘導しうることは当業者により理解されている。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界が完全に定められていないことから、数回の変異を受けたＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうることが理解されている。ほぼ常に大部分の細胞種内で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。植物細胞内で有用な様々なタイプの新しいプロモーターは常に発見されており、極めて多数の例がＯｋａｍｕｒｏ Ｊ．Ｋ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ Ｒ．Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２頁（１９８９年）での編集において見出されうる。
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するポリヌクレオチド配列を示す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全なプロセシングを受けたｍＲＮＡ内に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写産物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に作用しうる。翻訳リーダー配列の例については記載がなされている（Ｔｕｒｎｅｒ Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ Ｇ．Ｄ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５−２３６頁（１９９５年））。
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」または「終結配列」は、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸経路のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に作用することにより特徴づけられる。異なる３’非コード配列の使用については、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ Ｉ．Ｌ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０頁（１９８９年）で例示されている。
「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒された転写から得られる産物を示す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写産物と称される。ＲＮＡ転写産物は、一次転写産物の転写後プロセシングから得られるＲＮＡ配列である場合、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有さず、かつ細胞によりタンパク質に翻訳されうるＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、かつ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを示す。ｃＤＮＡは、一本鎖でありうるかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を用いて二本鎖形態に変換されうる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、かつ細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写産物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を遮断または低減するＲＮＡ転写産物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的遺伝子転写産物の任意の部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列の場合に存在しうる。「機能ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されることがないが細胞過程に対する効果を有する他のＲＮＡを示す。「相補体」および「逆相補体」という用語は、ｍＲＮＡ転写産物に関して本明細書中で同義的に用いられ、かつメッセージのアンチセンスＲＮＡを定義するように意図されている。
「作動可能に連結される」という用語は、単一の核酸断片上での核酸配列の、一方の機能が他方から作用を受けるような結合を示す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に作用可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結されうる。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、５’から標的ｍＲＮＡへ、または３’から標的ｍＲＮＡへ、または標的ｍＲＮＡの範囲内で、直接的または間接的に作動可能に連結されうるか、あるいは第１の相補的領域は標的ｍＲＮＡに対して５’側でありかつその相補体は３’側である。
本明細書で用いられる標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ． 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）においてより十分に記載されている。形質転換方法は当業者に周知であり、後述される。
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、多量の特異的ＤＮＡセグメントを合成するための技術であり、かつ一連の反復サイクルからなる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））。典型的には、二本鎖ＤＮＡは熱変性を受け、標的セグメントの３’境界に相補的な２種のプライマーは低温でアニールされ、次いで中温で伸長される。これら３つの連続ステップ一式は「サイクル」と称される。
「組換え」という用語は、例えば化学合成または遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、配列の別々に分離された２つのセグメントの人工的組み合わせを示す。
「プラスミド」または「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる余分な染色体因子である。かかる因子は、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ、あるいは任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線状または環状のヌクレオチド配列であり得、ここでは、多数のヌクレオチド配列に対し、発現カセットを細胞に導入可能な固有の作成物への連結または組換えが施されている。「発現カセット」は、外来遺伝子を有し、かつ外来遺伝子に加えて外来宿主内でのその遺伝子の発現を促進しうる因子を有するＤＮＡの断片を示す。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を有し、かつ外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する因子を有するＤＮＡの断片を示す。
「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」という用語は、本明細書中で同義的に用いられる。組換えコンストラクトは、人工的に組み合わされた核酸断片、例えば天然に見出されない調節およびコード配列を含む。例えば、組換えコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが天然に見出されない場合とは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含みうる。かかるコンストラクトは、単独使用されうるか、またはベクターと併用されうる。ベクターが用いられる場合、ベクターの選択は、当業者に周知の、宿主細胞の形質転換に用いられることになる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターが用いられうる。当業者は、本発明の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞に対する形質転換、選択および増殖が奏功するための、ベクター上に存在しなければならない遺伝的因子について精通している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたらすことから（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８頁（１９８５年）；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６頁（１９８９年））、所望の発現レベルおよびパターンを示す系を得るため、複数の事象に対するスクリーニングが必要であることを理解するであろう。かかるスクリーニングは、特にＤＮＡのＳｏｕｔｈｅｒｎ分析、ｍＲＮＡ発現のＮｏｒｔｈｅｒｎ分析、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、または表現型分析により実施されうる。
本明細書で用いられる「発現」という用語は、機能的最終産物（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質［前駆体または成熟体のいずれか］）の生成を示す。
「導入される」という用語は、核酸（例えば発現コンストラクト）またはタンパク質を細胞に供給することを意味する。導入されるとは、核酸が細胞のゲノムに取り込まれうる場合での核酸の真核または原核細胞への取り込みへの言及を含み、かつ核酸またはタンパク質の細胞への一時的供給への言及を含む。導入されるとは、安定または一時的な形質転換方法および性的交配への言及を含む。したがって、核酸断片（例えば組換えコンストラクト／発現コンストラクト）の細胞への挿入と関連した「導入される」とは、「形質移入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、かつ、核酸断片が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれうるか、自己レプリコンに変換されうるか、または一時的に発現されうる（例えば形質移入されたｍＲＮＡ）場合での核酸断片の真核または原核細胞への取り込みへの言及を含む。
「成熟」タンパク質は、翻訳後プロセシングを受けたポリペプチド（すなわち、それから一次翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されているもの）を示す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（すなわち、それとともにプレおよびプロペプチドが依然として存在する）を示す。プレおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルでありうるがそれに限定されない。
「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸断片の核およびオルガネラゲノムの双方を含む宿主生物のゲノムへの転移を示す。それに対し、「一時的形質転換」は、核酸断片の、組み込みまたは安定な遺伝的形質を伴わない遺伝子発現をもたらす宿主生物の核またはＤＮＡを有するオルガネラへの転移を示す。形質転換核酸断片を有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と称される。
本明細書で用いられる「トランスジェニック」は、植物またはそのゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む細胞を示す。好ましくは、異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが連続世代に伝えられるようにゲノム内に安定的に組み込まれる。異種ポリヌクレオチドは、単独にまたは発現コンストラクトの一部としてゲノムに組み込まれうる。トランスジェニックは、本明細書中で任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物の一部または植物を含むように用いられ、ここでその遺伝子型は異種核酸の存在により改変されており、そのように改変された初期トランスジェニックおよび初期トランスジェニックからの性的交配または無性繁殖により製造されるものを含む。本明細書で用いられる「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種方法または無作為な他家受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、または自然突然変異などの天然事象によるゲノム（染色体または染色体外）の改変を包含しない。
「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生成を示す。「共抑制」は、同一または実質的に類似の外来性または内因性遺伝子の発現を抑制可能なセンスＲＮＡ転写産物の生成を示す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。植物内の共抑制コンストラクトは、内因性ｍＲＮＡに対して相同性を有する核酸配列のセンス方向での過剰発現に着目することによって過去に設計されており、それは過剰発現された配列に対して相同性を有する全ＲＮＡの減少をもたらす（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６：６５１−６５９頁（１９９８年）；Ｇｕｒａ、Ｎａｔｕｒｅ ４０４：８０４−８０８頁（２０００年））。この現象の全効率は低く、ＲＮＡの減少の範囲は様々に変化する。より最近の研究では、発現されたＲＮＡにおいて有望な「ステムループ」構造をもたらす相補的方向でｍＲＮＡコード配列の全部または一部を組み込む「ヘアピン」構造の使用についての記載がなされている（ＰＣＴ公開の国際公開第９９／５３０５０号パンフレット；ＰＣＴ公開の国際公開第０２／００９０４号パンフレット）。これにより、回収されたトランスジェニック植物における共抑制の頻度が増加する。別の変形として、近接ｍＲＮＡコード配列の抑制または「サイレンシング」を誘導するための植物ウイルス配列の使用についての記載がなされている（ＰＣＴ公開の国際公開第９８／３６０８３号パンフレット）。これらの共抑制現象の双方は機構的に解明されていないが、遺伝的証拠によりこの複雑な状況が解明され始めている（Ｅｌｍａｙａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７４７−１７５７頁（１９９８頁））。
「油性」という用語は、脂質の形態でエネルギー源を保存する傾向がある生物を示す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。油性として同定された植物のクラスは、一般に「油料種子」植物と称される。油料種子植物の例として、限定はされないが、大豆（グリシン属（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐ．）およびソハ属（Ｓｏｊａ ｓｐ．））、亜麻（リナム属（Ｌｉｎｕｍ ｓｐ．））、菜種（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．））、トウモロコシ、綿、紅花（ウスイロアレチベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｓｐ．））およびヒマワリ（ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．））が挙げられる。
油性微生物内での細胞のオイルまたはＴＡＧ含有物は一般にＳ字形曲線に従い、ここで脂質の濃度は、後期対数または早期静止成長期で最大に達するまで増加し、次いで後期静止および死滅期の間に漸減する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９−２５頁（１９９１年））。「油性酵母」という用語は、オイルを作る酵母として分類される微生物を示す。油性微生物においては、オイルとしてその乾燥細胞重量の約２５％超で蓄積することはまれではない。油性酵母の例として、限定はされないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）といった属が挙げられる。
本明細書で用いられる「バイオマス」という用語は、具体的には、商業的に重要な量でＰＵＦＡを生成する組換え生成宿主の発酵に基づく消費または使用される酵母細胞材料を示し、ここで好ましい生成宿主は油性酵母、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株である。バイオマスは、全細胞、全細胞溶解液、均質化細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または部分精製された細胞材料（例えば微生物生産されたオイル）の形態でありうる。
「ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）」という用語は、淡水、海洋、土壌、および寄生環境内での生存が見出される単細胞の無色または光合成鞭毛虫（「ユーグレナ属（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ）」）の群を示す。クラスは単独の単細胞により特徴づけられ、ここで大部分は自由遊泳性であり、リザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）として知られる前部の陥入（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｉｎｖａｇｉｎａｔｉｏｎ）から生じる２つの鞭毛（その一方は非表出でありうる）を有する。光合成ユーグレナ属は１つから多数の草のような緑色の（ｇｒａｓｓ−ｇｒｅｅｎ）葉緑体を有し、それは微小なディスクから幅広いプレートまたはリボンにまで変化する。無色ユーグレナは、栄養素同化における浸透圧栄養または摂取栄養（ｐｈａｇｏｔｒｏｐｈｙ）に依存する。約１０００種については記載がなされ、約４０の属および６つの目に分類されている。ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）の例として、限定はされないが、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）およびテトルエトレプチア（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ）といった属が挙げられる。
「植物」という用語は、植物全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、これらの種子および子孫を示す。植物細胞は、限定はされないが、種子、浮遊培養物、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子に由来する細胞を含む。
「子孫」は植物の任意の後続世代を含む。
概観：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物内での脂質蓄積が、成長培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応答して誘発される。油性微生物内での遊離パルミチン酸塩（１６：０）のデノボ合成をもたらすこのプロセスは、米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に詳細に記載されている。パルミチン酸塩は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である（図１）。
ＴＡＧ（脂肪酸における主要な蓄積単位（ｓｔｏｒａｇｅ ｕｎｉｔ））は、（１）リゾホスファチジン酸を生成するための、アシルトランスフェラーゼを介した１分子のアシル−ＣｏＡからグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化；（２）（一般にホスファチジン酸として同定される）１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩を生成するための、アシルトランスフェラーゼを介した第２の分子のアシル−ＣｏＡのエステル化；（３）１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成するための、ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去；および（４）ＴＡＧを形成するための、アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加、を含む一連の反応により形成される。広域スペクトルの脂肪酸が、飽和および不飽和脂肪酸ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含むＴＡＧに取り込まれうる。
Ω脂肪酸の生合成
オレイン酸が長鎖ω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝過程は、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長および二重結合の付加による分子の脱飽和を含む。これは小胞体膜内に存在する一連の特定の脱飽和および伸長酵素を必要とする。しかし、図１に見られるように、また下記のように、特定の長鎖ω−３／ω−６脂肪酸を生成するための複数の代替経路が存在することが多い。
詳細には、すべての経路は、オレイン酸のＬＡ（ω−６脂肪酸の最初）へのΔ１２デサチュラーゼによる初期変換を必要とする。次いで、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを用い、長鎖ω−６脂肪酸が以下のようにして形成される。すなわち、（１）ＬＡはΔ９エロンガーゼによりＥＤＡに変換される；（２）ＥＤＡはΔ８デサチュラーゼによりＤＧＬＡに変換される；（３）ＤＧＬＡはΔ５デサチュラーゼによりＡＲＡに変換される；（４）ＡＲＡはＣ２０／２２エロンガーゼによりＤＴＡに変換される；および（５）ＤＴＡはΔ４デサチュラーゼによりＤＰＡｎ−６に変換される。あるいは、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」では、ＡＬＡが基質として用いられ、長鎖ω−３脂肪酸が以下のように生成されうる。すなわち、（１）ＬＡはΔ１５デサチュラーゼによりＡＬＡ（ω−３脂肪酸の最初）に変換される；（２）ＡＬＡはΔ９エロンガーゼによりＥＴｒＡに変換される；（３）ＥｔｒＡはΔ８デサチュラーゼによりＥＴＡに変換される；（４）ＥＴＡはΔ５デサチュラーゼによりＥＰＡに変換される；（５）ＥＰＡはＣ２０／２２エロンガーゼによりＤＰＡに変換される；および（６）ＤＰＡはΔ４デサチュラーゼによりＤＨＡに変換される。場合により、ω−６脂肪酸はω−３脂肪酸に変換可能であり、例えばＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によりそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
ω−３／ω−６脂肪酸を生合成するための代替経路では、Δ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼ（Δ６エロンガーゼとしても知られ、同用語は同義的に用いられうる）が用いられる（すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」）。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡはΔ６デサチュラーゼによりそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡに変換可能であり、次いでＣ１８／２０エロンガーゼはＧＬＡをＤＧＬＡにかつ／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。
ω−３／ω−６脂肪酸の生成のために特定の宿主生物への導入が必要とされる特定の機能性が、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡ特性および／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼ特性）、基質の可用性、および所望の最終生成物に依存することになると考えられる。例えば、一部の実施形態では、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現は、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現に対し、前者の経路を介して生成されたＰＵＦＡにはＧＬＡが欠如することから好ましい場合がある。
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成にとって望ましい各酵素をコードする様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列は、任意の供給源から誘導され、例えば（細菌、藻、真菌、植物、動物などに由来する）天然供給源から単離され、半合成経路を介して生成されるかまたはデノボで合成されうる。宿主に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重要でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択するための検討事項として、（１）ポリペプチドの基質特異性；（２）ポリペプチドまたはその成分が律速酵素であるか否か；（３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡの合成に必須であるか否か；（４）ポリペプチドにより必要とされる共同因子；および／または、（５）ポリペプチドがその生成後に（例えばキナーゼまたはプレニルトランスフェラーゼにより）修飾されるか否かが含まれる。発現されたポリペプチドは、好ましくは宿主細胞内でのその位置の生化学的環境に適合するパラメータを有する（さらなる詳細については米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照）。
さらなる実施形態では、特定のデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの各々の変換効率を考慮することも有用となる。より詳細には、各酵素が基質の生成物への変換に対して１００％の効率で機能することがまれであることから、宿主細胞内で生成される未精製オイルの最終的な脂質特性は、典型的には所望のω−３／ω−６脂肪酸からなる様々なＰＵＦＡおよび様々な上流の中間体ＰＵＦＡの混合になる。したがって、各酵素の変換効率もまた、所望の脂肪酸の生合成を最適化する場合に考慮すべき変数である。
上記の各検討事柄とともに、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えば、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびＤＨＡシンターゼ）を有する候補遺伝子は、ＰＵＦＡの生成能を有する生物に関する公的に入手可能な文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、および実験分析に従って同定されうる。これらの遺伝子は特定の宿主生物への導入に適することから、ＰＵＦＡの生物合成が可能になるかまたは促進されることになる。
マルチザイムおよびリンカー
一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチドを含むマルチザイムに関する。
適切な酵素活性の例として、エロンガーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、トランスフェラーゼ、アシルＣｏＡシンターゼおよびチオエステラーゼが挙げられる。例えば、適切な脂肪酸デサチュラーゼとして、限定はされないが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、および／またはΔ１７デサチュラーゼが挙げられる。適切なエロンガーゼの例として、限定はされないが、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、および／またはＣ２０／２２エロンガーゼが挙げられる。
適切なトランスフェラーゼの例として、限定はされないが、グリセロール−３−リン酸塩Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（グリセロール−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ；ＧＰＡＴとも称される）、２−アシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ、１−アシルグリセロール−３−リン酸塩Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（１−アシルグリセロール−リン酸アシルトランスフェラーゼまたはリソ−ホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ；ＡＧＰＡＴもしくはＬＰＡＡＴもしくはＬＰＡＴとも称される）、２−アシルグリセロール−３−リン酸塩Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、１−アシルグリセロホスホコリンＯ−アシルトランスフェラーゼ（リソ−レシチンアシルトランスフェラーゼまたはリソ−ホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ；ＡＧＰＣＡＴもしくはＬＬＡＴもしくはＬＰＣＡＴとも称される）、２−アシルグリセロホスホコリンＯ−アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ；ＤＡＧＡＴもしくはＤＧＡＴとも称される）およびリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）などのアシルトランスフェラーゼが挙げられる。
適切なアシルＣｏＡシンテターゼの例として、限定はされないが、長鎖−脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ（アシル−活性化酵素またはアシル−ＣｏＡシンテターゼとも称される）が挙げられる。
適切なチオエステラーゼの例として、限定はされないが、オレオイル−［アシル−担体−タンパク質］ヒドロラーゼ（アシル−［アシル−担体−タンパク質］ヒドロラーゼ、アシル−ＡＣＰ−ヒドロラーゼまたはアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼとも称される）が挙げられる。
好ましくは、本マルチザイムであれば、少なくとも１つの脂肪酸デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸エロンガーゼを含む酵素活性を有する必要がある。
マルチザイムの形成に用いられる連結は、最低で単一のポリペプチド結合からなる。別の態様では、連結は１個のアミノ酸残基、例えばプロリン、またはポリペプチドからなりうる。連結がポリペプチドである場合、それが少なくとも１つのプロリンアミノ酸残基を有することが望ましい場合がある。
好ましくは、本発明のマルチザイムは第２の酵素活性に連結された第１の酵素活性を含み、連結はポリペプチド結合、配列番号１９８（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号２００（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２リンカー）、配列番号２３５（ＥａＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号４７２、配列番号５０４、および修飾されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リンカー（配列番号４３８および４４５）からなる群から選択される。
また、マルチザイムを製造するための方法であって、
（ａ）第１のポリペプチドを少なくとも第２のポリペプチドと連結するステップと、ここで各ポリペプチドは独立しかつ分離可能な酵素活性を有し、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物での独立しかつ分離可能な酵素活性を評価するステップと、
を含む、方法は本発明の範囲内に含まれる。
上で考察のように、酵素活性は、脂肪酸エロンガーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡシンターゼおよびチオエステラーゼからなる群から選択される。好ましくは、酵素活性は少なくとも１つの脂肪酸デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸エロンガーゼを含む。
適切なデサチュラーゼ、エロンガーゼおよびリンカーの例が上で考察される。
マルチザイムの極めて多数の例が上で考察されるが、（Ｃ２０エロンガーゼ活性およびΔ４デサチュラーゼ活性の双方を含む）ＤＨＡシンターゼおよび（Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ活性の双方を含む）ＤＧＬＡシンターゼは特に重要である。本明細書中に記載のデータにより、各シンターゼ内部の２つのドメインを連結する結果としての効率またはフラックスが、酵素ドメインが独立実体としてすなわちマルチザイム内で共に連結されずに存在する場合に認められる効率またはフラックスよりも高まることが確認される。
例えば、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｃ２０エロンガーゼドメインおよびシゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼを含むマルチザイムがヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で発現される場合、融合コンストラクト内でのΔ４デサチュラーゼ活性は、単独で発現される場合でのその活性に対して約２〜３倍高まった（実施例２８）。同様に、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｃ２０エロンガーゼドメイン−シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ融合体が大豆内のマルチザイムとして発現される場合、ＥＰＡからＤＨＡへのフラックスが２種の酵素が独立に発現される場合に対して増加することが測定された（実施例４９）。
製造された様々なＤＧＬＡシンターゼにおいてもまた、効率（またはＬＡからＤＧＬＡへのフラックス）の増加が示された。一連の６種のΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ融合コンストラクトが、ユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ユーグレナ・アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３およびユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９に由来するΔ９エロンガーゼならびにユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３に由来するΔ８デサチュラーゼの様々な組み合わせを用いて製造され、これらはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で個別に発現された（各々、実施例５５および５６）。あらゆる場合、融合遺伝子は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で発現される場合、各遺伝子単独よりも高い活性を有した。これらのデータはまた、Δ９エロンガーゼの生成物が融合タンパク質内でのΔ８デサチュラーゼの基質として直接に導かれうることを示唆した。当業者であれば、本明細書中の教示内容を生かし、効率またはフラックスが増加している様々な他のマルチザイムを製造できるであろう。したがって、本発明は、本発明の配列由来のリンカーを用いて製造される任意のマルチザイムに関する。好ましいマルチザイムは、ＰＵＦＡ生合成経路の様々な遺伝子が組み合わされたものである。
新規ＤＨＡシンターゼの配列同定
本発明では、ＤＨＡシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、下の表４にまとめられるように、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されている。
Figure 2010523113
一部の実施形態では、本発明のＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２およびＥａＤＨＡｓｙｎ３ ＤＨＡシンターゼ配列は、特定の宿主生物内での発現のためにコドン最適化されうる。当該技術分野で周知のように、宿主として好ましいコドンの使用がポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に促進しうることから、これは代替宿主内での酵素の発現をさらに最適化するのに有用な手段でありうる。例えば、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化され（実施例５４）、それによりＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓが得られた（米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，１２５，６７２号明細書中で教示）。
当業者であれば、本明細書中の教示を生かし、上の表４中に記載の野生型ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２および／またはＥａＤＨＡｓｙｎ３配列に基づき、代替宿主内での最適な発現に適する様々な他のコドン最適化ＤＨＡシンターゼタンパク質を製造できるであろう。したがって、本発明は、本発明の野生型配列に由来する任意のコドン最適化ＤＨＡシンターゼタンパク質に関する。一部の好ましい実施形態では、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２および／またはＥａＤＨＡｓｙｎ３をコードするコドンの一部を修飾し、限定はされないが植物または植物の一部を含む宿主生物内での遺伝子の発現を促進することが望ましい場合がある。
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号２０５、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、ＤＨＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、または配列番号４１１で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む単離ポリヌクレオチドに関する。
好ましくは、ＤＨＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０のいずれかで示される配列を含む。
相同体の同定および単離
本ＤＨＡシンターゼ配列（すなわち、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２およびＥａＤＨＡｓｙｎ３）のいずれかまたはその一部を用い、同じまたは他の細菌、藻、真菌、ユーグレナまたは植物種におけるＤＨＡシンターゼ相同体についての探索が配列分析ソフトウェアを用いて可能である。一般に、かかるコンピュータソフトウェアは、類似配列を、相同性の度合いを様々な置換、欠失、および他の修飾に割り付けることにより一致させる。
あるいは、本ＤＨＡシンターゼ配列のいずれかまたはその一部はまた、ＤＨＡシンターゼ相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いられうる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的要素は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を有すると考えられる試料および特異的ハイブリダイゼーション法を含む。本発明のプローブは、典型的には検出対象の核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出対象の核酸配列に対して「ハイブリダイゼーション可能」である。プローブ長が５塩基から何万もの塩基にわたって変化しうるが、典型的には約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子のごく一部が検出対象の核酸配列に対して相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要がない。不完全に相補的な分子間で明らかにハイブリダイゼーションが生じる結果、ハイブリダイズされた領域内での特定の塩基の画分は適切な相補的塩基と対を形成しない。
ハイブリダイゼーション法は十分に確立されている。典型的には、プローブおよび試料は核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これは、無機または有機塩の存在下、適切な濃度および温度条件下でプローブと試料を接触させるステップを含む。プローブおよび試料核酸は、プローブと試料核酸の間で任意の考えられるハイブリダイゼーションが生じうるのに十分に長い期間、接触状態を保たなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定することになる。プローブまたは標的の濃度が高まるにつれ、要求されるハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤が添加されうる（例えば、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウム）。必要に応じ、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加してもよい。
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いてよい。典型的には、これらは約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含有する。一般のハイブリダイゼーション溶液には、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（約６〜９の範囲のｐＨ））、約０．０５〜０．２％の洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンが用いられる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液中には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識担体核酸、断片化された核ＤＮＡ（例えば、仔ウシ胸腺またはサケ精液ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンが含まれることになる。他の添加剤、例えば種々の極性の水溶性剤または水膨潤剤（ｗａｔｅｒ ｓｗｅｌｌａｂｌｅ ａｇｅｎｔｓ）を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）（例えばポリエチレングリコール）、アニオンポリマー（例えばポリアクリル酸塩またはポリメチルアクリル酸塩）およびアニオンサッカライドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）（例えば硫酸デキストラン）もまた含まれうる。
核酸ハイブリダイゼーションは種々のアッセイフォーマットに適合性がある。最も適切なものの１つがサンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合性がある。サンドイッチ型アッセイの主要素が固体支持体である。固体支持体は、それに吸着しているか、または未標識でありかつ配列の一部に相補的である固定化核酸プローブをそれに共有結合させている。
さらなる実施形態では、本明細書中に記載のＤＨＡシンターゼ核酸断片のいずれか（または同定されたその任意の相同体）を用い、相同タンパク質をコードする遺伝子の同じまたは他の細菌、藻、真菌、ユーグレナまたは植物種からの単離が可能である。配列依存性のプロトコルを用いた相同遺伝子の単離は当該技術分野で周知である。配列依存性のプロトコルの例として、限定はされないが、（１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（２）核酸増幅技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４頁（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２頁（１９９２年）］の様々な使用により例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法；ならびに（３）ライブラリー作成および相補性によるスクリーニングの方法が挙げられる。
例えば、類似のタンパク質またはポリペプチドから本明細書中に記載のマルチザイムまたはその各ドメイン（ＤＨＡシンターゼなど）までをコードする遺伝子であれば、本核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いて直接単離し、例えば任意の所望の酵母または真菌からのライブラリーを当業者に周知の方法を用いてスクリーニングすることが可能である（ここではＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡを生成する生物であれば好ましいことになる）。本核酸配列に基づく特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）により、設計および合成がなされうる。さらに、配列全体を直接用い、当業者に既知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技術）によるＤＮＡプローブの合成または利用可能なインビトロ転写系を用いるＲＮＡプローブの合成が可能である。さらに、特異的プライマーの設計および使用により、本配列の一部（または完全長）の増幅が可能である。得られた増幅産物は増幅反応期間中に直接標識されるかまたは増幅反応後に標識可能であり、それをプローブとして用い、完全長ＤＮＡ断片の適切なストリンジェントな条件下での単離が可能である。
典型的には、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。プライマーの配列は、所望の試験条件に応じ、標的核酸の効率的でかつ正確な複製をもたらすように設計されるべきである。ＰＣＲプライマー設計の方法は一般的であり、当該技術分野で周知である（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、（１９８６年）、３３−５０頁、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ Ｖ．Ａ．；およびＲｙｃｈｌｉｋ Ｗ．、「Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．編、（１９９３年）、第１５巻、３１−３９頁、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」 Ｈｕｍａｎｉａ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
一般に、本配列の２つの短いセグメントをＰＣＲプロトコルにおいて用い、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同遺伝子をコードするより長い核酸断片の増幅が可能である。ＰＣＲはまた、クローン化核酸断片のライブラリーに対して実施可能であり、ここで一方のプライマーの配列は本核酸断片に由来し、かつ他方のプライマーの配列は真核遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸経路の存在を利用する。
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクター由来の配列に基づく場合がある。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８頁（１９８８年））に従い、ｃＤＮＡをＰＣＲの使用により生成し、転写産物内の一点と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅することができる。３’および５’方向に向けられたプライマーは、本配列から設計されうる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を用い、特定の３’または５’ ｃＤＮＡ断片の単離が可能である（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３頁（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７頁（１９８９年））。
他の実施形態では、任意の酵素（例えば、マルチザイム、ＤＨＡシンターゼ、または本明細書中に記載の各ドメイン）が修飾されうる。当業者に周知のように、インビトロでの突然変異誘発および選択、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャッフリング」法または他の手段を用い、天然遺伝子の突然変異が得られうる。あるいは、マルチザイムはドメインスワッピングによる合成が可能であり、ここでは任意の酵素由来の機能ドメインを代替酵素内の機能ドメインと交換するかまたはそれに付加することにより、新規タンパク質が生成されうる。
新規Ｃ２０エロンガーゼの配列同定
本発明では、下の表５にまとめられるように、Ｃ２０エロンガーゼをコードするヌクレオチド配列はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されている。
Figure 2010523113
本発明は、
（ａ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２３１、配列番号２３２、または配列番号２３３で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１、配列番号２０６、配列番号２０３、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、または配列番号２３０で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１、配列番号２０６、配列番号２０３、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、Ｃ２０エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
好ましくは、Ｃ２０エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１、配列番号２０６、配列番号２０３、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、または配列番号２３０のいずれかで示される配列を含む。
新規Δ４デサチュラーゼの配列同定
本発明では、Δ４デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列は、下の表６にまとめられるように、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されている。
Figure 2010523113
他の実施形態では、本Δ４デサチュラーゼドメイン配列は、特定の宿主生物内での発現のためにコドン最適化されうる。例えば、ＥａＤＨＡｓｙｎ２のユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ４デサチュラーゼドメインが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された。例えば、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼドメインもまた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された。当業者であれば、本明細書中の教示を生かし、他の宿主内での最適な発現に適する様々な他のコドン最適化Δ４デサチュラーゼタンパク質を、上の表６中に記載のＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２および／またはＥａＤＨＡｓｙｎ３の野生型Δ４デサチュラーゼドメイン配列に基づいて作成できることになる。したがって、本発明は、本発明の野生型配列に由来する任意のコドン最適化Δ４デサチュラーゼタンパク質に関する。一部の好ましい実施形態では、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨ
Ａｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２および／またはＥａＤＨＡｓｙｎ３のΔ４デサチュラーゼドメイン配列をコードするコドンの一部を修飾し、限定はされないが植物または植物の一部を含む宿主生物内で遺伝子の発現を促進することが望ましい場合がある。
さらに、ＤＨＡシンターゼのＣ２０エロンガーゼドメインのＣ末端部分がΔ４デサチュラーゼドメインのＮ末端部分と重なるように見られるという観察に基づき、機能解析を行い、最適な機能をもつΔ４デサチュラーゼドメインを定めた。下の実施例５１および５３に記載のように、欠失突然変異誘発試験が、コドン最適化タンパク質配列のＥａＤ４Ｓ（配列番号１９３）およびＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８８）を用いて実施された。ＥａＤ４Ｓ−３（配列番号３８６）、ＥａＤ４Ｓ−２（配列番号３８４）、ＥａＤ４Ｓ−１（配列番号３８２）、ＥｇＤ４Ｓ−３（配列番号４０８）、ＥｇＤ４Ｓ−２（配列番号４０６）およびＥｇＤ４Ｓ−１（配列番号４０４）といった変異体が生成された。
当業者は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）に由来するこれら特定のΔ４デサチュラーゼ配列の正確な境界が完全に定められていないことから、長さが増加または減少したタンパク質断片またはポリペプチドが同等のΔ４デサチュラーゼ活性を有しうることを理解するであろう。同様に、同等の切断を上の表６に記載のＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２および／またはＥａＤＨＡｓｙｎ３の野生型Δ４デサチュラーゼドメイン配列に基づいて行い、十分量のΔ４デサチュラーゼ活性を有するΔ４デサチュラーゼを容易に生成できると思われ、ここでは同等のまたは増大したΔ４デサチュラーゼ活性であれば好ましいことになる。
したがって、本発明は、
（ａ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号１９３、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４０４、配列番号４０６、または配列番号４０８で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号１９２、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号１９２、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで相補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
を含む、Δ４デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドにさらに関する。
好ましくは、Δ４デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号２１４、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号１９２、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７のいずれかで示される配列を含む。
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ４デサチュラーゼを切断する効果は、酵素活性が野生型配列の酵素活性と比較される場合に増大することである。この結果は、当業者であれば切断型配列の活性が野生型配列の活性と等しく、場合によってはそれよりも低いことを予想する程度に予想外でかつ予測不可能なものである。したがって、本発明はまた、野生型配列よりも高い活性を有するΔ４デサチュラーゼを誘導するための新しい方法であって、ａ）ベースラインのΔ４デサチュラーゼ活性を有するユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離される野生型Δ４デサチュラーゼポリペプチドを提供するステップと、ｂ）（ａ）の野生型ポリペプチドから約１〜約２００個のアミノ酸を切断し、ベースラインのΔ４デサチュラーゼ活性と比較して増大したΔ４デサチュラーゼ活性を有する切断型突然変異ポリペプチドを製造するステップと、を含む、方法を提供する。これとの関連で用いられる「ベースライン」活性は、本明細書中に記載の標準の酵素プロトコルに従ってインビボまたはインビトロのいずれかで測定される野生型酵素の活性として定義される。
他の実施形態では、本明細書中で同定される任意の酵素（例えば、マルチザイム、ＤＨＡシンターゼ、Ｃ２０エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、および／または任意の相同体）を修飾し、新しい、および／または改善されたＰＵＦＡ生合成経路酵素の製造が可能である。当業者に周知のように、インビトロでの突然変異誘発および選択、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャッフリング」方法または他の手段を用い、天然遺伝子の突然変異が得られうる。あるいは、マルチザイムはドメインスワッピングにより合成可能であり、ここでは任意の酵素由来の機能ドメインを代替酵素内の機能ドメインと交換するかまたはそれに付加することにより、新規タンパク質の生成が可能である。
様々なΩ−３および／またはΩ−６脂肪酸を生成するための方法
本明細書中に記載のＤＨＡシンターゼ（すなわち、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２およびＥａＤＨＡｓｙｎ３または他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはこれらの相同体）をコードするキメラ遺伝子を適切なプロモーターの制御下で導入する結果、形質転換宿主生物内でのＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡの各々の生成が増大することになると想定される。そのようなものとして、本発明は、ＰＵＦＡを直接に生成するための方法であって、脂肪酸基質（すなわちＥＰＡまたはＤＰＡ）を本明細書中に記載のＤＨＡ合成酵素（例えば、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２およびＥａＤＨＡｓｙｎ３）に基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＤＨＡ）に変換されるように暴露するステップを含む、方法を包含する。
より詳細には、本発明は、宿主細胞がそのゲノム内に本発明の組換えコンストラクトを含むように宿主細胞を形質転換するための方法に関する。
適切な宿主細胞の例として、限定はされないが、植物および酵母が挙げられる。好ましくは、植物細胞は大豆などの油料種子植物から得られ、酵母細胞はヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）などの油性酵母から得られる。
また、形質転換植物または酵母を生成するための方法であって、植物細胞または酵母細胞を本発明のポリヌクレオチドのいずれかで形質転換するステップと、植物を形質転換植物細胞から再生するかまたは形質転換酵母細胞を成長させるステップと、を含む、方法は本発明の範囲内に含まれる。
より詳細には、宿主細胞（例えば植物、油性酵母）内でＤＰＡｎ−６またはＤＨＡを生成するための方法であって、ここで宿主細胞は、
（ｉ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド分子であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、単離ヌクレオチド分子；および
（ｉｉ）ＡＲＡまたはＥＰＡの供給源；
を含み、ここで宿主細胞は、ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドが発現され、かつＡＲＡがＤＰＡｎ−６に変換され、かつ／またはＥＰＡがＤＨＡに変換されるような条件下で成長され、ここでＤＰＡｎ−６またはＤＨＡは場合により回収される、方法を提供することが本発明の目的である。
他の実施形態では、本発明は、宿主細胞（例えば植物、油性酵母）内でＤＴＡまたはＤＰＡを生成するための方法であって、ここで宿主細胞は、
（ｉ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド分子であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２３１、配列番号２３２、または配列番号２３３で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、単離ヌクレオチド分子；および
（ｉｉ）ＡＲＡまたはＥＰＡの供給源；
を含み、ここで宿主細胞は、Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドが発現され、かつＡＲＡがＤＴＡに変換され、かつ／またはＥＰＡがＤＰＡに変換されるような条件下で成長され、ここでＤＴＡまたはＤＰＡは場合により回収される、方法に関する。
さらに、本発明は、ＤＰＡｎ−６またはＤＨＡを生成するための方法であって、ここで宿主細胞は、
（ｉ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド分子であって、ここでポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２１５、配列番号２２１、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４０４、配列番号４０６、または配列番号４０８で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、単離ヌクレオチド分子；および
（ｉｉ）ＤＴＡまたはＤＰＡの供給源；
を含み、ここで宿主細胞は、Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドが発現され、かつＤＴＡがＤＰＡｎ−６に変換され、かつ／またはＤＰＡがＤＨＡに変換されるような条件下で成長され、ここでＤＰＡｎ−６またはＤＨＡは場合により回収される、方法を提供する。
上記方法のいずれかで用いられる基質ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＥＰＡまたはＤＰＡの供給源は、天然または遺伝子組換えのいずれかで宿主により生成されうるか、または外因性に供給されうる。
各ドメインの連結によりマルチザイムを形成すれば、中間体脂肪酸の減少がもたらされうる。例えば、Ｃ２０エロンガーゼとマルチザイム内、例えばＤＨＡシンターゼ内のΔ４デサチュラーゼとの連結により、ＤＨＡが生成される間、中間体脂肪酸ＤＰＡの減少がもたらされうる。同様に、Δ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼのＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカーを用いた連結による本明細書中に記載のマルチザイムの形成により、ＥＤＡおよびＥＲＡ中間体の減少とともにＤＧＬＡおよびＥＴＡの生成がもたらされうる。
あるいは、ＤＨＡシンターゼを含む各マルチザイム遺伝子およびそれに対応する本明細書中に記載の酵素生成物が、例えばＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡを含む様々なω−６およびω−３ＰＵＦＡの生成のために間接的に用いられうる（図１；米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照）。ω−３／ω−６ ＰＵＦＡの間接的生成が生じ、ここで脂肪酸基質は所望の脂肪酸生成物に中間体ステップまたは経路中間体の手段を介して間接的に変換される。したがって、本明細書中に記載のＤＨＡシンターゼ（すなわち、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２およびＥａＤＨＡｓｙｎ３、または他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）が、ＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えば、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ、ＤＨＡシンターゼ）をコードする追加的な遺伝子との関連で発現される結果、より長い鎖のω−３／ω−６脂肪酸（例えば、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡ）の生成レベルが高まりうると考えられる。
特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡ特性および／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼ特性）、基質の可用性および所望の最終生成物に依存することになる。
場合により、副産物脂肪酸を最小化することが望ましい場合がある。相対的に豊富な副産物脂肪酸であれば、各経路酵素をリンカーとの連結によるマルチザイムの形成により減少されうる。例えば、［裸子植物の種子脂質中（Ｗｏｌｆｆら、Ｌｉｐｉｄｓ ３５（１）：１−２２頁（２０００年））、例えばマツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ）（マツ）において一般に見出される］シアドン酸（ＳＣＩ）および／またはジュニペロン酸（ＪＵＰ）の存在が、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９−エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の副産物脂肪酸として考えられうる。これらの脂肪酸はそれら自体で様々な健康増進特性を有すると考えられる（Ｎａｋａｎｅら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２３：７５８−７６１頁（２０００年））が、例えば油料種子作物内、改変ＰＵＦＡ経路内での副産物脂肪酸としてのそれらの存在は、用途によっては望ましいことではない。例えば、Δ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼとのリンカーを用いた連結によるマルチザイム（ＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡシンターゼ）の形成であれば、これらのステップを通じてフラックスが増加し、Δ５デサチュラーゼに対するＥＤＡ／ＥＲＡ中間体脂肪酸の可用性の低下、ひいてはＳＣＩおよびＪＵＰの濃度の低下がもたらされうる。
場合により、Δ６エロンガーゼは、意図される脂肪酸以外の脂肪酸を伸長しうる。例えば、Δ６エロンガーゼは、一般にＧＬＡをＤＧＬＡに変換するが、一部のΔ６エロンガーゼはまた、ＬＡまたはＡＬＡなどの意図されない基質をそれぞれＥＤＡまたはＥｔｒＡに変換しうる。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路内でのＥＤＡおよびＥｔｒＡであれば、「副産物脂肪酸」と見なされることになる。Δ８デサチュラーゼのΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路への付加は、「副産物脂肪酸」のＥＤＡおよびＥｔｒＡをそれぞれ「中間体脂肪酸」であるＤＧＬＡおよびＥＴＡに逆変換するための手段を提供しうる。
他の実施形態では、宿主生物の天然ＤＨＡシンターゼ、Ｃ２０エロンガーゼ、またはΔ４デサチュラーゼを、本明細書中に記載の完全な配列、それら完全な配列の相補体、それら配列の実質的部分、それらに由来するコドン最適化デサチュラーゼ、およびそれらに実質的に相同な配列に基づいて破壊することが有用でありうる。
植物発現系、カセットおよびベクター、ならびに形質転換
一実施形態では、本発明は、植物などの宿主細胞内での発現に適する少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された本発明の単離ポリヌクレオチドの中のいずれか１つを含む組換えコンストラクトに関する。プロモーターは、植物の細胞機構を誘導し、プロモーターの下流（３’）にある隣接コード配列からＲＮＡを生成するＤＮＡ配列である。プロモーター領域は、遺伝子のＲＮＡ転写産物が製造される速度、発生段階、および細胞種に作用する。ＲＮＡ転写産物はプロセシングを受け、ＲＮＡ配列のコードされたポリペプチドのアミノ酸配列への翻訳のための鋳型として機能するｍＲＮＡを生成する。５’非翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの開始および翻訳に関与しうるタンパク質コード領域の上流にあるｍＲＮＡの領域である。３’転写終結／ポリアデニル化シグナルは、植物細胞内でＲＮＡ転写産物の終結およびポリアデニル化ヌクレオチドのＲＮＡの３’末端への付加を引き起こすように機能するタンパク質コード領域の下流にある非翻訳領域である。
マルチザイムコード配列の発現を駆動するために選択されるプロモーターの起点は、所望の宿主組織内で所望の核酸断片における翻訳可能なｍＲＮＡを適時発現することによって本発明を実施するのに十分な転写活性を有する限り、重要でない。異種または非異種（すなわち内因性）プロモーターのいずれかを用い、本発明が実施されうる。例えば、植物内の適切なプロモーターとして、限定はされないが、βコングリシニンプロモーターのαプライムサブユニット、Ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター３プロモーター、アネキシンプロモーター、グリシニンＧｙ１プロモーター、βコングリシニンプロモーターのβサブユニット、Ｐ３４／Ｇｌｙ Ｂｄ ｍ ３０Ｋプロモーター、アルブミンプロモーター、Ｌｅｇ Ａ１プロモーターおよびＬｅｇ Ａ２プロモーターが挙げられる。
アネキシンまたはＰ３４プロモーターは、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレット（２００４年８月２６日公開）中に記載されている。アネキシンプロモーターの活性のレベルは、多数の既知の強力なプロモーター、例えば（１）ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ａｔａｎａｓｓｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：２７５−２８５頁（１９９８年）；ＢａｔｔｒａｗおよびＨａｌｌ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：５２７−５３８頁（１９９０年）；Ｈｏｌｔｏｒｆら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６頁（１９９５年）；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０７頁（１９８７年）；Ｗｉｌｍｉｎｋら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：９４９−９５５頁（１９９５年））；（２）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）オレオシンプロモーター（Ｐｌａｎｔら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３−２０５頁（１９９４年）；Ｌｉ、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｈ．Ｄ．論文、１０７−１２８頁（１９９７年））；（３）アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン伸長タンパク質プロモーター（Ｃａｌｌｉｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２１）：１２４８６−９３頁（１９９０年））；（４）トマトユビキチン遺伝子プロモーター（Ｒｏｌｌｆｉｎｋｅら、Ｇｅｎｅ．２１１（２）：２６７−７６頁（１９９８年））；（５）大豆熱ショックタンパク質プロモーター（Ｓｃｈｏｆｆｌら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２１７（２−３）：２４６−５３頁（１９８９年））；および（６）トウモロコシＨ３ヒストン遺伝子プロモーター（Ａｔａｎａｓｓｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７（２）：２７５−８５頁（１９８９年））のレベルに匹敵する。
アネキシンプロモーターの別の有用な特徴は、種子の発生におけるその発現特性である。アネキシンプロモーターは、種子の発生の初期段階（受粉後１０日以前）では最も活性が高く、後期段階では主に休止している。アネキシンプロモーターの発現特性は、発生の後期段階で最高の活性をもたらすことが多い多数の種子特異的プロモーター、例えば種子貯蔵タンパク質プロモーターのそれと異なる（Ｃｈｅｎら、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２−１２２頁（１９８９年）；Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０１９−１０２７頁（１９９６年）；Ｋｅｄｄｉｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３２７−３４０頁（１９９４年）；Ｐｌａｎｔら（上記）；Ｌｉ（上記））。アネキシンプロモーターは、より従来的な発現特性を有するが、他の既知の種子特異的プロモーターとは依然として異なる。したがって、アネキシンプロモーターは、胚内での遺伝子の過剰発現または抑制が発生の初期段階で望ましい場合には極めて注目すべき候補となる。例えば、初期胚の発生を調節する遺伝子または種子成熟に先立つ代謝に関与する遺伝子を過剰発現することが望ましい場合がある。
特定のＤＨＡシンターゼコード配列の発現に適する適切なプロモーターを同定した後に続き、プロモーターは当業者に周知の従来の手段を用い、センス方向で作動可能に連結される。
本明細書で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、「Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮｅｗＹｏｒｋ）、１９８９年（以後、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）またはＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ Ｊ．Ａ．およびＳｔｒｕｈｌ Ｋ．編；「Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ）、１９９０年（以後、「Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０年」）の中でより十分な記載がなされている。例えば、融合遺伝子は、少なくとも２つのＤＮＡ断片を停止コドンを導入しないようにインフレームで連結すること（インフレーム融合）により作成されうる。得られる融合遺伝子は、各ＤＮＡ断片が少なくとも１つの独立しかつ分離可能な酵素活性をコードするようになる。
一旦、組換えコンストラクトが作成されていると、次いでそれは当業者に周知の方法（例えば、形質移入、形質転換およびエレクトロポレーション）により選択された植物細胞に導入されうる。油料種子植物細胞は好ましい植物細胞である。次いで、形質転換植物細胞は、長鎖ＰＵＦＡの発現を可能にする適切な条件下で培養され、再生され、次いで場合により回収され、精製される。
本発明の組換えコンストラクトは１つの植物細胞に導入されうるか、あるいは各コンストラクトは別々の植物細胞に導入されうる。
植物細胞内での発現は、上記のように一時的または安定な方法でなされうる。
所望の長鎖ＰＵＦＡは種子内で発現されうる。また、かかる形質転換植物から得られる種子または植物部分は本発明の範囲内に含まれる。
植物部分は、限定はされないが、根、茎、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織ならびに様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）を含む分化および未分化組織を含む。植物組織は、植物内あるいは植物器官、組織または細胞培養物内に存在しうる。
「植物器官」という用語は、植物の形態学的かつ機能的に異なる部分を構成する植物組織または組織群を示す。「ゲノム」という用語は、（１）生物、またはウイルスまたはオルガネラの各細胞内に存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）の全相補体；および／または（２）片親からの１つの（半数体）単位として受け継がれた完全な染色体セットを示す。
したがって、本発明はまた、細胞を形質転換するための方法であって、細胞を本発明の組換えコンストラクトで形質転換するステップと、特許請求の範囲中に記載の組換えコンストラクトで形質転換された細胞を選択するステップと、を含む、方法に関する。
また、形質転換植物を生成するための方法であって、植物細胞を本発明のポリヌクレオチドで形質転換するステップと、植物を形質転換植物細胞から再生するステップと、を含む、方法は重要である。
双子葉植物を（主にアグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用により）形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法が、特に、綿（米国特許第５，００４，８６３号明細書；米国特許第５，１５９，１３５号明細書）；大豆（米国特許第５，５６９，８３４号明細書；米国特許第５，４１６，０１１号明細書）；ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（米国特許第５，４６３，１７４号明細書）；ピーナッツ（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７頁（１９９６年）；ＭｃＫｅｎｔｌｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３頁（１９９５年））；パパイヤ（Ｌｉｎｇ Ｋ．ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：７５２−７５８頁（１９９１年））；およびエンドウ豆（Ｇｒａｎｔら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８頁（１９９５年））について公表されている。植物形質転換に関する他の一般に用いられる方法のレビューについては、Ｎｅｗｅｌｌ Ｃ．Ａ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５３−６５頁（２０００年））を参照のこと。これらの形質転換方法の１つでは、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ｔｅｐｆｌｅｒ Ｍ．およびＣａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ Ｆ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：２４−２８頁（１９８７年））が用いられる。ＤＮＡの直接送達を用いる大豆の形質転換については、ＰＥＧ融合体（ＰＣＴ公開の国際公開第９２／１７５９８号パンフレット）、エレクトロポレーション（Ｃｈｏｗｒｉｒａ Ｇ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１７−２３頁（１９９５年）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３９６２−３９６６頁（１９８７年））、マイクロインジェクションおよび微粒子銃（ＭｃＣａｂｅ Ｄ．Ｅ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３頁（１９８８年）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４頁（１９８８年））の使用が公表されている。
植物組織からの植物の再生については種々の方法が挙げられる。特定の再生方法は、出発植物組織および再生されるべき特定の植物種に依存することになる。単一の植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換外植片からの植物の再生、発生および栽培は当該技術分野で周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、「Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）（１９８８年））。この再生および成長プロセスは、典型的には、形質転換細胞を選択するステップと、固着性の小植物段階（ｒｏｏｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｓｔａｇｅ）を通じて個別の細胞を胚発生の通常の段階を通じて培養するステップと、を含む。トランスジェニック胚および種子は同様に再生される。その後、得られたトランスジェニックの根づいた芽（ｒｏｏｔｅｄ ｓｈｏｏｔｓ）は土壌などの適切な植物成長培地内に植えられる。好ましくは、再生植物は、自家受粉によりホモ接合性トランスジェニック植物がもたらされる。そうでなければ、再生植物から得られる花粉は作物学的に重要な系列の種子成長植物と交配する。逆にいうと、これらの重要系列の植物からの花粉を用いて再生植物に受粉させる。所望のポリペプチドを含有する本発明のトランスジェニック植物が当業者に周知の方法を用いて栽培される。
上で考察された手順に加え、当業者は、高分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミドなど）の作成、操作および単離；組換えＤＮＡ断片および組換え発現コンストラクトの作成、ならびにクローンのスクリーニングおよび単離といった特定の条件および手順について記述する標準的資料に精通している。例えば：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）（１９８９年）；Ｍａｌｉｇａら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）（１９９５年）；Ｂｉｒｒｅｎら、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ」、第１巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）（１９９８年）；Ｂｉｒｒｅｎら、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ」、第２巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）（１９９８年）；「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｌａｒｋ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ＮＹ）（１９９７年）を参照のこと。
油料種子植物の例として、限定はされないが、大豆、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、亜麻および紅花が挙げられる。
少なくとも２０個の炭素原子および４つ以上の炭素−炭素二重結合を有するＰＵＦＡの例として、限定はされないが、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸が挙げられる。かかる植物から得られる種子はまた、かかる植物から得られるオイルと同様、本発明の範囲内に含まれる。
したがって、本発明はまた、油料種子植物の脂肪酸特性を改変するための方法であって、
ａ）油料種子植物細胞を本発明の特許請求の範囲に記載の組換えコンストラクトで形質転換するステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の形質転換された油料種子植物細胞から、改変された脂肪酸特性を有する植物を再生させるステップと、
を含む、方法に関する。
微生物発現系、カセットおよびベクター
本明細書中に記載のＤＨＡシンターゼ遺伝子および遺伝子産物（すなわち、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２およびＥａＤＨＡｓｙｎ３、または他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）もまた、異種微生物宿主細胞内、特に油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞内で生成されうる。
外来タンパク質の高レベルの発現を誘導する調節配列を有する微生物発現系および発現ベクターは当業者に周知である。これらのいずれか用いると、本配列の遺伝子産物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子の作成が可能である。次いで、これらのキメラ遺伝子であれば、形質転換を介して適切な微生物に導入し、コードされた酵素の高レベルの発現をもたらすことが可能である。
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターは当該技術分野で周知である。コンストラクト内に存在する配列の特定の選択は、所望の発現産物（上記）、宿主細胞の性質および形質転換細胞と非形質転換細胞を分離する手段案に依存している。しかし典型的には、ベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択可能マーカーおよび自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を有する。適切な発現カセットは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’（例えばプロモーター）、遺伝子コード配列、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’（すなわちターミネーター）を含む。両制御領域が形質転換微生物宿主細胞由来の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定種に固有の遺伝子に由来する必要がないことは理解されるべきである。
所望の微生物宿主細胞内での本マルチザイム、例えばＤＨＡシンターゼまたは各ドメインＯＲＦの発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは極めて多く、当業者に周知である。仮想的には、選択された宿主細胞内でのこれらの遺伝子の発現を誘導可能な任意のプロモーターは本発明に適する。微生物宿主細胞内での発現は、一時的または安定な方法で行われうる。一時的発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節可能なプロモーターの活性を誘発することにより行われうる。安定な発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された構成プロモーターの使用により行われうる。一例として、宿主細胞が酵母である場合、酵母細胞内で機能的な転写および翻訳領域が特に宿主種から提供される（例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で用いられる好ましい転写開始調節領域については米国特許第７，２３８，４８２号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照）。多数の調節配列のいずれか１つが、構成的または誘導的転写のいずれが望ましいか、目的のＯＲＦの発現におけるプロモーターの効率、作成の容易性などに応じて用いられうる。
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列は、酵母細胞内での発現に作用することが見出されている。所望のポリペプチドが酵母内で発現されにくい場合、外因性遺伝子のヌクレオチド配列を効率的な酵母翻訳開始配列を含むように修飾することで、最適な遺伝子発現が得られうる。酵母内での発現においては、これは、非効率的に発現された遺伝子の、それを内因性酵母遺伝子、好ましくは高度に発現された遺伝子とインフレームで融合することによる部位特異的突然変異誘発により行われうる。あるいは、宿主内のコンセンサス翻訳開始配列を決定し、この配列を異種遺伝子に、目的の宿主内でのその最適な発現を意図して改変することができる。
終結領域は、開始領域が得られた元となる遺伝子の３’領域かまたは異なる遺伝子に由来しうる。多数の終結領域は既知であり、（それらが得られた元となる同じ属および種と異なる属および種の双方において用いられる場合）種々の宿主内で十分に機能する。終結領域は、通常、任意の特定の特性故に選択されるのではなく便宜上の問題から選択される。終結制御領域はまた、好ましい宿主由来の様々な遺伝子に由来しうる。他の実施形態では、当業者が入手可能な情報を活用して転写ターミネーターとして機能する３’領域配列を設計し合成できることから、３’領域も合成でありうる。場合により、終結部位は不要でありうるが、含められる場合が最も好ましい。
当業者が理解するように、単に遺伝子をクローニングベクターに挿入するだけではそれが必要なレベルで有効に発現されるとはいえない。高い発現速度への必要性に応じて、多数の特定の発現ベクターが、転写、翻訳、タンパク質の安定性、酸素制限および微生物宿主細胞からの分泌の態様を制御する多数の異なる遺伝的因子の操作により作成されている。より詳細には、遺伝子発現を制御するように操作されている分子特性の一部として、関連の転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン化遺伝子のコピー数；遺伝子がプラスミドに担持されるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれるか；合成された外来タンパク質の最終の細胞位置；宿主生物内でのタンパク質の翻訳および正確なフォールディングの効率；宿主細胞内でのクローン化遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；ならびにコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくようなクローン化遺伝子内でのコドン使用が含まれる。修飾の各タイプは、本明細書中に記載のＤＨＡシンターゼの発現をさらに最適化するための手段として本発明に包含される。
微生物宿主細胞の形質転換
一旦、適切な宿主細胞内での発現に適するカセット（例えば、プロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターを含むキメラ遺伝子）、が得られていると、それは宿主細胞内で自己複製可能なプラスミドベクター内に配置されるかまたは宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内でランダムに生じうるか、または宿主遺伝子座内での組換えの標的化に十分な宿主ゲノムと相同性がある領域を有するコンストラクトの使用を通じて標的化されうる。コンストラクトが内因性遺伝子座に標的化される場合、転写および翻訳調節領域の全部または一部が内因性遺伝子座により提供されうる。
２種以上の遺伝子が別々の複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有し、かつ、安定な発現を維持しかつコンストラクト内での因子の再組み合わせ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を阻止するように他のコンストラクトに対する相同性が欠如することが望ましい。調節領域、選択手段および導入コンストラクトの増幅方法の選択が賢明か否かは実験的に判定可能であることから、すべての導入遺伝子が所望の産物の合成をもたらすための必要なレベルで発現される。
目的の遺伝子を含むコンストラクトは、任意の標準技術により微生物宿主細胞に導入されうる。これらの技術は、形質転換（例えば酢酸リチウムの形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６−１８７頁（１９９１年）］）、原形質融合、微粒子銃衝撃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｍｐａｃｔ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または目的の遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法を含む。
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を用いるための任意の方法により操作されている宿主細胞は、本明細書中で「形質転換」または「組換え」と称されることになる。形質転換宿主は発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有することになり、発現カセットがゲノムに組み込まれるかまたは複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するかに依存して２つ以上を有しうる。
形質転換宿主細胞は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，２５９，２５５号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載のように、様々な選択技術により同定されうる。
形質転換後、本ＤＨＡシンターゼ（また場合により宿主細胞内で同時発現される他のＰＵＦＡ酵素）に適する基質は、天然またはトランスジェニックのいずれかでの宿主により生成されうるかまたは外因性に提供されうる。
組換え発現にとって好ましい微生物宿主
本遺伝子および核酸断片を発現するための微生物宿主細胞は、広範囲の温度およびｐＨ値にわたり、単純または複合炭水化物、脂肪酸、有機酸、オイルおよびアルコール、および／または炭化水素を含む種々の供給原料上で成長する宿主を含みうる。出願人の要求に基づき、本発明に記載の遺伝子は油性酵母（および特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））内で発現されることになるが、転写、翻訳およびタンパク質生合成装置が高度に保存されることから、任意の細菌、酵母、藻、ユーグレナおよび／または真菌が本核酸断片の発現に適する微生物宿主になると考えられる。
しかし、好ましい微生物宿主は油性生物、例えば油性酵母である。これらの生物は、天然にオイルの合成および蓄積を行う能力があり、ここでオイルは、細胞乾燥重量の約２５％超、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％超、および最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％超を含みうる。典型的に油性酵母として同定される属として、限定はされないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。より詳細には、例示的なオイル合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス・スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ウチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（元はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類）が挙げられる。
油性酵母のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が最も好ましく、またさらなる実施形態では、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１という名称のヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が最も好ましい（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ．およびＡｇｇｅｌｉｓ Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−９頁（２００２年））。
歴史的に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株が、イソクエン酸リアーゼ；リパーゼ；ポリヒドロキシアルカン酸；クエン酸；エリスリトール；２−オキソグルタル酸；γ−デカラクトン；γ−ドデカラクトン；およびピルビン酸の製造および生成において用いられている。油性酵母（すなわち、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の形質転換に適用可能な具体的な教示として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書およびＣｈｅｎ Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４８（２）：２３２−２３５頁（１９９７年））が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内でのＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの生成の改変に適用可能な具体的な教示が、それぞれ米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット）の中に提供される。
油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））内でのＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼを含む発現ベクターの合成および形質転換のための具体的手段が、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット中に提供される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で遺伝子を発現する好ましい方法は、線状ＤＮＡの宿主のゲノムへの組み込みによるものである。ゲノム内の複数の位置への組み込みは、遺伝子の高レベルの発現が望ましい場合、特に有用でありうる［例えば、Ｕｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ_５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子座（米国特許第７，２１４，４９１号明細書）、Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、および／またはＰｅｘ１０遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）における］。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクターにおける本明細書中での開示において有用な終結領域は、例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外プロテアーゼ（ＸＰＲ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１７７４１）の約１００ｂｐの３’領域；アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（Ａｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１およびＣＡＡ０４６６１；Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ_５０３２４４）ターミネーター；Ｐｅｘ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）ターミネーター；Ｐｅｘ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）ターミネーター；Ｌｉｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）ターミネーター；Ｌｉｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）ターミネーター；および３−オキソアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ＯＣＴ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６９９８８）ターミネーターを含む。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において用いられる好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノ配糖体Ｇ４１８に対する耐性とともに、ウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジン欠損培地上で成長する能力である。他の実施形態では、５−フルオロオロチン酸（５−フルオロウラシル−６−カルボキシル酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）は、酵母Ｕｒａ−突然変異体を選択するために用いられる。化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して毒性があり、それ故にこの毒性に基づくと、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定において特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ Ｓ．、「Ｙｅａｓｔ２−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、第７巻、１０９−１４７頁、１９９７年；ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内での５−ＦＯＡの使用についてはＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットも参照）。より詳細には、最初に天然Ｕｒａ３遺伝子をノックアウトし、Ｕｒａ−表現型を有する株を生成でき、ここで選択性は５−ＦＯＡの耐性に基づいて生じる。次いで、複数のキメラ遺伝子群および新しいＵｒａ３遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムの異なる遺伝子座に組み込み、Ｕｒａ＋表現型を有する新しい株の生成が可能である。導入Ｕｒａ３遺伝子がノックアウトされる場合、その後の組み込みにより、（再び５−ＦＯＡの選択性を用いて同定された）新しいＵｒａ３−株が生成される。したがって、（５−ＦＯＡの選択性と組み合わせた）Ｕｒａ３遺伝子は複数回の形質転換での選択マーカーとして使用可能であることから、容易な方法で、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに組み込まれるように容易に遺伝的修飾がなされうる。
他の好ましい微生物宿主として、油性細菌、藻、ユーグレナ、および他の真菌が挙げられ、この広範な微生物宿主群内では、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物（またはこの目的で遺伝子操作されうるもの［例えば、サッカロミケスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの他の酵母］）が特に重要である。したがって、例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）（一般にＡＲＡの生成のために用いられる）の誘導または調節プロモーターの制御下、本ＤＨＡシンターゼ遺伝子のいずれかでの形質転換であれば、ＰＵＦＡを漸増的に合成可能な形質転換生物が得られうる。モルティエレラ・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換方法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅらによる記載がなされている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５頁（２０００年））。同様に、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物の形質転換方法は米国特許第７，００１，７７２号明細書中に開示されている。
基質供給が必要な場合がある。
所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るため、マルチザイム（例えばＤＨＡシンターゼ）の発現のために選択される宿主と無関係に、複数の形質転換体がスクリーニングされる必要がある。かかるクリーニングは、ＤＮＡブロットのＳｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のＮｏｒｔｈｅｒｎ分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１−２）：１３３−１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のＷｅｓｔｅｒｎおよび／またはＥｌｉｓａ分析、表現型分析、またはＰＵＦＡ生成物のＧＣ分析により行われうる。
当然のことながら、油性酵母内の天然に生成されるＰＵＦＡが１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）やあまり一般的ではないが１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限定されることから、本発明のより好ましい実施形態では、油性酵母を遺伝子操作し、本明細書中に記載のマルチザイムに加え、長鎖ＰＵＦＡの生合成にとって必要な複数の酵素が発現されることになる（それにより、例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの生成が可能になる）。
特に好ましい実施形態では、少なくとも１つの追加的な組換えＤＮＡコンストラクトは、マルチザイムがΔ９エロンガーゼ活性およびΔ８デサチュラーゼ活性の双方を有するようにＤＧＬＡシンターゼをコードする。一部の実施形態では、Δ９エロンガーゼはイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３９０１７４；ＩｇＤ９ｅもしくはＩｇＤ９ｅＳ）から単離または誘導されうるか、あるいはΔ９エロンガーゼはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）またはユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離または誘導されうる。例えば、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４５４、配列番号４６１、配列番号４６４および配列番号４７１で示されるＤＧＬＡシンターゼを参照のこと。
微生物内でのΩ−３および／またはΩ−６脂肪酸生合成の代謝改変
生化学経路を操作するための方法は当業者に周知であり、かつ、極めて多数の操作により、油性酵母内、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成が最大になりうると予想される。この操作には、ＰＵＦＡ生合成経路内での直接的な代謝改変または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作が必要でありうる。望ましい生化学経路の上方制御および望ましくない生化学経路の下方制御にとって有用な方法は当業者に周知である。
例えば、エネルギーまたは炭素に対してω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学経路あるいは特定のＰＵＦＡ最終生成物の生成に干渉する天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素は、遺伝子破壊により除去されうるかまたは他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）により下方制御されうる。
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増加させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内での操作（およびその関連技術）に関する詳細な考察は、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路における望ましい操作（およびその関連技術）として、それぞれＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］およびＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］の中に認められる。
本発明の範囲内で、脂肪酸生合成経路の発現を上記の方法のいずれか１つにより調節することは有用でありうる。例えば、本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生成のためにＰＵＦＡ生合成経路内での鍵酵素をコードする遺伝子が油性酵母に導入される場合の方法を提供する。ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を天然に有しない油性酵母内で本ＤＨＡシンターゼ遺伝子を発現しかつこれらの遺伝子の発現を調整し、宿主生物を代謝改変するための様々な手段を用いて好ましいＰＵＦＡ生成物の生成を最大にすることは特に有用となる。
ＰＵＦＡ生成のための微生物発酵プロセス
形質転換宿主細胞は、キメラ遺伝子の発現を最適化し、最大でかつ最も経済的な収量の所望のＰＵＦＡを生成する条件下で成長させる。一般に、最適化可能な培地条件は、炭素供給源のタイプおよび量、窒素供給源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なるミネラルイオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成段階の長さ、オイル蓄積段階の長さ、ならびに細胞採取の時間および方法を含む。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース培養液（ＹＰＤ））中、または成長にとって必要な成分が欠如することから所望の発現カセット（例えばＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））の選択が強いられる化学的組成の明らかな（ｄｅｆｉｎｅｄ）最少培地中で成長させる。
本発明における発酵培地は、適切な炭素供給源を含有する必要がある。適切な炭素供給源は米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に教示される。本発明において用いられる炭素の供給源が多種多様な炭素を有する供給源を包含しうると考えられるが、好ましい炭素供給源は糖類、グリセロール、および／または脂肪酸である。グルコースおよび／または１０〜２２個の炭素を有する脂肪酸が最も好ましい。
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸塩）供給源から供給されうる。発酵培地はまた、適切な炭素および窒素供給源に加え、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液、ビタミンおよび油性宿主の成長やＰＵＦＡの生成に必要な酵素経路の促進に適する当業者に既知の他の成分を含有する必要がある。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する数種の金属イオン（例えば、Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）に対して特別な注意が払われる（Ｎａｋａｈａｒａ Ｔ．ら、Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌｓ、Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編 ６１−９７頁（１９９２年））。
本発明における好ましい成長培地は、一般的な商業的に調製された培地、例えばＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））である。他の限定または合成された成長培地の使用も可能であり、形質転換宿主細胞の成長に適する培地について微生物学または発酵科学における当業者は知っているであろう。発酵に適するｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、ここではｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期成長条件における範囲として好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、ここでは微好気条件が好ましい。
典型的には、代謝状態が脂肪の成長および合成／保存の間で「均衡化」されなければならないことから、油性酵母細胞内での高レベルのＰＵＦＡの蓄積には２段階のプロセスが必要である。したがって、最も好ましくは、２段階発酵プロセスは油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））内でのＰＵＦＡの生成にとって必要である。このアプローチは、様々な適切な発酵プロセスの設計（すなわち、バッチ、供給バッチおよび連続）および成長の間での検討事項として、米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に記載されている。
ＰＵＦＡオイルの精製および加工
ＰＵＦＡは遊離脂肪酸としてかまたはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質、または糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物内および植物内で見出され、かつ宿主細胞から当該技術分野で周知の種々の手段を通じて抽出されうる。酵母脂質における抽出技術、品質分析、および合格基準（ａｃｃｅｐｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に関する１つのレビューがＺ．Ｊａｃｏｂｓのものである（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２（５／６）：４６３−４９１頁（１９９２年））。下流加工に関する簡単なレビューについてもＡ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄによるものが入手可能である（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１−３１２頁（１９９７年））。
一般に、ＰＵＦＡを精製するための手段は、有機溶媒での抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用）、鹸化およびプレスなどの物理的手段、またはこれらの組み合わせを含みうる。さらなる詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示内容が参照のこと。種油を単離する方法は当該技術分野で周知である（Ｙｏｕｎｇら、「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ，Ｉｎ Ｔｈｅ Ｌｉｐｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｇｕｎｓｔｏｎｅら編、Ｃｈａｐｔｅｒ ５、２５３−２５７頁；Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９９４年））。例えば、大豆油は含油種子からの食用油生成物の抽出および精製を含む一連のステップを用いて生成される。大豆油および大豆副産物は表７中に示される一般化ステップを用いて生成される。
Figure 2010523113
より詳細には、大豆種子に対して洗浄、テンパリング、皮むき、薄片化を行うことによりオイル抽出の効率が高められる。オイル抽出は通常、溶媒（例えばヘキサン）抽出によりなされるが、物理的圧力および／または溶媒抽出を組み合わせてもなされうる。得られるオイルは原油と称される。原油は、その非水和性トリグリセリド画分（大豆油）からの分離を促進するリン脂質や他の極性および中性脂質複合体を水和することにより脱ガムされうる。得られるレシチンガムをさらに加工し、乳化剤および放出剤（すなわち固着防止剤（ａｎｔｉｓｔｉｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ））のような、種々の食品および工業製品において用いられる商業的に重要なレシチン生成物の製造が可能である。脱ガム油は、不純物（主に遊離脂肪酸、色素および残留ガム）の除去のためにさらに精錬されうる。精錬を遊離脂肪酸と反応する腐食剤の添加により行うことで、原油中に石鹸や水和性リン脂質およびタンパク質が形成される。水を用い、精錬中に形成される石鹸の痕跡が洗い流される。ソープストック副産物を動物飼料中に直接使用するかまたは酸性化することで遊離脂肪酸の回収が可能である。大部分のクロロフィルおよびカロチノイド化合物を除去する漂白土との吸着により脱色される。精錬油の水素化により、様々な融解特性および生地を有する油脂が生成されうる。脱蝋（Ｗｉｎｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（分画化）を用い、注意深く制御された冷却条件下での結晶化による水素化油からのステアリンの除去が可能である。（主に真空下での蒸気蒸留を介した）脱臭化は最終ステップであり、オイルに臭気または風味を与える化合物を除去するように設計される。トコフェロールおよびステロールなどの他の貴重な副産物は、脱臭化プロセスの間に除去されうる。これらの副産物を含有する脱臭化された蒸留液は、天然ビタミンＥおよび他の高価な医薬品の生産のために販売されうる。精製、漂白（水素化、分画化）および脱臭化されたオイルおよび油脂は、直接に包装、販売されうるか、またはより特化された製品にさらに加工されうる。大豆種子の加工、大豆油の生産、および副産物の利用に対するより詳細な参考文献は、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｂｏａｒｄ（１９９５年）に見出されうる。大豆油は、ココナツ油、パーム油、パーム核油、およびカカオ油などと比較される場合に飽和脂肪酸が比較的少ないことから室温で液体である。
精製および／または精錬がなされているＰＵＦＡを含有する植物および微生物油は水素化されることにより、様々な融解特性および生地を有する油脂が生成されうる。（スプレッド、菓子の油脂、ハードバター、マーガリン、ベーキングショートニングなどを含む）多数の加工油脂は、室温で様々な程度の堅さを必要とし、原料油の物理的特性の改変によってのみ生産可能である。これは最も一般的には水素化触媒を通じて行われる。
水素化は、水素がニッケルなどの触媒の利用により不飽和脂肪酸の二重結合に付加される化学反応である。例えば、高オレイン酸大豆油は、不飽和オレイン脂肪酸、リノール脂肪酸、およびリノレン脂肪酸を含有し、これら各々は水素化されうる。水素化は２つの主要な効果を有する。第１に、不飽和脂肪酸含有量の低下の結果としてオイルの酸化安定性が高まる。第２に、脂肪酸修飾により融点が高まり、室温で半液体または固体油脂をもたらすことからオイルの物理的特性が変化する。
水素化反応に影響を与える変数は多く、それにより最終生成物の組成が次々と改変される。圧力、温度、触媒タイプおよび濃度、撹拌、および反応装置の設計を含む運転条件は、より重要な制御可能なパラメータの中に含まれる。選択的水素化条件を用い、不飽和度が低い脂肪酸よりも不飽和度が高い脂肪酸の水素化が可能である。非常に軽度の（ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｂｒｕｓｈ）水素化を用いることで、液体オイルの安定性が高まることが多い。さらなる水素化により、液体オイルが物理的に固体の油脂に変換される。水素化の程度は、特定の最終生成物用に設計された所望の性能および融解特性に依存する。（工業的なフライおよび焙焼工程で用いられるベーキング製品、固体油脂およびショートニングの製造において用いられる）液体ショートニングおよびマーガリン製造用の基点在庫（ｂａｓｅ ｓｔｏｃｋ）は、水素化を通じて得られる無数の考えられるオイルおよび油脂製品の中に含まれる。水素化および水素化製品に関するより詳細な説明が、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｈ．Ｂ．Ｗ．、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９９４年）の中に見出されうる。
水素化油は、水素化プロセスから生じるトランス脂肪酸異性体の存在が原因でやや論争の的になっている。多量のトランス異性体の摂取は、血漿中での低密度リポタンパク質対高密度リポタンパク質の比の増加および冠動脈性心疾患のリスクの増大を含む有害な健康効果に関連している。
食材、健康食品、医薬品および動物飼料において用いられるＰＵＦＡ含有油
現在の市場は、ω−３および／またはω−６脂肪酸（特にＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡなど）を含有する多種多様な食品および飼料製品に対応している。本発明のＰＵＦＡ含有植物／種油、改変種子、および微生物バイオマスおよび／またはオイルが食品および飼料製品中で機能し、現処方での健康上の利益をもたらすことになると考えられる。本発明のオイルは、他の植物油と比べると、物理的観点から判断して、食品用途での他のオイルと同様に機能すると考えられる（例えば、大豆油などの部分水素化油は、ソフトスプレッド、マーガリンおよびベーキングやフライ用のショートニングにおける原料として幅広く用いられる）。
ω−３および／もしくはω−６脂肪酸を含有する植物／種油、改変種子、および微生物バイオマスおよび／またはオイルは、限定はされないが、食品類似物、肉製品、穀物製品、ベーキング食品、スナック食品および乳製品を含む種々の食品および飼料製品における使用に適することになる。
さらに、本発明の植物／種油、改変種子、および微生物バイオマスおよび／またはオイルを調合物中で用い、医療栄養食品、栄養補助食品、乳児用調乳および医薬品を含む医療食品において健康上の利益がもたらされうる。食品加工および食品製剤に関する当業者は、植物および微生物油のいかなる量および組成が食品または飼料製品に添加されうるかを理解するであろう。かかる量は、本明細書中で「有効」量と称され、食品または飼料製品、同製品による補助が意図された食事、あるいは医療食品または医療栄養食品による治癒または治療が意図された病状に依存することになる。
食品類似物は当業者に周知のプロセスを用いて製造されうる。肉類似物、チーズ類似物、ミルク類似品などについても言及可能である。大豆から作られる肉類似品は、種々の肉を模倣するため、大豆タンパク質または豆腐および一緒に混合される他の原料を含有する。これらの肉代替品は冷凍、缶詰または乾燥食品として販売される。通常、それらはその代替食品と同様に用いられうる。大豆から作られる肉代替品は、タンパク質、鉄およびビタミンＢの優れた供給源である。肉代替品の例として、限定はされないが、ハム類似品、ソーセージ類似品、ベーコン類似品などが挙げられる。
食品類似物は、その機能および組成特性に応じて模倣物または代替物として分類されうる。例えば、イミテーションチーズはその代替用に設計されたチーズにあくまで類似する必要がある。しかし、製品は一般に、それが代替しているチーズに対して栄養的に等価であり、かつそのチーズにおける最低限の組成要件を満たす場合に限って代替チーズと称されうる。したがって、代替チーズは、イミテーションチーズよりも高いタンパク質レベルを有し、ビタミンおよびミネラルで強化されることが多くなる。
ミルク類似品または非乳食品として、限定はされないが、イミテーションミルクおよび非乳食品の冷凍デザート（例えば大豆から作られるものおよび／または大豆タンパク質製品）が挙げられる。
肉製品は多種多様な製品を包含する。米国では、「肉」は牛、豚および羊から生産される「赤肉」を含む。赤肉に加え、鶏、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、アヒルや魚および貝を含む家禽製品がある。加工された調味肉製品には、新鮮肉、塩漬け肉および揚げ肉や塩漬けされ調理された肉といった幅広い品揃えがある。ソーセージおよびホットドックは加工肉製品の例である。したがって、本明細書で用いられる「肉製品」という用語は、限定はされないが加工肉製品を含む。
穀物食品は穀物の加工から得られる食品である。穀物は食用穀物（種子）を生成するイネ科由来の任意の植物を含む。最も有名な穀物は、大麦、トウモロコシ、キビ、オート麦、キノア、米、ライ麦、サトウモロコシ、ライ小麦、小麦およびワイルドライスである。穀物食品の例として、限定はされないが、全粒、破砕穀物（ｃｒｕｓｈｅｄ ｇｒａｉｎ）、グリット、小麦粉、ぬか、胚芽、朝食用シリアル、押出食品（ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｆｏｏｄｓ）、パスタなどが挙げられる。
焼き食品（ｂａｋｅｄ ｇｏｏｄｓ ｐｒｏｄｕｃｔ）は、上記の穀物食品のいずれかを含み、ベーキング（すなわち加熱による乾燥または硬化）と同様の方法での焼き付けまたは加工がなされている。焼き食品の例として、限定はされないが、パン、ケーキ、ドーナツ、棒状の食品（ｂａｒｓ）、パスタ、パン粉、ベークドスナック（ｂａｋｅｄ ｓｎａｃｋｓ）、ミニビスケット、ミニクラッカー、ミニクッキー、およびミニプレッツェルが挙げられる。上記のように、本発明のオイルは原料として用いられうる。
スナック食品は、上記または下記の食品のいずれかを含む。
フライ食品は、揚げられている上記または下記の食品のいずれかを含む。
健康食品は、健康上の利益をもたらす任意の食品である。多数の油料種子由来の食品が健康食品と考えられうる。
飲料は、液体中にかまたは乾燥粉末形態で存在しうる。
例えば、フルーツジュース、フレッシュジュース、冷凍ジュース、缶ジュースまたは濃縮ジュース；フレーバーまたはプレーンの乳飲料などの非炭酸飲料についての言及が可能である。成人用および乳児用栄養製剤は当該技術分野で周知であり、市販されている（例えば、Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）、およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。
乳児用調乳は、乳児および若年小児に提供される液体であるかまたは戻された粉末である。「乳児用調乳」は、本明細書では乳児に提供されるヒト朝食用ミルクと代替可能な経腸栄養製品として定義され、典型的には水溶液中で望ましい百分率の炭水化物およびタンパク質と混合された望ましい百分率の脂肪分からなる（例えば米国特許第４，６７０，２８５号明細書を参照）。平均的なヒト朝食用ミルクは、世界的な組成研究や専門家集団により特定されたレベルに基づき、典型的には全脂肪酸の約０．２０％〜０．４０％を含有し（脂肪から約５０％のカロリーを仮定）、一般にＤＨＡ対ＡＲＡの比であれば約１：１〜１：２の範囲となる（例えば、Ｅｎｆａｍｉｌ ＬＩＰＩＬ（商標）（Ｍｅａｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）およびＳｉｍｉｌａｃ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の製剤を参照）。乳児用調乳は、乳児における栄養の唯一の供給源であることが多いことから乳児の食事において果たすべき特別な役割を有し、また、乳児にとっては授乳がやはり最良の栄養であるが、乳児用調乳は乳児の生存だけでなく発育にとってほぼ十分な第２の栄養である。
乳製品はミルクから得られる製品である。ミルク類似品または非乳製品、例えば豆乳は、上で考察したようにミルク以外の供給源から得られる。これらの製品として、限定はされないが、全乳、スキムミルク、ヨーグルトまたは酸乳などの発酵乳製品、クリーム、バター、濃縮ミルク、粉ミルク、コーヒーホワイトナー、コーヒークリーマ、アイスクリーム、チーズなどが挙げられる。
本発明のＰＵＦＡ含有油であれば含有しうるさらなる食品として、例えば、チューイングガム、菓子およびフロスティング、ゼラチンおよびプディング、ハードおよびソフトキャンデー、ジャムおよびゼリー、白グラニュー糖、糖代替物、スイートソース、トッピングおよびシロップ、ならびにドライブレンドされた粉体混合物が挙げられる。
健康食品は、健康上の利益をもたらす任意の食品であり、機能食品、医療食品、医療栄養食品および栄養補助食品を含む。さらに、本発明の植物／種油、改変種子および微生物油は標準の医薬組成物中で用いられうる（例えば、長鎖ＰＵＦＡ含有油は上記の食品のいずれにも容易に含有され、それによる機能または医療食品の生産が可能である）。ＰＵＦＡを含有するより濃縮された製剤には、ヒトまたはヒト以外の動物における栄養補助食品として使用可能なカプセル、粉末、タブレット、ソフトジェル、ジェルキャップ、液体濃縮物およびエマルジョンが含まれる。
動物飼料は、一般に、飼料としての使用またはヒト以外の動物用の飼料中での混合が意図された製品として本明細書中で定義される。本発明の植物／種油、改変種子および微生物油は、様々な動物飼料中の原料として用いられうる。
より詳細には、限定はされないが、本発明のオイルがペット食品、反芻動物および家禽食品ならびに養殖食品の中で使用可能であると想定される。ペット食品は、ペット（例えば、犬、猫、鳥、爬虫類、および齧歯類）への給与が意図された食品である。これらの食品は、上記の穀物および健康食品、ならびに肉および肉副産物、大豆タンパク質製品、生草および乾草製品（例えば、アルファルファ、オオアワガエリ、オートまたはスズメノチャヒキ、野菜）を含みうる。反芻動物および家禽食品は、動物（例えば、七面鳥、チキン、牛、および豚）への給与が意図された食品である。上記ペット食品と同様、これらの食品は、上に列挙される穀物および健康食品、大豆タンパク質製品、肉および肉副産物、および生草および乾草製品を含みうる。養殖食品（または「養殖飼料」）は養殖での使用が意図された食品であり、すなわちそれは増殖、培養、または水生生物および／または動物の淡水または海水中での飼育に関する。
本発明は、以下の実施例においてさらに定義され、ここで特に指定のない限り、部分および百分率は重量によるものであり、度はセ氏である。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性をその主旨および範囲から逸脱することなく確認でき、本発明の様々な変更および改良を行い、それを様々な用法および条件に適合させることができる。したがって、上記から、当業者は、本明細書中に示され記載される改良に加えて本発明の様々な改良について理解するであろう。かかる改良はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図されている。
略語の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
一般的方法：
発現カセットにおける命名法
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により示されることになり、ここでＸはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子コード領域断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、それらはすべて互いに作動可能に連結される。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２、＃７６９８２および＃９０８１２を有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を、典型的には下記の手法に従い、いくつかの培地中、２８〜３０℃で成長させた。寒天プレートは２０ｇ／Ｌの寒天の各液体培地への添加によって必要であることから、標準的方法に従って調製した。
ＹＰＤ寒天培地（１リットル当たり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］；および２０ｇのグルコース
基本最少培地（ＭＭ）（１リットル当たり）：２０ｇのグルコース；１．７ｇのアミノ酸を有しない酵母窒素塩基；１．０ｇのプロリン；およびｐＨ６．１（調節なし）
最少培地＋ウラシル（ＭＭ＋ウラシルまたはＭＭＵ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭ培地を調製し、０．１ｇのウラシルおよび０．１ｇのウリジンを添加する。
最少培地＋ウラシル＋スルホニル尿素（ＭＭＵ＋ＳＵ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭＵ培地を調製し、２８０ｍｇのスルホニル尿素を添加する。
最少培地＋ロイシン（ＭＭ＋ロイシンまたはＭＭＬｅｕ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭ培地を調製し、０．１ｇのロイシンを添加する。
最少培地＋ロイシン＋ウラシル（ＭＭＬｅｕＵｒａ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭ培地を調製し、０．１ｇのロイシン、０．１ｇのウラシルおよび０．１ｇのウリジンを添加する。
最少培地＋ロイシン＋リジン（ＭＭＬｅｕＬｙｓ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭ培地を調製し、０．１ｇのリジン、０．１ｇのロイシンを添加する。
最少培地＋５−フルオロオロチン酸（ＭＭ＋５−ＦＯＡ）（１リットル当たり）：（供給者から受け取った各バッチ内部でばらつきが生じることから）１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく、２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素塩基、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジンおよび適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））。
高グルコース培地（ＨＧＭ）（１リットル当たり）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調節を必要としない）
特に断りのない限り、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換を、Ｃｈｅｎ Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２−２３５頁（１９９７年））の方法に従って行った。つまり、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃で約１８時間成長させた。多量の数白金耳の細胞をプレートからこすり、５０％ＰＥＧ２．２５ｍＬ、平均分子量３３５０；２Ｍ酢酸リチウム０．１２５ｍＬ、ｐＨ６．０；２Ｍ ＤＴＴ０．１２５ｍＬ；および（場合により）５０μｇの剪断されたサケ精液ＤＮＡを含有する形質転換緩衝液１ｍＬ中に再懸濁した。次いで、約５００ｎｇの線状化プラスミドＤＮＡを再懸濁細胞１００μＬ中でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃で１時間維持した。細胞を選択培地プレート上に播種し、３０℃で２〜３日間維持した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析においては、細胞を遠心分離により回収し、脂質をＢｌｉｇｈ Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７頁（１９５９年））に記載のように抽出した。脂肪酸メチルエステルを脂質抽出物とナトリウムメトキシドとのエステル交換により調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ Ｉ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８−４６頁（１９９０年））、次いで３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径） ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを具備するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）〜１８５℃であった。
直接の塩基エステル交換においては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を採取し、蒸留水で１回洗浄し、真空下、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで５〜１０分間乾燥した。ナトリウムメトキシド（１％の１００μＬ）を試料に添加し、次いでそれをボルテックスし、２０分間振とうした。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよびヘキサン４００μＬの添加後、試料をボルテックスし、回転した。上部層を除去し、上記のようにＧＣにより分析した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３の作成
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３を下記の実施例５２、５３および５４における宿主として用いた。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来の株Ｙ４３０５Ｕ３の作成についての概要を以下に記載する。株Ｙ４３０５Ｕ３は、全脂質に対する約５３．２％のＥＰＡをΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して生成可能である（図４４）。
株Ｙ４３０５Ｕ３の作成には、株Ｙ２２２４（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自己突然変異から得られるＦＯＡ耐性突然変異体）、（Ｌｅｕ−表現型を有する１７％ＥＤＡを生成する）株Ｙ４００１、（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型を有する１７％ＥＤＡを生成する）株Ｙ４００１Ｕ１、（Ｌｅｕ−表現型を有する１８％ＤＧＬＡを生成する）株Ｙ４０３６、（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型を有する１８％ＤＧＬＡを生成する）株Ｙ４０３６Ｕ、（Ｕｒａ−表現型を有する１２％ＡＲＡを生成する）株Ｙ４０７０、（１４％ＥＰＡを生成する）株Ｙ４０８６、株Ｙ４０８６Ｕ１（Ｕｒａ３−）、（３７％ＥＰＡを生成する）株Ｙ４１２８、株Ｙ４１２８Ｕ３（Ｕｒａ−）、（４２％ＥＰＡを生成する）株Ｙ４２１７、株Ｙ４２１７Ｕ２（Ｕｒａ−）、（４６．５％ＥＰＡを生成する）株Ｙ４２５９および株Ｙ４２５９Ｕ２（Ｕｒａ−）の作成が必要であった。
株Ｙ２２２４の作成：株Ｙ２２２４を以下の方法で単離した。ＹＰＤ寒天プレート由来のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２細胞を、２５０ｍｇ／Ｌの５−ＦＯＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を有するＭＭプレート（ウラシルおよびウリジンの各々が７５ｍｇ／Ｌ、硫酸アンモニアを有し、アミノ酸を有しない６．７ｇ／ＬのＹＮＢ、および２０ｇ／Ｌのグルコース）上に画線培養した。プレートを２８℃でインキュベートし、得られたコロニーの中の４種を、２００ｍｇ／ｍＬの５−ＦＯＡを有するＭＭプレート上とウラシルおよびウリジンが存在しないＭＭプレート上に別々にパッチした。これを行うことで、ウラシルＵｒａ３の栄養要求性を確認した。
全脂質の約１７％のＥＤＡを生成するための株Ｙ４００１の作成：株Ｙ４００１をコンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３（図４５Ａ）の組み込みを介して作成した。４種のキメラ遺伝子（すなわち、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、および２種のΔ９エロンガーゼ）を有するこのコンストラクトを株Ｙ２２２４のＬｅｕ２遺伝子座に組み込むことにより、ＥＤＡの生成を可能にした。
コンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３は、以下の表８に示される成分を含有した。
Figure 2010523113
プラスミドｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法によるヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４（すなわちＡＴＣＣ＃２０３６２ Ｕｒａ３−）の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭＬｅｕ培地プレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。コロニーを採取し、ＭＭおよびＭＭＬｅｕ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕプレート上で成長できてもＭＭプレート上で成長できないコロニーをＬｅｕ−株として選択した。Ｌｅｕ−株の単一のコロニーを用い、液体ＭＭＬｅｕに接種し、液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＥＤＡがｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３の４種のキメラ遺伝子を有する形質転換体中に存在するがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２２２４対照株中には存在しないことが示された。選択された３６のＬｅｕ−株の大部分が全脂質の約１２〜１６．９％のＥＤＡを生成した。株Ｙ４００１、Ｙ４００２、およびＹ４００３と称される３つの株が、それぞれ全脂質の約１７．４％、１７％、および１７．５％のＥＤＡを生成した。
Ｙ４００１、Ｙ４００２、およびＹ４００３株の単一のコロニーを用い、液体ＭＭＬｅｕに接種し、液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。ＧＣ分析によると、Ｙ４００１、Ｙ４００２、およびＹ４００３株が全脂質の約２４％のＥＤＡを生成することが示された。
株Ｙ４００１Ｕ（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）の作成：株Ｙ４００１Ｕを株Ｙ４００１内でプラスミドｐＹ１１６（図４５Ｂ）内のＣｒｅ組換え酵素の一時的発現を介して作成し、Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型を生成した。コンストラクトｐＹ１１６は以下の成分を含有した。
Figure 2010523113
プラスミドｐＹ１１６を、一般的方法による新たに成長されたＹ４００１細胞の形質転換のために用いた。形質転換細胞を２８０μｇ／ｍＬのスルホニル尿素（クロリムロンエチル、Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を有するＭＭＬｅｕＵｒａプレート上に播種し、プレートを３０℃で３〜４日間維持した。４つのコロニーを採取し、次いでそれを用いて液体ＹＰＤ３ｍＬに接種した。液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で１日間振とうした。培養物を液体ＭＭＬｅｕＵｒａ培地で１：５０，０００に希釈し、１００μＬを新しいＹＰＤプレート上に播種した。プレートを３０℃で２日間維持した。コロニーを採取し、ＭＭＬｅｕおよびＭＭＬｅｕＵｒａ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕＵｒａプレート上で成長できるがＭＭＬｅｕプレート上では成長できないコロニーを選択し、ＧＣにより分析し、Ｃ２０：２（ＥＤＡ）の存在を確認した。いくつかの株（各々がＬｅｕ−およびＵｒａ−表現型を有する）が全脂質の約１７％のＥＤＡを生成し、それらをＹ４００１Ｕと称した。これらの株の中の１つをＹ４００１Ｕ１と称した。
全脂質の約１８％のＤＧＬＡを生成するためのＹ４０３６株の作成：コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９（図４６Ａ；配列番号３２４）を作成し、（Δ１２デサチュラーゼ、１種のΔ９エロンガーゼ、および２種の突然変異Δ８デサチュラーゼを含む）４種のキメラ遺伝子を株Ｙ４００１Ｕ１のΔ１２遺伝子座に組み込み、それによりＤＧＬＡの生成を可能にした。コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９は以下の成分を有した。
Figure 2010523113
Figure 2010523113
ｐＫＯ２ＵＦ８２８９プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４００１Ｕ１の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭＬｅｕ培地プレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。コロニーを採取し、ＭＭＬｅｕ選択プレート上に３０℃で２日間画線培養した。次いでこれらの細胞を用い、液体ＭＭＬｅｕ培地に接種し、液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＤＧＬＡがｐＫＯ２ＵＦ８２８９の４種のキメラ遺伝子を有する形質転換体中に存在するが親Ｙ４００１Ｕ１株中に存在しないことが示された。選択された９６株の大部分が全脂質の７％および１３％のＤＧＬＡを生成した。Ｙ４０３４、Ｙ４０３５、Ｙ４０３６、Ｙ４０３７、Ｙ４０３８、およびＹ４０３９と称される６つの株が、それぞれ全脂質の約１５％、１３．８％、１８．２％、１３．１％、１５．６％、および１３．９％のＤＧＬＡを生成した。
株Ｙ４０３６Ｕ（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ３−）の作成：コンストラクトｐＹ１１６（図４５Ｂ；配列番号３２３）を用い、株Ｙ４０３６中でＣｒｅ組換え酵素を一時的に発現した。これはゲノム由来のＬｏｘＰとサンドイッチ構造の（ｓａｎｄｗｉｃｈｅｄ）Ｕｒａ３遺伝子を放出した。
プラスミドｐＹ１１６を用い、一般的方法により株Ｙ４０３６を形質転換した。形質転換後、細胞をＭＭＬｅｕＵｒａプレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。ＭＭＬｅｕＵｒａプレート上で成長させた各コロニーを採取し、ＹＰＤ液体培地に画線培養した。液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で１日間振とうし、ｐＹ１１６プラスミドを救済した。成長させた培養物由来の細胞をＭＭＬｅｕＵｒａプレート上に画線培養した。３０℃で２日後、各コロニーをＭＭＬｅｕＵｒａ、ＭＭＵおよびＭＭＬｅｕプレート上に再度画線培養した。ＭＭＬｅｕＵｒａ上で成長できるがＭＭＵまたはＭＭＬｅｕプレート上で成長できないコロニーを選択した。Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型を有する１つの株をＹ４０３６Ｕ（Ｕｒａ−、Ｌｅｕ−）と称した。
全脂質の約１２％のＡＲＡを生成するためのＹ４０６９およびＹ４０７０株の作成：コンストラクトｐＺＫＳＬ−５５５Ｒ（図４６Ｂ；配列番号３３１）を作成し、３種のΔ５デサチュラーゼ遺伝子を株Ｙ４０３６ＵのＬｙｓ遺伝子座に組み込み、それによりＡＲＡの生成を可能にした。ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒプラスミドは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
ｐＺＫＳＬ−５５５ＲプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４０３６Ｕの形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭＬｅｕＬｙｓプレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。次いで、単一のコロニーをＭＭＬｅｕＬｙｓプレート上に再度画線培養し、得られたコロニーを用い、液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに接種した。次いで、液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＡＲＡがｐＺＫＳＬ−５５５Ｒの３種のキメラ遺伝子を有する形質転換体中に存在するが親Ｙ４０３６Ｕ株中に存在しないことが示された。選択された９６株の大部分が全脂質の約１０％のＡＲＡを生成した。Ｙ４０６８、Ｙ４０６９、Ｙ４０７０、およびＹ４０７１と称される４つの株は、それぞれ全脂質の約１１．７％、１１．８％、１１．９％および１１．７％のＡＲＡを生成した。さらなる分析によると、ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒの３種のキメラ遺伝子がＹ４０６８、Ｙ４０６９、Ｙ４０７０およびＹ４０７１株中のＬｙｓ５部位に組み込まれないことが示された。すべての株がＬｙｓ＋表現型を有した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４０７０の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ−、未知の１−、未知の３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴであった。
全脂質の約１４％のＥＰＡを生成するためのＹ４０８６株の作成：コンストラクトｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図４７Ａ；配列番号３３８）を作成し、３種のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子を株Ｙ４０７０のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）に組み込み、それによりＥＰＡの生成を可能にした。ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕプラスミドは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４０７０の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。次いで、単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、得られたコロニーを用い、液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに接種した。液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＥＰＡがｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３種のキメラ遺伝子を有する形質転換体中に存在するが親Ｙ４０７０株中に存在しないことが示された。選択された９６株の大部分が全脂質の１０〜１３％のＥＰＡを生成した。Ｙ４０８５およびＹ４０８６と称される２つの株は、それぞれ全脂質の約１４．２％および約１３．８％のＥＰＡを生成した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４０８６の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、未知の１−、未知の２−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。
株Ｙ４０８６Ｕ１（Ｕｒａ３−）の作成：株Ｙ４０８６Ｕ１を株Ｙ４０８６内でコンストラクトｐＹ１１７（図４７Ｂ；配列番号３４３）内のＣｒｅ組換え酵素の一時的発現を介して作成し、Ｕｒａ−表現型を生成した。これはゲノム由来のＬｏｘＰとサンドイッチ構造のＵｒａ３遺伝子を放出した。プラスミドｐＹ１１７内の突然変異ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＨＡＳ酵素からＳＵＲが得られ、それを陽性スクリーニングマーカーとして用いた。
プラスミドｐＹ１１７をプラスミドｐＹ１１６（上記、米国特許出願第１１／６３５２５８号明細書中に記載）から、ＰａｃＩ−ＳｗａＩ部位に隣接される突然変異ＡＨＡＳ遺伝子のＰａｃＩ−ＳｗａＩで消化されたｐＹ１１６への挿入により誘導し、それによりＬＥＵ選択可能マーカーをスルホニル尿素マーカーと交換した。したがって、コンストラクトｐＹ１１７は以下の成分を有した。
Figure 2010523113
プラスミドｐＹ１１７を用い、株Ｙ４０８６を一般的方法に従って形質転換した。形質転換後、細胞をＭＭＵ＋ＳＵ（２８０μｇ／ｍＬのスルホニル尿素；クロリムロンエチルとしても知られる、Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））プレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。ＭＭＵ＋ＳＵプレート上で成長させた各ＳＵＲコロニーを採取し、ＹＰＤ液体培地に画線培養し、液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で１日間振とうし、ｐＹ１１７プラスミドを救済した。成長させた培養物由来の細胞をＭＭＵプレート上に画線培養した。３０℃で２日後、各コロニーをＭＭおよびＭＭＵプレート上に再度画線培養した。ＭＭＵ上で成長できるがＭＭプレート上で成長できないコロニーを選択した。Ｕｒａ−表現型を有するこれらの株の中の２つをＹ４０８６Ｕ１およびＹ４０８６Ｕ２（Ｕｒａ−）と称した。
全脂質の約３７％のＥＰＡを生成するためのＹ４１２８株の作成：コンストラクトｐＺＰ２−２９８８（図４８Ａ；配列番号３４５）を作成し、１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子、２種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、および１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子を株Ｙ４０８６Ｕ１のＰｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＰ２−２９８８プラスミドは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
Figure 2010523113
ｐＺＰ２−２９８８プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４０８６Ｕ１の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、得られたコロニーを用い、液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに接種した。液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、選択された９６株の大部分が全脂質の１２〜１５．６％のＥＰＡを生成することが示された。Ｙ４１２８およびＹ４１２９と称される２つの株が、それぞれ全脂質の約３７．６％および約１６．３％のＥＰＡを生成した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４１２８の最終的な遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、Ｐｅｘ１０−、未知の１−、未知の２−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。２００７年８月２３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８が有する名称はＡＴＣＣ ＰＴＡ−８６１４である。
Ｙ４１２８Ｕ株の作成：株Ｙ４１２８中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図４８Ｂ；配列番号３５１）を作成し、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を株Ｙ４１２８のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＵＥ３Ｓは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
プラスミドｐＺＫＵＥ３ＳをＳｐｈＩ／ＰａｃＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４１２８の形質転換のために用いた。形質転換後、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、プレートを３０℃で２〜３日間維持した。
ＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上で成長させた全部で２４の形質転換体を採取し、新しいＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線培養した。細胞をプレートから掻き取り、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、プレートからのｐＺＫＵＥ３Ｓによるすべての形質転換体中に１０〜１５％のＥＰＡが存在することが示された。Ｙ４１２８Ｕ１、Ｙ４１２８Ｕ２、Ｙ４１２８Ｕ３、Ｙ４１２８Ｕ４、Ｙ４１２８Ｕ５、およびＹ４１２８Ｕ６と称される株は、それぞれ１２．９％、１４．４％、１５．２％、１５．４％、１４％、および１０．９％のＥＰＡを生成した（集合的にＹ４１２８Ｕ）。
Ｙ４１２８（３７．６％）対Ｙ４１２８Ｕ（平均１３．８％）での定量された％ＥＰＡの相違は成長条件の違いに基づく。詳細には、前者の培養物を液体培養物中で２日成長させた後に分析する一方、後者の培養物を寒天プレート上での成長後に分析した。出願人は、寒天プレートからの結果を液体培養物中での結果と比較する場合、％ＥＰＡが２〜３倍増加することを観察している。したがって、結果は直接的に比較し難いが、Ｙ４１２８およびＹ４１２８Ｕ株の双方はＥＰＡを多量に生成することが示される。
全脂質の約４２％のＥＰＡを生成するためのＹ４２１７株の作成：コンストラクトｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ（図４９Ａ；配列番号３４８）を作成し、１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ５デサチュラーゼ遺伝子、および１種のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）を株Ｙ４１２８Ｕ３のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣプラスミドは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
Figure 2010523113
ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４１２８Ｕ３の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種し、プレートを３０℃で３〜４日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで得られたコロニーを用い、液体ＭＭに接種した。液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、選択された９６株の大部分が全脂質の３２〜３９．９％のＥＰＡを生成することが示された。Ｙ４２１５、Ｙ４２１６、Ｙ４２１７、Ｙ４２１８、Ｙ４２１９およびＹ４２２０と称される６つの株が、それぞれ全脂質の約４１．１％、４１．８％、４１．７％、４１．１％、４１％および４１．１％のＥＰＡを生成した。野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての各株の最終的な遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。
株Ｙ４２１７Ｕ２（Ｕｒａ３−）の生成：株Ｙ４２１７中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図４８Ｂ；配列番号３５１）を用い、キメラＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を株Ｙ４２１７のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。形質転換後、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、プレートを３０℃で３〜４日間維持した。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させた全部で６種の形質転換体を採取し、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線培養した。６つ全部の株がＵｒａ−表現型を有した（すなわち細胞がＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長できたがＭＭプレート上で成長できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから擦り取り、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長したｐＺＫＵＥ３Ｓによるすべての形質転換体中に１８．７％〜２８．６％のＥＰＡが存在することが示された。株Ｙ４２１７Ｕ１およびＹ４２１７Ｕ２と称される２つの株がそれぞれ２２．５％および２８．６％のＥＰＡを生成した。
全脂質の約４６．５％のＥＰＡを生成するためのＹ４２５９株の作成：コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃ（図４９Ｂ；配列番号３５２）を作成し、１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子、および１種のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）を株Ｙ４２１７Ｕ２のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃプラスミドは以下の成分を含有した。
Figure 2010523113
Figure 2010523113
ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８ＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４２１７Ｕ２の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種し、プレートを３０℃で３〜４日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで得られたコロニーを用い、液体ＭＭに接種した。次いで、液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、選択された７２株の大部分が全脂質の４０〜４４％のＥＰＡを生成することが示された。Ｙ４２５９、Ｙ４２６０、Ｙ４２６１、Ｙ４２６２、Ｙ４２６３、およびＹ４２６４と称される６つの株が、それぞれ全脂質の約４６．５％、４４．５％、４４．５％、４４．８％、４４．５％、および４４．３％のＥＰＡを生成した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４２５９の最終的な遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、未知の８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。
株Ｙ４２５９Ｕ２（Ｕｒａ３−）の作成：Ｙ４２５９株中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５０Ａ；配列番号３５３）を用い、Ｕｒａ３突然変異遺伝子を株Ｙ４２５９のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＵＭは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させた全部で３種の形質転換体を採取し、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線培養した。３つ全部の株は、Ｕｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上では成長できたがＭＭプレート上では成長できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取り、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させたｐＺＫＵＭでの＃１、＃２および＃３形質転換体中に３１．４％、３１％および３１．３％のＥＰＡが存在することが示された。これら３つの株をそれぞれ株Ｙ４２５９Ｕ１、Ｙ４２５９Ｕ２およびＹ４２５９Ｕ３と称した（集合的にＹ４２５９Ｕ）。
全脂質の約５３％のＥＰＡを生成するためのＹ４３０５株の作成：コンストラクトｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２（図５０Ｂ；配列番号３５５）を作成し、1種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ５デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、および１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子を株Ｙ４２５９Ｕ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）遺伝子座に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２プラスミドは以下の成分を含有した。
Figure 2010523113
Figure 2010523113
ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４２５９Ｕ２の形質転換のために用いた。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種し、プレートを３０℃で３〜４日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、得られたコロニーを用い、液体ＭＭに接種した。液体培養物を２５０ｒｐｍ／分、３０℃で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、選択された９６株の大部分が全脂質の４０〜４６％のＥＰＡを生成することが示された。Ｙ４３０５、Ｙ４３０６、Ｙ４３０７およびＹ４３０８と称される４つの株は、それぞれ全脂質の約５３．２％、４６．４％、４６．８％、および４７．８％のＥＰＡを生成した。Ｙ４３０５の完全な脂質特性は、１６：０（２．８％）、１６：１（０．７％）、１８：０（１．３％）、１８：１（４．９％）、１８：２（１７．６％）、ＡＬＡ（２．３％）、ＥＤＡ（３．４％）、ＤＧＬＡ（２．０％）、ＡＲＡ（０．６％）、ＥＴＡ（１．７％）、およびＥＰＡ（５３．２％）である。全脂質％乾燥細胞重量（ｄｃｗ）は２７．５であった。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４３０５の最終的な遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、未知の８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。
株Ｙ４３０５Ｕ３（Ｕｒａ３−）の作成：株Ｙ４３０５中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５０Ａ；配列番号３５３）を用い、Ｕｒａ３突然変異遺伝子を株Ｙ４３０５のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させた全部で８種の形質転換体を採取し、それぞれＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線培養した。８つ全部の株はＵｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長できたがＭＭプレート上で成長できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取り、脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させたｐＺＫＵＭ形質転換体＃１、＃６および＃７中に３７．６％、３７．３％および３６．５％のＥＰＡが存在することが示された。これら３つの株をそれぞれ株Ｙ４３０５Ｕ１、Ｙ４３０５Ｕ２およびＹ４３０５Ｕ３と称した（集合的にＹ４３０５Ｕ）。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕの作成
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕを、下記の実施例３２、３３、３４および５１における宿主として用いた。株Ｙ４１８４Ｕはヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来し、全脂質に対して約３１％のＥＰＡを、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して生成可能である。
株Ｙ４１８４Ｕの作成には、株Ｙ２２２４、株Ｙ４００１、株Ｙ４００１Ｕ、株Ｙ４０３６、株Ｙ４０３６Ｕおよび株Ｙ４０６９の作成が必要であった（上記）。さらに株Ｙ４１８４Ｕの作成には（図５１Ａ中に図示）、（１４％のＥＰＡを生成する）株Ｙ４０８４、株Ｙ４０８４Ｕ１（Ｕｒａ−）、（１８％のＥＰＡを生成する）株Ｙ４１２７、株Ｙ４１２７Ｕ２（Ｕｒａ−）、（２５％のＥＰＡを生成する）株Ｙ４１５８、株Ｙ４１５８Ｕ１（Ｕｒａ−）、および（３０．７％のＥＰＡを生成する）株４１８４の作成が必要であった。株Ｙ４０６９の後に作成したＥＰＡ生成株の形質転換および選択に関する詳細は本明細書中で詳述しないが、株Ｙ４０８４、株Ｙ４０８４Ｕ１、株Ｙ４１２７、株Ｙ４１２７Ｕ２、株Ｙ４１５８、株Ｙ４１５８Ｕ１、株Ｙ４１８４、および株Ｙ４１８４Ｕの単離のために用いた方法は、上記の株Ｙ４３０５を作成過程で記載された通りであった。
つまり、コンストラクトｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図４７Ａ；配列番号３３８）を用い、３種のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子を株Ｙ４０６９のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）に組み込み、それにより（１４％のＥＰＡを生成する）株Ｙ４０８４の単離がもたらされた。株Ｙ４０８４Ｕ１を株Ｙ４０８４内でコンストラクトｐＹ１１７（図４７Ｂ；配列番号３４３）内のＣｒｅ組換え酵素の一時的発現を介して作成し、Ｕｒａ−表現型を生成した。次いで、コンストラクトｐＺＰ２−２９８８（図４８Ａ；配列番号３４５）を用い、１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子、２種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、および１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子を株Ｙ４０８４Ｕ１のＰｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）に組み込み、それにより（１８％のＥＰＡを生成する）株Ｙ４１２７の単離がもたらされた。２００７年１１月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２７が有する名称はＡＴＣＣ ＰＴＡ−８８０２である。
株Ｙ４１２７Ｕ２を、Ｕｒａ３遺伝子に対して標的化されたキメラＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含むコンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図４８Ｂ；配列番号３５１）を介して株Ｙ４１２７中のＵｒａ３遺伝子を破壊することにより作成した。コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃ（図４９Ｂ；配列番号３５２）を用い、１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子、および１種のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）を株Ｙ４１２７Ｕ２のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）に組み込み、それにより（２５％のＥＰＡを生成する）株Ｙ４１５８の単離がもたらされた。次いで、Ｕｒａ−誘導体（すなわち株Ｙ４１５８Ｕ１）を、Ｕｒａ３遺伝子に対して標的化されたキメラＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含むコンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図４８Ｂ；配列番号３５１）での形質転換を介して作成した。最終的に、コンストラクトｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ（図４９Ａ；配列番号３４８）を用い、１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ５デサチュラーゼ遺伝子、および１種のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１をＹ４１５８Ｕ１のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それにより株Ｙ４１８４の単離がもたらされた。
株Ｙ４１８４の完全な脂質特性は、１６：０（３．１％）、１６：１（１．５％）、１８：０（１．８％）、１８：１（８．７％）、１８：２（３１．５％）、ＡＬＡ（４．９％）、ＥＤＡ（５．６％）、ＤＧＬＡ（２．９％）、ＡＲＡ（０．６％）、ＥＴＡ（２．４％）、およびＥＰＡ（２８．９％）の通りである。全脂質％乾燥細胞重量（ｄｃｗ）は２３．９であった。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４１８４の最終的な遺伝子型は、未知の１−、未知の２−、未知の４−、未知の５−、未知の６−、未知の７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：Ｒｄ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった。
株Ｙ４１８４中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５０Ａ；配列番号３５３）を用い、Ｕｒａ３突然変異遺伝子を株Ｙ４１８４のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させた全部で１１種の形質転換体を採取し、それぞれＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線培養した。１１種全部の株はＵｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長できたがＭＭプレート上で成長できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取り、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させたｐＺＫＵＭでの＃７、＃８および＃１０形質転換体中に１１．２％、１０．６％、および１５．５％のＥＰＡが存在することが示された。これら３つの株をそれぞれ株Ｙ４１８４Ｕ１、Ｙ４１８４Ｕ２およびＹ４１８４Ｕ４と称した（集合的にＹ４１８４Ｕ）。
実施例１
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）の成長条件、脂質特性およびｍＲＮＡ単離
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）をＭｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）のＤｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔｒｉｅｍｅｒの研究室から入手した。活発に成長する培養物１０ｍＬからの一定分量１ｍＬを５００ｍＬのガラス瓶内のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｅｇ）培地２５０ｍＬに移した。Ｅｇ培地を、水９７０ｍＬ中で、１ｇの酢酸ナトリウム、１ｇのウシ抽出物（カタログ番号Ｕ１２６−０１、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、２ｇのＢａｃｔｏ（登録商標）トリプトン（０１２３−１７−３、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および２ｇのＢａｃｔｏ（登録商標）酵母抽出物（カタログ番号０１２７−１７−９、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を結合させて作成した。フィルタ滅菌後、土壌水の上清（カタログ番号１５−３７９０、Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））３０ｍＬを無菌添加し、最終的なＥｇ培地を作成した。ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）培養物を、撹拌せずに、２３℃、１６時間の明サイクル、８時間の暗サイクルの下で２週間成長させた。
２週間後、培養物１０ｍＬを脂質分析のために取り出し、１，８００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを水で１回洗浄し、再遠心分離した。得られたペレットを真空下で５分間乾燥し、トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＨ）１００μＬ中に再懸濁し、振とう下、室温で１５分間インキュベートした。この後、ヘキサン０．５ｍＬを添加し、バイアルを振とう下、室温で１５分間インキュベートした。脂肪酸メチルエステル（ヘキサン層から注射した５μＬ）を、Ｏｍｅｇａｗａｘ ３２０溶融シリカキャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号２４１５２）を具備するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを用いて分離、定量した。オーブン温度をプログラムし、２２０℃で２．７分間保持し、２０℃／分で２４０℃に高め、次いでさらに２．３分間保持した。キャリアガスをＷｈａｔｍａｎ水素発生装置により供給した。保持時間を市販の標準のメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｕ−９９−Ａ）における時間と比較し、得られたクロマトグラムを図２７に示す。
残留する２週間培養物（２４０ｍＬ）を１，８００×ｇでの遠心分離により１０分間でペレット状にし、水で１回洗浄し、再遠心分離した。全ＲＮＡを、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（商標）試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ））を用い、提供された製造業者のプロトコルに従い、得られたペレットから抽出した（試薬５ｍＬを使用、ＲＮＡを水０．５ｍＬ中に溶解）。この方法で全ＲＮＡ（２ｍｇ／ｍＬ）１ｍｇをペレットから得た。ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用い、提供された製造業者のプロトコルに従って１ｍｇの全ＲＮＡから単離した。この方法で８５μｇのｍＲＮＡを得た。
実施例２
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡ合成、ライブラリー作成および配列決定
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｃｌｏｎｅｍｉｎｅｒ（商標）ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号１８２４９−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用い、提供された製造業者のプロトコル（バージョンＢ、２５−０６０８）に従って作成した。非放射標識法を用い、ｃＤＮＡを３．２μｇのｍＲＮＡ（上記）からＢｉｏｔｉｎ−ａｔｔＢ２−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて合成した。第一鎖および第二鎖の合成後、ａｔｔＢ１アダプターを付加し、ライゲーションを行い、ｃＤＮＡをカラムクロマトグラフィーを用いてサイズ分画した。画分７および８（約８００〜１５００ｂｐのサイズ範囲）由来のＤＮＡを濃縮し、ｐＤＯＮＲ（商標）２２２に組換え、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１ Ｐｈａｇｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に形質転換した。ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ライブラリーをｅｅｇ１ｃと称した。
配列決定においては、クローンをまず、３８４ウェルの凍結培地プレート内で成長／凍結された保存したグリセロール培養物から回収した。自動ＱＰｉｘコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を用い、細胞を採取し、次いでＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する９６ウェルのディープウェルプレートに接種することに用いた。３７℃で２０時間成長後、細胞を遠心分離によりペレット状にし、−２０℃で保存した。次いで、プラスミドを、改良された９６ウェルフォーマットのアルカリ溶解ミニプレップ法（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰｅｒｆｅｃｔＰｒｅｐ）を用いてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５Ｐｒｉｍｅロボット上に単離した。つまり、フィルタおよび真空マニホールドを用い、酢酸塩の沈殿後に細胞残屑の除去を促進した。次いで、プラスミドＤＮＡを濾過物から直接に第２のフィルタプレート上で結合させ、洗浄し、乾燥し、溶出した。
プラスミドを、ベクターをプライムした（ｖｅｃｔｏｒ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｍ１３Ｆユニバーサルプライマー（配列番号１）およびＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅバージョン３ Ｐｒｉｓｍ配列決定キットを用い、３８４ウェルプレート内で末端配列決定した。配列決定反応においては、１００〜２００ｎｇの鋳型および６．４ｐモルのプライマーを用い、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間および６０℃で４分間といった反応条件を２５回繰り返した。エタノールに基づく洗浄後、サイクル配列決定反応産物を溶解し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７００自動シーケンサー上で検出した。
実施例３
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃからのＣ２０−ＰＵＦＡ伸長酵素相同体の同定
Ｃ２０−ＰＵＦＡ伸長酵素相同体（すなわち「Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ」）をコードするｃＤＮＡクローンを、（ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースの最近に主に発表された三次元構造のＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに由来する配列であるすべての非冗長なＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳物を含む）ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース内に含まれる配列に対する類似性について、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））探索を行うことにより同定した。実施例２で得られたｃＤＮＡ配列の、「ｎｒ」データベース内に含まれるすべての公有のＤＮＡ配列に対する類似性について、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて分析した。ＤＮＡ配列を全リーディングフレーム内で翻訳し、「ｎｒ」データベース内に含まれるすべての公有のタンパク質配列に対する類似性について、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２頁（１９９３年））を用いて比較した。便宜上、ｃＤＮＡ配列と探索データベース内に含まれる配列との一致がＢＬＡＳＴでの計算によると単なる偶然として認められるＰ値（確率）は、本明細書中で「ｐＬｏｇ」値として報告され、それは報告されたＰ値の負の対数を示す。したがって、ｐＬｏｇ値が大きくなると、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴ「ヒット」が相同タンパク質であることを示す可能性が高まる。
クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００５．ｐ１４．ｆ由来のヌクレオチド配列を用いるＢＬＡＳＴＸ探索により、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質とパブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９由来のＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３０（ＧＩ５４３０７１０８）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３０、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７３；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８４：３５７−３６６頁（２００４年））との類似性が示された。クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００５．ｐ１４．ｆ由来のｃＤＮＡ挿入物の一部の配列を配列番号３（ｃＤＮＡ挿入物の５’末端）で示す。次いで、得られた完全挿入配列（すなわちｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００５．ｐ１４．ｆ：ｆｉｓ）を配列番号４で示す。コード配列（ＣＤＳ）における配列を配列番号５で示す。対応する推定アミノ酸配列における配列を配列番号６で示す。
完全挿入配列決定（ＦＩＳ）を、修飾された転位プロトコルを用いて行った。ＦＩＳとして同定されたクローンを、保存したグリセロールストックから単一のコロニーとして回収し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解を介して単離した。プラスミド鋳型を、Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＧＳ ＩＩ）転位キット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ））を介し、製造業者のプロトコルに従って転位させた。転位ＤＮＡをＥＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））にエレクトロポレーションを介して形質転換した。複数の形質転換体を各転位反応物から無作為に選択し、プラスミドＤＮＡを調製し、鋳型を、固有のプライマーＳｅｑＥ（配列番号７）およびＳｅｑＷ（配列番号８）を用い、転位事象部位から外部に、上記のように（ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ ｖ３．１で）配列決定した。
配列データを収集し（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓソフトウェア）、Ｐｈｒａｐ配列アセンブリプログラム（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ））を用いてアセンブルした。アセンブリーを、最終編集において、Ｃｏｎｓｅｄ配列エディタ（Ｄ．Ｇｏｒｄｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ））により閲覧した。
配列番号６で示されるアミノ酸配列をＢＬＡＳＴＰにより評価し、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して６１．２２のｐＬｏｇ値（６ｅ−６２のＥ値）を得た。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法を用いると、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ配列（配列番号２）に対して４５．１％同一である。Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法（Ｈｅｉｎ Ｊ．Ｊ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８３：６２６−６４５頁（１９９０年））によりなされる配列同一性パーセントの計算を、ペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（ＫＴＵＰＬＥ＝２）を伴うＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムを用いて行った。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法を用いると、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ配列（配列番号２）に対して４０．４％同一である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１頁（１９９２年））によりなされる配列同一性パーセントの計算を、ペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ＝５およびダイアゴナルズセイブド＝５およびギャップ長ペナルティ＝１０）を伴うＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（上記）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムを用いて行った。ＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本核酸断片（配列番号５）が、本明細書でＥｇＣ２０ｅｌｏ１と称されるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ遺伝子の全体をコードすることを示す。
図２５に、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（実施例３）、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（実施例４、下記）、およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（実施例５、下記）におけるＢＬＡＳＴＰおよび同一性パーセント値をまとめる。
実施例４
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃからのＤＨＡシンターゼ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）の同定
追加的なＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ相同体をコードするｃＤＮＡクローンを、実施例３に記載のＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース内に含まれる配列に対する類似性についてのＢＬＡＳＴ探索を行うことにより同定した。
クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆ（ｐＫＲ１０４９とも称される）由来のヌクレオチド配列を用いるＢＬＡＳＴＸ探索により、ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質がパブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９由来のＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３０（ＧＩ５４３０７１０８）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３０、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７３；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８４：３５７−３６６頁（２００４年））に対して類似性があることが示された。クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆ由来のｃＤＮＡ挿入物の一部の配列を配列番号９（ｃＤＮＡ挿入物の５’末端）で示す。次いで、実施例３に記載のように得られた完全挿入配列（ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆ：ｆｉｓ）を配列番号１０で示す。コード配列を配列番号１１で示し、対応する推定アミノ酸配列を配列番号１２で示す。
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を実施例３に記載のＢＬＡＳＴＰにより評価した。興味深いことに、配列番号１２は、Ｃ２０−ＰＵＦＡ ＥｌｏおよびΔ４脂肪酸デサチュラーゼの双方に類似することが見出された。配列番号１２のＮ末端（アミノ酸約１６〜２６８由来）は、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して６０．３０のｐＬｏｇ値（５ｅ−６１のＥ値；１２４／２５８に一致するアミノ酸；４８％の同一性）をもたらす。配列番号１２のＣ末端（アミノ酸約２５３〜７９３に由来）は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＱ１９６０５（ＧＩ３３４６６３４６）、遺伝子座ＡＡＱ１９６０５、ＣＤＳ ＡＹ２７８５５８；Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（３２）：９７７９−９７８８頁（２００３年））に対して０．０のＥ値（５３５／５４１に一致するアミノ酸；９８％の同一性）をもたらす。ＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本核酸断片（配列番号１１）が、本明細書でユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）と称されるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ／Δ４脂肪酸デサチュラーゼ融合遺伝子の全体をコードすることを示す。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のアミノ酸配列（配列番号１２）は、実施例３に記載のＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法を用いると、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９由来のＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して４７．８％同一であり、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）に対して９８．９％同一である。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のアミノ酸配列（配列番号１２）は、実施例３に記載のＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法を用いると、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９由来のＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して４１．２％同一であり、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）に対して９８．９％同一である。
図２７に、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（実施例４）、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（実施例３、上記）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（実施例５、下記）におけるＢＬＡＳＴＰおよび同一性パーセント値をまとめる。
実施例５
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃからのＤＨＡシンターゼ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２）の同定
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃの約１７，０００のクローンを３つの大きい正方形（２４ｃｍ×２４ｃｍ）ペトリプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））（各々、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン寒天培地を有する）上に播種した。細胞を３７℃で一晩成長させ、次いでプレートを室温まで冷却した。
コロニーリフト
Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂの０．４５μｍ膜（カタログ番号６０２０７、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｅｎｓａｃｏｌａ，ＦＬ））を約２２ｃｍ×２２ｃｍにトリムし、膜を寒天の上部に注意深く置き、気泡を回避した。室温で２分間のインキュベーション後、膜を方向に応じて印を付け、ピンセットでリフトオフし、コロニー側を上にして０．５Ｍ水酸化ナトリウムおよび１．５Ｍ塩化ナトリウムで浸した濾紙上に置いた。４分間変性後、水酸化ナトリウムを、膜を０．５Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）および１．５Ｍ塩化ナトリウムで浸した濾紙上に４分間置くことによって中和した。このステップを繰り返し、膜を２×ＳＳＣ緩衝液（２０×ＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）で短時間すすぎ、濾紙上で風乾した。
ハイブリダイゼーション
膜をハイブリダイゼーション溶液２００ｍＬ中、６５℃で２時間予備ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬は２％（ｗ／ｖ）フィコル、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、２％（ｗ／ｖ）アセチル化ウシ血清アルブミン）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍＬの剪断サケ精液ＤＮＡ、および５％硫酸デキストランを含有した。
ＤＮＡプローブを、ＲａｄＰｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８４２８−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用い、製造業者の使用説明書に従ってＰ３２ｄＣＴＰで標識した（本明細書中、実施例１０に記載の）ｐＹ１４１由来のＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊を有するアガロースゲル精製ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を用いて作成した。組み込まれていないＰ３２ｄＣＴＰを、ＮＩＣＫカラム（カタログ番号１７−０８５５−０２、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用い、製造業者の使用説明書に従って分離した。プローブを１００℃で５分間変性させ、氷上に３分間置き、次いで半分をハイブリダイゼーション溶液に添加した。
膜をプローブと、軽く振とうさせながら６５℃で一晩ハイブリダイズし、次いで翌日、０．５％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで２回洗浄し（各々、５分間）、０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣで２回洗浄した（各々、１５分間）。洗浄後、ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（カタログ番号ＲＰＮ３０Ｋ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を膜に−８０℃で一晩暴露した。
プレートと暴露されたｈｙｐｅｒｆｉｌｍとのアラインメントに基づき、陽性コロニーを、Ｐａｓｔｅｕｒピペットの平滑末端を用いて採取して水１ｍＬ中に入れ、次いでボルテックスした。いくつかの希釈物を製造し、ＬＢ培地＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する小さくて丸いペトリ皿（８２ｍｍ）上に播種し、単一のプレート上に約１００ウェルの単離コロニーを得た。ＮｙｔｒａｎＮ膜サークル（カタログ番号１０４１６１１６、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ））の使用以外では上記のようにリフトし、ハイブリダイゼーションを残存する放射性標識プローブを用いて１００ｍＬ中で行った。この方法で、１つの陽性クローンを同定した（ｅｅｇ１ｃ−１と称される）。ｅｅｇ１ｃ−１由来のプラスミドはｐＬＦ１１６とも称されうる。
各陽性クローンをＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン液体培地中、３７℃で成長させ、プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従って精製した。プラスミド挿入物を、ベクターをプライムしたＭ１３Ｆユニバーサルプライマー（配列番号１）、ベクターをプライムしたＭ１３ｒｅｖプライマー（配列番号１４）、およびポリ（Ａ）テールをプライムしたＷｏｂｂｌｅＴオリゴヌクレオチドを用いるＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅバージョン３ Ｐｒｉｓｍ配列決定キットを用い、実施例２に記載のように配列決定した。つまり、ＷｏｂｂｌｅＴプライマーは、ｃＤＮＡクローンの３’末端を配列決定するための２１ｍｅｒのポリ（Ｔ）Ａ、ポリ（Ｔ）Ｃ、およびポリ（Ｔ）Ｇの等モルずつの混合物である。初期の配列データに基づき、追加的な内部断片配列を、オリゴヌクレオチドｏＥＵＧｅｌ４−１（配列番号１５）、ＥｇＥｌｏＤ４Ｍｕｔ−５（配列番号１６）、ｏＥＵＧｅｌ４−２（配列番号１７）、ＥｇＤＨＡｓｙｎ５’（配列番号１８）、およびＥｇＤＨＡｓｙｎ３’（配列番号１９）を用い、同様の方法で得た。このようにして得られたｅｅｇ１ｃ−１の完全挿入配列を配列番号２０で示す。コード配列を配列番号２１で示す一方、対応する推定アミノ酸配列を配列番号２２で示す。
配列番号２２で示されるアミノ酸配列を、実施例３で記載のようにＢＬＡＳＴＰにより評価した。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１における場合と同様、配列番号２２もまたＣ２０−ＰＵＦＡ ＥｌｏおよびΔ４脂肪酸デサチュラーゼの双方に類似することが見出された。（アミノ酸約４１〜２６８由来の）配列番号２２のＮ末端は、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して６１．０のｐＬｏｇ値（１ｅ−６１のＥ値；１１８／２３１に一致するアミノ酸；５１％の同一性）をもたらす。（アミノ酸約２５３〜７９３由来の）配列番号２２のＣ末端は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１３）に対し、０．０のＥ値（５４１／５４１に一致するアミノ酸；１００％の同一性）をもたらす。ＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本核酸断片（配列番号２１）が、本明細書でユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２）と称されるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ／Δ４脂肪酸デサチュラーゼ融合遺伝子の全体をコードすることを示す。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のアミノ酸配列（配列番号２２）は、実施例３に記載のＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法を用いると、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９由来のＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して４８．２％同一であり、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）に対して１００％同一である。ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のアミノ酸配列（配列番号２２）は、実施例３に記載のＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法を用いると、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９由来のＣ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対して４１．２％同一であり、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）に対して１００％同一である。
図２５に、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２（実施例５）、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（実施例３、上記）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ１（実施例４、上記）におけるＢＬＡＳＴＰおよび同一性パーセント値をまとめる。
実施例６
ＥｇＣ２０ｅｌｏ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２の一次構造分析
ＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）のＣ末端およびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号１３）の間でのアミノ酸同一性が１００％であると仮定し、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のコード配列（配列番号２１）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼのｃＤＮＡ配列（配列番号２３）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＹ２７８５５８（ＧＩ３３４６６３４５）、遺伝子座ＡＹ２７８５５８、Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（３２）：９７７９−９７８８頁（２００３年））、およびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼのコード配列（配列番号２４）（Ｍｅｙｅｒら、上記）の間でヌクレオチド配列のアラインメントを行った。配列アラインメントを（複数のアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイ・ディバージェン配列（％）＝３０、ＤＮＡトランジション・ウェイト＝０．５、タンパク質重み行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡ重み行列＝ＩＵＢ）を伴うＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を用いる）Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ法により行った。アラインメントを図２に示す。ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼコード配列はＥｇＤ４_ＣＤＳ（配列番号２４）と称され、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼｃＤＮＡ配列はＥｇＤ４_ｃＤＮＡ（配列番号２３）と称され、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ２コード配列はＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＤＳ（配列番号２１）と称される。
１ページ上でのアラインメントを適合させるため、アラインメントでの５’末端（配列が異なる場合）と３’末端（配列が一致する場合）を切断する。図２は、配列がユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼｃＤＮＡの開始部位からコード配列（ＣＤＳ）開始部位の８３ｂｐ上流にかけて極めて異なることを図示する。ＥｇＤ４_ｃＤＮＡおよびＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＤＳにおけるヌクレオチド配列が、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＤＳ（配列番号２１）のヌクレオチド６７４に相当するユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼｃＤＮＡ配列（配列番号２３）のＣＤＳ開始部位の８３ｂｐ上流から配列の末端に至るまで一致することは、アラインメントから明らかである。正確な相違点では、ＮｏｔＩ部位は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡ配列（配列番号２３のヌクレオチド６５６〜６６３）内に見出される可能性があり、ＮｏｔＩリンカーがユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼｃＤＮＡ（Ｍｅｙｅｒら、上記を参照）の最初のクローニングにおいて用いられたことから、クローン化されたものがＥｇＤＨＡｓｙｎ２における不完全で完全長でない転写産物であったと考えられうる。
アミノ酸配列ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）をＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）およびＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号６）と上記のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を用いて比較した上でのアラインメントを図３Ａおよび３Ｂに示す。ＥｇＣ２０ｅｌｏ１は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２との比較によると、Ｎ末端で、７個のアミノ酸の欠失（すなわちＡＬＤＬＡ［Ｖ／Ｉ］Ｌ）および２つの他のアミノ酸の置換（すなわちＷ４７Ｒ、Ｔ４８Ｉ；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１におけるナンバリングに基づく）を有する。ＥｇＣ２０ｅｌｏ１のアミノ酸２８９に続く配列は、ＤＨＡシンターゼと比較される場合に極めて異なる。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２は、それらのＣ末端にΔ４脂肪酸デサチュラーゼに対して相同性を有する追加的な４９８個のアミノ酸を有する一方、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１は９個のみの追加的なアミノ酸の後で終結する。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）のアミノ酸配列は、２つの配列の間に８個のアミノ酸の違いを有する（すなわち、Ｖ２５Ｉ、Ｇ５４Ｖ、Ａ３０５Ｔ、Ｌ３１０Ｐ、Ｖ３８０Ｉ、Ｓ４９１Ｎ、Ｉ７４４Ｔ、Ｒ７４７Ｐ；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１におけるナンバリングに基づく）。後ろの４つの違いはΔ４デサチュラーゼドメイン内で生じる。
図４Ａおよび４Ｂは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）のＮ末端およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）のＮ末端と、ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号６）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）ＰＵＦＡエロンガーゼ２（配列番号２５）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ６７７９８（ＧＩ５５８５２３９６）、遺伝子座ＡＡＶ６７７９８、ＣＤＳ ＡＹ５９１３３６；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４５（１０）：１８９９−１９０９頁（２００４年））、およびタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＰＵＦＡエロンガーゼ２（配列番号２６）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ６７８００（ＧＩ５５８５２４４１）、遺伝子座ＡＡＶ６７８００、ＣＤＳ ＡＹ５９１３３８；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、上記）とのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。図４Ａおよび４Ｂでは、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、およびタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）タンパク質は、それぞれＰａｖＣ２０ｅｌｏ、ＯｔＰＵＦＡｅｌｏ２、およびＴｐＰＵＦＡｅｌｏ２と称される。
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＣ末端（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＣＴ；配列番号１２のアミノ酸２５３〜７９３；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＮ末端は示さず、「…」で示される）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２のＣ末端（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＣＴ；配列番号２２のアミノ酸２５３〜７９３、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２のＮ末端は示さず、「…」で示される）と、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２７）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＮ７５７０７（ＧＩ２５９５６２８８）、遺伝子座ＡＡＮ７５７０７、ＣＤＳ ＡＦ３９１５４３）、シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２８）（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２９）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＸ１４５０６（ＧＩ６０１７３０１７）、遺伝子座ＡＡＸ１４５０６、ＣＤＳ ＡＹ８１７１５６；Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（１３）：３４０１−３４１２頁（２００５年））、およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号３０）（ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＶ３３６３１（ＧＩ５４３０７１１０）、遺伝子座ＡＡＶ３３６３１、ＣＤＳ ＡＹ６３０５７４；Ｐｅｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８４（２）：３５７−３６６頁（２００４年）およびＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット）とのＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄでは、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、およびイソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）タンパク質は、それぞれＥｇＤ４、ＴａＤ４、ＴｐＤ４、およびＩｇＤ４と称される。
図６は、Ｃ２０エロンガーゼ領域およびΔ４デサチュラーゼドメイン（相同性に基づく）の双方に及ぶ、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（「ＥｇＤＨＡｓｙｎ１_ＮＣＴ．ｐｒｏ」と称される；配列番号１２のアミノ酸２５３〜３６５）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（「ＥｇＤＨＡｓｙｎ２_ＮＣＴ．ｐｒｏ」と称される；配列番号２２のアミノ酸２５３〜３６５）の内部断片と、Ｃ２０エロンガーゼのＣ末端（ＥｇＣ２０ｅｌｏ１_ＣＴ．ｐｒｏ、配列番号６のアミノ酸２４６〜２９８；ＰａｖＣ２０ｅｌｏ_ＣＴ．ｐｒｏ、配列番号２のアミノ酸２４０〜２７７；ＯｔＰＵＦＡｅｌｏ２_ＣＴ．ｐｒｏ、配列番号２５のアミノ酸２５６〜３００；ＴｐＰＵＦＡｅｌｏ２_ＣＴ．ｐｒｏ、配列番号２６のアミノ酸２７９〜３５８）およびΔ４デサチュラーゼのＮ末端（ＥｇＤ４_ＮＴ．ｐｒｏ、配列番号１３のアミノ酸１〜１１６；ＴａＤ４_ＮＴ．ｐｒｏ、配列番号２７のアミノ酸１〜４７；ＳａＤ４_ＮＴ．ｐｒｏ、配列番号２８のアミノ酸１〜４７；ＴｐＤ４_ＮＴ．ｐｒｏ、配列番号２９のアミノ酸１〜８２；ＩｇＤ４_ＮＴ．ｐｒｏ、配列番号３０のアミノ酸１〜４３）とのアラインメントを示す。すべてのＣ２０エロンガーゼドメインのＣ末端での保存モチーフ（すなわちＶＬＦＸＸＦＹＸＸＸＹ（配列番号１８０））は、ＥｇＤ４のＮ末端にも存在し、不完全なＤＨＡシンターゼであるＥｇＤ４をさらに支持する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１、ＥｇＤＨＡｓｙｎ２、およびＥｇＣ２０ｅｌｏ１の各々におけるＣ２０エロンガーゼドメインのＣ末端に、ＮＧモチーフを有する反復配列（すなわち、ＫＮＧＫ（配列番号１８６）、ＰＥＮＧＡ（配列番号１８７）、およびＰＣＥＮＧＴＶ（配列番号１９１）；ＮＧリピートと称され、図６中に配列への下線で示される）が存在する。パターンが高い発生率で生じるが、Ｐｒｏｓｉｔｅを用いたＮＧ反復領域の走査により、この領域内の最後のＮＧモチーフ（すなわちＮＧＴＶ）が有望なＮ−グリコシル化部位であることが示される。ＮＧリピート領域に続くＥｇＤＨＡｓｙｎ１およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２の双方はプロリンリッチ領域（図６で「プロリンリッチリンカー」と称される）を有し、それはＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼドメインの間のリンカーとして作用しうる。リンカーは、Ｃ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼドメインをＥＰＡからＤＨＡへの効率的変換の実現に適する構造的方向（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で保持することに関与しうる。プロリンリッチリンカーは（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１におけるナンバリングに基づいて）Ｐ３０４からＶ３２１に伸長するものとして図６中に示されるが、ＮＧリピート領域はまた、ややプロリンリッチであり、このリンカーの機能に関与しうる。
図６中に定義されるＥｇＤＨＡｓｙｎ１のプロリンリッチリンカーにおけるヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９７および配列番号１９８で示される。図６中に定義されるＥｇＤＨＡｓｙｎ２のプロリンリッチリンカーにおけるヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２００で示される。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１由来のＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメインにおけるヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０１および配列番号２０２で示される。ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメインにおけるヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０３および配列番号２０４で示される。
実施例７
ｐＤＭＷ２６３の作成
（米国特許第７，２５９，２５５号明細書（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述の）プラスミドｐＹ５−３０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内の双方で複製可能なシャトルプラスミドである。プラスミドｐＹ５−３０は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自己複製配列（ＡＲＳ１８）；ＣｏｌＥ１プラスミドの複製起点；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での選択のためのアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内での選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、およびキメラＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲ遺伝子を有する。プラスミドｐＤＭＷ２６３（配列番号３１）を、当業者に周知の技術を用い、ＴＥＦプロモーターをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）と置換することによりｐＹ５−３０から作成した。つまり、ＦＢＡＩＮプロモーターは、ｆｂａ１遺伝子によりコードされるフルクトース−ビスフォスフェートアルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの５’上流側に面する未翻訳領域内に位置する。このプロモーターは、発現にとって必要であり、イントロンを有する５’コード領域の一部を含む。修飾プロモーターＦＢＡＩＮｍは、ＡＴＧ翻訳開始コドンとＦＢＡＩＮプロモーターのイントロンの間に５２ｂｐの欠失（それ故、Ｎ末端に２２個のみのアミノ酸を含む）、およびイントロンに続いて新しい翻訳コンセンサスモチーフを有する。表２０に、ｐＤＭＷ２６３（配列番号３１；ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０６１８４５号パンフレット中にも記載）の成分をまとめる。
Figure 2010523113
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１１５およびＧａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターｐＢＹ１およびｐＹ１５９の作成
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＤＭＷ２６３（配列番号３１）（実施例７における作成を参照）由来のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ ＤＮＡ断片を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述のｐＤＭＷ２３７（配列番号３２）のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ ＤＮＡ断片にクローン化した。ｐＤＭＷ２３７は、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）に由来しかつヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（ＩｇＤ９ｅ）を有する。この方法でプラスミドｐＹ１１５（配列番号３３；図７Ａ）を作成した。図７Ａでは、修飾ＦＢＡＩＮｍプロモーターはＦＢＡ１＋イントロンと称される。修飾ＦＢＡＩＮｍプロモーターは、他の図面中でＦＢＡ１＋イントロンまたはＹＡＲ ＦＢＡ１ ＰＲＯ＋イントロンのいずれかとして称され、これらの用語はＦＢＡＩＮｍと同義的に用いられる。
プラスミドｐＹ１１５（配列番号３３）をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ末端をＫｌｅｎｏｗを用いて満たした。満たして平滑末端を形成後、ＤＮＡ断片を仔牛腸アルカリホスファターゼで処理し、アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有する６９８９ｂｐの断片をアガロースゲルから切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従って精製した。６９８９ｂｐの精製断片を、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１１８２３−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってカセットｒｆＡとライゲートし、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターｐＢＹ１（配列番号３４；図７Ｂ）を形成した。
ｐＢＹ１の作成においては、満たされたＮｃｏＩ部位は翻訳開始におけるＡＴＧ開始を提供する。したがって、この発現ベクターに移される遺伝子は融合タンパク質として発現され、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング後に正確なフレーム内に存在しなければならない。また、５’未翻訳配列は、追加的なアミノ酸の得られるタンパク質のＮ末端への付加をもたらす。このため、第２のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターの作成によりベクター由来のＡＴＧ開始コドンが除去されたことから、挿入遺伝子からの翻訳開始が可能であった。
ＦＢＡＩＮｍプロモーターを、オリゴヌクレオチドプライマーｏＹＦＢＡ１（配列番号３５）およびｏＹＦＢＡ１−６（配列番号３６）でのＰＣＲを用い、プラスミドｐＹ１１５（配列番号３３）から増幅した。プライマーｏＹＦＢＡ１（配列番号３５）をＢｇｌＩＩ部位をプロモーターの５’末端に導入するように設計し、かつプライマーｏＹＦＢＡ１−６（配列番号３６）をＮｏｔＩ部位をプロモーターの３’末端に導入するように設計する一方、ＮｃｏＩ部位、それ故にＡＴＧ開始コドンを除去した。得られたＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ベクター骨格を有するｐＹ１１５のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＹ１５８（配列番号３７）を形成した。
プラスミドｐＹ１５８（配列番号３７）をＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ末端を満たした。満たして平滑末端を形成後、ＤＮＡ断片を仔牛腸アルカリホスファターゼで処理し、アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有する６９９２ｂｐの断片をアガロースゲルから切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従って精製した。６９９２ｂｐの精製断片を、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１１８２３−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってカセットｒｆＡとライゲートし、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）目的ベクターｐＹ１５９（配列番号３８；図７Ｃ）を形成した。
実施例９
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＢＹ−ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（ＥｇＣ２０ｅｌｏ１）、ｐＹ１３２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）、ｐＹ１６１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）およびｐＹ１６４（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２）の作成
プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００５．ｐ１４．ｆ（実施例３）、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆ（実施例４）、およびｅｅｇ１ｃ−１（実施例５）から精製した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ酵素ミックス（カタログ番号１１７９１−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、（ＥｇＣ２０ｅｌｏ１を含む）ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｐ１４．ｆおよび（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１を含む）ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆに由来するｃＤＮＡ挿入物をｐＢＹ１（配列番号３４；図７Ｂ）に移し、それぞれｐＢＹ−ＥｇＣ２０ｅｌｏ１（配列番号３９、図７Ｄ）およびｐＹ１３２（配列番号４０；図８Ａ）を形成した。（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２を含む）ｅｅｇ１ｃ−１由来のｃＤＮＡ挿入物は、不適切な翻訳フレームの発現をもたらしたと思われることから、ｐＢＹ１に移さなかった。
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ酵素ミックス（カタログ番号１１７９１−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆおよびｅｅｇ１ｃ−１由来のｃＤＮＡ挿入物をｐＹ１５９（配列番号３８；実施例８）に移し、それぞれｐＹ１６１（配列番号４１、図８Ｂ）およびｐＹ１６４（配列番号４２；図８Ｃ）を形成した。
実施例１０
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１４１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊）、ｐＹ１４３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１）およびｐＹ１４９（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ２Ｌｉｎｋｅｒ）の作成
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＥＰＡＥｌｏＤｏｍ−５（配列番号４３）およびｏＥＵＧ ｅｌ４−３（配列番号４４）でクローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｅ６．ｆから増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０６２（配列番号４５）を作成した。
ヌクレオチド６１９〜６２４での内部ＮｃｏＩ部位を、オリゴヌクレオチドＥｇＥｌｏＤ４Ｍｕｔ−５（配列番号４６）およびＥｇＥｌｏＤ４Ｍｕｔ−３（配列番号４７）を伴うＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（カタログ番号２００５１８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＫＲ１０６２内のＥｇＤＨＡｓｙｎ１から除去した。大規模な配列決定後、さらなる試験のため、ＮｃｏＩ部位が除去され（すなわちｃｃａｔｇｇからｃｃｔｔｇｇへの突然変異）かつさらなるヌクレオチド変化が生じていないクローンを選択した。このクローンをｐＬＦ１１５−７（配列番号４８）と称した。ＮｃｏＩ部位が除去されたＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊）におけるヌクレオチド配列を配列番号２０５で示す。対応するアミノ酸配列は配列番号１２に一致する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊を発現するプラスミドｐＹ１４１の作成：ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号２０５；内部ＮｃｏＩ部位を有しない；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ ＣＤＳのｎｔ６２１で；ｃｃａｔｇｇからｃｃｔｔｇｇへ）を有するｐＬＦ１１５−７（配列番号４８）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１４１（配列番号４９；図８Ｄ）を作成した。したがって、プラスミドｐＹ１４１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット；米国特許第７，２０２，３５６号明細書；図中、「Ｆｂａ１＋イントロン」と称される）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）由来のＰｅｘ２０ターミネーター配列の制御下で（図中、「ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（−ＮｃｏＩ）」と称される）完全長ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊遺伝子を有する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１−Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１を発現するプラスミドｐＹ１４３の作成：ｐＹ１４１内のＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１）におけるヌクレオチド配列は配列番号２０６（ＮｃｏＩ部位が除去される以外は配列番号２０１に一致）で示される。対応するアミノ酸配列は配列番号２０２に一致する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１（配列番号２０６）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＥＰＡＥｌｏＤｏｍ−５（配列番号４３）およびＥｇＤＰＡＥｌｏＤｏｍ−３（配列番号５０）でｐＬＦ１１５−７から増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＨＤ１６（配列番号５１）を作成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１（内部ＮｃｏＩ部位を有しない）を有するｐＨＤ１６（配列番号５１）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１４３（配列番号５２；図９Ａ）を作成した。プラスミドｐＹ１４３は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１）のＮ末端ドメインを有し、プロリンリッチリンカーまたはΔ４デサチュラーゼドメインを含まない。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１−Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ２Ｌｉｎｋｅｒを発現するプラスミドｐＹ１４９の作成：ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン（配列番号２０６）およびプロリンリッチリンカー（配列番号１９７）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＥＰＡＥｌｏＤｏｍ−５（配列番号４３）およびｏＥＵＧｓｙｎ６−２（配列番号５３）でｐＬＦ１１５−７（配列番号４８）から増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０７１（配列番号５４）を作成した。
ｐＫＲ１０７１（配列番号５４）由来のＮｃｏＩ／Ｅｃｌ１３２ＩＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片（ＮｏｔＩ部位が満たされた場合）にクローン化し、ｐＹ１４９（配列番号５５；図９Ｂ）を作成した。プラスミドｐＹ１４９は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１／プロリンリッチリンカー融合遺伝子（すなわちＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ２Ｌｉｎｋｅｒ；配列番号２０７）を有するが、Δ４デサチュラーゼドメインを有しない。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ２Ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列を配列番号２０８で示す。断片の合成およびクローン化の方法による結果として、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメインおよびプロリンリッチリンカー由来のアミノ酸に加え、追加的な４個のアミノ酸（すなわちＳＣＲＴ）がリンカー領域に続いて付加された。
実施例１１
新規Ｃ２０エロンガーゼ／Δ４デサチュラーゼ融合タンパク質を生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターの作成
新規Ｃ２０エロンガーゼ／Δ４デサチュラーゼ融合タンパク質を合成するため、固有のＳｂｆＩ部位を、プロリンリッチリンカー領域（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３Ｌｉｎｋｅｒ）に続くＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊のＣ２０エロンガーゼドメインの３’末端に付加した。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＥＰＡＥｌｏＤｏｍ−５（配列番号４３）およびｏＥＵＧｓｙｎ６−３（配列番号５６）でｐＬＦ１１５−７（配列番号４８）から増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０９１（配列番号５７）を作成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３Ｌｉｎｋｅｒを有するｐＫＲ１０９１（配列番号５７）由来のＮｃｏＩ／Ｅｃｌ１３６ＩＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し（ＮｏｔＩが満たされ平滑末端を形成する場合）、ｐＹ１５５（配列番号５８）を作成した。
新規Ｃ２０エロンガーゼ／Δ４デサチュラーゼ融合タンパク質を合成するため、固有のＳｂｆＩ部位を様々なΔ４デサチュラーゼの５’末端に付加した。各々の場合、ＳｂｆＩ部位は、各コード配列のＡＴＧ開始部位の後に位置し、同遺伝子によりコードされるΔ４デサチュラーゼのＮ末端で数個のアミノ酸の付加および／または置換をもたらした。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１−Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＩｇＤ４＊を発現するプラスミドｐＹ１５６の作成：イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２０９；ＩｇＤ４）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＲＩＧ６−１（配列番号５９）およびｏＲＩＧ６−２（配列番号６０）でｐＲＩＧ６（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット中に前述）から増幅した。得られたＤＮＡ断片はＩｇＤ４ ＣＤＳを有し、かつＳｂｆＩ部位が開始コドン（ＩｇＤ４＊；配列番号２１０）に続く５’末端に付加されたこと以外は配列番号２０９に一致するものであり、それを、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０６７（配列番号６１）を作成した。ｐＫＲ１０６７由来のＩｇＤ４＊におけるアミノ酸配列は、配列番号２１１で示され、最初から４個のアミノ酸（すなわちＭＣＮＡ）がヌクレオチド配列内でのＳｂｆＩ部位の付加によりＭＡＬＱに変化していること以外ではＩｇＤ４に対するアミノ酸配列（配列番号３０）に一致する。
ＩｇＤ４＊を有するｐＫＲ１０６７（配列番号６１）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１５０（配列番号６２；図９Ｃ）を作成した。図９Ｃでは、ＩｇＤ４＊は「Ｉｇ ｄ４ ＤＳ」と称される。この方法であれば、ＩｇＤ４＊はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で単独で発現されうる。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３Ｌｉｎｋｅｒを有するｐＫＲ１０９１（配列番号５７；上記）由来のＸｂａＩ／ＳｂｆＩ ＤＮＡ断片を、ＩｇＤ４＊を有するｐＫＲ１０６７（配列番号６１）由来のＸｂａＩ／ＳｂｆＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１０９７（配列番号６３）を作成した。したがって、インフレーム融合を、プロリンリッチリンカー領域（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＩｇＤ４と称される；配列番号２１２）により分かれたＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３ＬｉｎｋｅｒとＩｇＤ４＊の間で行った。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＩｇＤ４におけるアミノ酸配列を配列番号２１３で示す。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＩｇＤ４を有するｐＫＲ１０９７（配列番号６３）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１５６（配列番号６４；図９Ｄ）を作成した。図９Ｄでは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＩｇＤ４は「ＥＧｅｌ−ＩＧｄ４」と称される。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１−Ｄ４Ｄｏｍ１＊を発現するプラスミドｐＹ１５２の作成：プロリンリッチリンカー領域の末端の直後から開始するΔ４デサチュラーゼドメイン（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１；配列番号２１４；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１に対応するアミノ酸配列は配列番号２１５で示される）を有するＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊（配列番号２０５）のＣ末端の領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＥＧｓｌｎｅ６−１（配列番号６５）およびｏＥＵＧｅｌ４−３（配列番号４４）で（実施例１０に記載の）ｐＬＦ１１５−７から増幅した。オリゴヌクレオチドｏＥＧｓｌｎｅ６−１（配列番号６５）には、ＰＣＲ産物の５’末端にＡＴＧ開始コドン、次いでＳｂｆＩ部位を導入した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０６９（配列番号６６）を作成した。ｐＫＲ１０６９由来のＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１（すなわちＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊）を有する新しいＣＤＳおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１６および配列番号２１７で示される。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊におけるアミノ酸配列（配列番号２１７）は、最初から２個のアミノ酸（すなわちＳＧ）がヌクレオチド配列内でのＳｂｆＩ部位の付加によりＭＡＬに変化していること以外ではＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１におけるアミノ酸配列（配列番号２１５）に一致する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊を有するｐＫＲ１０６９（配列番号６６）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１５２（配列番号６７；図１０Ａ）を作成した。図１０Ａでは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊は「ＥＵＧ ｄ４（ｆｕｓ ｔｅｓｔ）」と称される。この方法であれば、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で単独で発現されうる。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１−Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＥｇＤ４Ｄｏｍ１を発現するプラスミドｐＹ１５７の作成：ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−リンカーを有するｐＫＲ１０９１（配列番号５７）由来のＸｂａＩ／ＳｂｆＩ ＤＮＡ断片を、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊を有するｐＫＲ１０６９由来のＸｂａＩ／ＳｂｆＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１０９９（配列番号６８）を作成した。この方法で、インフレーム融合を、プロリンリッチリンカー領域（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＥｇＤ４Ｄｏｍ１と称される；配列番号２１８）により分離されたＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍとＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１＊の間で行った。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＥｇＤ４Ｄｏｍ１におけるアミノ酸配列（配列番号２１９）は、１個のアミノ酸（すなわち、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１におけるナンバリングに基づくＧ３２３Ｌ）がＳｂｆＩクローニング部位および融合連結部により変化を受けたこと以外ではＥｇＤＨＡｓｙｎ１とほぼ一致する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＥｇＤ４Ｄｏｍ１を有するｐＫＲ１０９９（配列番号６８）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１５７（配列番号６９；図１０Ｂ）を作成した。図１０Ｂでは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＥｇＤ４Ｄｏｍ１は「ＥＧｅｌ−ＥＧｄ４ ｆｕｓ」と称される。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｄ４Ｄｏｍ２を発現するプラスミドｐＹ１５３の作成：Δ４デサチュラーゼドメインおよびＣ２０エロンガーゼドメイン（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ２；配列番号２２０；ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ２に対応するアミノ酸配列は配列番号２２１で示される）の一部を有するＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＣ末端の領域は、ＥｇＤ４として同定されたアミノ酸配列（配列番号１３；Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（３２）：９７７９−９７８８頁（２００３年））に対応するものであり、それを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＥＵＧｅｌ４−４（配列番号７０）およびｏＥＵＧｅｌ４−３（配列番号４４）で（実施例１０で記載の）ｐＬＦ１１５−７から増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０７３（配列番号７１）を作成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ２を有するｐＫＲ１０７３（配列番号７１）由来のＰｃｉＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１５３（配列番号７２；図１０Ｃ）を作成した。図１０Ｃでは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ２はＥＵＧｄ４（ＨＺ）と称される。この方法であれば、ＥｇＤＨＡｓｙｎＤ４Ｄｏｍ２はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で単独で発現されうる。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１−Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＳａＤ４＊を発現するプラスミドｐＹ１６０の作成：シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（配列番号２２２；ＳａＤ４）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＲＳＡ１−１（配列番号７３）およびｏＲＳＡ１−２（配列番号７４）で（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット中に前述の）ｐＲＳＡ−１から増幅した。得られたＤＮＡ断片は、ＳａＤ４ ＣＤＳを有し、かつＳｂｆＩ部位が開始コドン（ＳａＤ４＊；配列番号２２３）に続く５’末端で付加されたこと以外では配列番号２２２に一致するものであり、それを、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０６８（配列番号７５）を作成した。ｐＫＲ１０６８由来のＳａＤ４＊におけるアミノ配列は、配列番号２２４で示され、最初から３個のアミノ酸（すなわちＭＴＶ）がヌクレオチド配列内でのＳｂｆＩ部位の付加によりＭＡＬＱに変化されていること以外ではＳａＤ４に対するアミノ配列（配列番号２８）に一致する。
ＳａＤ４＊を有するｐＫＲ１０６８（配列番号７５）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片（内部ＮｃｏＩ部位を回避するための部分消化物）を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターを有するｐＹ１１５由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１５１（配列番号７６；図１０Ｄ）を作成した。図１０Ｄでは、ＳａＤ４＊は「ＲＳＡ ｄ４ ＤＳ」と称される。この方法であれば、ＳａＤ４＊はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で単独で発現されうる。
ＳａＤ４＊を有するｐＫＲ１０６８（配列番号７５）由来のＳｂｆＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３Ｌｉｎｋｅｒを有するｐＹ１５７（配列番号６９）由来のＳｂｆＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＹ１６０（配列番号７７；図１１）を作成した。この方法で、インフレーム融合を、プロリンリッチリンカー領域（すなわち、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＳａＤ４；配列番号２２５）により分かれたＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３とＳａＤ４＊の間で行った。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＳａＤ４におけるアミノ酸配列を配列番号２２６で示す。
実施例１２
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）の成長条件、脂質特性およびｍＲＮＡ単離
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）をＭｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＥａｓｔＬａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）のＤｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔｒｉｅｍｅｒの研究室から得た。約２ｍＬの培養物を脂質分析のために取り出し、１，８００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを水で１回洗浄し、再遠心分離した。得られたペレットを真空下で５分間乾燥し、トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＨ）１００μＬ中に再懸濁し、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。この後、ヘキサン０．５ｍＬを添加し、バイアルを撹拌しながら室温で１５分間インキュベートした。（ヘキサン層から注入された５μＬ）脂肪酸メチルエステルを、Ｏｍｅｇａｗａｘ ３２０溶融シリカキャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号２４１５２）を具備するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを用いて分離し、定量した。オーブン温度をプログラムし、１７０℃で１．０分間保持し、５℃／分で２４０℃に高め、次いでさらに１．０分保持した。キャリアガスをＷｈａｔｍａｎ水素発生装置により供給した。保持時間を市販の標準のメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｕ−９９−Ａ）における時間と比較し、得られたクロマトグラムを図１２に示す。脂肪酸特性におけるＥＰＡおよびＤＨＡの存在は、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）は、限定はされないが、Ｃ２０エロンガーゼ、Δ４デサチュラーゼ、および／またはＤＨＡシンターゼなどの、長鎖ＰＵＦＡ生合成遺伝子における優れた供給源となることを示唆した。
活発に成長する残留培養物５ｍＬを、１２５ｍＬのガラスフラスコ内のＡＦ−６培地（ＷａｔａｎａｂｅおよびＨｉｒｏｋｉ、「ＮＩＥＳ−Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（筑波）、１２７頁（２００４年））２５ｍＬ中に移した。ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）培養物を、２週間にわたる１６時間の明サイクル、８時間の暗サイクルの下、２２℃で非常に穏やかに撹拌しながら成長させた。
２週間後、培養物（２５ｍＬ）を５００ｍＬのガラス瓶内のＡＦ−６培地１００ｍＬ中に移し、上記のように培養物を１か月間成長させた。この期間後、２つの５０ｍＬの一定分量をＡＦ−６培地２５０ｍＬを有する２つの別々の５００ｍＬのガラス瓶に移し、上記のように培養物を２か月間成長させた（全部で約６００ｍＬの培養物を得た）。この後、培養物を１，８００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット状にし、水で１回洗浄し、再遠心分離した。全ＲＮＡを、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（商標）試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、得られたペレットの中の１つから抽出した（試薬５ｍＬを用い、水０．５ｍＬ中にＲＮＡを溶解）。この方法で、３４０μｇの全ＲＮＡ（６８０ｕｇ／ｍＬ）をペレットから得た。残留ペレットを液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、全部で３４０μｇの全ＲＮＡから単離した。この方法で、９．０μｇのｍＲＮＡを得た。
実施例１３
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ｃＤＮＡの合成、ライブラリーの作成およびｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃ由来のＤＨＡシンターゼの同定
ｃＤＮＡライブラリーを、Ｃｌｏｎｅｍｉｎｅｒ（商標）ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号１８２４９−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコル（バージョンＢ、２５−０６０８）に従って作成した。非放射標識方法を用い、ｃＤＮＡを、Ｂｉｏｔｉｎ−ａｔｔＢ２−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて５．１２μｇのｍＲＮＡから合成した（実施例１２）。第一鎖および第二鎖の合成後、ａｔｔＢ１アダプターを付加し、ライゲーションを行い、ｃＤＮＡをカラムクロマトグラフィーを用いてサイズ分画した。画分由来のＤＮＡを濃縮し、ｐＤＯＮＲ（商標）２２２に組換え、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１ Ｐｈａｇｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に形質転換した。ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ライブラリーをｅｕｇ１ｃと称した。
ｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃの約１７，０００クローンを、３つの大きい正方形（２４ｃｍｘ２４ｃｍ）のペトリプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））（各々、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン寒天培地を有する）上に播種した。まさに実施例５に記載のように、細胞を成長させ、Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂ膜に移し、ｐＹ１４１由来のＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊を有する標識ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片とハイブリダイズした。この方法で、１１の陽性クローンを同定した（ｅｕｇ１ｃ−１〜ｅｕｇ１ｃ−１１と称した）。
陽性クローンを成長させ、ＤＮＡを精製し、実施例２に記載のようにベクターをプライムしたＭ１３Ｆユニバーサルプライマー（配列番号１）、ベクターをプライムしたＭ１３−２８Ｒｅｖプライマー（配列番号１４）、およびポリ（Ａ）テールをプライムしたＷｏｂｂｌｅＴオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。開始配列データに基づき、追加的な内部断片配列を、オリゴヌクレオチドＥａＤＨＡｓｙｎ５’（配列番号７８）、ＥａＤＨＡｓｙｎ５’２（配列番号７９）、ＥａＤＨＡｓｙｎ５’３（配列番号８０）、ＥａＤＨＡｓｙｎ５’４（配列番号８１）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３’（配列番号８２）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３’２（配列番号８３）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３’３（配列番号８４）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３’４（配列番号８５）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ３’５（配列番号８６）を用い、同様の方法で得た。この方法で、ｅｕｇ１ｃクローンの完全挿入配列を得た。
配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（バージョン４．２、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を用いて整列し比較し、この方法で、クローンを挿入配列に基づいて４つの異なる群の中の１つに分類できた（ＥａＤＨＡｓｙｎ１〜ＥａＤＨＡｓｙｎ４として同定）。配列の各クラスにおけるｃＤＮＡを有する代表的クローンをさらなる試験のために選択した上で、各代表的プラスミド（すなわち、ｐＬＦ１１７−１、ｐＬＦ１１７−２、ｐＬＦ１１７−３およびｐＬＦ１１７−４）における配列は、それぞれ配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、および配列番号９０で示される。ＮＮＮＮの鎖で示されるｐＬＦ１１７−１の配列は、配列決定されていないポリＡテールの領域を示す。ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ３、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４におけるコード配列は、それぞれ配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、および配列番号９４で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ３、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４に対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８で示される。
ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）におけるアミノ酸配列を、実施例３に記載のようにＢＬＡＳＴＰにより評価し、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）における場合と同様、４つ全部のＥａＤＨＡｓｙｎ配列はＣ２０−ＰＵＦＡ ＥｌｏおよびΔ４脂肪酸デサチュラーゼの双方に類似することも見出された。ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）の各Ｎ末端は、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ４５９ Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ（配列番号２）に対し、５８．５のｐＬｏｇ値（３ｅ−５９のＥ値；１１４／２４７に一致するアミノ酸；４６％の同一性）をもたらした。ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）の各Ｃ末端は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ４脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１３）に対し、０．０（３７８／５３８に一致するアミノ酸；７０％の同一性）、０．０（３７８／５３８に一致するアミノ酸；７０％の同一性）、０．０（３７９／５３８に一致するアミノ酸；７０％の同一性）、および０．０（３６８／５２２に一致するアミノ酸；７０％の同一性）のＥ値をもたらした。ＢＬＡＳＴのスコアおよび確率は、本核酸断片がユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Ｃ２０−ＰＵＦＡ Ｅｌｏ／Δ４脂肪酸デサチュラーゼ全体をコードすることを示す。
ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）におけるアミノ酸配列を、実施例６に記載のようにＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を用いて比較し、アラインメントを図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃに示す。興味深いことに、ヌクレオチド配列内での単一のｂｐの欠失により、ＥａＤＨＡｓｙｎ４における得られたアミノ酸配列のＣ末端（最後の約３５個のアミノ酸）は極めて異なり、他の３種のＥａＤＨＡｓｙｎタンパク質よりも小さい。
ＢＬＡＳＴＰを用いてＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）のアミノ酸配列と比較する場合、ＥａＤＨＡｓｙｎ１（配列番号９５）、ＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号９６）、ＥａＤＨＡｓｙｎ３（配列番号９７）、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４（配列番号９８）の各アミノ酸配列は、７０％（５５８／７９１）、７０％（５５８／７９１）、７０％（５５９／７９１）および７０％（５４８／７７５）一致する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）における場合と同様、４つ全部のＥａＤＨＡｓｙｎ配列はプロリンリッチリンカー領域（ＥａＤＨＡｓｙｎ１におけるナンバリングに基づいて、約Ｐ３００〜Ｔ３３２）を有する。リンカーは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）またはＥｇＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２）における場合よりもやや長いように見られる。４つ全部のＥａＤＨＡｓｙｎ配列はまた、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２のプロリンリッチモチーフの上流に見出されるＮＧリピートモチーフが欠損するが、この領域はまた、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１およびＥｇＤＨＡｓｙｎ２の場合と同様、４つ全部のＥａＤＨＡｓｙｎ配列内でややプロリンリッチであり、かつリンカー機能に関与しうる。
ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ３、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４のＣ２０エロンガーゼドメインにおける各ヌクレオチド配列は、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、および配列番号２３０で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、およびＥａＤＨＡｓｙｎ３のＣ２０エロンガーゼドメインにおける各アミノ酸配列は、配列番号２３１、配列番号２３２、および配列番号２３３で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ４のＣ２０エロンガーゼドメインのアミノ酸配列はＥａＤＨＡｓｙｎ１の場合に一致する。
ＥａＤＨＡｓｙｎ１のプロリンリッチリンカーにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３４および配列番号２３５で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ３、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４のプロリンリッチリンカーにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＥａＤＨＡｓｙｎ１における場合と一致する。
ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４の各々のΔ４デサチュラーゼドメイン１における各ヌクレオチド配列は、配列番号２３６、配列番号２３７、および配列番号２３８で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４のΔ４デサチュラーゼドメインにおける各アミノ酸配列は、配列番号２３９、配列番号２４０、および配列番号２４１で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ３のΔ４デサチュラーゼドメイン１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はＥａＤＨＡｓｙｎ１の場合に一致する。
プロリンリッチリンカーおよびＣ２０エロンガーゼドメインの３’末端の一部を含む、ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ３、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４のΔ４デサチュラーゼドメイン２における各ヌクレオチド配列は、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、および配列番号２４５で示される。ＥａＤＨＡｓｙｎ１、ＥａＤＨＡｓｙｎ２、ＥａＤＨＡｓｙｎ３、およびＥａＤＨＡｓｙｎ４のΔ４デサチュラーゼドメインにおける各アミノ酸配列は、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、および配列番号２４９で示される。
図２９に、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＤＨＡシンターゼドメイン配列をまとめる。
実施例１４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＹ１６５、ｐＹ１６６、ｐＹ１６７およびｐＹ１６８の作成
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ酵素ミックス（カタログ番号１１７９１−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＬＦ１１７−１（配列番号８７）、ｐＬＦ１１７−２（配列番号８８）、ｐＬＦ１１７−３（配列番号８９）、およびｐＬＦ１１７−４（配列番号９０）由来のｃＤＮＡ挿入物をｐＹ１５９（配列番号３８；実施例８）に移し、それぞれｐＹ１６５（配列番号９９、図１４Ａ）、ｐＹ１６６（配列番号１００；図１４Ｂ）、ｐＹ１６７（配列番号１０１；図１４Ｃ）、およびｐＹ１６８（配列番号１０２；図１４Ｄ）を形成した。したがって、各プラスミドは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット；米国特許第７，２０２，３５６号明細書；図中で「Ｙａｒ Ｆｂａ１ Ｐｒｏ＋イントロン」と称される）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）由来のＰｅｘ２０ターミネーター配列の制御下で完全長ＥａＤＨＡｓｙｎ遺伝子を有する。
実施例１５
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）とサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１０６１の作成
本実施例は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１（配列番号１２）とＳｄＤ１７との同時発現のための大豆ベクターおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ選択可能マーカー（ｈｐｔ）の作成について記載する。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーｏＥＧｅｌ２−１（配列番号１０３）およびｏＥＵＧ ｅｌ４−３（配列番号４４）でｐＫＲ１０４９（クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ０１６．ｅ６．ｆ）から増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１０５５（配列番号１０４）を作成した。
ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／００８２６９号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述のｐＫＳ１２３の誘導体である開始プラスミドｐＫＲ７２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０１９；配列番号１０５、７０８５ｂｐの配列）は、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））内での選択および複製のための、Ｔ７プロモーターおよび転写ターミネーターにより隣接されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）（Ｇｒｉｔｚ Ｌ．およびＤａｖｉｅｓ Ｊ．、Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８頁（１９８３年））（Ｔ７ｐｒｏｍ／ＨＰＴ／Ｔ７ｔｅｒｍカセット）、および細菌複製起点（ｏｒｉ）を有する。さらに、ｐＫＲ７２はまた、大豆などの植物内での選択のための、３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２頁（１９８５年））およびＮＯＳ３’転写ターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７０頁（１９８２年））により隣接されたＨＰＴ（３５Ｓ／ＨＰＴ／ＮＯＳ３’カセット）を有する。ｐＫＲ７２はまた、β−コングリシニンのα’サブユニットにおけるプロモーター（Ｂｅａｃｈｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３頁（１９８５年））およびファゼリオン遺伝子の３’転写終結領域（Ｄｏｙｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８頁（１９８６年））により隣接されたＮｏｔＩ制限部位を有することから、ＮｏｔＩ部位にクローン化された遺伝子の大豆の種子内での強力な組織特異的発現を可能にする。
プラスミドｐＫＲ７２（配列番号１０５、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０１９を有する）内のβｃｏｎ／ＮｏｔＩ／Ｐｈａｓ３’カセットを、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーｏＣｏｎ−１（配列番号１０６）およびｏＣｏｎ−２（配列番号１０７）を用いて増幅した。得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで消化し、ｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１７９（配列番号１０８）を作成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１をＮｏｔＩでの消化によりｐＫＲ１０５５（配列番号１０４）から放出させ、プラスミドｐＫＲ１７９（配列番号１０８）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１０５７（配列番号１０９）を作成した。
βｃｏｎ／ＥｇＤＨＡｓｙｎ１／Ｐｈａｓ３’カセットを有するｐＫＲ１０５７（配列番号１０９）のＳｂｆＩ断片を、ＳｄＤ１７を有するｐＫＲ３２８（配列番号１１０；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ベクターｐＫＲ１０６１（配列番号１１１）を作成した。ｐＫＲ１０６１の略図を図１５Ａに示す。
実施例１６
パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ（ＰａｖＤ８）とユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅｌｏ）およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＭａＤ５）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ９７３の作成
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅｌｏ）：
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅｌｏ；配列番号１１２；米国特許出願第１１／６０１，５６３号明細書（２００６年１１月１６日に出願、米国特許出願公開第２００７−０１１８９２９−Ａ１号明細書として２００７年５月２４日に公開；代理人整理番号ＢＢ−１５６２）（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載）を有するｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５ｆと称されるユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）ｃＤＮＡライブラリー（ｅｅｇ１ｃ）由来のクローンを鋳型として用い、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーｏＥｕｇＥＬ１−１（配列番号１１３）およびｏＥｕｇＥＬ１−２（配列番号１１４）でＥｇＤ９ｅｌｏを増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ９０６（配列番号１１５）を作成した。
プラスミドｐＫＲ９０６をＮｏｔＩで消化し、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼを有する断片をプラスミドｐＫＲ１３２（配列番号１１６；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載）にクローン化し、ｐＫＲ９５３（配列番号１１７）を作成した。
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＭａＤ５）：
ベクターｐＫＲ２８７（配列番号１１８；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載、２００４年８月２６日に公開；その内容は参照により本明細書中に援用される）は、大豆グリシニンＧｙ１プロモーターおよびエンドウ豆レグミンＡ２の３’終結領域により隣接された、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＭａＤ５；配列番号１１９、米国特許第６，０７５，１８３号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット（これらの内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載）を有する（Ｇｙ１／ＭａＤ５／ｌｅｇＡ２カセット）。ベクターｐＫＲ２８７をＳｂｆＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、Ｇｙ１／ＭａＤ５／ｌｅｇＡ２カセットを有する断片をｐＫＲ２７７（配列番号１２０；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載、その内容は参照により本明細書中に援用される）のＳｂｆＩ／ＢｓｉＷＩ断片にクローン化し、ｐＫ９５２（配列番号１２１）を作成した。
ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述のベクターｐＫＲ４５７（配列番号１２２）は、Ｋｕｎｉｔｚ大豆トリプシンインヒビター（ＫＴｉ）プロモーター（Ｊｏｆｕｋｕら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１０７９−１０９３頁（１９８９年））およびＫＴｉ３’終結領域（その単離は米国特許第６，３７２，９６５号明細書中に記載）、それに続くＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に前述の大豆アルブミン転写ターミネーターにより隣接されたＮｏｔＩ部位を有する（Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’Ｓａｌｂ３’カセット）。多数のサブクローニングステップを通じて、Ａｓｐ７１８制限部位を有する配列をＫｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’Ｓａｌｂ３’カセットの５’および３’末端に付加し、配列番号１２３を作成した。
パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ（ＰａｖＤ８）：
パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）（ＣＣＭＰ４５９）を海洋植物プランクトン（Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ）（ＣＣＭＰ（Ｗｅｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ））の培養物から得て、（ＣＣＭＰから入手したＦ／２ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ−ＫＩＴ２０Ｆ２およびＦｉｌｔｅｒｅｄ Ｓｅｑｗａｔｅｒ−ＳＥＡ２を用いて作成した）Ｆ／２−Ｓｉ培地５０ｍＬを有する２５０ｍＬのフラスコ内で、１５０ｒｐｍで振とうしながら２６℃で成長させた。培養物を週１回の頻度で１：４（古い培地：新しい培地）の希釈物を用いた新しい培地に移した。
２８個のフラスコ（１４００ｍＬ）からの培養物を結合させ、細胞を、１０分間、１，８００×ｇでの遠心分離によりペレット状にし、水で１回洗浄し、再遠心分離した。全ＲＮＡを、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（商標）試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、得られたペレットから抽出した。この方法で２．６ｍｇの全ＲＮＡ（２．６ｍｇ／ｍＬ）をペレットから得た。ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、１．２５ｍｇの全ＲＮＡから単離した。この方法で１１２μｇのｍＲＮＡを得た。
ｃＤＮＡを、提供されるオリゴ（ｄＴ）プライマーを備えたＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、２２４ｎｇのｍＲＮＡから合成した。プロトコルによるリボヌクレアーゼＨ処理後、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ（ＰａｖＤ８；配列番号１２４；米国特許出願第１１／７３７７７２号明細書（２００７年４月２０日出願；代理人整理番号ＢＢ−１５６６）中に記載（その内容は参照により本明細書中に援用される））を、下記の条件を用い、オリゴヌクレオチドプライマーＰｖＤＥＳ５’Ｎｏｔ−１（配列番号１２５）およびＰｖＤＥＳ３’Ｎｏｔ−１（配列番号１２６）で得られたｃＤＮＡから増幅した。
上記の反応から得られたｃＤＮＡ（２μＬ）を、５０ｐモルのＰｖＤＥＳ５’Ｎｏｔ−１（配列番号１２５）、５０ｐモルのＰｖＤＥＳ３’Ｎｏｔ−１（配列番号１２６）、１μＬのＰＣＲヌクレオチドミックス（１０ｍＭ、Ｐｒｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１．５μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および５０μＬまでの水と結合させた。反応条件は、９４℃で３分間、次いで、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、および７２℃で１分間での３５サイクルであった。ＰＣＲを７２℃、７分間で終了させ、次いで４℃で保持した。ＰＣＲ反応物の５μＬについてアガロースゲル電気泳動により分析し、約１．３ｋｂの分子量を有するＤＮＡバンドを観察した。残存生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従って精製した。
ＮｏｔＩ部位により隣接されるＰａｖＤ８を修飾Ｋｔｉ／ＮｏｔＩ／Ｋｔｉ３’Ｓａｌｂ３’カセット（配列番号１２３）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、次いでＤＮＡ断片をＡｓｐ７１８で消化し、ｐＫＲ９５２（配列番号１２１）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ９７０（配列番号１２７）を作成した。
プラスミドｐＫＲ９５３（配列番号１１７）をＰｓｔＩで消化し、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼを有する断片をｐＫＲ９７０（配列番号１２７）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ９７３（配列番号１２８、図１５Ｂ）を作成した。
この方法であれば、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼは、強力な種子特異的プロモーターの補助下でモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼおよびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼと同時発現されうる。
実施例１７
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）とサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１０６４の作成
本実施例では、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１とＳｄＤ１７との同時発現のための大豆ベクターおよびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）選択可能マーカーの作成について記載する。
ｐＫＲ２７１（配列番号１２９；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）由来のＡｎｎ／Ｓｄｄ１７／ＢＤ３０カセットを有するＰｓｔＩ断片をｐＫＲ２２６（配列番号１３０；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中にも記載）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ベクターｐＫＲ８８６ｒ（配列番号１３１）を得た。この方法で、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）を、強力かつ種子特異的なアネキシンプロモーターの補助下でクローン化した。
βｃｏｎ／ＥｇＤＨＡｓｙｎ１／Ｐｈａｓ３’カセットを有するｐＫＲ１０５７（配列番号１０９）のＳｂｆＩ断片を、ＳｄＤ１７を有するｐＫＲ８８６ｒ（配列番号１３１）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ベクターｐＫＲ１０６４（配列番号１３２）を作成した。ｐＫＲ１０６４の略図を図１５Ｃに示す。
実施例１８
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１）とユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅｌｏ）およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＭａＤ５）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１１３３の作成
グリシニンＧｙ１プロモーターを、プライマーｏＳＧｌｙ−２（配列番号１３４）およびｏＳＧｌｙ−３（配列番号１３５）を用い、ｐＺＢＬ１１９（配列番号１３３；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）からＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片を製造業者のプロトコルに従って中間クローニングベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＡＭＰ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化し、プラスミドｐＰＳｇｌｙ３２（配列番号１３６）を作成した。
Ｇｙ１プロモーターを有するプラスミドｐＳＧｌｙ３２（配列番号１３６）のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片を、レグミンＡ２の３’転写終結領域、アンピシリン耐性遺伝子、および細菌ｏｒｉを有するプラスミドｐＫＲ１４２（配列番号１３７；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）のＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ２６４（配列番号１３８）を作成した。したがって、ベクターｐＫＲ２６４は、グリシニンＧｙ１遺伝子におけるプロモーターおよびレグミンＡ２の３’転写終結領域により隣接されたＮｏｔＩ部位を有する（Ｇｙ１／ＮｏｔＩ／ｌｅｇＡ２カセット）。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１をＮｏｔＩでの消化によりｐＫＲ１０５５（配列番号１０４；実施例１５）から放出させ、プラスミドｐＫＲ２６４（配列番号１３８）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１２８（配列番号１３９）を作成した。
ＭａＤ５を有するｐＫＳ１２９（配列番号１４０；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ４５７（配列番号１２２；実施例１６）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ６０６（配列番号１４１）を作成した。
ベクターｐＫＲ６０６（配列番号１４１）をＢｓｉＷＩで消化し、満たして末端を平滑化してから、Ｇｙ１／ＭａＤ５／ｌｅｇＡ２カセットを有する断片をｐＫＲ２７７（配列番号１２０）の満たされたＮｇｏＭＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ８０４（配列番号１４２）を作成した。
Ｇｙ１／ＥｇＤＨＡｓｙｎ１／ｌｅｇＡ２カセットを有するｐＫＲ１１２８（配列番号１３９）のＢｓｉＷＩ断片をｐＫＲ８０４（配列番号１４２）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１３０（配列番号１４３）を作成した。
プラスミドｐＫＲ９５３（配列番号１１７）をＢｓｉＷＩで消化し、末端を満たして平滑化し、次いでｐＫＲ９５３をＢａｍＨＩで消化した。Ｓａｌｂ／ＥｇＤ９Ｅｌｏ／Ｐｈａｓ３’カセットを有するｐＫＲ９５３の満たされたＢｓｉＷＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））のＰｍｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１３１（配列番号１４４）を作成した。
プラスミドｐＫＲ１１３１（配列番号１４４）をＰｓｔＩで消化し、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼを有する断片をｐＫＲ１１３０（配列番号１４３）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１３３（配列番号１４５、図１５Ｄ）を作成した。
この方法であれば、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１は、強力で種子特異的なプロモーターの補助下でモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼおよびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼと同時発現されうる。
実施例１９
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１）とシゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（ＳａＤ４）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１１０５の作成
βｃｏｎ／ＮｏｔＩ／Ｐｈａｓカセットを、プライマーｏＫｔｉ５（配列番号１４７）およびｏＫｔｉ６（配列番号１４８）を用い、ｐＫＳ１２３（配列番号１４６；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）からＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片をＢｓｉＷＩで消化し、細菌の複製および選択の起点を有するｐＫＲ１２４（配列番号１４９；ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、プラスミドｐＫＲ１９３（配列番号１５０）を作成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０Ｅｌｏｄｏｍ１をＮｏｔＩでの消化によりｐＨＤ１６（配列番号５１；実施例１０）から放出させ、プラスミドｐＫＲ１９３（配列番号１５０）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１０３（配列番号１５１）を作成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０Ｅｌｏｄｏｍ１を有するＢｓｉＷＩ断片をｐＫＲ１１０３（配列番号１５１）から放出させ、ｐＫＲ２２６（配列番号１３０；実施例１７）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ベクターｐＫＲ１１０４（配列番号１５２）を作成した。
ベクターｐＫＲ３００（配列番号１５３；２００４年８月２６日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）は、ＮｏｔＩ制限部位により隣接されたシゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（ＳａＤ４）（米国特許第７，０４５，６８３号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第０２／０９０４９３号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）を有する。ＳａＤ４内に存在するＡｓｃＩ部位を対応するアミノ酸配列に影響を与えずに除去し、ＮｏｔＩ部位により隣接された状態の新しい配列（配列番号１５４）を作成した。ＮｏｔＩ断片（配列番号１５４）をプラスミドｐＫＲ４５７（配列番号１２２；実施例１６）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１０２（配列番号１５５）を作成した。
プラスミドｐＫＲ１１０２（配列番号１５５）をＰｓｔＩで消化し、ＳａＤ４を有する断片をｐＫＲ１１０４（配列番号１５２）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１０５（配列番号１５６；図１６Ａ）を作成した。この方法であれば、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１ Ｃ２０エロンガーゼドメインは、強力かつ種子特異的なプロモーターの補助下でシゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼと同時発現されうる。
実施例２０
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン／シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ融合体（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＳａＤ４）を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１１３４の作成
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇＥＰＡＥｌｏＤｏｍ−５（配列番号４３）およびｏＥＵＧｓｙｎ６−４（配列番号１５７）でｐＫＲ１０９１から増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１１０７（配列番号１５８）を作成した。
プラスミドｐＫＲ１１０７（配列番号１５８）をＮｏｔＩで消化し、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３を有する断片を再ライゲートし、ｐＫＲ１１１２（配列番号１５９）を形成した。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３を有するｐＫＲ１１１２（配列番号１５９）のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片を、ＳａＤ４を有するｐＫＲ１０６８（配列番号７５；実施例１１）のＸｂａＩ／ＳｂｆＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１１５（配列番号１６０）を作成した。この方法で、内部ＳｂｆＩ部位を有しないＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０Ｅｌｏｄｏｍ３−ＳａＤ４を再び作成したが、それは実施例１１に記載される場合と同一のアミノ酸配列をコードする。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０Ｅｌｏｄｏｍ３−ＳａＤ４をＮｏｔＩでの消化によりｐＫＲ１１１５（配列番号１６０）から放出させ、ＡＬＳ選択可能マーカーを有するプラスミドｐＫＲ１１０４（配列番号１５２）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１３４（配列番号１６１；図１６Ｂ）を作成した。
実施例２１
テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８）とサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼ（ＳｄＤ１７）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１０９５の作成
本実施例では、ＴｐｏｍＤ８とＳｄＤ１７との同時発現のための大豆ベクターおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ選択可能マーカー（ｈｐｔ）の作成について記載する。
（培養物１Ｌ由来の）テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１細胞をＰｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｋｔｏｎ（ＣＣＭＰ）（Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｏｃｅａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ））から購入した。全ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従って単離した。細胞ペレットをトリゾール試薬０．７５ｍＬ中に再懸濁し、０．５ｍｍのガラスビーズ０．５ｍＬと混合し、最高の設定でのＢｉｏｓｐｅｃミニビードビーター（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）で３分間均質化した。混合物を１４，０００ｒｐｍでのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で３０秒間遠心し、残渣およびガラスビーズを除去した。上清を２４：１のクロロホルム：イソアミルアルコール１５０μＬで抽出した。上部の水相をＲＮＡ単離に用いた。
ＲＮＡ単離においては、水相をイソプロピルアルコール０．３７５ｍＬと混合し、室温で５分間インキュベートしておいた。沈殿ＲＮＡを８，０００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、４℃で５分間保持した。ペレットを８０％エタノール０．７ｍＬで１回洗浄し、風乾した。したがって、９５μｇの全ＲＮＡをテトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１から得た。
全ＲＮＡ（１μＬ中０．９５μｇの全ＲＮＡ）を鋳型として用い、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手したＣｒｅａｔｏｒ（商標）ＳＭＡＲＴ（商標）ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。全ＲＮＡ（１μＬ）を、ＳＭＡＲＴ ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号１８１）１μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの３’−ＲＡＣＥキットからのアダプタープライマー（配列番号１８２）１μＬ、および水２μＬと混合した。混合物を７５℃に５分間で加熱し、次いで氷上で５分間冷却した。混合物に、５×第一鎖緩衝液２μＬ、２０ｍＭ ＤＴＴ１μＬ、ｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを１０ｍＭずつ）１μＬ、およびＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素１μＬを添加した。試料を４２℃で１時間インキュベートした。次いで、得られた第一鎖ｃＤＮＡを増幅における鋳型として用いた。
テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８；配列番号１６２；米国特許出願第１１／８７６，１１５号明細書（２００７年１０月２２日出願；代理人整理番号ＢＢ−１５７４）中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＴｐｏｍＮｏｔ−５（配列番号１６３）およびＴｐｏｍＮｏｔ−３（配列番号１６４）でｃＤＮＡから増幅した。
テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ ｃＤＮＡ（１μＬ）を、５０ｐモルのＴｐｏｍＮｏｔ−５（配列番号１６３）、５０ｐモルのＴｐｏｍＮｏｔ−３（配列番号１６４）、１μＬのＰＣＲヌクレオチドミックス（１０ｍＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１．５μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および５０μＬまでの水と結合させた。反応条件は、９４℃で３分間、次いで９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で１分間からなる３５サイクルであった。ＰＣＲを７２℃で７分間で終了し、次いで４℃で保持した。ＰＣＲ反応物５μＬをアガロースゲル電気泳動により分析し、約１．３ｋｂの分子量を有するＤＮＡバンドが観察された。
残存生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））を用い、製造業者のプロトコルに従って精製した。得られたＤＮＡを、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってクローン化し、ｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５）を作成した。
ＴｐｏｍＤ８をＮｏｔＩでの消化によりｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５）から放出させ、プラスミドｐＫＲ１７９（配列番号１０８；実施例１５）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１００２（配列番号１６６）を作成した。
βｃｏｎ／ＴｐｏｍＤ８／Ｐｈａｓ３’カセットを有するｐＫＲ１００２（配列番号１６６）のＰｓｔＩ断片を、ＳｄＤ１７を有するｐＫＲ３２８（配列番号１１０；実施例１５）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ベクターｐＫＲ１０９５（配列番号１６７）を作成した。ｐＫＲ１０９５の略図を図１６Ｃに示す。
実施例２２
テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８）とユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅｌｏ）およびモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＭａＤ５）との同時発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１１３２の作成
ＴＰｏｍＤ８をＮｏｔＩでの消化によりｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５；実施例２１）から放出させ、プラスミドｐＫＲ２６４（配列番号１３８；実施例１８）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１２７（配列番号１６８）を作成した。
Ｇｙ１／ＴＰｏｍＤ８／ｌｅｇＡ２カセットを有するｐＫＲ１１２７（配列番号１６８）由来のＢｓｉＷＩ断片をｐＫＲ８０４（配列番号１４２；実施例１８）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１２９（配列番号１６９）を作成した。
プラスミドｐＫＲ１１３１（配列番号１４４；実施例１８）をＰｓｔＩで消化し、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼを有する断片をｐＫＲ１１２９（配列番号１６９）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１３２（配列番号１７０、図１６Ｄ）を作成した。この方法であれば、テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）Δ８デサチュラーゼは、強力かつ種子特異的なプロモーターの補助下でモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼおよびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼと同時発現されうる。
実施例２３
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ／ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１リンカー／パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ融合体（ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ−ＰａｖＤ８）を発現するための大豆発現ベクターＫＳ３７３の作成
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（ＥｇＤ９ｅｌｏ；実施例１６；配列番号１１２）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１プロリンリッチリンカー（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ；配列番号１７１；実施例６中に記載され、図６で示される）、およびパブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ（ＰａｖＤ８；実施例１６；配列番号１２４）の間でのインフレーム融合を下記の条件を用いて作成した。
５’末端でのＮｃｏＩ部位および３’末端でのＮｏｔＩ部位により隣接された、ＥｇＤ９ｅｌｏとＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの間の初期インフレーム融合（ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ）をＰＣＲ増幅により行った。ＥｇＤ９ｅｌｏ（配列番号１１２）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドＭＷＧ５０７（配列番号１７２）およびＭＷＧ５０９（配列番号１７３）を用いて増幅した。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号１７１）を、オリゴヌクレオチドＭＷＧ５１０（配列番号１７４）およびＭＷＧ５１１（配列番号１７５）を用いる同様の方法で増幅した。得られた２つのＰＣＲ産物を結合させ、ＭＷＧ５０７（配列番号１７２）およびＭＷＧ５１１（配列番号１７５）を用いて再増幅し、ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを形成した。ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの配列は配列番号１７６で示される。ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋが３’末端でのＮｏｔＩ部位の上流に停止コドンをインフレームで有しないことから、ＮｏｔＩ部位にクローン化されたＤＮＡ断片はＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋとインフレーム融合を生じうる。
プラスミドＫＳ３６６（配列番号１７７）は、β−コングリシニンのα’サブユニットにおけるプロモーター（Ｂｅａｃｈｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３頁（１９８５年））およびファゼリオン遺伝子の３’転写終結領域（Ｄｏｙｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８頁（１９８６年））により隣接された固有のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する。ｐＫＲ７２（配列番号１０５）内の固有のＮｏｔＩ部位と固有のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの複数のクローニング部位との置換以外では、ＫＳ３６６内のＢｃｏｎ／ＮｃｏＩＮｏｔＩ／Ｐｈａｓ３’カセットは、隣接するＨｉｎｄＩＩＩ部位がＢａｍＨＩ部位により置換された以外ではｐＫＲ７２（配列番号１０５）内に見出されるものと同一である。ＫＳ３６６のＢｃｏｎ／ＮｃｏＩＮｏｔＩ／Ｐｈａｓ３’カセットをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。
ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号１７６）を有するＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片をβ−コングリシニンのα’サブユニットにおけるプロモーターを有するＫＳ３６６（配列番号１７７）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ＫＳ３６６−ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号１７８）を作成した。
（実施例１６で記載のように生成された）ＰａｖＤ８を有するＮｏｔＩ断片をＫＳ３６６−ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号１７８）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ＫＳ３７３（配列番号１７９；図１７）を作成した。
実施例２４
ＤＨＡシンターゼ、Ｃ２０エロンガーゼドメイン、Δ４デサチュラーゼドメイン、合成Ｃ２０エロンガーゼ／Δ４デサチュラーゼ融合タンパク質および他の合成エロンガーゼ／デサチュラーゼ融合タンパク質を発現するための他の大豆発現ベクターの作成
当業者は、本明細書中に記載の遺伝子、プロモーター、ターミネーターおよび遺伝子カセットに加え、他のプロモーター／遺伝子／ターミネーターカセットの組み合わせが、限定はされないが、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１を発現するための本明細書中に記載された方法と同様の方法で合成可能であることを理解できる。同様に、他のＰＵＦＡ遺伝子（例えば表２３中に記載のもの）を、本発明のＤＨＡシンターゼまたはＤＨＡシンターゼドメイン（すなわち個別に発現されたＣ２０エロンガーゼドメインまたはΔ４デサチュラーゼドメイン）のいずれかとの同時発現として発現することが望ましい場合がある。さらに、適切なリンカー領域により分離されたエロンガーゼドメインとデサチュラーゼドメインの間の合成融合体であれば、作成および発現が可能である。例えば、Ｃ２０エロンガーゼ（またはＤＨＡシンターゼ由来のＣ２０エロンガーゼドメイン）と適切なΔ４デサチュラーゼ（またはＤＨＡシンターゼ由来のΔ４デサチュラーゼドメイン）の間の合成融合体であれば、作成および発現が可能である。あるいは、他のエロンガーゼまたはデサチュラーゼであれば、限定はされないが、ＤＨＡシンターゼ由来のリンカーにより分離されたΔ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼの間の本明細書中に記載の合成融合体などの使用が可能である（すなわち実施例２３）。
例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７１１７８号パンフレットでは、大豆における胚特異的な発現に用いられる多数のプロモーターおよび転写ターミネーター配列の単離について記載されている。さらに、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットでは、個別のプロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを併せて固有の組み合わせでライゲートすることによる複数のプロモーター／遺伝子／ターミネーターカセットの組み合わせでの合成について記載されている。一般に、適切なプロモーター（例えば限定はされないが表２１中に列挙されるもの）および転写ターミネーター（例えば限定はされないが表２２中に列挙されるもの）により隣接されたＮｏｔＩ部位を用い、所望の遺伝子がクローン化される。ＮｏｔＩ部位は、ＮｏｔＩ部位を遺伝子の５’および３’末端に導入するように設計されたオリゴヌクレオチドでのＰＣＲ増幅を用い、例えば限定はされないが表２３中に列挙される目的の遺伝子に付加されうる。次いで、得られたＰＣＲ産物はＮｏｔＩで消化され、適切なプロモーター／ＮｏｔＩ／ターミネーターカセットにクローン化される。
さらに、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットでは、所望の表現型発現を得るために各遺伝子カセットを併せて固有の組み合わせで適切な選択可能マーカーカセットとさらに連結することについて記載されている。これは主に異なる制限酵素部位を用いて行われるが、当業者は多数の技術を用いて所望のプロモーター／遺伝子／転写ターミネーターの組み合わせが得られうることを理解できる。そのように行うことで、胚特異的なプロモーター／遺伝子／転写ターミネーターカセットの任意の組み合わせが得られうる。当業者はまた、これらのカセットが各ＤＮＡ断片上、または遺伝子の同時発現が複数のＤＮＡ断片の同時形質転換の結果である場合には複数の断片上に位置しうることを理解できる。
Figure 2010523113
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Figure 2010523113
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実施例２５
大豆発現ベクターによる大豆不定胚培養の生成およびモデル系の形質転換
培養条件：
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を、６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの光強度、冷白色蛍光灯の１６：８時間の昼／夜の光周期、２６℃、１５０ｒｐｍのロータリーシェーカー上で液体培地ＳＢ１９６（下記）３５ｍＬ中に維持する。培養物を、７日から２週間置きに、約３５ｍｇの組織を３５ｍＬの新鮮な液体ＳＢ１９６に接種することにより継代培養する（好ましい継代培養間隔は７日置きである）。
大豆胚形成懸濁培養物を、すべての形質転換においてＤｕＰｏｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム改良）を用い、粒子銃衝撃法（ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０頁（１９８７年））により、大豆発現プラスミドで形質転換する。
大豆胚形成懸濁液の培養開始：
大豆培養を月ごとに２回開始し、各開始の間に５〜７日設ける。入手できる大豆植物由来の未熟種子とともに鞘を植え付けの４５〜５５日後に採取する。種子を鞘から取り出し、滅菌したマゼンタボックスに入れる。大豆種子を、Ｉｖｏｒｙ石鹸１滴を加えた５％Ｃｌｏｒｏｘ溶液（すなわち、９５ｍＬのオートクレーブ蒸留水＋Ｃｌｏｒｏｘ５ｍＬおよび石鹸１滴を十分に混合したもの）中での１５分間の振とうにより滅菌する。種子を２本の１リットルのボトルでの滅菌蒸留水を用いてすすぎ、４ｍｍ未満の種子を各顕微鏡用スライド上に置く。種子の細かい末端を切断し、子葉を種皮から押し出す。培養物を生成形質転換のために調製している最中に、子葉をＳＢ１培地を有するプレートに移す（１プレ
ート当たり２５〜３０の子葉）。プレートを繊維テープで巻き付け、６０〜８０μＥ／ｍ２／ｓの光強度、１６：８時間の昼／夜の光周期、冷白色蛍光下、２６℃で８週間維持し、４週間後に培地を変える。培養物をモデル系実験のために調製している最中に、子葉をＳＢ１９９培地を有するプレートに２週間移し（１プレート当たり２５〜３０の子葉）、次いでＳＢ１に２〜４週間移す。光および温度条件は上記と同じである。ＳＢ１培地でのインキュベーション後、二次胚を切断し、ＳＢ１９６液体培地に７日間入れる。
衝撃のためのＤＮＡの調製：
目的の遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を有する無傷プラスミドまたはＤＮＡプラスミド断片のいずれかを衝撃用に用いた。本明細書中に記載のように作成された大豆発現プラスミド由来の断片は消化されたプラスミドのゲル単離により得られる。各々の場合、１００μｇのプラスミドＤＮＡを下記の特異的な酵素ミックス０．５ｍＬ中で用いる。プラスミドを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（２０ｍＭトリス−酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．９）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、および５ｍＭのβ−メルカプトエタノール中のＡｓｃＩ（１００単位）で３７℃で１．５時間かけて消化する。得られたＤＮＡ断片を１％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧアガロース（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）上でのゲル電気泳動により分離し、遺伝子カセットを有するＤＮＡ断片をアガロースゲルから切断する。ＤＮＡを、ＧＥＬａｓｅ消化酵素を用い、製造業者のプロトコルに従い、アガロースから精製する。
３ｍｇの金粒子（３ｍｇの金）を含有する無菌蒸留水の一定分量５０μＬを、１０ｎｇ／μＬのＤＮＡ溶液（無傷プラスミドまたは本明細書中に記載のように調製されたＤＮＡ断片のいずれか）３０μＬ、５ＭのＣａＣｌ２ ２５μＬ、および０．１Ｍスペルミジン２０μＬに添加する。混合物をレベル３のボルテックスシェーカー上で３分間振とうし、卓上微量遠心機で１０秒間回転する。上清を除去後、１００％エタノール４００μＬで洗浄し、さらに短時間遠心分離する。エタノール４００μｌを除去し、ペレットを１００％エタノール４０μＬ中に再懸濁する。ＤＮＡ懸濁液５μＬをＢｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置ディスクの各フライングディスク（ｆｌｙｉｎｇ ｄｉｓｋ）に分注する。各一定分量５μＬは、１衝撃当たり（例えばディスク当たり）約０．３７５ｍｇの金を含有する。
モデル系形質転換においては、プロトコルはいくつかの小さな変更（すなわち、１ｍｇの金粒子を１μｇ／μＬのＤＮＡ溶液５μＬに添加し、２．５Ｍ ＣａＣｌ２５０μＬを用い、かつペレットを最終的に１００％エタノール８５μＬ中に再懸濁することで１衝撃当たり０．０５８ｍｇの金粒子をもたらすこと）以外では同一である。
組織調製およびＤＮＡによる衝撃：
約１５０〜２００ｍｇの７日目の胚形成懸濁培養物を６０×１５ｍｍの空の無菌ペトリ皿内に入れ、皿をプラスチックメッシュで覆う。チャンバを脱気し、２７〜２８インチの水銀の真空にし、組織を、１１００ＰＳＩに設定した膜破壊圧力での１プレート当たり１回もしくは２回のショットで攻撃する。組織を保持／停止スクリーンから約３．５インチの所に置く。モデル系形質転換条件は、１００〜１５０ｍｇの胚形成組織を用い、破壊圧力を６５０ＰＳＩに設定し、かつ組織を保持スクリーンから約２．５インチの所に置くこと以外は同一である。
形質転換胚の選択：
形質転換胚を、ハイグロマイシン（ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を選択可能マーカーとして用いる場合）またはクロルスルフロン（アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子を選択可能マーカーとして用いる場合）のいずれかを用いて選択する。
衝撃後、組織を新しいＳＢ１９６培地中に入れ、上記のように培養する。攻撃の６〜８日後、ＳＢ１９６を、用いられる選択可能マーカーに応じて、３０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンまたは１００ｎｇ／ｍＬのクロルスルフロンのいずれかを含有する新しいＳＢ１９６と交換する。選択培地を週ごとに更新する。選択の４〜６週後、緑色の形質転換組織が形質転換されていない壊死胚形成集団から成長することが観察される。
胚成熟：
生成形質転換においては、単離された緑色組織を取り出し、マルチウェルプレートに接種し、新しいクローン性増殖された形質転換胚形成懸濁培養物を生成する。形質転換胚形成集団を、９０〜１２０μＥ／ｍ２ｓの光強度、１６：８時間の光周期での冷白色蛍光（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ冷白色Ｅｃｏｎｏｗａｔｔ Ｆ４０／ＣＷ／ＲＳ／ＥＷ）およびＡｇｒｏ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｆ４０ Ａｇｒｏ）バルブ（４０ワット）下、ＳＢ１９６中、マルチウェルプレート内、２６℃で４〜６週間培養する。この期間後、胚集団を固形寒天培地ＳＢ１６６に１〜２週間移し、次いでＳＢ１０３培地に継代培養し、３〜４週間かけて成熟胚にする。ＳＢ１０３中、プレート上での成熟後、各胚を集団から取り出し、乾燥し、上記のようにそれらの脂肪酸組成物中での改変についてスクリーニングする。
モデル系形質転換においては、胚は、改良した手順を用い、大豆組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ２４：３９３頁（２００５年））中で成熟する。つまり、上記のようにＳＢ１９６中での選択の４週間後、胚集団を２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内のＳＢ２２８（ＳＨａＭ液体培地）３５ｍＬに移す。組織を、６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの光強度、１６：８時間の昼／夜の光周期での冷白色蛍光下、１３０ｒｐｍおよび２６℃でのロータリーシェーカー上のＳＨａＭ液体培地中で胚が成熟するように２週間維持する。ＳＨａＭ液体培地中で２週間成長させた胚のサイズおよび脂肪酸含量は、ＳＢ１６６／ＳＢ１０３で５〜８週間培養した胚に相当する。
ＳＨａＭ液体培地中で成熟後、各胚を集団から取り出し、乾燥し、上記のようにそれらの脂肪酸組成物中での改変についてスクリーニングする。
培地のレシピ：
ＳＢ１９６−ＦＮライト液体増殖培地（１リットル当たり）
ＭＳ ＦｅＥＤＴＡ-１００×ストック１ １０ｍＬ
ＭＳ硫酸塩−１００×ストック２ １０ｍＬ
ＦＮライトハロゲン化物−１００×ストック３ １０ｍＬ
ＦＮライトＰ、Ｂ、Ｍｏ−１００×ストック４ １０ｍＬ
ビタミンＢ５（１ｍＬ／Ｌ） １．０ｍＬ
２，４−Ｄ（１０ｍｇ／Ｌの最終濃度） １．０ｍＬ
ＫＮＯ３ ２．８３ｇｍ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．４６３ｇｍ
アスパラギン １．０ｇｍ
スクロース（１％） １０ｇｍ
ｐＨ５．８
Figure 2010523113
ＳＢ１固形培地（１リットル当たり）
１パッケージのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬのビタミンＢ５ １０００×ストック
３１．５ｇのグルコース
２ｍＬの２，４−Ｄ（２０ｍｇ／Ｌの最終濃度）
ｐＨ５．７
８ｇのＴＣ寒天
ＳＢ１９９固形培地（１リットル当たり）
１パッケージのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬのビタミンＢ５ １０００×ストック
３０ｇのスクロース
４ｍｌの２，４−Ｄ（４０ｍｇ／Ｌの最終濃度）
ｐＨ７．０
２ｇｍのゲルライト
ＳＢ１６６固形培地（１リットル当たり）
１パッケージのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬのビタミンＢ５ １０００×ストック
６０ｇの麦芽糖
７５０ｍｇのＭｇＣｌ２六水和物
５ｇの活性炭
ｐＨ５．７
２ｇのゲルライト
ＳＢ１０３固形培地（１リットル当たり）
１パッケージのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬのビタミンＢ５ １０００×ストック
６０ｇの麦芽糖
７５０ｍｇのＭｇＣｌ２六水和物
ｐＨ５．７
２ｇのゲルライト
ＳＢ７１−４固形培地（１リットル当たり）
１ボトルのガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ）Ｂ５塩ｗ／スクロース（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−カタログ番号２１１５３−０３６）
ｐＨ５．７
５ｇのＴＣ寒天
２，４−Ｄストック
Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈの既製品、カタログ番号Ｄ２９５―濃度１ｍｇ／ｍＬを入手
ビタミンＢ５ストック（１００ｍＬ当たり）
−２０℃で一定分量を保存
１０ｇのミオイノシトール
１００ｍｇのニコチン酸
１００ｍｇのピリドキシンＨＣｌ
１ｇのチアミン
溶液の溶解が十分に迅速でない場合、撹拌ホットプレート（ｈｏｔ ｓｔｉｒ ｐｌａｔｅ）により低レベルに加熱する。
ＳＢ２２８−大豆の組織分化および成熟（ＳＨａＭ）（１リットル当たり）
ＤＤＩ Ｈ２Ｏ ６００ｍＬ
ＳＨａＭ １０×におけるＦＮライトマクロ塩 １００ｍＬ
ＭＳマイクロ塩 １０００× １ｍＬ
ＭＳ ＦｅＥＤＴＡ １００× １０ｍＬ
ＣａＣｌ １００× ６．８２ｍＬ
ビタミンＢ５ １０００× １ｍＬ
Ｌ−メチオニン ０．１４９ｇ
スクロース ３０ｇ
ソルビトール ３０ｇ
容量を９００ｍＬに調節
ｐＨ５．８
オートクレーブ
冷却培地（３０℃以下）に添加：
＊グルタミン（最終濃度３０ｍＭ） ４％ １１０ｍＬ
＊注：最終容量はグルタミンの添加後、１０１０ｍＬになる。
グルタミンが比較的迅速に分解することから、培地の使用の直前に添加することが好ましい場合がある。グルタミンの添加から期限切れの２週間；塩基培地はグルタミンなしでより長期間保持されうる。
ＳＨＡＭ １０×におけるＦＮライトマクロ−ストック＃１（１リットル当たり）
（ＮＨ４）２ＳＯ４（硫酸アンモニウム） ４．６３ｇ
ＫＮＯ３（硝酸カリウム） ２８．３ｇ
ＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２０（硫酸マグネシウム七水和物） ３．７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４（リン酸カリウム、一塩基） １．８５ｇ
容量の調節（Ｂｒｉｎｇ ｔｏ ｖｏｌｕｍｅ）
オートクレーブ
ＭＳミクロ１０００×−ストック＃２（１リットル当たり）
Ｈ３ＢＯ３（ホウ酸） ６．２ｇ
ＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ（マンガン硫酸塩一水和物） １６．９ｇ
ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２０（硫酸亜鉛七水和物） ８．６ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４ ＊２Ｈ２０（モリブデン酸ナトリウム二水和物） ０．２５ｇ
ＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２０（硫酸銅五水和物） ０．０２５ｇ
ＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２０（塩化コバルト（ＩＩ）六水和物） ０．０２５ｇ
ＫＩ（ヨウ化カリウム） ０．８３００ｇ
容量の調節
オートクレーブ
ＦｅＥＤＴＡ １００×−ストック＃３（１リットル当たり）
Ｎａ２ＥＤＴＡ＊（ナトリウムＥＤＴＡ） ３．７３ｇ
ＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２０（硫酸鉄（ＩＩ）七水和物） ２．７８ｇ
＊ＥＤＴＡは鉄の添加前に完全に溶解される必要がある。
容量の調節
溶液は感光性である。ボトルはホイルで包み、光を遮断する必要がある。
オートクレーブ
Ｃａ １００×−ストック＃４（１リットル当たり）
ＣａＣｌ２ ＊２Ｈ２０（塩化カルシウム二水和物） ４４ｇ
容量の調節
オートクレーブ
ビタミンＢ５ １０００×−ストック＃５（１リットル当たり）
チアミン＊ＨＣｌ １０ｇ
ニコチン酸 １ｇ
ピリドキシン＊ＨＣｌ １ｇ
Ｍｙｏ−イノシトール １００ｇ
容量の調節
冷凍貯蔵
４％グルタミン−ストック＃６（１リットル当たり）
ＤＤＩ水を３０℃に加熱 ９００ｍＬ
Ｌ−グルタミン ４０ｇ
攪拌し、低温を適用しながら徐々に添加
３５℃を超えないこと
容量の調節
フィルタを殺菌する
冷凍貯蔵＊
＊注：３１℃の溶液中で解凍したストックを温め、結晶を完全に溶解する。
実施例２６
クロルスルフロンの選択（ＡＬＳ）および植物再生
クロルスルフロン（ＡＬＳ）の選択：
衝撃後、組織を、新しいＳＢ１９６培地を有する２つのフラスコに分けて、実施例２５に記載のように培養する。衝撃の６〜７日後、ＳＢ１９６を選択剤として１００ｎｇ／ｍＬのクロルスルフロン（クロルスルフロンストックは０．０１Ｎ水酸化アンモニウム中で１ｍｇ／ｍＬである）を含有する新しいＳＢ１９６と交換する。選択培地を週単位で更新する。選択の４〜６週後、緑色の形質転換組織が形質転換されていない壊死胚形成集団から成長することが観察可能である。単離した緑色組織を取り出し、ＳＢ１９６を有するマルチウェルプレートに接種し、胚を実施例２５に記載のように成熟させる。
大豆不定胚の植物への再生：
胚形成懸濁培養物から植物全体を得るため、組織は再生されなければならない。胚は実施例２５に記載のように成熟する。ＳＢ１０３培地での３週間の継代培養後、各胚は集団から除去され、本明細書中に記載のその脂肪酸組成物中での改変についてスクリーニングされうる。目的の遺伝子の発現から生じる任意の検出可能な表現型であればこの段階でスクリーニング可能であることは注目すべきである。これであれば、限定はされないが、脂肪酸の特性、タンパク質の特性および含量、炭水化物の含量、成長速度、生存度、または正常に大豆植物に発現させる能力における改変を含むことになる。
各成熟胚を、それらを空の小さいペトリ皿（３５×１０ｍｍ）に約４〜７日間入れることによって乾燥する。プレートを繊維テープで密封する（低湿度チャンバを作る）。乾燥させた胚をそれらが残存するＳＢ７１−４培地に植え、上記と同じ培養条件下で発芽させる。発芽した小植物を発芽培地から取り出し、水で徹底的にすすぎ、次いで２４の細胞パックトレイ内のＲｅｄｉ−Ｅａｒｔｈに植え、透明なプラスチックドームで覆う。２週間後にドームを除去し、さらに１週間で植物の耐寒性を高める。小植物に耐寒性が認められる場合、それらをＲｅｄｉ−Ｅａｒｔｈの１０インチのポットに、１ポット当たり最大３本の植物として移植する。１０〜１６週間後、成熟種子を採取し、切り開き、脂肪酸について分析する。
実施例２７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＤＨＡシンターゼの機能解析
上の一般的方法に記載のように、下の表２４中に記載の各発現ベクターをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のウラシルｕｒａ３栄養要求性株に形質転換した。
適切なヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現ベクター（表２４参照）を有する形質転換ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一のコロニーを、０．２％のタージトールを補充したウラシル欠損ＭＭ３ｍＬで、３０℃で１日間成長させた。この後、０．０５ｍＬを脂肪酸の補充が全くないかまたは０．１７５ｍＭまでのＥＰＡを補充した同じ培地３ｍＬに移した。これらを２５０ｒｐｍ、３０℃で１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によりペレットを得た。細胞を水で１回洗浄し、遠心分離によりペレット化し、風乾した。ペレットを１％ナトリウムメトキシド５００μＬと５０℃で３０分間エステル交換し（Ｒｏｕｇｈａｎ Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ Ｉ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８−４６頁（１９９０年））、その後、１Ｍ塩化ナトリウム５００μＬおよびヘプタン１００μＬを添加した。完全な混合および遠心分離後、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を上記のようにＧＣにより分析した（一般的方法を参照）。
Figure 2010523113
ｐＢＹ−ＥｇＣ２０ｅｌｏ１を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における脂肪酸特性によると、ＥＰＡからＤＰＡへの伸長が全く示されなかった。残存するクローンにおける脂肪酸特性、計算されたパーセント伸長および計算されたパーセント脱飽和を図１８に示す。パーセントＣ２０伸長（％ Ｃ２０ Ｅｌｏｎｇ）を、ＤＰＡおよびＤＨＡにおける重量パーセント（ｗｔ．％）の和をＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡにおけるｗｔ．％の和で除し、％で表すために１００を掛けることにより計算した。同様に、パーセントΔ４脱飽和（％ Ｄ４ Ｄｅｓａｔ）を、ＤＨＡにおけるｗｔ．％をＤＰＡおよびＤＨＡにおけるｗｔ．％の和で除し、％で表すために１００を掛けることにより計算した。平均はＡｖｅ．とそれに続く適切なヘッダーにより示される。
図１８を要約すると、ＥａＤＨＡｓｙｎ４以外のＤＨＡシンターゼの全部が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内でＣ２０エロンガーゼ（ＥＰＡからＤＰＡに伸長）およびΔ４デサチュラーゼ（ＤＰＡからＤＨＡに脱飽和）の双方として機能した。ヌクレオチド配列内でのフレームシフトが原因でＣ末端に実質的に異なるアミノ酸配列を有するＥａＤＨＡｓｙｎ４は、かなり低めの伸長機能を有し、デサチュラーゼ活性は全く検出されなかった。ｐＹ１３２におけるＥｇＤＨＡｓｙｎ１の連続的発現の結果、おそらくはＥｇＤＨＡｓｙｎ１が一部のベクター配列、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１の５’ＵＴＲおよびＥｇＤＨＡｓｙｎ１コード配列の間のインフレーム融合体として発現されたという事実に起因し、他のＥｇＤＨＡｓｙｎ１コンストラクトと比較する場合よりも高い活性がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で得られた。結果的に生成された融合体により、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内での発現の促進または酵素自体に対する特有の活性の増大が原因で活性の促進がもたらされうる。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊のコード配列のみが発現される場合（すなわち５’ＵＴＲを全く有しない；ｐＹ１４１を参照）、活性は５’ＵＴＲが存在するが融合体として翻訳されない場合（すなわちｐＹ１６１を参照）よりも高い。この観察結果は、おそらくは５’ＵＴＲの存在に起因するＥｇＤＨＡｓｙｎ１の発現の低下によるものである。
実施例２８
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１独立性のＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼドメインの機能解析ならびに異種融合体との比較
下記、表２５中の各発現ベクター（およびベクターのみ（対照）を、実施例２７に記載のようにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４に形質転換した。ＥＰＡおよび／またはＤＰＡを形質転換ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞に供給した。表２５中の各コンストラクトにおける相対的なドメイン構造を示す略図を図２１に示す。
Figure 2010523113
Figure 2010523113
Figure 2010523113
次いで、形質転換細胞の脂肪酸特性を実施例２７に記載のように分析した。
ＥＰＡのベクターのみ（対照）ｐＹ１４１、ｐＹ１４３、ｐＹ１４９、ｐＹ１５６、ｐＹ１５７およびｐＹ１６０への供給における結果を図１９に示す。ｐＹ１５０、ｐＹ１５１、ｐＹ１５２およびｐＹ１５３を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における脂肪酸特性はＥＰＡからＤＰＡへの伸長を全く示さず、図１９中に示されない。
ＤＰＡのベクターのみ（対照）ｐＹ１４１、ｐＹ１５０、ｐＹ１５１、ｐＹ１５２、ｐＹ１５３、ｐＹ１５６、ｐＹ１５７およびｐＹ１６０への供給における結果を図２０に示す。ｐＹ１４３およびｐＹ１４９を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における脂肪酸特性はＤＰＡからＤＨＡへの脱飽和を全く示さず、図２０中に示されない。
パーセントＣ２０伸長（％ Ｃ２０ Ｅｌｏｎｇ）、パーセントΔ４脱飽和（％ Ｄ４ Ｄｅｓａｔ）および平均を実施例２７に記載のように計算した。
図１９および図２０を要約すると、Ｃ２０の平均パーセント伸長は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０Ｅｌｏドメイン（リンカーを伴う場合または伴わない場合；すなわちｐＹ１４３およびｐＹ１４９）が単独で発現される場合、天然ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊（ｐＹ１４１；配列番号４９）の場合と比べて約４０％増加する。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Δ４デサチュラーゼドメインの場合に逆が生じ、この場合、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ１（ｐＹ１５２；配列番号６７；図２０を参照）の場合に全く活性が認められず、またＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｄ４Ｄｏｍ２（ｐＹ１５３；配列番号７２；図２０を参照）が単独で発現される場合にＤＰＡを供給するＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊（ｐＹ１４１；配列番号４９；図２０を参照）の場合よりも約５０％少ない。ＩｇＤ４は、単独で（ｐＹ１５０；配列番号６２；図２０を参照）または融合体として（ｐＹ１５６；配列番号６４；図１９および２０を参照）発現される場合、Δ４デサチュラーゼ活性を全く有しないだけでなく、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０エロンガーゼドメイン（ｐＹ１５６；配列番号６４；図１９を参照）と融合される場合、おそらくは不正確なフォールディングに起因し、伸長活性における約５０％の低下をもたらす。それに対し、単独で発現されるＳａＤ４（ｐＹ１５１；配列番号７６；図２０を参照）は、天然ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊（ｐＹ１４１；配列番号４９；図２０を参照）の場合とほぼ同じΔ４デサチュラーゼ活性を有する。興味深いことに、ＳａＤ４のΔ４デサチュラーゼ活性は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン（ｐＹ１６０；配列番号７７；図２０を参照）に融合される場合、約２倍高まる。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメインに融合され、ＥＰＡが供給される場合（ｐＹ１６０；配列番号７７；図１９を参照）、Δ４デサチュラーゼ活性は、ＤＰＡが供給される場合（ｐＹ１６０；配列番号７７；図２０を参照）、約３倍高まり、これは２つのドメインの連結がおそらくは基質チャネリングに起因して効率またはフラックスの増加をもたらすことを示唆している。
実施例２９
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊の基質特異性
ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡをｐＹ１４１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊；配列番号４９）およびベクターのみ（対照）で形質転換したヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞に供給し、脂肪酸特性を実施例２７に記載のように分析した。
ＥＰＡ、ＡＲＡおよびＤＰＡの供給における結果を図２２に示す。ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡおよびＥＴＡを供給したヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における脂肪酸特性は、伸長を全く示さず、図２２中に示されない。ＥＰＡまたはＤＰＡが供給される場合、パーセントＣ２０伸長（％ Ｃ２０ Ｅｌｏｎｇ）およびパーセントΔ４脱飽和（％ Ｄ４ Ｄｅｓａｔ）および平均を実施例２７に記載のように計算した。ＡＲＡが供給される場合、パーセントＣ２０伸長（％ Ｃ２０ Ｅｌｏｎｇ）を、ドコサテトラエン酸［ＤＴＡ；２２：４（７，１０，１３，１６）］およびω−６ドコサペンタエン酸［ＤＰＡｎ−６；２２：５（４，７，１０，１３，１６）］におけるｗｔ．％の和をＡＲＡ、ＤＴＡおよびＤＰＡｎ−６におけるｗｔ．％の和で割り１００を掛けて％で表すことにより計算した。同様に、ＡＲＡが供給される場合、パーセントΔ４脱飽和（％ Ｄ４ Ｄｅｓａｔ）を、ＤＰＡｎ−６におけるｗｔ．％をＤＴＡおよびＤＰＡｎ−６におけるｗｔ．％の和で割り１００を掛けて％で表すことにより計算した。
図２２を要約すると、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊はＡＲＡおよびＥＰＡの双方を伸長するが、ＥＰＡにおいて（活性が約４０％高く）若干の優位性を有する。さらにＡＲＡの伸長生成物（すなわちＤＴＡ）をＥｇＤＨＡｓｙｎ１によりΔ４位置で脱飽和してＤＰＡｎ−６を生成し、ＤＴＡにおける活性はＤＰＡよりも約４０％高い。
実施例３０
大豆発現ベクターｐＫＲ９７３およびｐＫＲ１０６４で形質転換された大豆胚内でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１と、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７デサチュラーゼおよびユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼとの同時発現
成熟した大豆不定胚は、接合子胚における優れたモデルである。大豆不定胚は、液体培養中で球状胚状態にある間、成熟した大豆の接合子胚に特有の極少量のトリアシルグリセロールまたは貯蔵タンパク質を含有する。この発生段階では、全極性脂質（リン脂質および糖脂質）に対する全トリアシルグリセリドの比は約１：４であり、それは不定胚培養が開始される発生段階で大豆接合子胚に特有である。同様に球状状態では、突起した種子タンパク質、β−コングリシニンのα’サブユニット、ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター３、および種子レクチンにおけるｍＲＮＡは本質的に存在しない。トリアシルグリセロールは、成熟不定胚状態への分化を可能にするホルモンフリー培地に移される時、最も豊富な脂質クラスになる。同様に、β−コングリシニンのα’サブユニット、ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター３および種子レクチンにおけるｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団内での極めて豊富なメッセージになる。これに基づき、大豆不定胚系はインビボで成熟大豆接合子胚に酷似した挙動をすることから、脂肪酸生合成経路内で遺伝子の発現を修飾する表現型効果を分析するための優れた迅速なモデル系である（ＰＣＴ公開の国際公開第２００２／００９０４号パンフレット、実施例３を参照）。最も重要なことに、モデル系ではまた、トランスジェニック胚由来の植物から種子の脂肪酸組成物が予測される。
ｐＫＲ９７３およびｐＫＲ１０６４を発現するトランスジェニック大豆不定胚の脂肪酸分析：
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を、実施例２５で生成について記載されかつ表２６中にまとめられるように、ｐＫＲ９７３およびｐＫＲ１０６４のＡｓｃＩ断片（発現カセットを有する断片）で形質転換した。
Figure 2010523113
各事象から製造された大豆胚のサブセット（１事象当たり１０の胚）を収穫し、ガラスＧＣバイアルに採取し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製した。エステル交換においては、トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＨ）５０μＬおよびヘキサン０．５ｍＬをグラスバイアル内の胚に添加し、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。脂肪酸メチルエステル（ヘキサン層から注射した５μＬ）を、Ｏｍｅｇａｗａｘ ３２０溶融シリカキャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．）を具備するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを用いて分離し、定量した。オーブン温度をプログラムし、２２０℃で２．６分間保持し、２０℃／分で２４０℃に高め、次いでさらに２．４分間保持した。キャリアガスをＷｈａｔｍａｎ水素発生装置により供給した。保持時間を市販の標準のメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）における時間と比較した。優れた表現型を有する事象を、オーブン温度を１５０℃で１分間保持し、次いで５℃／分で２４０℃に高めること以外は同一の条件を用いてＧＣにより再分析した。
代表的事象に由来する各胚における脂肪酸特性を図２３に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、１８：３（ＡＬＡ）、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＰＡ、２２：３（１０，１３，１６）（ドコサトリエン酸）、ＤＴＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡとして同定され、図２３に列挙した脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。
ＥｇＤＨＡｓｙｎ１の活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００により計算されるパーセントＣ２０伸長（％ Ｃ２０ Ｅｌｏｎｇ）および／またはパーセントΔ４脱飽和（％ Ｄ４ Ｄｅｓａｔ）で表される。
より詳細には、ＥＰＡにおけるパーセント伸長は、（［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］／［ＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００として決定される％ Ｃ２０ Ｅｌｏｎｇで示される。ＤＰＡにおけるパーセントΔ４脱飽和は、（［ＤＨＡ］／［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００として決定される％ Ｄ４ Ｄｅｓａｔで示される。伸長または脱飽和されうる他の脂肪酸はこの計算に含められなかった。
ＥＰＡおよびＡＲＡにおける伸長および脱飽和生成物に加え、大豆中で、大量の脂肪酸２２：３（１０，１３，１６）が作られたことから、ＤＧＬＡもＥｇＤＨＡｓｙｎ１により伸長されるように見られる。脂肪酸は、ＧＣ−ＭＳにより２２：３に対する質量を有することが見出され、２２：３（１０，１３，１６）に対する質量に合致するＭＳ特性を有したことから、２２：３（１０，１３，１６）として同定された。
実施例３１
大豆発現ベクターＫＳ３７３で形質転換された大豆胚内でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ／パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼ融合体（ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ−ＰａｖＤ８）の発現
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を、実施例２５でのモデル系についての記載のようにＫＳ３７３（配列番号１７９；図１７）およびＫＳ１２０（ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される）で形質転換した。ＫＳ１２０はハイグロマイシン選択を有する。実施例２３で作成したＫＳ３７３は、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼおよびパブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ８デサチュラーゼを含む融合タンパク質の発現を可能にし、ここで２つのドメインはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１リンカー（すなわちＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ）と連結された。
３１の事象由来の５つの各胚における脂肪酸特性を実施例３０に記載のように得た。５つの最高の伸長事象から得られた結果を図２４に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、１８：３（ＡＬＡ）、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＲＡおよびＥＴＡとして同定され、かつ図２４に列挙した脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。
ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ−ＰａｖＤ８の活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００により計算されるパーセントΔ９伸長（％ Ｄ９ Ｅｌｏｎｇ）および／またはパーセントΔ８脱飽和（％ Ｄ８ Ｄｅｓａｔ）で表される。
より詳細には、パーセントΔ９伸長は、（［ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］）×１００として決定される％ Ｄ９ Ｅｌｏｎｇで示される。パーセントΔ８脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］）×１００として決定される％ Ｄ８ Ｄｅｓａｔで示される。
最高の％ Ｄ９ Ｅｌｏｎｇ事象は、９２．７％の平均％ Ｄ８ Ｄｅｓａｔで２２．１％の平均伸長を有した。伸長はΔ９エロンガーゼが大豆胚内で単独で発現される場合に見られる伸長よりもやや短いが、これは観察された少数の事象に起因しうると思われる。それに対し、ＰａｖＤ８がＥｇＤ９ｅｌｏおよびＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋと融合される場合での脱飽和がＰａｖＤ８が大豆胚内で単独で発現される場合よりもかなり高く、これは一部の事象でほぼ１００％の変換に達する。Δ８デサチュラーゼによるこの変換の高まりは、おそらくは基質チャネリングに起因して効率またはフラックスが増加することに起因しうると思われる。
実施例３２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のコドン最適化Ｃ２０エロンガーゼ遺伝子（ＥｇＣ２０ＥＳ）の合成および機能解析
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のため、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のＥｇＤＨＡｓｙｎ１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１）のＣ２０エロンガーゼドメイン（すなわち配列番号１２のアミノ酸１〜３０３に対応）のコドン使用を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書で記載の場合と同様の方法で最適化した。具体的には、コドン最適化Ｃ２０エロンガーゼ遺伝子（「ＥｇＣ２０ＥＳ」と称され、配列番号１８３で示されるヌクレオチド配列および配列番号１８４で示されるアミノ酸配列を有する）を、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）でのコドン使用パターン（ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン辺りのコンセンサス配列、およびＲＮＡ安定性の一般的規則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｇｅｎｅ、２６５（１−２）：１１−２３頁（２００１年））に従い、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＣ２０エロンガーゼドメイン（配列番号２０１）のコード配列に基づいて設計した。翻訳開始部位の修飾に加え、９０９ｂｐのコード領域の中の１６３ｂｐを修飾し（１７．９％）、１４７のコドンを最適化した（４８．５％）。コドン最適化遺伝子内での修飾のうち、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものは皆無であった（すなわち、配列番号１８４は配列番号１２のアミノ酸１〜３０３に対して配列が１００％同一である）。設計したＥｇＣ２０ＥＳ遺伝子（配列番号１８３）はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成され、それをｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローン化し、ｐＥｇＣ２０ＥＳ（図５１Ｂ；配列番号１８５）を作成した。
コドン最適化ＥｇＣ２０ＥＳ遺伝子の機能を解析するため、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＣ２０ＥＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含むプラスミドｐＺｕＦｍＥｇＣ２０ＥＳ（図５２Ａ；配列番号３６０）を作成した。プラスミドｐＺｕＦｍＥｇＣ２０ＥＳは以下の成分を有した。
Figure 2010523113
一般的方法に記載のように、プラスミドｐＺｕＦｍＥｇＣ２０ＥＳをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で２日間成長後、ＭＭプレート上で成長した１０の形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長してから、１０の株を３０℃で３ｍＬの液体ＭＭに個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、全脂質の約６．２％のＥＰＡおよび２．８％のＤＰＡが１０全部の形質転換体中で生成されることが示され、ここではこれらの１０株中でのＥＰＡからＤＰＡへの変換効率が約３１％（実施例２７に記載のように計算）であることが判定された。したがって、この実験データによると、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Ｃ２０エロンガーゼ（すなわち配列番号１８３で示されるＥａＣ２０ＥＳ）がＥＰＡをＤＰＡに活発に変換することが示された。
実施例３３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）由来のコドン最適化Ｃ２０エロンガーゼ遺伝子（ＥａＣ２０ＥＳ）の合成および機能解析
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のため、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）のＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２２８）のＣ２０エロンガーゼドメイン（すなわち配列番号９６のアミノ酸１〜２９９に対応）のコドン使用を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット、米国特許第７，１２５，６７２号明細書および上の実施例３２で記載の場合と同様の方法で最適化した。具体的には、コドン最適化Ｃ２０エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＣ２０ＥＳ」と称され、配列番号１８８で示されるヌクレオチド配列および配列番号１８９で示されるアミノ酸配列を有する）を、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）でのコドン使用パターン（ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン辺りのコンセンサス配列、およびＲＮＡ安定性の一般的規則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｇｅｎｅ、２６５（１−２）：１１−２３頁（２００１年））に従い、ＥａＤＨＡｓｙｎ２のＣ２０エロンガーゼドメイン（配列番号９２）のコード配列に基づいて設計した。翻訳開始部位の修飾に加え、８９７ｂｐのコード領域の中の１４３ｂｐを修飾し（１５．９％）、１３４のコドンを最適化した（４４．８％）。コドン最適化遺伝子内での修飾のうち、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものは皆無であった（すなわち、配列番号１８９は配列番号９６のアミノ酸１〜２９９に対して配列が１００％同一である）。設計したＥａＣ２０ＥＳ遺伝子（配列番号１８８）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成し、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローン化し、ｐＥａＣ２０ＥＳ（配列番号１９０）を作成した。
コドン最適化ＥａＣ２０ＥＳ遺伝子の機能を解析するため、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＣ２０ＥＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子をを含むプラスミドｐＺｕＦｍＥａＣ２０ＥＳ（配列番号３６１）を作成した。プラスミドｐＺｕＦｍＥａＣ２０ＥＳ（配列番号３６１）は、ＥａＣ２０ＥＳ（配列番号１８８）をＥｇＣ２０ＥＳ（配列番号１８３）の代わりに用いたこと以外では、作成においてプラスミドｐＺｕＦｍＥｇＣ２０ＥＳ（配列番号３６０；図５２Ａ）の場合と同一であった。
一般的方法に記載のように、プラスミドｐＺｕＦｍＥａＣ２０ＥＳ（配列番号３６１）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で２日間成長後、ＭＭプレート上で成長した２０の形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長してから、２０の株を３０℃で３ｍＬの液体ＭＭに個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、全脂質の約７．４％のＥＰＡおよび１％のＤＰＡが２０全部の形質転換体中で生成されることが示され、ここではこれらの２０株中でのＥＰＡからＤＰＡへの変換効率が約１１％（実施例２７に記載のように計算）であることが判定された。したがって、この実験データによると、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Ｃ２０エロンガーゼ（すなわち配列番号１８８で示されるＥａＣ２０ＥＳ）がＥＰＡをＤＰＡに活発に変換することが示された。
実施例３４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）由来のコドン最適化Δ４デサチュラーゼ遺伝子（ＥａＤ４Ｓ）の合成および機能解析
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のため、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）のＥａＤＨＡｓｙｎ２（配列番号２４３）のΔ４デサチュラーゼドメイン（すなわち配列番号９６のアミノ酸２５９〜８４１に対応）のコドン使用を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット、米国特許第７，１２５，６７２号明細書および上の実施例３２および３３で記載の場合と同様の方法で最適化した。具体的には、コドン最適化Δ４デサチュラーゼ遺伝子（「ＥａＤ４Ｓ」と称され、配列番号１９２で示されるヌクレオチド配列および配列番号１９３で示されるアミノ酸配列を有する）を、配列番号１９４（ヌクレオチド）および配列番号１９５（アミノ酸）としても提供されるＥａＤＨＡｓｙｎ２のΔ４デサチュラーゼドメイン（配列番号９２）のコード配列に基づいて設計した。翻訳開始部位の修飾に加え、（ＴＡＡ停止コドンを含む）１７５２ｂｐのコード領域の中の３０７ｂｐを修飾し（１７．５％）、２８５のコドンを最適化した（４８．８％）。さらに、ＮｃｏＩ部位を、合成ＥａＤ４Ｓ遺伝子内で野生型Δ４デサチュラーゼドメインの２番目のアミノ酸（すなわち配列番号９６のアミノ酸残基２６０または配列番号１９５のアミノ酸残基２）をロイシンからバリン残基に変化させることにより翻訳開始コドンの辺りに導入した。したがって、ＥａＤ４Ｓのアミノ酸配列は配列番号１９３で示される。設計したＥａＤ４Ｓ遺伝子（配列番号１９２）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成し、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローン化し、ｐＥａＤ４Ｓ（配列番号１９６）を作成した。
コドン最適化ＥａＤ４Ｓ遺伝子の機能を解析するため、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４（図５２Ｂ；配列番号３６２）を作成し、２種のキメラＣ２０エロンガーゼ遺伝子およびキメラＥａＤ４Ｓ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４のリパーゼ４様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ_５０３８２５）に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４は以下の成分を有した。
Figure 2010523113
一般的方法に記載のように、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で５日間成長後、ＭＭプレート上で成長した８つの形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長してから、これらの株を３０℃で３ｍＬの液体ＭＭに個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、全脂質の平均で０．４％のＤＨＡおよび１０．２％のＤＰＡが８つ全部の形質転換体中で生成されることが示され、ここではこれらの８株中でのＤＰＡからＤＨＡへの変換効率が約４．２％（実施例２７に記載のように計算）であることが測定された。したがって、この実験データによると、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ４デサチュラーゼ（すなわち配列番号１９２で示されるＥａＤ４Ｓ）が活性があるが比較的低い変換効率で機能することが示された。
実施例３５
大豆発現ベクターｐＫＲ１１０５で形質転換された大豆胚内でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１）とシゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ（ＳａＤ４）との同時発現
以下の実施例では、植物中に製造される場合、ＥＰＡを生成する大豆事象と交配し、ＤＨＡを生成する植物を作成できる、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１およびＳａＤ４を発現するトランスジェニック大豆事象の製造について記載する。
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１１０５（配列番号１５６；図１６Ａ；発現カセットを有する断片）のＡｓｃＩ断片で形質転換し、胚は実施例２５での生成についての記載のように成熟したが、以下の変化を伴った。１０〜１２日間のＳＢ１０３上での成熟後、各事象における一群の胚を、６ウェルのマイクロタイタープレート内に０．０２％テルジトールおよび０．３３ｍＭ ＥＰＡを含有するＳＢ１４８液体培地（下記レシピ）４ｍＬ中に移した。
ＳＢ１０３固形培地（１リットル当たり）
１パッケージのＭＳ塩（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−カタログ番号１１１１７−０６６）
１ｍＬのビタミンＢ５ １０００×ストック
６０ｇの麦芽糖
ｐＨ５．７
集団を注意深く破壊して各胚を放出させ、マイクロタイタープレートを、６０〜８５μＥ／ｍ２／ｓの光強度、１６：８時間の昼／夜の光周期での冷白色蛍光下、１５０ｒｐｍでのロータリーシェーカー上、２６℃で４８時間振とうした。４８時間後、胚を水ですすぎ、乾燥し、１事象当たり５つの胚をガラスＧＣバイアルに採取した。脂肪酸メチルエステルをＴＭＳＨでのエステル交換により調製し、実施例３０に記載のように、Ｏｍｅｇａｗａｘ ３２０溶融シリカキャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．）を具備するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを用いて定量した。オーブン温度をプログラムし、１５０℃で１分間保持し、次いで５℃／分で２４０℃に高めた。保持時間を、市販の標準のメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）における場合と比較した。
この方法で、ｐＫＲ１１０５で形質転換された１２２の事象を分析した。分析された１２２の事象から４９がＥＰＡ（Ｃ２０／Δ５エロンガーゼ活性）を伸長することが同定され、かつこれらの中の４１がＤＰＡ（Δ４デサチュラーゼ活性）を脱飽和しＤＨＡを生成することが同定された。最高のＣ２０／Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性を有する事象は高度なものであり、胚へのＥＰＡの供給から得られる脂肪酸特性を図２６に示す。
図２６中の脂肪酸は１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＰＡ、２２：０（ドコサン酸）、ＤＰＡ、２４：０（テトラコサン酸）、ＤＨＡおよび２４：１（ネルボン酸）として同定され、かつ図２６で列挙される脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１の活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００により計算されるパーセントＣ２０／Δ５伸長（％ Ｃ２０／Δ５ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＥＰＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］／［ＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００として決定される「％ Ｃ２０／Δ５ ｅｌｏｎｇ」で示される。
ＳａＤ４の活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００により計算されるパーセントΔ４脱飽和（％Δ４ ｄｅｓａｔ）で表される。より詳細には、ＤＰＡにおける総パーセント脱飽和は、（ＤＨＡ／［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００として決定される「％Δ４ ｄｅｓａｔ」で示される。
実施例３６
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３由来のΔ９エロンガーゼの同定
本実施例では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３ ｃＤＮＡライブラリー由来のΔ９エロンガーゼの同定について記載する。この研究はまた、米国仮特許出願第６０／９１１，９２５号明細書（２００７年４月１６日出願；代理人整理番号ＢＢ−１６１３；その内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載される。
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３の成長およびＲＮＡの調製
増幅されたｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃを播種し、コロニーを実施例１３に記載のようにリフトした。ＤＮＡプローブを、ＲａｄＰｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８４２８−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用い、製造業者の使用説明書に従ってＰ３２ｄＣＴＰで標識した、ｐＫＲ９０６（配列番号１１５；実施例１６および２００７年５月３１日に公開された国際公開第２００７／０６１８４５号パンフレット；代理人整理番号ＢＢ−１５６２；その内容は参照により本明細書中に援用される）由来のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子を有するアガロースゲル精製ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を用いて作成した。
コロニーリフトをプローブし、実施例１３に記載のように陽性を同定し、確認した。プラスミドＤＮＡを単離し、実施例２に記載のように正確に配列決定し、配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（バージョン４．２、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を用いて整列し、比較した。この方法であれば、クローンは（ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２と称される）挿入配列に基づく２つの異なる群の中の１つに分類されうる。配列の各クラスにおけるｃＤＮＡを有する代表的なクローンをさらなる試験のために選択し、代表的な各プラスミド（ｐＬＦ１２１−１およびｐＬＦ１２１−２）における配列をそれぞれ配列番号２５０および配列番号２５１で示す。ＮＮＮＮの鎖により示される配列は、配列決定されていないポリＡテールの領域を示す。ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２におけるコード配列をそれぞれ配列番号２５２および配列番号２５３で示す。ＥａＤ９Ｅｌｏ１およびＥａＤ９Ｅｌｏ２に対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２５４および配列番号２５５で示す。
実施例３７
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３由来のΔ５デサチュラーゼの同定
本実施例では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３由来のΔ５デサチュラーゼの同定について記載する。この研究はまた、米国仮特許出願第６０／９１５７３３号明細書（２００７年５月３日出願；代理人整理番号ＢＢ−１６１４；その内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
増幅されたｃＤＮＡライブラリーｅｕｇ１ｃを播種し、コロニーを実施例１３に記載のようにリフトした。ＤＮＡプローブを、Ｐ３２で標識した、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（２００７年１１月２９日に公開；代理人整理番号ＢＢ１６２９；その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述のｐＤＭＷ３６７（配列番号１１５；実施例１６および２００７年５月３１日に公開された国際公開第２００７／０６１８４５号パンフレット；代理人整理番号ＢＢ−１５６２；その内容は参照により本明細書中に援用される）由来のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（ＥｇＤ５；配列番号２６７）を有するアガロースゲル精製ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を用いて作成した。
コロニーリフトをプローブし、実施例１３に記載のように陽性を同定し、確認した。プラスミドＤＮＡを単離し、実施例２に記載のように正確に配列決定し、配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（バージョン４．２、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を用いて整列し、比較した。
ｃＤＮＡ（ｐＬＦ１１９）を有する代表的なクローンを配列番号２５６で示し、ｃＤＮＡ内に含まれる遺伝子をＥａＤ５Ｄｅｓ１と称した。ＥａＤ５Ｄｅｓ１におけるコード配列を配列番号２５７で示す。ＥａＤ５Ｄｅｓ１に対応するアミノ酸配列を配列番号２５８で示す。
実施例３８
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１１８３の作成
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（ＥａＤ９Ｅｌｏ１；配列番号２５２；実施例３６）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１プロリンリッチリンカー（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ；配列番号１９７；実施例６）およびテトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８；配列番号１６２；実施例２１；米国特許出願第１１／８７６１１５号明細書（２００７年１０月２２日出願；代理人整理番号ＢＢ−１５７４）を有する出願人の譲受人の同時係属出願も参照）の間でのインフレーム融合を下記の条件を用いて作成した。
５’末端でのＮｃｏＩ部位および３’末端でのＮｏｔＩ部位により隣接された、ＥａＤ９Ｅｌｏ１とＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの間の初期インフレーム融合（ＥａＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ）をＰＣＲ増幅により行った。ＥａＤ９Ｅｌｏ１（配列番号２５２）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドＥａＤ９−５Ｂｂｓ（配列番号２５９）およびＥａＤ９−３ｆｕｓｉｏｎ（配列番号２６０）でｐＬＦ１２１−１（配列番号２５０）から増幅した。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号１９７）を、同様の方法で、オリゴヌクレオチドＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ−５ｆｕｓｉｏｎ（配列番号２６１）およびＭＷＧ５１１（配列番号１７５）でｐＫＲ１０４９（実施例４）から増幅した。２種の得られたＰＣＲ産物を結合させ、ＥａＤ９−５Ｂｂｓ（配列番号２５９）およびＭＷＧ５１１（配列番号１７５）を用いて再増幅し、ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを形成した。ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの配列は配列番号２６２で示される。ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋは３’末端でのＮｏｔＩ部位の上流にインフレームで停止コドンを有しないことから、ＮｏｔＩ部位にクローン化されたＤＮＡ断片は、正確なフレームが選択される場合、ＥｇＤ９ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋとのインフレーム融合を生じうる。ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＬＦ１２４（配列番号２６３）を作成した。
ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＬＦ１２４（配列番号２６３）のＢｂｓＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片をβ−コングリシニンのα’サブユニットにおけるプロモーターを有するＫＳ３６６（配列番号１７７；実施例２３）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１７７（配列番号２６４）を作成した。
ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＫＲ１１７７（配列番号２６４）のＢａｍＨＩＤＮＡ断片を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）に前述のｐＫＲ３２５のＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１７９（配列番号２６５）を作成した。
ＴｐｏｍＤ８を有するｐＬＦ１１４−１０（実施例２１；配列番号１６５）由来のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１１７９（配列番号２６５）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１８３（配列番号２６６；図２８）を作成した。図２８では、融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡシンターゼ）はＥＡｄ９ＥＬＯＮＧ−ＴＰＯＭｄ８ＤＳと称される。
実施例３９
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼとともにユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１２５３の作成
多数のサブクローン化ステップと通じて、ＮｏｔＩ部位をｐＤＭＷ３６７由来のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ（ＥｇＤ５；配列番号２６７）の５’末端に付加し、ＥｇＤ５を有するこのＮｏｔＩ断片をｐＫＲ４５７（配列番号１２２；実施例１６）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１２３７（配列番号２６８）を作成した。
Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡシンターゼを有するｐＫＲ１１８３（配列番号２６６；実施例３８）のＡｓｃＩ断片をｐＫＲ２７７（配列番号１２０、２００４年８月２６日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット中に前述；代理人整理番号ＢＢ−１５３８（その内容は参照により本明細書中に援用される）のＡｓｃＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１２５２（配列番号２６９）を作成した。
ＥｇＤ５遺伝子を有するｐＫＲ１２３７（配列番号２６８）のＢｓｉＷＩ断片をｐＫＲ１２５２（配列番号２６９）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１２５３（配列番号２７０；図３０）を作成した。
実施例４０
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼを発現するための大豆ベクターｐＫＲ１１３９の作成
本実施例では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３由来のΔ５デサチュラーゼの大豆発現ベクターへのクローニングについて記載する。この研究はまた、米国仮特許出願第６０／９１５７３３号明細書（２００７年５月３日出願；代理人整理番号ＢＢ−１６１４（その内容は参照により本明細書中に援用される））中に記載されている。
ＥａＤ５Ｄｅｓ１（配列番号２５７）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｏＥＡｄ５−１−１（配列番号２７１）およびｏＥＡｄ５−１−２（配列番号２７２）でｐＬＦ１１９（配列番号２５６、実施例３７）から増幅した。得られたＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１１３６（配列番号２７３）を作成した。
ＥａＤ５Ｄｅｓ１を有するｐＫＲ１１３６（配列番号２７３）におけるＮｏｔＩ断片を、２００７年１１月２９日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（代理人整理番号ＢＢ−１６２９（その内容は参照により本明細書中に援用される））中に前述のｐＫＲ９７４のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１３９（配列番号２７４）を作成した。
実施例４１
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼおよびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼとともにユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１２５５の作成
プラスミドｐＫＲ１１３９（配列番号２７４；実施例４０）をＳｂｆＩで消化し、ＥａＤ５Ｄｅｓ１を有する断片をｐＫＲ１２５３（配列番号２７０；実施例３９）のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１２５５（配列番号２７５；図３１）を作成した。
実施例４２
大豆Ｆａｄ３の下方制御発現のための大豆発現ベクターｐＫＲ１１８９の作成
本実施例では、大豆におけるｆａｄ３発現を低下させるように設計された大豆発現ベクターについて記載する。
開始ベクターｐＫＲ５６１（配列番号２７６）を、アネキシンプロモーターを有するｐＫＲ２６８（ＰＣＴ公開の国際公開第０４／０７１４６７号パンフレット中に前述）のＢｓｉＷＩ断片をＰＣＴ公開の国際公開第０４／０７１４６７号パンフレット中に記載のｐＫＲ１４５のＢｓｉＷＩ部位に挿入することにより構築した。
ＰＣＴ公開の国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（１９９３年６月１０日に公開；併せて米国特許第５，９５２，５４４号明細書；その内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載のプラスミドＸＦ１は、大豆Δ１５デサチュラーゼ（ｆａｄ３）遺伝子（配列番号２７７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２２９６４；ＧｍＦＡＤ３Ｂとも称される）を有する。
ｆａｄ３遺伝子の５’末端の一部を、ＨＰｆａｄ３−１（配列番号２７８）およびＨＰｆａｄ３−２（配列番号２７９）を用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、ＸＦ１から増幅し、ＨＰｆａｄ３ＡＢと称されるＤＮＡ断片（配列番号２８０）を作成した。
ｆａｄ３遺伝子の３’末端の一部を、ＨＰｆａｄ３−３（配列番号２８１）およびＨＰｆａｄ３−１（配列番号２７８）を用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＸＦ１から増幅し、ＨＰｆａｄ３Ａ’−２（配列番号２８２）と称されるＤＮＡ断片を作成した。
ＨＰｆａｄ３ＡＢおよびＨＰｆａｄ３Ａ’−２を結合し、ＨＰｆａｄ３−１（配列番号２７８）を用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅し、ＨＰｆａｄ３ＡＢＡ’−２（配列番号２８３）を作成した。ＨＰｆａｄ３ＡＢＡ’−２（配列番号２８３）は、ＤＮＡ断片の５’および３’末端の双方にＮｏｔＩ部位を有する。得られたＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＬＦ１２９（配列番号２８４）を作成した。
ｆａｄ３ヘアピンを有するｐＬＦ１２９（配列番号２８４）におけるＮｏｔＩ断片をｐＫＲ５６１（配列番号２７６）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１８９（配列番号２８５；図３２）を作成した。図３２では、ｆａｄ３におけるＡおよびＡ’ドメインをＴＲ１という名称で示す一方、ＢドメインをＴＲ２で示す。
実施例４３
大豆Ｆａｄ３および大豆Ｆａｄ３ｃを下方制御するための大豆発現ベクターｐＫＲ１２４９の作成
図３２で示される、ｆａｄ３のＴＲ１およびＴＲ２ドメインを有するｐＬＦ１２９（配列番号２８４）のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＬＦ１２９（配列番号２８４）のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ骨格断片にクローン化し、ｐＫＲ１２０９（配列番号２８６）を作成した。
ＧｍＦａｄ３Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２０４７１２）（Ｂｉｌｙｅｕら、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４３：１８３３−１８３８頁（２００３年）；Ａｎａｉら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１６８：１６１５−１６２３頁（２００５年））のコード配列は配列番号２８７で示され、対応するアミノ酸配列は配列番号２８８で示される。ｆａｄ３ｃ遺伝子の一部を、ｆａｄ３ｃ−５（配列番号２８９）およびｆａｄ３ｃ−３（配列番号２９０）を用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、ＰＣＴ公開の国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（１９９３年６月１０日に公開；併せて米国特許第５，９５２，５４４号明細書）（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に記載の大豆ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１２１３（配列番号２９１）を作成した。
ｆａｄ３ｃの断片を有するｐＫＲ１２１３（配列番号２９１）のＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ断片をｐＫＲ１２０９（配列番号２８６）のＮｏｔＩ（充満）／ＸｈｏＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１２１８（配列番号２９２）を作成した。
図３２に示される、ｆａｄ３由来のＴＲ１ドメインのみを有するｐＬＦ１２９（配列番号２８４）のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＬＦ１２９（配列番号２８４）のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ骨格断片にクローン化し、ｐＫＲ１２１０（配列番号２９３）を作成した。
ｆａｄ３ｃの断片を有するｐＫＲ１２１３（配列番号２９１）のＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ断片をｐＫＲ１２１０（配列番号２９３）のＮｏｔＩ（充満）／ＸｈｏＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１２１９（配列番号２９４）を作成した。
ｆａｄ３ｃおよびｆａｄ３のＴＲ１およびＴＲ２ドメインの断片を有するｐＫＲ１２１８（配列番号２９２）のＸｈｏＩ（充満）／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｆａｄ３ｃおよびｆａｄ３のＴＲ１のみのドメインの断片を有するｐＫＲ１２１９（配列番号２９４）のＭｌｕＩ（充満）／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１２２５（配列番号２９５）を作成した。この方法で、ｆａｄ３およびｆａｄ３ｃを含み、ＮｏｔＩ部位により隣接される新しいヘアピンが形成された。
ｆａｄ３およびｆａｄ３ｃを含む新しいヘアピンを有するｐＫＲ１２２５（配列番号２９５）におけるＮｏｔＩ断片をｐＫＲ５６１（配列番号２７６；実施例４２）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１２２９（配列番号２９６；図３３）を作成した。この方法で、ｆａｄ３／ｆａｄ３ｃヘアピンが、植物内でのハイグロマイシン選択性を有する強力かつ種子特異的なプロモーターから発現されうる。
ｆａｄ３およびｆａｄ３ｃを含む新しいヘアピンを有するｐＫＲ１２２５（配列番号２９５）におけるＢｓｉＷＩ断片をｐＫＲ２２６（配列番号１３０；実施例１７）のＢｓｉＷＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１２４９（配列番号２９７；図３４）を作成した。図３４では、ｐＫＲ１２４９はｐＫＲ１２４９_ＰＨＰ３３２４０と称される。この方法で、ｆａｄ３／ｆａｄ３ｃヘアピンが、植物内でクロルスルフロン（ＡＬＳ）選択性を有する強力かつ種子特異的なプロモーターから発現されうる。
実施例４４
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ−ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼ融合遺伝子（ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＴｐｏｍＤ８−ＥａＤ５Ｄｅｓ１融合体）を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１３２２の作成
本実施例では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（ＥａＤ９Ｅｌｏ１；配列番号２５２、実施例３６）、テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８；配列番号１６２；実施例２１）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＥａＤ５Ｄｅｓ１；配列番号２５７；実施例３７）の間でのインフレーム融合遺伝子の作成について記載する。各ドメインはＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカー（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ；配列番号１９７；実施例６）により分離される。
ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号２６２；実施例３８）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＥＡｄ９ｅｌ１−１（配列番号２９８）およびｏＬＩＮＫ−１（配列番号２９９）でｐＬＦ１２４（配列番号２６３）から増幅した。ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋは、５’末端でのＮｏｔＩと５’および３’末端でのＥａｇＩにより隣接され、３’末端でのＥａｇＩ部位の上流にインフレーム停止コドンを有しない。したがって、ＥａｇＩ部位にクローン化されたＤＮＡ断片は、正確なフレームが選択される場合、ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋとのインフレーム融合を生じうる。ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有する得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１２９８（配列番号３００）を作成した。
ＰＣＲ増幅により、ＴｐｏｍＤ８とＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ）の間のインフレーム融合を行い、それは５’末端にＮｏｔＩ部位と５’および３’末端にＥａｇＩ部位を有した。ＴｐｏｍＤ８（配列番号１６２）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＴＰｄ８−１（配列番号３０１）およびｏＴＰｄ８ｆｕＳ−１（配列番号３０２）でｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５）から増幅した。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号１９７）を、同様の方法で、オリゴヌクレオチドｏＬＩＮＫ−２（配列番号３０３）およびｏＬＩＮＫ−１（配列番号３０４）でｐＫＲ１０４９（実施例４）から増幅した。２種の得られたＰＣＲ産物を結合させ、ｏＴＰｄ８−１（配列番号３０１）およびｏＬＩＮＫ−１（配列番号３０４）を用いて再増幅し、ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号３０５）を形成した。ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１２９１（配列番号３０６）を作成した。
ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＫＲ１２９１のＥａｇＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、一方向にｐＫＲ１３０１（配列番号３０７）または逆方向にｐＫＲ１３０１Ｒ（配列番号３０８）のいずれかを形成した。
プラスミドｐＫＲ１３０１（配列番号３０７）をＭｆｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するＤＮＡ断片を完全に満たし、得られたＤＮＡ断片を再ライゲートし、ｐＫＲ１３１１（配列番号３０９）を形成した。
プラスミドｐＫＲ１３０１Ｒ（配列番号３０８）をＥｃｏＲＩで消化し、（ＴＰＯＭＤ８ＴＲ２と称される）ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの５’末端を有する断片とベクター骨格を再ライゲートし、ｐＫＲ１３０４（配列番号３１０）を形成した。
ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＫＲ１２９８（配列番号３００）のＥａｇＩ部位をｐＫＲ１３０４（配列番号３１０）のＥａｇＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３０９（配列番号３１１）を作成した。
ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＫＲ１２９８（配列番号３００）のＮｏｔＩ部位をｐＫＲ１３０４（配列番号３１０）のＥａｇＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３０９（配列番号３１１）を作成した。
ＥａＤ５Ｄｅｓ１を有するｐＫＲ１１３６（配列番号２７３；実施例４０）のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１３１１（配列番号３０９）のＥａｇＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３１３（配列番号３１２）を作成した。
ｐＫＲ１３１３（配列番号３１２）のＭｆｅＩ／Ｅｃｌ１３６ＩＩ断片をｐＫＲ１３０９（配列番号３１１）のＥｃｏＲＶ／ＭｆｅＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３１５（配列番号３１３）を作成した。
ｐＫＲ１３１５（配列番号３１３）のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ７２（配列番号１０５；実施例１５）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３２２（配列番号３１４；図３５）を作成した。
図３５では、ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＴｐｏｍＤ８−ＥａＤ５Ｄｅｓ１融合体はＥＡｄ９ｅｌ＋ＴＰｄ８ｄｓ＋ＥＡｄ５ｄｓ融合体と称される。
実施例４５
ｐＫＲ１１８９またはｐＫＲ１２２９での形質転換による大豆不定胚内での大豆ｆａｄ３およびｆａｄ３ｃ遺伝子の下方制御
本実施例では、ｆａｄ３ヘアピンコンストラクトを有するｐＫＲ１１８９（配列番号２８５、実施例４２）またはｆａｄ３およびｆａｄ３ｃヘアピンコンストラクトを有するｐＫＲ１２２９（配列番号２９６；実施例４３）の大豆不定胚内での形質転換および発現について記載する。両方のコンストラクトはまた、ハイグロマイシンに対する選択のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する。
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１１８９（配列番号２８５）またはｐＫＲ１２２９（配列番号２９６）で形質転換し、実施例２５や２００７年１１月２９日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述のように、胚を大豆の組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２４：３９３頁（２００５年））中で成熟させた。
ＳＨａＭ液体培地中での成熟後、各胚を集団から取り出し、乾燥し、実施例１に記載のようにその脂肪酸組成物中での改変についてスクリーニングした。各々の場合、ｐＫＲ１１８９（配列番号２８５）またはｐＫＲ１２２９（配列番号２９６）のいずれかで形質転換した大豆胚のサブセット（すなわち１事象当たり５つの胚）を採取し、分析した。
この方法で、ｐＫＲ１１８９（配列番号２８５；実験２１４８）またはｐＫＲ１２２９（配列番号２９６；実験２１６５）で形質転換した４１の事象を分析した。この実験における野生型胚に特有の脂肪酸特性を有する事象（２１４８−３−８−１）とともに最低の平均ＡＬＡ含量を有する５つの事象（分析した５つの胚の平均）における脂肪酸特性を図３６に示す。図３６では、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、およびＡＬＡとして同定される。脂肪酸組成は、全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。
ｆａｄ３ヘアピンコンストラクト（事象番号２１４８、図３６）またはｆａｄ３ｃヘアピンコンストラクト（事象番号２１６５、図３６）のいずれかを発現する不定胚内でのＡＬＡ含量は、典型的な野生型胚と比較した場合、少なくとも５０％の低下を示した（図３６）。これは、ヘアピンコンストラクトのいずれかが大豆胚内でのＡＬＡ含量を低下させる機能があることを明示している。
実施例４６
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現するためにｐＫＲ１１８３で形質転換される大豆不定胚
本実施例では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）およびハイグロマイシンに対する選択のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有するｐＫＲ１１８３（配列番号２６６；実施例３８）の大豆不定胚内での形質転換および発現について記載する。
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１１８３（配列番号２６６）で形質転換し、実施例２５や２００７年１１月２９日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中に前述のように、胚を大豆の組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２４：３９３頁（２００５年））中で成熟させた。
ＳＨａＭ液体培地中での成熟後、ｐＫＲ１１８３（配列番号２６６）で形質転換した大豆胚のサブセット（すなわち１事象当たり４つの胚）を採取し、本明細書中に記載のように分析した。
この方法で、ｐＫＲ１１８３（配列番号２６６；実験２１４５）で形質転換した２０の事象を分析した。最高の平均ＤＧＬＡ含量を有する５つの事象（分析した５つの胚の平均）における脂肪酸特性を図３７に示す。図３７では、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡおよびＥＴＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。
実施例４７
大豆Ｆａｄ３および大豆Ｆａｄ３ｃを下方制御するためのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼおよびｐＫＲ１２４９とともにユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現するために大豆発現ベクターｐＫＲ１２５３で形質転換される大豆胚 大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を、実施例２５に記載のようにｐＫＲ１２４９（配列番号２９７；実施例４３）およびｐＫＲ１２５３（配列番号２７０；実施例３９）のＡｓｃＩ断片で形質転換した。各事象から生成される大豆胚のサブセット（１事象当たり１０の胚）を採取し、ガラスＧＣバイアルに採取し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をエステル交換により調製し、実施例１に記載のようにＧＣにより分析した。保持時間を市販の標準のメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）における時間と比較した。
この方法で、ｐＫＲ１２４９（配列番号２９７）およびｐＫＲ１２５３（配列番号２７０）で形質転換した１４２の事象（Ｈｅａｌ２５と称される実験）を分析した。分析した１４２の事象から９０が、分析した１０の中から少なくとも１つの胚内でＡＲＡを全脂肪酸に対して１．０％超の相対量で生成することが同定された。これらの中の６４が、分析した１０の中から少なくとも１つの胚内でＡＲＡを全脂肪酸に対して１０．０％超の相対量で生成することが同定された。これらの中の４４の事象が、分析した１０の中から少なくとも１つの胚内でＡＲＡを全脂肪酸に対して２０．０％超の相対量で生成することが同定された。
最高のＡＲＡを有する２０の事象における平均脂肪酸特性（１０の胚の平均）を図３８に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＴＡおよびＥＰＡとして同定され、図３８に列挙される脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。図３８において「その他」として挙げられる脂肪酸は、１８：２（５，９）、１８：３（５，９，１２）、ＳＴＡ、２０：０、２０：１（１１）、２０：２（７，１１）または２０：２（８，１１）およびＤＰＡを含む。これらの各脂肪酸は全脂肪酸に対する２．０％未満の相対量で存在する。平均の全ω−３脂肪酸（全ｎ−３）はすべてのω−３脂肪酸の平均の和である。
１７．０％の平均ＡＲＡ含量および１．５％の平均ＥＰＡ含量を有する１つの事象（ＡＦＳ５４１６−８−１−１）由来の各胚における実際の脂肪酸特性を図３９に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＴＡおよびＥＰＡとして同定され、図３９に列挙される脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。図３９において「その他」に列挙される脂肪酸は、１８：２（５，９）、１８：３（５，９，１２）、ＳＴＡ、２０：０、２０：１（１１）、２０：２（７，１１）または２０：２（８，１１）およびＤＰＡを含む。これらの各脂肪酸、全脂肪酸に対する２．０％未満の相対量で存在する。全ω−３脂肪酸（全ｎ−３）はすべてのω−３脂肪酸の和である。
大豆不定胚内でのＡＬＡ含量が種子内での場合よりも、種子内での７〜１０％に対する成熟条件および時間に依存し（Ｂｉｌｙｅｕら、２００５年、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．４５：１８３０−１８３６頁）、一般に１．５〜３倍高いことから（すなわち胚内で１５％〜３０％（例えば、図３６中の典型的な野生型胚を参照））、一般にはω−３含量および具体的にはＥＰＡ含量が不定胚よりも種子内で有意に低いことになると想定される。
実施例４８
大豆Ｆａｄ３および大豆Ｆａｄ３ｃを下方制御するためのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼおよびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼおよびｐＫＲ１２４９とともにユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）を発現するために大豆発現ベクターｐＫＲ１２５５で形質転換される大豆胚 大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を、実施例２５に記載のようにｐＫＲ１２４９（配列番号２９７；実施例４３）およびｐＫＲ１２５５（配列番号２７５；実施例４１）のＡｓｃＩ断片で形質転換した。各事象から生成される大豆胚のサブセット（１事象当たり１０の胚）を採取し、ガラスＧＣバイアルに採取し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をエステル交換により調製し、実施例１に記載のようにＧＣにより分析した。保持時間を市販の標準のメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）における時間と比較した。
この方法で、ｐＫＲ１２４９（配列番号２９７）およびｐＫＲ１２５５（配列番号２７５）で形質転換した１９７の事象（Ｈｅａｌ２６と称される実験）を分析した。分析した１９７の事象からの１２８が、分析した１０の中から少なくとも１つの胚内でＡＲＡを全脂肪酸に対して１．０％超の相対量で生成することが同定された。これらの中の１０５が、分析した１０の中から少なくとも１つの胚内でＡＲＡを全脂肪酸に対して１０．０％超の相対量で生成することが同定された。また、これらの中の８３の事象が、分析した１０の中から少なくとも１つの胚内でＡＲＡを全脂肪酸に対して２０．０％超の相対量で生成することが同定された。
最高のＡＲＡを有する２０の事象における平均脂肪酸特性（９もしくは１０の胚の平均）を図４０に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＲＡ、ＪＵＮ、ＥＴＡおよびＥＰＡとして同定され、図４０に列挙される脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。図４０において「その他」として挙げられる脂肪酸は、１８：２（５，９）、１８：３（５，９，１２）、ＳＴＡ、２０：０、２０：１（１１）、２０：２（７，１１）または２０：２（８，１１）およびＤＰＡを含む。これらの各脂肪酸は全脂肪酸に対する２．０％未満の相対量で存在する。平均の全ω−３脂肪酸（全ｎ−３）はすべてのω−３脂肪酸の平均の和である。
実施例４９
大豆発現ベクターｐＫＲ１１３４で形質転換されたユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン／シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）Δ４デサチュラーゼ融合体（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ３−ＳａＤ４）の発現
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１１３４のＡｓｃＩ断片（配列番号１６１；実施例２０；発現カセットを有する断片）で形質転換し、胚を実施例２５での生成についての記載のように成熟させた。ＥＰＡの基質への供給および分析を実施例３５に記載のように行った。
この方法で、ｐＫＲ１１３４で形質転換した１９８の事象（Ｈｅａｌ２４と称される実験）を分析した。分析した１９８の事象から１９３が、ＥＰＡを伸長し（Ｃ２０／Δ５エロンガーゼ活性）、これらの全部がＤＰＡを脱飽和し（Δ４デサチュラーゼ活性）、ある程度ＤＨＡを生成することが同定された。最高のＣ２０／Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性を有する事象は高度なものであり、胚へのＥＰＡの供給から得られる脂肪酸特性を図４１に示す。
図４１中の脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＰＡ、２２：０（ドコサン酸）、ＤＰＡ、２４：０（テトラコサン酸）、ＤＨＡおよび２４：１（ネルボン酸）として同定され、図４１中に列挙される脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｃ２０ＥｌｏＤｏｍ１の活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００により計算されるパーセントＣ２０伸長／パーセントΔ５伸長（％ Ｃ２０／Δ５ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＥＰＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］／［ＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００として決定される「％ Ｃ２０／Δ５ ｅｌｏｎｇ」で示される。
ＳａＤ４の活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００により計算されるパーセントΔ４脱飽和（％Δ４ ｄｅｓａｔ）で表される。より詳細には、ＤＰＡにおける総パーセント脱飽和は、（ＤＨＡ／［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００として決定される「％Δ４ ｄｅｓａｔ」で示される。
実施例３５に記載のようにｐＫＲ１１０５で形質転換した大豆について分析された１２２の事象に加え（Ｈｅａｌ２３と称される実験）、実施例３５では全体の分析によって１４２の事象を得たことを記載したことから、さらに２０の事象を分析した。分析した２０の新しい事象から１８がＥＰＡを伸長し（Ｃ２０／Δ５エロンガーゼ活性）、またこれらの中の１７がＤＰＡを脱飽和し（Δ４デサチュラーゼ活性）、ある程度ＤＨＡを生成することが同定された。ｐＫＲ１１０５で形質転換した大豆について分析された２０の新しい事象に由来する最高のＣ２０／Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性を有する事象は高度なものであり、胚へのＥＰＡの供給から得られる脂肪酸特性を図４２に示す。
ｐＫＲ１１０５（個別に発現されるＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ）またはｐＫＲ１１３４（融合体として発現されるＣ２０エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ）のいずれかで形質転換した事象の相対的活性を、胚にＥＰＡが供給される場合の全事象における％ＤＨＡ（ｗｔ．％）対％ＤＰＡ（ｗｔ．％）をプロットすることで比較する。結果を図４３にプロットする。図４３では、Ｈｅａｌ２３はｐＫＲ１１０５が形質転換された場合の実験の名称であり、Ｈｅａｌ２４はｐＫＲ１１３４が形質転換された場合の実験である。図４３から、Ｃ２０エロンガーゼがΔ４デサチュラーゼに融合される場合、ＤＰＡ濃度が（検出できない程の低レベルに）減少している間にＤＨＡ濃度全体が増加していることは明らかである。したがって、２種の独立の酵素をリンカー領域により分離された１種の融合タンパク質として共に融合することで、ＥＰＡからＤＨＡへのフラックスが増加した。
実施例５０
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ−ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ５デサチュラーゼ融合遺伝子（ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＴｐｏｍＤ８−ＥａＤ５Ｄｅｓ１融合体）の発現
大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１３２２（配列番号３１４）で形質転換し、胚を成熟させ、本明細書中に記載の脂肪酸特性について分析した。
ｐＫＲ１３２２（配列番号３１４）で形質転換した大豆不定胚はＬＡをＥＤＡに伸長し、ＥＤＡはＤＧＬＡに脱飽和され、ＤＧＬＡはＡＲＡにさらに脱飽和されることになる。野生型大豆がＡＬＡも含有することから、一部のＡＬＡはＥＲＡに伸長され、ＥＲＡはＥＴＡに脱飽和され、ＥＴＡはＥＰＡにさらに脱飽和されることになる。
ｐＫＲ１３２２由来の融合遺伝子を発現する大豆植物は実施例２６に記載のように胚から再生可能であり、種子が得られうる。
大量のＡＬＡを含有するバックグラウンドでは、あるいはΔ１５デサチュラーゼおよび／またはΔ１７デサチュラーゼが同時発現されている場合、ＥＰＡが支配的となる。逆に、ＡＲＡは、（例えば少量のＡＬＡまたは少量のｌｉｎ植物への交配による）ＡＬＡが少量のバックグラウンドの使用または本明細書中に記載の内因性ｆａｄ３遺伝子のノックアウトにより濃縮されうる。中間体脂肪酸（すなわち、ＥＤＡおよびＤＧＬＡまたはＥＲＡおよびＥＴＡ）は、融合体が用いられる場合の方が各活性が独立に形質転換される場合（すなわち融合体でない）よりも少ないことになる。
（リンカーの組み合わせを含む）他の遺伝子の組み合わせは、実施例２４に記載される方法と同様の方法で共に融合されうる。同様に、他のプロモーター／遺伝子融合体／ターミネーターの組み合わせが可能である。
実施例５１
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）に由来しかつヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成Δ４デサチュラーゼ（ＥａＤ４Ｓ）内の機能ドメインの決定
図５２Ｃに概略的に図示されるように、ＥａＤＨＡｓｙｎ１のＣ２０エロンガーゼドメイン（図中で「ＥａＣ２０Ｅ」と称される）のＣ末端部分は、ＥａＤＨＡｓｙｎ１のΔ４デサチュラーゼドメイン（図中で「ＥａＤ４」と称される）のＮ末端部分と重なるように見られる。これは配列比較により示唆される。
ＥａＤ４Ｓ（配列番号１９２；実施例３４）内の機能Δ４デサチュラーゼドメインを定めるため、異なるＮ末端切断部位を有する３種のＥａＤ４Ｓ＊突然変異体を作成した。具体的には、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ（配列番号３６４）を、ｐＺｕＦｍＩｇＤ９ＥＳ（配列番号３６５）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＥａＤ４Ｓ（配列番号１９６；実施例３４）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＥａＤ４Ｓ断片と置き換えることにより作成した。ＮｃｏＩ部位を、プライマー対であるＹＬ９２１およびＹＬ９２２（それぞれ配列番号３６６および３６７）、ＹＬ９２３およびＹＬ９２４（それぞれ配列番号３６８および３６９）ならびにＹＬ９２５およびＹＬ９２６（それぞれ配列番号３７０および３７１）を用い、部位特異的突然変異誘発によってｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ（配列番号３６４）に導入し、それぞれｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−Ｍ１（配列番号３７２）、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−Ｍ２（配列番号３７３）およびｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−Ｍ３（配列番号３７４）を作成した。ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−Ｍ１、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−Ｍ２およびｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−Ｍ３プラスミドをＮｃｏＩで消化し、次いで自己ライゲートし、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−１（配列番号３７５）、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−２（配列番号３７６）およびｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−３（配列番号３７７）コンストラクトを作成した。ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−１、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−２、ｐＺｕＦｍＥａＤ４Ｓ−３由来のＥａＤ４Ｓの異なる切断部位を有するＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を用い、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−１（配列番号３７８）、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−２（配列番号３７９）およびｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−３（配列番号３８０）コンストラクトを作成した。これらの３つのコンストラクトは、ＥａＤ４Ｓのコード領域がＮ末端領域で切断されたこと以外ではｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４（配列番号３６２および図５２Ｂ、実施例３４の表２８中に記載）と全く同一であった。詳細には、切断型ＥａＤ４Ｓ＊ポリペプチドは、５８３個のアミノ酸長のＥａＤ４Ｓ（配列番号１９３）のコード配列ではなく、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−１（すなわち配列番号３８２）内の５４７個のアミノ酸長、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−２（すなわち配列番号３８４）内の５２７個のアミノ酸長およびｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−３（すなわち配列番号３８６）内の５１２個のアミノ酸長であった。これらポリペプチドのＮ末端領域（配列番号１９３のアミノ酸１〜９０に対応）は図５３Ａ中に整列される。
一般的方法に記載のように、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４（配列番号３６２）、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−１（配列番号３７８）、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−２（配列番号３７９）およびｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−３（配列番号３８０）をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で５日間成長後、各コンストラクトに由来するＭＭプレート上で成長させた５つの形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長させてから、これらの株を個別に３０℃で液体ＭＭ３ｍＬに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣの結果を下の表２９に示す。ＤＰＡおよびＤＨＡの組成物は全脂肪酸に対する％として存在する。変換効率（「Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）を式：（［ＤＨＡ］／［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００に従って測定した。各切断型ＥａＤ４Ｓ＊（すなわち、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−１、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−２およびｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４−３のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体内のそれぞれ５４７個のアミノ酸、５２７個のアミノ酸または５１２個のアミノ酸のポリペプチド）のΔ４デサチュラーゼ活性を、「％Δ４活性」と称される列内のＥａＤ４Ｓ（すなわち、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体）の場合と比較した。
Figure 2010523113
これらのデータによると、ＥａＤ４ＳのＮ末端の３７個のアミノ酸（すなわち、配列番号１９３のアミノ酸１〜３７）がΔ４デサチュラーゼの活性に対して負の効果を有することが示された。増大したΔ４デサチュラーゼ活性を、ＥａＤ４Ｓ＊切断型タンパク質の各々におけるＥａＤ４Ｓについて測定するが、５４７個のアミノ酸のＥａＤ４Ｓ＊ポリペプチド（配列番号３８２）はＮ末端から追加的なアミノ酸が欠如したＥａＤ４Ｓ＊ポリペプチド（すなわち配列番号３８４および３８６）よりも活性が高い。
実施例５２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のコドン最適化Δ４デサチュラーゼ遺伝子（ＥｇＤ４Ｓ）の合成および機能解析
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のため、（配列番号１２のアミノ酸２５３〜７９３に対応する）ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のＥｇＤＨＡｓｙｎ１のΔ４デサチュラーゼドメイン（配列番号２２１）のコドン使用を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット、米国特許第７，１２５，６７２号明細書、および本明細書中の実施例３２、３３、および３４の中に記載の場合と同様の方法で最適化した。詳細には、コドン最適化Δ４デサチュラーゼ遺伝子（「ＥｇＤ４Ｓ」と称される；配列番号３８７）を、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のコドン使用パターン（ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの辺りのコンセンサス配列、およびＲＮＡ安定性の一般規則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ、Ｇｅｎｅ、２６５（１−２）：１１−２３頁（２００１年））に従い、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のΔ４デサチュラーゼドメインのコード配列に基づいて設計した。翻訳開始部位の修飾に加え、１６２３ｂｐのコード領域の中の２８２ｂｐを修飾し（１７．４％）、２７０のコドンを最適化した（４９．９％）。ＥｇＤ４Ｓのコドン最適化されたコード領域は長さが１６２３ｂｐであることから、５４０個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号３８８）をコードする。したがって、ＥｇＤ４ＳはＥｇＤＨＡｓｙｎ１の野生型Δ４デサチュラーゼドメイン（すなわち配列番号２２１）よりも長さが短い１個のアミノ酸であり、詳細には配列番号１３のアミノ酸位置２に対応するロイシン残基がＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８８）内で除去された。設計されたＥｇＤ４Ｓ遺伝子（配列番号３８７）はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成され、それをｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローン化し、ｐＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８９）を作成した。
コドン最適化ＥｇＤ４Ｓ遺伝子の機能を解析するため、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４（配列番号３９０）を作成し、２つのキメラＣ２０エロンガーゼ遺伝子およびキメラＥｇＤ４Ｓ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３のリパーゼ４様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ_５０３８２５）に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４（配列番号３９０）は、ＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８７）をＥａＤ４Ｓ（配列番号１９２）の代わりに用いたこと以外では、作成においてプラスミドｐＺＫＬ４−２２０Ｅａ４（配列番号３６２；図５２Ｂ；実施例３４の表２８）の場合と一致した。
一般的方法に記載のように、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で５日間の成長後、ＭＭプレート上で成長させた１４の形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長させてから、これらの株を３０℃で液体ＭＭ３ｍＬに個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、１４全部の形質転換体中で全脂質に対して平均で４．９％のＤＨＡおよび１７．８％のＤＰＡが生成されることが示され、ここでＤＰＡからＤＨＡへの変換効率は約２１．５％であることが判定された（実施例２７に記載のように計算）。したがって、この実験データによると、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４デサチュラーゼ（すなわち配列番号３８７で示されるＥｇＤ４Ｓ）がＤＰＡからＤＨＡへの変換に対して活性を有することが示された。
実施例５３
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来しかつヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成Δ４デサチュラーゼ（ＥａＤ４Ｓ）内の機能ドメインの決定
ＥａＤＨＡｓｙｎ１（図５２Ｃ）において認められる方法と同様の方法において、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のＣ２０エロンガーゼドメインのＣ末端部分は、配列比較に基づいてＥｇＤＨＡｓｙｎ１のΔ４デサチュラーゼドメインのＮ末端部分と重なるように見られる。
ＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８７）内の機能Δ４デサチュラーゼドメインを限定するため、異なるＮ末端切断部位を有する３種のＥｇＤ４Ｓ突然変異体を作成した。ＮｃｏＩ部位を、プライマー対であるＹＬ９３５およびＹＬ９３６（それぞれ配列番号３９１および３９２）、ＹＬ９３７およびＹＬ９３８（それぞれ配列番号３９３および３９４）ならびにＹＬ９３９およびＹＬ９４０（それぞれ配列番号３９５および３９６）を用い、部位特異的突然変異誘発によってｐＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８９；実施例５２）に導入し、それぞれｐＥｇＤ４Ｓ−Ｍ１（配列番号３９７）、ｐＥｇＤ４Ｓ−Ｍ２（配列番号３９８）およびｐＥｇＤ４Ｓ−Ｍ３（配列番号３９９）コンストラクトを作成した。ｐＥｇＤ４Ｓ−Ｍ１、ｐＥｇＤ４Ｓ−Ｍ２およびｐＥｇＤ４Ｓ−Ｍ３由来のＥｇＤ４Ｓの異なる切断部位を有するＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を用い、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−１（配列番号４００）、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−２（配列番号４０１）およびｐＺＫＬ４−ＥｇＤ４−３（配列番号４０２）コンストラクトを作成した。これらの３つのコンストラクトは、ＥｇＤ４Ｓのコード領域がＮ末端領域で切断されたこと以外ではｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４（配列番号３９０；実施例５２）と全く同一であった。詳細には、切断型ＥｇＤ４Ｓ＊ポリペプチドは、ＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８８）の５４０個のアミノ酸長のコード配列ではなく、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−１（すなわち配列番号４０４）内の５１３個のアミノ酸長、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−２（すなわち配列番号４０６）内の４９０個のアミノ酸長およびｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−３（すなわち配列番号４０８）内の４７４個のアミノ酸長であった。これらポリペプチドのＮ末端領域（配列番号３８８のアミノ酸１〜８０に対応）は図５３Ｂ中で整列される。
一般的方法に記載のように、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４（配列番号３９０）、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−１（配列番号４００）、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−２（配列番号４０１）およびｐＺＫＬ４−ＥｇＤ４−３（配列番号４０２）をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３に個別に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で５日間成長後、各コンストラクトに由来するＭＭプレート上で成長させた４つの形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長させてから、これらの株を個別に３０℃で液体ＭＭ３ｍＬに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣの結果を下の表３０に示す。ＤＰＡおよびＤＨＡの組成物は全脂肪酸に対する％として存在する。変換効率（「Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）を式：（［ＤＨＡ］／［ＤＰＡ＋ＤＨＡ］）×１００に従って測定した。各切断型ＥｇＤ４Ｓ＊（すなわち、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−１、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−２およびｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−３のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体内のそれぞれ５１３個のアミノ酸、４９０個のアミノ酸または４７４個のアミノ酸のポリペプチド）のΔ４デサチュラーゼ活性を、「％Δ４活性」と称される列内のＥｇＤ４Ｓ（すなわち、ｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体）の場合と比較した。
Figure 2010523113
これらのデータによると、ＥｇＤ４Ｓ＊のＮ末端の２８個のアミノ酸が可欠であることが示された（すなわち、ＥｇＤ４Ｓの最初から２８個のアミノ酸が切断され、配列番号４０４で示される切断型タンパク質が完全なΔ４デサチュラーゼ活性を保持した場合のｐＺＫＬ４−２２０Ｅｇ４−１を参照のこと）。追加的なアミノ酸がＥｇＤ４Ｓタンパク質の５’部分から切断されることによって配列番号４０６および配列番号４０８がもたらされた場合、低下したΔ４デサチュラーゼ活性をｐＺＫＬ４−２２０ＥｇＤ４−２およびｐＺＫＬ４−２２０ＥｇＤ４−３での形質転換体中で測定した。
実施例５４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のコドン最適化ＥｇＤＨＡｓｙｎ１遺伝子（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓ）の合成および機能解析
プラスミドｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４（図５４Ａ；配列番号４０９）を、コドン最適化ＥｇＤＨＡｓｙｎ１コード領域（すなわち、配列番号４１０および４１１で示されるＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓ）を有するキメラ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３のリパーゼ７遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５４９５１９）に組み込むように設計した。翻訳開始部位の修飾に加え、２３８２ｂｐのコード領域の中の４１７ｂｐを修飾し（１７．５％）、全部で７９４のコドンの中の３９１のコドンを最適化した（４９．２％）。コドン最適化ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓのアミノ酸配列（配列番号４１１）は、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１のアミノ酸配列（配列番号１２）に対して配列が１００％同一である。
ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４を作成するため、ＫｐｎＩ部位をｐＥｇＣ２０ＥＳ（配列番号１８５；図５１Ｂ、実施例３２を参照）に導入し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ９７３およびＹＬ９７４（それぞれ配列番号４１３および４１４）および鋳型としてｐＥｇＣ２０ＥＳを用い、部位特異的突然変異誘発によりｐＥｇＣ２０ＥＳ−Ｋ（配列番号４１２；図５４Ｂ）を作成した。ｐＹＮＴＧＵＳ１−ＣＮＰ（図５４Ｃ；配列番号４１５）のＹＡＴ１プロモーター（米国特許出願公開第２００６／００９４１０２−Ａ１号明細書）を有する７３２ｂｐのＰｍｅＩ／ＮｃｏＩ断片、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓのコドン最適化されたＮ末端部分を有するｐＥｇＣ２０ＥＳ−Ｋの８７３ｂｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ断片およびＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓのコドン最適化されたＣ末端部分を有するｐＥｇＤ４Ｓ（配列番号３８９；実施例５２）の１５１２ｂｐのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ断片を単離し、次いで用いてｐＺＫＬＹ（図５４Ｄ；配列番号４１６）のＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換え、ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４（図５４Ａ）を作成した。したがって、ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４は以下の成分を有した。
Figure 2010523113
一般的方法に記載のように、ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５Ｕ３に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で５日間成長後、ＭＭプレート上で成長させた８つの形質転換体を採取し、新しいＭＭプレート上に再度画線培養した。一旦成長させてから、これらの株を個別に３０℃で液体ＭＭ３ｍＬに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、８つ全部の形質転換体中で全脂質に対して約５．０％のＤＨＡ、１３．５％のＤＰＡおよび２６．５％のＥＰＡが生成されることが示された。これら８つの株内では、ＥＰＡからＤＰＡおよびＤＨＡへの変換効率は約４１％であることが判定され、かつＤＰＡからＤＨＡへの変換効率は約２７％であることが判定された（実施例２７に記載のように計算）。したがって、この実験データによると、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＤＨＡシンターゼ（すなわち配列番号４１０で示されるＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓ）がＣ２０エロンガーゼ活性およびΔ４デサチュラーゼ活性の双方を有することが示された。ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓであれば、基質としてＥＰＡが用いられ、ＤＨＡが生成されうる。
実施例５５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現におけるΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体の作成
本実施例では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内でのΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼの酵素活性を改善するため、一連の６種のΔ９エロンガーゼ／Δ８遺伝子融合体（マルチザイム）を、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー（配列番号１９８；ＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶ）由来の２つの変異リンカー配列（すなわち、配列番号４３８［ＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶ］および配列番号４４５［ＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ］）を用いて作成する。
この研究には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現に適するΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼの同定、ならびに（ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含む）プラスミドｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ、（ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含む）プラスミドｐＺｕＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂ、（ＥｇＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体を含む）プラスミドｐＺＵＦｍＧ９Ａ８、（ＥａＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含む）プラスミドｐＺＵＦｍＡ９Ｇ８、（ＥａＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体を含む）プラスミドｐＺＵＦｍＡ９Ａ８および（Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含む）プラスミドｐＺＵＦｍＲ９Ｇ８の作成が必要であった。すべてのプラスミドは、共通のベクター骨格を共有することから、各々が含む遺伝子融合体によってのみ識別された。
各遺伝子融合体の活性の機能解析を下の実施例５６で試験する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ遺伝子の説明
出願人は、様々なΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼに関する多数の分析を行い、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で発現される場合に最適な基質特異性および／または基質選択性を有する酵素を判定した。これらの分析に基づき、下の表３２に記載の遺伝子および（米国特許第７，１２５，６７２号明細書の方法に基づき）それに由来するコドン最適化遺伝子がヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現に好ましいものとして同定された。次いで、太字で強調されたそれら遺伝子を用い、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体を作成した。
Figure 2010523113
上記の各用途におけるＥｇＤ９ｅＳ、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳおよびＥａＤ９ｅＳのＬＡからＥＤＡへの変換効率を報告する。しかし手短にいうと、各Δ９エロンガーゼが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット；米国特許第７，２０２，３５６号明細書）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）由来のＰｅｘ２０ターミネーター配列の制御下で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４（図４４）内でキメラ遺伝子として発現された場合、以下の基質変換を別々に測定した。ＥｇＤ９ｅＳ（２０．１％）；ＥａＤ９ｅＳ（１３％）；およびＥ３８９Ｄ９ｅＳ（１２％）。すべての合成コドン最適化遺伝子が、対応する野生型遺伝子よりも高い基質変換効率で機能した。
米国特許第７，２５６，０３３号明細書では、ＥＤＡおよびＥｔｒＡをそれぞれＤＧＬＡおよびＥＴＡに脱飽和可能なユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ（「ＥｇＤ８」）、およびＥｇＤ８に由来しヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のためにコドン最適化された合成Δ８デサチュラーゼ（「ＥｇＤ８Ｓ」）が開示されている。ＥｇＤ８およびＥｇＤ８Ｓの有用性に反し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のため、より好ましい実施形態では、本明細書中でＥｇＤ８Ｍ（配列番号３２７および３２８）として同定される合成的に改変された突然変異Δ８デサチュラーゼを用いる。米国特許出願第１１／６３５２５８号明細書で記載のように、「ＥｇＤ８Ｍ」（ここでは「ＥｇＤ８Ｓ−２３」として同定）をＥｇＤ８Ｓ内で複数回にわたる標的化変異を行うことにより作成した。得られた突然変異体のΔ８デサチュラーゼ活性に対する各突然変異の効果をスクリーニングし、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号４２６）のΔ８デサチュラーゼ活性との機能等価性を確認した。この研究の結果、突然変異ＥｇＤ８Ｍ（配列番号３２８）は、配列番号４２６で示されるコドン最適化された合成ＥｇＤ８Ｓ配列に対し、４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、２９３ＬからＭ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡおよび４２２ＬからＱの２４のアミノ酸変異を含む。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））のデフォルトパラメータを用いたＥｇＤ８ＭおよびＥｇＤ８Ｓタンパク質配列のペアワイズアラインメントによると、２つのタンパク質の間で４２２個のアミノ酸長にわたって９４．３％の配列同一性および９７．９％コンセンサスが示された。この突然変異Δ８デサチュラーゼによるＥＤＡからＤＧＬＡへの基質変換の平均は、ＥｇＤ８Ｍがヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４００１（図４４）内、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット；米国特許第７，２０２，３５６号明細書）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）由来のＰｅｘ２０ターミネーター配列の制御下で発現される場合、３７％であることが決定された。
ＥａＤ８Ｓの、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター（米国特許第７，２０２，３５６号明細書）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）由来のＰｅｘ２０ターミネーター配列の制御下、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４００１Ｕ内での発現時（図４４）、基質として内因性ＥＤＡを用いるＤＧＬＡへの変換効率は４１％であった。
ＥｇＤ９ＥＳを含むコンストラクトｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳ−Ｎａの作成
プラスミドｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（配列番号４３１）（米国特許出願公開第２００７−０１１７１９０Ａ１号明細書中で前述）は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ＥＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での選択のためのアンピシリン−耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自己複製配列（ＡＲＳ１８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ１７６０８）、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｕｒａ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）を含む。
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ９８９およびＹＬ９９０（それぞれ配列番号４３３および４３４）および鋳型としてｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳを用い、ＮａｒＩ部位をｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳに導入し、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ−Ｎａ（配列番号４３２）を作成した。導入されたＮａｒＩ部位（すなわちＧＧＣＧＣＣ）はＥｇＤ９ＥＳの翻訳停止コドンの直前に位置することから、ＥｇＤ９ＥＳのコード領域を２つの追加的なアミノ酸（すなわちグリシンおよびアラニン）で伸長した。
ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含むコンストラクトｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕの作成
ＥｇＤ８Ｍ（配列番号３２７）のＮ末端部分を、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ９９１およびＹＬ９９２（それぞれ配列番号４３５および４３６）および鋳型としてｐＫＯ２ＵＦｍ８Ａ（配列番号４３７）を用い、ＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドＹＬ９９１は、その５’末端にＮａｒＩ部位およびＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカーの修飾変異体（すなわち、配列番号１９８で示されるＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶに対する配列番号４３８で示されるＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶ）をコードするＤＮＡ配列を有した。このリンカーは、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー（配列番号１９８）に対し、５’末端に付加グリシンを有した。
ＥｇＤ８Ｍの５’部分を含むＮａｒＩ／Ｂｇｌ ＩＩで消化されたＰＣＲ産物およびＥｇＤ８Ｍの３’部分を含むｐＫＯ２ＵＦｍ８ＡのＢｇｌ ＩＩ／ＮｏｔＩで消化された断片を用い、ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳ−ＮａのＮａｒＩ／ＮｏｔＩ断片を置換し、ｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ（図５５Ａ）を作成したものは、それにより以下の成分を有した。
Figure 2010523113
ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含むコンストラクトｐＺｕＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂの作成
プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１０４３およびＹＬ１０４４（それぞれ配列番号４４３および４４４）および鋳型としてｐＺｕＦｍＧ９Ｇ８ｆｕを用い、ＢａｍＨＩ部位（すなわちＧＧＡＴＣＣ）をｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕに導入し、ｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂ（配列番号４４２）を作成した。ＢａｍＨＩ部位は翻訳開始コドンＡＴＧの直後に位置し、ＥｇＤ８Ｍのリーディングフレーム内に存在し、結果としてメチオニンアミノ酸残基とＥｇＤ８Ｍポリペプチドの残りの部分の間に２個のアミノ酸（すなわちグリシンおよびセリン）が挿入された。この修飾が原因でＥｇＤ９ＥＳとＥｇＤ８Ｍの間のリンカー領域が配列番号４４５で示される配列（すなわちＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ）を有するペプチドとなり、完全長ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４４６および４４７で示される。
ＥｇＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体を含むコンストラクトｐＺＵＦｍＧ９Ａ８の作成
ＥａＤ８Ｓ遺伝子（配列番号４２９）をｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローン化した時にプラスミドｐＥａＤ８Ｓ（配列番号４４８）が作成された。次いで、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１０５９およびＹＬ１０６０（それぞれ配列番号４４９および４５０）および鋳型としてｐＥａＤ８Ｓを用い、ＢａｍＨＩ部位をｐＥａＤ８Ｓに導入し、ｐＥａＤ８Ｓ−Ｂ（配列番号４５１）を作成した。導入されたＢａｍＨＩ部位（すなわちＧＧＡＴＣＣ）はｐＥａＤ８Ｓ−Ｂ内のＥａＤ８Ｓの翻訳開始コドンの直前に位置し、ＥａＤ８Ｓのリーディングフレーム内に存在する。
ＥａＤ８Ｓを含むｐＥａＤ８Ｓ−ＢのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片を用い、ｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂ（配列番号４４２）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片を置換し、ｐＺＵＦｍＧ９Ａ８（配列番号４５２；図５５Ｂ）を作成した（それによりＥｇＤ８Ｍの代わりにＥａＤ８Ｓを導入）。ＥｇＤ９ＥＳとＥａＤ８Ｓの間のリンカー領域は配列番号４４５で示される配列（すなわちＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ）を有するペプチドであった。したがって、プラスミドｐＺＵＦｍＧ９Ａ８は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰｅｘ２０ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）に隣接されたＥｇＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体を有した。完全長ＥｇＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５３および４５４で示される。
ＥａＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含むコンストラクトｐＺＵＦｍＡ９Ｇ８の作成
プラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳ（配列番号４５５）は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰｅｘ２０ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）により隣接されたＥａＤ９ＥＳ遺伝子を有した。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１０４９およびＹＬ１０５０（それぞれ配列番号４５７および４５８）および鋳型としてｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳを用い、ＮａｒＩ部位をプラスミドに導入し、ｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳ−Ｎａ（配列番号４５６）を作成した。導入されたＮａｒＩ部位（すなわちＧＧＣＧＣＣ）はＥａＤ９ＥＳの翻訳停止コドンの直前に位置し、ＥａＤ９ＥＳの同じリーディングフレーム内に存在する。
ＥａＤ９ＥＳを含むｐＺＵＦｍＥａＤ９ＥＳ−Ｎａ（配列番号４５６）のＮｃｏＩ／ＮａｒＩ断片を用い、ｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂ（配列番号４４２）のＮｃｏＩ／ＮａｒＩ断片を置換し、ｐＺＵＦｍＡ９Ｇ８（配列番号４５９）を作成した（それによりＥｇＤ９ＥＳの代わりにＥａＤ９ＥＳを導入）。ＥａＤ９ＥＳとＥｇＤ８Ｍの間のリンカー領域は、配列番号４４５で示される配列（すなわちＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ）を有するペプチドであった。したがって、プラスミドｐＺＵＦｍＡ９Ｇ８は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰｅｘ２０ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）により隣接されたＥａＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を有した。完全長ＥａＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６０および４６１で示される。
ＥａＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体を含むコンストラクトｐＺＵＦｍＡ９Ａ８の作成
ＥａＤ８Ｓを含むｐＥａＤ８Ｓ−Ｂ（配列番号４５１）のＢａｍＨＩＩ／ＮｏｔＩ断片を用い、ｐＺＵＦｍＡ９Ｇ８（配列番号４５９）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片を置換し、ｐＺＵＦｍＡ９Ａ８（配列番号４６２）を作成した（それによりＥｇＤ８Ｍの代わりにＥａＤ８Ｓを導入）。ＥａＤ９ＥＳとＥａＤ８Ｓの間のリンカー領域は、配列番号４４５で示される配列（すなわちＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ）を有するペプチドであった。したがって、プラスミドｐＺＵＦｍＡ９Ａ８は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰｅｘ２０ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）により隣接されたＥａＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体であった。完全長ＥａＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６３および４６４で示される。
Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を含むコンストラクトｐＺＵＦｍＲ９Ｇ８の作成
Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ遺伝子（配列番号３５８）をｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローン化した時にｐＥ３８９Ｓ（配列番号４６５）が作成された。次いで、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ１０５１およびＹＬ１０５２（それぞれ配列番号４６７および４６８）および鋳型としてｐＥ３８９Ｓを用い、ＮａｒＩ部位をｐＥ３８９Ｓに導入し、ｐＥ３８９Ｓ−Ｎａ（配列番号４６６）を作成した。導入されたＮａｒＩ（すなわちＧＧＣＧＣＣ）部位は翻訳開始コドンの直前に位置し、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳの同じリーディングフレーム内に存在する。
Ｅ３８９Ｄ９ｅＳを含むｐＥ３８９Ｓ−ＮａのＮｃｏＩ／ＮａｒＩ断片を用い、ＥｇＤ９ＥＳを含むｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−ＢのＮｃｏＩ／ＮａｒＩ断片を置換し、ｐＺＵＦｍＲ９Ｇ８（配列番号４６９）を作成した（それによりＥｇＤ９ＥＳの代わりにＥ３８９Ｄ９ｅＳを導入）。Ｅ３８９Ｄ９ｅＳとＥｇＤ８Ｍの間のリンカー領域は、配列番号４４５で示される配列（すなわちＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ）を有するペプチドであった。したがって、プラスミドｐＺＵＦｍＲ９Ｇ８は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰｅｘ２０ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）により隣接されたＥ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体を有した。完全長Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７０および４７１で示される。
実施例５６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４内でのΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体の機能解析
一般的方法に記載のように、実施例５５からのプラスミド［すなわち、ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳ（配列番号４３１）、ｐＺＵＦＭＥｇＤ９ＥＳ−Ｎａ（配列番号４３２）、ｐＺＵＦＭＧ９Ｇ８ｆｕ（配列番号４３９）、ｐＺＵＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂ（配列番号４４２）、ｐＺＵＦｍＧ９Ａ８（配列番号４５２）、ｐＺＵＦｍＡ９Ｇ８（配列番号４５９）、ｐＺｕＦｍＡ９Ａ８（配列番号４６２）およびｐＺＵＦｍＲ９Ｇ８（配列番号４６９）］を、個別にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ２２２４に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で２日間成長後、各形質転換反応からの８つの形質転換体を新しいＭＭプレート上に画線培養し、３０℃でさらに２日間インキュベートした。一旦成長してから、これらの株を３０℃で３ｍＬの液体ＭＭに個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、上清を除去し、ＨＧＭ３ｍＬを添加した。これらの株を２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃のインキュベーター内でさらに５日間成長させた。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。
ＧＣ分析によると、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体を有する全部の株内にΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ活性の双方が存在することが示された。結果を下の表３４にまとめる。Δ９エロンガーゼ活性を、ＥＤＡおよびＤＧＬＡにおける重量パーセント（ｗｔ％）の和をＬＡ、ＥＤＡおよびＤＧＬＡにおけるｗｔ％の和で除し、パーセントで表すように１００を掛けることにより計算し、同様に、Δ８デサチュラーゼ活性を、ＤＧＬＡにおけるｗｔ％をＥＤＡおよびＤＧＬＡにおけるｗｔ％の和で除し、パーセントで表すように１００を掛けることにより計算した。
Figure 2010523113
表３４を要約すると、データは、６種全部の融合遺伝子がΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ活性の双方を有することから、融合遺伝子由来の融合タンパク質が２つの独立しかつ分離可能な酵素活性の発現を効果的に可能にすることを示した。より重要なことには、２つの独立した酵素を共にリンカー領域により分離された１つの融合タンパク質として融合することで、ＬＡからＤＧＬＡへのフラックスが増加した。すべての場合において、融合遺伝子は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で単独で発現される場合に各遺伝子のうちの少なくとも１つよりも高い活性を有した。これらのデータから、Δ９エロンガーゼの生成物が融合タンパク質におけるΔ８デサチュラーゼの基質として直接輸送されうることが示唆された。
より詳細には、ＥｇＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体（すなわちｐＺｕＦｍＧ９Ｇ８ｆｕ−Ｂ）およびＥｇＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体（すなわちｐＺｕＦｍＧ９Ａ８）の場合、ＥｇＤ９ＥＳ Δ９エロンガーゼ（２１％の変換）はＥｇＤ９ＥＳが単独で発現される場合（２０％の変換［ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳのデータおよび実施例５５］）と同様の活性を示した。しかしそれに対し、ｐＺｕＦｍＧ９Ｇ８−Ｂを発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内でのＥｇＤ８Ｍ Δ８デサチュラーゼ活性は、ＥｇＤ８Ｍが単独で発現される場合よりも約９７％効率が高かった（７３％対３７％の変換［実施例５５］）。同様に、ｐＺｕＦｍＧ９Ａ８を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内でのＥａＤ８Ｓ Δ８デサチュラーゼ活性は、ＥａＤ８Ｓが単独で発現される場合よりも約６３％効率が高かった（６７％対４１％の変換［実施例５５］）。
ＥａＤ９ＥＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体（すなわちｐＺｕＦｍＡ９Ｇ８）およびＥａＤ９ＥＳ／ＥａＤ８Ｓ遺伝子融合体（すなわちｐＺｕＦｍＡ９Ａ８）の場合、ＥａＤ９ＥＳ Δ９エロンガーゼ活性はそれぞれＥａＤ９ＥＳが単独で発現される場合よりも約１５％および約３８％効率が高かった（それぞれ１５％および１８％の変換対１３％の変換［実施例５５］）。同様に、ｐＺｕＦｍＡ９Ｇ８を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内でのＥｇＤ８Ｍ Δ８デサチュラーゼ活性は、ＥｇＤ８Ｍが単独で発現される場合よりも約４６％効率が高かった（５４％対３７％の変換［実施例５５］）。同様に、ｐＺｕＦｍＡ９Ａ８を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内でのＥａＤ８Ｓ Δ８デサチュラーゼ活性は、ＥａＤ８Ｓが単独で発現される場合よりも約３２％効率が高かった（５８％対４１％の変換［実施例５５］）。
最後にＥ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ遺伝子融合体（すなわちｐＺｕＦｍＲ９Ｇ８）の場合、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ Δ９エロンガーゼ活性は、Ｅ３８９Ｄ９ｅＳが単独で発現される場合よりも約５０％効率が高かった（１８％対１２％の変換［実施例５５］）。同様に、ｐＺｕＦｍＲ９Ｇ８を発現するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内でのＥｇＤ８Ｍ Δ８デサチュラーゼ活性は、ＥｇＤ８Ｍが単独で発現される場合よりも約８９％効率が高かった（７０％対３７％の変換［実施例５５］）。
表３４はまた、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ遺伝子を共に融合させる場合、修飾リンカーＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ（配列番号４４５）がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での配列番号４３８で示されるリンカーよりも好ましいことを示した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での発現のにとって好ましい他のＰＵＦＡデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子（例えば表８〜１９に記載の遺伝子のいずれかを含む）が、上記の場合と同様の方法で共に融合され、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で発現されうることは当業者にとって明らかであろう。発現カセットの作成に適する好ましいプロモーターおよびターミネーター（ここでは発現されたＯＲＦはマルチザイムをコードする）は、
表８〜１９中に記載のものから選択されうる。効率またはフラックスの増加が、各遺伝子のいずれか（または双方）が単独で発現される場合と対照的に融合遺伝子内で認められることになると仮定される。
実施例５７
大豆内での発現のためのΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体の作成
大豆内でのΔ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼの間のマルチザイム融合体を特徴づけるため、一連のΔ９エロンガーゼ／Δ８マルチザイムを作成した。Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼドメインをＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー（配列番号１９８）により分離した。比較として、個別のΔ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ遺伝子を同時発現するコンストラクトも作成した。用いられるΔ９エロンガーゼは、ＥｇＤ９ｅｌｏ（実施例１６；配列番号１１２；本明細書中でＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ９Ｅとも称されるがそれらはすべて同一である）およびＥａＤ９ｅｌｏ１（配列番号２５２；実施例３６；本明細書中でＥａＤ９ＥおよびＥａＤ９ｅとも称されるがそれらはすべて同一である）を含む。用いられるΔ８デサチュラーゼは、ＴｐｏｍＤ８（配列番号１６２；実施例２１）およびユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ８デサチュラーゼ（ＥａＤ８Ｄｅｓ３；配列番号４２７；ＥａＤ８とも称されるがそれらは同一である；米国仮特許出願第６０／９１０８３１号明細書（２００７年４月１０日出願；代理人整理番号ＢＢ−１６１５）中に記載）を含む。
ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ−ＰａｖＤ８融合体の合成について記載の本実施例および実施例２３では、追加的なヌクレオチドをＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー配列の３’末端に付加し、全コンストラクトにおける融合体を作成する場合のクローニングを可能にした。したがって、追加的な４個のアミノ酸をＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカーの末端（配列番号１９８；ＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶ）と用いられるΔ８デサチュラーゼの開始部位の間に含めた（すなわち配列番号４７２；ＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＳＧＲＴ）。
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合体（Ｈｙｂｒｉｄ１−ＨＧＬＡ Ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８とも称される）を含むプラスミドｐＫＲ１１８３（配列番号２６６）について実施例３８に記載した。
本実施例中に記載の他のプラスミドは、ｐＫＲ１０１４（米国特許出願第１１／８７６，１１５号明細書（２００７年１０月２２日出願；代理人整理番号ＢＢ−１５７４）中に記載；個別に発現されたＥｇＤ９ｅおよびＴｐｏｍＤ８を含む）、ｐＫＲ１１５２（個別に発現されたＥｇＤ９ｅおよびＥａＤ８を含む）、ｐＫＲ１１５１（個別に発現されたＥａＤ９ｅおよびＴｐｏｍＤ８を含む）、ｐＫＲ１１５０（個別に発現されたＥａＤ９ｅおよびＥａＤ８を含む）、ｐＫＲ１１８４（ＥａＤ９ｅ／ＥａＤ８遺伝子融合体を含む）、ｐＫＲ１１９９（ＥｇＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８遺伝子融合体を含む）、およびｐＫＲ１２００（ＥｇＤ９ｅ／ＥａＤ８遺伝子融合体を含む）を含む。生成されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列における配列番号とともに作成されたコンストラクトの概要および試験された各遺伝子を表３５に示す。
各遺伝子融合体の活性の機能解析については下の実施例６０で試験する。
Figure 2010523113
ｐＫＲ１０１４の作成
ＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレット（２００４年８月２６日に公開）中に前述のベクターｐＫＲ１２３ｒは、Ｋｕｎｉｔｚ大豆トリプシンインヒビター（ＫＴｉ３）プロモーター（Ｊｏｆｕｋｕら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１０７９−１０９３頁（１９８９年））およびＫＴｉ３’終結領域により隣接されたＮｏｔＩ部位を有し、その単離については米国特許第６，３７２，９６５号明細書（ＫＴｉ３／ＮｏｔＩ／ＫＴｉ３’カセット）中に記載されている。ＴｐｏｍＤ８（配列番号１６２；実施例２１）をＮｏｔＩでの消化によりｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５；実施例２１）から放出させ、ｐＫＲ１２３ｒのＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１００７（配列番号４７３）を作成した。
米国特許出願公開第２００７−０１１８９２９−Ａ１号明細書（２００７年５月２４日に公開）中で前述のベクターｐＫＲ９１２は、大豆などの植物内での選択のために、３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２頁（１９８５年））およびＮＯＳ３’転写ターミネーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７０頁（１９８２年））により隣接されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（３５Ｓ／ｈｐｔ／ＮＯＳ３’カセット）を有する。ベクターｐＫＲ９１２はまた、β−コングリシニンのα’サブユニットにおけるプロモーター（Ｂｅａｃｈｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：３０４７−３０５３頁（１９８５年））およびファゼリオン遺伝子の３’転写終結領域（Ｄｏｙｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８頁（１９８６年））により隣接されたＥｇＤ９ｅ（配列番号１１２）を有することにより、大豆の種子内でのＥｇＤ９ｅの強力な組織特異的発現を可能にする。
プラスミドｐＫＲ１００７（配列番号４７３）をＰｓｔＩで消化し、テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）Δ８デサチュラーゼを有する断片をｐＫＲ９１２のＳｂｆＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１０１４（配列番号４７４）を得た。この方法で、テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）Δ８デサチュラーゼを、強力かつ種子特異的なプロモーターの補助下でユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼと同時発現した。ｐＫＲ１０１４の略図を図５６に示す。図５６では、ＴｐｏｍＤ８はテトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）１４９１ Δ８デサチュラーゼと称され、ＥｇＤ９ｅはｅｕｇ ｅｌ１と称される。
ｐＫＲ１１５１の作成
ＮｏｔＩおよびＮｃｏＩ制限部位をコード配列の５’末端にかつＮｏｔＩ部位をコード配列の３’末端に導入するため、ＥａＤ８（配列番号４２７）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーＥａＤ８−５（配列番号４７５）およびＥａＤ８−３（配列番号４７６）を用いて増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＬＦ１２０−３（配列番号４７７）を作成した。
ベクターｐＬＦ１２０−３（配列番号４７７）をＮｏｔＩで消化し、ＥａＤ８を有する断片をｐＫＲ４５７（配列番号１２２；実施例１６）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１３８（配列番号４７８）を作成した。
ベクターｐＫＲ１１３８（配列番号４７８）をＢｓｉＷＩで消化し、ＥａＤ８を有する断片をｐＫＲ９１２のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１５２（配列番号４７９）を得た。ｐＫＲ１１５２の略図を図５７に示す。図５７では、ＥａＤ８はＥａＤ８Ｄｅｓ３と称され、ＥｇＤ９ｅはｅｕｇ ｅｌ１と称される。
ｐＫＲ１１５２の作成
ＮｏｔＩおよびＮｃｏＩ制限部位をコード配列の５’末端にかつＮｏｔＩ部位をコード配列の３’末端に導入するため、ＥａＤ９ｅを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドプライマーｏＥＡｄ９ｅｌ１−１（配列番号２９８；実施例４４）およびｏＥＡｄ９ｅｌ１−２（配列番号４８０）を用い、ｐＬＦ１２１−１（配列番号２５０；実施例３６）からＰＣＲ増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１１３７（配列番号４８１）を作成した。
ＥａＤ９ｅをＮｏｔＩでの消化によりｐＫＲ１１３７（配列番号４８１）から放出させ、ｐＫＲ７２（配列番号１０５；実施例１５）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１４０（配列番号４８２）を作成した。
ＴｐｏｍＤ８をＮｏｔＩでの消化によりｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５；実施例２１）から放出させ、プラスミドｐＫＲ４５７（配列番号１２２；実施例１６）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１４５（配列番号４８３）を作成した。
ベクターｐＫＲ１１４５（配列番号４８３）をＢｓｉＷＩで消化し、ＴｐｏｍＤ８を有する断片をｐＫＲ１１４０（配列番号４８２）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１５１（配列番号４８４）を得た。ｐＫＲ１１５１の略図を図５８に示す。図５８では、ＴｐｏｍＤ８はテトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）１４９１ Δ８デサチュラーゼと称され、ＥａＤ９ｅはＥＡｄ９ｅｌｏｎｇと称される。
ｐＫＲ１１５０の作成
ベクターｐＫＲ１１３８（配列番号４７８）をＢｓｉＷＩで消化し、ＥａＤ８を有する断片をｐＫＲ１１４０（配列番号４８２）のＢｓｉＷＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１１５０（配列番号４８５）を得た。ｐＫＲ１１５０の略図を図５９に示す。図５９では、ＥａＤ８はＥａＤ８Ｄｅｓ３と称され、ＥａＤ９ｅはＥＡｄ９ｅｌｏｎｇと称される。
ｐＫＲ１１９９の作成
ＥｇＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するＫＳ３７３（配列番号１７９；実施例２３）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を、β−コングリシニンのα’サブユニットにおけるプロモーターを有するｐＫＲ１１７７（配列番号２６４；実施例３８）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１９０（配列番号４８６）を作成した。
ＴｐｏｍＤ８を有するｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５；実施例２１）由来のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１１９０（配列番号４８６）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１９５（配列番号４８７）を作成した。
ＥｇＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８融合遺伝子を有するｐＫＲ１１９５（配列番号４８７）のＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレット中に前述のｐＫＲ３２５のＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１９９（配列番号４８８）を作成した。ｐＫＲ１１９９の略図を図６０に示す。図６０では、ＥｇＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８はＥＧｄ９ｅｌｏｎｇ−ＴＰＯＭｄ８ＤＳと称される。
ｐＫＲ１２００の作成
ＥａＤ８を有するｐＬＦ１２０−３（配列番号４７７）由来のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１１９０（配列番号４８６）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１９６（配列番号４８９）を作成した。
ＥｇＤ９ｅ／ＥａＤ８融合遺伝子を有するｐＫＲ１１９６（配列番号４８９）のＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットに前述のｐＫＲ３２５のＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片にクローン化し、ｐＫＲ１２００（配列番号４９０）を作成した。ｐＫＲ１２００の略図を図６１に示す。図６１では、ＥｇＤ９ｅ／ＥａＤ８はＥＧｄ９ＥＬＯＮＧ−ＥＡｄ８ＤＳと称される。
ｐＫＲ１１８４の作成
ＥａＤ８を有するｐＬＦ１２０−３（配列番号４７７）由来のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１１７９（配列番号２６５）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１１８４（配列番号４９１）を作成した。ｐＫＲ１１８４の略図を図６２に示す。図６２では、ＥａＤ９ｅ／ＥａＤ８はＥＡｄ９ＥＬＯＮＧ−ＥＡｄ８ＤＳと称される。
実施例５８
テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ−ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ融合遺伝子（ＴｐｏｍＤ８−ＥａＤ９Ｅｌｏ１融合体）を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１３２１の作成
本実施例では、テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８；配列番号１６２；実施例２１）とユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（ＥａＤ９ｅ；配列番号２５２、実施例３６）の間でのインフレーム融合遺伝子の作成について記載する。各ドメインは、実施例５７で記載のように、ＥｇＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカーの末端とＥａＤ９ｅの開始部位の間に含められる追加的な４個のアミノ酸を有するＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカー（すなわち配列番号４７２；ＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＳＧＲＴ）により分離される。
プラスミドｐＫＲ１３０１（配列番号３０７；実施例４４）をＥｃｏＲＩで消化し、ＴｐｏｍＤ８−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（ＴｐｏｍＤ８＋Ｌ１ＴＲ１と称される）の３’末端を有するＤＮＡ断片を再ライゲートし、ｐＫＲ１３０３（配列番号４９７）を形成した。
ＥａＤ９ｅを有するｐＫＲ１１３７（配列番号４８１；実施例５７）のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ１３０３（配列番号４９７）のＥａｇＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３０８（配列番号４９８）を作成した。この方法で、ＥａＤ９ｅをＴｐｏｍＤ８の３’末端に融合した。
Ｇｙ１／Ｐａｖｅｌｏ／ｌｅｇＡ２カセットを、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩでの消化によりプラスミドｐＫＲ３３６（ＰＣＴ公開の国際公開第０４／０７１４６７号パンフレット中に記載；その内容は参照により本明細書中に援用される）から放出させ、ｐＫＲ２６８（ＰＣＴ公開の国際公開第０４／０７１４６７号パンフレット中に記載）のＰｓｔＩ／ＢａｍＨｉ部位にクローン化し、ｐＫＲ３９３（配列番号４９９）を作成した。Ｐａｖｅｌｏ遺伝子をＮｏｔＩでの消化によりｐＫＲ３９３（配列番号４９９）から放出させ、ベクターを再ライゲートし、ｐＫＲ４０７（配列番号５００）を形成した。
ＴｐｏｍＤ８をＮｏｔＩでの消化によりｐＬＦ１１４−１０（配列番号１６５；実施例２１）を放出させ、プラスミドｐＫＲ４０７（配列番号５００）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１０１８（配列番号５０１）を作成した。
プラスミドｐＫＲ１０１８（配列番号５０１）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、Ｔｐｏｍｄ８の５’末端を有する断片をｐＫＲ１３０８（配列番号４９８）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３１２（配列番号５０２）を作成した。この方法で、ＴｐｏｍＤ８配列を修復し、ＴｐｏｍＤ８／ＥａＤ９ｅ融合体を形成した。
ＴｐｏｍＤ８／ＥａＤ９ｅ融合体を有するｐＫＲ１３１２（配列番号５０２）のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ７２（配列番号１０５；実施例２３）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３２１（配列番号５０３）を作成した。ｐＫＲ１３２１の略図を図６３に示す。図６３では、ＴｐｏｍＤ８／ＥａＤ９ｅはＴＰｄ８ｄＳ−ＥＡｄ９ｅｌ融合体と称される。
実施例５９
ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカーを用いる、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ−テトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ融合遺伝子を発現するための大豆発現ベクターｐＫＲ１３２６の作成
本実施例では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）Δ９エロンガーゼ（ＥａＤ９ｅ；配列番号２５２、実施例３６）とテトルエトレプチア・ポムケテンシス（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ ｐｏｍｑｕｅｔｅｎｓｉｓ）ＣＣＭＰ１４９１ Δ８デサチュラーゼ（ＴｐｏｍＤ８；配列番号１６２；実施例２１）の間でのインフレーム融合遺伝子の作成について記載する。各ドメインはＥａＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー（配列番号２３５）により分離されるが、それとともにＥａＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカー（ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ）の末端とＥａＤ９ｅの開始部位の間に追加的な３個のアミノ酸を含めた（すなわち配列番号５０４；ＰＧＧＰＧＫＰＳＥＩＡＳＬＰＰＰＩＲＰＶＧＮＰＰＡＡＹＹＤＡＬＡＴＧＲＴ）。実施例５７の記載と同様にクローン化を行った。
ＥａＤ９ｅとＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの間の初期のインフレーム融合体（ＥａＤ９ｅｌｏ−ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ）をＰＣＲ増幅により作成し、５’末端でＮｏｔＩおよびＮｃｏＩ部位、３’末端でＮｏｔＩ部位により隣接させた。ＥａＤ９ｅ（配列番号２５２）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号Ｆ５５３Ｓ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用い、製造業者のプロトコルに従い、オリゴヌクレオチドｏＥＡｄ９ｅｌ１−１（配列番号２９８）およびＥａＬｉｎｋ１（配列番号５０５）でｐＬＦ１２１−１（配列番号２５０）から増幅した。ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋ（配列番号２３４）を、同様の方法で、オリゴヌクレオチドＥａＬｉｎｋ２（配列番号５０６）およびＥａＬｉｎｋ３（配列番号５０７）でｐＬＦ１１７−１（配列番号８７；実施例１３）から増幅した。２つの得られたＰＣＲ産物を結合させ、ｏＥＡｄ９ｅｌ１−１（配列番号２９８）およびＥａＬｉｎｋ３（配列番号５０７）を用いて再増幅し、ＥａＤ９ｅ−ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを形成した。ＥａＤ９ｅ−ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋの配列は配列番号５０８で示される。ＥａＤ９ｅ−ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）クローニングベクターにクローン化し、ｐＫＲ１３０５（配列番号５０９）を作成した。
ＥａＤ９ｅ−ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＫＲ１３０５（配列番号５０９）のＥａｇＩ ＤＮＡ断片をｐＫＲ１３０４（配列番号３１０；実施例４４）のＮｏｔＩ部位にクローン化し、ｐＫＲ１３１７（配列番号５１０）を作成した。この方法で、ＴｐｏｍＤ８の５’末端をＥａＤ９ｅ−ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋに融合した。
ＴｐｏｍＤ８の３’末端を有するｐＫＲ１１２７（配列番号１６８；実施例２２）のＥｃｏＲＩ／Ａｓｐ７１８断片を、ＥａＤ９ｅ−ＥａＤＨＡｓｙｎ１Ｌｉｎｋを有するｐＫＲ１３１７（配列番号５１０）のＥｃｏＲＩ／Ａｓｐ７１８断片にクローン化し、ｐＫＲ１３２０（配列番号５１１）を作成した。
融合体を有するｐＫＲ１３２０（配列番号５１１）由来のＮｏｔＩ断片をｐＫＲ７２（配列番号１０５；実施例１５）のＮｏｔＩ断片にクローン化し、ｐＫＲ１３２６（配列番号５１２）を作成した。ｐＫＲ１３２６の略図を図６４に示す。図６４では、ＥａＤＨＡｓｙｎ１プロリンリッチリンカーを有するＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８はＥＡｄ９ｅｌ−ＴＰＯＭｄ８ｄｓ Ｌ２融合体と称される。
実施例６０
大豆内のΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体の機能解析
本実施例では、ｐＫＲ１０１４（配列番号４７４）、ｐＫＲ１１５２（配列番号４７９）、ｐＫＲ１１５１（配列番号４８４）、ｐＫＲ１１５０（配列番号４８５）、ｐＫＲ１１９９（配列番号４８８）、ｐＫＲ１２００（配列番号４９０）、およびｐＫＲ１１８４（配列番号４９１）の大豆不定胚における形質転換および発現について記載し、それらの合成については実施例５７で先に記載した。ｐＫＲ１１８３（配列番号２６６）およびＫＳ３７３（配列番号１７９）の各機能解析については実施例４６および３１で先に記載した。
実施例２５で記載され、また２００７年１１月２９日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中で前述のように、大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）を上記の各ベクターで形質転換し、胚を大豆の組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２４：３９３頁（２００５年））内で成熟させた。
ＳＨａＭ液体培地内での成熟後、形質転換された大豆胚のサブセット（すなわち、１事象当たり５〜６個の胚）を採取し、本明細書中に記載のように分析した。
この方法で、ｐＫＲ１０１４（配列番号４７４）、ｐＫＲ１１５２（配列番号４７９）、ｐＫＲ１１５１（配列番号４８４）、ｐＫＲ１１５０（配列番号４８５）、ｐＫＲ１１９９（配列番号４８８）、ｐＫＲ１２００（配列番号４９０）、またはｐＫＲ１１８４（配列番号４９１）で形質転換した約３０の事象を分析した。最高の平均ＤＧＬＡ含量（分析された５個の胚の平均）を有する５つの事象を、それぞれ図６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１に示す。図６５〜７１では、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。表３６では、ベクター、用いられる遺伝子、実験番号（ＭＳＥ＃）、および対応する図をまとめる。
図６５〜７１では、伸長活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。
図６５〜７１では、ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示される。これは全％脱飽和とも称される。
Figure 2010523113
個別に発現されたΔ９エロンガーゼとΔ８デサチュラーゼに対し、それに対応するΔ９エロンガーゼ−Δ８デサチュラーゼ融合体と比較したものを図７２に示す。図７２では、各データポイントは分析された全事象での５〜６個の胚における（全脂肪酸の％としての）平均％ＤＧＬＡまたは％ＥＤＡを示し、平均％ＤＧＬＡを平均％ＥＤＡに対してプロットする。図７２Ａでは、ＥｇＴｐｏｍはＴｐｏｍＤ８（ｐＫＲ１０１４）と同時発現したＥｇＤ９ｅを示し、ＥｇＴｐｏｍｆｕｓはＥｇＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８融合体（ｐＫＲ１１９９）を示す。図７２Ｂでは、ＥｇＥａはＥａＤ８（ｐＫＲ１１５２）と同時発現したＥｇＤ９ｅを示し、ＥｇＥａｆｕｓはＥｇＤ９ｅ／ＥａＤ８融合体（ｐＫＲ１２００）を示す。図７２Ｃでは、ＥａＴｐｏｍはＴｐｏｍＤ８（ｐＫＲ１１５１）と同時発現したＥａＤ９ｅを示し、ＥａＴｐｏｍｆｕｓはＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８融合体（ｐＫＲ１１８３）を示す。図７２Ｄでは、ＥａＥａはＥａＤ８（ｐＫＲ１１５０）と同時発現したＥａＤ９ｅを示し、ＥａＥａｆｕｓはＥａＤ９ｅ／ＥａＤ８融合体（ｐＫＲ１２００）を示す。
実施例６１
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ／Δ５デサチュラーゼ遺伝子融合体の機能解析
本実施例では、ＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＴｐｏｍＤ８−ＥａＤ５Ｄｅｓ１三重融合体（ＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８／ＥａＤ５とも称される）を含むｐＫＲ１３２２（配列番号３１４；実施例５０）の大豆不定胚内での形質転換および発現について記載する。各ドメインは、追加的な４個のアミノ酸を有するＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカー（すなわち配列番号４７２；ＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＳＧＲＴ）により分離される。
実施例２５で記載され、また２００７年１１月２９日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中で前述のように、大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１３２２で形質転換し、胚を大豆の組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２４：３９３頁（２００５年））内で成熟させた。
ＳＨａＭ液体培地内での成熟後、形質転換された大豆胚のサブセット（すなわち１事象当たり５個の胚）を採取し、本明細書中に記載のように分析した。
この方法で、ｐＫＲ１３２２で形質転換した約３０の事象（実験ＭＳＥ２２７４）を分析し、最高の平均ＡＲＡおよびＥＰＡ含量（分析された５個の胚の平均）を有する５つの事象を図７３に示す。図７３では、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（５，９）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＳＣＩ、ＤＧＬＡ、ＪＵＮ（ＪＵＰとも称される）、ＥＴＡ、ＡＲＡ、およびＥＰＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。
図７３では、伸長活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（％Ｅｌｏ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］）×１００として決定される。
図７３では、ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセントΔ８脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］）×１００として決定される「％ Ｄ８」で示される。これは全％Δ８脱飽和とも称される。
図７３では、ＤＧＬＡおよびＥＴＡにおける総パーセントΔ５脱飽和は、（［ＥＰＡ＋ＡＲＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＰＡ＋ＡＲＡ］）×１００として決定される「％ Ｄ５」で示される。これは全％Δ５脱飽和とも称される。
図７３を要約すると、３つ全部のドメインは機能的である。この融合体であれば、ＥＰＡシンターゼまたはＡＲＡシンターゼのいずれかとして称されうる。
実施例６２
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼおよびΔ８デサチュラーゼ／Δ９エロンガーゼ遺伝子融合体の機能解析
本実施例では、追加的な３個のアミノ酸を有するＥａＤＨＡｓｙｎ１リンカー（すなわち配列番号５０４；ＰＧＧＰＧＫＰＳＥＩＡＳＬＰＰＰＩＲＰＶＧＮＰＰＡＡＹＹＤＡＬＡＴＧＲＴ）により分離されたＥａＤ９Ｅｌｏ１−ＴｐｏｍＤ８融合体（ＥａＤ９ｅ／ＴｐｏｍＤ８とも称される）を含むｐＫＲ１３２６（配列番号５１２）またはＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカーにより分離されたＴｐｏｍＤ８／ＥａＤ９ｅ融合体を含むｐＫＲ１３２１（配列番号５０３；実施例５８）のいずれかの大豆不定胚内での形質転換および発現について記載する。
実施例２５で記載され、また２００７年１１月２９日に公開されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６８７７号パンフレット（その内容は参照により本明細書中に援用される）中で前述のように、大豆胚形成懸濁培養物（ｃｖ．Ｊａｃｋ）をｐＫＲ１３２６またはｐＫＲ１３２１で形質転換し、胚を大豆の組織分化および成熟液体培地（ＳＨａＭ液体培地；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２４：３９３頁（２００５年））内で成熟させた。
ＳＨａＭ液体培地内での成熟後、形質転換された大豆胚のサブセット（すなわち１事象当たり５個の胚）を採取し、本明細書中に記載のように分析した。
この方法で、ｐＫＲ１３２６で形質転換した約３０の事象（実験ＭＳＥ２２７５）を分析し、最高の平均ＤＧＬＡおよびＥＴＡ含量（分析された５個の胚の平均）を有する５つの事象を図７４に示す。図７４では、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸塩）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＥＲＡ、ＤＧＬＡ、およびＥＴＡとして同定される。脂肪酸組成は全脂肪酸に対する重量パーセント（ｗｔ．％）で表される。
図７４では、伸長活性は、式：（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００に従って計算されるＣ１８脂肪酸の％Δ９伸長（Ｃ１８ ％ Δ９ ｅｌｏｎｇ）で表される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡにおける総パーセント伸長は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ＋ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される。
図７４では、ＥＤＡおよびＥＲＡにおける総パーセント脱飽和は、（［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ］／［ＤＧＬＡ＋ＥＴＡ＋ＥＤＡ＋ＥＲＡ］）×１００として決定される「Ｃ２０ ％ Δ８ ｄｅｓａｔ」で示される。これは全％脱飽和とも称される。
図７４を要約すると、ＥａＤＨＡｓｙｎ１リンカーはＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカーと同様に機能する。ＴｐｏｍＤ８がＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカーを用いてＥａＤ９ｅに融合される場合、ｐＫＲ１３２１で形質転換した事象のいずれにおいても活性が全く検出されなかった。

Claims (65)

  1. 少なくとも２つの独立しかつ分離可能な酵素活性を有する単一のポリペプチドを含むマルチザイム。
  2. 酵素活性が、脂肪酸エロンガーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡシンターゼ、およびチオエステラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のマルチザイム。
  3. 酵素活性が、少なくとも１つの脂肪酸デサチュラーゼに結合された少なくとも１つの脂肪酸エロンガーゼを含む、請求項１に記載のマルチザイム。
  4. 脂肪酸デサチュラーゼが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、またはΔ１７デサチュラーゼからなる群から選択される、請求項２または３に記載のマルチザイム。
  5. 脂肪酸エロンガーゼが、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、またはＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択される、請求項２または３に記載のマルチザイム。
  6. 第１の酵素活性が第２の酵素活性に連結され、かつ連結がポリペプチド結合、配列番号１９８（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号２００（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２リンカー）および配列番号２３５（ＥａＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号４３８、配列番号４７２、配列番号４４５、ならびに配列番号５０４からなる群から選択される、請求項１、２または３に記載のマルチザイム。
  7. （ａ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｂ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｃ）ＤＨＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで前記相補体および前記ヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
    を含む、ＤＨＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
  8. ヌクレオチド配列が、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  10. （ａ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２０２（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０４（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２３１（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２３２（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、または配列番号２３３（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｂ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０６（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２７（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２８（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２９（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、または配列番号２３０（ＥａＤＨＡｓｙｎ４ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｃ）Ｃ２０エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０６（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２７（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２８（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２９（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）または配列番号２３０（ＥａＤＨＡｓｙｎ４ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで前記相補体および前記ヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
    を含む、Ｃ２０エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
  11. （ａ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１９３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４０４、配列番号４０６または配列番号４０８で示されるアミノ酸配列と比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｂ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１９２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５；配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示されるヌクレオチド配列と比較される場合、ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメントに基づいて少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｃ）Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号１１、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号１９２、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；あるいは
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、ここで前記相補体および前記ヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
    を含む、Δ４デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
  12. 配列番号１１、配列番号２０５、配列番号２１、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、または配列番号４１０のいずれかで示される配列を含む、ＤＨＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
  13. 配列番号１８３、配列番号１８８、配列番号２０１（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０６（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１＊Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２０３（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２７（ＥａＤＨＡｓｙｎ１ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２８（ＥａＤＨＡｓｙｎ２ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、配列番号２２９（ＥａＤＨＡｓｙｎ３ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）、または配列番号２３０（ＥａＤＨＡｓｙｎ４ Ｃ２０エロンガーゼドメイン）のいずれかで示される配列を含む、Ｃ２０エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
  14. 配列番号１９２、配列番号２１４、配列番号２２０、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号４０３、配列番号４０５、または配列番号４０７で示される配列を含む、Δ４デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
  15. 少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された請求項７〜１４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えコンストラクト。
  16. 宿主細胞であって、そのゲノム内に請求項１５に記載の組換えコンストラクトを含む、宿主細胞。
  17. 細胞が植物および酵母からなる群から選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. 請求項１５に記載の組換えコンストラクトを含む、形質転換ヤロウィア属。
  19. 細胞を形質転換するための方法であって、細胞を請求項１５に記載の組換えコンストラクトで形質転換するステップと、前記組換えコンストラクトで形質転換された細胞を選択するステップと、を含む、方法。
  20. 形質転換植物を生成するための方法であって、植物細胞を請求項７〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれかで形質転換するステップと、植物を前記形質転換植物細胞から再生するステップと、を含む、方法。
  21. 植物が大豆植物である、請求項２０に記載の方法。
  22. 酵母を生成するための方法であって、酵母細胞を請求項７〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれかで形質転換するステップと、酵母を前記形質転換酵母細胞から成長させるステップと、を含む、方法。
  23. 植物であって、そのゲノム内に請求項１５に記載の組換えコンストラクトを含む、植物。
  24. 油料種子植物である、請求項２３に記載の植物。
  25. 大豆である、請求項２３または２４に記載の植物。
  26. 請求項２３または２４に記載の植物から得られる種子。
  27. 請求項２５に記載の植物から得られる種子。
  28. 請求項２６に記載の種子から得られるオイル。
  29. 請求項２７に記載の種子から得られるオイル。
  30. 請求項２６に記載のオイルを含有する食料または飼料。
  31. 請求項２７に記載のオイルを含有する食料または飼料。
  32. 請求項２６に記載のオイルを含有する飲料。
  33. 請求項２７に記載のオイルを含有する飲料。
  34. 少なくとも１４７個のコドンがヤロウィア属内での発現のためにコドン最適化される、配列番号１８３で示されるＣ２０エロンガーゼをコードする単離核酸分子。
  35. 少なくとも１３４個のコドンがヤロウィア属内での発現のためにコドン最適化される、配列番号１８８で示されるＣ２０エロンガーゼをコードする単離核酸分子。
  36. 少なくとも２８５個のコドンがデサチュラーゼに結合されたエロンガーゼを含むヤロウィア属マルチザイムにおける発現のためにコドン最適化される、配列番号１９２で示されるΔ４デサチュラーゼ酵素をコードする単離核酸分子。
  37. マルチザイムを製造するための方法であって、
    （ａ）第１のポリペプチドを少なくとも第２のポリペプチドと連結させるステップであって、ここで各ポリペプチドは独立しかつ分離可能な酵素活性を有するステップと；
    （ｂ）ステップ（ａ）の生成物の独立しかつ分離可能な酵素活性について評価するステップと、
    を含む、方法。
  38. 酵素活性が、脂肪酸エロンガーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡシンターゼ、およびチオエステラーゼからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 酵素活性が、少なくとも１つの脂肪酸デサチュラーゼに連結された少なくとも１つの脂肪酸エロンガーゼを含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 脂肪酸デサチュラーゼが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、またはΔ１７デサチュラーゼからなる群から選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 脂肪酸エロンガーゼが、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、またはＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
  42. 連結が、ポリペプチド結合、配列番号１９８（ＥｇＤＨＡｓｙｎ１リンカーアミノ酸配列）、配列番号２００（ＥｇＤＨＡｓｙｎ２リンカー）、配列番号２３５（ＥａＤＨＡｓｙｎ１リンカー）、配列番号４３５、配列番号４３８、配列番号４７２、および配列番号５０４からなる群から選択される、請求項３７、３８または３９に記載の方法。
  43. 油料種子植物の脂肪酸特性を改変するための方法であって、
    （ａ）油料種子植物細胞を請求項１５に記載の組換えコンストラクトで形質転換するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の前記形質転換された油料種子植物細胞から植物を再生するステップと、
    を含み、ここで前記植物は改変された脂肪酸特性を有する、方法。
  44. 油料種子植物が大豆である、請求項４３に記載の方法。
  45. 請求項２３に記載の植物の子孫。
  46. 第１の酵素活性がΔ９エロンガーゼであり、かつ第２の酵素活性がΔ８デサチュラーゼである、請求項６に記載のマルチザイムを含む組換え微生物宿主細胞。
  47. 第１の酵素活性がＣ２０エロンガーゼであり、かつ第２の酵素活性がΔ４デサチュラーゼである、請求項６に記載のマルチザイムを含む組換え微生物宿主細胞。
  48. 宿主細胞が油性酵母である、請求項４６または４７に記載の組換え宿主細胞。
  49. リノール酸をジホモγ−リノレン酸に変換するための方法であって、
    ａ）以下：
    ｉ）１）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
    ２）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
    ３）前記Δ９エロンガーゼと前記Δ８デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
    を含むＤＧＬＡシンターゼと、
    ｉｉ）リノール酸の供給源と、
    を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ）（ａ）の宿主細胞をジホモγ−リノレン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
    を含む、方法。
  50. α−リノレン酸をエイコサトリエン酸に変換するための方法であって、
    ａ）以下：
    ｉ）１）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
    ２）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
    ３）前記Δ９エロンガーゼと前記Δ８デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
    を含むＤＧＬＡシンターゼと、
    ｉｉ）α−リノレン酸の供給源と、
    を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ）（ａ）の宿主細胞をエイコサトリエン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
    を含む、方法。
  51. エイコサペンタエン酸をドコサヘキサエン酸に変換するための方法であって、
    ａ）以下：
    ｉ）１）Ｃ２０エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
    ２）Δ４デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
    ３）前記Ｃ２０エロンガーゼと前記Δ４デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
    を含むＤＨＡシンターゼと、
    ｉｉ）エイコサペンタエン酸の供給源と、
    を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ）（ａ）の宿主細胞をドコサヘキサエン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
    を含む、方法。
  52. アラキドン酸をドコサペンタエン酸に変換するための方法であって、
    ａ）以下：
    ｉ）１）Ｃ２０エロンガーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；
    ２）Δ４デサチュラーゼをコードする少なくとも１つのポリペプチド；および
    ３）前記Ｃ２０エロンガーゼと前記Δ４デサチュラーゼの間に挿入されるポリペプチドリンカー；
    を含むＤＨＡシンターゼと、
    ｉｉ）アラキドン酸の供給源と、
    を含む組換え微生物宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ）（ａ）の宿主細胞をドコサペンタエン酸が生成される条件下で成長させるステップと、
    を含む、方法。
  53. ＤＧＬＡシンターゼが、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４５４、配列番号４６１、配列番号４６４、配列番号４７１、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、および配列番号５１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４９または５０に記載の方法。
  54. ＤＨＡシンターゼが、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号４１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
  55. ポリペプチドリンカーが、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２３５、配列番号４３８、配列番号４４５、配列番号４７２、および配列番号５０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  56. Δ９エロンガーゼが、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号３１９、配列番号３５９、配列番号４２０、配列番号４２２、および配列番号５１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４９または５０に記載の方法。
  57. Δ８デサチュラーゼが、配列番号３２８、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、および配列番号５１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４９または５０に記載の方法。
  58. Ｃ２０エロンガーゼが、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号１８４、および配列番号１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
  59. Δ４デサチュラーゼが、配列番号１２、配列番号２２、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号２１５、配列番号２２１、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、および配列番号１９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５１または５２に記載の方法。
  60. 改善されたΔ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドを同定するための方法であって、
    ａ）ベースラインのΔ４デサチュラーゼ活性を有するユーグレナ・アナベナから単離される野生型Δ４デサチュラーゼポリペプチドを提供するステップと、
    ｂ）（ａ）の野生型ポリペプチドから約１〜約２００個のアミノ酸を切断し、前記ベースラインのΔ４デサチュラーゼ活性よりも増大したΔ４デサチュラーゼ活性を有する切断型突然変異ポリペプチドを製造するステップと、
    を含む、方法。
  61. 野生型ポリペプチドがポリペプチドのＮ末端部分で切断される、請求項６０に記載の方法。
  62. 野生型ポリペプチドから約１〜約７０個のアミノ酸が切断される、請求項６０に記載の方法。
  63. 多価不飽和脂肪酸を生成し、かつ以下：
    １）Δ９デサチュラーゼ、
    ２）Δ１２デサチュラーゼ、
    ３）Δ９エロンガーゼ、
    ４）Δ８デサチュラーゼ、
    ５）Δ５デサチュラーゼ、
    ６）Δ１７デサチュラーゼ、
    ７）Ｃ２０／２２エロンガーゼ、および
    ８）Δ４デサチュラーゼ；
    の連続経路における酵素をコードするポリペプチドを発現する微生物宿主細胞であって、ここで前記ポリペプチドは少なくとも１つのマルチザイムを含み、前記融合体は少なくとも１つの連続的な酵素対の間での融合体を含む、微生物宿主細胞。
  64. 多価不飽和脂肪酸が、ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸からなる群から選択される、請求項６３に記載の微生物宿主。
  65. （ａ）配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４５４、配列番号４６１、配列番号４６４、配列番号４７１、配列番号５１５、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、または配列番号５１９で示される、ＤＧＬＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号４４０、配列番号４４６、配列番号４５３、配列番号４６０、配列番号４６３、配列番号４７０、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、または配列番号４９６で示される、ＤＧＬＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）配列番号４４０、配列番号４４６、配列番号４５３、配列番号４６０、配列番号４６３、配列番号４７０、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５、または配列番号４９６で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＤＧＬＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるいは
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列の相補体であって、前記相補体および前記ヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなりかつ１００％相補的である、相補体
    を含む、ＤＧＬＡシンターゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
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