BR112013004355A2

BR112013004355A2 - polipeptídeo mutante possuindo atividade delta-5 dessaturase, molécula de ácido nucleico isolada e célula transformada.

Info

Publication number: BR112013004355A2
Application number: BR112013004355-5A
Authority: BR
Inventors: Michael W. Bostick; Qun Zhu; Narendra S. Yadav; Dana M. Walters Pollak; Hongxian He; Hongxiang Zhang; Melissa D. Daubert; Pamela L. Sharpe; Seung-Pyo Hong; Yehong Jamie Wang; Zhixiong Xue
Original assignee: E.I. Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 2010-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2021-05-04
Also published as: WO2012027698A1; AU2011293189B2; AU2011293189A1; CA2808002A1; US8658413B2; CN103080317A; JP2013535988A; US20120052549A1; CL2013000534A1; EP2609202A1; CN103080317B

Abstract

POLIPEPTÍDEO MUTANTE POSSUINDO ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA E CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA. São divulgadas delta-5 dessaturases mutantes possuindo a capacidade de converter ácido dihomo-gama-linolênico [DGLA; 20:3 ômega-6] em ácido araquidônico [ARA; 20:4 ômega-6] e/ou ácido eicosatetraenóico [ETA,20:4 ômega-3] em ácido eicosapentaenóico [EPA; 20:5 ômega 3] e possuindo pelo menos uma mutação dentro do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) do domínio citocromo b<sym>-like e pelo menos uma mutação dentro do motivo HDASH (SEQ ID NO:8). São também descritos fragmentos de ácidos nucleicos isolados e construções recombinantes compreendendo tais fragmentos codificantes de delta-5 dessaturases, juntamente com um processo para a fabricação de ácidos graxos poli-insaturados ["PUFAs"] cadeia longa.</sym>

Description

.. . . 1 . .. "POLIPEPTÍDEO MUTANTE POSSUINDO ATIVIDADE DEL TA-5 DESSATURASE, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEJCO ISOLADA E CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA" Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 5 61/377248, depositado em 26 de agosto de 2010, e do Pedido Provisório US 61/428277, depositado em 30 de dezembro de 201 O, cujas descrições são integralmente incorporadas ao presente pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está no campo da biotecnologia. Mais 10 especificamente, esta invenção diz respeito à produção de fragmentos de ácidos nucleicos codificantes de delta-5 dessaturases de ácido graxo mutantes (em que pelo menos uma mutação ocorre dentro do motivo HPGG [SEQ 10 NO: 7] do domínio citocromo b5-like e pelo menos uma mutação ocorre dentro do motivo HOASH [SEQ 10 NO: 8]).

15 ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Uma variedade de diferentes hospedeiros incluindo plantas, algas, fungos e leveduras, está sendo investigada como meio para a produção de ácidos graxos poli-insaturados ["PUFAs"] comerciais. A engenharia genética tem demonstrado que as habilidades naturais de alguns hospedeiros (mesmo 20 aqueles nativamente limitados a produção do ácido graxo ácido linoleico [LA; 18:2 ômega-6] e ácido a-linolênico [ALA; 18:3 ômega-3]) pode ser substancialmente alterada para resultar na produção de alto nível de diversos PUFAs de cadeia longa ômega-3/ômega-6. Se este é o resultado proveniente da capacidade natural ou da tecnologia recombinante, a produção de ácido 25 araquidônico [ARA; 20:4 ômega-6], ácido eicosapentanóico [EPA; 20:5 03] e ácido docosahexaenóico [OHA; 22:06 ômega- 3] pode, todos estes, necessitar da expressão de um gene delta-5 dessaturase.

Assim, a presente invenção diz respeito a novas delta-5 dessaturases com elevada atividade que são adequadas para a integração em vias biossintéticas dos PUFAs em células hospedeiras comercialmente úteis.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Em um primeiro exemplo de realização, a invenção diz respeito a 5 um polipeptídeo mutante possuindo atividade delta-5 dessaturase, compreendendo: (a) um motivo de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 34 [HxGx], em que a SEQ ID NO: 34 [HxGx] não é idêntica à SEQ ID NO: 7 [HPGG]; e, (a) um motivo de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 [HxxxH], em que a SEQ ID NO: 1 [HxxxH] não é idêntica à SEQ ID NO: 8 [H DAS H].

Em um segundo exemplo de realização, o motivo de aminoácidos de (a) é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:9 [HgGG], SEQ ID N0:10 [HhGG], SEQ ID N0:11 [HPGs], SEQ ID N0:12 [HcGG], SEQ ID N0:13 [HwGG] e SEQ ID N0:14 [HaGG]; e, o motive de aminoácidos de (b) é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 15 [HDgSH ] NO, SEQ ID NO: 16 [HDsSH], SEQ ID NO: 17 [HDAaH], SEQ ID NO: 18 [HDAgH] e SEQ ID NO: 19 [HeASH].

Em um terceiro exemplo de realização, o polipeptídeo mutante tem identidade de sequência de pelo menos 90% com base em um método de alinhamento BLASTP quando comparado com um polipeptídeo que possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ lO NO: 21, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 29.

Em um quarto exemplo de realização, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo mutante é selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 139 [EgD5R*-34g157g], SEQ lO NO: 141 [EgD5R*- 34g158a], SEQ ID N0:143 [Eg05R*-34g158g], SEQ ID N0:145 [EgD5R*-

34h158a], SEQ ID N0:147 [EgD5R*-34h158g], SEQ ID N0:149 [EgD5R*- 36s158a], SEQ ID N0:151 [EgD5R*-36s158g], SEQ ID N0:153 [EgD5M, EgD5R*-34g158g códon-otimizado], SEQ ID N0:157 [EgD5M1, EgD5R*- 34g158g347s códon-otimizado], SEQ ID N0:181 [EgD5S-36s156e], SEQ ID 5 N0:183 [EgD5S-36s157g], SEQ ID N0:185 [EgD5S-36s158a], SEQ ID N0:187 [EgD5S-36s 158g], SEQ ID N0:213 [EaD5S-35a158g], SEQ ID N0:215 [EaD5S-35a158s], SEQ ID N0:217 [EaD5S-35a159g], SEQ ID N0:255 [EgD5R-34g158g], SEQ ID N0:260 [EgD5R-34g158a], SEQ ID N0:271 [EaD5- 35g159g] e SEQ ID N0:276 [EaD5-35g159a].

Em um quinto exemplo de realização, o polipeptídeo mutante tem uma eficiência de conversão de ácido dihomo-y-linolênico para ácido araquidônico que é pelo menos 64% da eficiência de conversão de ácido dihomo-y-linolênico para ácido araquidônico do polipeptídeo parenta!, em que o dito polipeptídeo parenta! compreende um motivo de aminoácidos idêntico ao da SEQ ID NO: 7 [HPGG] e um motivo de aminoácidos idêntico ao da SEQ ID NO: 8 [HDASH].

Em um sexto exemplo de realização, a invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica qualquer um dos polipeptídeos mutantes descritos acima. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico isolada possui uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 138 [EgD5R*-34g157g], SEQ ID N0:140 [EgD5R*-34g158a], SEQ ID N0:142 [EgD5R*-34g158g], SEQ lO N0:144 [EgD5R*-34h158a], SEQ ID N0:146 [EgD5R*-34h158g], SEQ lO N0:148 [EgD5R*-36s158a], SEQ ID N0:150 [EgD5R*-36s 158g], SEQ lO N0:152 [EgD5M, EgD5R*-34g158g códon-otimizado], SEQ ID N0:156 [EgD5M1, EgD5R*-34g158g347s códon-otimizado], SEQ ID N0:180 [EgD5S- 36s156e], SEQ ID NO: 182 [EgD5S-36s157g], SEQ ID NO: 184 [EgD5S- 36s158a], SEQ ID N0:186 [EgD5S-36s158g], SEQ ID N0:212 [EaD5S-

35a158g], SEQ ID N0:214 [EaD5S-35a158s], SEQ ID N0:216 [EaD5S- 35a159g], SEQ ID N0:254 [EgD5R-34g158g], SEQ ID N0:259 [EgD5R- 34g158a], SEQ ID N0:270 [EaD5-35g159g] e SEQ ID N0:275 [EaD5-35g159a].

Em um sétimo exemplo de realização, a invenção diz respeito a uma 5 célula hospedeira transformada expressando qualquer um dos polipeptídeos mutantes. Preferencialmente, a célula hospedeira transformada é selecionada a partir do grupo que consiste de: micróbios, mais preferivelmente de leveduras oleaginosas e plantas, mais preferivelmente, plantas de sementes oleaginosas.

Em um oitavo exemplo de realização, a célula hospedeira transformada produz um ácido graxo poli-insaturado selecionado a partir do grupo que consiste de ácidos graxos ômega-6 e ácidos graxos ômega-3.

DEPÓSITOS BIOLÓGICOS O seguinte material biológico foi depositado junto da Coleção de Culturas Americana "American Type Cu/fure Col/ection" (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e tem a seguinte designação, número de acesso e data de depósito.

Material Biológico N° de acesso Data de Depósito Yarrowia lipolytica Y8412 A TCC PTA-1 0026 14 de maio de 2009 O material biológico listado acima foi depositado sob as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Propósitos de Procedimentos de Patentes. O depósito listado será mantido no depositário internacional indicado por pelo menos 30 anos e serão disponibilizados ao público mediante a concessão de uma patente divulgando estas. A disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para a prática da referida invenção em derrogação dos direitos de patente concedidos por ações governamentais.

A Yarrowia lipolytica Y9502 foi derivada da Yarrowia lipolytica

: 5 Y8412, de acordo com a metodologia descrita na Publicação do Pedido de Patente US 2010-0317072-A1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS FIG. 1A e FIG. 18 ilustram a via biossintética de ácidos graxos 5 ômega-3/ômega-6, e devem ser vistas juntas ao considerar a descrição desta via abaixo.

FIG. 2 é um modelo topológico previsto da enzima delta-5 dessaturase de Euglena gracílís.

FIG. 3A, 38, 3C e 30 mostram um alinhamento das sequências 10 de DNA do gene delta-5 dessaturase tipo selvagem da Euglena graci/ís (ou seja, EgD5 [SEQ ID NO: 20]), com um gene delta-5 dessaturase variante do tipo selvagem da E. gracilís que contém uma mutação S347R (ou seja, EgD5R [SEQ ID NO: 24]).

FIG. 4A, 48 e 4C ilustram a construção do plasmídeo 15 pDMW367-M4.

FIG. 5 mostra um alinhamento de sequências da porção 5' do gene delta-5 dessaturase variante do tipo selvagem a partir da E. gracílís (ou seja, EgD5R [SEQ ID NO: 24]) com os primeiros 204 pb da delta-5- dessaturase mutante sintética derivada de E. gracílís e códon-otimizado para 20 a expressão em Yarrowia lípolytica, compreendendo os motivos HgGG [SEQ ID NO: 9] e HDAgH [SEQ ID NO: 18] (ou seja, EgD5M [SEQ ID NO: 152]).

FIG. 6 - apresenta um mapa dos seguintes plasmídeos: (A) pEgD5M e (8) pDMW367-5M.

FIG. 7 - ilustra o desenvolvimento da cepa Yarrowía lípolytica 25 Z1978.

FIG. 8 - fornece um mapa dos seguintes plasmídeos: (A) pZKUM e (8) pZKL3-9DP9N.

FIG. 9 - ilustra o desenvolvimento das cepas Z8001 até Z8054

: 6 de Yarrowía lípolytíca.

FIG. 1OA: ilustra esquematicamente uma reação de recombinação homóloga com pYPS234, enquanto a FIG. 1OB fornece um mapa do plasmídeo pYPS234.

5 FIG. 11A: ilustra esquematicamente uma reação de recombinação homóloga com pYPS233, enquanto a FIG. 11 B fornece um mapa do plasmídeo pYPS233.

FIG. 12A: ilustra esquematicamente uma reação de recombinação homóloga com pYPS241, enquanto a FIG. 128 fornece um 10 mapa do plasmídeo pYPS241.

FIG. 13 - Fornece um mapa dos seguintes plasmídeos: (A) pZR5AU-555 e (B) pZR5AU-555M.

A presente invenção pode ser mais bem compreendida a partir da seguinte descrição detalhada e da descrição das sequências anexa que 15 fazem parte do presente pedido.

As sequências a seguir estão de acordo com o Título 37 do CFR §1.821-1.825 ("Requírements for Patent Applícations Contaíning Nucleotide Sequences andlor Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rufes") e são consistentes com as regras da Organização 20 Mundial de Propriedade Intelectual (OMPI/WIPO), Standard ST.25 (1998) e os requisitos de listagem de sequências EPO e PCT (Regras 5.2 e 49,5 (a- bis), e seção 208 no Anexo C das instruções administrativas). Os símbolos e formatos utilizados para os dados de sequências de nucleotídeos e aminoácidos obedecem as regras estabelecidas no Título 37 do CFR § 25 1,822.

As SEQ 10 NOs :1-311 são ORFs (quadros de leitura abertos) de genes codificantes ou proteínas (ou partes destas), primers ou plasmídeos, conforme identificado na Tabela 1.

... 7 TABELA 1 SEQ ID NOs DE ÁCIDOS NUCLÉICOS E PROTEÍNAS

RESUMO DAS SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Motivo rico em His: H(X)3H -- 1 Motivo rico em His: H(X)4H -- 2 Motivo rico em His: H(X)2HH -- 3 Motivo rico em His: H(X)3HH -- 4 Motivo rico em His: (H/Q)(X)2HH -- 5 Motivo rico em His: (H/Q)(X)3HH -- 6 Motivo HPGG -- 7 Motivo HDASH -- 8 Motivo HgGG -- 9 Motivo HhGG -- 10 Motivo HPGs -- 11 Motivo HcGG -- 12 Motivo HwGG -- 13 Motivo HaGG -- 14 Motivo HDgSH -- 15 Motivo HDsSH -- 16 Motivo HDAaH -- 17 Motivo HDAgH -- 18 Motivo HeASH -- 19 Delta-5 dessaturase de Euglena gracilis 20 21 ("EgD5") (1350 bp) (449 AA) Delta-5 dessaturase sintética, derivada de 22 23 Euglena gracilis, codón-otimizada para (1350 bp) (449 AA) expressão em Yarrowia lipo/ytica ("EgD5S") Delta-5 dessaturase variante de Euglena 24 25 gracilis, compreendendo um resíduo de arginina (1350 bp) (449 AA) na posição de aminoácido 347 ("EgD5R") Delta-5 dessaturase modificada de Euglena graci/is compreendendo um resíduo de arginina 26 27 na posição de aminoácido 347, com quatro (1350 bp) (449 AA) sítios de enzimas de restrição na região codificante removidos ("EgD5R*") Delta-5 dessaturase de Euglena anabaena 28 29 ("EaD5") (1362bp) (454 AA) Delta-5 dessaturase sintética, derivada da 30 31 Euglena anabaena, códon-otimizada para a (1362bp) (454 AA) expressão em Yarrowia lipolytica ("EaD5S") Motivo HxGG -- 32 Motivo HPGx -- 33 Motivo HxGx -- 34

SEQ 10 NO SEQ 10 NO Descrição de ácido de proteína nucleico Motivo HxASH -- 35 Motivo HDxSH -- 36 Motivo HDAxH -- 37 38 Plasmídeo pDMW367 -- (8438 bp) 39 Plasmídeo pDMW367-M4 (8438 bp) -- Pares de primers de oligonucleotídeos utilizados para mutar os sítios de enzimas de restrição EcoRI e Bg/11 da região codificante do EgD5R 40-43 -- para gerar pDMW367 -M4 44 Plasmídeo pDMW367-M2 -- (8438 bp) Pares de primers de oligonucleotídeos utilizados para mutar os sítios de enzimas de restrição 45-48 -- Hindlll e Ncol nativos da região codificante do Eg05R para gerar pDMW367-M4 Primers de oligonucleotídeos utilizados para mutar individualmente o resíduo Ala do motivo HDASH [SEQ 10 N0:8] do Eg05R*, por 49-86 -- mutagênese sítio-dirigida. Delta-5 dessaturase sintética mutante, derivada 87 (449 -- da Euglena gracilis ("EgD5R*-HDgSH") AA) Delta-5 dessaturase sintética mutante, derivada 88 (449 da Eug/ena gracilis ("EgD5R*-HDsSH") -- AA) Primers de oligonucleotídeos utilizados para mutar individualmente o resíduo Ser do motivo 89-126 HDASH [SEQ 10 N0:8] do EgD5R* por mutagênese sítio-dirigida.

Delta-5 dessaturase sintética mutante, derivada 127 -- da Euglena gracilis ("EgD5R*-HDAaH") (449 AA) Delta-5 dessaturase sintética mutante, derivada 128 da Eug/ena gracilis ("EgD5R*-HDAgH") -- (449 AA) 129 Plasmídeo pDMW367M4-157g -- (8438 bp) 130 Plasmídeo pDMW367M4-158a -- r------· .. --~----------··--- (8438 bp) 131 Plasmídeo pDMW367M4-158g -- (8438 bp)

• t ' 9

SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Primers de oligonucleotídeos utilizados para mutar individualmente o resíduo Pro ou o segundo resíduo Gli do motivo HPGG [SEQ ID NO:?] de genes delta-5 dessaturase mutantes 132-137 -- no pDMW367M4-157g, pDMW367M4-158a, e pDMW367M4-158g por mutagênese sítio- dirigida. Delta-5 dessaturase sintética mutante, derivada da Euglena graci!is ("EgD5R*-34g157g") (ou 138 139 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1350bp) (449 AA) HDgSH motifs) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R*-34g158a") (ou 140 141 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1350 bp) (449 AA) HDAaH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R*-34g 158g") (ou 142 143 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1350 bp) (449 AA) HDAgH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R*-34h158a") (ou 144 145 seja, compreendendo os motivos HhGG e (1350bp) (449 AA) HDAaH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena graci!is ("EgD5R*-34h158g") (ou 146 147 seja, compreendendo os motivos HhGG e (1350 bp) (449 AA) HDAgH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R*-36s158a") (ou 148 149 seja, compreendendo os motivos HPGs e (1350 bp) (449 AA) HDAaH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Eug!ena gracilis ("EgD5R*-36s158g") (ou 150 151 seja, compreendendo os motivos HPGs e (1350 bp) (449 AA) HDAgH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R*-34g158g") (ou 152 153 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1350 bp) (449 AA) HDAgH), códon-otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica ("EgD5M"l 154 Plasmídeo pEgD5M -- (4070 bp) Plasmídeo pDMW367-5M, compreendendo 155 EgD5M (8438 bp) --

. r 10

SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Eug/ena gracilis ("Eg05R*-34g158g347s") 156 157 (ou seja, compreendendo os motivos HgGG e (1350 bp) (449 AA) HDAgH, e o resíduo Ser na posição de aminoácido 347) ("EgD5M1") 158 Plasmídeo pEgD5M1 -- (4070 bp) Plasmídeo pDMW367-5M1, compreendendo 159 EgD5M1 (8438 bp) -- Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada 160 de Euglena gracilis e códon-otimizada para a -- (449 AA) expressão em Yarrowia lipolytica ("EgD5S-36s") (ou seja, compreendendo um motivo HPGs) 161 Plasmídeo pDMW369S -- (8438 bp) Primers de oligonucleotídeo utilizados para mutar individualmente os resíduos Asp, Ala ou Ser do motivo HDASH [SEQ 10 N0:8] do 162-179 -- EgD5S-HPGs por mutagênese sítio-dirigida Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis e códon-otimizada para a 180 181 expressão em Yarrowia lipolytica ("Eg05S- (1350bp) (449 AA) 36s 156e") (ou seja, compreendendo os motivos HPGs e HeASH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Eug/ena gracilis e códon-otimizada para a 182 183 expressão em Yarrowia lipolytica ("Eg05S- (1350 bp) (449 AA) 36s157g") (ou seja, compreendendo os motivos HPGs e H~gSH) --· Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Eug/ena gracilis e códon-otimizada para a 184 185 expressão em Yarrowia lipo/ytica ("EgD5S- (1350bp) (449 AA) 36s158a") (ou seja, compreendendo os motivos HPGs e HDAaH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Eug/ena gracilis e códon-otimizada para a 186 187 expressão em Yarrowia lipolytica ("EgD5S- (1350 bp) (449 AA) 36s158g") (ou seja, compreendendo os motivos HPGs e HDAgH)

SEQ 10 NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena anabaena e códon-otimizada para a 188 -- expressão em Yarrowia lipolytica ("Ea05S-35a") (454 AA) (ou seja, compreendendo um motivo HaGG) 189 Plasmídeo pZuFmEaD5S-A(S) (8357 bp) -- Primers de oligonucleotídeos utilizados para mutar individualmente o resíduo Asp, Ala ou Ser 190-211 -- do motivo HDASH [SEQ ID N0:8] do Ea05S- 35a por mutagênese sítio-dirigida Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena anabaena e códon-otimizada para a 212 213 expressão em Yarrowia lipolytica ("Ea05S- (1365 bp) (454 AA) 35a158g") (ou seja, compreendendo os motivos HaGG e HDgSH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena anabaena e códon-otimizada para a 214 215 expressão em Yarrowia lipolytica ("Ea05S- (1365 bp) (454 AA) 35a158s") (ou seja, compreendendo os motivos HaGG e HDsSH) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Eug/ena anabaena e códon-otimizada para a 216 217 expressão em Yarrowia lipolytica ("Ea05S- (1365 bp) (454 AA) 35a159g") (ou seja, compreendendo os motivos HaGG e HDAgH) 218 Plasmídeo pZKUM -- (4313 bp) -----·--- 219 Plasmídeo pZKL3-9DPN9N -- (13565 bp) Delta-9 elongase mutante sintética derivada de 220 221 Euglena gracilis ("EgD9eS-L35G") (777 bp) (258 AA) Delta-9 dessaturase de Yarrowia lipolytica 222 223 ("YID9") (1449 bp) (482 AA)

-. 12

SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Colina-fosfato citidililtransferase ("YIPCT") de 224 225 Yarrowia lipolytica (1101 bp) (366 AA) 226 Plasmídeo pZKSL-5S5A5 (13975 bp) 227 Plasmídeo pZP2-85m98F (14619 bp) 228 993 bp fragmento stuffer -- (993 bp) 229 Plasmídeo pYPS234 -- (7338 bp) 230 1019 bp fragmento stuffer -- (1 019 bp) 231 Plasmídeo pYPS233 -- (7364 bp) 232 Plasmídeo pYSP241 -- (9211 bp) 233 Plasmídeo pZR5AU-555 -- (13926 bp) 234 Plasmídeo pZR5AU-555M -- (13926 bp) -- ~-··- -··-------- Motivo HDgnH -- 235 Motivo HDAnH -- 236 Motivo HefaH -- 237 Motivo HeftH -- 238 Motivo HemgH -- 239 Motivo HeAgH -- 240 Motivo HDfgH -- 241

. ' 13

SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Motivo HDyg H -- 242 Motivo HDscH -- 243 Motivo HDAcH -- 244 Primer Eg0 5-5 245 -- Primer Eg 05 M 1-3 246 -- Prime r Eg 05 M 1-5 247 -- Primer Eg 05-3 248 -- Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada 249 250 de Euglena gracilis ("EgD5R-34g") (ou seja, (1347 bp) (449 AA) compreendendo um motivo HgGG) Primer EgD5 M2-3 251 -- Primer EgD5 M2-5 252 -- 253 Plasmídeo pLF336 -- (5050 bp) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R-34g158g") (ou 254 255 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1347 bp) (449 AA) HDAgH) Primer EgD5 M3-3 256 -- Primer EgD5 M3-5 257 -- 258 Primer pLF337 -- (5050 bp) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena gracilis ("EgD5R-34g158a") (ou 259 260 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1347 bp) (449 AA) HDAaH) Primer EaD5-5 261 --

-I 14

SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Primer EaD5 M1-3 262 -- Primer EaD5 M1-5 263 -- Primer EaD5-3 264 -- Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada 265 266 de Euglena anabaena ("Ea05-35g") (ou seja, (1362 bp) (454 AA) compreendendo um motivo HgGG) Primer EaD5 M2-3 267 -- Primer EaD5 M2-5 268 -- 269 Plasmídeo pLF338 -- (5007 bp) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena anabaena ("EaD5-35g159g") (ou 270 271 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1362 bp) (454 AA) HDAgH) Primer Ea05 M3-3 272 -- Primer Ea05 M3-5 273 -- 274 Plasmídeo pLF339 -- (5007 bp) Delta-5 dessaturase mutante sintética, derivada de Euglena anabaena ("EaD5-35g159a") (ou 275 276 seja, compreendendo os motivos HgGG e (1362 bp) (454 AA) HDAaH) Motivo HDcSH -- 277 Motivo HDdSH -- 278 Motivo HDeSH -- 279 Motivo HDfSH -- 280 Motivo HDhSH -- 281

•• 15

SEQ ID NO

SEQ ID NO Descrição de ácido de proteína nucleico Motivo HDiSH -- 282 Motivo HDkSH -- 283 Motivo HDISH -- 284 Motivo HDmSH -- 285 Motivo HDnSH -- 286 Motivo HDpSH -- 287 Motivo HDqSH -- 288 Motivo HDrSH -- 289 Motivo HDtSH -- 290 Motivo HDvSH -- 291 Motivo HDwSH -- 292 Motivo HDySH -- 293 Motivo H DAc H -- 294 Motivo H DAd H -- 295 Motivo HDAeH -- 296 Motivo H DAfH -- 297 Motivo HDAhH -- 298 Motivo HDAiH -- 299 Motivo HDAkH -- 300 Motivo HDAIH -- 301 Motivo HDAmH -- 302 Motivo HDAnH -- 303 Motivo HDApH -- 304 Motivo HDAqH -- 305 Motivo HDArH -- 306 Motivo HDAtH -- 307 Motivo HDAvH -- 308 Motivo HDAwH -- 309 Motivo HDAyH -- 310 Motivo HDxxH -- 311

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Toda a literatura patentária e não patentária citada no presente é integralmente incorporada ao presente pela referência.

Na presente divulgação, são utilizados diversos termos e siglas.

5 Os códigos de três letras ou códigos de uma letra padrão são utilizados para se referirem aos aminoácidos. As definições a seguir são fornecidas.

"Quadro de leitura aberto" é abreviado como "ORF".

"Reação em cadeia da polimerase" é abreviada como "PCR".

A "Coleção Americana de Culturas" (American Type Culture Collection) é abreviada como "ATCC".

"Acido(s) graxo(s) poli-insaturado(s)" é abreviado como "PUFA(s)".

Os "Triacilgliceróis" são abreviados como TAGs.

5 Os "ácidos graxos totais" são abreviados como "TFAs".

Os "ácidos graxos metil-ésteres" são abreviados como "FAMEs".

O "peso celular seco" é abreviado como "DCW".

O motivo que possui uma sequência de aminoácidos tal como estabelecido na SEQ 10 NO: 7 (isto é, His-Pro-Gii-Gii) é abreviado como "HPGG".

O motivo que possui uma sequência de aminoácidos tal como estabelecido na SEQ 10 NO: 8 (isto é, His-Asp-Aia-Ser-His) é abreviado como "HDASH".

Conforme utilizado no presente, o termo "invenção" ou "presente invenção" pretende referir-se a todos os aspectos e exemplos de realização da invenção tal como descrito nas reivindicações e relatório descritivo do presente e não devem ser interpretados de modo a limitar-se a qualquer exemplo de realização ou aspecto específico.

O termo "ácidos graxos" refere-se a ácidos alifáticos de cadeia longa (ácidos alcanóicos), de diferentes comprimentos de cadeia, de cerca de C12 a Cn embora sejam conhecidos ácidos tanto com comprimento de cadeia maior quando com comprimento de cadeia menor. Os comprimentos de cadeia predominantes estão entre C16 e C22 . A estrutura dos ácidos graxos é representada por um sistema de notação simples de "X:Y", onde X é o número total de átomos de carbono ["C"] no ácido graxo específico e Y é o número de ligações duplas. Detalhes adicionais sobre a diferenciação entre "ácidos graxos saturados" versus "ácidos graxos insaturados", "ácidos graxos monoinsaturados" versus "ácidos graxos poli-insaturados" ["PUFAs"] e "ácidos

. -- 17 graxos ômega-6 ["w-6" ou "n-6"] versus "ácidos graxos ômega- 3" ["w-3"] ou [" n-3"] são fornecidos na Patente US 7 .238.482, que é incorporada ao presente pela referência.

A nomenclatura usada para descrever os PUFAs no presente é 5 exibida na Tabela 2 abaixo. Na coluna intitulada "Anotações Estenográficas", o sistema de referência ômega é usado para indicar o número de carbonos, o número de duplas ligações e a posição da dupla ligação mais próxima do carbono ômega, contados a partir do carbono ômega (que é numerado como 1 para esse propósito). O restante da tabela resume os nomes comuns dos 1o ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 e seus precursores, as abreviações que serão utilizadas durante todo o relatório descritivo e o nome químico de cada composto.

TABELA 2 NOMENCLATURA DE ÁCIDOS GRAXOS POLI-INSATURADOS E PRECURSORES Nome comum Abreviatura Nome Químico Notação abreviada Mirístico -- tetradeca nó ico 14:0 Palmítico Palmitate hexadecanóico 16:0 Palmitoléico -- 9-hexadecenóico 16:1 Esteárico -- octadecanóico 18:0 Oleico -- cis-9-octadecenóico 18:1 Linoleico LA cis-9, 12- 18:2 w-6 octadecadienóico y-linolênico GLA cis-6, 9, 12- 18:3 w-6 octadecatrienóico Eicosadienóico EDA cis-11, 14-eicosadienóico 20:2 w-6 Dihomo-y- DGLA cis-8, 11' 14- 20:3 w-6 linolênico eicosatrienóico Araquidônico ARA cis-5, 8, 11' 14- 20:4 w-6 eicosatetraenóico a-linolênico ALA cis-9, 12, 15- 18:3 w-3 octadecatrienóico

Nome comum Abreviatura Nome Químico Notação abreviada Estearidônico STA cis-6, 9, 12, 15- 18:4 w-3 octadecatetraenóico Eicosatrienóico ETrA cis-11, 14, 17- 20:3 w-3 eicosatrienóico E icosa- ETA cis-8, 11' 14, 17- 20:4 w-3 tetraenóico eicosatetraenóico E icosa- EPA cis-5, 11' 14, 8, 17- 20:5 w-3 pentaenóico eicosapentaenóico Docosa- cis-7, 10, 13, 16- DTA 22:4 w-6 tetraenóico docosatetraenóico Docosa- cis-4, 7, 10, 13, 16- 22:5 w-6 DPAn-6 pentaenóico docosapentaenóico Docosa- OPA cis-7, 10, 13, 16, 19- 22:5 w-3 pentaenóico docosapentaenóico Docosa- DHA cis-4, 7, 10, 13, 16, 19- 22:6 w-3 hexaenóico docosahexaenóico Embora os PUFAs ômega-3/ômega-6 listados na Tabela 2 sejam os mais prováveis a se acumularem em frações de óleo de hospedeiros microbianos e vegetais usando os métodos descritos no presente, esta lista não deve ser interpretada como limitante ou como completa.

5 O termo "óleo" refere-se a uma substância lipídica que é líquida a 25 °C, o óleo é hidrofóbico, mas é solúvel em solventes orgânicos. Nos organismos oleaginosos, o óleo constitui uma parte importante dos lipídios totais. O "óleo" é composto principalmente de triacilgliceróis, mas podem também conter outros lipídeos neutros, fosfolipídeos e ácidos graxos livres. A composição de ácidos graxos no óleo e a composição de ácidos graxos dos lipídios totais são geralmente semelhantes, assim, um aumento ou diminuição na concentração de PUFAs nos lipídios totais corresponde a um aumento ou diminuição na concentração de PUFAs no óleo e vice-versa.

"Lipídios neutros" referem-se aos lipídios comumente encontrados em células em corpos lipídicos como gorduras de armazenamento e são assim chamados porque em pH celular, os lipídios não possuem grupos carregados.

Geralmente, eles são completamente apoiares e não possuem afinidade para a água. Os lipídios neutros referem-se, em geral, a mono-, di- e/ou triésteres de 5 glicerol com ácidos graxos, também denominados de monoacilglicerol, diacilglicerol ou triacilglicérol, respectivamente, ou coletivamente, como acilgliceróis. Uma reação de hidrólise deve levar a liberação de ácidos graxos livres a partir dos acilgliceróis.

O termo "triacilgliceróis" ["TAGs"] refere-se lipídios neutros composto de três resíduos de ácidos graxos esterificados em uma molécula de glicerol. Os TAGs podem conter PUFAs de cadeia longa e ácidos graxos saturados, bem como, ácidos graxos curtos insaturados e saturados.

A expressão "ácidos graxos totais" ["TFAs"] refere-se na presente invenção à soma de todos os ácidos graxos celulares que podem ser derivados de ácidos graxos metil-ésteres ["FAMEs"] pelo método da transesterificação base (como é conhecido no estado da técnica), em uma dada amostra, que pode ser a biomassa ou óleo, por exemplo. Assim, os ácidos graxos totais incluem os ácidos graxos a partir de frações de lipídios neutros (incluindo monoacilgliceróis, diacilgliceróis e TAGs) e a partir de frações de lipídios polares (incluindo as frações fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina), mas não de ácidos graxos livres.

O termo "teor de lipídeos totais" de células é uma medida de TFAs como uma porcentagem do peso celular seco ["DCW"], embora o conteúdo lipídico total possa ser aproximado como uma medida de FAMEs como uma porcentagem de DCW ["F AMEs% DCW"]. Desse modo, o teor de lipídios totais ["TFAs % DCW"] é equivalente a, por exemplo, a miligramas de ácidos graxos totais por 100 miligramas de DCW.

A concentração de um ácido graxo nos lipídeos totais é expressa no presente como porcentagem do peso de TFAs ["% TFAs"], por exemplo, miligramas de um dado ácido graxo por 100 miligramas de TFAs. Salvo quando indicado expressamente de outra forma na presente divulgação, a referência ao percentual de um dado ácido graxo em relação aos lipídios totais é 5 equivalente à concentração do ácido graxo como % TFAs (por exemplo, a % EPA nos lipídios totais é equivalente a EPA% TFAs).

Os termos "perfil lipídico" e "composição lipídica" são intercambiáveis e referem-se à quantidade de ácidos graxos individuais contidos em uma fração lipídica específica, como nos lipídios totais ou óleo, onde a quantidade é expressa como uma porcentagem de peso de TFAs. A soma de cada ácido graxo individual presente na mistura deve ser 100.

O termo "via biossintética do PUFA" refere-se a um processo metabólico que converte o ácido oleico em ácidos graxos ômega-6, tais como LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, ORA, DTA e DPAn-6; e ácidos graxos ômega-3 tais como ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, OPA e DHA. Este processo é bem descrito na literatura. Vide, por exemplo, a Patente US 7.932.077.

Resumidamente, este processo envolve o alongamento da cadeia de carbono através da adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula através do acréscimo de duplas ligações, por meio de uma série de enzimas especiais de alongamento e dessaturação denominadas de "enzimas da via biossintética do PUFA" que estão presentes na membrana do reticulo endoplasmático. Mais especificamente, as "enzimas da via biossintética do PUFA" referem-se a qualquer uma das seguintes enzimas (e genes que codificam tais enzimas) associadas com a biossíntese de um PUFA, incluindo: delta-4 dessaturase, delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase, delta-9 dessaturase, delta-8 dessaturase, delta-9 elongase, c14/16 elongase, c16/18 elongase, c18/20 elongase e/ou c20/22 elongase.

O termo "dessaturase" refere-se a um polipeptídeo que pode dessaturar, ou seja, introduzir uma dupla ligação, em um ou mais ácidos graxos para produzir um ácido graxo ou precursor de interesse. Apesar do uso do sistema de referência ômega durante todo o relatório descritivo para se referir a 5 ácidos graxos específicos, é mais conveniente para indicar a atividade de uma dessaturase, contando a partir da extremidade carboxila do substrato usando o sistema delta. De particular interesse para a presente invenção são as delta-5 dessaturases que irão dessaturar um ácido graxo entre o quinto e sexto átomo de carbono numerado a partir da extremidade carboxi-terminal da molécula, e que pode, por exemplo, catalisar a conversão de DGLA em ARA e/ou ETA em EPA. Outras ácido graxo dessaturases incluem, por exemplo: delta-S dessaturases, delta-6 dessaturases, delta-4 dessaturases, delta-12 dessaturases, delta-15 dessaturases, delta-17 dessaturases e delta-9 dessaturases. No estado da técnica, as delta-15 e delta-17 desaturases ocasionalmente, são também referidas como "ômega-3 dessaturases", "w-3 dessaturases", e/ou "w-3 dessaturases ", com base na sua capacidade de converter os ácidos graxos ômega 6 em sua contraparte ômega-3 (por exemplo, conversão de LA em ALA e ARA em EPA, respectivamente). Pode ser desejável para determinar empiricamente a especificidade de uma dessaturase de ácido graxo específica, a transformação de um hospedeiro adequado com o gene para a ácido graxo dessaturase e a determinação de seu efeito sobre o perfil de ácidos graxos do hospedeiro.

O termo "EgD5" refere-se a uma enzima delta-5 dessaturase (SEQ ID NO: 21) da Eug/ena gracilis, codificada pela SEQ ID NO: 20 no presente. De forma similar, o termo "EgD5S" refere-se a uma delta-5 dessaturase sintética derivada de E. graci/is que é códon-otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica (ou seja, SEQ ID NOs: 22 e 23). Outros detalhes em relação a EgD5 e EgD5S estão descritos na Patente US 7.678.560.

O termo "EgD5R" (isto é, SEQ ID NOs: 24 e 25) refere-se a uma variante tipo selvagem da Eg05 no qual o resíduo de aminoácido na posição 347 é a arginina. O termo "EgD5R*" (isto é, SEQ ID NOs: 26 e 27) refere-se a uma variante modificada do EgD5R tipo selvagem, no qual quatro sítio de restrição 5 enzimática são removidos da região codificante do tipo selvagem. As sequências de aminoácidos de EgD5R e EgD5R* são idênticas.

O termo "Ea05" refere-se a uma enzima delta-5 dessaturase (SEQ ID NO: 29) da Eug/ena anabaena, codificada pela SEQ ID NO: 28 no presente. De forma similar, o termo "EaD5S" refere-se a uma delta-5 dessaturase sintética derivada de E. anabaena que é códon-otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica (ou seja, SEQ ID NOs: 30 e 31). Outros detalhes em relação a Ea05 e EaD5S estão descritos na Patente US 7.943.365.

O termo "domínio conservado" ou "motivo" refere-se a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma sequência alinhada de proteínas evolutivamente relacionadas. Embora aminoácidos em outras posições possam variar entre duas proteínas homólogas, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam que estes aminoácidos podem ser importantes na estrutura, estabilidade ou atividade de uma proteína. Pelo fato deles serem identificados por alto grau de conservação nas sequências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadores, ou "assinaturas" para determinar se uma proteína com uma sequência recém determinada pertence a uma família de proteínas identificada anteriormente.

Motivos que são universalmente encontrados nas enzimas delta-5 dessaturases de animais, plantas e fungos incluem três caixas de histidina (ou seja, H(X)3_4 H [SEQ ID NOs: 1 e 2], H(X)2_3HH [SEQ ID NOs: 3 e 4] e H/Q(X)2- 3HH [ID SEQ NOs: 5 e 6]) e um motivo de ligação heme (ou seja, His-Pro-Gii- Gii ou HPGG [SEQ ID NO: 7]), dentro do domínio citocromo b 5 fundido ao N-

terminal. Um motivo adicional (ou seja, His-Asp-Aia-Ser-His ou HDASH [SEQ ID NO: 8]) parece estar conservado em alguns genes delta-5 dessaturase.

Os termos "delta-5 dessaturase mutante" e "duplo mutante" referem-se a uma delta-5-dessaturase conforme descrito na presente invenção, 5 que tem pelo menos uma mutação no motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) do domínio citocromo b 5 e, pelo menos, uma mutação no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8), em que a dita mutação resulta em uma substituição do aminoácido, seja esta uma substituição conservadora ou não conservadora. Embora as mutações possam incluir qualquer substituição de aminoácido, a delta-5 dessaturase mutante compreende preferencialmente um motivo HPGG mutante (SEQ ID NO: 7) que possui uma sequência His-Xaa-Gii-Xaa ou "HxGx" (SEQ ID NO: 34 ) (em que Xaa pode ser qualquer aminoácido), e um motivo HDASH mutante (SEQ ID NO: 8) que tem uma sequência de His-Xaa-Xaa-Xaa- His ou "HxxxH" (SEQ ID NO: 1). Mais preferivelmente, a delta-5 dessaturase mutante compreende um motivo HPGG mutante selecionado a partir do grupo que consiste de HxGG (SEQ ID NO: 32) e HPGx (SEQ ID NO: 33), e um motivo HDASH mutante selecionado a partir do grupo que consiste de HxASH ( SEQ ID NO: 35), HDxSH (SEQ ID NO: 36), e HDAxH (SEQ ID NO: 37), em que a atividade delta-5 dessaturase da delta-5 dessaturase mutante é pelo menos funcionalmente equivalente a atividade delta-5 dessaturase da delta-5 dessaturase do tipo selvagem. Preferencialmente, o motivo HPGG mutante é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:9 (HgGG), SEQ ID N0:10 (HhGG), SEQ ID N0:11 (HPGs), SEQ ID N0:12 (HcGG), SEQ ID N0:13 (HwGG) e SEQ ID N0:14 (HaGG), e o motivo HDASH mutante é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:15 (HDgSH), SEQ ID N0:16 (HDsSH), SEQ ID N0:17 (HDAaH), SEQ ID N0:18 (HDAgH) e SEQ ID N0:19 (HeASH).

Cada "delta-5 dessaturase mutante" tem uma "delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente". Especificamente, a delta-5 dessaturase mutante e a delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente compartilham sequências de aminoácidos idênticas, com a exceção de que o tipo selvagem compreenderá um motivo HPGG (SEQ ID NO: 7), dentro do 5 domínio citocromo b 5 e um motivo HDASH (SEQ ID NO: 8), enquanto que o mutante compreende pelo menos uma mutação em cada um destes motivos (conforme descrito acima).

Uma delta-5 dessaturase mutante é "pelo menos funcionalmente equivalente" à delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente quando a 1o atividade enzimática e a seletividade específica da delta-5 mutante são essencialmente comparáveis ao da delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente. Assim, uma delta-5 dessaturase mutante funcionalmente equivalente possuirá atividade de delta-5 dessaturase que não é substancialmente reduzida em relação à delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente quando a "eficiência de conversão" de cada uma das enzimas é comparada (ou seja, uma delta-5 dessaturase mutante terá pelo menos cerca de 50-64%, mais preferencialmente pelo menos 60-74%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75-85%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85- 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca 95% da atividade enzimática da delta-5 dessaturase tipo selvagem). Apesar dos intervalos preferidos estarem descritos acima, exemplos úteis de eficiência de conversão inclui qualquer percentual inteiro entre 50% a 100%, tal como 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. A atividade delta-5 dessaturase dos dois polipeptídeos pode ser substancialmente idêntica. Preferencialmente, a delta-5 dessaturase mutante terá atividade enzimática e seletividade específica aumentada quando

' comparada com a delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente, ou seja, terá pelo menos cerca de 101%, 102%, 103%, 104% ou 105%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114% ou 115%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 5 116% ou mais da atividade enzimática da delta-5 dessaturase tipo selvagem.

Os termos "polipeptídeo parenta!" ou "enzima parenta!" referem-se a qualquer polipeptídeo a partir do qual um polipeptídeo ou uma enzima mutante divulgado é derivado. O termo abrange o tipo selvagem, tipo selvagem variante e polipeptídeos tipo selvagem variantes modificados possuindo os 10 motivos de aminoácidos HPGG (SEQ 10 NO: 7) e HOASH (SEQ 10 NO: 8), bem como os polipeptídeos sintéticos e códon-otimizados com base nos mesmos. O termo engloba ainda as versões de polipeptídeos anteriores a partir dos quais diversos sítios de enzimas de restrição foram eliminados.

As delta-5 dessaturases mutantes são designadas usando dois 15 sistemas de nomenclatura diferentes, embora ambos sistemas descrevam as sequências específicas do motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) e HOASH (SEQ 10 NO: 8) no mutante. O primeiro sistema especifica: 1) tipo selvagem, enzima parenta!; 2) hífen (-), 3) motivo HPGG mutante; 4) sublinhado (_); 5) motivo HOASH mutante. O resíduo de aminoácido mutante é apresentado em letras 20 minúsculas. Assim, por exemplo, uma delta-5-dessaturase mutante compreendendo motivos HaGG (SEQ 10 NO: 14) e HOgSH (SEQ 10 NO: 15), derivada da delta-5 dessaturase sintética que foi derivada de Euglena graciilis e códon-otimizada para a expressão na Yarrowia lipolytica (ou seja, "Eg05S") é referida como "Eg05S-HPGs _HOgSH". Alternativamente, esta mesma delta-5- 25 dessaturase mutante pode também ser referida como "E-g05S-36s157g", utilizando o segundo sistema de nomenclatura. Mais especificamente, o motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) do Eg05S está localizado entre os resíduos de aminoácidos 33-36, enquanto que o motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) do Eg05S

• está localizado entre os resíduos de aminoácidos 155-159. Assim, "36s" indica que o resíduo de aminoácido 36 foi modificado a partir do tipo selvagem para Ser, enquanto que "157g" indica que o resíduo de aminoácido 157 foi modificado a partir do tipo selvagem para Gli.

5 Os termos "eficiência de conversão" e "percentual de conversão de substrato" referem-se à eficácia pela qual uma enzima específica (por exemplo, uma dessaturase) pode converter um substrato em produto. A eficiência de conversão é mensurada de acordo com a seguinte fórmula: ([produto]/[substrato + produto])*1 00. Assim, a "eficiência de conversão de 10 DGLA em ARA" refere-se à eficiência de conversão através da qual o substrato DGLA é convertido no produto ARA.

O termo "elongase" refere-se a um polipeptídeo que pode alongar uma cadeia de carbono do ácido graxo para produzir um ácido que é dois carbonos maior do que o ácido graxo substrato sobre o qual a elongase agiu.

15 Este processo de alongamento ocorre em um mecanismo de várias etapas, em associação com a sintase de ácidos graxos, tal como descrito na Patente US

7.659.120. Exemplos de reações catalisadas pelos sistemas elongase são as conversões de GLA em DGLA, STA em ETA, EPA em OPA.

Em geral, a seletividade de substrato das elongases é um tanto 20 ampla, mas segregadas tanto pelo comprimento da cadeia quanto pelo grau e tipo de insaturação. Por exemplo, uma elongase C 14116 irá utilizar um substrato C 14 (por exemplo, ácido mirístico), uma elongase C 16,18 irá utilizar um substrato C16 (por exemplo, palmitato), uma elongase C1s12o irá utilizar um substrato C1s (por exemplo, GLA , STA, LA, ALA) e uma elongase C2o122 [também referida 25 como delta-5 elongase] irá utilizar um substrato C2o (por exemplo, ARA, EPA).

Para os propósitos da presente invenção, podem ser definidos dois tipos distintos de elongases C1s12o: uma delta-6 elongase irá catalisar a conversão de GLA e STA em DGLA e ETA, respectivamente, enquanto que uma delta-9 elongase é capaz de catalisar a conversão de LA e ALA em EDA e ETrA, respectivamente.

É importante notar que algumas elongases têm ampla especificidade e, portanto, uma única enzima pode ser capaz de catalisar 5 várias reações de elongase, por exemplo, agindo dessa forma tanto como uma C1 611a elongase quanto como uma C1a12o elongase. Pode ser desejável determinar empiricamente a especificidade de uma elongase de ácido graxo, transformando um hospedeiro adequado com o gene para a elongase de ácido graxo e determinando o seu efeito sobre o perfil de ácidos graxos do 1o hospedeiro.

Geralmente, o termo "oleaginoso" refere-se aqueles organismos que tendem a armazenar sua fonte de energia na forma de óleo (Weete, em: Funga/ Lipid Biochemistry, 2a Ed., Plenum, 1980). Durante este processo, o teor de óleo celular dos micro-organismos oleaginosos geralmente segue uma curva sigmoide, onde a concentração de lipídeos aumenta até atingir um máximo no final da fase logarítmica ou fase inicial de crescimento estacionário e, em seguida, diminui gradualmente durante o final das fases estacionária e de morte (Yongmanitchai e Ward, App/. Environ. Microbiol. 57:419--25 (1991)).

Para os propósitos do presente pedido de patente e, quando utilizado em relação aos micro-organismos, o termo "oleaginoso" refere-se aos micro- organismos que podem acumular pelo menos cerca de 25% do seu DCW como óleo.

O termo "levedura oleaginosa" refere-se a esses micro- organismos oleaginosos classificados como leveduras que podem produzir óleo, ou seja, no quais o óleo pode se acumular em um excesso de cerca de 25% do DCW destes organismos. Exemplos de leveduras oleaginosas incluem, mas não se limitam aos seguintes gêneros: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces. A capacidade de acumular óleo em um excesso de cerca de 25% do DCW da levedura pode ser por meio de esforços da engenharia recombinante ou por meio das capacidades naturais do organismo.

Aquelas plantas que produzem sementes nas quais o óleo é 5 expresso podem ser referidas como plantas ou culturas "oleaginosas" ou "de sementes oleaginosas". Exemplos de plantas oleaginosas incluem, mas não são limitadas a: soja, girassol, canola, colza, cártamo, linhaça, mostarda, algodão, amendoim, mamona e sésamo.

O termo "substituição conservadora de aminoácido" refere-se a uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma dada proteína por outro aminoácido sem alterar a natureza química ou funcional desta proteína.

Por exemplo, é bem conhecido no estado da técnica que são comuns as alterações em um gene que resulta na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado sítio (mas que não afeta as propriedades estruturais e funcionais da proteína codificada e enovelada). Para os propósitos da presente invenção, "substituições conservadoras de aminoácidos" são definidas como o intercâmbio dentro de um dos cinco grupos a seguir:

1. Alifáticos pequenos, resíduos apoiares ou pouco polares: Ala [A], Ser [S], Tre [T] (Pro [P], Gli [G]);

2. Polar, resíduos carregados negativamente e suas amidas: Asp [D], Asn [N], Glu [E], Gln [Q];

3. Polar, resíduos carregados positivamente: His [H], Arg [R], Lis [K];

4. Alifático grande, resíduos apoiares: Met [M], Leu [L], lle [1], Vai [V] (Cis [C]); e

5. Resíduos aromáticos grandes: Fen [F], Tir [Y], Trp [W].

Assim, Ala, um aminoácido ligeiramente hidrofóbico, pode ser substituído por outro resíduo menos hidrofóbico (por exemplo, Gli). Da mesma forma, as alterações que resultam na substituição de um resíduo de carga negativa por outro (tal como Asp por Glu) ou de um resíduo de carga positiva por outro (tal como a alteração de Lis por Arg) também podem ser esperadas 5 para produzir um produto funcionalmente equivalente. Assim, substituições conservadoras de aminoácidos geralmente mantém a estrutura da cadeia principal polipeptídica na área da substituição; a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo; ou o volume da cadeia lateral. Adicionalmente, em muitos casos, pode-se esperar que alterações das porções N-terminal e C- terminal da molécula de proteína não altere a atividade da proteína.

O termo "substituição de aminoácido não conservadora" refere-se a uma substituição de aminoácido em que a produção de uma maior alteração nas propriedades da proteína é geralmente esperada. Assim, por exemplo, uma substituição de aminoácido não conservadora seria aquela em que: 1) um resíduo hidrofílico é substituído por um resíduo hidrofóbico (por exemplo, Ser ou Tre por Leu, lle, Vai), 2) uma Cis ou Pro é substituída pela/por qualquer outro resíduo; 3) um resíduo com uma cadeia lateral eletropositiva é substituído pela/por um resíduo eletronegativo (por exemplo, Lis, Arg ou His pela/por Asp ou Glu); ou, 4) um resíduo com uma cadeia lateral volumosa é substituído por um que não possui cadeia lateral, por exemplo, Fen por Gli. Ocasionalmente, substituições de aminoácidos não conservadoras entre dois dos cinco grupos não afetará a atividade da proteína codificada.

O termo "polinucleotídeo", "sequência de polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico isolado" são usados de maneira intercambiável na presente invenção. Esses termos incluem sequências de nucleotídeos e similares. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou fita-dupla, que contém opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou modificadas. Um polinucleotídeo na forma de um polímero de DNA pode ser composto por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou misturas destes. Os nucleotídeos (normalmente encontrados em sua forma 5' - monofosfato) são referidos por suas designações de letra única 5 da seguinte forma: "A" para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deoxicitidilato, "G" para guanilato ou deoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para deoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para o G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina e "N" para qualquer nucleotídeo.

Um fragmento de ácido nucleico é "hibridizável" a outro fragmento de ácido nucleico, tal como um DNA, DNA genômico, ou molécula de RNA, quando uma forma de fita-simples do fragmento de ácido nucleico pode parear com o fragmento de ácido nucleico sob condições adequadas de temperatura e força iônica da solução. As condições de hibridização e de lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T.

Molecular C/oning: A Laboratory Manual, 2a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory:.

Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989) (Sambrook et a/.), o qual é incorporado ao presente pela referência, especialmente o Capítulo 11 e Tabela 11.1. As condições de temperatura e força iônica determinam a "estringência" da hibridização. Condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, (tais como sequências homólogas a partir de organismos distantemente relacionados) até fragmentos muito similares (tais como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos estreitamente relacionados). A lavagem pós-hibridização determina as condições de estringência. Um conjunto de condições preferenciais usa uma série de lavagens iniciais com 6X SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente por 15 min, em seguida, repetido com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 °C por 30 min, e depois repetido duas vezes com 0,2 X SSC, 0,5% de SDS a 50 °C por

30 min. Um conjunto de condições de estringência mais preferido utiliza altas temperaturas em que lavagens são idênticas às mencionadas anteriormente, exceto que a temperatura das duas últimas lavagens de 30 minem 0,2 X SSC, 0,5% de SDS foi aumentada para 60 °C. Outro conjunto de condições de 5 estringência preferenciais usa duas lavagens finais em O X SSC, O, 1% de SDS a 65 °C. Um conjunto adicional de condições de estringência inclui a hibridização em O X SSC, O, 1% de SDS a 65 °C e lavagens com 2X SSC, O, 1% de SDS, seguido por O, 1 X SSC, O, 1% de SDS, por exemplo.

A hibridização exige que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, contudo, dependendo da estringência da hibridização, pareamentos inadequados entre as bases são possíveis. A estringência adequada para hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas no estado da técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre as duas sequências de nucleotídeos, maior o valor de ponto de fusão térmica ["T m"] para híbridos de ácidos nucleicos com essas sequências. A estabilidade relativa, correspondendo a um T m maior, de hibridizações de ácidos nucleicos diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, ONA: R NA, ONA: ONA. Para híbridos com mais de 100 nucleotídeos de comprimento, foram obtidas equações para o cálculo do T m (vide Sambrook et a/. Supra, 9,509,51). Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, ou seja, oligonucleotídeos, a posição de pareamentos inadequados se torna mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade (vide Sambrook et a/. Supra, 11,7-11 ,8). Em um exemplo de realização, o comprimento de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 1O nucleotídeos. Preferencialmente, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, e mais preferencialmente ainda de pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Além disso, o técnico hábil no assunto irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário de acordo com fatores como o comprimento 5 da sonda.

Uma "porção substancial" de um aminoácido ou uma sequência de nucleotídeos é a porção que compreende uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou sequência de nucleotídeos de um gene que é suficiente para identificar putativamente o polipeptídeo ou gene, seja pela avaliação manual da sequência por um técnico do assunto, ou por comparação e identificação de sequência automatizada por computador utilizando algoritmos como o "BLAST" (Basíc Local Alignment Search Tool- Altschul, S.F., et a/. J.

Moi. Biol., 215:403410 (1993)). Em geral, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou de trinta ou mais nucleotídeos é necessária para identificar putativamente um polipeptídeo ou sequência de ácidos nucleicos como homóloga a um gene ou proteína conhecida. Além disso, com relação às sequências nucleotídicas, sondas de oligonucleotídeos gene específicas compreendendo de 20-30 nucleotídeos contíguos podem ser usadas em métodos de identificação de genes dependente de sequência (por exemplo, a hibridização Southem) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas de bacteriófago). Além disso, oligonucleotídeos curtos de 12-15 bases podem ser usados como primers para amplificação por PCR, a fim de se obter um fragmento de ácido nucleico específico compreendendo os primers. Assim, uma "porção substancial" de uma sequência de nucleotídeos compreende o suficiente da sequência para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento de ácido nucleico que compreende a dita sequência. A presente divulgação ensina as sequências de aminoácido e nucleotídeos completas que codificam proteínas dessaturase específicas. O técnico hábil assunto, possuindo o benefício das sequências descritas na presente invenção, pode agora utilizar a totalidade ou uma porção substancial das sequências reveladas para fins conhecidos aos técnicos hábeis neste assunto. Assim, as sequências completas conforme descrito na Listagem 5 de Sequências anexa, bem como as porções substanciais dessas sequências conforme definido acima, são abrangidas pela presente divulgação.

O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Assim, são englobados na presente divulgação os fragmentos de ácidos nucleicos isolados que são complementares às sequências completas conforme descrito na Listagem de Sequências anexa, bem como aquelas sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares.

Os termos "homologia" e "homólogo" são usados de maneira intercambiável. Eles referem-se a fragmentos de ácidos nucleicos ou polipeptídeos que possuem sequências semelhantes, mas não idênticas. Estes termos algumas vezes também se referem a modificações dos fragmentos de ácido nucleico, (por exemplo, por meio da deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos) que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante em relação ao fragmento inicial, não modificado. Fica deste modo compreendido, assim como os técnicos hábeis no assunto compreenderão, que a invenção abrange mais do que as sequências exemplares específicas.

Além disso, os técnicos hábeis no assunto irão reconhecer que as sequências homólogas de ácido nucleico são definidas pela capacidade destas de se hibridizarem sob condições de estringência moderada, por exemplo, 0,5X SSC, O, 1% de SDS, 60 °C, com as sequências exemplificadas na presente invenção, ou com qualquer porção das sequências nucleotídicas divulgadas na presente invenção, e que são funcionalmente equivalentes a estas. Condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas a partir de organismos distantemente relacionados, a fragmentos muito similares, tais 5 como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos estreitamente relacionados.

O termo "hibridiza seletivamente" refere-se a hibridização de uma sequência de ácido nucleico sob condições estringentes de hibridização à uma sequência ácido nucleico alvo especificada em um grau detectável maior (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre a marcação de fundo (background)) do que a sua hibridação a uma sequência de ácidos nucleicos não alvo e até a exclusão significativa dos ácidos nucleicos não alvo. As sequências que hibridizam seletivamente têm normalmente cerca de pelo menos 80% de identidade de sequência, ou 90% de identidade de sequência, e até inclusive 100% de identidade de sequência (ou seja, as sequências são totalmente complementares entre si).

"Identidade de sequência" e "identidade" no contexto de ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos refere-se às bases de ácidos nucleicos ou resíduos de aminoácidos em duas sequências que são iguais quando alinhadas para uma correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

Os métodos para determinar a "porcentagem de identidade" e "porcentagem de similaridade" estão codificados em programas de computador publicamente disponíveis. A "porcentagem de identidade" e "porcentagem de similaridade" podem ser facilmente calculadas por meio de métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando aos descritos em: 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2) Biocomputinq: lnformatics and Genome Projects (Smith, O. W., Ed.)

Academic: NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, PartI (Griffin, A.

M., e Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e 5) Sequence Analysis Primer(Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

5 Os alinhamentos da sequência e os cálculos da porcentagem de identidade e similaridade podem ser determinados por meio de uma variedade de métodos de comparação para a detecção de sequências homólogas, incluindo, mas não se limitando ao programa Megalign®, da LASERGENE® bioinformática computação (DNASTAR® Inc., Madison, Wl). O alinhamento 1o múltiplo das sequências é realizado utilizando o "método de alinhamento Clustal", que abrange diversas variedades do algoritmo, incluindo o "método de alinhamento Clustal V" e o "método de alinhamento Clustal W" (descrito por Higgins, D.G. et a/. Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAiign® (versão 8.0.2) (supra). Após o alinhamento das sequências, utilizando ambos os programas Clustal, é possível obter uma "porcentagem de identidade" pela visualização da tabela "distâncias de sequência" no programa.

Para alinhamentos múltiplos, utilizando o método de alinhamento de Clustal V, os valores pré-definidos (padrão) correspondem a GAP PENALTY = 1O e GAP LENGTH PENALTY = 1O. Os parâmetros pré-definidos (padrão) para alinhamentos pareados e o cálculo da porcentagem de identidade das sequências de proteínas utilizando o método Clustal V são KTUPLE = 1, GAP PENAL TY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5. Para ácidos nucleicos estes parâmetros são KTUPLE = 2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4.

Os parâmetros pré-definidos para o alinhamento múltiplo utilizando o método de alinhamento de Clustal W correspondem a GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Oelay Divergen Seqs(%)=30,

DNA Transition Weight=O. 5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB.

O "método de alinhamento BLASTN" é um algoritmo fornecido pelo Centro Nacional de Informações em Biotecnologia (National Center for 5 Biotechnology lnformation - "NCBI") para comparar as sequências de nucleotídeos utilizando parâmetros padrões, enquanto o "método de alinhamento BLASTP" é um algoritmo fornecido pelo NCBI para comparar as sequências de proteína usando parâmetros padrões.

É bem compreendido por um técnico no assunto que muitos níveis de identidade da sequência são úteis na identificação de polipeptídeos, a partir de outras espécies, onde tais polipeptídeos têm a mesma ou similar função ou atividade. Fragmentos de ácido nucleicos adequados, ou seja, polinucleotídeos isolados de acordo com a presente divulgação, codificam polipeptídeos que são pelo menos 70-85% idênticos, enquanto que os fragmentos de ácidos nucleicos mais preferidos codificam sequências de aminoácidos que são pelo menos 85-95% idênticas às sequências de aminoácidos divulgadas no presente. Apesar dos intervalos preferidos estarem descritos acima, exemplos úteis de porcentagem de identidade inclui qualquer percentual inteiro entre 50% a 100%, tal como 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Além disso, é de interesse qualquer complemento de comprimento total ou parcial deste fragmento de nucleotídeos isolados.

Fragmentos de ácidos nucleicos adequados não só possuem as homologias acima, mas normalmente codificam um polipeptídeo possuindo pelo menos 50 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 100 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 150 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 200 aminoácidos, e mais preferencialmente pelo menos 250 aminoácidos.

A "degenerescência do códon" refere-se a natureza do código genético que permite uma variação na sequência de nucleotídeos sem afetar a 5 sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Deste modo, é descrito na presente invenção qualquer fragmento de ácido nucleico que codifica toda ou uma porção substancial da sequência de aminoácidos que codifica os presentes polipeptídeos conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 157' 181, 183, 185, 187,213,215,217, 255, 260, 271 e 276.

Os técnicos hábeis no assunto estão cientes do "códon-bias" exibido por uma célula hospedeira específica no uso de códons nucleotídicos para especificar um determinado aminoácido. Portanto, quando sintetizando um gene para a expressão melhorada em uma célula hospedeira, é desejável projetar o gene de forma que a frequência dos códons de uso preferencial (codon usage) se aproxime da frequência dos códons de uso preferencial da célula hospedeira.

Os "genes sintéticos" podem ser montados a partir de blocos de construção de oligonucleotídeos que são quimicamente sintetizados utilizando procedimentos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Esses blocos de construção de oligonucleotídeos são anelados e, em seguida, ligados para formar segmentos de genes que são então montados enzimaticamente para a construção do gene completo. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para a expressão ideal do gene com base na otimização da sequência de nucleotídeos para refletir o codon-bias da célula hospedeira. O técnico hábil no assunto aprecia a probabilidade de uma expressão gênica bem sucedida se o códon de uso preferencial (codon usage) tende a favorecer aqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferenciais pode ser baseada em uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira, onde a informação de sequência está disponível. Por exemplo, o perfil do códon de uso preferencial (codon usage) para a Yarrowia lipolytica é fornecida na Patente US 7 .125.672.

5 "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, e que pode referir-se à região codificante sozinha ou pode incluir sequências de regulação a montante e/ou a jusante da região codificante (por exemplo, regiões 5' não traduzidas a montante do sítio de início da transcrição da região codificante, regiões 3' não codificantes). "Gene nativo" 1o se refere a um gene como encontrado na natureza, com as suas próprias sequências regulatórias. "Gene quimérico" se refere a qualquer gene que não é um gene nativo, incluindo sequências regulatórias e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente um gene quimérico pode incluir sequências regulatórias e sequências codificantes que são provenientes de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua posição natural no genoma de um organismo. Um gene "exógeno" ou "estrangeiro" refere-se a um gene que é introduzido em um organismo hospedeiro por transferência gênica. Os genes estrangeiros podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, genes nativos introduzidos em um novo local dentro do hospedeiro nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação. Um "gene códon-otimizado" é um gene que possui a sua frequência de utilização do códon projetado para imitar a frequência do uso do códon preferencial da célula hospedeira.

"Sequência codificante" refere-se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácido específico. "Sequências reguladoras"

referem-se a sequências nucleotídicas localizadas a montante do sítio de inicio da transcrição da sequência codificante, regiões 5' não traduzidas e regiões 3' não codificantes, e que podem influenciar a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou a tradução da sequência codificante associada. As 5 sequências reguladoras podem incluir, mas não estão limitadas a: promotores, facilitadores (enhancers), sequências líderes 5' não traduzidas, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítio de ligação efetora e estrutura stem-loop.

O termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma sequência promotora está localizada 5' a montante de uma sequência codificante. Os promotores podem ser obtidos em sua totalidade a partir de um gene nativo, ou podem ser compostos por diversos elementos provenientes de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintético. É compreendido pelos técnicos no assunto que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso em quase todos os estágios do crescimento e/ou desenvolvimento celular são comumente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, como na maioria dos casos os limites exatos das sequências reguladoras (especialmente em suas extremidades 5') não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA com algumas variações podem ter atividade promotora idêntica.

Os termos "sequência 3' não codificante", "terminador da transcrição", "terminador" e "sequências terminadoras" referem-se a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificante. Isso inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificantes de sinais regulatórios capazes de afetar o processamento do mRNA ou da expressão gênica. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico na 5 extremidade 3' do mRNA precursor. A região 3' pode influenciar a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou a tradução da sequência codificante associada.

"Transcrito de RNA" refere-se ao produto resultante a partir da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA.

Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, ela é referida como transcrito primário. Um transcrito de RNA é referido como RNA maduro quando ele é uma sequência de RNA derivada do processamento pós-transcricional do transcrito primário. O "RNA mensageiro" ou "mRNA" refere-se ao RNA, que está sem íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar a, sintetizados a partir de, um mRNA molde usando a enzima transcriptase reversa. O cDNA pode ser de fita simples ou convertido na forma de dupla-fita utilizando fragmentos Klenow da DNA polimerase I. O termo "sense" refere-se ao transcrito RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou sistema in vitro. RNA "antisense" refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a totalidade ou parte de um transcrito primário alvo ou mRNA, e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente US

5.1 07.065).

O termo "operacionalmente ligado" refere-se a associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando esta é capaz de afetar a expressão da sequência codificante, ou seja, a sequência codificante está sob o controle transcricional do promotor. As sequências codificantes podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação sense ou antisense.

O termo "recombinante" refere-se a uma combinação artificial de 5 dois segmentos diferentes separados de uma sequência, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos através de técnicas de engenharia genética.

O termo "expressão", conforme utilizado no presente, refere-se à transcrição e acúmulo estável de RNA sense (RNAm) ou antisense. A expressão também inclui a tradução do mRNA em proteína (tanto o precursor quanto o maduro).

O termo "transformação" refere-se à transferência de uma molécula de ácido nucleico para dentro de um organismo hospedeiro, resultando na herança geneticamente estável. A molécula de ácido nucleico pode ser, por exemplo, um plasmídeo que se replica de forma autônoma, ou ela pode se integrar ao genoma do organismo hospedeiro. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácidos nucleicos transformados são referidos como organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados" ou "modificados".

Os termos "plasmídeo" e "vetor" referem-se a um elemento extracromossômico que geralmente carregam genes que não fazem parte do metabolismo central da célula e frequentemente estão sob a forma de fragmentos de DNA circular de fita dupla. Tais elementos podem ter sequências que se replicam autonomamente, sequências de integração ao genoma, fago ou sequências de nucleotídeos, e podem ser lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou de fita-dupla, derivados de qualquer fonte, no qual um variedade de sequências nucleotídicas foram unidas ou recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um(alguns) cassete(s) de expressão dentro da célula.

O termo, "cassete de expressão" refere-se ao fragmento de DNA compreendendo a sequência codificante de um gene selecionado e as sequências reguladoras anteriores (sequências 5' não codificantes) e 5 posteriores (sequências 3' não codificantes) à sequência codificante que são necessárias para a expressão do produto gênico selecionado. Desse modo, um cassete de expressão é geralmente composto de: 1) um promotor, 2) uma sequência codificante [ou seja, ORF], e 3) um terminador que geralmente contém um sítio de poliadenilação nos eucariotos. O(s) cassete(s) de expressão está(estão) normalmente incluído(s) dentro de um vetor, para facilitar a clonagem e a transformação. Os diferentes cassetes de expressão podem ser transformados em diferentes organismos, incluindo bactérias, fungos, e células de vegetais e mamíferos, contanto que as sequências reguladoras corretas sejam usadas para cada hospedeiro.

Os termos "construção recombinante", "construção de expressão", "construção quimérica", "construção" e "construção de DNA recombinante" são utilizados de maneira intercambiável na presente invenção. A construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências regulatórias e sequências codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção recombinante pode compreender um ou mais cassetes de expressão. Em outro exemplo, uma construção de DNA recombinante pode compreender sequências regulatórias e sequências codificantes que são provenientes de diferentes fontes, ou sequências regulatórias e sequências codificantes derivadas da mesma origem, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tais construções podem ser usadas sozinhas ou podem ser usadas em conjunto com um vetor. Se um vetor é utilizado, então a escolha do vetor é dependente do método que será usado para transformar células hospedeiras, como é bem conhecido pelos técnicos hábeis no assunto.

Por exemplo, um vetor plasmidial pode ser usado.

Os técnicos no assunto são bem conscientes dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor, a fim de transformar, selecionar 5 e propagar com sucesso células hospedeiras compreendendo qualquer um dos fragmentos de ácidos nucleicos isolados descritos na presente invenção. Os técnicos no assunto também reconhecerão que diferentes eventos de transformação independentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et a/. EMBO J. 4:2411 2418 (1985), De Almeida et ai. Mo/.

Gen. Genetics 218:78 86 (1989)) e, portanto, que vários eventos devem ser selecionados afim de se obter cepas ou linhagens exibindo o nível e o padrão de expressão desejado. Essa seleção pode ser realizada pela análise do DNA pelo método de Southern, análise da expressão do mRNA pelo método de Northern, e análise da expressão proteica pelo método Western, ou análise fenotípica, dentre outras.

Os termos "célula hospedeira" e "organismo hospedeiro" são utilizados na presente invenção de modo alternado e referem-se a qualquer organismo, tal como um micro-organismo ou uma planta (isto é, uma planta de semente oleaginosa), que é capaz de receber genes exógenos ou heterólogos e capaz de expressar esses genes. Uma "célula hospedeira recombinante" refere-se a uma célula hospedeira que tenha sido modificada de forma recombinante.

A expressão "software de análise de sequência" refere-se a qualquer algoritmo ou programa de computador que seja útil para a análise de sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. "Software de análise de sequência" pode ser comercialmente disponível ou desenvolvido de forma independente. Softwares de análise de sequência típicos incluem, mas não estão limitados a: 1) o suíte GCG de programas (Wisconsin Package versão

9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl); 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Aitschul et a/. J. Mo/. Biol. 215, 403410); 3) DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), 4) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml); e 5) programa FASTA incorporando o algoritmo Smith-Waterman (Pearson, W. R.

5 Comput. Methods Genome Res., [Proc. lnt. Symp] (1994) Meeting Date 1992,

111120. Ed(s). Suhai, Sandor. Plenum, Nova Iorque, NY). Dentro desta descrição, sempre que um software de análise de sequência é usado para a análise, os resultados analíticos são baseados nos "valores predeterminados" do programa mencionado, salvo quando especificado de outro modo. Conforme utilizado no presente "valores predeterminados" (default) ou "valores-padrão" significa qualquer conjunto de valores ou parâmetros originalmente carregados com o software quando este é inicializado pela primeira vez.

Técnicas-padrão de DNA recombinante e clonagem molecular usadas na presente invenção são bem conhecidas no estado da técnica e estão descritas em maiores detalhes em Sambrook, et a/; por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984) (doravante "Silhavyu et a/."); e por Ausubel, F. M. et a/., Current Protocols in Molecular Biology, publicado pela Greene Publishing Assoe. & Wiley lnterscience, Hoboken, NJ (1987) (doravante como "Ausubel et a/.").

A FIG. 1A e FIG. 18 em conjunto definem múltiplas vias para a produção de ácido graxo ômega-3/ômega-6, conforme descrito abaixo. Todas as vias necessitam da conversão inicial de ácido oleico em ácido linoleico ["LA"], o primeiro dos ácidos graxos ômega-6, por um delta-12 dessaturase. Então, usando a "via da delta-9 elongase/ delta-8 dessaturase" e LA como substrato, os seguintes ácidos graxos ômega-6 de cadeia longa são formados: 1) LA é convertido em ácido eicosadienóico ["EDA"] por uma delta-9 elongase, 2) EDA é convertido em ácido dihomo-y-linolênico ["DGLA"] por uma delta-8 dessaturase, 3) OGLA é convertido em ácido araquidônico ["ARA"] por uma delta-5 dessaturase, 4) ARA é convertido em ácido docosatetraenóico ["OTA"] por uma C 20122 elongase; e 5) DTA é convertido em ácido docosapentaenóico ["OPAn-6"] por uma delta-4 dessaturase.

5 A "via delta-9 elongase/ delta-8 dessaturase" pode também utilizar ácido a-linolênico ["ALA"] como substrato para produzir os seguintes ácidos graxos ômega-3: 1) LA é convertido em ALA, o primeiro dos ácidos graxos ômega-3, por uma delta-15 dessaturase; 2) ALA é convertido em ácido eicosatrienóico ["ETrA"] pela delta-9 elongase, 3) ETrA é convertido em ácido eicosatetraenóicos ["ETA"] por uma delta-8 dessaturase, 4) ETA é convertido em ácido eicosapentaenóico ["EPA"] por uma delta-5 dessaturase, 5) EPA é convertido em ácido docosapentaenóico ["OPA"] por uma C2o122 elongase; e 6) OPA é convertido em ácido docosahexaenóico ["OHA"] por uma delta-4 dessaturase. Opcionalmente, os ácidos graxos ômega-6 podem ser convertidos em ácidos graxos ômega-3. Por exemplo, o ETA e EPA são produzidos a partir do OGLA e ARA, respectivamente, pela atividade da delta-17 dessaturase.

As vias alternativas para a biossíntese de ácidos graxos ômega- 3/ômega-6 utilizam uma delta-6 desaturase e C1a12o elongase, ou seja, a "via da delta-6 dessaturase I delta-6 elongase". Mais especificamente, LA e ALA podem ser convertidos em GLA e ácido estearidônico ["STA"], respectivamente, por uma delta-6 dessaturase e, então, uma C1a12o elongase converte o GLA em OGLA e/ou STA em ETA. PUFAs a jusante são posteriormente formados conforme descrito acima.

Contempla-se que as funcionalidades específicas necessárias para serem introduzidas em um organismo hospedeiro específico para a produção de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 irá depender da célula hospedeira (e seu perfil nativo de PUFA e/ou perfil desaturase I elongase), o disponibilidade de substrato e do(s) produto(s) final(ais) desejado(s). Por

" . 46 exemplo, a expressão da via delta-9 elongase/delta-8 dessaturase pode ser preferida em alguns exemplos de realização, em oposição à expressão da via delta-6 dessaturase/delta-6 elongase, uma vez que as PUFAs produzidas através da via anterior são desprovidas de GLA e/ou STA.

5 Um técnico do assunto será capaz de identificar vários genes candidatos que codificam cada uma das enzimas desejadas para biossíntese de ácidos graxos ômega-3/ômega-6. As sequências úteis da dessaturase e elongase podem ser derivadas de qualquer fonte, por exemplo, isoladas a partir de uma fonte natural (a partir de bactérias, algas, fungos, plantas, animais, etc), 1o produzidas através de uma via semi-sintética, ou sintetizadas de novo. Embora a fonte específica dos genes da dessaturase e elongase introduzidos no hospedeiro não seja crítica, as considerações para a escolha de um polipeptídeo específico possuindo atividade dessaturase ou elongase incluem: 1) especificidade de substrato do polipeptídeo, 2) se o polipeptídeo ou um 15 componente deste é uma enzima limitante da velocidade, 3) se a dessaturase ou elongase é essencial para a síntese de um PUFA desejado, 4) os cofatores necessários pelo polipeptídeo, e/ou, 5) se o polipeptídeo foi modificado após a sua produção (por exemplo, uma quinase ou preniltransferase). O polipeptídeo expresso tem preferencialmente parâmetros compatíveis com o ambiente 20 bioquímica da sua localização na célula hospedeira (vide a Patente US

7.238.482 para detalhes adicionais).

É também útil considerar a eficiência de conversão de cada dessaturase e/ou elongase em particular. Mais especificamente, uma vez que cada enzima raramente funciona com 100% de eficiência para converter 25 substrato em produto, o perfil lipídico final de óleos não purificados produzido em uma célula hospedeira será tipicamente uma mistura de vários PUFAs consistindo do ácido graxo ômega-3/ômega-6 desejado, bem como vários PUFAs intermediários a montante. Assim, a eficiência de conversão de cada

.. 47 enzima é também uma variável a ser considerada, quando a otimização da biossíntese de um ácido graxo é desejada.

Tendo cada uma das considerações acima em mente, os genes candidatos que possuem as atividades de dessaturase e elongase apropriadas 5 (por exemplo, a delta-6 dessaturases, C 1812o elongases, delta-5 dessaturases, delta-17 dessaturases, delta-15 dessaturases, delta-9 dessaturases, delta-12 dessaturases, c14/16 elongases, c16/18 elongases, delta-9 elongases, delta-8 dessaturases, delta-4 dessaturases e C 20122 elongases) podem ser identificados de acordo com a literatura publicamente disponível (por exemplo, GenBank), a 10 literatura patentária, e análise experimental de organismos com a capacidade de produzir PUFAs. Esses genes serão adequados para a introdução em um organismo hospedeiro específico, para ativar ou aumentar a síntese de PUFAs no organismo.

Uma vez que os ácidos graxos são sintetizados em um organismo 15 (incluindo ácidos graxos saturados e insaturados e ácidos graxos de cadeia curta e de cadeia longa), eles podem ser incorporados em TAGs. TAGs são a unidade de armazenamento primária de ácidos graxos.

A maioria das enzimas delta-5 dessaturase identificadas até o momento têm a capacidade primária de converter DGLA em ARA, com 20 atividade secundária na conversão de ETA em EPA. Diversas delta-5 dessaturases foram divulgadas tanto na literatura aberta quanto na literatura de patentes. Características gerais das delta-5 dessaturases, com base na evolução da dessaturase, estão bem descritas por P. Sperling et a/.

(Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids,68 :73-95 (2003). Juntamente com 25 a delta 6, delta-8 e delta-4 dessaturases, as delta-5 dessaturases são conhecidas como dessaturases "front-end' de PUFA de cadeia longa (em que a dessaturação ocorre entre uma ligação dupla pré-existente e a extremidade carboxila do grupo acila do ácido graxo, em oposição à dessaturação meti!-

dirigida). Essas dessaturases são caracterizadas por três caixas de histidina [H(X)3_4H (SEQ ID NOs: 1 e 2), H(X)2_ 3 HH (SEQ ID NOs: 3 e 4) e de H/Q(X)z_ 3 HH (SEQ ID NOs: 5 e 6)] e são membros da superfamília de fusão do citocromo bs, uma vez que possuem um domínio citocromo b 5 fundido no seu 5 N-terminal, que serve como um doador de elétrons. O domínio citocromo b 5 também contém um motivo de ligação a heme conservado (isto é, uma sequência HPGG [SEQ ID NO: 7]), apesar de divergirem das sequências de domínio citocromo bs restantes. Um motivo adicional previamente identificado em algumas delta-5 dessaturases também parece ser rico em histidina (isto é, uma sequência HDASH [SEQ ID NO: 8]), embora a importância do motivo HDASH para a atividade enzimática ainda não ter sido elucidada.

Diversos estudos sugerem que o motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) está implicado na atividade enzimática. Sayanova, O. et a/. (P/ant Physiol., 121:641 (1999)) realizaram mutagênese sítio-dirigida para substituir o resíduo His do motivo HPGG por um resíduo Ala na delta 6-dessaturase de barragem.

A enzima mutante foi expressa em Arabídopsis, no entanto, nenhuma atividade enzimática pode ser mensurada, o que sugere que o resíduo His no motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) do domínio citocromo b 5 da dessaturase era importante para a função. Um estudo semelhante foi realizado em uma delta-6 dessaturase de rato, onde uma substituição de Ala por His foi manipulada dentro do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7). A proteína mutante também não teve atividade (Guillou, H., et a/., J. Lípíd Res., 45:32-40 (2004)). Mais recentemente, Hongsthong, A. et a/. (Appl. Mícrobíol. Biotechnol., 72:1192-1201 (2006)) relataram a substituição do resíduo His do motivo HPGG (SEQ ID NO: motif 7) por um resíduo Ala na delta-6 dessaturase de Spírulína. Assim como nas divulgações anteriores, a mutação tornou a enzima mutante incapaz de produzir GLA em E. co/i, o que sugere que o domínio citocromo b 5 era importante para a atividade e as alterações no resíduo His do motivo HPGG

" . 49 (SEQ ID NO: 7) resultará em uma atividade enzimática reduzida. Embora estas enzimas delta-5 dessaturases sejam relativamente comuns e bem caracterizadas, ainda permanece uma necessidade de enzimas que são eficientemente expressas em níveis elevados em células hospedeiras de 5 produção capazes de produzirem PUFAs.

Conforme foi mencionado acima, as delta-5 dessaturases possuem diversas sequências conservadas. No entanto, apenas o motivo de ligação a heme (ou seja, HPGG [SEQ ID NO: 7]) e o motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) carecem de variação dentro da sequência. Estes motivos foram 10 selecionados como alvos para mutagênese na presente invenção. Embora a importância do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) para a função enzimática não estar clara, a literatura sugere que pelo menos o resíduo His do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) é importante para a função. Consequentemente, as substituições nos resíduos His em ambos os motivos foram evitadas em favor 15 de substituições nos resíduos remanescentes.

A Patente US 201 0-0075386-A 1 descreve a mutagênese sítio- dirigida do resíduo Pro e do segundo resíduo Gli dentro do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) de diversas delta-5 dessaturases, seguido da expressão dos polipeptídeos mutantes resultantes e determinação de suas atividades com 20 relação a enzima tipo selvagem. Esse pedido divulgou a criação de várias delta-5 dessaturases mutantes compreendendo motivos de aminoácidos mutantes, incluindo HxGG (SEQ ID NO: 32) e HPGx (SEQ ID NO: 33), em que a atividade delta-5 dessaturase da delta-5 dessaturase mutante era funcionalmente equivalente à atividade delta-5 dessaturase da enzima delta-5 25 dessaturase do tipo selvagem correspondente.

Existem diversos protocolos de mutagênese sítio-dirigida [por exemplo, lshii, T. M., et ai., Methods Enzymol., 293:53-71 (1998); Ling M. M. e B.H. Robinson, Anal. Biochem., 254:157-178 (1997); Braman J. (ed.) In Vitro

Mutagenesís Protocols. 2nd Ed., Humania: Totowa, NJ (2002); Kunkel T. A, et ai., Methods Enzymol., 154:367-382 (1987); Sawano A e Miyawaki, A Nucleíc Acíds Res., 28:e78 (2000)]; no entanto, o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) foi selecionado para utilização com 5 base em sua fácil execução e alta eficiência. O procedimento básico utiliza um vetor de ONA de cadeia dupla superenrolado, com uma inserção de interesse e dois prímers de oligonucleotídeos sintéticos contendo a mutação desejada. Os prímers de oligonucleotídeos, cada um complementar com as cadeias opostas do vetor, estendem-se durante os ciclos de temperatura por uma ONA 1o polimerase. A incorporação dos primers de oligonucleotídeos gera um plasmídeo mutado contendo cortes desiguais (staggered nicks). Seguindo a temperatura de cilclagem, o produto é tratado com endonuclease Dpnl (específica para ONA metilado e hemi-metilado) como um meio de digerir o ONA molde parenta! e selecionar o ONA mutante recém-sintetizado. O ONA vetor cortado contendo as mutações desejadas é então transformado e propagado em um hospedeiro Escherichia co/i.

Usando as técnicas descritas acima, a mutagênese sítio-dirigida foi realizada de forma independente sobre os resíduos Asp[O], Ala[A] e Ser[S] dentro do motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) de diversas delta-5 dessaturases, seguido pela expressão dos polipeptídeos mutantes resultantes e da determinação das suas atividades em relação à enzima do tipo selvagem.

Surpreendentemente, diversas delta-5 dessaturases mutantes foram criadas compreendendo motivos mutantes de aminoácidos, incluindo HxASH (SEQ 10 NO: 35), HOxSH (SEQ 10 NO: 36) e HOAxH (SEQ 10 NO: 37), em que a atividade delta-5 dessaturase da enzima delta-5 dessaturase mutante foi funcionalmente similar à atividade delta-5 dessaturase da enzima delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente.

Por exemplo, todas as possíveis substituições de aminoácidos para o resíduo Ala no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) foram introduzidas por mutagênese sítio-dirigida em uma delta-5 dessaturase variante tipo selvagem modificada derivada de Euglena gracilis dentro de uma construção de plasmídeo quimérico compreendendo um gene quimérico 5 FBAIN::EgD5R*::Pex20 (ou seja, EgD5R* [SEQ ID NO: 27], carecendo de quatro sítios de enzimas de restrição internos dentro do gene e compreendendo uma Arg na posição 347 em vez de uma Ser, quando comparado com o EgD5 [SEQ ID NO: 21]). Os plasmídeos com as sequências mutadas foram individualmente transformados em E. co/i, sequenciados e, em 1o seguida, transformados em uma cepa adequada de Yarrowia lipolytica previamente programada para produzir - 18% de DGLA. Este permite rastrear a atividade delta-5 dessaturase com base na produção de ARA (ou seja, por meio de análises por CG).

Foram identificadas muitas mutações que resultaram em delta-5 dessaturases mutantes possuindo atividade delta-5 dessaturase substancialmente diminuída em relação a enzima do tipo selvagem. Entretanto, de modo surpreendente, o rastreio preliminar identificou dois resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos para a Ala dentro do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) que resultou em uma atividade delta-5 dessaturase, aproximadamente, equivalente ou maior no mutante, quando comparada com a atividade delta-5 dessaturase da enzima de tipo selvagem correspondente (ou seja, EgD5R*). Assim, essa experimentação preliminar sugeriu que o resíduo de Ala no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) poderia ser substituído por Gli ou Ser sem afetar significativamente a atividade delta-5 dessaturase do EgD5R*.

Uma experimentação semelhante foi realizada usando EgD5R* como molde em reações de mutagênese sítio-dirigida, onde o resíduo Ser do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) foi mutado. As análises das enzimas mutantes determinaram que dois resíduos de aminoácidos (isto é, Ala ou Gli) foram suficientes para substituir o aminoácido tipo selvagem (isto é, Ser), e resultou em uma enzima EgD5R* mutante possuindo atividade delta-5 dessaturase equivalente ou superior.

Uma vez que as análises preliminares de substituições de 5 aminoácidos no motivo HOASH (SEQ ID NO: 8) do * EgD5R foram concluídas, conforme descrito acima, a mutagênese sítio-dirigida mediada por oligonucleotídeos foi posteriormente utilizada para criar mutações pontuais específicas no interior do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7), em combinação com vários motivos HOASH mutantes de delta-5 dessaturases descritas acima.

Assim, diversas substituições de aminoácidos no interior do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) foram introduzidas por mutagênese sítio-dirigida em cada um dos três motivo HOASH mutantes de delta-5 dessaturases descritas acima (ou seja, EgD5R*-157g [SEQ 10 NO: 87], EgD5R*-158a [SEQ 10 NO: 127] e EgD5R*-158g [SEQ ID NO: 128]), dentro dos plasmídeos pOMW367M4-157g (SEQ ID NO: 129), pDMW367M4-158a (SEQ 10 NO: 130), e pDMW367M4- 158g (SEQ lO NO: 131 ), respectivamente, gerando mutantes duplos possuindo uma mutação pontual em cada um dos motivos HPGG (SEQ 10 NO: 7) e HDASH (SEQ ID NO: 8). Os duplos mutantes foram amplificados em E. co/i, confirmados por sequenciamento de ONA e, em seguida, transformados em uma cepa adequada de Y. lipolytica. Mais uma vez, o rastreio da atividade de delta-5 dessaturase baseada na produção de ARA (isto é, por meio de análises de CG) foi realizada.

Todos os duplos mutantes possuíam algum nível detectável de atividade de delta-5 dessaturase com relação à enzima do EgD5R* tipo selvagem não mutante. Mais especificamente, todos os 7 mutantes de delta-5 dessaturases funcionavam com uma eficiência de conversão de OGLA em ARA de pelo menos 64%, em relação ao EgD5R* controle tipo selvagem correspondente, enquanto que 3 foram capazes de converter OGLA em ARA com eficiência de conversão de, pelo menos, 83% (Tabela 3, abaixo). O rastreio confirmou que a Pro e a segunda Gli no motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) e a Ala e Ser no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) podem ser simultaneamente substituídas e produzirem um mutante duplo com atividade 5 delta-5 dessaturase aproximadamente equivalente quando comparada com a atividade de delta-5 dessaturase da enzima delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente (ou seja, EgD5R*). Assim, este experimento sugeriu 1) que o resíduo Pro dentro do motivo HPGG [SEQ ID NO: 7] pode ser substituído por Gli, com substituição simultânea de ambos: a) o resíduo Ala no motivo HDASH [SEQ ID NO: 8] para Gli, ou b) o resíduo Ser no motivo HDASH [SEQ ID NO: 8] para Ala ou Gli; 2) o resíduo Pro no motivo HPGG [SEQ ID NO: 7] pode também ser substituído por His, com substituição simultânea da Ser dentro do motivo HDASH [SEQ ID NO: 8] ou para Ala ou Gli; e, 3) o segundo resíduo Gli no motivo HPGG [SEQ ID NO: 7] pode ser substituído por Ser, com substituição simultânea da Ser dentro do motivo HDASH [SEQ ID NO: 8] para Ala ou Gli, sem afetar significativamente a atividade delta-5 dessaturase de EgD5R *.

A extremidade N-terminal do gene que codifica o mutante duplo EgD5R* delta-5 dessaturase identificado como tendo a maior eficiência de conversão em relação aos EgD5R* (isto é, EgD5R*- 34g158g; SEQ ID NO: 142) foi códon-otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica (ou seja, EgD5M; SEQ ID NO: 152). O EgD5M foi então modificado para codificar uma Ser na posição 347 (isto é, EgD5M1; SEQ ID NO: 156), a fim de analisar o efeito da mutação R347S sobre a atividade delta-5 dessaturase.

Os plasmídeos que compreendem tanto EgD5M (oi seja, pDMW367-5M; SEQ ID NO: 155) ou EgD5M1 (ou seja, pDMW367-5M1, SEQ ID NO: 159) foram transformados separadamente em uma cepa adequada de Y. lipolytica, e a atividade de delta-5 dessaturase e a eficiência da conversão foi mensurada e comparada com a EgD5R* tipo selvagem.

Ambas delta-5 dessaturases duplo mutantes, ou seja, Eg05M e EgD5M1, tinham uma maior atividade em comparação com EgD5R* tipo selvagem (Tabela 3, abaixo). Surpreendentemente, a Eg05M1 demonstrou 5 melhora na atividade de delta-5 dessaturase, em comparação com EgD5M, sugerindo que um resíduo Ser no aminoácido 347 melhorou a atividade enzimática.

Utilizando as técnicas descritas acima, substituições de aminoácidos pontuais foram então individualmente introduzidas por mutagênese sítio-dirigida nos resíduos Asp, Ala ou Ser do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) de uma delta-5 dessaturase sintética possuindo um motivo HPGs mutante (SEQ ID NO: 11 ), que foi códon-otimizado para a expressão em Yarrowia lipolytica e derivado da Eug/ena gracilis (ou seja, Eg05S-36s [SEQ lO NO: 160]; Pedido de Patente US 201 0-0075386-A 1), dentro de um plasmídeo compreendendo uma construção quimérica FBAIN::Eg05S- 36s::gene Pex20. O protocolo foi repetido utilizando uma delta-5 dessaturase sintética possuindo um motivo HaGG mutante (SEQ ID NO: 14), que foi códon-otimizado para a expressão em Y. lipolytica e derivado da Euglena Anabaena (ou seja, EaD5S-35a [SEQ ID NO: 188]; Pedido de Patente US 201 0-0075386-A 1). Os plasmídeos com os mutantes duplos foram amplificados separadamente em E. co/i, confirmados por sequenciamento de DNA, e em seguida, transformados em uma cepa adequada de Y. lipo/ytica para a triagem da atividade delta-5 dessaturase baseada na produção de ARA (ou seja, por meio de análises de CG). Genes da delta-5 dessaturases duplos mutantes foram obtidos a partir de cada experimento, compreendendo os motivos HxGx (SEQ ID NO: 34) e HxxxH (SEQ ID NO: 1) que possuem atividade delta-5-dessaturase adequada (vide Exemplos para detalhes adicionais e Tabela 3 abaixo).

TABELA 3 DELTA-5 DESSATURASES MUTANTES PREFERIDAS COMPREENDENDO MOTIVOS HXGX (SEQ lO NO· 34) E HxxxH (SEQ ID NO· 1) Atividade de Delta-S Dessaturase Mutante Motivo HPGG Motivo HDASH delta-S (SEQ ID NO) mutante mutante dessaturase EgDSR*-34g1S7g HgGG HDgSH 83% a (SEQ ID N0:139) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID N0:1S) Eg DSR* -34g 1S8a HgGG HDAaH 88% a (SEQ ID N0:141) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID N0:17) EgDSR*-34g1S8g HgGG HDAgH 97% a (SEQ ID N0:143) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID N0:18) EgDSM (EgDSR*-34g 1S8g códon- HgGG HDAgH

106.9% a otimizado) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID N0:18) (SEQ ID NO: 1S3) EgDSM1 (EgDSR*-34g1S8g347s HgGG HDAgH

111.3% a códon-otim izado) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID N0:18) (SEQ ID N0:1S7) EgDSS-36s1S7g HPGs HDgSH

79.9% b (SEQ ID N0:183) (SEQ ID N0:11) (SEQ ID N0:15) EgDSS-36s1S8a HPGs HDAaH 8S.4% b (SEQ ID N0:18S) (SEQ ID N0:11) (SEQ ID NO: 17) Eg DSS-36s 1S8g HPGs HDAgH

74.9% b (SEQ ID NO: 187) (SEQ ID N0:11) (SEQ ID N0:18) Eg DSS-36s 1S6e HPGs HeASH

79.0% b (SEQ ID N0:181) (SEQ ID N0:11) (SEQ ID N0:19) EaDSS-3Sa1S8g HaGG HDgSH

76.3% c (SEQ ID N0:213) (SEQ ID N0:14) (SEQ ID N0:1S) ---- EaDSS-3Sa1S8s HaGG HDsSH

73.7% c (SEQ ID N0:21S) (SEQ ID N0:14) (SEQ ID N0:16) EaDSS-3Sa1S9g HaGG HDAgH

71.2% c (SEQ ID N0:217) (SEQ ID N0:14) (SEQ ID N0:18) a A atividade de delta-5 dessaturase é com relação à enzima tipo selvagem correspondente possuindo um motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) e um motivo HDASH (SEQ 10 NO: 8).

b A atividade de delta-5 dessaturase é com relação à enzima parenta!

correspondente possuindo apenas um motivo HPGs mutante (SEQ lO NO: 11 ).

c A atividade de delta-5 dessaturase é com relação à enzima parenta! correspondente possuindo apenas um motivo HaGG mutante (SEQ 10 NO: 14).

Os estudos acima não sugerem um consenso em relação a quais 5 substituições de aminoácidos simultâneas específicas nos motivos HPGG (SEQ 10 NO: 7) e HOASH (SEQ 10 NO: 8) são suficientes para produzir um polipeptídeo mutante que possui atividade delta-5 dessaturase aceitável. No entanto, contrariamente as divulgações anteriores do estado da técnica, os dados demonstram surpreendentemente que as substituições para ambos os resíduos Pro ou Gli do motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) combinadas com substituições para os resíduos Asp, Ala ou Ser do motivo HOASH (SEQ lO NO: 8) podem resultar em uma enzima possuindo atividade delta-5 dessaturase funcionalmente equivalente ou melhorada em comparação com a sua parenta! tipo selvagem.

Consequentemente, está dentro do escopo da presente invenção fornecimento de um polipeptídeo possuindo atividade de delta-5 dessaturase compreendendo um primeiro motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ lO N0:9 (HgGG), SEQ lO NO: 1O (HhGG), SEQ lO N0:11 (HPGs), SEQ 10 N0:12 (HcGG), SEQ 10 N0:13 (HwGG) e SEQ 10 NO: 14 (HaGG), e um segundo motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:15 (HOgSH), SEQ 10 N0:16 (HOsSH), SEQ ID N0:17 (HOAaH), SEQ 10 N0:18 (HDAgH) e SEQ 10 N0:19 (HeASH).

Mais preferivelmente, a delta-5 dessaturase mutante descrita acima (ou seja, compreendendo um motivo HxGx [SEQ 10 NO: 34] e um motivo HxxxH [SEQ 10 NO: 1] mutante adicionalmente tem atividade de delta-5 dessaturase que é pelo menos 64% da atividade da enzima delta-5 dessaturase tipo selvagem correspondente possuindo ambos os motivos de aminoácidos HPGG (SEQ 10 NO: 7) e HOASH (SEQ 10 NO: 8).

O polipeptídeo delta-5 dessaturase mutante compreendendo um motivo HPGG mutante e um motivo HOASH mutante pode ter uma identidade de sequência de pelo menos 90%, e mais preferivelmente uma identidade de sequência de pelo menos 95%, com base no método de alinhamento BLASTP 5 quando comparado com um polipeptídeo possuindo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ lO NO: 21, SEQ lO NO: 25 e SEQ 10 NO: 29.

Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ 10 N0:139, SEQ 10 N0:141, SEQ 10 N0:143, SEQ 10 N0:145 [Eg05R*- 34h158a], SEQ 10 N0:147 [Eg05R*-34h158g], SEQ 10 N0:149 [Eg05R*- 36s158a], SEQ 10 N0:151 [Eg05R*-36s158g], SEQ 10 N0:153, SEQ 10 N0:157, SEQ 10 N0:181, SEQ 10 N0:183, SEQ 10 N0:185, SEQ 10 N0:187, SEQ 10 N0:213, SEQ 10 N0:215, SEQ 10 N0:217, SEQ 10 N0:255 [Eg05R- 34g158g], SEQ 10 N0:260 [Eg05R-34g158a], SEQ 10 N0:271 [Ea05-35g159g] e SEQ 10 N0:276 [Ea05-35g159a].

Será apreciado por um técnico do assunto que delta-5 dessaturases mutantes úteis não estão limitadas às mutações descritas acima.

Em vez disso, os resultados sugerem que a experimentação semelhante pode ser realizada utilizando qualquer enzima delta-5 dessaturase tipo selvagem possuindo um motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) dentro do domínio citocromo b 5 e um motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8), para, desse modo, desenvolver uma delta- 5 dessaturase mutante adequada possuindo atividade de delta-5 dessaturase, em que a mutação resultaria em um motivo HxGG mutante (SEQ 10 NO: 32), ou um motivo HPGx (SEQ 10 NO: 33) e um motivo HxASH mutante (SEQ 10 NO: 35), HOxSH mutante (SEQ 10 NO: 36) ou HOAxH mutante (SEQ 10 NO: 37). A enzima mutante possuindo atividade delta-5 dessaturase adequada pode ser útil para permitir o aumento da produção de ácidos graxos ômega-

3/ômega-6.

Por exemplo, a mutagênese in vitro e por PCR propensa a erros ou seleção (Leung etal, Techníques, 1:11-15 (1989),. Zhou etal, NucleicAcids Res., 19:6052-6052 (1991), Spee etal, NucleicAcíds Res., 21:777-778 (1993), 5 Melnikov et ai, Nuc/eic Acids Res., 27 (4) :1056-1062 (15 de fevereiro de 1999)) também podem ser utilizadas como meio para obtenção de mutações de ocorrência natural de genes da delta-5 dessaturase, em que as mutações podem incluir deleções, inserções e mutações pontuais, ou combinações das mesmas. A principal vantagem da PCR propensa a erros é que todas as mutações introduzidas por este método estarão dentro do gene da dessaturase desejado, e qualquer alteração pode ser facilmente controlada através da alteração das condições da PCR. Alternativamente, a mutagênese in vivo pode ser utilizada a partir de materiais comercialmente disponíveis, tais como a E.

co/i cepa XL 1-Red e cepa mutante Epicurian co/i XL 1-Red da Stratagene (La Jolla, CA; Greener e Callahan, Strategies, 7:32 - 34 (1994)). Esta cepa é deficiente em três das vias de reparação de DNA primário (mutS, mutO e mutT), resultando em uma taxa de mutação 5000 vezes maior do que a cepa do tipo selvagem. A mutagênese in vivo não depende da eficiência de ligação (tal como com a PCR propensa a erro), no entanto, uma mutação pode ocorrer em qualquer região do vetor e as taxas de mutação são geralmente muito menores.

É também contemplado que uma delta-5 dessaturase mutante com atividade de delta-5 dessaturase alterada ou melhorada pode ser construída usando o método de "embaralhamento de genes" (gene shufflíng) (Patente US 5.605.793; Patente US 5.811.238; Patente dos EUA 5.830.721; Patente US 5.837.458). O método de embaralhamento de genes é particularmente atrativo devido a sua fácil aplicação e uma elevada taxa de mutagênese. O processo de embaralhamento de genes (gene shuffling) envolve a restrição de um gene de interesse em fragmentos de tamanho específico na presença de populações adicionais de regiões de DNA de ambas as similaridades (ou diferenças) do gene de interesse. Este poo/ de fragmentos ira desnaturar e, em seguida, reanelar para criar um gene mutante. O gene mutado é então pesquisados quanto à atividade alterada. Qualquer um destes 5 métodos pode ser usado para criar enzimas delta-5 dessaturase mutantes possuindo os motivos substituídos HxGG (SEQ ID NO: 32) ou HPGx (SEQ ID NO: 33), e HxASH (SEQ ID NO: 35), HDxSH (SEQ ID NO: 36), ou HDAxH (SEQ ID NO: 37), que podem então ser rastreadas para a atividade adequada, utilizando os métodos descritos na presente invenção.

Espera-se que a introdução de genes quiméricos codificantes das delta-5 dessaturases mutantes descritas na presente invenção (ou seja, nas quais a referida delta-5 dessaturase mutante compreende pelo menos uma mutação na região codificante de um motivo de aminoácido HPGG e pelo menos uma mutação na região codificante de um motivo de aminoácido HDASH, e em que a referida delta-5 dessaturase mutante tem preferencialmente pelo menos 64% da atividade delta-5 dessaturase em relação a delta-5-dessaturase do tipo selvagem correspondente), sob o controle dos promotores apropriados resultará na produção de ARA e/ou EPA no organismo hospedeiro transformado, respectivamente. Como tal, são divulgados na presente invenção métodos para a produção direta de PUFAs compreendendo a exposição de um substrato de ácido graxo (ou seja, DGLA e/ou ETA) para uma dessaturase mutante descrita na presente invenção (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 157, 181, 183, 185, 187,213,215,217,255,260,271 e 276), de tal modo que o substrato é convertido no produto de ácido graxo pretendido (por exemplo, ARA e/ou EPA, respectivamente).

Mais especificamente, é descrito na presente invenção um método para a produção de um PUFA em uma célula hospedeira microbiana

(por exemplo, bactérias, leveduras, algas, euglenóides, estramenópilos, oomicetos e fungos) ou uma célula vegetal hospedeira (por exemplo, uma célula de planta oleaginosa), em que a célula hospedeira microbiana ou vegetal compreende: 5 a) um polipeptídeo que tem atividade delta-5 dessaturase compreendendo um primeiro motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:9 (HgGG), SEQ ID N0:10 (HhGG), SEQ ID N0:11 (HPGs), SEQ ID N0:12 (HcGG), SEQ ID N0:13 (HwGG) e SEQ ID N0:14 (HaGG), e um segundo motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:15 (HDgSH), SEQ ID N0:16 (HDsSH), SEQ ID N0:17 (HDAaH), SEQ ID N0:18 (HDAgH) eSEQ ID N0:19 (HeASH); e b) uma fonte de substrato ácido graxo selecionada a partir do grupo que consiste de DGLA e ETA; em que a célula hospedeira é cultivada sob condições tais que a delta-5 dessaturase mutante é expressa e o ácido graxo substrato é convertido no produto PUFA, em que DGLA é convertido em ARA e/ou ETA é convertido em EPA, e em que o produto PUFA é opcionalmente recuperado.

Alternativamente, cada gene mutante da delta-5 dessaturase e seu produto enzima correspondente descrito na presente invenção pode ser utilizado indiretamente para a produção de vários PUFAs ômega-6 e ômega-3 (vide a Figura 1;. Patente US 7.238.482; Patente US 7.678.560; Patente US

7.695.950). A produção indireta de PUFAs ômega-3/ômega-6 ocorre de modo que o substrato é convertido indiretamente nos produtos de ácidos graxos desejado, por meio de uma(algumas) etapa(s) intermediária(s) ou via(s) intermediária(s). Assim, é contemplado que as delta-5 dessaturases mutantes descritas na presente invenção podem ser expressas em conjunto com genes adicionais que codificam enzimas da via biossintética dos PUFAs (por exemplo, delta-6 dessaturases, c18/20 elongases, delta-17 dessaturases, delta-8 dessaturases, delta-15 dessaturases, delta-9 dessaturases, delta-12 dessaturases, c14/16 elongases, c16/18 elongases, delta-9 elongases, delta-5 dessaturases, delta-4 dessaturases, C2o;22 elongases) para resultar em níveis mais elevados de produção de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 de cadeias 5 mais longas, tais como, por exemplo, ARA, EPA, DTA, DPAn-6, OPA e/ou DHA.

Preferencialmente, as delta-5 dessaturases descritas na presente invenção serão expressas em conjunto com pelo menos uma delta-9 elongase e delta-S dessaturase. As delta-5 dessaturases descritas na presente invenção podem ser expressas em conjunto com pelo menos uma delta-6 dessaturase e uma delta-6 elongase. No entanto, os genes específicos incluídos dentro de um cassete de expressão específicos dependerão da célula hospedeira (e seu perfil de PUFAs e/ou perfil de desaturase/elongase), disponibilidade de substrato e do(s) produto(s) final(ais) desejado(s).

É necessário criar e introduzir uma construção recombinante compreendendo um ORF que codifica uma delta-5 dessaturase mutante (ou seja, em que o referido mutante compreende um primeiro motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:9 (HgGG), SEQ ID N0:10 (HhGG), SEQ ID N0:11 (HPGs), SEQ ID N0:12 (HcGG), SEQ ID N0:13 (HwGG) e SEQ ID N0:14 (HaGG), e um segundo motivo de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:15 (HDgSH), SEQ ID N0:16 (HDsSH), SEQ ID N0:17 (HDAaH), SEQ ID N0:18 (HDAgH) e SEQ ID N0:19 (HeASH) dentro de uma célula hospedeira desejada.

Um técnico hábil no assunto tem conhecimento de materiais de recurso padrão que descrevem: 1) As condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas, como as moléculas de DNA, plasmídeos, etc; 2) geração de fragmentos de DNA recombinantes e construções de expressão recombinantes e 3) a triagem e isolamento de clones ou linhagens de plantas. Vide, Sambrook et a/.; Silhavy et ai.; Ausubel et a/.; Maliga et a/., Methods in Plant Molecular Bio/ogy, Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren et a/., Genome Analysis: Oetecting Genes, Vol.

1, Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren et ai., Genome Analysis: Analyzing ONA, Vol. 2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology: A 5 Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997).

De modo geral, a escolha das sequências incluídas na construção dependente dos produtos de expressão desejados, da natureza da célula hospedeira e os meios propostos para separação das células transformadas versus células não transformadas. Os técnicos no assunto são conscientes dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor plasmidial, a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras compreendendo o gene quimérico. Normalmente, entretanto, o vetor ou cassete contém sequências que direcionam a transcrição e tradução do(s) gene(s) pertinente(s), um marcador de seleção e sequências que permitam a replicação autônoma ou integração cromossômica. Cassetes de expressão apropriados compreendem tipicamente um promotor, a sequência codificante de um gene selecionado, e um terminador. É mais preferido quando ambas as regiões de controle são derivadas de genes originados da célula hospedeira transformada.

Promotores úteis para conduzir a expressão de ORFs da delta-5 dessaturase da presente invenção na célula hospedeira microbiana ou célula vegetal desejada são bem conhecidos. Virtualmente, qualquer promotor (isto é, nativo, sintético ou quimérico) capaz de dirigir a expressão desses genes na célula hospedeira selecionada é adequado. Expressão em uma célula hospedeira pode ser conseguida de forma induzida ou constitutiva. A expressão induzida ocorre pela indução da atividade de um promotor regulável operacionalmente ligado ao gene de interesse, enquanto que a expressão constitutiva ocorre pelo uso de um promotor constitutivo.

Como um exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 2009- 0093543-A 1 descreve promotores para utilização em Yarrowia lipolytica.

Qualquer um dentre uma variedade de promotores pode ser utilizado, dependendo se é desejada uma transcrição constitutiva ou induzida, da 5 eficiência do promotor na expressão do ORF de interesse, e da facilidade de construção e coisas do gênero.

As sequências de nucleotídeos que cercam o códon de inicio de tradução 'ATG' foram encontradas por afetarem a expressão em células de levedura. Se o polipeptídeo desejado é pobremente expresso em leveduras, a região codificante de genes exógenos pode ser modificada para incluir uma sequência de inicio de tradução eficiente em leveduras para se obter a expressão gênica ideal. Para a expressão em levedura, isso pode ser feito por meio da mutagênese sítio-dirigida de um gene ineficientemente expresso ou pela fusão deste no quadro (in-trame) de um promotor endógeno da levedura, de preferência um promotor altamente expresso. Alternativamente, a sequência de consenso de iniciação da tradução do hospedeiro pode ser manipulada em genes heterólogos para a expressão ótima.

O terminador pode ser derivado da região 3' do gene a partir do qual o promotor foi obtido ou a partir de um gene diferente. Um grande número de terminadores é conhecido e funcionam de maneira satisfatória em uma variedade de hospedeiros quando utilizadas tanto no mesmo gênero quanto em gêneros e espécies diferentes a partir dos quais eles foram derivados. O terminador geralmente é selecionado mais como uma questão de conveniência do que devido a qualquer propriedade específica. Os terminadores também podem ser derivados de vários genes nativos para os hospedeiros preferidos.

O terminador pode ser sintético, de modo que um técnico hábil no assunto pode utilizar a informação disponível para desenvolver e sintetizar um terminador. Um terminador pode ser desnecessário, mas é altamente preferido.

.' 64 A mera inserção de um gene em um vetor de clonagem não assegura a sua expressão na taxa, concentração e quantidade desejada, e etc.

Em resposta à necessidade de uma expressão de alto nível, muitos vetores de expressão especializados foram criados ajustando certas propriedades que 5 governam a transcrição, estabilidade de RNA, estabilidade de tradução em proteína, e localização, assim como a secreção a partir da célula hospedeira microbiana ou célula vegetal. Estas propriedades incluem: a natureza do promotor transcricional relevante e das sequências terminadoras; o número de cópias do gene clonado (em que as cópias adicionais podem ser clonadas 1o dentro de uma construção de expressão única e/ou cópias adicionais podem ser introduzidas na célula hospedeira, aumentando a número de cópias do plasmídeo, ou pela integração múltipla do gene clonado no genoma), se o gene é de origem plasmidial (plasmid-bome) ou integrado ao genoma da célula hospedeira; a localização celular final da proteína exógena sintetizada; a 15 eficiência da tradução e o enovelamento correto da proteína no organismo hospedeiro; a estabilidade intrínseca da proteína e do mRNA do gene clonado dentro da célula hospedeira; e a utilização preferencial de códons (codon usage) dentro do gene clonado. Cada um destes pode ser utilizado nos métodos e células hospedeiras descritos na presente invenção, para otimizar 20 ainda mais a expressão das delta-5 dessaturases mutantes.

Após a criação da construção recombinante compreendendo pelo menos um gene quimérico que compreende um promotor, um quadro de leitura aberto do delta-9 dessaturase e um terminador, esta é colocada em um vetor capaz de replicação autônoma na célula hospedeira, ou seja, ela é diretamente 25 integrada ao genoma da célula hospedeira. A integração dos cassetes de expressão pode ocorrer de maneira aleatória dentro do genoma da célula hospedeira ou pode ser direcionada por meio do uso de construções que contêm regiões de homologia suficiente com o genoma do hospedeiro para

.. 65 direcionar a recombinação dentro do lócus do hospedeiro. Quando as construções são direcionadas para um lócus endógeno, todas ou algumas das regiões reguladoras da transcrição e tradução podem ser fornecidas pelo lócus endógeno.

5 Quando dois ou mais genes são expressos a partir vetores de replicação distintos, é desejável que cada vetor possa ter uma forma diferente de seleção e que de homologia com a(s) outra(s) construção(ões) para manter a expressão estável e prevenir a recombinação de elementos entre as construções. A escolha criteriosa das regiões reguladoras, meios de seleção e 10 método de propagação da(s) construção(ões) introduzida(s) pode(m) ser determinada(s) experimentalmente para que todos os genes introduzidos sejam expressos em níveis necessários para fornecer a síntese dos produtos desejados.

As construções compreendendo o(s) gene(s) de interesse podem 15 ser introduzidas em uma célula hospedeira microbiana ou célula vegetal hospedeira por meio de qualquer técnica padrão. Essas técnicas incluem a transformação, por exemplo, a transformação com acetato de lítio (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)), impacto por biobalística, eletroporação, microinjeção, ou qualquer outro método que introduza o gene de interesse 20 dentro da célula hospedeira.

Por conveniência, uma célula hospedeira que tenha sido manipulada por qualquer método para receber uma sequência de DNA, por exemplo, em um cassete de expressão, ela é referida na presente invenção como "transformada", "transformante", "recombinante" ou "modificada". A célula 25 hospedeira transformada terá pelo menos uma cópia da construção de expressão e pode ter duas ou mais, dependendo se o casse te de expressão está integrado ao genoma, amplificado, ou está presente em um elemento extracromossômico possuindo vários números de cópias. A célula hospedeira

.. 66 transformada pode ser identificada por um marcador contido na construção introduzida. Alternativamente, um marcador de construção separado pode ser cotransformado com a construção desejada, com muitas técnicas de transformação para a introdução de muitas moléculas de DNA nas células 5 hospedeiras.

Normalmente, os hospedeiros transformados são selecionados por suas capacidades de crescerem em meios seletivos, podendo incorporar um antibiótico ou a falta de um fator necessário para o crescimento do hospedeiro não transformado, tal como um nutriente ou fator de crescimento.

1o Um gene marcador introduzido pode conferir resistência a antibióticos, ou codificar um fator de crescimento essencial ou enzima, permitindo assim o crescimento em meios seletivos quando expresso no hospedeiro transformado.

A seleção de um hospedeiro transformado também pode ocorrer quando o marcador expresso pode ser detectado, seja direta ou indiretamente. As 15 técnicas de seleção adicionais estão descritas na Patente US 7.238.482, Patente US 7.259.255 e Patentes US 7.932.077.

Após a transformação, os substratos adequados para a presente delta-5 dessaturases mutante (e, opcionalmente, outras enzimas PUFA que são coexpressas na célula hospedeira) podem ser produzidos pelo hospedeiro 20 naturalmente ou transgenicamente, ou podem ser fornecidos exogenamente.

Uma grande variedade de organismos eucarióticos são adequados como hospedeiro, para assim originar um transformante compreendendo delta-5 dessaturases mutantes, tal como descrito na presente invenção, incluindo bactérias, leveduras, algas, estramenópilos, oomicetos, 25 euglenóides, fungos e/ou plantas. Isto é contemplado devido a transcrição, tradução e aparelho de biossíntese de proteínas serem altamente conservados.

Assim, os hospedeiros adequados podem incluir, mas não estão limitados aqueles que crescem sobre uma variedade de matérias-primas, incluindo carboidratos simples ou complexos, ácidos graxos, ácidos orgânicos, óleos, gliceróis e alcoóis e/ou hidrocarbonetos em um amplo intervalo de temperatura e valores de pH.

Os hospedeiros microbianos preferidos são organismos 5 oleaginosos. Estes organismos oleaginosos são naturalmente capazes de síntese e acúmulo de óleo, em que o teor total de óleo pode compreender mais do que cerca de 25% do peso celular seco ["DCW"], mais preferencialmente mais do que cerca de 30% do DCW, mais preferivelmente mais do que cerca de 40% do DCW, preferivelmente mais do que cerca de 50% do DCW, e mais preferivelmente mais do que cerca de 60% do DCW. Várias bactérias, algas, euglenóides, musgos, fungos, leveduras e estramenópilos são naturalmente classificados como oleaginosos. Em exemplos de realização alternativos, um organismo não oleaginoso pode ser geneticamente modificado para se tornar oleaginosa, por exemplo, leveduras como a Saccharomyces cerevísíae (vide a Publicação do Pedido de Patente WO 2006/102342).

Em exemplos de realização mais preferidos, as células hospedeiras microbianas são leveduras oleaginosas capazes de produzir pelo menos 25% do DCW como óleo. Os gêneros tipicamente identificados como leveduras oleaginosas incluem, mas não estão limitados a: Yarrowía, Candída, Rhodotoru/a, Rhodosporídíum, Cryptococcus, Tríchosporon e Lípomyces. Mais especificamente, exemplos ilustrativos de leveduras que sintetizam óleo incluem: Rhodosporídíum toru/oídes, Lípomyces starkeyíí, L. lípoferus, Candída revkaufí, C. pulcherríma, C. tropícalís, C. utílís, Tríchosporon pullans, T.

cutaneum, Rhodotorula glutinus, R. graminis e Yarrowia lipo/ytica.

A levedura mais preferida é a levedura oleaginosa Yarrowía lipolytica. Em um exemplo de realização adicional, as leveduras mais preferidas são as cepas de Y. lipolytica designadas como ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982 e/ou LGAM 8(7)1 (Papanikolaou S. e Aggelis G.,

.- 68 Bioresour. Technol., 82(1 ):439 (2002)).

Ensinamentos específicos aplicáveis para a transformação de leveduras oleaginosas (por exemplo, Yarrowia lipolytica) incluem; a Patente US

4.880.741 e Patente US 5.071.764 e Chen, D.C. et a/. (Appl. Microbiol.

5 Biotechnol., 48 (2): 232-235 (1997)) Ensinamentos específicos aplicáveis para a produção de ARA, EPA e DHA em Y. lipo/ytica por engenharia genética são fornecidos na Patente US 7.588.931, Pedidos de Patente US 2009-0093543 A1 e No. 2010-0317072 A1 e Patente US 7.550.286, respectivamente.

O método preferido para expressar genes nesta levedura é pela 10 integração do DNA linear no genoma do hospedeiro. Integração em locais múltiplos dentro do genoma pode ser particularmente útil quando a expressão de alto nível dos genes é desejada, tal como para os seguintes loci: Ura3, Leu2, Lys5, Aco2, Pox3, Lip1, Lip2, SCP2, Pex3, Pex16 e/ou Pex10 (vide, por exemplo, os Pedidos de Patente US 2009-0093543-A1 e US 2010-0317072- 15 A1).

Métodos de seleção preferidos para uso na Yarrowia lipolytica é a resistência à canamicina, higromicina e aminoglicosideo G418, bem como a capacidade de crescer em meios sem uracila, leucina, lisina, triptofano ou histidina. O ácido 5-fluorórotico (ácido 5-fluoro-uracila-6-carboxílico mono- 20 hidrato; "5-FOA") também pode ser especialmente útil para a seleção de leveduras mutantes Ura- (Pedido de Patente 2009-0093543-A 1), ou uma ácido acetohidróxi sintetase nativa (ou acetolactato sintase; EC 4.1.3.18), que confere resistência a herbicidas sulfonil-uréia (Patente US 7.932.077), pode ser utilizada para a seleção de transformantes. Um método único de "reciclagem" 25 de um par de marcadores de seleção preferidos para uso em várias transformações sequenciais, pela utilização de sistemas de recombinase sítio- específicas, é também ensinado no Pedido de Patente US 2009-0093543 A 1.

Com base no exposto, é divulgado na presente invenção um método de produção ou ARA ou EPA, respectivamente, compreendendo: (a) o fornecimento de uma levedura oleaginosa (por exemplo, Yarrowia lipolytica) compreendendo: (I) uma primeira molécula de nucleotídeos recombinante que 5 codifica um polipeptídeo delta-5 dessaturase mutante, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora; e (ii) uma fonte de substrato da dessaturase que consiste de OGLA e/ou ETA, respectivamente; e (b) o cultivo da levedura da etapa (a) na presença de uma fonte de carbono fermentável adequada, em que o gene que codifica o polipeptídeo delta-5 dessaturase mutante é expresso e o OGLA é convertido em ARA e/ou o ETA é convertido em EPA, respectivamente; e (c) opcionalmente, a recuperação do ARA e/ou EPA, respectivamente, da etapa (b).

A adição de substrato pode ser necessária. Em exemplos de realização preferidos, o polipeptídeo delta-5 dessaturase mutante é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ lO NO: 139 [Eg05R*- 34g157g], SEQ 10 N0:141 [Eg05R*-34g158a], SEQ 10 N0:143 [Eg05R*- 34g158g], SEQ 10 N0:145 [Eg05R*-34h158a], SEQ 10 N0:147 [Eg05R*- 34h158g], SEQ 10 N0:149 [Eg05R*-36s158a], SEQ 10 N0:151 [Eg05R*- 36s158g], SEQ 10 N0:153 [Eg05M, Eg05R*-34g158g códon-otimizado], SEQ lO NO: 157 [Eg05M1, Eg05R*-34g158g347s códon-otimizado], SEQ lO NO: 181 [Eg05S-36s156e], SEQ 10 N0:183 [Eg05S-36s157g], SEQ 10 N0:185 [Eg05S-36s158a], SEQ 10 N0:187 [Eg05S-36s158g], SEQ 10 N0:213 [Ea05S-35a158g], SEQ 10 N0:215 [Ea05S-35a158s], SEQ 10 N0:217 [Ea05S-35a159g], SEQ 10 N0:255 [Eg05R-34g158g], SEQ 10 N0:260 [Eg05R-34g158a], SEQ 10 N0:271 [Ea05-35g159g] e SEQ 10 N0:276 [Ea05- 35g159a]. Assim, por exemplo, a sequência nucleotídica do gene codificante do polipeptídeo delta-5 dessaturase mutante pode ser, por exemplo, selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ 10 NOs: 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 156, 180, 182, 184, 186, 212, 214, 216, 254, 259, 270 e 275.

Uma vez que os PUFAs produzidos naturalmente na levedura 5 oleaginosa estão limitados a ácidos graxos 18:2 (ou seja, LA), e menos comummente, ácidos graxos 18:3 (ou seja, ALA), a levedura oleaginosa pode ser geneticamente modificada para expressar várias enzimas necessárias para a biossíntese de PUFA de cadeia longa (permitindo assim a produção, por exemplo, de DPAn-6, OPA e DHA), além das delta-5 dessaturases mutantes 1o descritas na presente invenção.

Especificamente, uma levedura oleaginosa está contemplada na presente invenção, em que a referida levedura compreende: a) uma primeira construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado codificante de um polipeptídeo delta-5 dessaturase mutante, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora; e b) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional compreendendo um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de: delta-4 dessaturase, delta-6 dessaturase, delta- 9 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase, delta-8 dessaturase, delta-9 elongase, c14/16 elongase, c16/18 elongase, c18/20 elongase e c20/22 elongase.

Outros hospedeiros microbianos adequados incluem bactérias, algas, euglenofíceas, estramenópilos, oomicetos e fungos. Dentro deste grupo amplo de hospedeiros microbianos, de particular interesse são os micro- organismos que sintetizam ácidos graxos ômega-3/ômega-6, ou aqueles que podem ser geneticamente modificados para este fim. Assim, por exemplo, a transformação de Mortierella alpina (que é utilizada comercialmente para a produção de ARA) com qualquer uma dos genes da delta-5 dessaturase presentes sob o controle de promotores induzíveis ou regulados poderia produzir um organismo transformante capaz de sintetizar quantidades 5 aumentadas de ARA. O método de transformação da M. alpina é descrito por Mackenzie et a!. (Appl. Environ. Microbiol., 66:4655 (2000)). Do mesmo modo, os métodos para a transformação dos micro-organismos Thraustochytriales (por exemplo, Thraustochytrium, Schizochytrium) são divulgados na Patente us 7.001.772. Os genes da delta-5 dessaturase e os produtos gênicos descritos na presente invenção podem também ser produzidos em células dentro de plantas oleaginosas heterólogas, os quais são vulgarmente referidas como plantas "oleaginosas". Exemplos de plantas de sementes oleaginosas incluem, mas não estão limitados a: soja (Giycine e Soja sp.), linho (Linum sp.), canola (Brassica sp.), milho, algodão, cártamo (Carthamus sp.) e girassol (He/ianthus sp.).

Em uma realização, esta invenção diz respeito a uma construção recombinante compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos delta-5 dessaturase da invenção operacionalmente ligado à, pelo menos, uma sequência de reguladora adequada para a expressão em um vegetal.

O promotor vegetal escolhido para direcionar a expressão da sequência codificante da delta-5 dessaturase não é importante, contanto que a atividade transcricional tenha sido suficiente para realizar a invenção pela expressão do mRNA traduzível para os fragmentos desejados de ácido nucleico no tecido hospedeiro desejado no tempo certo. Promotores tanto heterólogos quanto não heterólogos (ou seja, endógenos) podem ser utilizados para a prática da presente invenção. Por exemplo, os promotores adequados incluem, mas não estão limitados a: subunidade alfa principal do promotor da beta conglicinina, o promotor 3 inibidor de tripsina de Kunitz, promotor da anexina (também conhecido como promotor P34; W02004/071178), promotor Gy1 da glicinina, subunidade beta do promotor da beta conglicinina, promotor P34/Gii Bd m 30K, promotor da albumina, promotor LegA 1 e promotor Leg A2.

5 O promotor é então operacionalmente ligado em uma orientação sense utilizando meios convencionais bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.

A construção recombinante pode ser então introduzida em uma ou mais células vegetais de escolha por métodos bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto (por exemplo, por transfecção, transformação e eletroporação). A célula vegetal é transformada em seguida, cultivada e regenerada sob condições adequadas que permitem a expressão do PUFA de cadeia longa, que é então opcionalmente recuperado e purificado.

Tanto a expressão transitória quanto a expressão estável de pelo menos um PUFA de cadeia longa desejado em uma célula vegetal, pode ser realizada conforme está descrito acima. Tais PUFAs podem também serem expressos em sementes, partes de plantas obtidas a partir de plantas transformadas ou do óleo obtido a partir de sementes de plantas transformadas.

Partes da planta incluem tecidos diferenciados e indiferenciados incluindo, mas não limitado a: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido do tumor e várias formas de células e cultura (por exemplo, células isoladas, protoplastos, embriões e tecidos de calos). O tecido vegetal pode estar na planta ou em um órgão ou tecido da planta ou cultura de célula.

O termo "órgão da planta" refere-se aos tecidos vegetais ou a um grupo de tecidos que constituem uma parte morfológica e funcionalmente distinta de uma planta.

Assim, a presente invenção também diz respeito a um método para a transformação de uma célula, compreendendo a transformação de uma

-. 73 célula com uma construção recombinante da invenção e selecionando as células transformadas com a construção recombinante, em que: a dita construção recombinante compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo mutante possuindo atividade delta-5 dessaturase, em que a 5 sequência de aminoácidos do polipeptídeo mutante compreende um motivo de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 34 [HxGx], em que a SEQ ID NO: 34 [HxGx] não é idêntica à SEQ ID NO: 7 [ HPGG] e, um motivo de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 [HxxxH], em que a SEQ ID NO: 1 [HxxxH] não é idêntica à SEQ ID NO: 8 [HDASH].

10 Também de interesse é um método para produzir uma célula vegetal transformada com os polinucleotídeos da delta-5 dessaturase mutante da presente invenção e a regeneração de uma planta a partir da célula vegetal transformada.

Métodos para a transformação de dicotiledôneas (principalmente 15 pelo uso de Agrobacterium tumefacíens) e obtenção de plantas transgênicas têm sido publicados, dentre outros, para: algodão (Patente US 5.004.863; Patente US 5.159.135), soja (Patente US 5.569.834; Patente US 5.416.011); Brassíca (Patente US 5.463.174), amendoim (Cheng et a/. Plant Ce/1 Rep.

75:653-657 (1996), McKently et ai. Plant Ce/1 Rep. 14:699-703 (1995)); mamão 20 (ling, K. et a/. Bíoltechnology 9:752-758 (1991 )); e ervilha (Grant et a/. Plant Ce/1 Rep. 15:254-258 (1995)). Para uma revisão de outros métodos comumente usados de transformação de plantas vide Newell, C.A. (Mo/. Bíotechnol. 16:53- 65 (2000)). Um desses métodos de transformação usa Agrobacteríum rhízogenes (Tepfler, M. e Casse-Delbart, F. Mícrobío/. Sei. 4:24-28 (1987)). A 25 transformação de soja utilizando a entrega direta de DNA foi publicada utilizando fusão em PEG (Documento WO 92/17598), eletroporação (Chowrira, GM et a/. Moi. Bíotechnol. 3:17-23 (1995); Christou, P. et a/. Proc. Natl.. Acad.

USA. 84:3962 -3966 (1987)), microinjeção ou bombardemento de partícula

(McCabe, DE et. a/. BioíTechnology 6:923 (1988); Christou et a/. Plant Physiol.

87:671-674 (1988)).

Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais. O método específico de regeneração vai depender 5 do tecido vegetal de partida e das espécies vegetais específicas a serem regeneradas. A regeneração, o desenvolvimento e cultivo de plantas a partir de um único protoplasto vegetal transformante ou a partir de vários explantes transformados é bem conhecida no estado da técnica (Weissbach e Weissbach, em: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Esse processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas e cultivo dessas células individualizadas através dos estágios habituais de desenvolvimento embrionário por meio da formação de mudas enraizadas. Embriões e sementes transgênicas são igualmente regenerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são posteriormente plantados em um meio de crescimento vegetal adequado, tal como o solo. Preferencialmente, as plantas regeneradas são auto-polinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. Por outro lado, o pólen obtido a partir dessas plantas regeneradas é utilizado para polinizar plantas que produzem sementes de linhagens agronomicamente importantes. Por outro lado, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada utilizando métodos bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.

Em um exemplo de realização esta invenção diz respeito a uma planta oleaginosa compreendendo: a) uma primeira construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado codificante de um polipeptídeo possuindo atividade delta-5 dessaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora; e b) pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional compreendendo um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a 5 partir do grupo consistindo de: uma delta-4 dessaturase, uma delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase, uma delta-9 dessaturase, uma delta-12 dessaturase, uma delta-15 dessaturase, uma delta-17 dessaturase, uma delta- 9 elongase, uma C14t16 elongase, uma C1511a elongase, uma C1a12o elongase e uma C2o122 elongase.

Tais dessaturases e elongases adicionais são discutidas em numerosas referências na literatura patentária e pública (por exemplo, nas Patentes US 6.075.183 US 5.968.809, US 6.136.574, US 5.972.664, US

6.051.754, US 6.410.288, US 7.932.077 e pedidos internacionais WO 98/46763, wo 98/46764, wo 00/12720, wo 00/40705). A escolha da combinação de cassetes utilizados depende em parte do perfil de PUFA e/ou perfil de dessaturase/elongase das células de plantas oleaginosas a serem transformadas e do(s) PUFA(s) de cadeia longa que serão expressos.

Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir PUFAs de cadeia longa, em uma célula vegetal, compreendendo: a) a transformação de uma célula com uma construção recombinante da invenção; e, b) a seleção das células transformadas que produzem PUFAs de cadeia longa.

Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir pelo menos um PUFA em uma célula vegetal, compreendendo: (a) a transformação de uma célula vegetal com uma primeira construção de DNA recombinante compreendendo:

.. 76 i. um polinucleotídeo isolado codificante de um polipeptídeo mutante possuindo atividade delta-5 dessaturase, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora; e ii. pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional 5 compreendendo um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de: uma delta-4 dessaturase, uma delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase, uma delta-9 dessaturase, uma delta-12 dessaturase, uma delta-15 dessaturase, uma delta-17 dessaturase, uma delta- 10 9 elongase, uma c14/16 elongase, uma c16/18 elongase, uma c18120 elongase e uma C2o122 elongase; (b) a regeneração de uma planta a partir da célula transformada da etapa (a); e (c) a seleção daquelas sementes obtidas a partir das plantas da 15 etapa (b) que possuem um nível de PUFAs alterado quando comparadas com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta não transformada.

Em exemplos de realização particularmente preferidos, a pelo menos uma construção de DNA recombinante adicional codifica polipeptídeos possuindo atividade delta-9 elongase e atividade delta-8 dessaturase.

20 Independentemente do hospedeiro selecionado para a expressão das delta-5 dessaturases mutantes descritas na presente invenção, múltiplos transformantes devem ser rastreados de modo a se obter uma cepa ou linhagem vegetal que exiba o nível e padrão de expressão desejado. Por exemplo, Juretzek et ai. (Yeast, 18:97-113 (2001)) observam que a estabilidade 25 de um fragmento de DNA integrado na Yarrowia lipolytica é dependente dos transformantes individuais, da cepa receptora e a da plataforma de direcionamento utilizada. Essa seleção pode ser realizada pela análise por Southern de blots de DNA (Southem, J. Moi. Biol., 98:503 (1975)), análise por

.,. 77 Northern da expressão do RNAm (Kroczek, J. Chromatogr. Biomed. Appl., 618 (1-2):133 145 (1993)), análise por Western ou ELISA da expressão de proteínas, análise fenotípica ou análise por CG dos produtos PUFA.

O conhecimento das sequências das delta-5 dessaturases 5 mutantes da presente invenção serão úteis para a manipulação da biossíntese de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 em diferentes células hospedeiras.

Os métodos para manipular as vias bioquímicas são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto e espera-se que as numerosas manipulações tornem possível maximizar a biossíntese de ácidos graxos ômega-3 e/ou 10 ômega-6 em leveduras oleaginosas, particularmente na Yarrowia lipolytica, e em plantas de sementes oleaginosas. Esta manipulação pode exigir a modificação metabólica diretamente na via biossintética dos PUFAs ou a manipulação adicional de vias que contribuem com carbono para a via biossintética dos PUFAs. Os métodos úteis para a regulação positiva desejável 15 das vias bioquímicas e regulação negativa indesejável das vias bioquímicas são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.

Por exemplo, as vias bioquímicas que competem com a via biossintética de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 por energia ou carbono, ou enzimas da via biossintética de PUFAs nativas que interferem com a 20 produção de um determinado produto final PUFA, podem ser eliminadas por inter-rompimento do gene ou pela regulação negativa por outros meios, por exemplo, mRNA antisense.

Discussões detalhada das manipulações dentro da via biossintética de PUFAs como um meio de aumentar ARA, EPA ou DHA e as 25 técnicas associadas às mesmas são apresentados na Patente US 7.588.931, Patente US 7.932.077, Pedido de Patente US 2009-0993543 A1, e Patente US

7.550.286, respectivamente, como sendo manipulações desejáveis na via biossintética de TAG e via de degradação de TAG (e técnicas associadas à

' mesma).

Pode ser útil modular a expressão da via de biossíntese de ácido graxo por qualquer uma das estratégias descritas acima. Por exemplo, são fornecidos na presente invenção métodos em que os genes que codificam as 5 enzimas chave na via biossintética da delta-9 elongase/delta-8 dessaturase e via biossintética da delta-6 dessaturase/delta-elongase são introduzidos em leveduras oleaginosas ou plantas de sementes oleaginosas para a produção de ácidos graxos ômega -3 e/ou ômega-6. Será particularmente útil expressar os presentes genes mutantes da delta-5 dessaturase em leveduras oleaginosas 1o ou plantas de sementes oleaginosas, que não possuem naturalmente as vias biossintéticas de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 e coordenar a expressão desses genes para maximizar a produção de produtos PUFAs preferidos utilizando vários meios para a engenharia metabólica do organismo hospedeiro.

15 A célula hospedeira transformada microbiana é cultivada em condições que otimizam a expressão de genes quiméricos (por exemplo, dessaturase, elongase) e produzem PUFAs desejados em maior rendimento e de maneira mais econômica. Em geral, as condições do meio podem ser otimizadas pela inclui; o tipo e quantidade de fonte de carbono, o tipo e 20 quantidade da fonte de nitrogênio, a proporção carbono I nitrogênio, a quantidade de diferentes íons minerais, o nível de oxigênio, a temperatura de crescimento, o pH, a duração da fase de produção de biomassa, a duração da fase de acúmulo de óleo e o tempo e método de coleta das células. Os microrganismos de interesse, tais como a levedura oleaginosa (por exemplo, 25 Yarrowia lipolytica), são geralmente cultivados em meio complexo, tais como: caldo de extrato de levedura-peptona-dextrose ["YPD"] ou um meio mínimo definido que carece de um componente necessário para o crescimento e, assim, força a seleção dos cassetes de expressão desejados (por exemplo,

... 79 '• meio base de nitrogênio para levedura "Yeast Nitrogen Base" (DIFCO Laboratories, Detroit, Ml)).

Os meios de fermentação para os métodos e células hospedeiras descritas na presente invenção devem conter uma fonte de carbono adequada, 5 assim como é ensinado na Patente US 7.238.482 e Pedido de Patente US 2011-0059204-A 1. Embora seja contemplado que a fonte de carbono utilizada nos métodos da presente invenção possa abranger uma grande variedade de fontes contendo carbono, as fontes de carbono preferidas são os açúcares (pOor exemplo, glicose, sacarose invertida, frutose e combinações destes), 1o gliceróis e/ou ácidos graxos.

O nitrogênio pode ser fornecido a partir de uma fonte inorgânica (por exemplo, (NH4)2S04) ou orgânica (por exemplo, uréia ou glutamato ou "extrato de levedura"). Além das fontes de carbono e nitrogênio adequadas, os meios de fermentação devem conter também minerais, sais, cofatores, 15 tampões, vitaminas e outros componentes adequados conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto para o crescimento de hospedeiros oleaginosos e promoção das vias enzimáticas necessárias para a produção de PUFA. É dada especial atenção aos diversos íons metálicos, tais como Fe+ 2 , Cu+ 2 , Mn+ 2 , Co+ 2 , zn+ 2 e Mg+ 2 , que promovem a síntese de lipídeos e PU FAs (Nakahara, T. et ai., 20 lnd. Appl. Single Ce/1 Oils, Kyle D.J. e Colin R., eds. págs 61-97 (1992)).

Os meios de crescimento preferenciais para os métodos e células hospedeiras descritas na presente invenção são meios preparados comercialmente comuns, como o meio 'Base de Nitrogênio Para Leveduras' "Yeast Nitrogen Base" (DIFCO Laboratories, Detroit, Ml). Outros meio de 25 cultura definido ou sintético também pode ser usado e o meio adequado para o crescimento da célula hospedeira transformante será do conhecimento de um técnico no assunto da ciência da microbiologia ou fermentação. A faixa adequada de pH para a fermentação está geralmente entre cerca de pH 4,0 a pH 8,0, onde o pH 5,5 a pH 7,5 é preferível como o intervalo para as condições iniciais de crescimento. A fermentação pode ser realizada em condições aeróbias ou anaeróbias, de modo que as condições microaeróbicas são preferidas.

5 Tipicamente, o acúmulo de altos níveis de PUFA em células de leveduras oleaginosas requer um processo de duas fases, uma vez que o estado metabólico deve ser "balanceado" entre o crescimento e a síntese/armazenamento de gorduras. Assim, preferencialmente, um processo de fermentação em duas fases é necessário para a produção de PUFA em leveduras oleaginosas (por exemplo, Yarrowia lipolytica). Esta abordagem é descrita na Patente US 7.238.482, como diversos modelos de processo de fermentação adequados (ou seja, descontínuo (batch), descontínuo alimentado (fed-batch) e contínuo) e considerações durante o crescimento.

Os PUFAs podem ser encontrados em organismos hospedeiros na ácidos graxos livres ou na forma esterificada como acilgliceróis, fosfolipídios, sulfolípidios ou glicolipídios, e podem ser extraído das células hospedeiras através de uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Uma revisão das técnicas de extração, análise de qualidade e padrões de aceitabilidade para os lipídeos de leveduras é a de Jacobs Z. (Critica/ Reviews in Biotech, 12(5/6):463-491 (1992)). Uma breve revisão de processo a jusante também está disponível por A. Singh e O. Ward (Adv. App/. Microbiol., 45:271- 312 (1997)).

Em geral, os meios para a purificação de PUFAs podem incluir a extração (por exemplo, a descrita na Patente US 6.797.303 e Patente US

5.648.564) com solventes orgânicos, ultrassom, extração fluída supercrítica (por exemplo, usando o dióxido de carbono), saponificação e meios físicos como prensas ou combinações destes. Vide a Patente US 7.238.482 para detalhes adicionais.

Há uma infinidade de produtos alimentícios e rações que incorporam ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6, particularmente, por exemplo, ALA, ABL, ARA, EPA, OPA e DHA. Contempla-se que a biomassa microbiana ou vegetal compreendendo PUFAs de cadeia longa, biomassa 5 parcialmente purificadas compreendendo PUFAs, óleo purificado compreendendo PUFAs, e/ou PUFAs purificados funcionará em produtos alimentares e rações para conferir benefícios para a saúde nas presentes formulações. Mais especificamente, os óleos contendo ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 serão adequados para o uso em uma variedade de produtos alimentares e rações, incluindo, mas não se limitando a: análogos de produtos alimentares, produtos de carne, produtos à base de cereais, alimentos cozidos, alimentos tipo 'snack' e produtos lácteos (vide, por exemplo, a Patente US

7.588.931).

As composições da presente invenção podem ser utilizadas em formulações para conferir benefícios para saúde em alimentos médicos, incluindo nutritivos medicinais, suplementos dietéticos, fórmulas para lactantes e produtos farmacêuticos. Um técnico hábil no assunto de processamento de alimentos e formulações alimentares irá compreender como a quantidade e a composição dos óleos da presente invenção podem ser adicionadas ao produto alimentar ou ração. Tal quantidade será referida na presente invenção como uma quantidade "eficaz" e irá depender do produto alimentar ou ração, da dieta ao qual o produto se destina a complementar ou a condição médica que o alimento médico ou nutricional médico se destina a corrigir ou tratar.

As composições da presente invenção também podem ser utilizadas para melhorar a saúde animal, pois elas podem ser utilizadas na alimentação animal, rações e produtos farmacêuticos.

EXEMPLOS A presente invenção é adicionalmente descrita nos exemplos a seguir, que ilustram as reduções para a prática da invenção, mas não definem completamente todas as suas possíveis variações.

MÉTODOS GERAIS Técnicas-padrão de DNA recombinante e de clonagem 5 molecular utilizadas nos exemplos são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas por: 1) Sambrook et ai., 2) Silhavy et a/,. e 3) Ausubel et a/.

Os materiais e métodos adequados para a manutenção e o crescimento de culturas microbianas são bem conhecidos no estado da técnica. Técnicas adequadas para uso nos Exemplos a seguir podem ser encontradas conforme o estabelecido em: Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, Eds), American Society for Microbiology: Washington, D.C. (1994)); ou por Thomas D. Brock em: Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, (2a Edição, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, 1989). Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiais utilizados para o crescimento e manutenção das células bacterianas foram obtidos da Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), DIFCO Laboratories (Detroit, Ml) GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), salvo quando especificado de outra forma. As cepas de E. co/i foram cultivadas normalmente a 37 °C em placas com Luria Bertani ["LB"].

A clonagem molecular geral foi realizada de acordo com métodos-padrão (Sambrook et a/. Supra). A sequência de DNA foi gerada em um sequenciador automático ABI usando a tecnologia "dye-terminator' (Patente US 5.366.860; EP 272007) usando uma combinação de vetores e primers de inserção específica. A edição da sequência foi realizada em um sequenciador (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). Todas as sequências representam a cobertura de pelo menos duas vezes nos dois sentidos. As comparações de sequências gênicas foram realizadas utilizando o software DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, Wl).

O significado das abreviações são: "Sec" significa segundo(s), 5 "min" significa minuto(s), "h" ou "hr" significa hora(s), "d" significa dia(s), "i-JL" significa microlitro(s), "ml" significa mililitro(s), "L" significa litro(s), "1-1M" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "i-Jmole" significa micromol(es), "g" significa grama(s), "g" significa micrograma(s), "ng" significa nanograma(s), "U" significa unidade(s), "bp" significa pares de bases e "kB" significa kilobase(s).

NOMENCLATURA PARA Os CASSETES DE EXPRESSÃO A estrutura de um cassete de expressão será representada por um sistema de numeração simples de "X::Y::Z", onde X descreve o fragmento promotor, Y descreve o fragmento do gene, e Z descreve o fragmento terminador, que estão operacionalmente ligados entre si.

TRANSFORMAÇÃO E CULTIVO DE YARROWIA LIPOLYTICA As cepas de Y. lipo/ytíca número de acesso ATCC #20362, #76982 e #90812 foram adquiridas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). As cepas de Yarrowia Jipolytica foram tipicamente cultivadas a 28-30 °C em diversos meios de acordo com as receitas descritas abaixo. As placas de ágar foram preparadas conforme necessário pela adição de 20 g/L de ágar para cada meio líquido, de acordo com a metodologia convencional.

MEIO ÁGAR YPD (POR LITRO): 10 G DE EXTRATO DE LEVEDURA (DIFCO], 20 G DE 8ACTO PEPTONA (DIFCO] j E 20 G DE GLICOSE.

Meio Mínimo Básico (MM) (por litro): 20 g de glicose; 1,7 g de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 1 ,O g de prolina, e pH 6,1

(não ajustado).

Meio Mínimo + Leucina (MM + leucina ou MMLeu) (por litro): Preparar meio MM conforme descrito acima e adicionar O, 1 g de leucina.

Meios com alto teor de glicose (HGM) (por litro): 80 g de glicose, 5 2,58 g de KH2P04, e 5,36 g de K2HP0 4, pH 7,5 (não necessário ajustar).

A transformação de Y lipolytica foi realizada conforme descrito no Pedido de Patente US 2009-0093543-A 1, incorporada ao presente pela referência.

ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS DA YARROWIA LIPOL YTICA Para a análise de ácidos graxos, as células foram coletadas por centrifugação e os lipídeos foram extraídos, conforme descrito em Bligh, E. G.

& Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959)). FAMEs foram preparados por transesterificação do extrato lipídico com metóxido de sódio (Roughan, G. e Nishida 1., Arch Biochem Biophys. 276(1 ):38-46 (1990)) e subsequentemente analisados por CG com um Hewlett-Packard 6890 combinado com uma coluna de 30 m X 0,25 mm (i.d.) HP-INNOWAX (Hewlett- Packard). As temperaturas do forno foram de 170 oc (mantidas por 25 min) para 185 oca 3,5 oC/min.

Para transesterificação de base direta, a cultura de Yarrowia (3 ml) foi coletada, lavada uma vez com água destilada e seca sob vácuo em Speed-Vac durante 5-1 O min. O metóxido de sódio (1 00 1-JL de 1%) foi adicionado à amostra, e então a amostra foi colocada no vortex e agitada por 20 min. Após a adição de 3 gotas de NaCI 1 M e 400 1-JL de hexano, a amostra foi colocada no vortex e centrifugada. A camada superior foi removida e analisada por CG, conforme descrito acima.

Alternativamente, uma modificação do método de transesterificação catalisada em base descrita em "Lipid Analysis", William W.

Christie, 2003; foi utilizada para a análise de rotina de amostras de caldo a partir da fermentação ou de frascos de amostras. Especificamente, as amostras de caldo foram rapidamente descongeladas em água a temperatura ambiente, em seguida, pesado (a O, 1 mg) em um tubo de microcentrífuga de 2 ml nivelado com um filtro de tubo de centrífuga de 0,22 1-Jm Corning Gostar® 5 Spin-X ® (Cat. No. 8161 ). A amostra (75-800 IJI) foi usada, dependendo do DCW previamente determinado. Usando uma centrifuga Eppendorf 5430, as amostras foram centrifugadas durante 5-7 min a 14.000 rpm ou durante o tempo necessário para remover o caldo. O filtro foi removido, o líquido foi drenado, e- 500 1-JI de água deionizada foram adicionados ao filtro para lavar a 1 o amostra. Após a centrifugação para remover a água, o filtro foi novamente removido, o líquido drenado e o filtro reinserido. O tubo foi então reintroduzido na centrifuga, desta vez com a tampa aberta, por - 3-5 min. para secar. O filtro foi então cortado a cerca de Yz caminho até o tubo e inserido em um novo tubo Eppendorf de 2 ml de fundo arredondado (Cat. 22 36 335-2). O filtro foi pressionado ao fundo do tubo com uma ferramenta apropriada que toca apenas a borda do recipiente do filtro cortado e não encosta na amostra ou material do filtro. Uma quantidade conhecida de TAG C15:0 (supra) em tolueno foi adicionada a 500 1-JI de metóxido de sódio a 1% fresco em solução de metano!. O sedimento da amostra foi firmemente quebrado com a ferramenta adequada e os tubos foram fechados e colocados em um bloco de aquecimento a 50 oc (Cat VWR. No. 12621-088) durante 30 min. Em seguida, foi permitido que os tubos esfriassem por pelo menos 5 min. Em seguida, 400 IJI de hexano e 500 IJL de uma solução aquosa de Na CI 1M foram adicionados, os tubos foram agitados 2x durante 6 seg. e centrifugados durante 1 min.

Aproximadamente 150 IJI da camada superior (orgânica) foram colocados em um frasco de CG com uma inserção e analisados por CG.

CONSTRUÇÃO DA YARROWIA L/POLYT/CA CEPA Y4036U A Y. /ipolytica cepa Y4036U (Leu-, ura-), descrita no Pedido

Internacional WO 2008/073367, foi utilizada como hospedeiro nos Exemplos 3- 5, 7-8 e 10, abaixo.

A cepa Y4036U foi derivada da Y. lípolytica ATCC # 20362 por meio da construção da cepa Y2224 (URA3-, um mutante resistente a FOA a 5 partir de uma mutação autônoma do gene URA3), cepa Y4001 (produtora de 17% de EDA com um fenótipo Leu"), cepa Y4001 U1 (Leu· e Ura·) e cepa Y4036 (produzindo 18% de DGLA com um fenótipo Leu").

O genótipo final da cepa Y4036U com relação a Y. lípolytica tipo selvagem ATCC #20362 foi Ura3-, YAT1 ::ME3S::Pex16, EXP1 ::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, GPAT::EgD9e::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::0CT (em que FmD12 é um gene da delta-12 dessaturase de Fusarium moníliforme [Patente US 7.504.259.]; ME3S é um gene da códon otimizado da C 16t 18 elongase derivado a partir de Mortíerella alpina [Patente US 7.470.532.]; EgD9e é um gene da delta-9 elongase de Euglena gracilís [Patente US 7.645.604.]; EgD9eS é um gene códon-otimizado da delta-9 elongase derivado de E. graci/is [Patente US 7.645.604]; e EgD8M é um mutante sintético da delta-8 dessaturase [Patente US 7.709.239], derivada de E. gracilis [Patente US

7.256.033]).

EXEMPLO 1 DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO TOPOLÓGICO PARA DELTA-5 DESSATURASE DE EUGLENA GRACILIS ["EGD5"] A fim de melhor predizer a possível importância do motivo HDASH dentro da delta-5 dessaturase de E. gracílís ["EgD5"; Patente US 7.678.560], um modelo topológico (FIG. 2) foi desenvolvido com base na lógica e análises abaixo.

Primeiro, uma análise dos domínios transmembrana da EgD5 foi realizada utilizando o programa TMHMM ("Predíction of transmembrane helíces in proteíns"; Servidor TMHMM v 2.0, Centro de Análise de sequências biológicas, BioCentrum-DTU, Universidade Técnica da Dinamarca, DK- 2800 Lyngby , Dinamarca). A predição indicou seis hélices abrangendo a membrana (resíduos de aminoácidos 103-125, 130-152, 165-187, 234-256, 5 280-302 e 306-328), com ambas as extremidades, N- e C-terminal, localizadas no lado citoplasmático da membrana.

Uma análise TMHMM semelhante foi realizada utilizando os seguintes homólogos da EgD5: número de acesso GenBank AAT09160 [Nítzchía closterium. f mínutíssíma], número de acesso GenBank BAG71 007 [Oblongichytrium sp.SEK 347], e número de acesso GenBank AAL92562 [Phaeodactylum tricornutum]. Para cada homólogo, quatro segmentos transmembrana foram previstos, o que corresponde aos dois primeiros e os últimos dois domínios transmembrana previstos para EgD5.

As dessaturases de ácidos graxos ligadas à membrana pertencem a uma superfamília de proteínas de membrana di-ferro que apresentam três motivos ricos em histidina (His-rico): HX( 3_4 )H (SEQ ID NOs: 1 e 2), HX(2 -3)HH (SEQ ID NOs: 3 e 4) e (H/Q)X(2- 3)HH (SEQ ID NOs: 5 e 6). Estes resíduos His-ricos foram previstos por estarem localizados na face citoplasmática da membrana e se mostraram importantes para a atividade da enzima (Shanklin, J. et ai, Biochemistry, 33:12787-12794 (1994),. Shanklin, J., e Cahoon, E. B., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mo/.

Biol., 49:611-641 (1998)). Dentro do EgD5, a primeira região His-rica (HDASH [SEQ ID NO: 8]) está localizada antes do terceiro segmento transmembrana previsto que abrange os resíduos de aminoácidos 165-187, ao passo que a segunda região His-rica (HIMRHH [SEQ ID NO: 4 ]) está situada após este segmento transmembrana. Se o terceiro segmento transmembrana de fato atravessa a membrana, então a segundo região His-rica estaria localizada no espaço periplasmático - impedindo assim a sua participação no sítio de ferro ativo. Como resultado, foi levantada a hipótese de que nem o terceiro segmento transmembrana (resíduos de aminoácidos 165-187), nem o quarto segmento transmembrana (resíduos de aminoácidos 234-256) atravessam a membrana. Isto foi consistente com 5 as previsões TMHMM para as três delta-5 dessaturases homólogas, (por exemplo, números de acesso GenBank AAT09160, BAG71007 e AAL92562).

Uma vez que o substrato da delta-5-dessaturase (por exemplo, DGLA, ETA) é altamente hidrofóbico, assumiu-se a provável partição na bicamada lipídica. Do mesmo modo, assumiu-se que o sítio ativo montado a partir de três aglomerados ricos em His provavelmente ocorreria na superfície da membrana, ou muito próximo dela. Assim, o terceiro e quarto segmentos transmembranares encontrados entre os resíduos 165-187 e 234-256, respectivamente, que eram originalmente previstos pelo TMHMM por abrangerem toda a membrana, foram, ao invés disso, previstos em uma posição deitada próxima à superfície da membrana para assegurar que o sítio ativo ficasse posicionado próximo à membrana. As regiões transmembranares nos resíduos de aminoácidos 103-125, 130-152, 280- 302 e 306-328 permaneceram conforme previsto pelo TMHMM.

Assim, o modelo topológico final previsto para EgD5 é mostrado na FIG. 2. Os cilindros verticais indicam os domínios abrangendo a membrana, enquanto que os cilindros horizontais indicam as duas regiões altamente hidrofóbicas que não atravessam a membrana, mas se encontram próximas da superfície da membrana interna. Os círculos correspondem aos resíduos His presumivelmente envolvidos no sítio ativo.

As localizações dos motivos HPGG (SEQ ID NO: 7) e HDASH (SEQ ID NO: 8) são também identificadas. Finalmente, "IN" corresponde ao espaço citoplasmático, enquanto que "OUT" corresponde ao espaço periplasmático.

EXEMPLO 2 DETERMINAÇÃO DA VARIAÇÃO Do MOTIVO HDASH (SEQ ID NO: 8) NATURAL EM

DESSATU RASES As sequências de proteína dessaturase selecionadas foram 5 examinadas para determinar se a variação natural ocorreu dentro do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8). Especificamente, as proteínas dessaturases incluíram a delta-5 dessaturase de Euglena gracilis ["EgD5"; Patente US 7.678.560], a delta-5 dessaturase de Morteriella alpina ["MaD5"; Patente US 5.972.664], e hits do BLAST para outras delta-5 dessaturases e/ou delta-6 dessaturases 1o conhecidas que são intimamente relacionadas com as delta-5 dessaturases. As sequências selecionadas foram alinhadas utilizando o programa MegAiign® da LASERGENE bioinformatics computing suíte (DNASTAR Inc., Madison, Wl), e o motivo HDASH (ou variante deste) está resumido a seguir na Tabela 4.

TABELA 4 VARIANTES NATURAIS Do MOTIVO HDASH (SEQ ID NO· 8) N° de acesso do GenBank Organismo Motivo SEQ ou Número da Patente HDASH ID Variante NO CBL59059.1 (gi 295016816) Mortierel/a alpina H DAS H 8 CAL49887.1 (gi 116001271) Phytophthora sojae H DAS H 8 CBL59057.1 ( gi 295016812) Physcomitrella patens HDgnH 235 CAT16395.1 (gi 218101624) Euglena gracilis H DAS H 8 CBL59055.1 (gi 295016808) Phaeodactylum tricornutum HDAnH 236 __g_l?'::_591 02.1 (gi_295016902) Thalassiosira pseudonana ~~" HDAnH -·-·····-·····----~ 236 CAM55833.1 (gi 126633754) Thalassiosira pseudonana HDAnH 236 AAL13311.1 (gi 16033740) Pythium irregulare HDsSH 16 CAD53323.1 (gi 23894018) Phytophthora megasperma H DAS H 8 BAD95486.1 (gi 62484905) Mortierella alpina HDASH 8 NP 501751.1 (gi 17542396) Caenorhabditis elegans HefaH 237 CAE65324.1 (gi 39585564) Caenorhabditis briggsae HeftH 238 AAM09687.1 (gi_20069123) Thraustochytrium sp. ATCC HemgH 239 21685 CAJ07076.1 (gi_68124314) Leishmania major cepa HeAgH 240 Friedlin

N° de acesso do GenBank Organismo Motivo SEQ ou Número da Patente HDASH ID Variante NO AAH26831.1 (gi 20070924) Mus muscu/us HDfgH 241 NP_571720.2 (gi_42476248) Danio rerio HDfgH 241 AAL82631.2 (gi 55846441) Salmo safar HDygH 242 AAL92562.1 (gi_19879687) Phaeodactylum tricornutum HDAnH 236 AAX14502.1 (gi_60172920) Thalassiosira pseudonana HDAnH 236 AAT09160.1 (gi_47028617) Nitzschia c/osterium f HDAnH 236 minutissima AAT85663.1 (gi 50882495) Marchantia polymorpha HDgnH 235 XP _638329.1 (gi_66809213) Oictyostelium discoideum HDscH 243 AX4 XP_640331.1 (gi_66812304) Dictyoste/ium discoideum HDAcH 244 AX4 Patente US 7.678.560 Euglena gracilis HDASH 8 Patente US 5.972.664 Morteriella alpina HDASH 8 Com base na análise acima, verificou-se que o resíduo Asp ["D"] do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) poderia ser eventualmente substituído por um resíduo Glu ["E"], o resíduo Ala ["A"] poderia ser substituído por um resíduo Gli ["G"], Ser ["S"], Fen ["F"], Tir ["Y"] ou Met ["M"]; e/ou o resíduo Ser ["S" ] do 5 motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) poderia ser eventualmente substituído por um resíduo Cis ["C"], Asn ["N"], Gli ["G"], Ala ["A"] ou Tre [''T''].

EXEMPLO 3 SEQUÊNCIA DA DELTA-5 DESSATURASE TIPO SELVAGEM DE EUGLENA GRACILIS ["EGD5"] A Patente US 7.678.560 descreve o isolamento e clonagem de uma delta-5 dessaturase de E. gracilis (ou seja, EgD5, SEQ ID NO: 21 ).

Recentemente, análises mais detalhadas do EgD5 clonado identificou mais uma sequência variante "tipo selvagem" da delta-5 dessaturase de E. gracilis, designada como EgD5R e definido na presente invenção como SEQ ID NO: 25, que não foi anteriormente apreciado. Em vez de um resíduo de aminoácido Ser na posição 347 do Eg05 conforme descrito na Patente US 7.678.560, o Eg05R (SEQ 10 NO: 25) compreende um resíduo Arg na posição 347. Supõe-se que esta discrepância surgiu como resultado da PCR ou metodologias de geração de cONA.

5 Especificamente, a Eg05 (SEQ 10 NO: 20, que corresponde a SEQ 10 NO: 1 da Patente US 7.678.560) foi obtida utilizando técnicas 5'- e 3'- RACE com um cONA de fita dupla de E. gracilis como molde (Exemplos 4-5 da Patente US 7.678.560). Em seguida, o ORF codificante da delta-5 dessaturase de E. gracilis foi amplificado por PCR utilizando o cONA de E. gracilis como molde, purificado, submetido a digestão com enzimas de restrição e, em seguida, direcionalmente ligado em um vetor apropriado para produzir o pOMW367 (Exemplo 6 da Patente US 7.678.560). A sequência do pOMW367 foi fornecida como SEQ 10 NO: 23 na Patente US 7.678.560 (correspondendo a SEQ 10 NO: 38 na presente invenção). Embora tenha sido relatada na Patente US 7.678.560, que o pOMW367 compreende um gene FBAIN::Eg05::PEX20 quimérico, é agora apreciado que a sequência da delta-5 dessaturase dentro deste gene quimérico foi realmente a sequência de nucleotídeos do Eg05R (SEQ 10 NO: 24).

Um alinhamento de Eg05 (SEQ 10 NO: 20) e Eg05R (SEQ 10 NO: 24) (Figs. 3A, 38, 3C e 30) mostra quatro diferenças de nucleotídeos, em que as mutações com relação à SEQ 10 NO: 20 são G819A, T948C, C1041A e G1349A. A mutação G1349A é atribuída à sequência prímer-específica utilizada para amplificar Eg05 para clonagem no pOMW367. O alinhamento dos produtos traduzidos do Eg05 (SEQ 10 NO: 21) e Eg05R (SEQ ID NO: 25) revela uma diferença de um único aminoácido, ou seja, a mutação S347R.

A Patente US 7.678.560, Exemplo 9, também descreve a criação de uma delta-5 dessaturase sintética derivada do Eg05 e códon-otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica (Eg05S; SEQ 10 NOs: 22 e 23). A códon-

otimização de EgD5 resultou na modificação de 196 pb dos 1350 pb da região codificante (14,5%) e a otimização de 189 códons do 449 códons totais (42%).

A sequência da proteína codificada pelo gene códon-otimizado EgD5S (ou seja, SEQ ID NO: 23) foi idêntica ao da sequência da proteína tipo selvagem (ou 5 seja, SEQ ID NO: 21), na qual o aminoácido na posição 347 é Ser.

EXEMPL04 GERAÇÃO DA CONSTRUÇÃO PDMW367 -M4, COMPREENDENDO EGD5R TIPO SELVAGEM COM QUATRO SíTIOS DE ENDONUCLEASE DE RESTRIÇÃO ELIMINADOS ["EGD5R*"] O presente Exemplo descreve a construção do plasmídeo pDMW367-M4, que compreende um gene FBAIN::EgD5R*::Pex20 quimérico. O EgD5R * (SEQ ID NO: 26) foi um variante modificado do EgD5R tipo selvagem (SEQ ID NO: 24) criado para facilitar os procedimentos de clonagem subsequentes, em que as modificações resultaram na remoção de quatro sítio de enzimas de restrição (por exemplo, EcoRI, Hindlll, Bg/11 e Ncol) a partir da região codificante do EgD5R tipo selvagem. As sequências de aminoácidos de EgD5R (SEQ ID NO: 25) e EgD5R* (SEQ ID NO: 27) são idênticas.

Especificamente, o plasmídeo pDMW367-M4 (SEQ ID NO: 39.; FIG 4C) foi obtido a partir do pDMW367 (SEQ ID NO: 38, Exemplo 3, Fig. 4A).

Os sítios de enzimas de restrição nativos EcoRI, Hindlll, Bg/11 e Ncol foram sequencialmente eliminados a partir da região codificante do EgD5R para gerar o pDMW367-M4. Primeiro, os sítios EcoRI e Bg/11 foram eliminados por mutagênese in vitro utilizando o pDMW367 (SEQ ID NO: 38) como molde, e dois pares de oligonucleotídeos como primers. O par de primers YL813 (SEQ lO NO: 40) e YL814 (SEQ lO NO: 41) habilitou a mutação do sítio Ecol, enquanto que o par primers YL815 (SEQ ID NO: 42) e YL816 (SEQ ID NO: 43) habilitou a mutação do sítio Bg/11. Estas reações geraram a construção pDMW367-M2 (FIG. 48; SEQ ID NO: 44). A análise da sequência confirmou que a sequência de aminoácidos da Eg05R variante no pOMW367 -M2 foi idêntica à sequência de aminoácidos do Eg05R no p0MW367.

Em seguida os sítios Hindl e Ncol foram eliminados por mutagênese in vitro utilizando o pOMW367 -M2 como molde, e dois pares de 5 oligonucleotídeos como primers. O par de primers YL829 (SEQ 10 NO: 45) e YL830 (SEQ 10 NO: 46) habilitou a mutação do sítio Hindl, enquanto que o par primers YL831 (SEQ 10 NO: 47) e YL832 (SEQ 10 NO: 48) habilitou a mutação do sítio Ncol. Isto resultou na geração do pOMW367-M4. Novamente, a análise da sequência confirmou que a sequência de aminoácidos do Eg05R variante (ou seja, Eg05R*) no pOMW367-M4 foi idêntica à sequência de aminoácidos do Eg05R no pOMW367.

Para exemplos subsequentes, a referência ao Eg05 tipo selvagem irá efetivamente incluir a referência ao Eg05R (SEQ 10 NOs: 24 e 25) e Eg05R* (SEQ 10 NOs: 26 e 27), a menos que especificado de outra forma.

EXEMPLO 5 IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES HDXSH (SEQ ID NO: 36) QUE RESULTAM EM ATIVIDADE DELTA-5 DESSATU RASE SIMILAR À ATIVIDADE DELTA-5 DESSATU RASE Do EGD5R* O motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) se estende a partir do resíduos de aminoácidos 155-159 do Eg05R* (SEQ 10 NO: 27). Mutações de aminoácidos pontuais foram realizadas usando pOMW367-M4 (Exemplo 4), como molde e 19 pares de oligonucleotídeos (SEQ 10 NOs :49-86, Tabela 5, abaixo), como primers para mutar individualmente o resíduo Ala do motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) do Eg05R* por mutagênese sítio-dirigida (QuickChange Kit, Stratagene, CA), gerando desse modo todas as substituições de aminoácidos possíveis (ou seja, mutantes HOxSH [SEQ 10 NO: 36]). Os plasmídeos de cada mutação foram transformados em células E.

co/i XL2Biue. Três colônias de cada uma das 19 transformações foram repicadas e cultivadas individualmente em meio líquido a 37 °C durante a noite.

Os plasmídeos (ou seja, 57 no total) foram isolados a partir destas culturas e sequenciados individualmente para confirmar as mutações.

5 O plasmídeo pDMW367-M4 tipo selvagem e os plasmídeos mutantes isolados foram transformados em Y. lipolytica cepa Y4036U1 individualmente, conforme descrito em Métodos Gerais. Os transformantes foram selecionados em placas de MMLeu. Após 2 dias de crescimento a 30 o C, três transformantes de cada reação de transformação foram semeados em placas de MMLeu novas e incubadas por mais 2 dias a 30 °C. As colônias foram então usadas para inocular 3 ml de MMLeu em um bloco Qiagen de 24 poços. Os blocos foram incubados em uma incubadora a 30 °C com agitação a 200 rpm. Depois as culturas serem incubadas durante 2 dias, os blocos foram centrifugados, o sobrenadante foi removido e 3 ml de HGM foi adicionado. Os blocos foram colocados em volta de uma incubadora a 30 °C com agitação a 200 rpm por um período adicional de 5 dias. As células foram coletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos e os ácidos graxos metil-ésteres "FAMEs" foram preparados por transesterificação, e posteriormente, analisadas com um cromógrafo Hewlett-Packard 6890 GC.

A atividade delta-5 dessaturase (média de três transformantes) atribuída a cada motivo HDxSH mutante (SEQ ID NO: 36) é resumida a seguir na Tabela 5. Os transformantes que compreendem as construções mutantes pDMW367-M4, nos quais as construções mutantes compreendem mutantes EgD5R*, são designados de acordo com a substituição de aminoácidos que ocorreu para o resíduo Ala na posição 157 dentro do EgD5R* (isto é, transformantes pDMW367M4-157C que compreende uma delta-5 dessaturase mutante designado como EgD5R*-157C, e com uma substituição de Cis para Ala na posição 157, produzindo desse modo um motivo HDcSH [SEQ ID NO:

277]; o transformante pDMW367M4-157g compreende uma delta-5 dessaturase mutante designada EgD5R*-157g, e possui uma substituição de Gli para Ala, gerando assim um motivo HDgSH [SEQ ID NO: 15], etc.) A eficiência de conversão média ("Efic. Conv. Méd.") foi mensurada de acordo 5 com a seguinte fórmula: ([produto]/[substrato + produto])*1 00, onde "produto" inclui o produto imediato e todos os produtos na via derivada dele. Os resultados são comparados com EgD5R* tipo selvagem (SEQ ID NO: 26) dentro do plasmídeo pDMW367-M4, em que a análise por CG determinou 10,8% de DGLA e 3,6% de ARA de lipídios totais que foram produzidos pelos transformantes (ou seja, a eficiência de conversão média foi de 24,8 %).

TABELAS ATIVIDADE DA OELTA-5 DESSATURASE No EG05R E MOTIVO MUTANTE HDxSH (SEQ ID NO· 36) SEQID Sequência do Efi c. Porcentage Transformante NOs de motivo HDASH Conv. m de Y4036U1* prímers mutante Méd. Atividade**

H DAS H pDMW367-M4 -- 24,8% 100 (SEQ 10 NO: 8) HDcSH pDMW367M4-157c 49 e 50 10,7% 43,1% (SEQ 10 NO: 277) HDdSH pDMW367M4-157d 51 e 52 1,0% 4,0% (SEQ 10 NO: 278) HDeSH pDMW367M4-157 e 53 e 54 0,9% 3,6% (SEQ 10 NO: 279) HDfSH pDMW367M4-157f 55 e 56 1,0% 4,0% (SEQ 10 NO: 280) HDgSH pDMW367M4-157g 57 e 58 23,8% 96% (SEQ 10 NO: 15) HDhSH pDMW367M4-157h 59 e 60 1,0% 4,0% (SEQ lO NO: 281) H OiS H pDMW367M4-157i 61 e 62 0,9% 3,6% (SEQ 10 NO: 282)

SEQIO Sequência do Efie. Porcentage Transformante NOs de motivo HOASH Conv. m de Y4036U1* primers mutante Méd. Atividade** HOkSH pOMW367M4-157k 63 e 64 1,0% 4,0% (SEQ 10 NO: 283)

H OIS H pOMW367M4-1571 65 e 66 1,1% 4,4% (SEQ 10 NO: 284) HOmSH pOMW367M4-157m 67 e 68 1,0% 4,0% (SEQ 10 NO: 285) HOnSH pOMW367M4-157n 69 e 70 1,1% 4,4% (SEQ 10 NO: 286) HOpSH pOMW367M4-157p 71 e 72 2,3% 9,3% (SEQ 10 NO: 287) HOqSH pOMW367M4-157 q 73 e 74 0,6% 2,4% (SEQ 10 NO: 288) HOrSH pOMW367M4-157r 75 e 76 0,8% 3,2% (SEQ 10 NO: 289) HDsSH pDMW367M4-157s 77 e 78 23,3% 94% (SEQ 10 NO: 16) HOtSH pOMW367M4-157t 79 e 80 1,0% 4,0% (SEQ lO NO: 290) HOvSH pOMW367M4-157v 81 e 82 0,3% 1,2% (SEQ 10 NO: 291) HOwSH pOMW367M4-157w 83 e 84 0,9% 3,6% (SEQ 10 NO: 292) HOySH pOMW367M4-157y 85 e 86 0,7% 2,8% (SEQ 10 NO: 293) * Cada gene EgD5R* (mutante ou tipo selvagem) foi expresso dentro do pDMW367 -M4.

**Porcentagem de atividade é com relação ao EgD5R*.

Com base no exposto acima, está claro que o resíduo Ala dentro do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) pode ser substituído por Gli ou Ser sem afetar significativamente a atividade delta-5 dessaturase de EgD5R*.

Especificamente, o EgD5R*-157g (SEQ ID NO: 87) nos transformantes pOMW367M4-157g foi capaz de converter OGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 23,8%, enquanto que o Eg05R*-157s (SEQ 10 NO: 88) em transformantes pOMW367M4-157s foi capaz de converter OGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 23,3%.

5 EXEMPLO 6 IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES HDAxH (SEQ ID NO: 37) QuE RESULTAM EM ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASE SIMILAR À ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASE Do EGD5R* Mutações de aminoácidos pontuais foram realizadas usando pOMW367-M4 (Exemplo 4), como molde e 19 pares de oligonucleotídeos (SEQ 10 NOs :89-126, Tabela 6, abaixo), como primers para mutar individualmente o resíduo Ala do motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) do Eg05R* por mutagênese sítio-dirigida (QuickChange Kit, Stratagene, CA), gerando desse modo todas as substituições de aminoácidos possíveis (ou seja, mutantes HOAxH [SEQ 10 NO: 37]). Após a mutagênese, os plasmídeos foram transformados em Y. lipolytica Y4036U1, os transformantes foram selecionados e cultivados em MMLeu e HGM e os FAMEs foram preparados e analisados por CG, tal como descrito no Exemplo 5.

A atividade delta-5 dessaturase (média de 3 transformantes) atribuída a cada mutação dentro do motivo HOxSH (SEQ 10 NO: 8) está resumida abaixo na Tabela 6. Os transformantes que compreendem as construções mutantes pOMW367 -M4, nos quais as construções mutantes compreendem mutantes Eg05R*, são designados de acordo com a substituição de aminoácidos que ocorreu para o resíduo Ser na posição 158 dentro do Eg05R* (isto é, transformantes p0MW367M4-158a que compreende uma delta-5 dessaturase mutante designada como Eg05R*- 158a, e com uma substituição de Ala para a Ser na posição 158, produzindo desse modo um motivo HOAaH [SEQ 10 NO: 17]; o transformante pDMW367M4-158r compreende uma delta-5 dessaturase mutante designada EgD5R*-158r, e possui uma substituição de Arg para Ser, gerando assim um motivo HDArH [SEQ ID NO: 306]. etc.) A eficiência da conversão foi mensurada de acordo com a fórmula descrita no Exemplo 5.

5 Os resultados são comparados com EgD5R* tipo selvagem (SEQ ID NO: 26) dentro do plasmídeo pDMW367-M4, em que a análise por CG determinou 11,3% de DGLA e 3,4% de ARA dos lipídios totais que foram produzidos pelos transformantes (ou seja, a eficiência de conversão média foi de 23,3%).

TABELA 6 ATIVIDADE DA DELTA-5 DESSATURASE No EG05R* E MUTANTES No MOTIVO HDAxH (SEQ ID NO· 37) . SEQID Sequência do Transformante Efic. Conv. Porcentagem NOs de motivo HDASH Y4036U1* Méd. de Atividade** primers mutante

HDAS H pDMW367-M4 -- 23,3% 100% (SEQ ID N0:8) pDMW367M4- HDAaH 89 e 90 23,5% 100,9% 158a (SEQ ID N0:17) pDMW367M4- HDAcH 91 e 92 17,9% 76,8% 158c (SEQ ID N0:294) pDMW367M4- HDAdH 93 e 94 2,8% 12,0% 158d (SEQ ID N0:295) pDMW367M4- HDAeH 95 e 96 1,9% 8,2% 158e (SEQ ID N0:296) pDMW367M4- HDAfH 97 e 98 1% 4,3% 158f (SEQ ID N0:297) pDMW367M4- HDAgH 99 e 100 25,1% 107,7% 158g (SEQ ID N0:18)

SEQID Sequência do Transformante Efic.

Conv.

Porcentagem NOs de motivo HDASH Y4036U1* Méd. de Atividade** primers mutante pDMW367M4- HDAhH 101 e 102 1,6% 6,9% 158h (SEQ 10 N0:298)

pOMW367M4- HOAiH 103 e 104 1,1% 4,7% 158i (SEQ 10 N0:299)

pOMW367M4- HDAkH 105 e 106 1% 4,3% 158k (SEQ 10 N0:300)

pOMW367M4- HDAIH 107 e 108 1,1% 4,7% 1581 (SEQ 10 N0:301)

pOMW367M4- HDAmH 109 e 11 O 2,3% 9,9% 158m (SEQ 10 N0:302)

pDMW367M4- HDAnH 111 e 112 16,5% 70,8% 158n (SEQ 10 N0:303)

pOMW367M4- HDApH 113e114 1,2% 5,2% 158p (SEQ 10 N0:304)

pOMW367M4- HDAqH 115e116 10,4% 44,6% 158q (SEQ 10 N0:305)

pOMW367M4- HOArH 117e118 10,0% 42,9% 158r (SEQ 10 N0:306)

pOMW367M4- HOAtH 119 e 120 9,6% 41,2% 158t (SEQ 10 N0:307)

pOMW367M4- HDAvH 121 e 122 1,5% 6,4% 158v (SEQ 10 N0:308)

pOMW367M4- HOAwH 123 e 124 9,3% 40,0% 158w (SEQ 10 N0:309)

pDMW367M4- HOAyH 125 e 126 1,1% 4,7% 158y (SEQ 10 N0:310)

* Cada gene EgD5R* (mutante ou tipo selvagem) foi expresso dentro do pDMW367 -M4.

** Porcentagem de atividade é com relação ao EgD5R*.

Os resultados demonstram que o resíduo Ser dentro do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) pode ser substituído tanto por Ala como por Gli 5 sem afetar significativamente a atividade delta-5 dessaturase do EgD5R*.

Especificamente, o EgD5R*-158a (SEQ ID NO: 127) nos transformantes pDMW367M4-158a foi capaz de converter DGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 23,5%, enquanto que o EgD5R*-158g (SEQ ID NO: 128), em transformantes pDMW367M4-158g foi capaz de converter DGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 25,1 %.

EXEMPLO 7 IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES HxGx (SEQ ID NO: 34) E HDxxH (SEQ ID NO: 311) QUE RESULTAM EM ATIVIDADE DELTA-5 DESSATU RASE SIMILAR À ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASE Do EGD5R* A Publicação US 201 0-0075386-A 1 descreve delta-5 dessaturases mutantes que possuem pelo menos uma mutação dentro do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) do domínio citocromo b5-like (ou seja, mutações HxGx [SEQ ID NO: 34]). O motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) se estende a partir do resíduos de aminoácidos 33 ao 36 do EgD5R (SEQ ID NO: 25).

O presente Exemplo introduz mutações dentro do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) do EgD5R*-157g (Exemplo 5, SEQ ID NO: 87), EgD5R*-158a (Exemplo 6, SEQ ID NO: 127) e EgD5R*-158g (Exemplo 6, SEQ ID NO: 128), para ver o efeito de duplas mutações dentro dos domínios HPGG (SEQ ID NO: 7) e HDASH (SEQ ID NO: 8).

Mutações pontuais de aminoácidos foram realizadas usando o pDMW367M4-157g (Exemplo 5, SEQ ID NO: 129), pDMW367M4-158a (Exemplo 6, SEQ ID NO: 130) e pDMW367-158g (Exemplo 6, SEQ ID NO: 131) como molde e diversos pares de oligonucleotídeos (SEQ ID NOs :132-137,

Tabela 7) como primers para mutar individualmente o resíduo Pro ou o segundo resíduo Gli do motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) do gene da delta-5 dessaturase mutante por mutagênese sítio-dirigida (QuickChange Kit, Stratagene, CA), gerando mutações duplas dentro dos motivos HPGG (SEQ 10 5 NO: 7) e HOASH (SEQ 10 NO: 8). Após a mutagênese, os plasmídeos foram transformados em Y. lipolytica cepa Y4036U 1, os transformantes foram selecionados e cultivados em MMLeu e HGM e os FAMEs foram preparados e analisados por CG, tal como descrito no Exemplo 5.

As atividades delta-5 dessaturase das delta-5 dessaturases mutantes com ambas mutações, HxGx (SEQ 10 NO: 34) e HOxxH (SEQ 10 NO: 311), estão resumidas abaixo na Tabela 7. Os transformantes compreendendo construções pOMW367M4 mutantes, em que as construções mutantes compreendem Eg05R* mutantes, são designados de acordo com a substituição de um aminoácido para o resíduo Pro ou o segundo resíduo Gli dentro do motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) do Eg05R*, combinado com a substituição de aminoácido para o resíduo Ala ou resíduo Ser dentro do motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) do Eg05R*. Ou seja, o transformante pOMW367- 34g158g compreende uma delta-5-dessaturase mutante designada como Eg05R*-34g158g, possuindo uma substituição Gli para a Pro da posição 34 (produzindo assim um motivo HgGG [SEQ 10 NO: 9]) e possuindo uma substituição Gli para a Ser na posição 158 (produzindo deste modo um motivo HOAgG [SEQ 10 NO: 18]), etc.

A eficiência da conversão foi mensurada de acordo com a fórmula descrita no Exemplo 5. Os resultados são comparados ao do Eg05R* tipo selvagem dentro do plasmídeo pOMW367-M4, em que a análise por CG determinou 11,7% de OGLA e 4,4% de ARA dos lipídios totais que foram produzidos pelos transformantes (ou seja, a eficiência de conversão média foi de 27,5%).

TABELA 7 ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASES EM MUTANTES EGD5R* COMPREENDENDO SIMULTANEAMENTE MOTIVOS HXGX (SEQ ID NO· 34) E HDxxH (SEQ ID NO· 311) Transformante Gene SEQ ID -{}-Sequência Sequência Eficiência Porcentagem Y4036U1 mutante de do Motivo do Motivo de de Atividade primers HPGG HDASH conversão em Relação Mutante média ao EgD5R* pDMW367-M4 -- HPGG HDASH 27,5% 100% (SEQ ID (SEQ ID NO:?) N0:8) pDMW367- EgD5R*- 132 e HgGG HDgSH 22,9% 83% 34g157g 34g157g 133 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID N0:9) N0:15) NOs:138 e 139) pDMW367- EgD5R*- 132 e HgGG HDAaH 24,3% 88% 34g158a 34g158a 133 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID N0:9) N0:17) NOs:140 e 141) pDMW367- EgD5R*- 132 e HgGG HDAgH 26,8% 97% 34g158g 34g158g 133 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID N0:9) N0:18) NOs:142 e 143) pDMW36- EgD5R*- 134 e HhGG HDAaH 18,7% 68% 34h158a 34h158a 135 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID N0:10) N0:17) NOs:144 e 145) pDMW367- EgD5R*- 134 e HhGG HDAgH 22% 80% 34h158g 34h158g 135 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID N0:10) N0:18) NOs:146 e 147) pDMW367- EgD5R*- 136 e HPGs HDAaH 17,5% 64% 36s158a 34s158a 137 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 11) N0:17) NOs:148 e 149) ··---- pDMW367- EgD5R*- 136 e HPGs HDAgH 18,9% 69% 36s158g 34s158g 137 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 11) N0:18) NOs:150 e 151) * Cada gene Eg05R* (mutante ou tipo selvagem) foi expresso dentro do pOMW367 -M4.

Os resultados demonstraram que, embora o motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) e o motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) sejam importantes para a atividade enzimática da delta-5-dessaturase, as dessaturases podem ser construídas possuindo motivos HxGx (SEQ ID NO: 34) e HDxxH (SEQ ID NO: 311) que retêm pelo menos 64% de atividade delta-5-dessaturase quando comparada com a tipo selvagem. Especificamente, o resíduo Pro dentro do 5 motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) pode ser substituído por Gli, com substituição simultânea de: 1) o resíduo Ala no motivo H DAS H (SEQ ID NO: 8) para Gli, ou, 2) o resíduo Ser no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) para Ala ou Gli. O resíduo Pro no motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) também pode ser substituído por His, com substituição simultânea do resíduo Ser no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) para um Ala ou Gli. E, segundo resíduo Gli dentro do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) também pode ser substituído por Ser, com substituição simultânea do resíduo Ser no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) para um Ala ou Gli.

Mutantes duplos preferidos foram EgD5R*-34g157g (SEQ ID NO: 139; capaz de converter DGLA em ARA com eficiência de conversão de 22,9% em transformantes pDMW367-34g157g), EgD5R*-34g158a (SEQ ID NO: 141; capaz de converter DGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 24,3% em transformantes pDMW367-34g158a) e EgD5R*-34g158g (SEQ ID NO: 143; capaz de converter DGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 26,8% em transformantes pDMW367-34g158g).

EXEMPLO 8 SíNTESE DE UM GENE DELTA-5 DESSATURASE MUTANTE COM N-TERMINAL CóDON- OTIMIZADO ("EG05M") PARA A EXPRESSÃO EM YARROWIA LIPOL YTICA, DERIVADO DO EGD5R*-34G158G O uso preferencial de códons (codon usage) da porção 5' do EgD5R*-34g158g (SEQ ID NO: 142, Exemplo 7) foi otimizado para a expressão em Y. lipolytica, de uma maneira semelhante à descrita na Patente US

7.125.672. Especificamente, os primeiros 204 bp do EgD5R* 34g158g foram códon-otimizados para resultar na síntese de um gene delta-5 dessaturase códon-otimizado designado "EgD5M" (SEQ ID NOs: 152 e 153). O EgD5M foi desenhado com base na sequência codificante do gene delta-5-dessaturase EgD5R*-34g158g, de acordo com o padrão de utilização preferencial de códons (codon usage) da Yarrowía (Patente US 7.125.672), da sequência de 5 consenso em torno códon "ATG" de iniciação da tradução, e das regras gerais de estabilidade de RNA (Guhaniyogi, G. e J. Brewer, Gene, 265 (1-2) :11-23 (2001 )).

Além da modificação do sítio de iniciação da tradução, 52 pb dos 204 pb dentro da extremidade N-terminal da região codificante foram modificados (25,5%;. FIG 5), e 45 dos 68 códons de aminoácidos dentro do N- terminal da proteína dessaturase foram otimizados (66,2%). Um sítio Ncol e sítios Notl foram incorporados em torno do códon de iniciação da tradução e após o códon de parada do EgD5M, respectivamente.

A sequência da proteína codificada pelo gene EgD5M códon- otimizado (por exemplo, SEQ ID NO: 153) é idêntica à sequência de proteína do EgD5R*-34g158g tipo selvagem (ou seja, SEQ ID NO: 143). O gene EgD5M concebido (SEQ ID NO: 152) foi sintetizado pela GenScrípt Corporatíon (Piscataway, NJ) e clonado em pUC57 (número de acesso GenBank: Y14837) para gerar o pEgD5M (FIG. 6A, SEQ ID NO: 154).

EXEMPL09 GERAÇÃO DA CONSTRUÇÃO PDMW367 -5M, COMPREENDENDO EGD5M O presente Exemplo descreve a construção do plasmídeo pDMW367-5M, que compreende um gene FBAIN::EgD5M::Pex20 quimérico. O plasmídeo pDMW367-5M (Figura 68, SEQ ID NO: 155) foi construído pela substituição do fragmento Ncoi/Notl EgD5R* do pDMW367-M4 (FIG. 4, SEQ ID NO: 39) pelo fragmento Ncoi/Notl EgD5M do pEgD5M (FIG. 6A, SEQ ID NO: 154). O produto desta ligação foi o pDMW367-5M, que dessa forma continha os seguintes componentes:

TABELA 8 COMPONENTES Do PLASMÍDEO PDMW367-5M (SEQ ID NO· 155) Sítios Re e nucleotídeos Descrição dos componentes do fragmento e Gene dentro da Quimérico SEQ ID NO: 155 FBAIN::EgD5M::Pex20, compreendendo: • FBAIN: Yarrowia lipolytica promotor FBAIN (Patente US 7.202.356); • EgD5M: EgD5R*-34g158g delta-5 dessaturase EcoR l/Bs1W I ["EgD5M"] mutante sintético com N-terminal códon- (6063-318) otimizado (SEQ ID N0:152), derivado da Euglena gracilis; • Pex20: Pex20 sequência terminadora do gene Pex20 de Yarrowia (número de acesso GenBank: AF054613) 1354-474 Origem de replicação plasmidial CoiE1 gene de resistência à ampicilina (AmpR) para a seleção 2284-1424 em E. co/i Sequência de replicação autônoma da Yarrowia 3183-4476 (ARS 18; número de acesso GenBank: A 17608) Gene Ura 3 de Yarrowia (número de acesso GenBank: 6020-4533 AJ306421) EXEMPLO 10 GERAÇÃO DA CONSTRUÇÃO PDMW367 -5M1, QUE COMPREENDE O "EGD5M1" 5 VARIANTE DO GENE DELTA-5 DESSATURASE MUTANTE COM N-TERMINAL CóDON-

OTIMIZADO O presente Exemplo descreve a construção do plasmídeo pDMW367-5M1, que compreende um gene FBAIN::EgD5M1 ::Pex20 quimérico. A sequência de nucleotídeos do EgD5M1 (SEQ 10 NO: 156) é idêntica ao do EgD5M (SEQ ID NO: 152), com a exceção que códon CGA para Arg na posição 347 no EgD5M foi alterado para codificar um códon AGC para Ser no EgD5M1. Esta modificação foi concebida para uma analisar o efeito da mutação R347S (descrita no Exemplo 3) sobre a atividade delta-5-dessaturase.

O gene EgD5M 1 desenvolvido (também referido como "EgD5R*-34g158g347S"; SEQ ID NO: 156) foi sintetizado pela GenScript Corporation (Piscataway, NJ) e clonado em pUC57 (número de acesso 5 GenBank: Y14837) para gerar o pEgD5M1 (SEQ ID NO: 158).

O plasmídeo pDMW367-5M1 (SEQ ID NO: 159) foi construído pela substituição do fragmento Ncoi!Notl EgD5R* do pDMW367-M4 (FIG. 4, SEQ ID NO: 39) pelo fragmento Ncoi/Notl EgD5M1 do pEgD5M1 (SEQ ID NO: 158). O produto desta ligação foi o pDMW367-5M1, compreendendo um gene FBAIN::Eg05M1 ::PEX20 quimérico.

EXEMPLO 11 ANÁLISE FUNCIONAL DA DELTA-5 DESSATURASES EGD5M E EG05M1 EM YARROWIA LIPOLYTICA CEPA Y4036U1 O Plasmídeo controle pDMW367-M4 (SEQ ID NO: 39; Exemplo 4) e os plasmídeos pDMW367-5M (SEQ ID NO: 155; Exemplo 9) e pDMW367 -5M1 (SEQ lO NO: 159; Exemplo 1O) foram cada uma deles transformados separadamente em Y . lipolytica cepa Y4036U1. Os transformantes foram selecionados e cultivados em MMLeu e HGM e os FAMEs foram preparados e analisados por CG, tal como descrito no Exemplo 5.

A atividade delta-5-dessaturase (média de três transformantes) do Eg05R*, EgD5M e EgD5M1 estão resumidas abaixo na Tabela 9. A eficiência da conversão ("Efic. Conv.") foi mensurada de acordo com a fórmula descrita no Exemplo 5. Os resultados são comparados com do EgD5R* tipo selvagem (SEQ ID NO: 26) dentro do plasmídeo pDMW367-M4, em que a análise por CG determinou 10,8% de DGLA e 3,6% de ARA dos lipídios totais que foram produzidos pelos transformantes (ou seja, a eficiência de conversão média foi de 24,8%).

TABELA 9 ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASE No EGD5R* I EGD5M E EGD5M1 Plasmídeo Sequência dos Aminoácido Efie. Delta-5 Transformado Motivos H PGG e no resíduo Conv. Dessaturase em Y4036U1 HDASH mutantes 347 Méd. EgD5R* (SEQ HPGG (SEQ ID pDMW367-M4 ID NOs: 26 e NO:?), HDASH (SEQ R 24,8% 27) ID N0:8) EgD5M(SEQ HgGG (SEQ ID pDMW367-5M ID NOs: 152 e N0:9), HDAgH (SEQ R 26,5% 153) ID N0:18) EgD5M1 (SEQ HgGG (SEQ ID pDMW367-5M1 ID NOs: 156 e N0:9), HDAgH (SEQ s 27,6% 157) ID N0:18) Os resultados demonstraram que tanto EgD5M (SEQ ID NO: 153) quanto Eg05M1 (SEQ ID NO: 157) tiveram maior atividade de delta-5- 5 dessaturase do que o EgD5R* tipo selvagem (SEQ ID NO: 27). A melhoria da atividade delta-5-dessaturase no EgD5M1, quando comparada com a do EgD5M, demonstra que o resíduo de aminoácido 347 afeta a atividade da proteína delta-5-dessaturase, com Ser preferido ao invés de Arg.

EXEMPLO 12 IDENTIFICAÇÃO DE HPGs (SEQ ID NO: 11) E MUTAÇÕES HxxxH (SEQ ID NO: 1) EM UM GENE DELTA-5 DESSATURASE SINTÉTICO ("EGD55") DERIVADO DE EUGLENA GRACILIS E CóDON-OTIMIZADO PARA A EXPRESSÃO EM YARROWIA

LIPOLYTICA O presente Exemplo introduz mutações dentro do HDASH (SEQ ID NO: 8) do motivo de um EgD5S-36s mutante (ou "EgD5S-HPGs") de genes para determinar o efeito de mutações duplas dentro dos domínios conservados HPGG (SEQ ID NO: 7) e HDASH (SEQ ID NO: 8).

O gene EgD5S (SEQ ID NOs: 22 e 23) é de uma delta-5 dessaturase sintética derivada do EgD5 (Exemplo 3) e códon-otimizada para a expressão em Y. lipolytica (Patente US 7.678.560). Embora a sequência de aminoácidos do EgD5S fosse idêntica ao do EgD5, as sequências de nucleotídeos diferem, especificamente, em adição à alteração do sítio de 5 iniciação da tradução, 196 bp dos 1350 pb da região codificante foram modificados (14,5%) e 189 códons foram otimizados (42 %). O conteúdo de GC foi reduzido de 55,5% dentro do gene tipo selvagem (ou seja, EgD5) para 54,4% dentro do gene sintético (EgD5S). E um sítio Ncol e sítios Notl foram incorporados em torno do códon de iniciação da tradução e após o códon de parada do EgD5S, respectivamente.

Os exemplos 1 a 4 da Publicação US 2010-0075386-A1 descrevem a identificação de mutantes EgD5S-36s (SEQ ID NO: 160), utilizando o EgD5S como modelo em reações de mutagênese sítio-dirigida para modificar o segundo resíduo Gli do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7 ) do EgD5S, que se estende a partir de resíduos de aminoácidos 33 até 36 do domínio citocromo b 5-like (mutações HPGx [SEQ ID NO: 33]). Assim, mutantes EgD5S- 36s compreendiam um motivo HPGs (SEQ ID NO: 11 ), nos quais o segundo resíduo Gli do motivo HPGG (SEQ ID NO: 7) foi substituído por Ser utilizando o EgD5S (SEQ ID NO: 23) como molde. A atividade delta-5-dessaturase do EgD5S-36s (Pedido de Patente Publicado 201 0-0075386-A 1) foi cerca de 106,9% em relação a atividade delta-5 dessaturase do EgD5S. O plasmideo pDMW369S (SEQ ID NO: 161), contém o gene Eg05S-36s mutante, os componentes do vetor são semelhantes aos do pDME367-5M (Figura 68), com a exceção de que o gene EgD5S-36s mutante está no lugar do gene EgD5M).

Com base na geração bem sucedida de EgD5R* duplos mutantes no Exemplo 7 (isto é, que compreendem simultaneamente motivos HPGG mutante [SEQ ID NO: 7] e HDASH mutante [SEQ ID NO: 8]), previu-se que mutações similares a HxxxH (SEQ ID NO : 1) seriam toleradas quando introduzidas no

EgD5S-36s. Especificamente, mutações pontuais de aminoácidos foram realizadas usando o pDMW369S (compreendendo um gene quimérico FBAIN::EgD5S- 36S::Pex20) como molde e nove pares de oligonucleotídeos (SEQ ID NOs :162-179, Tabela 10) como primers para mutar individualmente o resíduo Asp, Ala ou Ser no 5 motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) do EgD5S-36s (SEQ ID NO: 160), por meio da mutagênese sítio-dirigida (QuickChange Kit, Stratagene, CA), gerando assim 9 substituições de aminoácidos selecionadas. Após a mutagênese, os plasmídeos foram transformados em Y lipolytica cepa Y4036U 1, os transformantes foram selecionados e cultivados em MMLeu e HGM e os FAMEs foram preparados e 1o analisados por CG, tal como descrito no Exemplo 5.

As atividades delta-5 dessaturase das delta-5 dessaturases mutantes (média de 3 transformantes) com ambas mutações, HPGs (SEQ ID NO: 11) e HxxxH (SEQ ID NO: 1), estão resumidas abaixo na Tabela 1O. Os transformantes contendo as construções mutantes pDMW369S, em que as construções mutantes compreendem os mutantes de EgD5S-36s, são designados de acordo com a substituição de aminoácidos que ocorreram para o resíduo Asp, Ala ou Ser no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) (ou seja, o transformante pDMW369S-156e compreende um gene mutante da delta-5-dessaturase designado como EgD5S- 36s156e, e que tem uma Glu para a substituição Asp na posição 156, produzindo desse modo um motivo HeASH [SEQ ID NO: 19]; o transformante pDMW369S- 157g compreende um gene mutante da delta-5 dessaturase designado como EgD5S-36s157g, possuindo uma Gli para a substituição Ala, gerando assim tempo um motivo HDgSH [SEQ ID NO: 15], etc.) A eficiência da conversão foi mensurada de acordo com a fórmula descrita no Exemplo 5. Os resultados são comparados com os resultados do EgD5S-36S (SEQ ID NO: 160) dentro do plasmídeo pDMW369S, em que a análise por CG determinou 8,1% de DGLA e 6,8% de ARA dos lipídios totais que foram produzidos pelos transformantes (ou seja, a eficiência de conversão média foi de 45,8%).

TABELA 10

ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASES EM MUTANTES EG055 COMPREENDENDO SIMULTANEAMENTE MOTIVOS HPGS (SEQ 10 NO: 11)

E HXXXH MUTANTE (SEQ 10 NO: 1) Transformante Gene Mutante SEQ ID NOs Sequência do Motivo Eficiência de Porcentagem de Y4036U1 de Primers HDASH Mutante conversão Atividade em Relação média ao EgD5S-36S pDMW369S EgD5S-36s -- HDAS H 45,8% 100% (SEQ ID N0:160) (SEQ ID N0:8) pDMW369S-157f EgD5S-36s157f 162 e 163 HDfSH 3,4% 7,4% (SEQ ID N0:280) pDMW369S-157m EgD5S-36s157m 164 e 165 HDmSH 2,4% 5,2% (SEQ ID N0:285) pDMW369S-157g EgD5S-36s157g 166 e 167 HDgSH 36,6% 79,9% ....... ....... (SEQ ID NOs:182 e 183) (SEQ ID N0:15) o pDMW369S-157S EgD5S-36s157s 168 e 169 HDsSH 17,9% 39,1% (SEQ ID N0:16) pDMW369S-158 3 Eg D5S-36s 158a 170 e 171 HDAaH 39,1% 85,4% (SEQ ID NOs:184 e 185) (SEQ ID N0:17) pDMW369S-158n EgD5S-36s158n 172 e 173 HDAnH 13,0% 28,4% (SEQ ID N0:303) pDMW369S-158t Eg D5S-36s 158t 174 e 175 HDAtH 4,5% 9,8% (SEQ ID N0:307) pDMW369S-158g EgD5S-36s158g 176 e 177 HDAgH 34,3% 74,9% (SEQ ID NOs:186 e 187) (SEQ ID N0:18) pDMW369S-156e EgD5S-36s156e 178 e 179 HeASH 36,2% 79,0% (SEQ ID NOs:180 e 181) (SEQ ID N0:19) --

Os resultados demonstraram que o EgD5S da delta-5-dessaturase códon-otimizado pode ser modificado para incluir tanto o motivo HPGG mutante (SEQ ID NO: 7) quanto o motivo HDASH mutante (SEQ ID NO: 8), mantendo uma atividade delta-5 dessaturase razoável quando comparada com o EgD5S-36s 5 mutante, possuindo apenas um motivo HPGG mutante (ou seja, HPGs [SEQ ID NO: 11]). Os mutantes duplos preferidos foram Eg05S-36s156e (SEQ ID NO s: 180 e 181 ; capaz de converter DGLA em ARA com eficiência de conversão de 36,2% em transformantes pDMW369S-156e), EgD5S-36s157g (SEQ ID NOs: 182 e 183, capaz de converter DGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 36,6% em transformantes pDMW369S-157g), EgD5S-36s158a (SEQ ID NOs: 184 e 185; capaz de converter DGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 39,1% em transformantes pDMW369S-158a) e EgD5S-36s158g (SEQ ID NOs: 186 e 187; capaz de converter OGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 34,3% em transformantes pDMW369S-158g).

EXEMPLO 13 IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES HAGG (SEQ ID NO: 14) E HxxxH (SEQ ID NO: 1) EM UM GENE DELTA-5 DESSATURASE SINTÉTICO ("EAD5S") DERIVADO DE EUGLENA ANABAENA E CóDON-OTIMIZADO PARA A EXPRESSÃO EM YARROWIA LIPOL YTICA O presente Exemplo introduz mutações dentro do motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8) de um gene Eg05S-36s mutante (ou "Eg05S-HPGs") para determinar o efeito das mutações duplas dentro dos domínios HPGG (SEQ lO NO: 7) e HOASH (SEQ 10 NO: 8) conservados.

A Patente US 7.943.365 descreve o isolamento e clonagem de uma delta-5 dessaturase de E. anabaena (ou seja, Eg05, SEQ 10 NO: 28). Este gene foi então códon-otimizado para a expressão em Y. lipolytica, resultando no gene EaD5S sintético da delta-5 dessaturase (SEQ ID NO: 30). Embora a sequência de aminoácidos do Ea05S fosse idêntica ao do Ea05, as sequências de nucleotídeos diferem, especificamente, em adição à alteração do sítio de iniciação da tradução,

em que 183 bp dos 1362 pb da região codificante foram modificados (13,4%) e 174 códons foram otimizados (38,3%). O conteúdo de GC foi reduzido de 57,6% dentro do gene tipo selvagem (ou seja, Ea05) para 54,6% dentro do gene sintético (Ea05S). E um sítio Ncol e sítios Notl foram incorporados em torno do códon de 5 iniciação da tradução e após o códon de parada do Ea05S, respectivamente.

O Exemplo 6 da Publicação US 201 0-0075386-A 1 descreve a identificação de mutantes Ea05S-36a (SEQ 10 NO: 188), utilizando o Ea05S como modelo em reações de mutagênese sítio-dirigida para modificar o resíduo Pro do motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7 ) do Ea05S, que se estende a partir de resíduos de aminoácidos 34 até o 37 do domínio citocromo b 5-líke (ou seja, mutações HxGG [SEQ 10 NO: 32]). Assim, o mutante Ea05S-35a (SEQ 10 NO: 188) compreende um motivo HaGG (SEQ 10 NO: 14), em que o resíduo Pro do motivo HPGG (SEQ 10 NO: 7) foi substituído por Ala utilizando o Ea05S (SEQ 10 NO : 31) como molde. A atividade delta-5-dessaturase do Ea05S-36a (Pedido de Patente Publicado 201 0-0075386-A 1) foi cerca de 99,2% em relação a atividade delta-5 dessaturase do Ea05S. O plasmídeo pZuFmEa05S-A(S) (SEQ 10 NO: 189), contém o gene Ea05S-36a mutante, os componentes do vetor são semelhantes aos do pOMW367-5M (Figura 68, na presente invenção), com a exceção de que o gene Ea05S-36a mutante está no lugar do gene Ea05M).

Com base na geração bem sucedida dos duplos mutantes Eg05R* no Exemplo 7 e duplos mutantes Eg05S no Exemplo 12 (isto é, que compreendem simultaneamente motivos HPGG mutante [SEQ 10 NO: 7] e HOASH mutante [SEQ 10 NO: 8]), previu-se que mutações similares a HxxxH (SEQ lO NO : 1) seriam toleradas quando introduzidas no Ea05S-36a. O motivo HOASH (SEQ 10 NO: 8), abrange do resíduo de aminoácido 156 até o resíduo 160 do Ea05S e Ea05S-35a.

Mutações pontuais de aminoácidos foram realizadas usando o pZuFmEa05S-A(S) (compreendendo um gene quimérico FBAIN::Ea05S-

36Sa::Pex20) como molde e 9 pares de oligonucleotídeos (SEQ ID NOs :190-211, Tabela 11) como primers para mutar individualmente o resíduo Asp, Ala ou Ser dentro do motivo HDASH (SEQ ID NO: 8) do EaD5S-36a (SEQ ID NO: 188), por meio da mutagênese sítio-dirigida (QuickChange Kit, Stratagene, CA), gerando 5 assim 9 substituições de aminoácidos selecionadas. Após a mutagênese, os plasmídeos foram transformados em Y. lipolytica cepa Y4036U1, os transformantes foram selecionados e cultivados em MMLeu e HGM e os FAMEs foram preparados e analisados por CG, tal como descrito no Exemplo 5.

As atividades delta-5 dessaturase das proteínas delta-5 1o dessaturases mutantes (média de 3 transformantes) compreendendo ambas mutações, HaGG (SEQ ID NO: 14) e HxxxH (SEQ ID NO: 1), estão resumidas abaixo na Tabela 11. Os transformantes compreendendo as construções mutantes pZuFmEaD5S-A(S), em que as construções mutantes compreendem os genes mutantes EaD5S-35a, são designados de acordo com a substituição de aminoácidos que ocorreu para o resíduo Asp, Ala ou Ser no motivo HDASH (SEQ ID NO: 8). Isto é, por exemplo, o transformante pZuFmEaD5S-A(S)-157E compreende um gene da delta-5 dessaturase mutante designado como EaD5S- 35a157e, e possuindo uma Glu para a substituição Asp na posição 157, produzindo assim um motivo HeASH (SEQ ID NO 19); o transformante pZuFmEaD5S-A (S)-158g compreende um gene da delta-5 dessaturase mutante designado como EaD5S-35a158g, que possui uma Gli para a substituição Ala, gerando dessa forma um motivo HDgSH (SEQ ID NO 15) e etc. A eficiência da conversão foi mensurada de acordo com a fórmula descrita no Exemplo 5. Os resultados são comparados aos resultados obtidos com o EaD5S-35a (SEQ ID NO: 188) dentro do plasmídeo pZuFmEaD5S-A(S), em que a análise por CG determinou 8,6% de DGLA e 5,1% de ARA dos lipídios totais que foram produzidos pelos transformantes (ou seja, a eficiência de conversão média foi de 37,2%).

.. ' TABELA 11 ATIVIDADE DELTA-S DESSATURASES EM MUTANTES EA05S COMPREENDENDO SIMULTANEAMENTE MOTIVOS HAGG (SEQ 10 NO: 14) E HxxxH MUTANTE {SEQ 10 NO: 1) Porcentagem de Eficiência de SEQ ID NOs Sequência do Motivo Atividade em Transformante Y4036U1 Gene Mutante conversão de Primers HDASH Mutante Relação ao média EaD5S-36a . EaD5S-35a (SEQ ID pZuFmEaD5S-A(S) -- HDASH (SEQ ID N0:8) 37,2% 100% N0:188) pZuFmEaD5S-A(S)-157e EaD5S-35a157e 190 e 191 HeASH (SEQ ID N0:19) 14,0% 37,6% pZuFmEaD5S-A(S)-158f EaD5S-35a157f 192 e 193 HDfSH (SEQ 10 N0:280) 2,1% 5,6% I Ea05S-35a158g (SEQ ' pZu FmEaDSS-A(S )-158g 194 e 195 HDgSH (SEQ ID N0:15) 28,4% 76,3% I ->. ID N0s:212 e 213) ->.

pZu Fm EaD5S-A(S )-158m EaD5S-35a 158m 196 e 197 HDmSH (SEQ ID N0:285) 1,8% 4,8% ~ EaDSS-35a158s (SEQ pZuFmEaD5S-A(S)-158s 198 e 199 HDsSH (SEQ ID N0:16) 27,4% 73,7% ID NOs:214 e 215) pZuFmEaD5S-A(S)-158y EaD5S-35a 158y 200 e 201 HDySH (SEQ ID N0:293) 1,9% 5,1% pZuFmEaD5S-A(S)-159a EgD5S-35a 159a 202 e 203 HDAaH (SEQ ID N0:17) 2,0% 5,4% pZuFmEaD5S-A(S)-159c Ea05S-35a 159c 204 e 205 HOAcH (SEQ 10 N0:294) 14,2% 38,2% Ea05S-35a159g (SEQ pZuFmEaDSS-A(S)-159g 206 e 207 HDAgH (SEQ lO NO: 18) 26,5% 71,2% 10 N0s:216 e 217) pZuFmEa05S-A(S)-159n Ea05S-35a159n 208 e 209 HOAnH (SEQ ID N0:303) 4,2% 11,3% pZuFmEa05S-A(S)-159t EaD5S-35a 159t --- - 210e211 HDAtH (SEQ ID N0:307) 9,8% 26,3%

Os resultados demonstraram que o gene Ea05S da delta-5- dessaturase códon-otimizado pode ser modificado para incluir tanto o motivo HPGG mutante (SEQ 10 NO: 7) quanto o motivo HDASH mutante (SEQ 10 NO: 8), mantendo uma atividade delta-5 dessaturase razoável quando comparada 5 com o EaD5S-36a mutante, possuindo apenas um motivo HPGG mutante (ou seja, HaGG [SEQ 10 NO: 14]). Os duplos mutantes preferidos foram Ea05S- 35a158g (SEQ 10 NOs: 212 e 213; capaz de converter OGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 28,4% em transformantes pZuFmEa05S-A(S)- 158g), Ea05S-35a158s (SEQ 10 NOs: 214 e 215; capaz de converter OGLA 10 em ARA com uma eficiência de conversão de 27,4% em transformantes pZuFmEa05S-A(S)-158s) e Ea05S-35a159g (SEQ 10 NOs: 216 e 217; capaz de converter OGLA em ARA com uma eficiência de conversão de 26,5% em transformantes pZuFmEa05S -A(S)-159g).

EXEMPLO 14 15 GERAÇÃO DE YARROWIA L/POLYT/CA CEPAZ1978 PARA PRODUZIR CERCA DE 58,7% DE EPA Do TOTAL DE ÁCIDOS GRAXOS O exemplo descreve a construção da cepa Z1978, derivada de Yarrowia lipo/ytíca ATCC # 20362, capaz de produzir cerca de 58,7% de EPA em relação ao total de ácidos graxos ["EPA % TFAs"] com o teor total de 20 lipídios de 38,3% ["TFAs% DCW"] por meio da expressão de uma via da delta- 9 elongase/delta-8 dessaturase.

Genótipo da Yarrowia lípolvtica cepa Y9502 A geração da cepa Y9502 é descrita na Publicação do Pedido de Patente US 2010-0317072-A1. A cepa Y9502, provenientes da Y. /ipo/ytica 25 ATCC# 20362, foi capaz de produzir cerca de 57,0% de EPA em relação aos lipídeos totais pela expressão de uma via delta-9 elongase/delta-8 dessaturase (FIG. 7).

O genótipo final da cepa Y9502 em relação a Y. lipolytica ATCC #

20362 tipo selvagem foi: Ura+, Pex3-, unknown (desconhecido) 1-, unknown 2-, unknown 3-, unknown 4-, unknown 5-, unknown6-, unknown 7-, unknown 8-, unknown9-, unknown 10-, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1 ::ME3S::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1 ::EgD9eS::Lip1, 5 GPAT::EgD9e::Lip2, YAT1 ::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1 ::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD8M::Lip1, GPD::EaD8S::Pex16 (2 copies), YAT1 ::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1 ::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2, GPD::FmD12::Pex20, YAT1 ::FmD12::0ct, EXP1 ::FmD12S::Aco, GPDIN::FmD12::Pex16, EXP1 ::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, GPDIN::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1 ::EgD5SM::Lip1, YAT1 ::EaD5SM::Oct, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1 ::PaD17::Pex16, YAT1 ::PaD17S::Lip1, YAT1 ::YICPT1 ::Aco, YAT1 ::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1, YAT1 ::MaLPAAT1 S::Pex16. As abreviações são as seguintes: FmD12 é um gene da delta-12 dessaturase de Fusarium moniliforme [Patente US 7.504.259]; FmD12S é um gene códon- otimizado da delta-12 dessaturase derivada de F. moniliforme [Patente US

7.504.259]; ME3S é um gene códon-otimizado da C1611a elongase obtido a partir de Mortierella alpina [Patente US 7.470.532]; EgD9e é um gene da delta-9 elongase de Euglena gracilis [Patente US 7.645.604]; EgD9eS é um gene códon-otimizado da delta-9 elongase derivado de E. gracilis [Patente US

7.645.604]; EgD8M é um gene sintético da delta-8 dessaturase mutante [Patente US 7.709.239], derivado de E. gracilis [Patente US 7.256.033]; EaD8S é um gene códon-otimizado da delta-8 dessaturase derivado de Euglena Anabaena [Patente US 7.790.156]; E389D9eS/EgD8M é uma DGLA sintase criada pela ligação de um gene códon-otimizado da delta-9 elongase ("E389D9eS"), derivado de Eutreptiella sp.CCMP389 (Patente US 7.645.604) com o gene da delta-8 dessaturase "EgD8M" (supra) [Pedido de Patente 2008- 0254191-A1]; EgD9eS/EgD8M é uma DGLA sintase criada pela ligação de um gene da delta-9 elongase "Eg09eS" (supra) a um gene da delta-8 dessaturase "Eg08M" (supra) [Pedido de Patente US 2008-0254191-A1]; Ea09eS/Eg08M é uma DGLA sintase criada pela ligação de um gene códon-otimizado da delta-9 elongase ("EaD9eS"), derivado de E. Anabaena [Patente US 7.794.701] com o 5 gene da delta-8 dessaturase "EgD8M" (supra) [Pedido de Patente US 2008- 0254191-A1]; Eg05M e Eg05SM são mutantes sintéticos dos genes da delta-5 dessaturase compreendendo um motivo HPGs mutante (SEQ 10 NO: 11) [Pedido de Patente US 201 0-0075386-A 1], derivado de E. gracilís [Patente US

7.678.560]; EaD5SM sintético é um gene mutante da delta-5 dessaturase que compreende um motivo Hagg (SEQ ID NO: 14) [Pedido de Patente US 2010- 0075386-A1J, derivado de E. Anabaena [Patente US 7.943.365]; Pa017 é um gene delta-17 dessaturase de da Pythium aphanidermatum [Patente US

7.556.949]; PaD17S é um gene códon-otimizados da delta-17 dessaturase derivado de P. aphanidermatum [Patente US No. 7.556.949]; YICPT1 é um gene da diacílglicerol colinafosdotransferase de Yarrowia lipolytica [Patente US

7.932.077]; MCS é um gene códon-otimizado da malonii-CoA sintetase derivado de Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 [Pedido de Patente 2010-0159558-A1], e, MaLPAAT1S é um gene códon-otimizado da ácido lisofosfatídico aciltransferase, derivado de Mortierella alpina [Patente US

7.879.591 ]. Para uma análise detalhada do teor total de lipídeos e composição na cepa Y9502, um balão ensaio foi utilizado no qual as células foram cultivadas em 2 estágios por um total de 7 dias. Com base nas análises, a cepa Y9502 produziu 3,8 g/L DCW, 37,1% TFAs% DCW, 21,3% de EPA% DCW, e o perfil lipídico foi o seguinte, em que a concentração de cada ácido graxo é representada como uma porcentagem em peso de TFAs ["% TFAs" ]: 16:0 (palmitato)-2,5, 16:1 (ácido palmitoleico)- 0,5, 18:0 (ácido esteárico)- 2,9, 18:1 (ácido oleico)- 5,0, 18:2 (LA)- 12,7, ALA - 0,9, EDA- 3,5, DGLA- 3,3,

ARA- 0,8, ETrA- 0,7, ETA- 2,4, EPA- 57,0, outro- 7,5.

Geração de Yarrowia lipolytica cepa Z1978 a partir da cepa Y9502 O desenvolvimento da cepa Z1978 a partir da cepa Y9502 é exibido na FIG. 7 e descrito No Pedido de Patente Provisório 61/377248 5 (número de referência CL4783USPRV, depositado em 26 de agosto de 201 0), incorporado ao presente pela referência.

Especificamente, para interromper o gene URA3 na cepa Y9502, a construção pZKUM digerida com Sa/1/Pacl (FIG. 8A, SEQ ID NO: 218; descrita na Tabela 15 do Pedido de Patente US 2009-0093543-A 1, incorporada ao presente pela referência) foi utilizado para integrar um gene URA3 mutante no gene URA3 da cepa Y9502, de acordo com os Métodos Gerais. Um total de 27 transformantes (selecionados a partir de um primeiro grupo compreendendo 8 transformantes, um segundo grupo compreendendo 8 transformantes, e um terceiro grupo compreendendo 11 transformantes) foram cultivados em placas de seleção com meio mínimo + ácido 5-fluoroórotico ["MM + 5-FOA"] e mantios a 30 °C durante 2 a 5 dias. Experimentos adicionais determinaram que apenas o terceiro grupo de transformantes possuía um fenótipoUra- verdadeiro.

As células Ura- foram raspadas das placas MM + 5-FOA e submetidas a análise de ácidos graxos, de acordo com os Métodos Gerais.

Deste modo, as análises por CG demonstraram que havia 28,5%, 28,5%, 27,4%, 28,6%, 29,2%, 30,3% e 29,6% de EPA de TFAs nos transformantes pZKUM # 1, # 3, # 6, # 7, # 8, # 1O e# 11 do grupo 3, respectivamente. Estas sete cepas foram designadas como cepas Y9502U12, Y9502U14, Y9502U17, Y9502U18, Y9502U19, Y9502U21 e Y9502U22, respectivamente (e coletivamente como Y9502U).

A construção pZKL3-9DP9N (Fig. 88; SEQ ID NO: 219) foi gerada para integrar um gene da delta-9 dessaturase, um gene da colina-fosfato citidilil-transferase, e um gene de delta-9 elongase mutante na Yarrowia no lócus YALIOF32131p (número de acesso GenBank XM_506121) da cepa

Y9502U.

O plasmídeo pZKL3-9DP9N continha os seguintes componentes:

TABELA 12

DESCRIÇÃO Do PLASMÍDEO PZKL3-9DP9N CSEQ ID NO· 219) Sítios RE e nucleotídeos dentro Descrição do Fragmento e dos componentes do Gene Quimérico da SEQ 10 NO: 219 884 pb da porção 5' do lócus YALIOF32131p (número de Asci!Bs1WI acesso GenBank XM_506121, rotulado como "Lip3-5" na (887-4) Figura) Paci/Sphl 801 pb da porção 3' do lócus YALIOF32131 p (número de (4396-3596) acesso GenBank XM_506121, rotulado como "Lip3-3" na figura) Swai/Bs1WI YAT1:: EgD9eS-L35G:: PEX20, compreendendo: (11716- 1) n YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia /ipo/ytica (rotulado como "YAT" na figura; Pedido de Patente US 201 0-0068789-A 1); n Mutante sintético do gene delta-9 elongase EgD9eS-L35G: (SEQ 10 NO:. 220; Pedido Provisório US 61/377248), derivado de Eug/ena gracilis (".EgD9eS"; Patente US 7.645.604) (rotulado como "Eg09ES- 24 "na Figura); n PEX20: sequência terminadora PEX20 do gene PEX20 de Yarrowia (número de acesso GenBank AF054613) Pmei/Swal GPDIN::YID9 ::Lip1, compreendendo: (8759-11716) r 1 GPDIN: promotor GPDIN de Yarrowia /ipolytica (Patente US 7.459.546; rotulado como "GPDPro + lntron" na figura.); n YID9: gene delta-9 dessaturase de Yarrowia lipolytica (número de acesso GenBank XM_501496, SEQ 10 NO: 222); [J Lip1: sequência terminadora Lip1 do gene Lip1 de Yarrowia (número de acesso GenBank Z50020) ~------------~----- Claii/Pmel EXP1 ::YIPCT::Pex16, compreendendo: (6501-8759) n EXP1: promotor da proteína de exportação (EXP1) de Yarrowia lipolytica (rotulado como "VAL" na figura; Patente US 7.932.077.); ll YIPCT: gene da colina-fosfato citidilil transferase ["PCT"] (número de acesso GenBank XM_502978, SEQ ID NO: 224); 11 Pex16: sequência terminadora do gene Pex16 de f---------------_,_Y_a_r,.,_o_w_ia_(,__núme_!"_O de acesso GenBank U7 5433) Sa/1/EcoRI gene URA3 de Yarrowia (número de acesso GenBank (6501-4432) AJ306421)

O plasmídeo pZKL3-9DP9N foi digerido com Asci!Sphl e, em seguida, utilizado para transformação da cepa Y9502U17, de acordo com os Métodos Gerais. As células transformantes foram semeadas em placas MM e ' mantidas a 30 oc durante 3 a 4 dias. Colônias isoladas foram resemeadas em 5 placas MM e, em seguida, inoculadas em MM líquido a 30 °C e agitadas a 250 rpm/min durante 2 dias. As células foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em HGM e, em seguida, agitadas a 250 rpm/min, durante 5 dias.

As células foram submetidas a análise de ácidos graxos, supra.

As análises de CG demonstraram que a maioria das 96 cepas 10 selecionadas de Y9502U17 com pZKL3-9DP9N produziram 50-56% de EPA de TFAs. Cinco cepas (ou seja, #31, #32, #35, #70 e #80) que produziram cerca de 59,0%, 56,6%, 58,9%, 56,5% e 57,6% de EPA de TFAs foram designadas como Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 e Z1981, respectivamente.

O genótipo final destas cepas transformantes pZKL3-9DP9N em 15 relação a Yarrowia lipolytica ATCC # 20362 tipo selvagem foi: Ura+, Pex3-, unknown 1-, unknown 2-, unknown 3-, unknown 4-, unknown 5-, unknown6-, unknown 7-, unknown 8-, unknown9-, unknown 10-, unknown 11-, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1::ME3S::Lip1, FBA/Nm::Eg09eS::Lip2, EXP1::Eg09eS::Lip1, GPAT:Eg09e::Lip2, 20 YAT1::Eg09eS::Lip2, YA T::Eg09eS-L35G::Pex20, FBA/Nm::Eg08M::Pex20, EXP1::Eg08M::Pex16, FBAIN::Eg08M::Lip1, GPD::Ea08S::Pex16 (2 cópias), YAT1::E38909eS/Eg08M::Lip1, YAT1::EgD9eS!Eg08M::Aco, FBA/Nm::Ea09eS!EaD8S::Lip2, GPDIN::Y/09::Lip1, GPD::Fm012::Pex20, YAT1::Fm012::0ct, EXP1 ::Fm012S::Aco, GPDIN::Fm012::Pex16, 25 EXP1::Eg05M::Pex16, FBAIN::Eg05SM::Pex20, GPDIN::Eg05SM::Aco, GPM::Eg05SM::Oct, EXP1::Eg05SM::Lip1, YAT1::Ea05SM::Oct, FBA/Nm::Pa017::Aco, EXP1::Pa017::Pex16, YAT1 ::Pa017S::Lip1, YAT1::YICPT1::Aco, YA T1::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1,

YAT1::MaLPAAT1S::Pex16, EXP1::YIPCT::Pex16 O nocaute do lócus YALIOF32131p (número de acesso GenBank XM_50612) nas cepas Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 e Z1981 não foi confirmado em nenhuma dessas cepas produtoras de EPA pela transformação 5 com pZKL3-9DP9N.

As células a partir de placas YPD de cepa Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 e Z1981 foram cultivadas e analisadas quanto ao teor de lipídeos totais e composição (supra). A Tabela 13 abaixo resume o DCW total, tTFAs% DCW, concentração de cada ácido graxo como uma porcentagem em peso de TFAs ["% TFAs"] e o EPA% DCW das cepas Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 e Z1981, conforme determinado por ensaios laboratoriais em balão (Fiask assays). Os ácidos graxos são 16:0 (palmitato), 16:1 (ácido palmitoleico), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), 18:2 (ácido linoleico), ALA (ácido a-linolênico), EDA (ácido eicosadienóico), DGLA (ácido di-homo-y linolênico), ARA (ácido araquidônico), ETrA (ácido eicosatrienóico) ETA (ácido eicosatetraenóico), EPA (ácido eicosapentaenóico) e outros.

TABELA 13 TEOR E COMPOSIÇÃO DE LIPÍDIOS TOTAIS NAS CEPAS DE YARROWIA Z1977, Z1978, Z1979 I Z1980 E Z1981 POR ENSAIO EM BALÃO %TFAs DCW TFAs% EPA% Cepa (g/L) DCW DCW 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 ALA EDA DGLA ARA EirA ETA EPA outro Z1977 3,8 34,3 2,0 0,5 1,9 4,6 11,2 0,7 3,1 3,3 0,9 0,7 2,2 59,1 9,9 20,3 Z1978 3,9 38,3 2,4 0,4 2,4 4,8 11 '1 0,7 3,2 3,3 0,8 0,6 2,1 58,7 9,5 22,5 Z1979 3,7 33,7 2,3 0,4 2,4 4,1 10,5 0,6 3,2 3,6 0,9 0,6 2,2 59,4 9,8 20,0 Z1980 3,6 32,7 2,1 0,4 2,2 4,0 10,8 0,6 3,1 3,5 0,9 0,7 2,2 59,5 10,0 19,5 Z1981 3,5 34,3 2,2 0,4 2,1 4,2 10,6 0,6 3,3 3,4 1,0 0,8 2,2 58,5 10,7 20,1 Após o depósito do Pedido de Patente Provisório US 61/377248 (número de referência CL4783USPRV, depositado em 26 de agosto de

201 0), a cepa Z1978 foi submetida ao sequenciamento parcial do genoma.

Este trabalho determinou que, em vez de seis genes delta-5 dessaturase integrados no genoma de Yarrowia, a cepa modificada possuía na verdade apenas quatro.

5 Mais especificamente, dois fragmentos de plasmídeos distintos (ou porções destes) não foram detectados na cepa Z1978, conforme descrito abaixo.

(1) A construção pZKL2-5mB89C (vide Pedido de Patente US 2010-0317072 A1, SEQ ID NO: 131 aí contida) pretendeu integrar um gene da delta-5 dessaturase nos loci Lip2 da cepa Y8069U. Entretanto, o sequenciamento do genoma não conseguiu detectar a porção final Lip2.3N do fragmento pZKL2-5mB89C e o gene quimérico GPDIN::EgD5SM::Aco. O rearranjo de DNA pode ter resultado em uma perda do cassete GPDIN::EgD5SM::Aco durante a geração da cepa Y8154 (FIG. 7).

(2) A construção pZKL 1-2SR9G85 (vide o Pedido de Patente US 2010-0317072 A 1, SEQ ID NO: 132 aí contida) pretendeu integrar um gene da delta-5 dessaturase nos Joci Lip2 da cepa Y8154U1. Contudo, nem a sequenciamento do genoma nem a amplificação por PCR foi capaz de detectar o gene da delta-5-dessaturase na cepa Z1978. O rearranjo de DNA pode ter resultado em uma perda do cassete GPM::EgD5SM::Oct durante a geração da cepa Y8269 (FIG. 7).

Além disso, foi determinado que a construção pZSCP-Ma83 (vide o Pedido de Patente US 2010-0317072 A1, SEQ ID NO: 133 nele contida) e a construção pZP2-85m98F (vide o Pedido de Patente US 2010- 0317072 A 1, SEQ ID NO: 135 nele contida) ambos integrados no lócus YALIOB21890g.

Assim, o verdadeiro genótipo da cepa Y1978 com relação à cepa de Yarrowia lipolytica tipo selvagem ATCC # 20362 foi a seguinte: Ura+,

Pex3-, unknown 1-, unknown 2-, unknown 3-, unknown 4-, YALIOE12947g-, unknown6-, YALIOB21890g-, unknown 8-, unknown 10-, unknown 11-, YAT1 ::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1 ::ME3S::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1 ::EgD9eS::Lip1, GPA T: :EgD9e::Lip2, s YAT1 ::EgD9eS::Lip2, YA T 1:: Eg D9eS-L35G:: Pex20, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1 ::EgD8M::Pex16, FBAIN: :EgDSM: :Lip1, GPD::EaD8S::Pex16 (2 copies), YAT1 ::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1 ::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2, GPDIN::YID9::Lip1, GPD::Fm012: :Pex20, YAT1 ::Fm012::0ct, EXP1 ::Fm012S::Aco, GPDIN::Fm012::Pex16, EXP1 ::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, EXP1 ::Eg05SM::Lip1, YAT1 ::EaD5SM::Oct, FBAINm::PaD17: :Aco, EXP1 ::PaD17::Pex16, YAT1 ::PaD17S::Lip1, YAT1 ::YICPT1 ::Aco, YAT1 ::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1, YAT1 ::MaLPAAT1 S::Pex16, EXP1 ::YIPCT::Pex16.

EXEMPLO 15 GERAÇÃO DE CEPAS YARROWIA LIPOL YTICA COMPREENDENDO DELTA-5 DESSATURASE DUPLO MUTANTE E COM PRODUÇÃO SUPERIOR A 50 EPA% TFAs O presente Exemplo descreve a construção de um conjunto de cepas derivadas da Yarrowia lipolytica cepa Z1978 (Exemplo 14), capazes de produzir mais de 50 % de EPA dentre os TFAs ["EPA % TFAs"] com mais de 35% de teor de lipídeos totais ["TFAs % DCW"] pela via expressão de uma delta-9 elongase/delta-8 dessaturase.

As cepas de EPA incluíram as seguintes delta-5 dessaturases mutantes que compreendem mutações duplas dos motivos HPGG (SEQ ID NO: 7) e HDASH (SEQ ID NO: 8): EgD5S-36s157g (SEQ ID NO: 183; Exemplo 12) e EaD5S-35a158g (SEQ ID NO: 213; Exemplo 13), bem como qualquer EgD5M (ou seja, EgD5R*-34g158g; SEQ ID NO: 153; Exemplos 9 e 11) ou EgD5M1 (ou seja, EgD5R*-34g158g347s; SEQ ID NO: 157; Exemplos

10e11).

As cepas foram geradas em um método de duas etapas, conforme mostrado na FIG. 9, em que os gene da delta-5 dessaturase iniciais na cepa Z1978 foram primeiramente deletados para resultar em 5 cepas YOS9017 ( Ura-) e YOS9019 ( Ura-) que produziam, pelo menos, cerca de 56% de ETA, mas já não eram capazes de produzir EPA.

Em seguida, as delta-5 dessaturases duplos mutantes acima foram integradas no cromossomo das cepas YOS9017 ( ura-) e YOS9019 (Ura-), restaurando assim a capacidade das cepas transformante produzirem EPA.

Mais especificamente, os quatro genes delta-5 dessaturase na cepa Z1978 foram originalmente integrados no cromossomo de duas construções diferentes: pZKSL-5S5A5 (SEQ 10 NO:. 226, vide também o Pedido de Patente US 2010-0317072 A1, Fig. 4A e Tabela 6 nele incluído) que compreendia os genes quiméricos EXP1 ::Eg05M::Pex16, FBAIN::Eg05SM::Pex20 e YAT1::Ea05SM::OCT, e pZP2-85m98F (SEQ 10 NO: 227, vide também o Pedido de Patente US 2010-0317072 A1, Fig. 78 e Tabela 13 nele incluído) que compreendia um gene quimérico EXP1 ::Eg05SM::Lip1 gene. Três diferentes eventos de recombinação homóloga foram necessários para remover esses quatro genes quiméricos.

Em primeiro lugar, o gene quimérico FBAIN::Eg05SM::Pex20 e uma grande porção do gene Leu (ou seja, a partir do pZKSL-5S5A5) no genoma da cepa Z1978U foi substituído por recombinação homóloga (FIG.

1OA) com 993 bp de um fragmento stuffer de ONA (SEQ lO NO: 228) dentro do plasmídeo pYPS234 (FIG. 1OB, SEQ lO NO: 229), em que os 993 bp do fragmento stuffer compreendiam porções 5' e 3' do gene transportador carnitina/acil-carnitina de Yarrowia. Mais especificamente, o plasmídeo pYSP234 continha os seguintes componentes.

j 125 j j j TABELA 14 j DESCRIÇÃO Do PLASMÍDEO PYPS234 (SEQ ID NO· 229) Sítios Re e Descrição do fragmento e dos componentes do gene j nucleotídeos quimérico j dentro da SEQ IO j NO: 229 j Swa 1/Pac I Gene URA3 de Yarrowia (número de acesso GenBank (1-1498) AJ306421) j 2494-3354 Gene de resistência à ampicílina para seleção em E. co/i j Bs1W 1/Pme I YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia /ipolytica (rotulado como j (4239-4964) "YAT" na figura; Pedido de Patente US 2010-0068789-A1) 4968-5320 Fragmento Leu: 353 pb do gene Leu2 (número de acesso j GenBank AF260230) j 5327-6319 Fragmento Stuffer 180: 993 pb de fragmento de DNA (SEQ j 10 NO: 228), que compreende porções 5 'e 3' do gene transportador de carnitina/acil-carnitina da Yarrowia (número j de acesso GenBank: XP 501358) j Bam HI/BsiWI Pex20: Sequência terminadora Pex20 a partir do gene j Pex20 de Yarrowia (número de acesso GenBank AF054613 Hind 111/Swa I Lys5-5': 720 pb a 5' da porção do gene Lys5 de Yarrowia j (6638-7338) (número de acesso GenBank: M34929, rotulado como "lys5 j região 5'" na figura) j O primeiro evento de crasso ver (cruzamento cromossômico) j ocorreu dentro do fragmento de DNA Lys5-5', enquanto que o segundo evento j 5 de crossover ocorreu dentro da região do promotor YAT1. A cepa YOS9001 foi j gerada a partir desta recombinação homóloga, possuindo um fenótipo Leu-, j Ura- e três genes da delta-S dessaturase dentro de seu genoma. j Em seguida, os genes EXP1 ::EgD5M::Pex16 quimérico e j YAT1 ::Ea05SM::OCT no genoma da cepa YOS9001 foram substituídos por j 1o recombinação homóloga (FIG. 11 A) com um fragmento de DNA stuffer de 1O19 bp (SEQ lO NO: 230) dentro do plasmídeo pYPS233 (FIG. 11 B, SEQ lO NO: j 231), em que o fragmento stuffer de 1019 bp compreendia porções 5' e 3' do j j j j Petição 870210034927, de 16/04/2021, pág. 146/369 j gene ALK2 de Yarrowia. O plasmídeo pYSP233 continha os seguintes componentes: TABELA 15 DESCRIÇÃO Do PLASMÍDEO PYPS233 (SEQ lO NO· 231) Sítios Re e Descrição do fragmento e dos componentes do gene nucleotídeos quimérico dentro da SEQ 10 NO: 231 Swa 1/Pac I Gene URA3 de Yarrowia (número de acesso GenBank: (1-1498) AJ306421) 2494-3354 Gene de resistência à ampicilina para seleção em E. co/i Sph 1/Pac I Lys5-3: 684 pb da porção 3' do gene Lys5 de Yarrowia (4214-4901) (número de acesso GenBank M34929, rotulado como "Lys5- região 3'" na figura) Mlui/BstWI 171 stuffer. fragmento de DNA de 1019 bp (SEQ 10 NO: 230), (5229-6263) que compreende as porções 5' e 3' do gene ALK2 de Yarrowia (número de acesso GenBank BAA31434) BsiWI!Pme I YAT1: Promotor YA T1 de Yarrowia lipolytica (Pedido de (6263-6988) Patente US 2010-0068789-A1) Pme 1/Swa I Fragmento Leu: 353 pb do gene Leu2 (número de acesso (6988/1) GenBank: AF260230) 5 O primeiro evento de crossover (cruzamento cromossômico) ocorreu dentro do fragmento de DNA Lys5-3', enquanto que o segundo evento de crossover ocorreu dentro da região 3' Leu ou do promotor YAT1. As cepas YOS9006 e YOS9009 (correspondendo a duas colônias separadas que possuem genótipos idênticos) foram geradas a partir desta recombinação homóloga, cada uma possuindo um fenótipo Leu-, Ura- e um gene da delta-S dessaturase dentro do genoma.

Finalmente, o gene EXP1 ::Eg05SM::Lip1 quimérico no genoma da cepa YOS9006 e YOS9009 foi substituído por recombinação homóloga (FIG.

12A) por um gene Leu2 funcional dentro do plasmídeo pYSP241 (FIG. 128; SEQ ID NO: 232). O plasmídeo pYSP241 continha os seguintes componentes:

TABELA 16 DESCRICÃO Do PLASMÍDEO PYPS241 (SEQ 10 NO· 232) Sítios RE e Descrição do fragmento e dos componentes do gene quimérico nucleotídeos dentro da SEQ 10 NO: 232 Clal! Pme/ Leu L: gene Leu2 de Yarrowia codificante da isopropilmalato (1-2134) desidrogenase (número de acesso GenBank: AF260230) Swai!Pmel Ea08S::Pex20, compreendendo: (3893-2134) • Ea08S: delta-8 dessaturase sintética derivada de Euglena anabaena (Patente US 7. 790.156), códon-otimizada para a expressão em Yarrowia /ipo/ytica ("Ea08S"); • Pex20: sequência terminadora Pex20 a partir do gene Pex20 de Yarrowia (Número de acesso GenBank: AF054613) Sphl/C!al 821890 arm A: Sequência de DNA a montante do ORF 821890 de (8107-9209) Yarrowia (Número de acesso GenBank: XP_501199).

O primeiro evento crossover ocorreu na região entre a posição de 2870148 e 2871250 do cromossomo B, enquanto que o segundo evento 5 crasso ver ocorreu na região EaD8S do plasmídeo pYSP241, gerando as cepas YOS9017 (Ura-) e YOS9019 (Ura} As cepas YOS9017 e YOS9019 (correspondendo a duas colônias separadas possuindo genótipos idênticos) foram geradas a partir desta recombinação homóloga, cada uma possuindo um fenótipo ura- e sem gene da delta-S dessaturase dentro do genoma.

Para a análise da composição de ácidos graxos e do teor de óleo nas cepas YOS9001 (Leu-, ura-), YOS9006 (Leu-, Ura-), YOS9009 (Leu-, Ura-), YOS9017 (Ura-), YOS9019 (Ura-) e Z1978U (ura-) controle, balões de ensaio em triplicatas (identificadas como amostras "A", "8" e "C") foram realizadas de acordo com a metodologia do Exemplo 14.

A Tabela 17 resume a concentração de cada ácido graxo como uma porcentagem em peso de TFAs ["% TFAs"]. Os ácidos graxos são como na Tabela 13, enquanto que 20:4 (5, 11, 14, 17) refere-se a ácido juniperônico. A soma de todos os ácidos graxos, em cada amostra atingiu 100.

A Tabela 18 resume o DCW total, TFAs % DCW, e EPA% DCW.

TABELA 17 CoMPOSIÇÃO DE_Ac_tpos GRAXos DAs CEPAS YOS9001 I YOS90061 YOS90091 YOS9017 I YOS9019 E Z1978U DE Y ARROWIA

I %TFAs I Cepa (# de Genes Amostra 20:4 (5,11, 1'.5-Dessatu rase) 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 ALA EDA DGLA ARA ETrA ETA EPA Outro II 14,17)

I A 2,2 0,5 1,5 2,2 7,9 0,0 2,4 5,1 1,3 0,5 0,5 2,8 58,2 14,8 ' YOS9001 8 2,3 0,5 1,4 2,3 8,1 0,0 2,5 5,0 1,4 0,4 0,7 2,8 57,7 14,8 (3 genes 1'>5) c 2,6 0,5 1,5 2,3 8,4 0,0 2,5 4,8 1,5 0,4 0,6 2,8 56,9 15,1 Méd. 2,4 0,5 1,5 2,3 8,2 0,0 2,5 5,0 1,4 0,4 0,6 2,8 57,6 14,9 A 2.3 0,4 1,8 3,1 9,9 0,5 3,1 7,9 0,9 0,4 0,3 6,3 53,1 9,9 YOS9006 8 2,3 0,4 1,8 3,1 10,0 0,6 3,1 7,8 1,O 0,4 0,3 6,2 52,9 10,1 (1 gene 1'>5) c 2,2 0,5 1,8 3,3 10,2 0,5 3,2 7,9 1,0 0,4 0,4 6,3 52,6 9,9 Méd. 2,3 0,4 1,8 3,2 10,0 0,5 3,2 7,9 1,0 0,4 0,3 6,3 52,9 10,0 A 2,1 0,4 1,8 2,9 9,9 0,5 2,8 8,8 1 ,O 0,4 0,4 7,3 51,6 10,1 YOS9009 8 2,1 0,4 1,8 2,9 9,9 0,3 2,6 8,6 1,0 0,4 0,3 7,3 52,2 10,2 ~ (1 gene 1'.5) c 2,0 0,5 1,7 2,8 9,7 0,3 2,5 8,8 1,O 0,4 0,3 7,4 52,1 10,5 N Méd. 2,1 0,4 1,8 2,9 9,8 0,3 2,7 8,7 1,0 0,4 0,4 7,3 52,0 10,3 co A 2,3 1,0 2,4 6,5 10,7 0,7 3,7 10,0 0,1 0,7 0,0 56,6 0,0 5,0 YOS9017 8 2,4 0,9 2,4 6,6 10,7 0,8 3,6 9,8 0,2 0,7 0,0 55,7 0,0 6,0 (zero gene 1'.5) c 2,3 0,9 2,4 6,6 10,6 0,7 3,6 9,9 0,2 0,7 0,0 56,1 0,0 6,0 Méd. 2,3 0,9 2,4 6,6 10,6 0,7 3,6 9,9 0,2 0,7 0,0 56,1 0,0 5,7 A 2,1 0,9 2,3 6,9 10,7 0,8 3,8 9,5 0,2 0,8 0,0 56,3 0,0 5,7 YOS9019 8 2,1 0,9 2,2 6,8 10,7 0,8 3,7 9,6 0,2 0,8 0,0 56,5 0,0 5,6 (zero gene 1'.5) c 2,1 0,9 2,3 7,0 10,8 0,8 3,8 9,4 O, 1 0,8 0,0 56,2 0,0 5,8 Méd. 2,1 0,9 2,3 6,9 10,7 0,8 3,8 9,5 0,2 0,8 0,0 56,3 0,0 5,7 A 2,4 0,6 2,8 6,6 13,4 0,9 4,8 3,4 0,7 0,9 0,8 2,6 52,3 7,9 Z1978U 8 2,4 0,6 2,8 6,5 13,4 0,9 4,8 3,4 0,8 1 ,O 0,8 2,6 52,2 7,8 (4 genes 1'.5) c 2,4 0,6 2,8 6,6 13,4 0,9 4,8 3,4 0,8 0,9 0,8 2,6 52,3 7,8 Méd. 2,4 0,6 2,8 6,6 13,4 0,9 4,8 3,4 0,8 0,9 0,8 2,6 52,3 7,8

TABELA 18

TEOR DE LIPÍDEOS TOTAIS NAS CEPAS Y059001, YOS9006, Y059009, Y059017,

YOS9019 E Z1978U DE YARROWIA Cepa(# de Fame (% EPA(% Genes .65- Amostra DCW (g/L) DCW) DCW) Dessaturase ) A 1 16 J 15,9 9,3 YOS9001 B 1,25 15,1 8,7 (3 genes .65) c 1,44 15,0 8,5 Méd. 1,28 15,3 8,8 A 1,88 18,9 1O, 1 YOS9006 B 1,97 18,8 10,0 (1 gene .65) c 1,98 18,9 9,9 Méd. 1,94 18,9 10,0 A 1,82 19,3 9,9 YOS9009 B 1,90 18,3 9,6 (1 gene .65) c 1,82 18,6 9,7 Méd. 1,85 18,7 9,7 A 4,4 27,9 0,0 YOS9017 B 4,4 28,2 0,0 (zero gene .65) c 4,5 28,3 0,0 Méd. 4,44 28,1 0,0 A 4,5 30,3 0,0 YOS9019 B 5,0 29,9 0,0 (zero gene .65) c 4,6 29,3 0,0 Méd. 4,69 29,8 0,0 A 5,4 34,1 17,8 Z1978U B 5,4 33,9 17,7 (4 genes .65) c 5,4 33,3 17,4 Méd. 5,40 33,8 17,7

Os dados do experimento em balões demonstrou que a cepa

5 YOS9001 (Leu-, ura-), que compreende três genes delta-5 dessaturase dentro do genoma, produziu cerca de 57% de EPA % TFAs, enquanto que as cepas

YOS9006 (Leu-, Ura) e YOS9009 (Leu-, Ura), compreendendo apenas um gene delta-5 dessaturase em seus genomas, produziram cerca de 52,0% de

EPA % TFAs.

Em contrapartida, as cepas YOS9017 (Ura-) e YOS9019 (Ura-)

não foram capazes de produzir qualquer EPA, mas foram capazes de produzir cerca de 56% de ETA. A falta de atividade delta-5 dessaturase nas cepas YOS9017 (Ura-) e YOS9019 (Ura-) foi validada pela análise de ácidos graxos totais acima; as análises por PCR confirmaram a ausência de qualquer sequência de DNA codificante de uma delta-5 dessaturase.

A construção pZR5AU-555 (FIG. 13A, SEQ 10 NO: 233) foi gerada para integrar três genes mutantes quiméricos da delta-5 dessaturase (por exemplo, FBAIN::Eg05S-36s157g::Pex20 [Exemplo 12], YAT1 ::Ea05S- 35a158g::Oct [Exemplo 13], e EXP1::Eg05M (Eg05R*-34g158g)::Pex16 [Exemplos 9 e 11] entre as regiões 1685392 e 1687267 do cromossomo C da cepa YOS9017 e YOS9019 e, dessa forma, permitir a produção de EPA.

O plasmídeo pZR5AU-555 continha os seguintes componentes: TABELA 19 DESCRIÇÃO Do PLASMÍDEO PZR5AU-555 (SEQ 10 NO: 233} Sítios RE e nucleotídeos Descrição do fragmento e dos componentes do gene quimérico dentro da SEQ ID NO: 233 Asci/BsM/1 Fragmento de DNA de 890 pb entre as regiões 1685392 e 1686281 do cromossomo (7713-6820) C de Yarrowia (rotulado como "região R5-5'" na figura) Paci!Ascl Fragmento de DNA de 967 pb entre 1686300 e 1687260 do cromossomo C de (11396-10436) Yarrowia (rotulado como "região R5-3"' na figura) Pmei/C/al YAT1::Ea05S-35a158g ::Oct, compreendendo: (2476-1) 1! YAT1: promotor YAT1 de Yarrowia lipolytica (rotulado como "YAT" na figura; Pedido de Patente US 2010-0068789-A1); 11 EaD5S-35a158g: Gene mutante sintético da delta-5-dessaturase compreendendo os motivos (SEQ ID NO: 212) mutantes Hagg [SEQ ID NO: 14] e HDgSH [SEQ 10 NO: 15], derivados de Euglena Anabaena; 1 1 Oct: sequência terminadora Oct do gene Oct de Yarrowia (número de acesso GenBank: X69988)

Sítios RE e nucleotídeos Descrição do fragmento e dos componentes do gene quimérico dentro da SEQ ID NO: 233 EcoRI/BsM/1 FBAIN::EgD5S-36s157g: :PEX20, compreendendo: (4127-6820) '! FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (rotulado como "FBA1 + lntron" na figura; Patente US 7.202.356.); i I EgD5S-36s 157g: Gene mutante sintético da delta-5-dessaturase compreendendo motivos (SEQ ID NO: 182) HPGs [SEQ ID NO: 11] e HDgSH [SEQ ID NO: 15] mutantes, derivados de Euglena gracilis (rotulado como "Eg05S" na Figura ); II PEX20: sequência terminadora PEX20 do gen PEX20 de Yarrowia (número de acesso GenBank: AF054613) Paci/C/al EXP1 ::EgD5M (EgD5R-34g158g)::Pex16, compreendendo: (11396-1) IJ EXP1: promotor da proteína de exportação (EXP1) de Yarrowia /ipolytica (rotulados como "VAL" na figura; Patente US 7.932.077.); 11 EgD5M (EgD5R-34g158g): Gene mutante sintético da delta-5-dessaturase compreendendo motivos (SEQ ID NO: 152) HgGG [SEQ ID NO: 9] e HDAgH [SEQ ID NO: 18] mutantes, derivados de Euglena gracilis (rotulado como "EgD5M "na Figura); 1 I Pex16: sequência terminadora Pex16 do gene Pex16 de Yarrowia (número de acesso GenBank: U75433) Pmei/EcoRI Gene URA3 de Yarrowia (número de acesso GenBank: AJ306421) (24 76-4127) A construção pZR5AU-555M (FIG. 138, SEQ ID NO: 234) foi idêntica a construção pZR5AU-555, com a exceção de que o gene quimérico EXP1 ::EgD5M1 (EgD5R*-34g158g347s)::Pex16 [Exemplos 10 e 11] foi usado no lugar do gene quimérico EXP1::EgD5M (EgD5R*-34g158g)::Pex16 do pZR5AU-555.

Os plasmídeos pZR5AU-555 e pZR5AU-555M foram digeridos separadamente com Ascl e, em seguida, utilizados para a transformação das cepas YOS9017 e YOS9019 individualmente de acordo com os Métodos Gerais.

As células transformantes foram semeadas em placas MM e mantidas a 30 oc durante 3 a 4 dias. Colônias isoladas foram resemeadas em placas MM e, em 1o seguida, inoculadas em MM líquido a 30 °C e agitadas a 250 rpm/min durante 2 dias. As células foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em HGM e, em seguida, agitadas a 250 rpm/min, durante 5 dias.

As células foram submetidas a análise de ácidos graxos, de acordo com Métodos Gerais.

A análise por CG dos 96 transformantes pZR5AU-555 na cepa YOS9017 identificou 20 cepas (ou seja, #9, #17, #22, #27, #31, #32, #42, #44, #46, #52, #53, #63, #68, #72, #74, #75, #77, #79, #80, #84 e #89), que produziam mais de 48% EPA de TFAs; essas cepas foram designadas como cepas Z8001 a 5 Z8020, respectivamente.

As análises por CG de 82 transformantes pZR5AU-555M na cepa YOS9017 identificou 10 cepas (ou seja, #1, #27, #29, #33, #39, #41, #44, #49, #69 e #82) que produziam mais que 48% EPA de TFAs; essas cepas foram designadas como cepas Z8021 a Z8030, respectivamente.

1o A análise por CG dos 84 transformantes pZR5AU-555 na cepa YOS9019 identificou doze cepas (ou seja, #28, #31, #39, #41, #42, #45, #63, #71, #73, #75, #78 e #84), que produziam mais de 48% EPA de TFAs; essas cepas foram designadas como cepas Z8031 a Z8042, respectivamente.

A análise por CG dos 76 transformantes pZR5AU-555 na cepa YOS9019 identificou doze cepas (ou seja, #2, #24, #28, #30, #38, #46, #50, #66, #67, #69, #72 e #73), que produziam mais de 48% EPA de TFAs; essas cepas foram designadas como cepas Z8043 a Z8054, respectivamente.

Para analisar a composição de ácidos graxos e teor de óleo dessas novas cepas EPA, ensaios em balões em duplicatas foram realizados para 13 cepas representativas (ou seja, Z8001, Z8005, Z8007, Z8011, Z8014, Z8018, Z8020, Z8022, Z8024, Z8026, Z8035, Z8048 e Z8049). A Tabela 20 resume o DCW total, TFAs % DCW, concentração de cada ácido graxo como uma porcentagem em peso de TFAs ["% TFAs"] e o EPA (% DCW). Os ácidos graxos são como indicado na Tabela 13 e Tabela 17.

Todas as 13 amostras foram capazes de produzir mais de 53 EPA % TFAs, com mais de 37 TFAs % OCW. As cepas Z8024 e Z8035 produziram 58,5 EPA % TFAs e 57,9 EPA % TFAs, com 40,8 TFAs % OCW e 37,8 TFAs% OCW, respectivamente.

TABELA 20 COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS E TEOR DE LIPÍDIOS TOTAIS NAS LINHAGENS DE YARROWIA Z8001, Z8005, Z8007, Z8011, Z8014, Z8018, Z8020, Z8022, Z8024, Z8026, Z8035, Z8048 E Z8049 COMPREENDENDO DELTA-S DESSATURASES MUTANTES COMPREENDENDO SIMULTANEAMENTE Os MOTIVOS MUTANTES HXGX (SEQ ID NO: 34) E HDXXH (SEQ ID NO: 311) %Ácidos Graxos Totais TFAs% EPA% Amostra DCW(g/L) 20:4

DCW DCW 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 ALA EDA DGLA ARA ETrA (5, 111 ETA EPA 14, 17) Z8001 4,0 41,2 2,4 0,5 2,7 4,8 11,5 0,6 2,7 5,0 1,0 0,0 0,6 3,8 54,6 22,5 Z8005 3,7 41,5 2,5 0,5 2,6 4,6 11,5 0,6 2,6 5,7 1,0 0,0 0,6 4,6 53,4 22,2 ~

VJ Z8007 3,7 41,2 2,6 0,5 2,9 4,7 11,4 0,7 2,6 5,7 0,9 0,0 0,6 4,8 53,1 21,9 VJ Z8011 4,0 41,7 2,4 0,6 3,5 5,8 11,9 0,8 3,4 3,1 0,8 1,0 0,9 2,9 53,4 22,2 Z8014 3,8 37,8 2,4 0,5 2,6 4,5 11,3 0,6 2,6 5,3 1,0 0,0 0,6 4,1 54,9 20,8 Z8018 3,2 40,8 2,4 0,4 2,6 4,5 11,3 0,6 2,7 6,1 0,9 0,0 0,6 4,9 53,4 21,8 Z8020 3,2 41,3 2,4 0,4 2,7 4,5 11,4 0,6 2,6 5,9 0,9 0,0 0,6 4,9 53,7 22,1 Z8022 3,1 41,5 2,4 0,4 2,6 4,3 11,2 0,6 2,7 5,2 1,0 0,0 0,6 3,7 55,5 23,0 Z8024 3,2 40,8 2,5 0,4 2,6 4,4 11,6 0,6 3,0 2,5 1,2 0,0 1,4 1,4 58,5 23,9 Z8026 3,1 40,8 2,4 0,4 2,7 4,4 11,2 0,6 2,7 5,6 1,0 0,0 0,6 4,2 54,5 22,3 Z8035 3,0 37,8 2,3 0,5 2,2 4,6 11,7 0,7 3,2 3,9 0,7 0,5 0,4 2,7 57,9 21,9 Z8048 3,9 37,4 2,3 0,5 2,4 4,8 11,9 0,6 3,0 5,0 1,1 0,3 0,7 3,7 54,4 20,3 Z8049 3,7 37,5 2,3 0,5 2,3 4,4 11,4 0,6 2,6 6,0 1,0 0,0 0,7 4,9 53,8 20,2

EXEMPLO 16 GERAÇÃO DE MUTAÇÕES HGGG (SEQ ID NO: 9) E HDAxH (SEQ ID NO: 37) NA DELTA-5 DESSATURASE VARIANTE DE EUGLENA GRACILIS ["EGD5R"] PARA

CLONAGEM EM VETORES DE EXPRESSÃO DE VEGETAIS 5 A Tabela 7 do Exemplo 7 resume a atividade delta-5- dessaturase a partir de diferentes EgD5R* variantes que compreendem mutações que alteram ambos os motivos HPGG (SEQ ID NO: 7) e HDASH (SEQ ID NO: 8). Na Tabela 7, as proteínas EgD5R* possuindo os motivos modificados, HgGG (SEQ ID NO: 9) e HDAgH (SEQ ID NO: 18) (como no EgD5R*-34g158g; SEQ ID NO: 143) ou os motivos modificados HgGG (SEQ ID NO : 9) e HDAaH (SEQ ID NO: 17) (como no EgD5R*-34g158a; SEQ ID NO: 141) possuem, pelo menos, 88% de atividade da proteína EgD5R* (que é idêntica à proteína EgD5R).

O presente Exemplo descreve os métodos utilizados para introduzir mutações semelhantes na sequência de DNA do EgD5R (SEQ ID NO: 24), flanqueado por sítios Notl para a fácil clonagem em vetores de expressão de vegetais existentes (Exemplo 18, abaixo), utilizando a mutagênese baseada em PCR com oligonucleotídeos que contenham modificações desejadas de nucleotídeos. Mais especificamente, os mutantes duplos foram introduzidos em um gene da delta-5 dessaturase por meio de duas rodadas de amplificação por PCR, e cada reação de PCR foi realizada utilizando a polimerase "Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase" (Cat. No.

F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo as instruções do fabricante. Os produtos foram separados por eletroforese em gel de agarose e purificados usando o kit de recuperação de DNA em gel "Ge/ Zymoc/ean® Recovery DNA Kif' (Zymo Research, Orange, CA), seguindo o protocolo do fabricante, a menos que especificado de outra forma.

Introdução de Uma Mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) No EgD5R

Flanqueado Por Sítios Notl Uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) foi introduzida no gene EgD5R (SEQ ID NO: 24) por meio de duas rodadas de amplificação por PCR usando o plasmídeo pKR1032 como molde de DNA. O plasmídeo PKR1032 5 foi previamente descrito na Patente US 7.678.560 e compreende o gene EgD5R (SEQ ID NO: 24), flanqueado por sítios Notl. A extremidade 5' do EgD5R (SEQ ID NO: 24) foi amplificada a partir do pKR1 032 com o primer de oligonucleotídeo Eg05-5 (SEQ ID NO: 245) e primer Eg05 M1-3 (SEQ ID NO: 246), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9). A extremidade 3' do Eg05R (SEQ ID NO: 24) foi similarmente amplificada a partir do vetor pKR1032 com o primer de oligonucleotídeo EgD5-5 M1-5 (SEQ ID NO: 247), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9), e sendo perfeitamente complementar ao EgD5 M1-3 e primer Eg05- 3 (SEQ ID NO: 246). Os fragmentos de DNA resultantes foram separados e purificados.

Os dois fragmentos de DNA purificados foram então combinados e o gene de comprimento total possuindo uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) foi amplificado em um segundo ciclo de PCR com os primers de oligonucleotídeos Eg05-5 (SEQ ID NO: 245 ) e EgD5-3 (SEQ ID NO: 248). O fragmento de DNA resultante foi purificado.

A . sequência de DNA de comprimento total da delta-5 dessaturase compreendendo o motivo HgGG (SEQ ID NO: 9) é mostrada na SEQ 10 NO: 249, enquanto que a proteína codificada é apresentada como SEQ ID NO: 250. Combinação de Uma Mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) com uma mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18) no gene Eg05R flanqueado por Sítios

Notl A mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18) foi introduzida na sequência de DNA que codifica a delta-5 dessaturase de SEQ ID NO: 250 por meio de dois ciclos adicionais de amplificação por PCR, utilizando as 5 metodologias descritas acima e utilizando o fragmento de DNA purificado contendo a mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) como molde. Especificamente, a extremidade 5' da SEQ ID NO: 249 foi amplificada com o primer de oligonucleotídeo EgD5-5 (SEQ ID NO: 245) e primer EgD5 M2-3 (SEQ ID NO: 251 }, desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18); a extremidade 3' da SEQ ID NO: 249 foi amplificada com o primer de oligonucleotídeo EgD5 M2-5 (SEQ ID NO: 252}, desenhado para introduzir uma alteração do DNA que codifica uma mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18) e sendo perfeitamente complementar ao EgD5 M2-3 (SEQ ID NO: 251), e o prímer EgD5-3 (SEQ ID NO: 248). Os fragmentos de DNA resultantes foram separados e purificados, conforme descrito acima.

Os dois fragmentos de DNA purificados foram então combinados e o gene de comprimento total possuindo uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) e HDAgH (SEQ ID NO: 18) foi amplificado em um segundo ciclo de PCR com os primers de oligonucleotídeos EgD5-5 (SEQ ID NO: 245 ) e EgD5-3 (SEQ ID NO: 248).

O produto da PCR resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Biunt® utilizando o kit de clonagem "ZERO BLUN-r® PCR Cloníng Kít" (lnvitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir o pLF336 (SEQ ID NO: 253). A sequência de DNA da delta-5-dessaturase resultante compreendendo um motivo HgGG (SEQ ID NO: 9) e um motivo HDAgH (SEQ ID NO: 18) no pLF336 é mostrada na SEQ ID NO: 254, enquanto que a proteína codificada é exibida como SEQ ID NO: 255.

Combinação de Uma Mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) com uma mutação HDAaH (SEQ ID NO: 17) no gene EgD5R flanqueado por Sítios Notl 5 A mutação HDAaH (SEQ ID NO: 17) foi introduzida na sequência de DNA que codifica a delta-5 dessaturase de SEQ ID NO: 250 por meio de dois ciclos adicionais de amplificação por PCR, utilizando as metodologias descritas acima e utilizando o fragmento de DNA purificado contendo a mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) como molde. Especificamente, a extremidade 5' da SEQ ID NO: 249 foi amplificada com o primer de oligonucleotídeo EgD5-5 (SEQ ID NO: 245) e o primer EgD5 M3-3 (SEQ ID NO: 256), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HDAaH (SEQ ID NO: 17); a extremidade 3' de SEQ ID NO: 249 foi amplificada da mesma forma com o primer de oligonucleotídeo EgD5 M3-5 (SEQ ID NO: 257), desenhado para introduzir uma alteração do DNA que codifica uma mutação HDAaH (SEQ ID NO: 17) e sendo perfeitamente complementar ao EgD5 M3-3 (SEQ ID NO: 256), e o primer EgD5-3 (SEQ ID NO: 248). Os fragmentos de DNA resultantes foram separados e purificados, conforme descrito acima.

Os dois fragmentos de DNA purificados foram então combinados e o gene de comprimento total possuindo uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) e HDAaH (SEQ ID NO: 17) foi amplificado em um segundo ciclo de PCR com os primers de oligonucleotídeos EgD5-5 (SEQ ID NO: 245 ) e EgD5-3 (SEQ ID NO: 248).

O produto da PCR resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Biunt® utilizando o kit de clonagem "ZERO BLUN-r® PCR Cloning Kit" (lnvitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir o pLF337 (SEQ ID NO: 258).

A sequência de DNA da delta-5-dessaturase resultante compreendendo um motivo HgGG (SEQ ID NO: 9) e um motivo HDAaH (SEQ ID NO: 17) no pLF337 é exibida na SEQ ID NO: 259, enquanto que a proteína codificada é exibida como SEQ ID NO: 260.

5 EXEMPLO 17 GERAÇÃO DE MUTAÇÕES HGGG (SEQ ID NO: 9) E HDAxH (SEQ ID NO: 37) NA DELTA-5 DESSATURASE VARIANTE DE EUGLENA ANABAENA ["EAD5R"] PARA

CLONAGEM EM VETORES DE EXPRESSÃO DE VEGETAL O presente Exemplo descreve a introdução de uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) e uma mutação HDAgH (EQF 10 NO: 18) ou HDAaH (SEQ ID NO: 17) na sequência de DNA do EaD5 (SEQ ID NO: 28) pela amplificação por PCR, de um modo análogo ao descrito no Exemplo 16. Os genes resultantes foram flanqueados por sítios Notl para permitir a clonagem em um conjunto de vetores de expressão de plantas existentes (Exemplo 18, abaixo); especificamente, os mutantes duplos foram introduzidos no gene da delta-5-dessaturase por meio de duas rodadas de amplificação por PCR, em que em cada reação de PCR foi usada a DNA polimerase "Phusion™ High- Fide/ity DNA Polymerase" (Cat. N°. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. Os produtos foram separados por eletroforese em gel de agarose e purificados usando o kit de recuperação de DNA em gel "Ge/ Zymoclean® Recovery DNA Kif' (Zymo Research, Orange, CA), seguindo o protocolo do fabricante, a menos que especificado de outra forma.

Introdução de Uma Mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) No Ea05 Flanqueado Por Sítios Notl Uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) foi introduzida no gene EaD5 (SEQ ID NO: 28) por meio de duas rodadas de amplificação por PCR usando o plasmídeo pKR1136 como DNA molde. O plasmídeo PKR1136 foi previamente descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2008-0254191-

A1 e compreende o gene EaD5 (SEQ ID NO: 28) flanqueado por sítios Notl. A extremidade 5' do Ea05 (SEQ ID NO: 28) foi amplificada a partir do pKR1136 com o primer de oligonucleotídeo EaD5-5 (SEQ ID NO: 261) e primer EaD5 M1-3 (SEQ ID NO: 262), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que 5 codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9). A extremidade 3' do EaD5 (SEQ ID NO: 28) foi similarmente amplificada a partir do vetor pKR1136 com o primer de oligonucleotídeo EaD5 M1-5 (SEQ ID NO: 263), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9), e sendo perfeitamente complementar ao EaD5 M1-3 (SEQ ID NO: 262) e Ea05-3 (SEQ ID NO: 264). Os fragmentos de DNA resultantes foram separados e purificados.

Os dois fragmentos de DNA purificados foram então combinados e o gene de comprimento total possuindo uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) foi amplificado em um segundo ciclo de PCR com os primers de oligonucleotídeos EaD5-5 (SEQ ID NO: 261) e EaD5-3 (SEQ lO NO: 264). O fragmento de DNA resultante foi purificado.

A sequência de DNA da delta-5 dessaturase resultante compreendendo o motivo HgGG (SEQ ID NO: 9) é exibida na SEQ ID NO: 265, enquanto que a proteína codificada é exibida como SEQ ID NO: 266.

Combinação de Uma Mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) com uma mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18) no gene EaD5 flanqueado por Sítios Notl A mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18) foi introduzida na sequência de DNA que codifica a delta-5 dessaturase de SEQ ID NO: 265 por meio de dois ciclos adicionais de amplificação por PCR, utilizando as metodologias descritas acima e utilizando o fragmento de DNA purificado contendo a mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) como molde. A extremidade 5' da SEQ ID NO: 265 foi amplificada com o primerde oligonucleotídeo EaD5-5 (SEQ ID NO: 261) e o primer EaD5 M2-3 (SEQ ID NO: 267), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HDAgH (SEQ ID NO: 18); a extremidade 3' da SEQ ID NO: 265 foi amplificada de modo similar com o primer de oligonucleotídeo EaD5 M2-5 (SEQ ID NO: 268), desenhado para introduzir uma alteração do DNA que codifica uma mutação HDAgH (SEQ ID 5 NO: 18) e sendo perfeitamente complementar ao EaD5 M2-3 (SEQ ID NO: 267), e o primer EaD5-3 (SEQ ID NO: 264). Os fragmentos de DNA resultantes foram separados e purificados, conforme descrito acima.

Os dois fragmentos de DNA purificados foram então combinados e o gene de comprimento total possuindo uma alteração no DNA que codifica uma mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) e HDAgH (SEQ ID NO: 18) foi amplificado em um segundo ciclo de PCR com os primers de oligonucleotídeos EaD5-5 (SEQ ID NO: 261) e EaD5-3 (SEQ ID NO: 264). O produto da PCR resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Biunt® utilizando o kit de clonagem "ZERO BLUNf® PCR C/oning Kif' (lnvitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir o pLF338 (SEQ ID NO: 269).

A sequência de DNA da delta-5-dessaturase resultante compreendendo um motivo HgGG (SEQ ID NO: 9) e um motivo HDAgH (SEQ ID NO: 18) no pLF338 é mostrada na SEQ ID NO: 270, enquanto que a proteína codificada é exibida como SEQ ID NO: 271.

Combinação de Uma Mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) com uma mutação HDAaH (SEQ ID NO: 17) no gene EaD5 flanqueado por Sítios Notl A mutação HDAaH (SEQ ID NO: 17) foi introduzida na sequência de DNA que codifica a delta-5 dessaturase de SEQ ID NO: 270 por meio de dois ciclos adicionais de amplificação por PCR e utilizando o fragmento de DNA purificado contendo a mutação HgGG (SEQ ID NO: 9) como molde. A extremidade 5' da SEQ ID NO: 270 foi amplificada com o primer de oligonucleotídeo EaD5-5 (SEQ ID NO: 261) e o primer EaD5 M3-3 (SEQ ID NO: 272), desenhado para introduzir uma alteração no DNA que codifica uma mutação HOAaH (SEQ 10 NO: 17); a extremidade 3' de SEQ 10 NO: 270 foi amplificada da mesma forma com o primer de oligonucleotídeo Ea05 M3-5 (SEQ 10 NO: 273), desenhado para introduzir uma alteração do ONA que codifica uma mutação HOAaH (SEQ 10 NO: 17) e sendo perfeitamente 5 complementar ao Ea05 M3-3 (SEQ 10 NO: 272), e o primer Ea05-3 (SEQ 10 NO: 264). Os fragmentos de ONA resultantes foram separados e purificados, conforme descrito acima.

Os dois fragmentos de ONA purificados foram então combinados e o gene de comprimento total possuindo uma alteração no ONA que codifica uma mutação HgGG (SEQ 10 NO: 9) e HOAaH (SEQ 10 NO: 17) foi amplificado em um segundo ciclo de PCR com os primers de oligonucleotídeos Ea05-5 (SEQ 10 NO: 261) e Ea05-3 (SEQ 10 NO: 264). O produto da PCR resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Biunt® utilizando o kit de clonagem "ZERO BLUNf® PCR C/oning Kif' (lnvitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir o pLF339 (SEQ 10 NO: 274).

A sequência de ONA da delta-5-dessaturase resultante compreendendo um motivo HgGG (SEQ 10 NO: 9) e um motivo HOAaH (SEQ 10 NO: 17) no pLF339 é exibida na SEQ 10 NO: 275, enquanto que a proteína codificada é exibida como SEQ 10 NO: 276.

EXEMPLO 18 CONSTRUÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO DE SOJA PARA A COEXPRESSÃO Do EGD5R Ou EAD5 DUPLOS MUTANTES PARA DELTA-5 DESSATURASE COM UMA DELTA-9 ELONGASE E UMA DELTA-8 DESSATURASE EM SOJA O presente Exemplo descreve a construção de vetores de soja para a coexpressão de duplos mutantes para delta-5 dessaturase, Eg05R ou Ea05, compreendendo os motivos: HgGG (SEQ 10 NO: 9) e HOAgH (SEQ 10 NO: 18) ou os motivos HOAaH (SEQ 10 NO: 9) e HOAaH (SEQ 10 NO: 17) conforme descrito nos Exemplos 16 e 17, respectivamente, com um delta-9 elongase e delta-8 dessaturase adequadas em soja.

Os mutantes de EgD5R a partir do pLF336 e pLF337 (descrito no Exemplo 16), e os mutantes de EaD5 a partir do pLF338 e pLF339 (descrito no Exemplo 17) podem ser liberados de seus respectivos vetores pela digestão 5 com Notl. Isto permitiria que a delta-5 dessaturase pudesse ser facilmente clonada em qualquer vetor de expressão para soja existente logo atrás (sob o controle) de fortes promotores semente-específicos.

Por exemplo, os fragmentos Notl compreendendo cada uma das delta-5 dessaturases mutadas podem ser clonados no fragmento Notl do pKR974, previamente descrito na Publicação PCT WO 2007/136877 (cujo conteúdo incorporado ao presente pela referência). Deste modo, as delta-5 dessaturases mutantes podem ser expressas atrás do promotor da glicinina da soja (GY1) para uma expressão forte e específica na semente.

Estes vetores são, em seguida, digeridos com Sbfl e os fragmentos contendo a delta-5 dessaturase mutante são clonados no sítio Sbfl do pKR913, previamente descrito na Publicação PCT WO 2008/137516, cujo conteúdo é incorporado ao presente pela referência. Deste modo, as delta-5 dessaturases mutantes podem ser coexpressas com a delta-8 dessaturase de Euglena graci/is ["EgD8"] e a delta-9 elongase de E. gracilis ["EgD9e"] atrás de (sob o controle) fortes promotores semente-específicos.

Qualquer um dos vetores assim gerados é purificado e o vetor ou um fragmento Ascl do vetor é cotransformado com vetores desenhados para aumentar PUFAs ômega-3, tais como, mas não se limitando a: pKR328 (descrito na Publicação PCT WO 04/071467), que compreende a delta-17 dessaturase de Saprolegnia diclina ["SdD17"] sob o controlo do promotor da anexina e possui um gene de resistência à higromicina para seleção em plantas, em culturas de embriões de soja tal como descrito na Publicação PCT WO 2008/137516. Após a transformação, os embriões de soja transgênicos são selecionados, maturados, e os perfis de ácidos graxos são analisados e plantas são regeneradas.

Desta forma, podem ser obtidos embriões ou sementes que expressam as delta-5 dessaturases mutantes que compreendem PUFAs de 5 cadeia longa, tais como EPA e/ou ARA.

Alternativamente, os vetores, ou fragmentos derivados destes, que coexpressam as delta-5 dessaturases mutadas, juntamente com os genes EgD9 e EgD8, podem ser cotransformados com outros vetores que contêm um marcador selecionável adequado, tal como o pKR325, descrito na Patente US

7.659.120. Os embriões são maturados e analisados e as plantas são regeneradas exatamente da mesma forma e, dessa forma, perfis de ácidos graxos alternados, tal como um aumento de ARA e redução de EPA, podem ser conseguidos nas sementes das plantas resultantes.

Os plasmídeos que expressam as delta-5 dessaturases mutantes, juntamente com os genes EgD9 e EgD8, podem ser também cotransformadas com vetores que compreendem genes ou fragmentos de DNA ou microRNAs artificiais concebidos para silenciar os genes fad3 endógenos da soja, tais como, mas não se limitando a pKR1189 ou pKR1249 ou outras construções anteriormente descritas no Pedido de Patente US 2008-0194685 A1. Desta forma, a maior concentração de ARA e menor de EPA em sementes de soja pode ser alcançada.

Além dos genes, promotores, terminadores e cassetes de genes descritos na presente invenção, um técnico hábil no assunto pode compreender que outras combinações de cassete promotor/gene/terminador podem ser sintetizadas de um modo similar, mas não se limitando aos descritos na presente invenção para a expressão das delta-5 dessaturases mutantes. De forma similar, pode ser desejável expressar outros genes de PUFAs (tais como os descritos a seguir na Tabela 23), para a coexpressão com a delta-5 dessaturase da presente invenção.

Por exemplo, as Publicações PCT: WO 2004/071467 e WO 2004/071178 descrevem o isolamento de uma série de sequências promotoras e de terminação da transcrição para o uso na expressão embrião-específica em 5 soja. Além disso, as Publicações PCT; WO 2004/071467, WO 2005/047479 e WO 2006/012325 descrevem a síntese de diversas combinações de cassetes promotor/gene/terminador pela ligação de promotores, genes e terminadores da transcrição individuais em combinações únicas. Geralmente, um sítio Notl flanqueado pelo promotor adequado (tais como aqueles listados (mas não limitando) na Tabela 21) e um terminador de transcrição (tais como aqueles listados (mas não limitando) na Tabela 21) é usado para clonar o gene desejado. Os sítios Notl podem ser adicionados a um gene de interesse, tais como os listados, sem se limitar, na Tabela 23 utilizando a amplificação por PCR com os oligonucleotídeos desenhados para introduzir sítios Notl na extremidade 5' e 3' do gene. O produto da PCR resultante é então digerido com Notl e clonado em um cassete promotor/Notl/terminador adequado.

Além disso, as Publicações PCT; WO 2004/071467, WO 2005/047479 e WO 2006/012325 descrevem a união adicional de cassetes de genes individuais em combinações únicas, juntamente com cassetes com marcadores selecionáveis adequados, de modo a se obter uma expressão fenotípica desejada. Embora isto seja feito utilizando principalmente diferentes sítios de enzimas de restrição, um técnico hábil no assunto pode reconhecer que um determinado número de técnicas podem ser utilizadas para se chegar a combinação promotor/gene/terminador da transcrição desejada. Ao fazer isso, qualquer combinação de cassetes promotor embrião- específico/gene/terminador da transcrição pode ser alcançada. Um técnico hábil no assunto pode também apreciar que estes cassetes podem estar localizados em fragmentos individuais de DNA ou múltiplos fragmentos de DNA em que a coexpressão de genes é o resultado da cotransformação de múltiplos fragmentos de DNA.

Além disso, o Pedido de Patente Publicado US 2008-0254191-A1 descreve a criação de uma série de vetores que coexpressam delta-9 com 5 elongases individuais com delta-8 dessaturases, bem como a fusão destes genes para criar multienzimas. Qualquer uma das delta-5 dessaturases mutantes descritas na presente invenção pode ser coexpressa com os vetores descritos no Pedido de Patente Publicado US 2008-0254191 A 1, tanto pela clonagem nos vetores de expressão descritos quanto pela cotransformação de vetores de expressão adequados como plasmídeo(s) ou fragmento(s) para atingir as sementes de soja que produzem PUFAs, tais como, mas não se limitando a, ARA, EPA, DPA e DHA.

TABELA 21 PROMOTORES SEMENTE-ESPECÍFICOS Promotor Organismo Referência do Promotor subunidade a' da [3- Beachy et a!., EMBO J. 4:3047- soja conglicinina 3053 (1985) Jofuku et a/., Plant Ce/! 1:1 079- lnibidor de tripsina kunitz soja 1093 (1989) Anexina soja wo 2004/071467 glicinina Gi1 soja wo 2004/071467 albumina 28 soja Patente US 6.177.613 Rerie et a!., Mo!. Gen. Genet. legumina A1 ervilha 225:148-157 _{1991) subunidade [3 da [3- conglicinina soja wo 2004/071467 8030 (também chamado P34) soja wo 2004/071467 Rerie et a!., Mo!. Gen. Genet. legumina A2 ervilha 225:148-157 (1991) .15 TABELA 22

TERMINADORES DE TRANSCRIÇÃO Terminador .. de transcrição Organismo Referência -.

Faseolina 3' feijão wo 2004/071467 lnibidor de tripsina kunitz 3' soja wo 2004/071467

Terminador de transcrição Organismo Referência 8030 (também chamado soja wo 2004/071467 P34) 3' legumina A2 3' ervilha wo 2004/071467 albumina 2S 3' soja wo 2004/071467 TABELA 23

GENES DA VIA BIOSSINTÉTICA DE PUFA Gene Organismo Referência delta-6 dessaturase Saprolegnia diclina wo 2002/081668 delta-6 dessaturase Mortierella alpina Patente US 5.968.809 IWO 2000/12720 elongase Mortierella alpina Patente US 6.403.349 delta-5 dessaturase Mortierella alpina Patente US 6.075.183 delta-5 dessaturase Sapro/egnia diclina wo 2002/081668 delta-5 dessaturase Peridinium sp. Patente US 7.695.950 delta-5 dessaturase Euglena gracilis Patente US 7.678.560 delta-15 dessaturase Fusarium moniliforme Patente US 7.659.120 delta-17 dessaturase Sapro/egnia dicfina wo 2002/081668 Thraustochytrium wo 2002/08401 elongase aureum Patente US 6.677.145 Pereira et a/.. Biochem. J. elongase Pavlova sp. 384:357-366 (2004) Schizochytrium wo 2002/090493 delta-4 dessaturase aggregatum Patente US 7.045.683 wo 2002/090493 delta-4 dessaturase /sochrysis galbana Patente US 7.045.683

Gene Organismo Referência

Thraustochytríum wo 2002/090493 delta-4 dessaturase aureum Patente US 7.045.683 delta-4 dessaturase Euglena gracílís Patente US 7.629.503 delta-9 elongase lsochrysís galbana wo 2002/077213 delta-9 elongase Euglena grací/is Patente US 7.645.604

Eutreptíella sp. delta-9 elongase Patente US 7.645.604 CCMP389 wo 2000/34439 Patente US 6.825.017 delta-8 dessaturase Euglena gracílís Patente US 7.709.239 wo 2004/057001 wo 2006/012325 Acanthamoeba Sayanova et ai .. FEBS Lett. delta-8 dessaturase castellaníí 580:1946-1952 (2006)

delta-8 dessaturase Pav/ova salina wo 2005/1 03253 delta-8 dessaturase Pav/ova lutherí Patente US 7.943.823

Tetruetreptía delta-8 dessaturase pomquetensís Patente US 7.863.502

CCMP1491

Eutreptiella sp. delta-8 dessaturase Patente US 7.863.502 CCMP389

Eutreptiella delta-8 dessaturase cf_gymnastica Patente US 7.863.502

CCMP1594

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. POLIPEPTÍDEO MUTANTE POSSUINDO ATIVIDADE DELTA-5 DESSATURASE, compreendendo: (a) um motivo de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID 5 NO: 34 [HxGx], em que a SEQ ID NO: 34 [HxGx] não é idêntica à SEQ ID NO: 7 [HPGG]; e, (a) um motivo de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 [HxxxH], em que a SEQ ID NO: 1 [HxxxH] não é idêntica à SEQ ID NO: 8 [H DAS H].

2. POLIPEPTÍDEO MUTANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) o dito motivo de aminoácido de (a) é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:9 [HgGG], SEQ ID N0:10 [HhGG], SEQ ID N0:11 [HPGs], SEQ ID N0:12 [HcGG], SEQ ID N0:13 [HwGG] e SEQ ID N0:14 [HaGG]; e, (b) o dito motivo de aminoácido de (b) é selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:15 [HDgSH], SEQ ID N0:16 [HDsSH], SEQ ID N0:17 [HDAaH], SEQ ID N0:18 [HDAgH] e SEQ ID N0:19 [HeASH].

3. POLIPEPTÍDEO MUTANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo mutante tem pelo menos 90% de identidade de sequência com base em um método de alinhamento BLASTP quando comparado com um polipeptídeo possuindo a sequência selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 29.

4. POLIPEPTÍDEO MUTANTE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de possuir uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:139 [EgD5R*-34g157g], SEQ ID N0:141 [EgD5R*-34g158a], SEQ ID N0:143

[EgD5R*-34g158g], SEQ ID N0:145 [EgD5R*-34h158a], SEQ ID N0:147 [EgD5R*-34h158g], SEQ ID N0:149 [EgD5R*-36s158a], SEQ ID N0:151 [EgD5R*-36s158g], SEQ ID N0:153 [EgD5M, EgD5R*-34g158g códon- otimizado], SEQ ID NO: 157 [EgD5M1, EgD5R*-34g158g347s códon-otimizado], SEQ ID N0:181 [EgD5S-36s156e], SEQ ID N0:183 [EgD5S-36s157g], SEQ 10 N0:185 [EgD5S-36s158a], SEQ ID N0:187 [EgD5S-36s158g], SEQ ID N0:213 [EaD5S-35a158g], SEQ ID N0:215 [EaD5S-35a158s], SEQ ID N0:217 [EaD5S-35a159g], SEQ ID N0:255 [EgD5R-34g158g], SEQ ID N0:260 [EgD5R-34g158a], SEQ ID N0:271 [EaD5-35g159g] e SEQ ID N0:276 [EaD5- 35g159a].

5. POLIPEPTÍDEO MUTANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo mutante tem uma eficiência de conversão de ácido dihomo-y-linolênico para ácido araquidônico que é de pelo menos 64% da eficiência de conversão de ácido dihomo-y-linolênico para ácido araquidônico do polipeptídeo parenta!, em que o dito polipeptídeo parenta! compreende um motivo de aminoácidos idêntico ao da SEQ ID NO: 7 [HPGG] e um motivo de aminoácidos idêntico ao da SEQ ID NO: 8 [HDASH].

6. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, codificante do polipeptídeo da reivindicação 1.

7. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de possuir uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID N0:138 [EgD5R*-34g 157g], SEQ ID N0:140 [EgD5R*-34g158a], SEQ ID N0:142 [EgD5R*-34g158g], SEQ ID N0:144 [EgD5R*-34h158a], SEQ ID N0:146 [Eg05R*-34h158g], SEQ ID N0:148 [EgD5R*-36s158a], SEQ ID N0:150 [Eg05R*-36s158g], SEQ ID N0:152 [EgD5M, EgD5R*-34g158g códon- otimizado], SEQ ID N0:156 [EgD5M1, EgD5R*-34g158g347s códon-otimizado],

SEQ ID N0:180 [EgD5S-36s156e], SEQ ID N0:182 [EgD5S-36s157g], SEQ ID N0:184 [EgD5S-36s158a], SEQ ID N0:186 [EgD5S-36s158g], SEQ ID N0:212 [EaD5S-35a158g], SEQ ID N0:214 [EaD5S-35a158s], SEQ ID N0:216 [EaD5S-35a159g], SEQ ID N0:254 [EgD5R-34g158g], SEQ ID N0:259 5 [EgD5R-34g158a], SEQ ID N0:270 [EaD5-35g159g] e SEQ ID N0:275 [EaD5- 35g159a].

8. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, que expressa o polipeptídeo da reivindicação 1.

9. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é selecionada a partir do grupo consistindo de células microbianas e de plantas.

1O. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira microbiana é uma levedura oleaginosa.

11. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 1O, caracterizada pelo fato de que a levedura oleaginosa é Yarrowia lipolytica.

12. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula compreende uma construção genética compreendendo um gene selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 182 e SEQ ID NO: 212.

13. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dita célula expressa uma proteína que possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 183 e SEQ ID NO: 213.

14. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 8 ou 11, caracterizada pelo fato de que a dita a célula hospedeira produz um ácido graxo poli-insaturado selecionado a partir do grupo que consiste de ácidos graxos ômega-6 e ácidos graxos ômega-3.

15. CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira vegetal é uma célula de planta oleaginosa.

Ácido Esteárico ----=---- Palmitato ______ Ácido Mirístico [C18=0J c16118 elongase [C16:Q] C14/16 elongase CC14:QJ I ~9 Idesaturase Ácido Ácido'Oléico Ecosadienóico ~ CC18:1J / [C20=2,w-6J <EDA> l ô 12 ose / elongose 118 desaturase Continuação desatur~ ~ da Fig. 1A Ácido Ácido di horno Ácido Linoleico ~6 desaturose y-Linolênico C 18/2Qelongase v·- Linolênico [CHs:z,w-6] [C18=3, w-6] [C2Q:3,w-6] ......J.. -..... <LA> CGLA> <DGLA> ......J.. -.....! I desoturase 1 ~ 17 ~ 15 , • . desoturase 'Ácido a-Linolênico ~ 6 desoturase Acldo Acido Estearidônico c t8/2Qelongose Eicosatetraenóico [Cl8:3,w-3] [C18:4,w-3] [C2Q:4,w-3] <ALA> ...._.. <STA> ~ <ETA> ~ 9 elongose ~ 8 desoturase ~ Ácido ___., Eicosatrienóico [C20:3,w-3) <ETrA> Fig. 1A

Ácido Docosa_pentaenóico [C22=5,w-6] <DPAn-6> id~ioturose Ácido Docosatetraenóico [C22:4,w -6] <DTA> fc 20122 elongose Ácido Aracdônico .6 5 desoturose [C20:4,w-6]

ARA .617 65 desoturose 1 . desoturose Acido Continuação [ Eicosapentaenóico da Fig. 1A > [C20:5,w-3] CEPA> l 1 C20122 elongose Ácido Docosapentaenóico [C22:5,w- 3] <OPA> !d~:oturose Ácido Docosahexaenóico [C22=6,w-3] <OH A> Fig. 18

IN (.V -....... ~

~

~HPGG c (i} HX(3·4) H: 155, 159

(ii) HX <2·3) HH: 190,194,195

(iii) (H/Q)X (2-3) HH: 385, 388, 389

Fig. 2

I I _ - - - - - - · _L__ EgDS (SEQ ID NO. 20) ATGGCTCTCAGTCTTACCACAGAACAGCTGTTAGAACGCCCTGATTTGGTTGCGATTGATGGCATCCTCT EgDSR (SEQ ID NO. 24) ATGGCTCTCAGTCTTACCACAGAACAGCTGTT AGAACGCCCTGA TTTGGTTGCGATTGATGGCATCCTCT 80 90 100 110 120 130 140 I f _I -~--~ _J ----~ J ---~-_1- _____________ J EgD5 (SEQ ID NO. 20) ACGACCTTGAAGGGCTTGCCAAAGTTCATCCAGGAGGAGATTTGATTCTCGCTTCTGGTGCCTCTGATGC EgDSR (SEQ ID NO. 24} ACGACCTTGAAGGGCTTGCCAAAGTTCATCCAGGAGGAGATTTGATTCTCGCTTCTGGTGCCTCTGATGC 150 t 160

I 170

I 180 1 190 200 l _______________ !__________ 210 l -- ~ .....Jt.

EgD5 (SEQ ID NO. 20) CTCCCCTCTCTTTTATTCAATGCATCCATACGTCAAACCGGAGAATTCCAAATTGCTTCAACAGTTCGTC EgDSR (SEQ ID NO. 24) CTCCCCTCTCTTTTATTCAATGCATCCAT ACGTCAAACCGGAGAATTCCAAATTGCTTCAACAGTTCGTC """' 220 230 240 250 260 270 280 I I J t L 1 J EgDS (SEQ ID NO. 20) CGAGGGAAGCATGACCGCACCTCGAAGGACA TTGTCTACACGT ATGATTCTCCCTTCGCACAAGACGTTA EgD5R (SEQ lD NO. 24) CGAGGGAAGCATGACCGCACCTCGAAGGACATTGTCTACACGT ATGATTCTCCCTTCGCACAAGACGTT A 290

I 300 1 31

I o 320

I 330 340 350 EgDS (SEQ ID NO. 20) AGCGGACAA TGCGCGAGGT GA T GAAAGGGAGGAACT GGT ACGCAACCCCT GGCTT CT GGCTGCGCACCGT EgDSR(SEQ ID NO. 24} AGCGGACAATGCGCGAGGTGATGAAAGGGAGGAACTGGTACGCAACCCCTGGCTTCTGGCTGCGCACCGT Fig. 3A

I I I EgD5 (SEQ 10 NO. 20} TGGGATCATCGCCGTGACGGCCTTTTGCGAGTGGCACTGGGCTACCACGGGGATGGTGCTGTGGGGCCTG EgD5R (SEQ ID NO. 24} T GGGA T CA T CGCCGT GACGGCCTTTT GCGAGTGGCACTGGGCT ACCACGGGGA T GGT GCT GT GGGGCC T G

430 440 450 460 470 480 490 f I I t I_ EgDS (SEQ ID NO. 20) TTGACTGGATTCATGCACATGCAGATCGGCTTATCCATCCAGCATGA TGCGTCCCACGGGGCCATCAGCA EgD5R(SEQ ID NO. 24} TTGACTGGATTCATGCACATGCAGATCGGCTTATCCATCCAGCATGATGCGTCCCACGGGGCCATCAGCA

01 ......... 500 510 520 530 540 550 560 ....lo.

EgD5 (SEQ ID NO. 20) AGAAGCCTTGGGTCAACGCCCTCTTCGCCTACGGCATTGACGTCATCGGATCGTCCCGGTGGATTTGGCT -....J EgDSR (SEQ ID NO. 24} AGAAGCCTTGGGTCAACGCCCTCTTCGCCTACGGCATTGACGTCATCGGATCGTCCCGGTGGATTTGGCT

570 580 590 600 610 620 630 t 1 l J I t f

EgDS (SEQ lO NO. 20} GCAGTCGCACATCA TGCGGCACCACACCT ACACCAACCAGCACGGCCTCGACCTGGATGCGGAGT CGGCA EgDSR(SEQ ID NO. 24) GCAGTCGCACATCATGCGGCACCACACCTACACCAACCAGCACGGCCTCGACCTGGATGCGGAGTCGGCA

640 650 660 670 680 690 700 )_____ l.. f I l l l

EgDS (SEQ ID NO. 20) GAGCCGTTCCTGGT GTT CCACAACT ACCCCGCCGCAAACACCGCCCGAAAGT GGTTCCACCGCTT CCAAG EgDSR (SEQ ID NO. 24} GAGCCGTTCCTGGTGTTCCACAACTACCCCGCCGCAAACACCGCCCGAAAGTGGTTCCACCGCTTCCAAG

Fig. 38

I l '---~ _ _ _ _L _ ____ _ EgD5 (SEQ ID NO. 20) CTTGGTACATGTACCTTGTGCTGGGGGCATACGGGGT ATCGCTGGTGTACAACCCGCTCTACATTTTCCG EgDSR (SEQ ID NO. 24) CTTGGTACATGTACCTTGTGCTGGGGGCATACGGGGTATCGCTGGTGTACAACCCGCTCTACATTTTCCG 780 790 800 810 820 830 840 l_ l __ _1 _~ l L~- --~- _______ _1___ J EgDS {SEQ ID NO. 20) GATGCAGCACAATGACACCATCCCAGAGTCTGTCACGGCCATGCGGGAGAATGGCTTTCTGCGGCGCTAC EgDSR(SEQ lD NO. 24) GATGCAGCACAATGACACCATCCCAGAGTCTGTCACGGCCATGCGGGA~AATGGCTTTCTGCGGCGCTAC (J) -...... 850 860 870 880 890 900 910 ---lo. -~ _ _ L... - - - - - __ L EgD5 (SEQ ID NO. 20) ·- _t _ _ ------_L___-

CGCACACTTGCATTCGTGATGCGAGCTTTCTTCATCTTCCGGACCGCATTCTTGCCCTGGTACCTCACTG _________]_ -.....! EgDSR (SEO ID NO. 24) CGCACACTTGCATTCGTGATGCGAGCTTTCTTCATCTTCCGGACCGCATTCTTGCCCTGGTACCTCACTG 920 930 940 950 960 970 980 EgDS (SEQ ID NO. 20) GGACCTCATTGCTGATCACCATTCCTCTGGTGCCCACrfiGCAACTGGTGCCTTCTTGACGTTCTTCTTCAT EgDSR (SEQ !D NO. 24} GGACCTCATTGCTGATCACCATTCCTCTGGTGCCCAC"ÇIGCAACTGGTGCCTTCTTGACGTTCTTCTTCAT 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 L____ I l i _I_ L__________ _I EgDS (SEQ ID NO. 20) TTTGTCCCACAATTTTGATGGCTCCGAACGGATCCCCGACAAGAACTGCAAGGTTAAGA~TCTGAGAAG EgDSR (SEQ ID NO. 24) TTTGTCCCACAATTTTGATGGCTCCGAACGGATCCCCGACAAGAACTGCAAGGTTAAGAGIJTGTGAGAAG Fig. 3C

•

1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 )_- ___I_ - ----- _ _1.____ -- - __ _ L _ _______ _

EgD5 (SEQ ID NO. 20) GACGTT GAGGCT GACCAAA TT GACT GGT AT CGGGCGCAGGT GGAGACGT CCTCCACA T ACGGT GGCCCCA EgDSR (SEQ lD NO. 24) GACGTTGAGGCTGACCAAATTGACTGGTATCGGGCGCAGGTGGAGACGTCCTCCACATACGGTGGCCCCA

1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 J J I __ L __ _j __________ J I

EgD5 (SEQ ID NO. 20) TCGCCATGTTCTTCACTGGCGGTCTCAATTTCCAGATCGAGCACCACCTCTTTCCCCGGA TGTCGTCTTG EgD5R (SEQ !D NO. 24) TCGCCATGTTCTTCACTGGCGGTCTCAATTTCCAGATCGAGCACCACCTCTTTCCCCGGATGTCGTCTTG

1200 J --- ~- - 1210 1____ - - -- 1220 __ ____.1__ _ 1230 __ .l 1240 ~---·----·· 1250 ------ t 1260 l -- -....! .....lo. -....! EgD5 (SEQ ID NO. 20) GCACTACCCCTTCGTCCAGCAGGCGGTCCGGGAGTGTTGCGAACGCCATGGAGTGCGATATGTTTTCTAC EgD5R (SEQ lD NO. 24) GCACT ACCCCTTCGTCCAGCAGGCGGTCCGGGAGTGTTGCGAACGCCATGGAGTGCGATATGTTTTCT AC

1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 L_____ _L_ . _ .I _____ __j ___________ L J

EgDS (SEQ ID NO. 20) CCTACCATCGTCGGCAACATCATCTCCACCCTGAAGTACATGCATAAGGTGGGTGTCGTCCACTGCGTGA EgDSR (SEQ ID NO. 24) CCTACCATCGTCGGCAACATCATCTCCACCCTGAAGT ACATGCATAAGGTGGGTGTCGTCCACTGCGTGA

1340 1350 Eg05 (SEQ 10 NO. 20) AGGACGCACAGGA TTCCT;GA EgDSR (SEQ ID NO. 24) AGGACGCACAGGATTCCT~A

Fig. 3D

Fig. 4A ~367 8438 bp oEl Pacl (5883) Clal C5863 Sphl (5813)

~ ARS18 YL81 EcoRI (4467> YL81 815

Ncol m U.EI 816 Ncol m M.EI -- CX> ~

-..J E~OSDS E~D50S Hindlll (7001 FBAIN M.HI U.BI EcoRI <7416) ~ W.BI Ncol <t238J Yl829 EcoRI C7394) u.

Ncol Not[ (1354) Notl (1354) Pex20·J' YL8JO Pex20·J' lko3 BsiWI U67D BsiWI U67U YL8Jl Yl8J2 Pocl C5883> Pocl <58831 Oal <5863> Clol (5863 Sph( <5813) Sphl <5813> lindlll C5265> lindlll (5265 ARSl ARS1 EcoRI C4467l lfndlll (4455) Fig. 48 EcoRI (4467> H'l'ldlll (4455) ,. Fig. 4C

EgOSR (SEQ 10 N0:24) ATGGC~.~TjCA.~TCT!f;AC~~Cft.;GAACAGCT~GT!TlA.;GAA~~CTGATjTjT~TtD,GC~.: TPlGAT EgOSM (SEQ lO NO: 152) AT GGC[Ç;CT~I.Ç~ CTLC.,A C[I?\ qgGAACAGCTjÇgT~GAgGGt:,lCCT GA Ti9'ftSGTI9JCt!:iA Ti9GA T

70 80 90 100 110 120 I I L_ _ __

EgOSR (SEO lO N0:24) GGGATCCTCT ACGACCT'TGA~GGGCTTGCCAAAGTTCATCCAOGAGGAGATTtT;GA TT CTC< Eg05M (SEQ 10 N0:152) GCirATCCTW ' .• .... "" ACGACCT1 CGA'OOoCCT~GCCAA'OOT'dcA ..• ,, c·---~ TGGTloGrGGAGA!cq)-çATT crlG ~ \+'>-~ ~....... ,, .~ ,...... '-·~····-- ... ~ ......... \".-···- '·"-~ ·~--•1 co ....._ 130 140 150 160 170 180 ---lo.

I I _1 I ________ _______j____ _ _ _ _ _! -.......! EgOSR (SEQ 10 N0:24) GCTffCTGG.TGCCTCTGATBCCTCCCCTiCTCTT.TjTÃTiniAATGCATCC\AT ACGTCAAA:cc:G.

EgosM (SEO to N0:152) Gddr ·..__,; c r GGAúccr l.. .J C:cc.c.Jccccr i.. .. J dr:cddcr '~·,;:.. ... ; c r r'dr ~~.; L_} ACfr •••; r GcA r cddr ;.... .;. ~-~... cTA AcGr cAAldccc ~ O. "J :.. •..• ;

190 200 210 220 230 240 I I I I _ ____l _L

Eg05R (SEQ 10 N0:24) GAGAAtr[TCC_A_AATTOí::;T[TiCAACAQTTCGTCCGAGGGAAGCATGACCGCACCTCGAAGGAC EgOSM (SEQ 10 N0:152) GAGAA~~CcAAjGqrcbrk~cAqCAA;TTCGTCCGAGGGAAGCATGACCGCACCTCGAAGGAC

Fig. 5

HOAgH pEg05U 4070 bp Pex20-S EgOSM BsiWI <318> BomHI <1409) HOAgH ~ r-CoEl Notl (1751) HgGG BamHI <l796l Sphl l1830l Clol (7143) ,.,., -lo. o ...._ Hii'KIIII C1832> FBAIN pOtiW367 ·5M -lo. 8438 bp -..J Fig. 6A EcoRI (6063> EcoRI C604U f1 ori Soll <6022l Uro3 EcoRI t3114l ARS 18 Pocl (4530> Clal <45101 Sphl (4460

Fig. 68

FDA pZKLeuN·29E3 pY116 pK02UF8289 pY116 pY157

ATCC •20362 "'-20~ LA + Y2224 __..., Ura· • ... Y4001

171. EDA. Leu· • __..., Y4001Ul Leu, Ura· • • Y40J6U ... Y4036 ___.

181. OGLA, Leu· Leu, Ura· • j .. L135 <Pex3·l pY116_. pZP3·Pa777U pZP3·Pa777U pZKL2·5m889C pZKUM I pZKUM I pZKSL·5S5A5 Y8154 + Y8069U 4 • Y8069 4 t Y8006U 4 • Y8006 t Y8002 4 + L135U9 <44.8l +--- 37.5l EPA 411. MA+--- 341. MA +- pZKLN ....lo.

1 Y8154Ul • pZKll-2SR9G85 Y8269 pZKUM • Y8269U pZSCP-Ma83 • Y8412 pZKUM • pZKL4-398F2 Y8412U pZKUM + ... Y8647 +...Y8647U ....lo. ......... ....lo. -...J --+ ... ... ... <45.31. EPA Ura- 55.81. EPA Ura· 53.61. EPA Uro· pZP2·85m98F-+ pZKL3·9DP9N pZKUM pZKl6·UL pZKUM Fig. 7 78 4 + Y9502U 4 • Y9502 4 + Y9028UJ Y9028 EPA 581. EPA Uro· 541. EPA

BsiWI C3594l CoiEl Ool (3569) UroJU pZKUM 4313 bp Pex20·3' Eg09ES·24 BsiWI CU Soll U2523l LipJ-5' YAT Asci l888l ......lo.

Fig. BA Swal (11716) Lipi·J' Amp --

N ......lo. -.J YI09D Sphl <35961 Sall <9970) Soll <3947) Sall t9873) -LipJ·J' GPO Pro • lntron. Pocl (4400) Pmel {8759> EcoRI (4432) Pex16 Uro3 YPCT Soll (6051l Clol (650]) Fig. BB

~ pZR5AU-555

I

I Z8001 to Z8020 pYPS241 1 at least 481. EPA I YOS9017 pYPS234

I pYPS233 I ~

I

I

I 1 561. ElA ' f pZR5AU-555U • Z8021 to Z8030 ot leost 481. EPA ....lo.

ZJ978 * • YOS9001 + • YOS9006. I ~

58.71. EPA YOS9009 plR5AU-555 ~

I

I Z8031 to Z8042 ot least 481. EPA YOS9019

561. ETA . Z8043 to Z8054 at least 48t EPA

SSSM Fig. 9

" I [C1684903- Cl686256ll Lys~·5'~P~x20==Eg05SM==FBAINj-IL~~-I;ATl==Eo05SM==Ocq-IEXPl==Eg05M==Pex1ª--Lys5-3 j lC1687779- C1686360ll Crom.

180 Sluffer Nm 2 L~-5' pYPS234 Hindlll (6638) BsiWI (6612) Ap Uro3 Pex20 .....Jo. ~ BamHI C632U ............ Notl (5969) .....Jo.

ICCP E Pacl Cl498l -..J 180 sluffer Fig. 10A K.CP H pYPS234 Ascl (1506) 7338 bp Cloi (5498) Leu frogment Pmel (4964) YAT1 Hindiii (4411> BomHI C4292l BsiWI <42J9l Fig. 108

< • .. [C1684903- 1Cl68625611 ICI686J6011 [C\687779- Lys5-5'~Pex20::Eg05SM==FBA1Nj-lLeug-IYATl==Eo?5SM::Ocq-jEXPl::Eg05M==Pexl~--L~s5-3' chrom 171 stuffer km 2 pYPS233 Leu IrOC)'IIelll Ap Uro3 Pmel t6988) --\. YATI 01 ........... BsiWJ <6263> --\.

EcoRI <6052> Fig. 11A --......! ALK2 B Pocl <1498> 171 sluffer #tK2 C pYPS233 Ascl (1506) Sphl {5318> 7364 bp Mlul C5229) Pexl6 Pacl C490U Lys5-J' Sphl (4214) Fig. 118

C~om.t -POX2-5'·1 Lipl==Eg05SM==Expl HPex16==E,oOBS==~PO~ -Uro3-lYAT==Eg09ES crl'lkerl Eg08M::ACDt ·POX2·3' ChromiStuffer rrogment I Pex20==Eo08S pYPS241 Ap Uro3 Eco! C8668> __.lo.

O) 821890 orm A ...._ __.lo. Sphl <8106> -.....! Fig. 12A pYPS241 Pmel <2134> Amp 9211 bp Edl8S Fig. 128

Fig. 13B Fig. 13A