ES2915598T3 - Una composición que contiene un ácido graso altamente insaturado o un éster alquílico del mismo y un método para producirla - Google Patents

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Abstract

Un método para producir una composición que contiene un ácido graso altamente insaturado o éster alquílico del mismo, que comprende: (1) esterificación alquílica de una materia prima que contiene un triglicérido que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, para preparar una composición que contenga un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado; (2) al menos uno seleccionado entre: (a) reducir a menos de 10.000 ppm la concentración en la composición preparada en la etapa (1) de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer, (b) reducir la concentración de hierro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 0,20 ppm y (c) reducir la concentración de cloro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 10 ppm; y (3) destilar la composición resultante de la etapa (2) y recoger la fracción destilada principal.

Description

DESCRIPCIÓN
Una composición que contiene un ácido graso altamente insaturado o un éster alquílico del mismo y un método para producirla
La presente invención se refiere a composiciones que contienen ácidos grasos altamente insaturados o ésteres alquílicos de los mismos, y a métodos para producirlas.
Antecedentes
Se sospecha que el compuesto 3-cloropropano-1,2-diol (3-MCPD) es cancerígeno y diferentes países y regiones, incluida la UE, tienen regulaciones sobre la concentración de 3-MCPD en los productos alimentarios. También se sabe que el 3-MCPD se produce en grasas y aceites con diacilglicerol (DAG) o monoacilglicerol (MAG) que actúa como sustrato (documento no de patente 1). Desde que se informó acerca de la presencia de 3-MCPD en grasas y aceites ricos en diacilglicerol (DAG), se han realizado intentos de reducir su contenido en las grasas y aceites mediante diversos métodos. Por ejemplo, conociéndose que el 3-MCPD se forma a altas temperaturas, los documentos de patente 1 y 2 divulgan que las concentraciones de sustancias formadoras de 3-MCPD en las grasas y aceites pueden reducirse mediante el tratamiento con un adsorbente, reduciendo la temperatura de desodorización o acortando el tiempo de tratamiento. Sin embargo, estos métodos están destinados específicamente a reducir las concentraciones de sustancias que forman 3-MCPD en la producción de triacilglicerol y los documentos de patente 1 y 2 no describen ningún método para reducir las concentraciones de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en la producción de ésteres alquílicos.
El documento de patente 3 divulga aceites de AGPI refinados, tales como aceites microbianos o marinos, que contienen 10 ppm o menos de ésteres de ácidos grasos de 2-MCPD, 3-MCPD y epoxipropanol. El aceite se trata con sílice, tierra blanqueadora o carbón activado y se desodoriza con vapor.
Se sabe que los ácidos grasos polivalentes insaturados (AGPI) tienen diversas propiedades funcionales y se utilizan AGPI muy enriquecidos en productos alimentarios, complementos, productos farmacéuticos o cosméticos. En el proceso de enriquecimiento mejorado, por el que la proporción de los AGPI deseados aumenta entre los ácidos grasos de una composición de partida, los AGPi experimentan conversión de glicéridos basados en triacilglicerol a ésteres alquílicos con alcoholes inferiores. Por lo tanto, los AGPI muy refinados y enriquecidos que se utilizan en productos alimentarios, complementos, productos farmacéuticos o cosméticos se encuentran en la mayoría de los casos en forma de ésteres alquílicos. No se ha conocido hasta la fecha ningún método que sea capaz de reducir las concentraciones de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en los ésteres alquílicos de AGPI muy enriquecidos. Los factores que se sabe que afectan a la formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD incluyen una fuente de cloro, sustratos tales como MAG y DAG, así como el tiempo de tratamiento a alta temperatura (documentos no de patente 1 y 2). Sin embargo, los aceites que se utilizan como materia prima para productos alimentarios que contienen AGPI, etc., contienen habitualmente cantidades tan pequeñas de fuentes de cloro y sustratos, tales como MAG y DAG, para ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD, que sus efectos sobre el refinado del producto final de AGPI son extremadamente pequeños y generalmente no se reconoce la necesidad de eliminarlos. A este respecto, la eliminación completa de fuentes de cloro y sustratos tales como MAG y DAG no se realiza actualmente debido a las dificultades técnicas implicadas y los efectos potenciales sobre la productividad, tales como el porcentaje de recuperación de AGPI.
La rectificación es una técnica de destilación que potencialmente puede lograr un alto rendimiento de separación; por otro lado requiere empaquetamiento interno y reflujo, lo que, con frecuencia, da lugar a la necesidad de calentar a temperaturas superiores a 150 °C. La destilación molecular y la destilación de recorrido corto, que implican temperaturas de calentamiento que no superen los 150 °C, se pueden realizar a temperaturas relativamente menores que la rectificación; sin embargo, para lograr un enriquecimiento satisfactorio de AGPI, se requiere procesamiento repetido y esto plantea el riesgo de que se formen grandes cantidades de 3-MCPD en la destilación de AGPI.
La formación de aductos de urea y la HPLC son técnicas que realizan la separación de acuerdo con las estructuras (por ejemplo, la longitud de la cadena, el número de dobles enlaces, etc.) de los ácidos grasos que constituyen la molécula que se va a separar; sin embargo, si el material de partida contiene 3-MCPD en forma de di- o monoésteres de ácidos grasos, en función de los tipos de ácidos grasos constituyentes, son difíciles de separar de los ésteres alquílicos deseados, con el resultado de que los ésteres alquílicos de ácidos grasos con un contenido reducido de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD son difíciles de obtener de manera uniforme.
Por lo tanto, las etapas de refinado, tales como la eliminación de disolventes y la destilación, que incluyen un procedimiento de calentamiento, implican evidentemente el riesgo de formar ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD, mientras que incluso métodos tales como la formación de aductos de urea y HPLC no son necesariamente capaces de eliminar los diversos ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD que están contenidos en el material de partida.
Documento de patente 1: JP 2011-147435 A
Documento de patente 2: JP 2011-147436 A
Documento de patente 3: US 2018-242609 A
Documento no de patente 1: Eur. J. Lipid Sci. Technol. 114, 1268-1273 (2012)
Documento no de patente 2: Eur. J. Lipid Sci. Technol. 115, 735-739 (2013)
Documento no de patente 3: J. Agric. Food. Chem. 63 (6), 1839-48 (2015)
En muchos casos, las grasas y aceites que contienen AGPI también contienen 3-MCPD o sus ésteres de ácidos grasos que proceden del material de partida o son el resultado de las etapas de prensado (extracción) y refinado del aceite. Cuando los glicéridos de las grasas y aceites están esterificados con ésteres alquílicos, MAG y DAG permanecerán o es más probable que aumenten sus concentraciones, lo que crea un ambiente en el que los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD son propensos a formarse. Asimismo, el refinado de los ésteres alquílicos implica con frecuencia la etapa de eliminación de disolventes, así como etapas de destilación tales como la destilación molecular, destilación de recorrido corto y rectificación, y se pueden formar ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en cada una de estas etapas. En cromatografía y formación de aductos de urea, no se aplica temperatura externa, por lo que la posibilidad de formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD es baja, pero, por otro lado, existe el riesgo de que las concentraciones de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD que ya están presentes no puedan reducirse de manera adecuada.
LA INVENCIÓN
Un objeto en el presente documento, por tanto, es proporcionar composiciones que comprendan AGPI muy enriquecido o un éster alquílico del mismo, conteniendo al mismo tiempo ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en concentraciones adecuadamente bajas, y proporcionar métodos eficientes para producir tales composiciones.
Los presentes inventores realizaron un estudio intensivo con la perspectiva de lograr los objetivos mencionados anteriormente y han descubierto que las fracciones de ésteres alquílicos de ácidos grasos C20-C22, que se van a enriquecer en AGPI, y monoésteres de ácidos grasos de 3-MCPD, que tienen una molécula de ácido graso C14 o C16 unida a los mismos, muestran comportamientos similares en la destilación. Los presentes inventores descubrieron además que, al reducir el contenido de un monoacilglicerol (MAG), especialmente uno que tuviera el ácido graso C14 o C16 unido al mismo, que está presente en el material de partida, pueden reducirse las concentraciones de los monoésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en las fracciones de ésteres alquílicos de ácidos grasos C20-C22.
Los presentes inventores también han descubierto que la velocidad a la que se forman los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD varía considerablemente dependiendo del cambio en la concentración de una traza (<1 ppm) de metal, tal como el hierro que está contenido en el material de partida. Se había informado de que el contenido de hierro tendría un efecto sobre la formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD a partir de triacilglicerol (documento no de patente 3). Sin embargo, la divulgación en el documento no de patente 3 es acerca del resultado de un estudio sobre la formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en presencia de una cantidad considerablemente grande de Fe2+ o Fe3+ y no se sabía que las trazas de hierro habitualmente contenidas en el aceite como materia prima para la producción de ésteres alquílicos de AGPI tendrían un efecto sobre la formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD.
Los ésteres alquílicos de AGPI que aún no se han enriquecido, como los que se producen a partir del aceite de pescado y otras materias primas, son generalmente de bajo grado de refinamiento, por lo que su concentración de hierro puede variar en función del contenido de hierro en el aceite como material de partida. La concentración de hierro de los ésteres alquílicos de AGPI que aún no se han enriquecido también puede variar considerablemente dependiendo de otros factores, incluida la calidad del aceite de partida que se va a extraer, el método de extracción y el método de refinado. Por tanto, si aumenta la concentración de hierro, los tratamientos térmicos, tales como la destilación, pueden conducir a una concentración inesperadamente alta de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD. Se ha descubierto que tal aumento inesperado en la concentración de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD se puede suprimir de manera eficaz, garantizando que la concentración de hierro antes del tratamiento térmico, tal como la destilación, se ajuste a menos de 0,20 ppm.
Los presentes inventores realizaron estudios adicionales basados en estos hallazgos y realizaron la presente invención.
Un aspecto de la invención es una composición como se define en la reivindicación 8, que se puede obtener mediante un método definido en el aspecto del método descrito a continuación, que contiene ácidos grasos libres o ésteres alquílicos de ácidos grasos como componente principal, conteniendo los ácidos grasos libres o ésteres alquílicos de ácidos grasos ácido graso altamente insaturado o éster alquílico del mismo, en donde la proporción del ácido graso altamente insaturado en los ácidos grasos constituyentes de la composición es del 50 % del área o más, la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society es mayor de cero ppm e inferior a 1,80 ppm y la concentración de isómeros en trans del ácido graso altamente insaturado es del 0,01 % del área o más.
La proporción del ácido graso altamente insaturado en los ácidos grasos constituyentes de la composición puede ser del 70 % del área o más.
La concentración de 3-MCPD hallada al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser menor que un límite de detección.
El ácido graso altamente insaturado podría ser ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico, ácido araquidónico o una combinación de los mismos.
Una materia prima de la composición puede ser un aceite de pescado, un aceite de microorganismos, un aceite vegetal o un aceite de animal marino.
Otro aspecto es una composición de alimentación de destilación como se define en la reivindicación 14 que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos, incluyendo los ésteres alquílicos de ácidos grasos ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados y
comprendiendo el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer por destilación, y
en donde la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es superior a cero ppm e inferior a 10.000 ppm y/o la concentración de hierro es superior a cero ppm e inferior a 0,20 ppm.
La concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 6 átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer puede ser inferior a 10.000 ppm.
La concentración de cloro en la composición puede ser inferior a 10 ppm.
El éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer podría ser un éster alquílico de ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico o ácido araquidónico, o una combinación de los mismos.
Una materia prima de la composición puede ser un aceite de pescado, un aceite de microorganismos, un aceite vegetal o un aceite de animal marino.
Un aspecto adicional de la invención es un método como se define en la reivindicación 1 para producir una composición que contiene un ácido graso altamente insaturado o un éster alquílico del mismo, que comprende: (1) esterificación alquílica de una materia prima que contiene un triglicérido que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente para preparar una composición que contiene un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado;
(2) al menos uno seleccionado entre (a) reducir a menos de 10.000 ppm la concentración en la composición preparada en la etapa (1) de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer, (b) reducir la concentración de hierro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 0,20 ppm y (c) reducir la concentración de cloro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 10 ppm; y
(3) destilar la composición resultante de la etapa (2) y recoger la fracción destilada principal.
Una concentración de 3-MCPD hallada al analizar la fracción destilada principal de la etapa (3) por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser inferior a 1,80 ppm.
La etapa (2)(a) se puede realizar mediante cromatografía en gel de sílice.
La destilación en la etapa (3) puede ser rectificación.
La concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 6 átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer se puede reducir a menos de 10.000 ppm en la etapa (2).
Se ha descubierto que, según la presente divulgación, las composiciones que comprenden altas concentraciones de AGPI o ésteres alquílicos de AGPI y que contienen al mismo tiempo ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en bajas concentraciones se pueden producir de manera uniforme.
EXPLICACIONES ADICIONALES; OPCIÓN Y PREFERENCIAS
En las siguientes páginas, se describen en detalle características de las presentes propuestas. En lo sucesivo, en el presente documento, los ácidos grasos se designan, en ocasiones, usando expresiones numéricas en las que el número de átomos de carbono, el número de dobles enlaces y las posiciones de los dobles enlaces se indican de forma simplificada combinando números y letras del alfabeto. Por ejemplo, un ácido graso saturado que tiene 20 átomos de carbono puede designarse como "C20:0", un ácido graso insaturado monovalente que tiene 18 átomos de carbono designado como "C18:1", el ácido eicosapentaenoico puede designarse como "C20:5 n-3", y así sucesivamente. El símbolo "n-" representa la posición de un doble enlace contado desde el grupo metilo terminal en un ácido graso; por ejemplo, "n-3" indica que el enlace entre los átomos de carbono tercero y cuarto contados desde el grupo metilo terminal en un ácido graso es un enlace doble. Este método de designación es bien conocido por los expertos en la materia y los ácidos grasos designados de acuerdo con este método pueden ser fácilmente identificados por cualquier experto en la materia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ácidos grasos altamente insaturados" significa ácidos grasos que tienen 18 o más átomos de carbono y 3 o más dobles enlaces. Los ácidos grasos altamente insaturados pueden, por ejemplo, ser ácidos grasos que tienen 20 o más átomos de carbono y 3 o más o incluso 4 o más dobles enlaces, o ácidos grasos que tienen 20 o más átomos de carbono y 5 o más dobles enlaces. Los ácidos grasos altamente insaturados ilustrativos incluyen ácido a-linolénico (18:3 n-3), ácido Y-linolénico (18:3 n-6), ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6), ácido araquidónico (20:4 n-6), ácido eicosapentaenoico (C20:5 n-3), ácido docosapentaenoico (22:5 n-6) y ácido docosahexaenoico (22:6 n-3).
Como se usa en el presente documento, la expresión "aceite en bruto" significa un aceite que es una mezcla de los lípidos, tal como se extraen de los organismos. Como se usa en el presente documento, la expresión "aceite refinado" significa un aceite que se obtiene a partir del aceite en bruto mediante la realización de al menos una etapa de refinado de grasa/aceite seleccionada del grupo que consiste en una etapa de desgomado, una etapa desacidificante, una etapa de decoloración y una etapa de desodorización para que las sustancias no deseadas, tales como fosfolípidos y esteroles, se eliminen del aceite en bruto. Un experto en la materia puede distinguir un aceite en bruto de un aceite refinado mediante análisis rutinario.
Como se usa en el presente documento, una composición que contiene ácidos grasos altamente insaturados o ésteres alquílicos de los mismos significa una composición de ácidos grasos que contiene ácidos grasos altamente insaturados o una composición de ésteres alquílicos de ácidos grasos que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados. Aquí, la composición de ácidos grasos es una composición que contiene ácidos grasos como constituyentes principales y la composición de ésteres alquílicos de ácidos grasos es una composición que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos como constituyentes principales.
Como se usa en el presente documento, los términos colectivos (tales como ácidos grasos altamente insaturados, ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados, etc.) no excluyen la posibilidad de la presencia de múltiples constituyentes a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, los términos colectivos significan habitualmente la presencia de al menos un constituyente.
COMPOSICIONES QUE CONTIENEN ÁCIDOS GRASOS ALTAMENTE INSATURADOS O ÉSTERES ALQUILICOS DE LOS MISMOS, CON CONCENTRACIONES REDUCIDAS DE ÉSTERES DE ÁCIDOS GRASOS DE 3-MCPD La presente invención proporciona una composición que contiene ácidos grasos altamente insaturados o ésteres alquílicos de los mismos, en donde la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición es del 50 % del área o más y en donde la concentración de 3-MCPD que se encuentra al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society es inferior a 1,80 ppm (en lo sucesivo en el presente documento, la composición se denominará en ocasiones la composición de la presente invención).
En la presente invención, el ácido graso altamente insaturado no está particularmente limitado si los ésteres alquílicos del mismo se obtienen como destilado principal tras el enriquecimiento por destilación. El ácido graso altamente insaturado podría ser ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico, ácido araquidónico o combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, el ácido graso altamente insaturado puede ser ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico o una combinación de los mismos. En realizaciones más preferidas, el ácido graso altamente insaturado puede ser ácido eicosapentaenoico.
La proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser del 50 % del área o más, por ejemplo, 55 % del área o más, 60 % del área o más, 65 % del área o más, 70 % del área o más, 75 % del área o más, 80 % del área o más, 85 % del área o más, 90 % del área o más, 95 % del área o más o 96 % del área o más. Por otro lado, en una realización, la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser del 99 % del área o menos, por ejemplo, 98 % del área o menos, 95 % del área o menos, 90 % del área o menos, 85 % del área o menos, 80 % del área o menos, 75 % del área o menos, 70 % del área o menos, 65 % del área o menos, 60 % del área o menos o 55 % del área o menos. La proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser, p. ej., del 50 al 99 % del área, del 50 al 98 % del área, del 50 al 95 % del área, del 50 al 90 % del área, del 50 al 85 % del área, del 50 al 80 % del área, del 50 al 75 % del área, del 50 al 70 % del área, del 50 al 65 % del área, del 50 al 60 % del área, del 55 al 99 % del área, del 55 al 98 % del área, del 55 al 95 % del área, del 55 al 90 % del área, del 55 al 85 % del área, del 55 al 80 % del área, del 55 al 75 % del área, del 55 al 70 % del área, del 55 al 65 % del área, del 55 al 60 % del área, del 60 al 99 % del área, del 60 al 98 % del área, del 60 al 95 % del área, del 60 al 90 % del área, del 60 al 85 % del área, del 60 al 80 % del área, del 60 al 75 % del área, del 65 al 99 % del área, del 65 al 98 % del área, del 65 al 95 % del área, del 65 al 90 % del área, del 65 al 85 % del área, del 65 al 80 % del área, del 65 al 75 % del área, del 70 al 99 % del área, del 70 al 98 % del área, del 70 al 95 % del área, del 70 al 90 % del área, del 70 al 85 % del área, del 70 al 80 % del área, del 70 al 75 % del área, del 75 al 99 % del área, del 75 al 98 % del área, del 75 al 95 % del área, del 75 al 90 % del área, del 75 al 85 % del área o del 75 al 80 % del área. En un aspecto, el ácido graso altamente insaturado puede ser ácido eicosapentaenoico y la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser del 50 al 99 % del área, del 50 al 98 % del área, del 50 al 95 % del área, del 50 al 90 % del área, del 50 al 85 % del área, del 50 al 80 % del área, del 50 al 75 % del área, del 50 al 70 % del área, del 50 al 65 % del área, del 50 al 60 % del área, del 55 al 99 % del área, del 55 al 98 % del área, del 55 al 95 % del área, del 55 al 90 % del área, del 55 al 85 % del área, del 55 al 80 % del área, del 55 al 75 % del área, del 55 al 70 % del área, del 55 al 65 % del área o del 55 al 60 % del área.
En otro aspecto, el ácido graso altamente insaturado puede ser ácido eicosapentaenoico y la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser del 60 al 99 % del área, del 60 al 98 % del área, del 60 al 95 % del área, del 60 al 90 % del área, del 60 al 85 % del área, del 65 al 99 % del área, del 65 al 98 % del área, del 65 al 95 % del área, del 65 al 90 % del área, del 65 al 85 % del área, del 70 al 99 % del área, del 70 al 98 % del área, del 70 al 95 % del área, del 70 al 90 % del área, del 70 al 85 % del área, del 75 al 99 % del área, del 75 al 98 % del área, del 75 al 95 % del área, del 75 al 90 % del área o del 75 al 85 % del área.
En otro aspecto más, el ácido graso altamente insaturado puede ser ácido eicosapentaenoico y la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser del 60 al 80 % del área, del 65 al 80 % del área, del 70 al 80 % del área o del 75 al 80 % del área.
Al tener altas proporciones de ácidos grasos altamente insaturados, la composición de la presente invención es adecuada como materiales para la fabricación de productos farmacéuticos o complementos que contienen ácidos grasos altamente insaturados como principio activo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "% del área" que representa la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en los ácidos grasos constituyentes de una composición se puede explicar de la siguiente manera: la composición se analiza utilizando un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama de hidrógeno (FID, por sus siglas en inglés) (GC-FID); se identifican los picos de los componentes respectivos en el gráfico obtenido y se determinan las áreas de los picos de los ácidos grasos respectivos utilizando el algoritmo de integración de Agilent ChemStation (Revisión C.01.03[37], Agilent Technologies); el "% del área" es la proporción del área de un pico individual con respecto a la suma total de las áreas de los picos para los ácidos grasos respectivos y representa el contenido relativo del componente en ese pico. En el campo de la química del aceite, el % del área se utiliza como unidad prácticamente sinónima del % en peso. Véanse los Standard Methods for the Analysis of Fats, Oils and Related Materials established by Japan Oil Chemists' Society (JOCS), edición de 2013, 2.4.2.1-2013, Makeup of Fatty Acids (FID constant temperature gas chromatography) y misma referencia, 2.4.2.2­ 2013, Makeup of Fatty Acids (FID elevated temperature gas chromatography). Las condiciones de análisis para la cromatografía de gases se exponen a continuación.
Condiciones de medición de GC-FID
GC: 6890N (Agilent Technologies)
Columna: DB-WAX (Agilent Technologies)
DI 30 m x 0.25 mm, espesor de película de 0,25 pm
Gas portador: helio, 1 ml/min
Orificio de inyección: 250 °C, 1 pl, dividido (1:100)
Temperatura de la columna: 180 °C => 3 °C/min => 230 °C, retenido durante 15 min
Detector: FID, 250 °C
Gas auxiliar: nitrógeno, 45 ml/min.
En las realizaciones donde la composición de la presente invención es una composición de ácidos grasos que contiene ácidos grasos altamente insaturados, la proporción del ácido graso altamente insaturado en los ácidos grasos constituyentes se determina mediante el siguiente método. En resumen, de acuerdo con el método oficial Ce lb-89 del AOCS, la composición de ácidos grasos se esterifica con éster metílico y después se somete a CG en las condiciones anteriores, calculándose el % del área de los ácidos grasos altamente insaturados de la misma manera que se ha indicado anteriormente.
En este caso, los ácidos grasos constituyentes de la composición significan ácidos grasos libres en la composición de ácidos grasos.
En realizaciones donde la composición de la presente invención es una composición de éster alquílico de ácido graso que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados, la proporción del ácido graso altamente insaturado en los ácidos grasos constituyentes de la composición se determina mediante el siguiente método. En resumen, la composición de ésteres alquílicos de ácidos grasos se analiza mediante cromatografía de gases en las condiciones anteriores y se calcula la proporción de las áreas de los picos para los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados en relación con la suma total de las áreas de los picos para los ésteres alquílicos de ácidos grasos (% del área). En este caso, los ácidos grasos constituyentes de la composición significan los ácidos grasos que constituyen los ésteres alquílicos de ácidos grasos en la composición de ésteres alquílicos de ácidos grasos. El grupo alquilo en los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados es un grupo alquilo que procede de alcoholes inferiores usados habitualmente en la esterificación alquílica de ácidos grasos y puede ilustrarse mediante un grupo alquilo que tiene un átomo de carbono (un grupo metilo) o dos átomos de carbono (un grupo etilo). En realizaciones preferidas, los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados pueden ser ésteres etílicos de ácidos grasos altamente insaturados. La composición de la presente invención es tal que la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la composición mediante el método oficial de ensayo Cd 29b-13 de la American Oil Chemists' Society se ha reducido a menos de 1,80 ppm (mg/kg), por ejemplo, menos de 1,70 ppm, menos de 1,60 ppm, menos de 1,50 ppm, menos de 1,40 ppm, menos de 1,30 ppm, menos de 1,20 ppm, 1,10 ppm, menos de 1,00 ppm, menos de 0,90 ppm, menos de 0,80 ppm, menos de 0,70 ppm, menos de 0,60 ppm, menos de 0,50 ppm, menos de 0,40 ppm, menos de 0,30 ppm, menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm, menos de 0,05 ppm, menos de 0,04 ppm, menos de 0,03 ppm, menos de 0,02 ppm o menos de 0,01 ppm. La concentración de 3-MCPD es mayor de cero ppm. La composición de la presente invención es tal que la concentración de 3-MCPD que se encuentra al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0,01 ppm o más, por ejemplo, 0,02 ppm o más. Asimismo, la composición de la presente invención puede ser tal que la concentración de 3-MCPD que se encuentra al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0,01 ppm o más, y menos de 1,80 ppm, menos de 1.70 ppm, menos de 1,60 ppm, menos de 1,50 ppm, menos de 1,40 ppm, menos de 1,30 ppm, menos de menos de 1,10 ppm, menos de 1,00 ppm, menos de 0,90 ppm, menos de 0,80 ppm, menos de 0,70 ppm, 0,60 ppm, menos de 0,50 ppm, menos de 0,40 ppm, menos de 0,30 ppm, menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm, menos de 0,05 ppm, 0,04 ppm, menos de 0,03 ppm o menos de 0,02 ppm. Asimismo, la composición de la presente invención puede ser tal que la concentración de 3-MCPD que se encuentra al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0,02 ppm o más, y menos de 1,80 ppm, menos de 1.70 ppm, menos de 1,60 ppm, menos de 1,50 ppm, menos de 1,40 ppm, menos de 1,30 ppm, menos de 1,20 ppm, menos de 1,10 ppm, menos de 1,00 ppm, menos de 0,90 ppm, menos de 0,80 ppm, menos de 0,70 ppm, 0,60 ppm, menos de 0,50 ppm, menos de 0,40 ppm, menos de 0,30 ppm, menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm, menos de 0,05 ppm, 0,04 ppm o menos de 0,03 ppm.
Como se menciona en el presente documento, el análisis por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society (AOCS) se realiza mediante el siguiente procedimiento con el que está familiarizado un experto en la materia.
A 100 mg de una muestra, se añaden 100 pl de una solución patrón de 3-MCPD-d5-dipalmitato (diluido con tolueno para obtener 5 ppm de 3-MCPD-d5) y 600 pl de éter dietílico y después de mezclar con agitación hasta que la muestra se disuelva por completo, la mezcla se enfría entre -22 °C y -25 °C durante aproximadamente 15 minutos.
Posteriormente, se añaden 350 pl de una solución metanólica de hidróxido de sodio (se disuelven 0,25 g de hidróxido de sodio en 100 ml de metanol) y la mezcla se agita de forma intensa, seguido de una reacción entre -22 °C y -25 °C durante 16 horas o más. A la misma temperatura, se añaden 600 pl de una solución ácida de bromuro de sodio (preparada disolviendo 600 g de bromuro de sodio en 1 l de agua purificada y añadiendo después 3 ml de ácido fosfórico al 85 %) para detener la reacción y la capa orgánica separada de la capa acuosa se burbujea con nitrógeno hasta que se concentra a un volumen de aproximadamente 100 pl. Posteriormente, se añaden 600 pl de hexano y, después de una agitación vigorosa, la mezcla se deja reposar durante 5 a 10 minutos sin alteraciones para eliminar la capa orgánica; este proceso se repite dos veces. A la capa acuosa restante, se le añaden 600 pl de una mezcla líquida de éter dietílico y acetato de etilo (3:2, V/V) y la mezcla se agita vigorosamente, seguido de recuperación de la capa orgánica; este proceso se repite tres veces. Las tres capas orgánicas recuperadas se combinan y deshidratan con sulfato de sodio anhidro. La capa orgánica deshidratada se burbujea con nitrógeno hasta que se concentra a un volumen de 200 pl; posteriormente, se añaden 20 pl de una solución de ácido fenilborónico saturado en éter dietílico y se agita vigorosamente la mezcla durante 10 segundos; a continuación, se burbujea la mezcla con nitrógeno para eliminar completamente el disolvente. Al residuo, se le añaden 200 pl de isooctano y la mezcla se agita vigorosamente durante 10 segundos y la solución resultante se utiliza como muestra para GC-MS.
Para construir una curva de calibración para la cuantificación de 3-MCPD, se disuelve dipalmitato de 3-MCPD en tolueno para proporcionar concentraciones de 3-MCPD de 0 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm y 5 ppm para preparar soluciones patrón de 3-Mc Pd , que se analizan de la misma manera que con la muestra descrita anteriormente.
Las condiciones de análisis para GC-MS se establecen a continuación.
Condiciones de GC-MS
GC: GC-2010 y GCMS-QP2010 (Shimadzu)
Columna: DB-5ms (Agilent Technologies)
DI 30 m x 0.25 mm, espesor de película de 0,25 pm Gas portador: helio, 1,2 ml/min
Orificio de inyección: 250 °C, 1 pl, sin separación, tiempo de muestreo 1 min
Temperatura de la columna: 85 °C, retenido durante 0,5 min => 6 °C/min => 150 °C, retenido durante 5 min => 12 °C/min => 180 °C => 25 °C/min => 280 °C, retenido durante 7 min.
Temperatura de ionización: 200 °C
Temperatura de interfaz: 200 °C
Método de ionización: EI; la supervisión de SIM se realizó a los siguientes valores de m/z:
3-MCPD-d5: m/z = 149, 150, 201,203
3-MCPD: m/z = 146, 147, 196, 198
Para la cuantificación, se utilizan valores de m/z de 150 para 3-MCPD-d5 y 147 para 3-MCPD y los demás valores se utilizan para verificar las sustancias diana.
En el método de análisis descrito anteriormente, el 3-MCPD en la muestra, ya sea en una forma libre o de éster, se detecta como 3-MCPD como tal. Por lo tanto, los valores medidos obtenidos en el método de análisis descrito anteriormente representan el contenido total (ppm (mg/kg)) de la forma libre de 3-MCPD inicialmente presente en la muestra y una forma libre de 3-MCPD que se puede formar a partir de la forma de éster de 3-MCPD.
En un aspecto del presente documento, la composición de la presente invención es tal que la concentración de 3-MCPD que se encuentra al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0 ppm o más, y menos de 1,80 ppm. En este caso, la composición de la presente invención puede abarcar una composición sin 3-MCPD. En otras realizaciones, la composición de la presente invención contiene 3-MCPD (en concreto, 3-MCPD o un éster de ácido graso de 3-MCPD) y la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser inferior a 1,80 ppm.
La composición de la presente invención puede ser tal que la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society sea menor que el límite inferior de cuantificación, preferentemente menor que un límite de detección del método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society.
Se sabe que los ácidos grasos altamente insaturados, tales como el ácido eicosapentaenoico, abundan en ciertos tipos de aceites de microorganismos, aceites vegetales o aceites de animales marinos. Por lo tanto, estos se pueden utilizar como materias primas para la composición de la presente invención. Las materias primas para la composición de la presente invención se pueden ejemplificar específicamente mediante: aceites de pescado, tales como aceite de sardina, aceite de atún, aceite de bonito, aceite de lacha, aceite de hígado de bacalao, aceite de arenque, aceite de capelán y aceite de salmón; aceites de animales marinos procedentes de crustáceos, tales como kril; aceites vegetales derivados de la perilla, lino, soja y colza; y aceites derivados de microorganismos productores de lípidos, incluidas levaduras tales como las del género Yarrowia, hongos filamentosos pertenecientes, por ejemplo, al género Mortierella, al género Penicillium, al género Aspergillus, al género Rhodotorula y al género Fusarium, algas tales como la del género Euglena y estramenópilas. La composición de la presente invención puede ser un aceite procedente de microorganismos modificados por ingeniería genética transfectados con un gen tal como una variante genéticamente modificada del gen de elongasa A9. Como alternativa, también se pueden utilizar aceites procedentes de plantas modificadas genéticamente, en concreto, plantas oleaginosas tales como especies del género Brassica, girasol, maíz, algodón, lino y cártamo que se han transfectado con un gen tal como una variante del gen de la elongasa A9 mediante tecnología de gen recombinante como materias primas para la composición de la presente invención. Los aceites vegetales modificados por ingeniería genética, aceites de microorganismos modificados por ingeniería genética, etc., pueden, por ejemplo, ilustrarse por los que se divulgan en los documentos WO 2012/027698, WO 2010/033753, etc. En una realización preferida, las materias primas para la composición de la presente invención son aceites de pescado, aceites de microorganismos, aceites vegetales o aceites de animales acuáticos tales como aceites de animales marinos, más preferentemente, aceites de pescado.
Las materias primas para la composición en el presente documento contienen ácidos grasos altamente insaturados principalmente como glicéridos. En aceites de pescado, por ejemplo, muchos tipos de ácidos grasos que tienen de
14 a 22 átomos de carbono y de 0 a 6 enlaces dobles están contenidos como glicéridos. En presencia de un catalizador o una enzima, los glicéridos se hacen reaccionar con un alcohol inferior tal como etanol para esterificar con éster alquílico los ácidos grasos contenidos en los glicéridos y, a continuación, se eliminan los ésteres alquílicos de ácidos grasos distintos de los ácidos grasos altamente insaturados diana (tales como ésteres alquílicos de EPA), por lo que se pueden producir ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados (tales como ésteres alquílicos de EPA) de alta pureza. En una realización, los ésteres alquílicos de ácidos grasos distintos de los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados diana (tales como ésteres alquílicos de EPA) se pueden eliminar por destilación. Los presentes inventores descubrieron que los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD procedentes de mono- o diacilglicerol que tienen pesos moleculares relativamente altos se incluyen en grandes cantidades en el residuo que queda después de obtener la fracción destilada principal en la destilación. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la composición de la presente invención puede ser un destilado (fracción destilada).
Se sabe que tras los tratamientos térmicos implicados en la destilación, los isómeros en trans desnaturalizados térmicamente se forman a partir de los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados (véase, por ejemplo, European Journal of Lipid Science and Technology, 108 (2006) 589-597, "Geometrical isomerization of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid at high temperatures"; JAOCS, 66 (1989) 1822-1830, "Eicosapentaenoic acid geometrical isomer artifacts in heated fish oil esters"). Por lo tanto, en una realización, la composición de la presente invención puede contener además isómeros en trans de los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados. La concentración de isómeros en trans en la composición de la presente invención puede ser del 2,5 % del área o menos, por ejemplo, 2,3 % del área o menos, 2,0 % del área o menos, 1,8 % del área o menos, 1,6 % del área o menos, 1,4 % del área o menos, 1,2 % del área o menos, 1,0 % del área o menos, 0,9 % del área o menos, 0,8 % del área o menos, 0,7 % del área o menos, 0,6 % del área o menos o 0,5 % del área o menos. Por otro lado, la concentración de isómeros en trans en la composición de la presente invención es del 0,01 % del área o más, por ejemplo, 0,02 % del área o más, 0,03 % del área o más, 0,04 % del área o más o 0,05 % del área o más.
Como se menciona en el presente documento, la concentración de isómeros en trans es un valor medido por análisis de GC. Específicamente, se mide mediante el siguiente procedimiento.
Se disuelven diez miligramos de una muestra en 1 ml de hexano y se someten a análisis de GC en las siguientes condiciones.
[Condiciones de análisis de GC]
GC: 6890N (Agilent Technologies)
Columna: DB-WAX (Agilent Technologies)
DI 30 m x 0.25 mm, espesor de película de 0,25 pm
Gas portador: helio, 1 ml/min
Orificio de inyección: 250 °C, 1 pl, dividido (1:100)
Temperatura de la columna: 180 °C => 3 °C/min => 230 °C, retenido durante 15 min
Detector: FID, 250 °C
Gas auxiliar: nitrógeno, 45 ml/min.
Por ejemplo, la concentración de cinco isómeros en trans (A a E) del éster etílico de EPA (EPA-E) se calcula de la siguiente manera.
Dada una muestra de la que se han eliminado por destilación ácidos grasos saturados C21 o superiores o ácidos grasos insaturados monovalentes, los isómeros en trans del éster etílico de EPA (EPA-E) tienen los siguientes tiempos de retención relativos, tomándose el tiempo de retención para EPA-E como uno: de 0,98 a 0,99 para el isómero A; de 1,01 a 1,02 para el isómero B; de 1,02 a 1,03 para el isómero C; de 1,04 a 1,05 cada uno para los isómeros D y E que proporcionan picos solapantes. Entre los picos de los cinco isómeros, los de los isómeros D y E se solapan, lo que permite una detección de cuatro picos. La suma de las áreas de esos picos de tiempo de retención relativos se describe como el área del pico para los isómeros en trans de EPA-E. Se determina la proporción de los isómeros en trans a EPA-E y se calcula la concentración de los isómeros en la muestra a partir de la concentración de EPA-E en la muestra.
Dada una muestra que contiene ácidos grasos saturados C21 o superiores o ácidos grasos insaturados monovalentes, se realiza fraccionamiento con una columna de nitrato de plata utilizando 750 mg/6 ml de Discovery
Ag-ION (Supelco) para eliminar los ácidos grasos saturados C21 o superiores y los ácidos grasos insaturados monovalentes antes de realizar el análisis anterior.
Considerando, por ejemplo, los isómeros en trans del éster etílico del ácido dihomo-Y-linolénico (DGLA-E); la suma de las áreas de los siguientes picos de tiempo de retención relativos se mide mediante el análisis GC anterior y se determina la proporción de los isómeros en trans con respecto a DGLA-E y se calcula la concentración de los isómeros en la muestra a partir de la concentración de DGLA-E en la muestra.
Isómero A: tiempo de retención relativo; 1,001 a 1,009
Isómero B: tiempo de retención relativo; 1,01 a 1,03
(El tiempo de retención de DGLA se toma como 1).
Los contenidos de los isómeros en trans de otros ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados también se pueden medir mediante métodos rutinarios.
La composición de la presente invención puede ser tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de un éster alquílico de EPA puede ser del 2.5 % del área o menos, por ejemplo, 2,3 % del área o menos, 2,0 % del área o menos, 1,8 % del área o menos, 1.6 % del área o menos, 1,4 % del área o menos, 1,2 % del área o menos, 1,0 % del área o menos, 0,9 % del área o menos, 0,8 % del área o menos, 0,7 % del área o menos, 0,6 % del área o menos o 0,5 % del área o menos. Por otro lado, la composición de la presente invención es tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de un éster alquílico de EPA puede ser del 0,01 % del área o más, por ejemplo, 0,02 % del área o más, 0,03 % del área o más, 0,04 % del área o más o 0,05 % del área o más.
En realizaciones preferidas, la composición de la presente invención es tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de éster etílico de EPA puede ser del 2,5 % del área o menos, por ejemplo, 2,3 % del área o menos, 2,0 % del área o menos, 1,8 % del área o menos, 1,6 % del área o menos, 1,4 % del área o menos, 1,2 % del área o menos, 1,0 % del área o menos, 0,9 % del área o menos, 0,8 % del área o menos, 0,7 % del área o menos, 0,6 % del área o menos o 0,5 % del área o menos. Por otro lado, la composición de la presente invención es tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de éster etílico de EPA puede ser del 0,01 % del área o más, por ejemplo, 0,02 % del área o más, 0,03 % del área o más, 0,04 % del área o más o 0,05 % del área o más.
La composición de la presente invención puede ser tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de un éster alquílico de DGLA puede ser del 2,5 % del área o menos, por ejemplo, 2,3 % del área o menos, 2,0 % del área o menos, 1,8 % del área o menos, 1.6 % del área o menos, 1,4 % del área o menos, 1,2 % del área o menos, 1,0 % del área o menos, 0,9 % del área o menos, 0,8 % del área o menos, 0,7 % del área o menos, 0,6 % del área o menos o 0,5 % del área o menos. Por otro lado, la composición de la presente invención es tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de un éster alquílico de DGLA puede ser del 0,01 % del área o más, por ejemplo, 0,02 % del área o más, 0,03 % del área o más, 0,04 % del área o más o 0,05 % del área o más.
En realizaciones preferidas, la composición de la presente invención es tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de éster etílico de DGLA puede ser del 2,5 % del área o menos, por ejemplo, 2,3 % del área o menos, 2,0 % del área o menos, 1,8 % del área o menos, 1,6 % del área o menos, 1,4 % del área o menos, 1,2 % del área o menos, 1,0 % del área o menos, 0,9 % del área o menos, 0,8 % del área o menos, 0,7 % del área o menos, 0,6 % del área o menos o 0,5 % del área o menos. Por otro lado, la composición de la presente invención es tal que, tras la medición por cromatografía de gases en las condiciones de análisis anteriores, la concentración de isómeros en trans de éster etílico de DGLA puede ser del 0,01 % del área o más, por ejemplo, 0,02 % del área o más, 0,03 % del área o más, 0,04 % del área o más o 0,05 % del área o más.
Los aceites de pescado y los aceites de microorganismos que contienen ácidos grasos altamente insaturados también contienen colesterol además de triglicéridos. Los aceites enriquecidos con ácidos grasos altamente insaturados preparados a partir de estos aceites de alimentación también contienen colesterol (documento WO 2012/118173). Lo que es más, los aceites que contienen colesterol no están completamente exentos de colesterol incluso si se someten a esterificación alcalina o formación de aductos de urea. Por lo tanto, en determinadas realizaciones en el presente documento, la composición de la presente invención contiene colesteroles. El contenido de colesterol puede, por ejemplo, ser del 1,5 % en peso o menos, del 0,3 % en peso o menos o del 0,2 % en peso o menos. A este respecto, el contenido de colesterol puede, por ejemplo, ser del 0,01 % en peso o más o del 0,02 % en peso o más.
Los colesteroles son compuestos que tienen una estructura básica esteroide representada por la fórmula molecular C27H46O y, en productos naturales, los colesteroles están presentes en forma libre o de éster. La forma de éster es un colesterol de acilo que tiene un ácido graso unido al resto de un grupo hidroxilo (grupo OH). En el contexto de la presente invención, el contenido de colesterol significa la suma de los contenidos de colesteroles en forma libre y de éster. El contenido de colesterol se mide por el siguiente método.
A aproximadamente 0,1 g de una muestra, se le añade 1 ml de 5a-colestano 0,1 g/l como patrón interno y después de añadir 1 ml de hidróxido de potasio 20 mol/l en etanol hidratado, la mezcla se calentó a 100 °C durante 10 minutos. Después de enfriarse, se añaden 3 ml de éter de petróleo y 3 ml de sulfato de amonio saturado y la mezcla se agita y se deja reposar sin alteraciones; posteriormente, la capa superior se recupera y se somete a una medición por cromatografía de gases en las siguientes condiciones. Para determinar las sensibilidades relativas al 5acolestano y a colesteroles libres, una solución de hexano que tiene cada uno de 5a-colestano y colesteroles disueltos en una cantidad de 25 mg se somete a una medición por cromatografía de gases y se calcula la cantidad total de colesteroles.
Condiciones de análisis por cromatografía de gases
Modelo de aparato: Sistema de GC Agilent 6890 (Agilent)
Columna: DB-1 J&W 123-1012
Temperatura de la columna: 270 °C
Temperatura de inyección: 300 °C
Método de inyección: Separación
Relación de separación: 50:1
Temperatura del detector: 300 °C
Detector: FID
Gas portador: helio (39,3 kPa, presión constante)
En una realización, la composición de la presente invención puede contener como impureza ácidos grasos saturados con un número de carbonos de no más de 18 o ésteres alquílicos de los mismos. En este caso, la proporción de ácidos grasos saturados con un número de carbonos no superior a 18 en los ácidos grasos constituyentes de la composición de la presente invención puede ser del 0,1 % del área o más, por ejemplo, 0,2% del área o más o 0,3 % del área o más, y menos del 10 % del área, por ejemplo, menos del 5 % del área, menos del 4 % del área o menos del 3 % del área.
Los ácidos grasos altamente insaturados se pueden obtener hidrolizando los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados producidos por el método descrito anteriormente.
La composición de la presente invención es una que contiene ácidos grasos o ésteres alquílicos de ácidos grasos como componente principal y normalmente contiene 50 % en peso o más, 55 % en peso o más, 60 % en peso o más, 65 % en peso o más, 70 % en peso o más, 75 % en peso o más, 80 % en peso o más, 85 % en peso o más, 90 % en peso o más, 95 % en peso o más, 96 % en peso o más, 97 % en peso o más, 98 % en peso o más, 99 % en peso o más, 99,5 % en peso o más o 99,9 % en peso o más de ácidos grasos o ésteres alquílicos de ácidos grasos. El contenido de ácidos grasos o ésteres alquílicos de ácidos grasos en la composición de la presente invención se puede confirmar mediante una técnica conocida públicamente, tal como TLC/FID.
MÉTODO PARA PRODUCIR UNA COMPOSICIÓN QUE CONTIENE UN ÁCIDO GRASO ALTAMENTE INSATURADO O UN ÉSTER ALQUILICO DEL MISMO
La presente invención proporciona un método para producir la composición descrita anteriormente de la presente invención. El método comprende:
(1) esterificación alquílica de una materia prima que contiene un triglicérido que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente para preparar una composición que contiene un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado;
(2) al menos uno seleccionado entre (a) reducir a menos de 10.000 ppm la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer en la composición preparada en la etapa (1), (b) reducir la concentración de hierro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 0,20 ppm y (c) reducir la concentración de cloro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 10 ppm; y
(3) destilar la composición resultante de la etapa (2) y recoger la fracción de destilado principal (en lo sucesivo en el presente documento, el método se denominará en ocasiones el método de la presente invención).
Según el método de la presente invención, se puede producir una composición que contiene ácidos grasos o ésteres alquílicos de ácidos grasos como componente principal y contiene un 95 % en peso o más, 96 % en peso o más, 97 % en peso o más, 98 % en peso o más, 99 % en peso o más, 99,5 % en peso o más o 99,9 % en peso o más de ácidos grasos o ésteres alquílicos de ácidos grasos.
En lo sucesivo, en el presente documento, la etapa (1) se denomina, en ocasiones, etapa de esterificación alquílica, la etapa (2)(a) se denomina, en ocasiones, etapa de eliminación de monoacilglicerol, la etapa (2)(b) se denomina, en ocasiones, etapa de eliminación de hierro, la etapa (2)(c) se denomina, en ocasiones, etapa de eliminación de cloro y la etapa (3) se denomina, en ocasiones, etapa de destilación.
Las materias primas que se pueden usar en el método de la presente invención incluyen los aceites enumerados para la composición descrita anteriormente de la presente invención y se pueden ilustrar específicamente mediante: aceites de pescado, tales como aceite de sardina, aceite de atún, aceite de bonito, aceite de lacha, aceite de hígado de bacalao, aceite de arenque, aceite de capelán y aceite de salmón; aceites de animales marinos procedentes de crustáceos, tales como kril; aceites vegetales derivados de la perilla, lino, soja y colza; y aceites derivados de microorganismos productores de lípidos, incluidas levaduras tales como las del género Yarrowia, hongos filamentosos pertenecientes, por ejemplo, al género Mortierella, al género Penicillium, al género Aspergillus, al género Rhodotorula y al género Fusarium, algas tales como la del género Euglena y estramenópilas. Los aceites que se pueden usar como materias primas para el método de la presente invención pueden ser un aceite procedente de microorganismos modificados genéticamente transfectados con un gen tal como una variante modificada genéticamente del gen de elongasa A9. Como alternativa, también se pueden utilizar aceites procedentes de plantas modificadas genéticamente, en concreto, plantas oleaginosas tales como especies del género Brassica, girasol, maíz, algodón, lino y cártamo que se han transfectado con un gen tal como una variante del gen de la elongasa A9 mediante tecnología de gen recombinante como materias primas para el método de la presente invención. Los aceites vegetales modificados por ingeniería genética, aceites de microorganismos modificados por ingeniería genética, etc., pueden, por ejemplo, ilustrarse por los que se divulgan en los documentos WO 2012/027698, WO 2010/033753, etc. En realizaciones preferidas, las materias primas utilizadas en el método de la presente invención son aceites de pescado, aceites de microorganismos, aceites vegetales o aceites de animales acuáticos tales como aceites de animales marinos, más preferentemente aceites de pescado.
Etapa de refinado de aceite en bruto
El aceite de alimentación que se va a utilizar para la esterificación alquílica en la etapa (1) puede ser un aceite en bruto o un aceite refinado. Los aceites en bruto pueden obtenerse por cualquier método a partir de productos acuáticos tales como pescado o productos marinos y, en el caso de los aceites de pescado, se recogen habitualmente de la siguiente manera: el pescado en su conjunto o los residuos resultantes del procesamiento del pescado, tales como la cabeza, la piel, la espina dorsal o las vísceras del pescado se muelen, se cuecen al vapor y se prensan para separarlos en agua de cola y harina prensada. La grasa y el aceite obtenidos junto con el agua de cola se centrifugan para separarlos como aceite de pescado en bruto.
Los aceites de pescado refinados se obtienen en general a partir de aceites de pescado en bruto mediante un proceso de refinado en el que se realiza una etapa de desgomado, una etapa desacidificante, una etapa de descoloración mediante arcilla activada o carbón activado, una etapa de lavado con agua, una etapa de desodorización como por destilación al vapor y otras etapas dependiendo de la materia prima a partir de la cual se han preparado los aceites de pescado en bruto, para eliminar de este modo sustancias no deseadas tales como fosfolípidos y esteroles. En realizaciones de la presente invención, los aceites de pescado refinados se pueden utilizar como materia prima.
Etapa (1) (etapa de esterificación alquílica)
Las grasas o los aceites como aceite de alimentación se descomponen en ésteres de alcoholes inferiores por medio de alcohólisis utilizando alcoholes inferiores. Los alcoholes inferiores incluyen los que se utilizan habitualmente en la esterificación alquílica de ácidos grasos, por ejemplo, alcoholes inferiores que tienen uno o dos átomos de carbono. La alcohólisis es una técnica mediante la cual se hace reaccionar una grasa o un aceite con un alcohol inferior tal como el etanol en presencia de un catalizador o una enzima añadidos para formar un éster alquílico a partir de un ácido graso unido a la glicerina. Los catalizadores que se pueden utilizar incluyen un catalizador alcalino, un catalizador ácido, etc. Las enzimas que se pueden utilizar incluyen lipasa.
Se ha encontrado empíricamente que la alcohólisis de los ácidos grasos presenta una alta eficiencia de reacción y, después de la alcohólisis, se obtienen composiciones que comprenden principalmente ácidos grasos en forma de sus ésteres alquílicos. Esto, sin embargo, no excluye totalmente el caso de comprender ácidos grasos en formas distintas de los ésteres alquílicos.
Etapa (2)
La etapa (2) es una etapa preliminar antes de la destilación y es al menos una etapa seleccionada de las siguientes (a) a (c). En resumen, la etapa (2) puede ser una cualquiera de (a) a (c) o puede consistir en (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c), o (a), (b) y (c).
(a) Etapa de eliminación de monoacilglicerol
En la etapa (2)(a), antes de que la composición preparada en la etapa (1) que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos se concentre por destilación, se reduce el contenido de monoacilgliceroles que actúan como sustrato para los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD. Como resultado, puede reducirse la cantidad de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD que se obtienen como resultado de los tratamientos térmicos durante la destilación para que se incluyan en la fracción destilada principal.
Para eliminar los monoacilgliceroles de la composición preparada en la etapa (1) que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos, se pueden emplear técnicas existentes tales como tratamientos repetidos de esterificación alquílica o tratamientos con adsorbentes.
La esterificación es una reacción en equilibrio y la cantidad residual de glicéridos depende de la relación entre el alcohol y el subproducto glicerina. Si las fracciones de éster obtenidas como resultado de la esterificación alquílica se someten de nuevo a esterificación alquílica, la relación entre el alcohol y la glicerina se desplaza significativamente más hacia el lado del alcohol que hacia el lado de la glicerina, de modo que se puede reducir el contenido de glicéridos.
Los tratamientos con adsorbentes pueden, por ejemplo, incluir cromatografía en gel de sílice, tratamiento con arcilla activada, tratamiento con arcilla ácida, tratamiento con carbón activado y tratamiento con gel de sílice. La cromatografía en gel de sílice puede, por ejemplo, realizarse mediante el siguiente procedimiento. En el tratamiento con gel de sílice (por ejemplo, Microesfera D75-60A), se aplica una composición que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos a una columna rellena con gel de sílice de modo que los ésteres alquílicos de ácidos grasos se adsorban en el gel de sílice. Posteriormente, se hace pasar acetato de etilo/hexano (1:50) a través de la columna, el eluato se fracciona y se recuperan las fracciones que consisten en ésteres alquílicos de ácidos grasos sin MAG y DAG. El disolvente se elimina de las fracciones recuperadas para obtener ésteres alquílicos de ácidos grasos. El tratamiento con arcilla activada puede, por ejemplo, realizarse mediante la adición de arcilla activada en una cantidad del 5 % con respecto al aceite, agitando la mezcla a 120 °C durante 2 horas a presión reducida y después filtrando la mezcla. Otros tratamientos con adsorbentes se pueden realizar mediante métodos rutinarios.
El monoacilglicerol que se pretende eliminar en la etapa (2)(a) comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer. Aquí, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer se refiere al éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer en el método de la presente invención. Para ser más específico, en la destilación de la etapa (3), las condiciones se establecen de tal manera que el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer se recogerá como la fracción destilada principal. Por lo tanto, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se recoge como la fracción destilada principal, y se enriquece en ella, en la destilación de la etapa (3).
En el caso de que se vayan a enriquecer dos o más ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados (por ejemplo, se van a enriquecer combinaciones de ésteres alquílicos de dos o más ácidos grasos altamente insaturados seleccionados entre ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico y ácido araquidónico), se reducen las concentraciones de monoacilgliceroles que comprenden como ácidos grasos constituyentes los ácidos grasos que tienen 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que tiene el mayor número de carbonos. Aunque el ácido graso constituyente de monoacilglicerol que se pretende eliminar en la etapa (2)(a) puede ser un ácido graso saturado o insaturado, se prefiere la eliminación de monoacilglicerol de ácido graso saturado. En la etapa (2)(a), la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer se reduce a menos de 10.000 ppm, menos de 9.000 ppm, menos de 8.000 ppm, menos de 7.000 ppm, menos de 6.000 ppm, menos de 5.000 ppm, menos de 4.000 ppm, menos de 3.000 ppm, menos de 2.000 ppm, menos de 1.000 ppm, menos de 900 ppm, menos de 800 ppm, menos de 700 ppm, menos de 600 ppm o menos de 500 ppm. En algunas realizaciones, la concentración de monoacilglicerol es superior a cero ppm. En algunas realizaciones, antes de dicha reducción, la concentración de dicho monoacilglicerol es de 10.000 ppm o más o el otro límite superior mencionado o superior. Por ejemplo, en el caso en que el éster alquílico altamente insaturado que se pretende enriquecer sea un éster alquílico de ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3), ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6) o ácido araquidónico (20:4 n-6), o combinaciones de los mismos, la concentración de monoacilgliceroles que comprenden como ácido graso constituyente un ácido graso que no tiene más de 15 átomos de carbono, preferentemente un ácido graso que tiene 14 átomos de carbono, se reduce a uno cualquiera de los valores enumerados anteriormente. Si el éster alquílico altamente insaturado que se pretende enriquecer es un éster alquílico de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3), la concentración de monoacilgliceroles que comprenden como ácido graso constituyente un ácido graso que no tiene más de 17 átomos de carbono, preferentemente un ácido graso que tiene 16 átomos de carbono, se reduce a uno cualquiera de los valores enumerados anteriormente. Además, si el éster alquílico altamente insaturado que se pretende enriquecer es una combinación de un éster alquílico de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3) con al menos un miembro seleccionado entre ésteres alquílicos de ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3), ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6) y ácido araquidónico (20:4 n-6), la concentración de monoacilgliceroles que comprenden como ácido graso constituyente un ácido graso que no tiene más de 17 átomos de carbono, preferentemente un ácido graso que tiene 14 átomos de carbono y un ácido graso que tiene 16 átomos de carbono, se reduce a uno cualquiera de los valores enumerados anteriormente.
En la destilación de la etapa (3), un éster de ácido graso de 3-MCPD, que puede generarse a partir de un monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer, puede estar contenido en la fracción destilada principal junto con dicho éster alquílico de ácido graso altamente insaturado. Por lo tanto, si, en el caso de que el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer en la destilación de la etapa (3) se obtenga como destilado principal, la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer se reduce de forma preliminar, se puede obtener una composición que contiene un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que tiene una concentración reducida de un éster de ácido graso de 3-MCPD.
Los monoacilgliceroles que se pretende eliminar en la etapa (2)(a) pueden ser los que comprenden como ácidos grasos constituyentes los ácidos grasos que tienen de 5 a 10, de 5 a 9, de 5 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 o 6 átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer. En la etapa (2)(a), la concentración de estas clases de monoacilgliceroles puede reducirse colectivamente a uno de los valores enumerados anteriormente.
En algunas realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es el éster alquílico de ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3), éster alquílico de ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6) o éster alquílico de ácido araquidónico (20:4 n-6), o combinaciones de los mismos, y el monoacilglicerol que se pretende eliminar en la etapa (2)(a) puede ser monomiristato de glicerol.
En algunas realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es un éster alquílico de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3) y el monoacilglicerol que se pretende eliminar en la etapa (2)(a) puede ser monopalmitato de glicerol.
En algunas realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es una combinación de éster alquílico de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3) con al menos un miembro seleccionado entre éster alquílico de ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3), éster alquílico de ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6) y éster alquílico de ácido araquidónico (20:4 n-6), y los monoacilgliceroles que se van a eliminar en la etapa (2)(a) pueden consistir en monomiristato de glicerol y monopalmitato de glicerol.
Como se menciona en el presente documento, las concentraciones de monoacilglicerol (MAG) y diacilglicerol (DAG) en la composición son valores (ppm (mg/kg)) calculados a partir de los valores de medición por el siguiente método. Se muestrean cien microlitros de la composición, se pesan con precisión y se disuelven en 400 pl de hexano para preparar 150 pl de una solución, que después se somete a cromatografía en capa fina (TLC) en las siguientes condiciones para separar de este modo MAG y DAG. Todas las bandas de MAG y DAG identificadas de este modo a UV 254 nm se raspan y, después de añadir 1 ml de metóxido de sodio 1 N en metanol, la mezcla se calienta durante 5 minutos con agitación intensa. Posteriormente, la mezcla se enfría a temperatura ambiente y, después de añadir 1 ml de HCl 1 N, la mezcla se agita de forma intensa. Después de añadir 1 ml de FAME (éster metílico del ácido tricosanoico) C23:0 0,1 mg/ml en hexano y 5 ml de salmuera saturada, la mezcla se agita de forma intensa. Utilizando la capa de hexano resultante como muestra, se realiza un análisis GC-FID en las siguientes condiciones y las concentraciones de los respectivos ácidos grasos se calculan mediante la siguiente fórmula:
Concentración de un ácido graso [mg/kg] = (área del pico del ácido graso/área del pico de C23:0) x (105/la cantidad [mg] de la muestra sometida a TLC)
Condiciones de TLC
Placa de TLC: Gel de sílice PLC 60F2540,5 mm, 10 cm x 10 cm
Disolventes de revelado: hexano/éter dietílico/ácido acético (7:3:0,1, vol/vol/vol)
Condiciones de medición de GC-FID
GC: 6890N (Agilent Technologies)
Columna: DB-WAX (Agilent Technologies)
DI 30 m x 0.25 mm, espesor de película de 0,25 pm
Gas portador: helio, 1 ml/min
Orificio de inyección: 250 °C, 1 pl, dividido (1:100)
Temperatura de la columna: 180 °C => 3 °C/min => 230 °C, retenido durante 15 min
Detector: FID, 250 °C
Gas auxiliar: nitrógeno, 45 ml/min.
(b) Etapa de eliminación de hierro
En la etapa (2)(b), la concentración de hierro se reduce a menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm o menos de 0,05 ppm. En algunas realizaciones, la concentración de hierro es superior a cero ppm. En algunas realizaciones, antes de dicha reducción, la concentración de hierro es de 0,20 ppm o más o el otro límite superior mencionado o superior. Al reducir la concentración de hierro, se puede suprimir la formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD.
Como se menciona en el presente documento, la concentración de hierro (o contenido de hierro) es un valor (ppm (mg/kg)) que se calcula a partir de mediciones realizadas por ICP-MS. Específicamente, se calcula mediante el siguiente procedimiento.
Después de pesar con precisión 1 g de una composición de prueba, se añade acetato de butilo (de una calidad apta para análisis de absorción atómica; fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para preparar 10 ml; la solución resultante se utiliza como fluido de muestra.
Como muestra patrón, se utiliza Conostan S-21 (10 ppm (peso)). Esta muestra patrón se diluye con acetato de butilo para preparar muestras para la construcción de una curva de calibración (0 pg/l, 0,1 pg/l, 0,5 pg/l, 1 pg/l, 5 pg/l, 10 pg/l, 50 pg/l y 100 pg/l).
El fluido de muestra y las muestras para la curva de calibración se someten a análisis ICP-MS en las siguientes condiciones; se construye una curva de calibración mediante cálculos automáticos con el programa informático que es un accesorio del aparato y se determina el contenido de hierro en el fluido de muestra.
Instrumento: ICP-MS Agilent serie 7700 (Agilent Technologies)
Potencia de RF: 1550 W
Posición de muestreo: 10 mm
Gas portador: 0,45 l/min
Proporción de gas: 20 %
Gas auxiliar: 0,20 l/min
Temperatura de la cámara de pulverización: -5 °C
Introducción de muestras: succión a presión negativa
Modo de medición: Modo de He
Caudal de gas de la celda de He: 43 ml/min
Elemento que se pretende medir: 56Fe
Dado el contenido de hierro determinado de este modo en el fluido de muestra, el contenido de hierro en la composición de la muestra se calcula mediante la siguiente fórmula:
Contenido de hierro [ppm] en la composición de la muestra = C/(W x 100) C: el contenido de hierro (pg/l) en el fluido de muestra medido por ICP-MS
W: la cantidad de la composición de la muestra recogida (g)
La concentración de hierro se puede reducir a menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm o menos de 0,05 ppm mediante una etapa diferente de la etapa de eliminación de monoacilglicerol. En algunas realizaciones, la concentración de hierro es superior a cero ppm. Las técnicas para reducir la concentración de hierro pueden ser las que se pueden emplear en la etapa de eliminación de monoacilglicerol descrita anteriormente; otros ejemplos incluyen la limpieza con ácido y el intercambio iónico. Estas técnicas de eliminación se pueden realizar mediante métodos rutinarios.
(c) Etapa de eliminación de cloro
En la etapa (2)(c), la concentración de cloro se reduce a menos de 10 ppm, por ejemplo, menos de 9 ppm, menos de 8 ppm o menos de 7 ppm. En algunas realizaciones, la concentración de cloro es superior a cero ppm. En algunas realizaciones, antes de dicha reducción, la concentración de cloro es de 10 ppm o más o el otro límite superior mencionado o superior. Al reducir la concentración de cloro, se puede suprimir la formación de ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD.
Como se menciona en el presente documento, la concentración de cloro (o contenido de cloro) es un valor (ppm (mg/kg)) calculado a partir de mediciones realizadas por ICP-MS. Específicamente, se calcula mediante el siguiente procedimiento.
Después de pesar con precisión 1 g de una composición de prueba, se añade acetato de butilo (de una calidad apta para análisis de absorción atómica; fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para preparar 10 ml; la solución resultante se utiliza como fluido de muestra.
Como muestra patrón, se utiliza un patrón de Cl Conostan (1000 ppm (peso)). Esta muestra patrón se diluye con acetato de butilo para preparar muestras para la construcción de una curva de calibración (0 |jg/l, 0,1 |jg/l, 0,5 |jg/l, 1 jg/l, 5 jg/l, 10 jg/l, 50 jg/l y 100 jg/l).
El fluido de muestra y las muestras para la curva de calibración se someten a análisis ICP-MS en las siguientes condiciones; se construye una curva de calibración mediante cálculos automáticos con el programa informático que es un accesorio del aparato y se determina el contenido de cloro en el fluido de muestra.
Instrumento: ICP-MS Agilent serie 7700 (Agilent Technologies)
Potencia de RF: 1550 W
Posición de muestreo: 10 mm
Gas portador: 0,45 l/min
Proporción de gas: 20 %
Gas auxiliar: 0,20 l/min
Temperatura de la cámara de pulverización: -5 °C
Introducción de muestras: succión a presión negativa
Modo de medición: Modo de He
Caudal de gas de la celda de He: 43 ml/min
Elemento que se pretende medir: 35Cl
Dado el contenido de cloro determinado de este modo en el fluido de muestra, el contenido de cloro en la composición de la muestra se calcula mediante la siguiente fórmula:
Contenido de cloro [ppm] en la composición de la muestra = C/(W x 100) C: el contenido de cloro (jg/l) en el fluido de muestra medido por ICP-MS
W: la cantidad de la composición de la muestra recogida (g)
La concentración de cloro puede reducirse a menos de 10 ppm, por ejemplo, menos de 9 ppm, menos de 8 ppm o menos de 7 ppm mediante una etapa diferente de la etapa de eliminación de monoacilglicerol. En algunas realizaciones, la concentración de cloro es superior a cero ppm. Las técnicas para reducir la concentración de cloro pueden ser las que se pueden emplear en la etapa de eliminación de monoacilglicerol descrita anteriormente; otros ejemplos incluyen desgomado, desacidificación y otras técnicas que se emplean habitualmente en el proceso de refinado de grasas y aceites. Estas técnicas de eliminación se pueden realizar mediante métodos rutinarios.
Etapa (3) (etapa de destilación)
La composición que se ha reducido en la concentración de monoacilgliceroles en la etapa (2) se destila y se recoge la fracción principal del destilado. Estableciendo condiciones tales que la fracción principal del destilado comprenda los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados que se pretende enriquecer, se puede obtener una composición que contiene los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados y en la que la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society es inferior a 1,80 ppm, incluso si los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD se obtienen como resultado del tratamiento térmico durante la destilación. Dichas condiciones de destilación se pueden establecer de manera adecuada para los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados que se pretende enriquecer. La etapa de destilación se puede realizar mediante, por ejemplo, rectificación (destilación de precisión), destilación molecular o destilación de recorrido corto. Estas operaciones se pueden realizar mediante métodos rutinarios, tales como los divulgados en los documentos JP H4-128250 A, JP H5-222392 A, JP H4-41457 A y JP H6-33088 A.
La rectificación se realiza a alto vacío y se pueden obtener ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados como destilado principal separándolo de un destilado inicial más volátil y de un residuo menos volátil. Las condiciones para la rectificación pueden establecerse de modo que los ésteres alquílicos de ácidos grasos altamente insaturados que se pretende enriquecer puedan enriquecerse como el destilado principal y pueden ilustrarse mediante una temperatura entre 150 °C y 200 °C, por ejemplo, entre 160 °C y 200 °C o entre 170 °C y 200 °C, y una presión entre 1 y 300 Pa, por ejemplo, entre 1 y 200 Pa, entre 1 y 100 Pa o entre 1 y 50 Pa. Se prefiere obtener el destilado principal entre 170 °C y 200 °C con un grado de vacío entre 1 y 50 Pa.
Las condiciones ilustrativas para la destilación molecular o la destilación de recorrido corto incluyen una temperatura entre 80 °C y 150 °C, por ejemplo, entre 80 °C y 130 °C o entre 80 °C y 120 °C, y una presión inferior a 10 x 10-1 Pa, por ejemplo, inferior a 10 x 10-2 Pa o inferior a 10 x 10-3 Pa.
La concentración de 3-MCPD hallada al analizar la fracción destilada principal de la etapa (3) por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society es menos de 1,80 ppm, por ejemplo, menos de 1,70 ppm, menos de 1,60 ppm, menos de 1,50 ppm, menos de 1,40 ppm, menos de 1,30 ppm, menos de 1,20 ppm, menos de 1,10 ppm, menos de 1,00 ppm, menos de 0,90 ppm, menos de 0,80 ppm, menos de 0,70 ppm, menos de 0,60 ppm, menos de 0,50 ppm, menos de 0,40 ppm, menos de 0,30 ppm, menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm, menos de 0,05 ppm, menos de 0,04 ppm, menos de 0,03 ppm, menos de 0,02 ppm o menos de 0,01 ppm. En algunas realizaciones, la concentración de 3-MCPD es superior a cero ppm. En particular, concentración de 3-MCPD hallada al analizar la fracción destilada principal de la etapa (3) por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0,01 ppm o más, por ejemplo, 0,02 ppm o más. Lo que es más, la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la fracción destilada principal de la etapa (3) por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0,01 ppm o más, y menos de 1,80 ppm, menos de 1,70 ppm, menos de 1,60 ppm, menos de 1,50 ppm, menos de 1,40 ppm, menos de 1,30 ppm, menos de 1,20 ppm, menos de 1,10 ppm, menos de 1,00 ppm, menos de 0,90 ppm, menos de 0,80 ppm, menos de 0,70 ppm, menos de 0,60 ppm, menos de 0,50 ppm, menos de 0,40 ppm, menos de 0,30 ppm, menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm, menos de 0,05 ppm, menos de 0,04 ppm, menos de 0,03 ppm, menos de 0,02 ppm. La concentración de 3-MCPD hallada al analizar la fracción destilada principal de la etapa (3) por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society puede ser de 0,02 ppm o más, y menos de 1,80 ppm, menos de 1,70 ppm, menos de 1,60 ppm, menos de 1,50 ppm, menos de 1,40 ppm, menos de 1,30 ppm, menos de 1,20 ppm, menos de 1,10 ppm, menos de 1,00 ppm, menos de 0,90 ppm, menos de 0,80 ppm, menos de 0,70 ppm, menos de 0,60 ppm, menos de 0,50 ppm, menos de 0,40 ppm, menos de 0,30 ppm, menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm, menos de 0,05 ppm, menos de 0,04 ppm o menos de 0,03 ppm.
Etapa cromatográfica
El método de la presente invención puede comprender además una etapa de refinado después de la etapa (3) que se basa en cromatografía tal como cromatografía en columna líquida de alta resolución (HPLc ).
La etapa cromatográfica basada en HPLC o de otro tipo, que es posterior a la etapa de destilación, es tal que el contenido de componentes no deseados en la composición que resulta de la etapa de destilación se reduce al, por ejemplo, eliminar los componentes no deseados, después de lo cual el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado se enriquece adicionalmente en la composición posteriormente a la destilación. La etapa cromatográfica se puede realizar de acuerdo con métodos conocidos convencionalmente, por ejemplo, el método divulgado en el documento JP H5-222392 A. La cromatografía para su uso en el proceso de enriquecimiento puede ilustrarse mediante cromatografía en columna de fase inversa. Los ejemplos de la fase estacionaria (adsorbente) incluyen perlas poliméricas, preferentemente poliestireno reticulado con DVB (divinilbenceno), y gel de sílice, preferentemente gel de sílice unido en fase inversa que comprende alcano C8 o C18, y se prefiere particularmente gel de sílice en fase inversa unido en C18. El adsorbente que se va a utilizar en la cromatografía a continuación de la destilación en la presente invención es preferentemente apolar. Se puede utilizar cualquier adsorbente para la división de fase inversa sin limitaciones particulares y un ejemplo es un gel de sílice de octadecilsililo (ODS) que se puede utilizar para realizar una columna de ODS.
El tamaño de las columnas que se van a utilizar en el aparato no está particularmente limitado, excepto que depende de la cantidad de muestra que se va a purificar. Cualquier experto en la materia puede determinar fácilmente la columna de tamaño adecuado que se va a utilizar. El diámetro de cada columna es normalmente de entre 10 y 800 mm, preferentemente entre 50 y 800 mm, más preferentemente entre 300 y 800 mm y lo más preferentemente entre 600 y 800 mm. La longitud de cada columna es normalmente de entre 10 y 200 mm, preferentemente entre 25 y 150 mm.
La temperatura de la fase móvil y la columna no está particularmente limitada, excepto que depende del grado en que el material que se va a separar se disuelva en la fase móvil. Cualquier experto en la materia puede determinar fácilmente la temperatura de la columna y la fase móvil apropiadas que se va a utilizar. La temperatura de la columna suele estar entre 0 °C y 70 °C, preferentemente entre 20 °C y 40 °C.
El disolvente que se va a utilizar en la fase móvil puede, por ejemplo, ilustrarse mediante alcoholes de cadena corta. Los alcoholes de cadena corta tienen normalmente entre 1 y 6 átomos de carbono. Los ejemplos de alcoholes de cadena corta adecuados incluyen metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, s-butanol y t-butanol. El disolvente que se va a utilizar en la fase móvil es preferentemente metanol o etanol, más preferentemente metanol. Para acortar el tiempo de elución, se prefiere no añadir agua intencionadamente a los alcoholes de cadena corta.
COMPOSICIÓN DE ALIMENTACIÓN DE DESTILACIÓN
La presente invención también proporciona una composición de alimentación de destilación para obtener la composición de la presente invención descrita anteriormente y el uso de tal composición de alimentación de destilación como alimentación de destilación en un método para producir la composición de la presente invención descrita anteriormente. La composición de alimentación de destilación contiene un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado y tiene un contenido reducido de monoacilglicerol o una concentración reducida de hierro. El éster alquílico de ácido graso altamente insaturado comprende un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer. Al destilar la composición de alimentación de destilación para obtener un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado en una fracción destilada, es posible enriquecer el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado mientras se reduce el contenido de un éster de ácido graso de 3-MCPD.
Para producir la composición de alimentación de destilación de la presente invención, los aceites que se han enumerado como materias primas para la composición de la presente invención pueden esterificarse con éster alquílico mientras se reduce el contenido de monoacilglicerol o se reduce la concentración de hierro. En una realización, la composición de alimentación de destilación de la presente invención se produce o se puede obtener a partir de una materia prima tal como aceite de pescado, un aceite de microorganismos, un aceite vegetal o un aceite de animal marino, tal como mediante el método para producir la composición descrita anteriormente de la presente invención. En una realización preferida, la materia prima para la composición de alimentación de destilación de la presente invención es un aceite de pescado. La esterificación alquílica y la reducción del contenido de monoacilglicerol o de la concentración de hierro pueden llevarse a cabo mediante los métodos descritos anteriormente en relación con el método de la presente invención. En una realización preferida, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado contenido en la composición de alimentación de destilación de la presente invención puede ser un éster etílico de ácido graso altamente insaturado. A este respecto, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer puede ser un éster alquílico de ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico o ácido araquidónico, o combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer puede ser un éster alquílico de ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico, o una combinación de los mismos. En una realización más preferida, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer puede ser un éster alquílico de ácido eicosapentaenoico.
La composición de alimentación de destilación de la presente invención es una composición que contiene un éster alquílico de ácido graso como componente principal y contiene 95 % en peso o más, 96 % en peso o más, 97 % en peso o más, 98 % en peso o más, 99 % en peso o más o 99,5 % en peso o más, del éster alquílico de ácido graso. La proporción de ácidos grasos altamente insaturados en relación con todos los ácidos grasos en la composición de alimentación de destilación de la presente invención es del 5 % del área o más, por ejemplo, 10 % del área o más, 15 % del área o más o 20 % del área o más. Por otro lado, la proporción de ácidos grasos altamente insaturados en relación con todos los ácidos grasos en la composición de alimentación de destilación de la presente invención es de menos del 70 % del área o más, por ejemplo, menos del 65 % del área o más, 60 % del área o más o 55 % del área o más.
La composición de alimentación de destilación de la presente invención puede contener un ácido graso saturado con un número de carbonos de no más de 18 o un éster alquílico del mismo como impureza. En este caso, la proporción del ácido graso saturado con un número de carbonos no superior a 18 en los ácidos grasos constituyentes de la composición de alimentación de destilación de la presente invención puede ser del 0,1 % del área o más, por ejemplo, 0,2 % del área o más, 0,3 % del área o más, 0,4 % del área o más o 0,5 % del área o más, y menos del 50 % del área, por ejemplo, menos del 40 % del área o menos del 30 % del área.
En realizaciones preferidas, con respecto a monoacilgliceroles que comprenden como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer, la concentración de tal monoacilglicerol en la composición de alimentación de destilación de la presente invención es de menos de 10.000 ppm, menos de 9.000 ppm, menos de 8.000 ppm, menos de 7.000 ppm, menos de 6.000 ppm, menos de 5.000 ppm, menos de 4.000 ppm, menos de 3.000 ppm, menos de 2.000 ppm, menos de 1.000 ppm, menos de 900 ppm, menos de 800 ppm, menos de 700 ppm, menos de 600 ppm o menos de 500 ppm. En algunas realizaciones, la concentración de tal monoacilglicerol es superior a cero ppm.
La clase de monoacilgliceroles a los que se aplican los límites superiores descritos anteriormente pueden ser los que comprenden como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene de 5 a 10, de 5 a 9, de 5 a 8, de 5 a 7, de 5 a 6 o 6 átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer.
En realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es el éster alquílico de ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3), éster alquílico de ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6) o éster alquílico de ácido araquidónico (20:4 n-6), o combinaciones de los mismos, y el monoacilglicerol puede ser monomiristato de glicerol.
En realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es éster alquílico de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3) y el monoacilglicerol que se pretende eliminar puede ser monopalmitato de glicerol.
En realizaciones preferidas, el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es una combinación de éster alquílico de ácido docosahexaenoico (22:6 n-3) con al menos un miembro seleccionado entre éster alquílico de ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3), éster alquílico de ácido dihomo-Y-linolénico (20:3 n-6) y éster alquílico de ácido araquidónico (20:4 n-6), y el monoacilglicerol que puede consistir en monomiristato de glicerol y monopalmitato de glicerol.
En realizaciones preferidas, la concentración de hierro en la composición de alimentación de destilación de la presente invención es de menos de 0,20 ppm, menos de 0,10 ppm, menos de 0,09 ppm, menos de 0,08 ppm, menos de 0,07 ppm, menos de 0,06 ppm o menos de 0,05 ppm. En tales realizaciones, la concentración de hierro es superior a cero ppm.
En realizaciones preferidas, la concentración de cloro en la composición de alimentación de destilación de la presente invención es de menos de 10 ppm, por ejemplo, menos de 9 ppm, menos de 8 ppm o menos de 7 ppm. En algunas realizaciones, la concentración de cloro es superior a cero ppm.
MODO DE UTILIZACIÓN
El modo en que se utiliza la composición de la presente invención no está particularmente limitado, pero es preferentemente en forma de dosificación oral, normalmente, en forma de preparaciones orales tales como gránulos, comprimidos, cápsulas y líquidos. Los usos de la composición de la presente invención incluyen, por ejemplo, alimentos o bebidas (por ejemplo, alimentos naturales, productos nutracéuticos, alimentos para usos sanitarios específicos, complementos, productos lácteos, refrescos, alimentos o bebidas para animales de compañía y piensos para el ganado), productos farmacéuticos y productos parafarmacéuticos; se prefieren en particular complementos y productos farmacéuticos. Aparte de los ingredientes o productos alimentarios, la composición de la presente invención se puede utilizar como componentes para añadir a los alimentos para animales. Por lo tanto, la composición de la presente invención se puede utilizar como ingredientes o componentes eficaces para los alimentos o bebidas, productos farmacéuticos y productos parafarmacéuticos mencionados anteriormente, de modo que puedan utilizarse preferentemente en la elaboración de dichos alimentos o bebidas, productos farmacéuticos y productos parafarmacéuticos.
En lo sucesivo, en el presente documento, se describen ejemplos de la presente invención pero debe entenderse que no se pretende de ninguna manera que limiten el alcance de la presente invención.
En los siguientes ejemplos, la designación de "%" significa % en peso salvo que se indique lo contrario; "ppm" significa ppm en peso (es decir, mg/kg) salvo que se indique lo contrario.
En los ejemplos, la concentración de 3-MCPD significa un valor de medición por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society (AOCS). Además, Una concentración de 3-MCPD de 0,00 ppm significa que dicho método de ensayo no detectó 3-MCPD (es decir, fue inferior al valor del límite de detección).
En los ejemplos, una concentración de hierro de 0,00 ppm significa que el ICP-MS descrito anteriormente no detectó hierro en la medición (es decir, fue inferior al valor del límite de detección).
Prueba 1 - Efectos del contenido de hierro en la formación de 3-MCPD
Se desacidificó aceite de sardina como alimento mediante destilación de recorrido corto y el aceite resultante se esterificó con éster etílico en presencia de un catalizador alcalino, seguido de refinado en gel de sílice y recogida de una fracción de éster etílico. Para el refinado en gel de sílice, se usó una columna de vidrio abierta rellena con gel de microesferas D-75-60A (AGC Si-Tech Co., Ltd.) en 5 volúmenes de la muestra, usándose hexano/acetato de etilo (50:1) como eluyente.
La fracción de éster etílico (éster etílico (EE) de aceite de pescado) se sometió a cromatografía en capa fina (TLC) que confirmó que no se detectaron bandas de DAG ni MAG. También se realizó la medición de la concentración de hierro, pero no se detectó hierro en la fracción de éster etílico.
Al EE de aceite de pescado, se añadió monomiristato de glicerol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; código de producto 321-32412) en una cantidad de 1000 ppm. Lo que es más, se añadió una solución acuosa de sulfato de hierro (II) heptahidratado para proporcionar un contenido de hierro de 0,10 ppm (ejemplo 2) o 1,00 ppm (ejemplo comparativo 1); como alternativa, no se añadió en absoluto (ejemplo 1). Posteriormente, se añadió etanol para preparar una solución uniforme. Mediante evaporación posterior y extracción al vacío, el disolvente se eliminó por completo. Cada sección de prueba se agitó en una corriente de nitrógeno con calentamiento a 210 °C en un baño de aceite mientras se muestreaba a lo largo del tiempo para medir la concentración de 3-MCPD. Los cambios en la concentración de 3-MCPD de cada sección de prueba durante el calentamiento se muestran en la tabla 1.
Tabla 1
Contenido de hierro
Tiempo de calentamiento Ejemplo 10,00 PPM Ejemplo 20,10 PPM Ejemplo Comparativo 11,00 PPM 0 h 0,00 PPM 0,00 PPM 0,00 PPM 1 h 0,01 PPM 0,04 PPM 0,21 PPM 2 h 0,05 PPM 0,06 PPM 0,63 PPM 4 h 0,08 PPM 0,15 PPM 0,61 PPM
En el ejemplo comparativo 1, donde se añadieron 1,00 ppm de hierro, se formaron 0,61 ppm de 3-MCPD después de calentar durante 4 horas. Por el contrario, los ejemplos 1 y 2, donde la concentración de hierro se ajustó a 0,00 ppm y 0,10 ppm, respectivamente, tenían contenidos de 3-MCPD de 0,08 ppm y 0,15 ppm incluso después de calentar durante 4 horas; esos valores fueron considerablemente inferiores a los 0,61 ppm del ejemplo comparativo 1.
Prueba 2 - Efectos del contenido de MAG en la formación de 3-MCPD
Se preparó EE de aceite de pescado (con concentración de hierro ajustada a 10 ppm) como en la prueba 1 y se calentó en una corriente de nitrógeno a 120 °C durante una hora, bien solo o bien con monomiristato de glicerol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; código de producto 321-32412) que se añade en concentraciones de 1 a 10 %.
Las concentraciones de 3-MCPD después del calentamiento se muestran en la tabla 2. Incluso a la temperatura relativamente baja de 120 °C que se suele adoptar para separar por destilación los ésteres etílicos de ácidos grasos mediante destilación molecular, se descubrió que la concentración de 3-MCPD aumentaba al aumentar la concentración de MAG.
Tabla 2
Tabla 2
Cantidad de MAG añadida 3-MCPD
Sin adición 0,00 PPM
1 % 0,10 PPM
2 % 0,18 PPM
3 % 0,23 PPM
5 % 0,36 PPM
10 % 0,67 PPM
Prueba 3 - Efectos del contenido de MAG en la formación de 3-MCPD en el producto de destilación de éster etílico de aceite de pescado
Se esterificó con éster etílico un aceite de pescado que contenía 20 % del área de EPA en presencia de un catalizador alcalino de la manera habitual para preparar el éster etílico de aceite de pescado 1. El éster etílico de aceite de pescado 1 tenía los siguientes datos característicos: la proporción de EPA en la composición de los ácidos grasos fue del 20 % del área; DAG y MAG, cada uno de los cuales comprendía C14:0 como ácido graso constituyente, estaban contenidos en las concentraciones mostradas en la tabla 3; la concentración de hierro fue de 0,2 ppm; y la concentración de cloro fue de 17 ppm.
Tabla 3
Tabla 3 Contenido de DAG y MAG [mg/kg] en éster etílico de aceite de pescado 1
Especies de AG Fracción de DAG Fracción de MAG
C12:0 0 8
C14:0 201 501
C15:0 26 30
C16:0 575 1127
C16:1n-7 215 541
C16:2(9,12) 0 95
C16:3(5.9,12 29 13
C16:4n-1 77 232
C18:0 137 232
C18:1n-9 282 534
(continuación)
C18:1n-7 94 216
C18:2n-6 0 62
C18:4n-3 53 161
C20:4n6 0 73
C20:5n-3 502 1447
C22:5n-3 0 161
C22:6n-3 288 535
Otros 112 216
Total 2591 6284
Después, se prepararon éster etílico de aceite de pescado 2 como se obtiene al eliminar MAG y DAG del éster etílico de aceite de pescado 1, éster etílico de aceite de pescado 3 que tiene monomiristato de glicerol añadido al éster etílico de aceite de pescado 2 y éster etílico de aceite de pescado 4 que tiene monopalmitato de glicerol añadido al éster etílico de aceite de pescado 2.
El éster etílico de aceite de pescado 2 se preparó mediante el siguiente método.
Se mezclaron seiscientos gramos de éster etílico de aceite de pescado 1 con 2400 ml de hexano y la mezcla líquida resultante se hizo pasar a través de una columna rellena con una suspensión de gel de sílice (1200 g; Microesfera D75-60A) en hexano de modo que el éster etílico de aceite de pescado se adsorbiera en el gel de sílice. Posteriormente, se hizo pasar acetato de etilo/hexano (1:50) a través de la columna y se fraccionó el eluato, seguido de la recuperación de una fracción que consiste en el éster etílico de aceite de pescado del que se habían eliminado el MAG y el DAG. De la fracción recuperada, se eliminó el disolvente por medio de un evaporador y extracción al vacío, tras lo cual se obtuvo un éster etílico de aceite de pescado sin MAG/DAG en una cantidad de 585 g. El éster etílico de aceite de pescado 2 obtenido de este modo estaba completamente exento de MAG y DAG y tenía concentraciones de hierro y cloro de 0,05 ppm y 7 ppm, respectivamente.
Se mezclaron cien gramos de éster etílico de aceite de pescado 2 con 0,1 g de monomiristato de glicerol y la mezcla se uniformizó mediante disolución completa para preparar éster etílico de aceite de pescado 3. Por otro lado, se mezclaron 100 g de éster etílico de aceite de pescado 2 con 0,1 g de monopalmitato de glicerol (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.; código de producto: G0083) y la mezcla se uniformizó mediante disolución completa para preparar el éster etílico de aceite de pescado 4.
Se usó éster etílico de aceite de pescado 3 o 4 como muestra (composición de alimentación para destilación) y se sometió a un proceso de destilación de precisión que consiste en las siguientes primera y segunda etapas de destilación de precisión.
La primera etapa de destilación de precisión es una que se pretende eliminar fracciones de ésteres etílicos de hasta C18. Un tubo de fraccionamiento con camisa de vacío (925 mm; Kiriyama Glass) se hizo funcionar con 5 unidades de empaquetado de laboratorio EX de Sulzer (25 mm x 50 mm; Sulzer Chemtech Ltd.) como empaquetado interno. Se realizó destilación de precisión durante un periodo de calentamiento de 4,0 horas, estableciéndose la temperatura del líquido en el fondo de la columna (temperatura inferior) en 185 °C o menos, estableciéndose la temperatura del vapor superior (temperatura superior) en 135 °C o menos y estableciéndose la presión corriente arriba de una bomba de vacío (presión superior o el grado de vacío) en 30 Pa o menos. En esta primera etapa de destilación de precisión, se eliminaron fracciones de ésteres etílicos de hasta C18 como el destilado inicial para obtener un residuo enriquecido con EPA que estaba exento del destilado inicial.
En la segunda etapa de destilación de precisión posterior, el residuo sin el destilado inicial obtenido en la primera etapa de destilación de precisión se sometió a la siguiente destilación de precisión. Un tubo de fraccionamiento con camisa de vacío (925 mm; Kiriyama Glass) se hizo funcionar con 5 unidades de empaquetado de laboratorio EX de Sulzer (25 mm x 50 mm; Sulzer Chemtech Ltd.) como empaquetado interno. Se realizó destilación de precisión durante un periodo de calentamiento de 3,5 horas, estableciéndose la temperatura del líquido en el fondo de la columna (temperatura inferior) en 195 °C, estableciéndose la temperatura del vapor superior (temperatura superior) en 150 °C y estableciéndose la presión corriente arriba de una bomba de vacío (presión superior o el grado de vacío) en 30 Pa. En esta segunda etapa de destilación de precisión, se eliminaron fracciones de C22 y ésteres etílicos superiores como residuo (residuo de destilación) para obtener un destilado principal.
Ochenta gramos de éster etílico de aceite de pescado 3 como alimentación se habían enriquecido con EPA en la primera etapa de destilación de precisión para proporcionar 26 g de un residuo sin destilado inicial. A continuación, se introdujeron veinticinco gramos del residuo obtenido sin destilado inicial a la segunda etapa de destilación de precisión donde se enriqueció EPA adicionalmente para proporcionar 11 g de un destilado principal. El destilado principal estaba enriquecido con EPA y, como muestra la tabla 4, la proporción de EPA en la composición de ácidos grasos aumentó del 20,9% al 73,1 %. Por otro lado, se descubrió que se habían formado isómeros debido al calentamiento en el proceso de destilación y se descubrió que la fracción principal del destilado contenía isómeros en trans de éster etílico de EPA en una cantidad de 0,8 % del área (la suma de cinco isómeros en trans; no indicado en la tabla 4; igual en lo sucesivo en el presente documento).
Lo que es más, la concentración de 3-MCPD fue de 0,00 ppm en el éster etílico de aceite de pescado 3 como alimentación y aumentó después de la destilación a 0,01 ppm en el destilado principal.
Una porción (77,8 g) de éster etílico de aceite de pescado 4 como alimentación se habían enriquecido con EPA en la primera etapa de destilación de precisión para proporcionar 29,5 g de un residuo sin destilado inicial. A continuación, se introdujo una porción (26,4 g) del residuo obtenido sin destilado inicial a la segunda etapa de destilación de precisión donde se enriqueció EPA adicionalmente para proporcionar 12,6 g de un destilado principal. El destilado principal estaba enriquecido con EPA y, como muestra la tabla 4, la proporción de EPA en la composición de ácidos grasos aumentó del 20,9% al 77,4%. Por otro lado, se descubrió que se habían formado isómeros debido al calentamiento en el proceso de destilación y se descubrió que la fracción principal del destilado contenía isómeros en trans de éster etílico de EPA en una cantidad de 1,6 % del área.
Lo que es más, la concentración de 3-MCPD en el destilado principal fue de 0,00 ppm, lo que indica que no aumenta el valor del éster etílico de aceite de pescado 4 como alimentación.
Tabla 4
Nombre de la muestra Éster etílico de aceite de pescado 3 Éster etílico de aceite de pescado 4
Alimentación Fracción de
destilado principal Alimentación Fracción de destilado principal Rendimiento 15,3 % 18,1 % Porcentaje de recuperación
de EPA 53,6 % 67,1 %
C14:0 7,5 0,0 7,5 0,0
C15:0 0,4
Figure imgf000022_0001
0,0 0,4
Figure imgf000022_0002
0,0
C16:0 16,5 0,1 16,5 0,0
C17:0 0,4 0,0 0,4 0,0
C18:0 3,3 2,6 3,3 0,3
C20:0 0,2 0,4 0,2 0,7
C20:3 n-6 0,2 0,5 0,2 0,7 C20:5 n-3 20,9 73,1 20,9 77,4 C22:5 n-3 2,3 0,2 2,3 0,3 C22:6 n-3 7,3 1,1 7,3 1,9 Otros ácidos grasos 41,1 21,9 41,1 18,8
3-MCPD [PPM] 0,00 0,01 0,00 0,00
También se investigó la distribución de 3-MCPD en cada una de las fracciones de ésteres etílicos de aceite de pescado 3 y 4. El equilibrio material para el 3-MCPD contenido en cada destilado principal y el residuo sin destilado principal se muestra en la tabla 5.
__________________________ _ ___________ Tabla 5____________ ___________________________ Ester etílico de aceite de pescado 3 Ester etílico de aceite de pescado 4
_____________________________EPA_________ 3-MCPD_________ EPA_________ 3-MCPD
Destilado principal 75,3 28,0 80,3 0,0
Residuo sin destilado principal 24,7___________ 72,0___________ 19,7___________100,0______
Se reveló que la concentración de 3-MCPD en el destilado principal se vería muy afectada por un MAG particular en la alimentación. Considerando el destilado principal que comprendía específicamente una fracción de EPA, o un componente de ácido graso C20; en éster etílico de aceite de pescado 3 donde se añadió un MAG que contenía C14:0 o un ácido graso C14, como ácido graso constituyente, el destilado principal contenía el 28,0 % del 3-MCPD total, pero en el éster etílico de aceite de pescado 4 donde se añadió un MAG que contenía C16:0 o un ácido graso C16, como ácido graso constituyente, todo el 3-MCPD estaba contenido en el residuo sin destilado principal. Esto mostró lo siguiente: en el caso de que los ésteres etílicos de ácidos grasos C20, incluido el éster etílico de EPA, deban recuperarse como destilado principal, los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD formados a partir de MAG que contienen ácidos grasos C14 como ácidos grasos constituyentes se incluirán en el destilado principal, mientras que los ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD formados a partir de MAG que contienen ácidos grasos C16 como ácidos grasos constituyentes difícilmente se incluirán en el destilado principal. Por tanto, se puede concluir que, cuando los ácidos grasos altamente insaturados para refinar son AGPI C20 tales como EPA, la concentración de 3-MCPD en el producto de destilación se ve muy afectada por el ácido graso saturado C14.
Cabe señalar aquí que, en cada una de las pruebas realizadas, el destilado inicial estaba completamente exento de 3-MCPD o sus ésteres de ácidos grasos.
Los inventores descubrieron que, al usar los métodos y materiales divulgados en el presente documento, las composiciones que comprenden altas concentraciones de ésteres alquílicos de AGPI y que contienen al mismo tiempo ésteres de ácidos grasos de 3-MCPD en bajas concentraciones se pueden producir de manera uniforme. Observaciones
Con respecto a los intervalos numéricos divulgados en la presente descripción, por supuesto, se entenderá que, de manera normal, el criterio técnico para el límite superior es diferente del criterio técnico para el límite inferior, es decir, los límites superior e inferior son propuestas intrínsecamente distintas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una composición que contiene un ácido graso altamente insaturado o éster alquílico del mismo, que comprende:
(1) esterificación alquílica de una materia prima que contiene un triglicérido que comprende un ácido graso altamente insaturado como ácido graso constituyente, para preparar una composición que contenga un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado;
(2) al menos uno seleccionado entre:
(a) reducir a menos de 10.000 ppm la concentración en la composición preparada en la etapa (1) de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer,
(b) reducir la concentración de hierro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 0,20 ppm y (c) reducir la concentración de cloro en la composición preparada en la etapa (1) a menos de 10 ppm; y (3) destilar la composición resultante de la etapa (2) y recoger la fracción destilada principal.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde la concentración de 3-MCPD hallada al analizar la fracción destilada principal de la etapa (3) por el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society es de menos de 1,80 ppm.
3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en donde la etapa (2)(a) se realiza mediante cromatografía en gel de sílice.
4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la destilación de la etapa (3) es rectificación.
5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 6 átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer se reduce a menos de 10.000 ppm en la etapa (2).
6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido graso altamente insaturado es ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico, ácido araquidónico o una combinación de los mismos.
7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la materia prima es un aceite de pescado, un aceite de microorganismos, un aceite vegetal o un aceite de animal marino.
8. Una composición, que se puede obtener mediante un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene ácidos grasos libres o ésteres alquílicos de ácidos grasos como componente principal, conteniendo los ácidos grasos libres o ésteres alquílicos de ácidos grasos ácido graso altamente insaturado o éster alquílico del mismo, en donde
la proporción del ácido graso altamente insaturado en los ácidos grasos constituyentes de la composición es del 50 % del área o más, donde el % del área es la proporción de un área de pico para el ácido graso altamente insaturado en relación con el total de áreas de pico para todos los ácidos grasos en la composición, determinada utilizando un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama de hidrógeno (GC-FID), la concentración de 3-cloropropano-1,2-diol (3-MCPD) hallada al analizar la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society es mayor de cero ppm e inferior a 1,80 ppm, y la concentración de isómeros en trans del ácido graso altamente insaturado es del 0,01 % del área o más, según lo determinado por análisis de cromatografía de gases, donde el % del área se refiere a la proporción del área del pico para los isómeros en trans del ácido graso altamente insaturado en relación con el área del pico de todos los ácidos grasos en la composición.
9. Una composición según la reivindicación 8, en donde la proporción del ácido graso altamente insaturado en los ácidos grasos constituyentes de la composición es del 70 % del área o más.
10. Una composición según la reivindicación 8 o 9, en donde la concentración de 3-MCPD es menor que el límite de detección para el análisis de la composición mediante el método oficial Cd 29b-13 ensayo A de la American Oil Chemists' Society.
11. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el ácido graso altamente insaturado es ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico, ácido araquidónico o una combinación de los mismos.
12. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que dicha concentración de isómeros en trans del ácido graso altamente insaturado es del 0,02 % del área o más.
13. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde una materia prima de la composición es un aceite de pescado, aceite de microorganismos, aceite vegetal o aceite de animales marinos.
14. Una composición de alimentación de destilación que contiene ésteres alquílicos de ácidos grasos, incluyendo los ésteres alquílicos de ácidos grasos éster alquílico de ácido graso altamente insaturado y comprendiendo el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado un éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer por destilación, y
en donde la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 5 o más átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es superior a cero ppm e inferior a 10.000 ppm y/o la concentración de hierro es superior a cero ppm e inferior a 0,20 ppm.
15. Una composición de alimentación de destilación según la reivindicación 14, en donde la concentración de monoacilglicerol que comprende como ácido graso constituyente un ácido graso que tiene 6 átomos de carbono menos que el ácido graso altamente insaturado que constituye el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es inferior a 10.000 ppm.
16. Una composición de alimentación de destilación según la reivindicación 14 o 15, en donde la concentración de cloro es inferior a 10 ppm.
17. Una composición de alimentación de destilación según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el éster alquílico de ácido graso altamente insaturado que se pretende enriquecer es un éster alquílico de ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido dihomo-Y-linolénico o ácido araquidónico, o una combinación de los mismos.
18. Una composición de alimentación de destilación según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde una materia prima de la composición es un aceite de pescado, aceite de microorganismos, aceite vegetal o aceite de animales marinos.
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