DE69826494T2

DE69826494T2 - Verfahren und Zusammensetzungen für die Synthese von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren

Info

Publication number: DE69826494T2
Application number: DE69826494T
Authority: DE
Inventors: Deborah Knutzon; Pradip Mukerji; Yung-Sheng Huang; Jennifer Thurmond; Sunita Chaudhary; Eun-Yeong Amanda LEONARD
Original assignee: Abbott Laboratories; Calgene LLC
Current assignee: Abbott Laboratories; Monsanto Co
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2018-04-11
Also published as: WO1998046765A1; US6589767B1; PT1007691E; JP2001523092A; AU7114898A; HUP0001295A3; DE69826494D1; BR9809083A; IL132149A0; PL336067A1; IN1998KO00639A; MX9909327A; AU720725B2; EP1007691B1; SK139799A3; TR199902466T2; KR20010006258A; ATE277188T1; HUP0001295A1; NO994924D0

Description

VERWANDTE ANMELDUNG
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung der Seriennummer 08/833.610, eingereicht am 11. April 1997.
EINFÜHRUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Modulationskonzentrationen von Enzymen und/oder Enzymkomponenten im Zusammenhang mit der Produktion langkettiger, mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA = poly-unsaturated fatty acids) in einem Mikroorganismus oder einem Tier.
Hintergrund
Die zwei Hauptfamilien mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) sind die ω3-Fettsäuren, beispielsweise Eicosapentaenylsäure (EPA), und die ω6-Fettsäuren, beispielsweise Arachidonsäure (ARA). PUFA sind wichtige Komponenten der Plasmamembran der Zelle, wo sie in solchen Formen wie Phospholipiden vorgefunden werden können. PUFA sind für eine korrekte Entwicklung, insbesondere die Entwicklung des Gehirns im Kindesalter, und für die Gewebsbildung und -erneuerung notwendig. PUFA dienen auch als Vorläufer für andere Moleküle, die für Menschen und Tiere wichtig sind, umfassend die Prostacycline, Eicosanoide, Leukotriene und Prostaglandine.
Vier zentrale langkettige PUFA, die bedeutend sind, umfassen Docosahexaenylsäure (DHA) und EPA, die hauptsächlich in unterschiedlichen Arten von Fischölen vorkommen, Gamma-Linolensäure (GLA), die in den Samen zahlreicher Pflanzen vorkommt, umfassend Nachtkerze (Oenothera biennis), Borretsch (Borago officinalis) und schwarze Ribisel (Johannisbeere) (Ribes nigrum), und Stearidonsäure (SDA), die in Meeresölen und Pflanzensamen vorkommt. Sowohl GLA als auch eine andere wichtige langkettige PUFA, Arachidonsäure (ARA) kommen in Fadenpilzen vor. ARA kann aus Tiergeweben, umfassend Leber und Nebenniere, extrahiert werden. GLA, ARA, EPA und SDA sind selbst wichtige langkettige Fettsäuren oder Nahrungsvorläufer für solche Fettsäuren, die in Prostaglandinsynthese, in der Behandlung von Herzerkrankungen und in der Entwicklung von Hirngewebe eingebunden sind.
Mehrfach ungesättigte Fettsäuren haben zahlreiche pharmazeutische und medizinische Anwendungsmöglichkeiten, umfassend die Behandlung von Herzerkrankungen, Krebs und Arthritis.
Es gibt zahlreiche Quellen für die kommerzielle Produktion von DHA, umfassend eine Vielzahl von Meeresorganismen, Öle, die von Meeresfischen aus kalten Gewässern gewonnen werden, und Eidotterfraktionen. Für ARA können Mikroorganismen, umfassend die Genera Mortierella, Entomophthora, Phytium und Porphyridium, zur kommerziellen Produktion eingesetzt werden. Kommerziell nutzbare Quellen von SDA umfassen die Genera Trichodesma und Echium. Kommerziell nutzbare Quellen von GLA umfassen Nachtkerze, schwarze Johannisbeere und Borretsch. Dennoch gibt es mehrere Nachteile, die mit der kommerziellen Produktion von PUFA aus natürlichen Quellen einhergehen. Natürliche Quellen von PUFA wie Tiere oder Pflanzen weisen tendenziell stark heterogene Ölzusammensetzungen auf. Die aus diesen Quellen gewonnenen Öle können daher ausführliche Reinigungsverfahren erfordern, um eine oder mehrere erwünschte PUFA auszulösen oder um ein Öl herzustellen, das mit einer oder mehreren PUFA angereichert ist. Natürliche Quellen sind auch unkontrollierbaren Fluktuationen hinsichtlich der Verfügbarkeit ausgesetzt. Fischbestände können natürliche Variation erfahren oder können durch Überfischen erschöpft werden. Fischöle haben unangenehme Geschmäcke und Gerüche, bei denen es nicht möglich ist, sie wirtschaftlich vom erwünschten Produkt zu entfernen und die solche Produkte als Nahrungsmittelergänzungen unannehmbar machen können. Tierische Öle, und insbesondere Fischöle, können Umweltschadstoffe akkumulieren. Wetter und Krankheit können den Ertrag sowohl aus Fisch- als auch aus pflanzlichen Quellen beeinflussen. Verfügbares Anbaugebiet zur Produktion verschiedener Ölpflanzen wird durch die permanente Ausdehnung menschlicher Bevölkerung und den damit verbundenen wachsenden Bedarf an Nahrungsmittelprodukti on am verbleibenden Ackerland fortlaufend eingeschränkt. Pflanzen, die PUFA produzieren, wie Borretsch, wurden an das Handelswachstum nicht angepasst und bringen in Monokulturen keinen zufrieden stellenden Ertrag. Der Anbau solcher Pflanzen ist somit nicht wettbewerbsfähig, wenn profitablere und besser entwickelte Pflanzen angebaut werden können. Massenfermentation von Organsimen wie Mortierella ist auch teuer. Natürliche Tiergewebe enthalten geringe Mengen an ARA und sind schwierig zu verarbeiten. Mikroorganismen wie Porphyridium und Mortierella sind schwierig in kommerziellen Größenordnungen zu kultivieren.
Nahrungsmittelergänzungen und pharmazeutische Formulierungen, die PUFA enthalten, behalten möglicherweise die Nachteile der PUFA-Quellen bei. Ergänzungen wie Fischölkapseln enthalten möglicherweise geringe Konzentrationen der besonders erwünschten Komponente und erfordern so hohe Dosierungen. Hohe Dosierungen führen jedoch zur Aufnahme hoher Konzentrationen an unerwünschten Komponenten, umfassend Kontaminanten. Unangenehme Geschmäcke und Gerüche der Ergänzungen können solche Diäten unerwünscht machen und sind möglicherweise dem Patienten höchst unwillkommen. Auch muss beim Bereitstellen von Fettsäureergänzungen vorsichtig vorgegangen werden, da ein zu großer Zusatz zur Unterdrückung der endogenen biosynthetischen Wege führen und somit eine Konkurrenz mit anderen notwendigen Fettsäuren in verschiedenen Lipidfraktionen in vivo provozieren kann, was wiederum zu unerwünschten Ergebnissen führt. Inuits beispielsweise, die mit einer ω3-Fettsäure-reichen Ernährung leben, bluten leichter und schneller (US-Pat. Nr. 4.874.603).
Zahlreiche Enzyme sind in die PUFA-Biosynthese eingebunden. Linolensäure (LA, 18:2 Δ9, 12) wird aus Oleinsäure (18:1 Δ°) durch eine Δ12-Desaturase produziert. GLA (18:3 Δ6, 9, 12) wird aus Linolensäure (LA, 18:2 Δ9, 12) durch eine Δ6-Desaturase produziert. ARA- (20:4 Δ5, 8, 11, 14) Produktion aus Dihomo-gamma linolensäure (DGLA, 20:3 Δ8, 11, 14) wird durch eine Δ5-Desaturase katalysiert. Tiere können jedoch nicht über der Δ9-Position desaturieren und können daher Oleinsäure (18:1 Δ9) nicht zu Linolensäure (18:2 Δ9, 12) umsetzen. Dem ähnlich kann α-Linolensäure (ALA, 18:3, Δ9, 12, 15) von Säugetieren nicht synthetisiert werden. Andere Eukaryoten, umfassend Pilze und Pflanzen, haben Enzyme, die an den Positionen Δ12 und Δ15 desaturieren. Die wichtigsten mehrfach ungesättigten Fettsäuren von Tieren sind daher entweder von der Ernährung und/oder von Desaturierung und Elongation von Linolensäure (18:2 Δ9, 12) oder α-Linolensäure (18:3 Δ9, 12, 15), abgeleitet. Daher ist es von großem Interesse, genetisches Material zu erhalten, das in PUFA-Biosynthese von Spezies eingebunden ist, die diese Fettsäuren natürlich produzieren, und das isolierte Material in einem mikrobiellen oder tierischen System zu exprimieren, das so manipuliert werden kann, dass es die Produktion kommerzieller Mengen einer oder mehrerer PUFA bereitstellt. Es gibt also einen Bedarf an Fettsäure-Desaturasen, an Genen, die für diese kodieren, und an Rekombinationsverfahren, um diese zu produzieren. Weiters besteht Bedarf an Ölen, die höhere relative Anteile an spezifischen PUFA enthalten und/oder mit spezifischen PUFA angereichert sind. Auch besteht Bedarf an verlässlichen wirtschaftlichen Verfahren zur Produktion spezifischer PUFA.
Relevante Literatur
Die Produktion von Gamma-Linolensäure durch eine Δ6-Desaturase ist im US-Patent Nr. 5.552.306 beschrieben. Die Produktion von 8,11-Eicosadiensäure unter Einsatz von Mortierella alpina ist im US-Patent Nr. 5.376.541 offenbart. Die Produktion von Docosahexaensäure durch Dinoflagellata ist im US-Patent Nr. 5.407.957 beschrieben. Das Klonieren einer Δ6-Palmitoylacyl-Trägerprotein-Desaturase ist in der PCT-Veröffentlichung WO 96/13.591 und dem US-Patent Nr. 5.614.400 beschrieben. Das Klonieren einer Δ6-Desaturase von Borretsch ist in der PCT-Veröffentlichung WO 96/21.022 beschrieben. Das Klonieren von Δ9-Desaturasen ist in den veröffentlichten Patentanmeldungen PCT WO 91/13.972, EP 0.550.162 A1 , EP 0.561.569 A2 , EP 0.644.263 A2 und EP 0.736.598 A1 und im US-Patent Nr. 5.057.419 beschrieben. Das Klonieren von Δ12-Desaturasen von verschiedenen Organismen ist in der PCT-Veröffentlichung WO 94/11.516 und dem US-Patent Nr. 5.443.974 beschrieben. Das Klonieren von Δ15-Desaturasen von verschiedenen Organismen ist in der PCT-Veröffentlichung WO 93/11.245 beschrieben. Alle Veröffentlichungen und US-Patente oder -Anmeldungen, auf die hierin verwiesen wird, sind durch Verweis hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter, langkettiger Fettsäuren oder PUFA. Die Zusammensetzungen umfassen Nucleinsäuren, die für eine Δ5-Desaturase und/oder Polypeptide mit Δ5-Desaturase-Aktivität, die Polypeptide und Sonden zur Isolation und Detektion derselben kodieren. Die Verfahren umfassen das Züchten eines Wirtsmikroorganismus oder -tiers, der/das ein oder mehrere Transgene enthält und exprimiert, das/die für eine Δ5-Desaturase und/oder ein Polypeptid mit Δ5-Desaturase-Aktivität kodiert/kodieren. Expression des Desaturase-Polypeptids sorgt für ein relatives Ansteigen an Δ5-desaturierter PUFA oder metabolische Nachkommenschaft davon als Resultat veränderter Konzentrationen an Enzymen und Substraten, die in PUFA-Biosynthese eingebunden sind. Die Erfindung findet beispielsweise in der Massenproduktion von Öl-hältigen PUFA, die beispielsweise ARA, EPA und/oder DNA umfassen, Einsatz.
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes oder isoliertes Polypeptid mit Δ5-Desaturase-Aktivität bereit, wobei das Polypeptid zur Desaturierung eines Fettsäuremoleküls am 5. Kohlenstoff vom Carboxylende der Fettsäure in der Lage ist und das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest 60%, vorzugsweise zumindest 80%, und noch bevorzugter zumindest 90%, Homologie zur 446-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Die Erfindung stellt weiters ein gereinigtes oder isoliertes Polypeptid mit Δ5-Desaturase-Aktivität bereit, wobei das Polypeptid eine Deletionsmutante von Seq.-ID Nr. 2 ist und zur Desaturierung eines Fettsäuremoleküls am 5. Kohlenstoff des Carboxylendes der Fettsäure fähig ist.
Das Polypeptid der Erfindung kann ein Aminosäuremotiv umfassen, das aus der aus den Resten 30–38, 41–44, 171–175, 203–212 und 387–394 von Seq.-ID Nr. 2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Das Polypeptid der Erfindung kann die Reste 30–38, 41–44, 171–175, 203–212 und 387–394 von Seq.-ID Nr. 2 umfassen. Das Polypeptid der Erfindung kann Seq.-ID Nr. 2 umfassen.
Die Erfindung stellt weiters eine isolierte Nucleinsäure bereit, die für ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Die isolierte Nucleinsäure kann Seq.-ID Nr. 1 umfassen.
Die Nucleinsäure ist vorzugsweise von einer eukaryotischen Zelle, wie einer Pilzzelle, oder einer Pilzzelle des Genus Mortierella oder vom Genus/von der Spezies Mortierella alpina abgeleitet. Auch bevorzugt ist eine isolierte Nucleinsäure, die eine Sequenz umfasst, die an eine in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 1) abgebildete Nucleotidsequenz anelliert. Auch wird eine isolierte Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, die an eine in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 1) abgebildete Nucleotidsequenz hybridisiert.
Die Erfindung stellt weiters ein Nucleinsäurekonstrukt bereit, das eine Nucleinsäure der Erfindung umfasst, die operabel an einen Promotor gebunden ist. Die vorliegende Erfindung umfasst ein Nucleinsäurekonstrukt, umfassend eine in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 1) abgebildete Nucleotidsequenz, die an eine heterologe Nucleinsäure gebunden ist; ein Nucleinsäurekonstrukt, umfassend eine in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 1) abgebildete Nucleotidsequenz, die operabel an einen Promotor gebunden ist; und ein Nucleinsäurekonstrukt, umfassend eine in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 1) abgebildete Nucleotidsequenz, die operabel an einen Promotor gebunden ist, der in einer mikrobiellen Zelle funktionell ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mikrobielle Zelle eine Hefezelle, und die Nucleotidsequenz ist von einem Pilz, wie ei nem Pilz des Genus Mortierella, insbesondere einem Pilz der Spezies Mortierella alpina, abgeleitet.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Nucleinsäurekonstrukt bereitgestellt, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die einer in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 2) abgebildeten Aminosäuresequenz entspricht, worin die Nucleotidsequenz operabel an einen Promotor gebunden ist, der in einer Wirtszelle funktionell ist, und worin die Nucleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, das ein Fettsäuremolekül am 5. Kohlenstoff des Carboxylendes eines Fettsäuremoleküls desaturiert. Weiters wird von der Erfindung ein Nucleinsäurekonstrukt bereitgestellt, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine funktionell aktive Δ5-Desaturase kodiert, worin die Desaturase eine Aminosäuresequenz umfasst, die der gesamten Aminosäuresequenz oder einem Abschnitt der Aminosäuresequenz, die in den 3A–3D abgebildet ist, entspricht, worin die Nucleotidsequenz operabel an einen in einer Wirtszelle funktionellen Promotor gebunden ist.
Die Erfindung schließt auch eine Wirtszelle ein, die ein Nucleinkonstrukt der Erfindung umfasst. Die Erfindung stellt eine rekombinante Wirtszelle bereit, die mit einer Nucleinsäure der Erfindung oder mit einem Nucleinsäurekonstrukt der Erfindung transformiert ist. Die Wirtszelle kann eine mikrobielle Wirtszelle sein. Die Wirtszelle kann eine Hefezelle sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine rekombinante Wirtszelle bereitgestellt, die zumindest eine Kopie einer DNA-Sequenz umfasst, die für eine funktionell aktive Mortierella-alpina-Fettsäuredesaturase mit einer in den 3A–3D (Seq.-ID Nr. 2) abgebildeten Aminosäuresequenz kodiert, worin die Zelle oder ein Vorfahre der Zelle mit einem die genannte DNA-Sequenz umfassenden Vektor transformiert wurde und worin die DNA-Sequenz operabel an einen Promotor gebunden ist. Die Wirtszelle ist entweder eukaryotisch oder prokaryotisch. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind jene, die aus der aus einer Säugetierzelle, einer Insektenzelle, einer Pilzzelle und einer Algenzelle bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Bevorzugte Säugetierzellen umfassen eine Vogelzelle, eine Pilzzelle wie Hefe und eine Meeresalgenzelle. Bevorzugte prokaryotische Zellen umfassen jene, die aus der aus einer Bakterie, einer Cyanobakterie, Zellen, die einen Bakteriophagen enthalten, und/oder einem Virus bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Die DNA-Sequenz der rekombinanten Wirtszelle enthält vorzugsweise einen Promotor, der in der Wirtszelle funktionell ist.
Die Wirtszellen der Erfindung, die die DNA-Sequenzen der Erfindung enthalten, sind mit Fettsäuren wie 20:3-Fettsäuren angereichert. Die Erfindung stellt eine Wirtszelle bereit, die, im Vergleich zu einer nicht transformierten Zelle mit einem Nucleinsäurekonstrukt der Erfindung oder einer Nucleinsäure der Erfindung, mit 20:3-, 20:4- oder ω-3-20:4-Fettsäuren angereichert ist. Eine rekombinante Wirtszelle der Erfindung kann eine aus der aus einer Dihomo-gamma-linolensäure, n-6-Eicosatriensäure, 20:3n-6-Säure und 20:3-(8, 11, 14)-Säure bestehenden Gruppe ausgewählte Fettsäure enthalten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung der Fettsäure Arachidonsäure, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Züchten einer Wirtszelle der Erfindung in Gegenwart von Dihomo-γ-linolensäure unter Bedingungen, unter denen die Säure durch Expression eines Polypeptids der Erfindung in Arachidonsäure übergeführt wird; und Gewinnen der Fettsäure Arachidonsäure aus der Kultur.
Das Polypeptid der Erfindung ist ein Enzym, das ein Fettsäuremolekül am 5. Kohlenstoff des Carboxylendes des Fettsäuremoleküls desaturiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nucleinsäure von einem Mortierella sp. abgeleitet; und das Substrat für das Polypeptids wird exogen zugeführt. Die in den Verfahren eingesetzten mikrobiellen Zellen können entweder eukaryotische oder prokaryotische Zellen sein. Die bevorzugten eukaryotischen Zellen sind aus der aus einer Säugetierzelle, einer Insektenzelle, einer Pilzzelle und einer Algenzelle bestehenden Gruppe ausgewählt. Bevorzugte Säugetierzellen umfassen eine Vogelzelle, eine bevorzugte Pilzzelle ist eine Hefe, und eine bevorzugte Algenzelle ist eine Meeresalgenzelle. Die bevorzugten prokaryotischen Zellen umfassen jene, die aus der aus einer Bakterie, einer Cyanobakterie, Zellen, die einen Bakteriophagen enthalten, und/oder einem Virus bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Die Nucleinsäuresequenz, die für das Polypeptid der mikrobiellen Zelle kodiert, enthält vorzugsweise einen Promotor, der in der Wirtszelle funktionell ist, der gegebenenfalls ein beispielsweise durch Komponenten der Kulturlösung induzierbarer Promotor ist. Die in den Verfahren eingesetzten bevorzugten mikrobiellen Zellen sind Hefezellen wie Saccharomyces-Zellen.
Eine rekombinante Hefezelle der Erfindung kann mehr als etwa 5% von 20:3-Fettsäuresubstrat in ein 20:4-Fettsäureprodukt überführen.
Auch durch Verfahren dieser Erfindung erhältlich ist ein Öl, das eine oder mehrere PUFA umfasst. Die Menge dieser einen oder mehreren PUFA beläuft sich auf etwa 0,3–30% Arachidonsäure (ARA), etwa 0,2–30% Dihomo-gamma-linolensäure (DGLA) und etwa 0,2–30% Gamma-Linolensäure (GLA). Das Öl kann ein Verhältnis von ARA : DGLA : GLA aufweisen, das etwa 1,0 : 19,0 : 30 bis 6,0 : 1,0 : 0,2 entsprechen kann.
Verfahren der Erfindung können weiters das Formulieren der Fettsäure zu einem aus folgender Gruppe ausgewählten Produkt umfassen: eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger; eine Nahrungsmittelformulierung; eine Kindernahrung; eine Nahrungsmittelergänzung; einen Nahrungsmittelersatz; ein Kosmetikum; und ein Tierfutter. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Nahrungsmittelzusammensetzungen der Erfindung in einer flüssigen Form oder festen Form vor. Die Nahrungsmittelzusammensetzungen der Erfindung werden einem Säugetierwirt vorzugsweise parenteral oder innerlich verabreicht.
Die Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung können zur Desaturierung einer Fettsäure durch Kultivieren einer rekombinanten mikrobiellen Zelle der Erfindung unter Bedingungen eingesetzt werden, die zur Expression eines Polypeptids, das durch die Nucleinsäure kodiert wird, geeignet sind, worin die Wirtszelle weiters ein Fettsäuresubstrat des Polypeptids umfasst. Eine durch die Verfahren der Erfindung desaturierte Fettsäure kann zu einem Öl formuliert werden.
Gereinigte Nucleotid- und Peptidsequenzen, die mit Nucleinsäuren und Polypeptiden der Erfindung verwandt sind, sind in den Seq.-ID Nr. 1–34 dargestellt. Die in den Seq.-ID Nr. 1–34 dargestellten Sequenzen können als Sonden, um verwandte Sequenzen zu identifizieren, als Komponenten von Expressionssystemen und als Komponenten von Systemen, die zur Produktion transgener Öle nützlich sind, eingesetzt werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung sind weiters Verfahren, um veränderte langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäure-Biosysteme durch Züchten transgener Mikroben zu erhalten, die für transgene Expressionsprodukte kodieren, die ein Fettsäuremolekül am 5. Kohlenstoff des Carboxylendes des Fettsäuremoleküls desaturieren.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können Formulierungen, Nahrungsmittelergänzungen oder Nahrungsmittelergänzungen in Form einer Flüssigkeit oder eines Feststoffs, die/der die langkettige Fettsäure, wie in den Ansprüchen definiert, enthalten, bereitstellen. Diese Formulierungen und Ergänzungen können einem Menschen oder einem Tier verabreicht werden.
Die durch die Verfahren der Erfindung produzierten Formulierungen und Ergänzun gen können weiters zumindest einen aus der aus Kokosnussöl, Sojaöl, Canolaöl, Mono- und Diglyceriden, Glucose, essbarer Lactose, elektrodialysierter Molke, elektrodialysierter Magermilch, Molke, Sojaprotein und anderen Proteinhydrolysaten bestehenden Gruppe ausgewählten Makronährstoff umfassen.
Die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierten Formulierungen können weiters zumindest ein aus der aus Vitamin A, C, D, E und Vitamin-B-Komplexen bestehenden Gruppe ausgewähltes Vitamin; und zumindest ein aus der aus Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Natrium, Kalium, Phosphor, Kupfer, Chlorid, Iod, Selen und Eisen bestehenden Gruppe ausgewähltes Mineral einschließen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch den Einsatz der Wirtszelle der Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, bereit.
Die vorliegende Erfindung kann in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten zum Einsatz kommen, der durch unzureichende Aufnahme oder Produktion von mehrfach ungesättigten Fettsäuren erkrankt ist, umfassend das Verabreichen eines Nahrungsmittelersatzes der Erfindung an den Patienten in einer ausreichenden Menge, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um kosmetische und pharmazeutische Zusammensetzungen des Materials der Erfindung herzustellen.
Sequenzen, die ähnliche Regionen wie die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung aufweisen, sind in der folgenden Gruppe aufgezeigt: Seq.-ID Nr. 13; Seq.-ID Nr. 15; Seq.-ID Nr. 17; Seq.-ID Nr. 19; Seq.-ID Nr. 21; Seq.-ID Nr. 22; Seq.-ID Nr. 23; Seq.-ID Nr. 24; Seq.-ID Nr. 25, Seq.-ID Nr. 26 und Seq.-ID Nr. 27.
Sequenzen mit ähnlichen Regionen wie Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden Gruppe aufgezeigt: Seq.-ID Nr. 14; Seq.-ID Nr. 16; Seq.-ID Nr. 18; Seq.-ID Nr. 20; Seq.-ID Nr. 28; Seq.-ID Nr. 29; Seq.-ID Nr. 30; Seq.-ID Nr. 31; Seq.-ID Nr. 32, Seq.-ID Nr. 33 und Seq.-ID Nr. 34.
Verfahren der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um transgene Öle in pharmazeutisch annehmbaren Trägern und transgene Öle enthaltende Nahrungsmittelergänzungen, Kosmetika und Kindernahrung herzustellen.
Die vorliegende Erfindung kann in einem Verfahren eingesetzt werden, um veränderte Biosynthese von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu erhalten, das die folgenden Schritte umfasst: Züchten einer Mikrobe, die Zellen aufweisen, die ein Transgen enthalten, das für ein Polypeptid der Erfindung kodiert, worin das Transgen operabel an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, unter Bedingungen, unter denen das Transgen exprimiert wird, wodurch die Biosynthese von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure in den Zellen verändert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, die aus der aus ARA, DGLA und EPA bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können pharmazeutische Zusammensetzungen herstellen, die zumindest einen aus der aus einem Vitamin, einem Mineral, einem Kohlenhydrat, einem Zucker, einer Aminosäure, einer freien Fettsäure, einem Phospholipid, einem Antioxidans und einer Phenolverbindung bestehenden Gruppe ausgewählten Nährstoff umfasst.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt mögliche Wege für die Synthese von Arachidonsäure (20:4 Δ5, 8, 11, 14) und Stearidonsäure (18:4 Δ6, 9, 12, 15) aus Palmitinsäure (C₁₆) von einer Vielzahl von Organismen, umfassend Algen, Mortierella und Menschen. Diese PUFA können als Vorläufer für andere Moleküle dienen, die für Menschen und andere Tiere wichtig sind, umfassend Prostacycline, Leukotriene und Prostaglandine, von denen manche gezeigt werden.
2 zeigt mögliche Wege zur Produktion von PUFA zusätzlich zu ARA, umfassend EPA und DHA, für eine Vielzahl an Organismen.
Die 3A–3D zeigen die DNA-Sequenz der Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase und die abgeleitete Aminosäuresequenz.
4 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des PCR-Fragments (siehe Beispiel 1).
Die 5A und 5B zeigen Angleichungen der Proteinsequenz der Δ5-Desaturase mit Δ6-Desaturasen.
Die 6A und 6B zeigen die Wirkung des Zeitpunktes der Substratzusetzung in Bezug auf die Einleitung der Überführung des Substrats zum Produkt in SC334, das das Δ5-Desaturase-Gen enthält.
Die 7A und 7B zeigen die Wirkung der Induktorkonzentration auf Δ5-Desaturase-Expression in SC334.
Die 8A und 8B zeigen die Wirkung der Induktortemperatur auf Δ5-Desaturase-Aktivität in SC334.
Die 9A und 9B zeigen die Wirkung des Wirtsstammes auf die Überführung des Substrats zum Produkt in Stämmen, die das Δ5-Desaturase-Gen bei 15°C exprimieren.
Die 10A und 10B zeigen die Wirkung des Wirtsstammes auf die Überführung des Substrats zum Produkt in Stämmen, die das Δ5-Desaturase-Gen bei 30°C exprimieren.
11 zeigt die Wirkung eines Wirtsstammes, der Cholin-Transferase sowie das Δ5-Desaturase-Gen exprimiert, auf die Überführung des Substrats zum Produkt.
Die 12A und 12B zeigen die Wirkung der Medien-Zusammensetzung und Temperatur auf die Überführung des Substrats zum Produkt in zwei Wirtsstämmen, die das Δ5-Desaturase-Gen exprimieren.
13 zeigt die Angleichung der Proteinsequenz von Ma 29 mit Contig 253538a.
14 zeigt die Angleichung der Proteinsequenz von Ma 524 mit Contig 253538a.
Kurzbeschreibung des Sequenzprotokolls
Seq.-ID Nr. 1 zeigt eine DNA-Sequenz von Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase.
Seq.-ID Nr. 2 zeigt eine Aminosäuresequenz von Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase.
Seq.-ID Nr. 3 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des M.-alpina-PCR-Fragments (siehe Beispiel 1).
Seq.-ID Nr. 4 – Seq.-ID Nr. 7 zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen verschiedener Δ6-Desaturasen.
Seq.-ID Nr. 8 und Seq.-ID Nr. 9 zeigen PCR-Primer-Sequenzen für Δ6-Desaturasen.
Seq.-ID Nr. 10 zeigt einen Primer für reverse Transkription von Gesamt-RNA.
Seq.-ID Nr. 11 und Seq.-ID Nr. 12 zeigen Aminosäuremotive für Desaturasesequenzen.
Seq.-ID Nr. 13 und Seq.-ID Nr. 14 zeigen die Nucleotid- und Aminosäuresequenz einer Dictyostelium-discoideum-Desaturasesequenz.
Seq.-ID Nr. 15 und Seq.-ID Nr. 16 zeigen die Nucleotid- und Aminosäuresequenz einer Phaeodactylum-tricornutum-Desaturasesequenz.
Seq.-ID Nr. 17–20 zeigen die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz eines Schizochytrium-cDNA-Klons.
Seq.-ID Nr. 21–27 zeigen Nucleotidsequenzen für menschliche Desaturasen.
Seq.-ID Nr. 28 – Seq.-ID Nr. 34 zeigen Peptidsequenzen für menschliche Desaturasen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Um ein gutes und vollständiges Verständnis der Erfindung sicherzustellen, werden die folgenden Definition gegeben:
Δ5-Desaturase: Δ5-Desaturase ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen dem 5. und dem 6. Kohlenstoffatom des Carboxylendes eines Fettsäuremoleküls einführt.
Δ6-Desaturase: Δ6-Desaturase ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen dem 6. und dem 7. Kohlenstoffatom des Carboxylendes eines Fettsäuremoleküls einführt.
Δ9-Desaturase: Δ9-Desaturase ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen dem 9. und dem 10. Kohlenstoffatom des Carboxylendes eines Fettsäuremoleküls einführt.
Δ12-Desaturase: Δ12-Desaturase ist ein Enzym, das eine Doppelbindung zwischen dem 12. und dem 13. Kohlenstoffatom des Carboxylendes eines Fettsäuremoleküls einführt.
Fettsäuren: Fettsäuren sind eine Gruppe an Verbindungen, die eine lange Kohlenwasserstoffkette und eine endständige Carboxylatgruppe enthalten. Fettsäuren schließen folgende Verbindungen ein:
In Anbetracht dieser Definitionen zielt die Erfindung darauf ab, neue DNA-Sequenzen, DNA-Konstrukte, Verfahren und Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine Modifikation des mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuregehalts von beispielsweise mikrobiellen Zellen oder Tieren ermöglichen. Wirtszellen werden manipuliert, um ein Sense- oder Antisense-Transkript einer DNA zu exprimieren, die für (ein) Polypeptid(e) kodiert, das die Überführung von DGLA in ARA katalysiert. Das/Die Substrate) für das exprimierte Enzym kann/können durch die Wirtszelle produziert werden oder exogen zugeführt werden. Um Expression zu erlangen, wird die transformierte DNA operabel an Transkriptions- und Translationsinitiations- und -terminationsregulatorregionen gebunden, die in der Wirtszelle funktionell sind. Konstrukte, die das zu exprimierende Gen umfassen, können für Integration in das Genom der Wirtszelle sorgen oder können sich in der Wirtszelle autonom vervielfachen. Zur Produktion von ARA umfassen die im Allgemeinen eingesetzten Expressionskassetten eine Kassette, die für Δ5-Desaturase-Aktivität sorgt, insbesondere in einer Wirtszelle, die DGLA produziert oder aufnehmen kann. Die Produktion von ungesättigten Fettsäuren vom ω6-Typ, wie ARA, wird in einem Wirtsmikroorganismus oder –tier bevorzugt, der/das im Wesentlichen frei von ALA ist. Der Wirt wird durch Entfernen oder Hemmen der Aktivität einer Δ15- oder ω3-Typ-Desaturase ausgewählt oder erhalten (siehe 2). Die endogene Desaturase-Aktivität kann durch Bereitstellen einer Expressionskassette für ein Antisense-Δ15- oder -ω3-Transkript, durch Unterbrechen eines Ziel-Δ15- oder -ω3-Desaturasegens durch Insertion, Substitution und/oder Deletion des gesamten Zielgens oder eines Teils davon oder durch Zusetzen eines Δ15- oder ω3-Desaturase-Inhibitors beeinflusst werden. Die Produktion von LA kann auch durch Bereitstellen von Expressionskassetten für Δ9- und/oder Δ12-Desaturasen erhöht werden, wobei deren jeweilige enzymatische Aktivität einschränkend wirkt.
MIKROBIELLE PRODUKTION VON FETTSÄUREN
Mikrobielle Produktion von Fettsäuren hat mehrere Vorteile gegenüber der Reinigung aus natürlichen Quellen wie aus Fischen oder Pflanzen. Zahlreiche Mikroben sind im Vergleich zu jenen höher entwickelter Organismen mit sehr stark vereinfachten Ölzusammensetzungen bekannt, was das Reinigen der erwünschten Komponenten leichter macht. Mikrobielle Produktion ist keinen Fluktuationen durch äußere Variablen wie Wetter und Nahrungszufuhr ausgesetzt. Mikrobiell produziertes Öl ist im Wesentlichen frei von Kontamination durch Umweltschadstoffe. Darüber hinaus können Mikroben PUFA in bestimmten Formen bereitstellen, die spezifische Einsatzgebiete abdecken. Beispielsweise kann Spirulina PUFA erstrangig an der ersten und der dritten Position der Triglyceride bereitstellen; Verdauung durch Pankreaslipasen setzt vorzugsweise Fettsäuren aus diesen Positionen frei. Bei der menschlichen oder tierischen Verdauung von von Spirulina abgeleiteten Triglyceriden werden diese PUFA durch Pankreaslipasen als freie Fettsäuren freigesetzt und sind somit beispielsweise für die Entwicklung des Gehirns eines Kindes direkt verfügbar. Weiters kann mikrobielle Ölproduktion durch Einstellen der Kulturbedingungen manipuliert werden, insbesondere durch Bereitstellen bestimmter Substrate für mikrobiell exprimierte Enzyme oder durch Zusetzen von Verbindungen, die unerwünschte biochemische We ge unterdrücken. Zusätzlich zu diesen Vorteilen verleiht die Produktion von Fettsäuren aus rekombinanten Mikroben die Fähigkeit, das natürlich vorkommende mikrobielle Fettsäureprofil durch Bereitstellen neuer synthetischer Wege im Wirt oder durch Unterdrücken unerwünschter Wege zu verändern, wodurch die Konzentrationen an erwünschten PUFA oder konjugierten Formen davon erhöht und die Konzentrationen an unerwünschten PUFA reduziert werden.
PRODUKTION VON FETTSÄUREN IN TIEREN
Die Produktion von Fettsäuren in Tieren stellt auch mehrere Vorteile dar. Die Expression von Desaturasegenen in Tieren kann stark erhöhte Konzentrationen erwünschter PUFA in Tiergeweben produzieren, was die Gewinnung von PUFA aus solchen Geweben wirtschaftlicher gestaltet. Werden die erwünschten PUFA beispielsweise in der Muttermilch von Tieren exprimiert, sind Verfahren zum Isolieren von PUFA aus Tiermilch gut angebracht. Zusätzlich dazu, dass sie eine Quelle zum Reinigen der erwünschten PUFA darstellt, kann tierische Muttermilch durch Expres sion von Desaturasegenen, entweder alleine oder in Kombination mit anderen menschlichen Genen, manipuliert werden, um tierische Milcharten mit einer PUFA-Zusammensetzung bereitzustellen, die menschlicher Muttermilch im Laufe der unterschiedlichen Stadien der Entwicklung des Säuglings im Wesentlichen ähnlich ist. Humanisierte tierische Milch könnte als Kindernahrungsformulierungen dienen, wenn ein Stillen durch die Mutter unmöglich oder nicht erwünscht ist oder auch im Falle von Unterernährung oder Krankheit.
Je nach Wirtszelle, Verfügbarkeit des Substrats und dem/den erwünschten Endprodukten) sind mehrere Polypeptide, insbesondere Desaturasen, von Interesse. Unter "Desaturase" wird ein Polypeptid verstanden, das eine oder mehrere Fettsäuren desaturieren kann, um eine einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäure von Interesse oder einen Vorläufer davon von Interesse zu produzieren. Von besonderem Interesse sind Polypeptide, die die Überführung von DGLA in ARA katalysieren kann, die Enzyme einbindet, die an Position Δ5 desaturieren. Unter "Polypeptid" wird, unabhängig von der Länge oder von post-translationellen Modifikationen, beispielsweise Glycosylierung oder Phosphorylierung, jede beliebige Aminosäurekette verstanden. Relevante Überlegungen für die Auswahl eines spezifischen Polypeptids mit Desaturase-Aktivität umfassen den optimalen pH des Polypeptids, ob das Polypeptid ein Geschwindigkeits-bestimmendes Enzym oder eine Komponente davon ist, ob die eingesetzte Desaturase für die Synthese einer erwünschten, mehrfach ungesättigten Fettsäure essentiell ist, und/oder vom Polypeptid erforderte Co-Faktoren. Das exprimierte Polypeptid weist vorzugsweise mit der biochemischen Umgebung seiner Platzierung in der Wirtszelle kompatible Parameter auf. Beispielsweise kann das Polypeptid mit anderen Enzymen in der Wirtszelle um das Substrat konkurrieren müssen. Analysen des K_m-Werts und der spezifischen Aktivität des Polypeptids von Interesse werden daher bei der Bestimmung der Eignung eines bestimmten Polypeptids zur Modifikation von PUFA-Produktion in einer bestimmten Wirtszelle in Betracht gezogen. Das in einer bestimmten Situation eingesetzte Polypeptid ist eines, das unter den in der beabsichtigten Wirtszelle vorhandenen Bedingungen funktionieren kann, das andererseits jedoch jegliches Polypeptid sein kann, das Desaturase Aktivität und die erwünschte Fähigkeit aufweist, die relative Produktion einer erwünschten PUFA zu modifizieren.
Zur Produktion von ARA kodiert die eingesetzte DNA-Sequenz für ein Polypeptid mit Δ5-Desaturase-Aktivität. In bestimmten Fällen kann dies mit einer Expressionskassette kombiniert werden, die für Produktion eines Polypeptid sorgt, das Δ6-Desaturase-Aktivität aufweist, und die Wirtszelle kann gegebenenfalls von jeglicher gegenwärtiger Δ15-Desaturase-Aktivität befreit werden, beispielsweise durch Bereitstellen einer Transkriptionskassette zur Produktion von Antisense-Sequenzen zum Δ15-Desaturase-Transkriptionsprodukt durch Unterbrechen des Δ15-Desaturasegens oder durch Einsetzen einer Wirtszelle, die von Natur aus oder durch Mutation geringe Δ15-Desaturase-Aktivität aufweist. Das Hemmen von unerwünschten Desaturase-Wegen kann auch durch den Einsatz spezifischer Desaturase-Inhibitoren wie jene, die im US-Patent Nr. 4.778.630 beschrieben werden, erfolgen. Die Auswahl der eingesetzten Kassetten-Kombination kann teilweise vom PUFA-Profil der Wirtszelle abhängen. Ist die Wirtszellen-Δ5-Desaturase-Aktivität einschränkend, wird Überexpression von Δ5-Desaturase alleine im Allgemeinen ausreichend sein, um für gesteigerte ARA-Produktion in Gegenwart eines geeigneten Substrats wie DGLA zu sorgen. ARA-Produktion kann auch durch Bereitstellen von Expressionskassetten für Δ9- oder Δ12-Desaturase-Gene gesteigert werden, sofern die Aktivitäten dieser Desaturasen einschränkend wirken. Ein Schema für die Synthese von Arachidonsäure (20:4 Δ^5,8,11,14) aus Palmitinsäure (C₁₆) ist in 1 dargestellt. Ein Schlüsselenzym für diesen Weg ist eine Δ5-Desaturase, die DH-γ-linolensäure (DGLA, Eicosatriensäure) in ARA überführt. Das Überführen von α-Linolensäure (ALA) in Stearidonsäure durch eine Δ6-Desaturase wird auch dargestellt. Die zusätzliche Produktion von PUFA neben ARA, umfassend EPA und DHA, ist in 2 dargestellt.
POLYPEPTIDQUELLEN MIT DESATURASE-AKTIVITÄT
Eine Polypeptid-Quelle mit Desaturase-Aktivität und Oligonucleotiden, die für solche Polypeptide kodieren, sind Organismen, die eine erwünschte, mehrfach ungesättigte Fettsäure produzieren. Beispielsweise können Mikroorganismen, die in der Lage sind, ARA zu produzieren, als Quelle von Δ5-Desaturase-Aktivität eingesetzt werden. Solche Mikroorganismen umfassen beispielsweise jene, die zu den Genera Mortierel-la, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula und Entomophthora gehören. Innerhalb des Genus Porphyridium ist Porphyridium cruentum von besonderem Interesse. Innerhalb des Genus Mortierella sind Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierel-la hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora, und Mortierella alpina von besonderem Interesse. Innerhalb des Genus Mucor sind Mucor circinelloides und Mucor javanicus von besonderem Interesse.
DNA, die für die erwünschten Desaturasen kodieren, können auf verschiedene Arten identifiziert werden. Beispielsweise wird eine Quelle der erwünschten Desaturase, beispielsweise genomische oder cDNA-Bibliotheken von Mortierella, mit nachweisbaren enzymatisch oder chemisch synthetisierten Sonden gescreent, die aus DNA, RNA oder nicht natürlich vorkommenden Nucleotiden oder Gemischen davon hergestellt werden. Sonden können für normale oder reduziert-stringente Hybridisierungsverfahren enzymatisch aus DNA bekannter Desaturasen synthetisiert werden. Auch Oligonucleotidsonden können eingesetzt werden, um Quellen zu screenen, und sie können auf Sequenzen bekannter Desaturasen aufbauen, umfassend Sequenzen, die unter bekannten Desaturasen konserviert sind, oder auf Peptidsequenzen aufbauen, die vom erwünschten gereinigten Protein erhalten wurden. Oligonucleotidsonden, basierend auf Aminosäuresequenzen, können degeneriert sein, um die Degeneration des genetischen Codes zu umfassen, oder sie können zugunsten der bevorzugten Codons des Quellenorganismus beeinflusst sein. Oligonucleotide können auch als Primer für PCR von revers transkribierter mRNA einer bekannten oder vermuteten Quelle eingesetzt werden; das PCR-Produkt kann die Volllän gen-cDNA sein oder kann eingesetzt werden, um eine Sonde herzustellen, um die gewünschte Volllängen-cDNA zu erhalten. Alternativ dazu kann ein erwünschtes Protein völlig sequenziert werden, und Gesamtsynthese einer für dieses Polypeptid kodierenden DNA kann durchgeführt werden.
Wurde die erwünschte genomische oder cDNA einmal isoliert, kann sie mittels bekannter Verfahren sequenziert werden. Auf dem Gebiet der Erfindung ist bekannt, dass bei solchen Verfahren Fehler unterlaufen können: mehrfaches Sequenzieren derselben Region kommt beispielsweise häufig vor, und es wird immer noch damit gerechnet, dass dies zu messbaren Fehlerraten in der resultierenden abgeleiteten Sequenz führt, besonders in Regionen, die wiederholte Domänen, ausgedehnte Sekundärstruktur oder ungewöhnliche Basenzusammensetzungen aufweisen, wie beispielsweise Regionen mit hohem GC-Basengehalt. Treten Diskrepanzen auf, so kann ein erneutes Sequenzieren durchgeführt werden, bei dem spezielle Verfahren eingesetzt werden. Spezielle Verfahren können das Abändern der Sequenzierungsbedingungen durch Einsatz von: anderen Temperaturen; anderen Enzymen; Proteinen, die die Fähigkeit von Oligonucleotiden, Strukturen höherer Ordnung zu bilden, verändern; veränderten Nucleotiden wie ITP oder methyliertem dGTP; anderen Gelzusammensetzungen, beispielsweise durch Zusatz von Formamid; anderen Primern oder Primern, die in anderen Entfernungen zur problematischen Region angeordnet sind; oder anderen Matrizen wie einzelsträngiger DNA; umfassen. Auch kann Sequenzieren von mRNA herangezogen werden.
Größtenteils stammt ein bestimmter Teil der kodierenden Sequenz oder die gesamte kodierende Sequenz des Polypeptids mit Desaturase-Aktivität von einer natürlichen Quelle. In manchen Fällen ist es jedoch wünschenswert, die gesamten Codons oder einen Teil davon zu modifizieren, beispielsweise um Expression durch Einsatz bevorzugter Wirtscodons zu steigern. Bevorzugte Wirtscodons können aus den Codons mit höchster Frequenz in den Proteinen bestimmt werden, die in einer bestimmten Wirtsspezies von Interesse in der größten Menge exprimiert werden. So kann die kodierende Sequenz für ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität gänzlich oder teil weise synthetisiert werden. Die gesamte DNA oder ein Teil davon kann auch synthetisiert werden, um jegliche destabilisierende Sequenzen oder Regionen der Sekundärstruktur zu entfernen, die in der transkribierten mRNA gegenwärtig wären. Die gesamte DNA oder ein Teil davon kann auch synthetisiert werden, um die Basenzusammensetzung zu einer bevorzugteren Zusammensetzung in der erwünschten Wirtszelle zu verändern. Verfahren zum Synthetisieren und zum Zusammenführen von Sequenzen sind in der einschlägigen Literatur gut beschrieben. In-vitro-Mutagenese und -Selektion, ortsgerichtete Mutagenese oder andere Mittel können eingesetzt werden, um Mutationen natürlich vorkommender Desaturase-Gene zu erlangen, um ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität in vivo herzustellen, das wünschenswertere physikalische und kinetische Parameter für die Funktion in der Wirtszelle, wie längere Halbwertszeit oder eine höhere Produktionsgeschwindigkeit einer mehrfach ungesättigten Fettsäure, erfüllt.
Mortierella-alpina-Desaturase
Von besonderem Interesse ist die Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase, die 446 Aminosäuren aufweist; die Aminosäuresequenz ist in 3 dargestellt. Das für die Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase kodierende Gen kann in transgenen Mikroorganismen oder Tieren exprimiert werden, um stärkere Synthese von ARA aus DGLA zu bewirken. Andere DNA, die mit der Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase-DNA im Wesentli chen ident sind oder die für Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen mit dem Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase-Polypeptid ident sind, können auch eingesetzt werden. Unter "im Wesentlichen ident" wird eine Aminosäuresequenz oder Nucleinsäuresequenz verstanden, die, um die Präferenz zu erhöhen, zumindest 60%, 80%, 90% oder 95% Homologie mit der Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase-Aminosäuresequenz oder -Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, aufweist. Bei Polypeptiden liegt die Länge von Vergleichssequenzen im Allgemeinen bei zumindest 16 Aminosäuren, vorzugsweise bei zumindest 20 Aminosäuren, oder am meisten bevorzugt bei 35 Aminosäuren. Bei Nucleinsäuren liegt die Länge der Vergleichssequenzen im Allgemeinen bei zumindest 50 Nucleotiden, vorzugsweise bei zumindest 60 Nucleotiden, noch bevorzugter bei zumindest 75 Nucleotiden, und am meisten bevorzugt bei 110 Nucleotiden. Homologie wird typischerweise unter Einsatz von Sequenzanalyse-Software gemessen, beispielsweise dem Sequenzanalyse-Softwarepaket der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St:, Madison, Wisconsin 53715) und MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Kalifornien 95008). Solche Software vergleicht ähnliche Sequenzen durch Zuordnen von Homologiegraden zu unterschiedlichen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin und Alanin; Valin, Isoleucein und Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; Lysin und Arginin; und Phenylalanin und Tyrosin. Substitutionen können auch auf Grundlage konservierter Hydrophobie oder Hydrophilie hergestellt werden (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982)) oder auf Grundlage der Fähigkeit, ähnliche Polypeptid-Sekundärstruktur anzunehmen (Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47, 45–148 (1978)).
Andere Desaturasen
In die vorliegende Erfindung sind auch verwandte Desaturasen aus denselben oder anderen Organismen, wie in den Ansprüchen definiert, eingebunden. Solche verwandten Desaturasen umfassen Varianten der offenbarten Δ5-Desaturase, die innerhalb derselben oder anderer Spezies von Mortierella natürlich vorkommen, sowie Homologe der offenbarten Δ5-Desaturase von anderen Spezies. Auch sind Desaturasen eingebunden, die, obwohl sie nicht im Wesentlichen ident mit der Mortierella-alpina-Δ5-Desaturase sind, ein Fettsäuremolekül am 5. Kohlenstoff des Carboxylendes eines Fettsäuremoleküls desaturieren. Verwandte Desaturasen können durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, im Wesentlichen gleich zu funktionieren wie die offenbarten Desaturasen; das bedeutet, dass sie immer noch in der Lage sind, DGLA wirksam zu ARA umzusetzen. Verwandte Desaturasen können auch durch Screenen von Sequenz-Datenbanken auf Sequenzen hin, die mit der offenbarten Desaturase homolog sind, durch Hybridisieren einer Sonde, die auf der offenbarten Desaturase basiert, an eine aus dem Quellenorganismus konstruierte Bibliothek oder durch RTPCR unter Einsatz von mRNA aus dem Quellenorganismus und auf der offenbarten Desaturase basierenden Primern identifiziert werden. Solche Desaturasen umfassen jene von Menschen, von Dictyostelium discoideum und von Phaeodactylum tricornum.
Die Regionen eines Desaturase-Polypeptids, das für die Desaturase-Aktivität wichtig ist, können durch Routine-Mutagenese, Expression der resultierenden mutierten Polypeptide und Bestimmung ihrer Aktivität bestimmt werden. Mutanten können De-letionen, Insertionen und Punktmutationen oder Kombination davon umfassen. Eine typische Funktionsanalyse beginnt mit Deletionsmutagenese, um die N- und C-terminalen Grenzen des für die Funktion notwendigen Proteins zu bestimmen, woraufhin innere Deletionen, Insertionen oder Punktmutanten hergestellt werden, um für die Funktion notwendige Regionen näher zu bestimmen. Andere Verfahren wie Kassettenmutagenese oder Gesamtsynthese können auch eingesetzt werden. Deletionsmutagenese wird beispielsweise durch den Einsatz von Exonucleasen durchgeführt, um die 5'- oder 3'-kodierenden Regionen nacheinander zu entfernen. Für solche Verfahren sind Sets verfügbar. Nach der Deletion wird die kodierende Region durch verbindende Oligonucleotide vervollständigt, die Start- oder Stopcodons zu der deletierten kodierenden Region nach 5'- bzw. 3'-Deletion enthalten. Alternativ dazu werden Oligonucleotide, die für Start- oder Stopcodons kodieren, in die kodierende Region durch zahlreiche verschiedene Verfahren, umfassend ortsgerichtete Mutagenese, mutagene PCR, oder durch Ligation an DNA, die an den existierenden Restriktionsstellen verdaut ist, eingeführt. Innere Deletionen können auf ähnliche Weise durch eine Vielzahl an Verfahren hergestellt werden, umfassend den Einsatz existierender Restriktionsstellen in der DNA, unter Verwendung mutagener Primer über ortsgerichtete Mutagenese oder mutagene PCR. Insertionen können mittels Verfahren wie Linker-Scanning-Mutagenese, ortsgerichtete Mutagenese oder mutagene PCR hergestellt werden. Punktmutationen können mittels Verfahren wie ortsgerichtete Mutagenese oder mutagene PCR hergestellt werden.
Auch chemische Mutagenese kann zur Identifikation von Regionen eines Desaturase-Polypeptids, das für die Aktivität wichtig ist, eingesetzt werden. Ein mutiertes Konstrukt wird exprimiert, und die Fähigkeit des resultierenden, veränderten Proteins, als eine Desaturase zu funktionieren, wird getestet. Solche Struktur-Funktionsanalyse kann bestimmen, welche Regionen deletiert werden können, welche Regionen Insertionen tolerieren und welche Punktmutationen dem mutierten Protein die Fähigkeit verleihen, auf im Wesentlichen dieselbe Art zu funktionieren wie die native Desaturase. Alle solche mutierte Proteine und Nucleotidsequenzen, die dafür kodieren, sind vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
EXPRESSION VON DESATURASE-GENEN
Wurde die für ein Desaturase-Polypeptid kodierende DNA erst einmal erhalten, wird sie in einen Vektor platziert, der zur Replikation in einer Wirtszelle in der Lage ist, oder sie wird in vitro mittels Verfahren wie PCR oder langer PCR vermehrt. Replikationsvektoren können Plasmide, Phagen, Viren, Cosmide und dergleichen umfassen. Wünschenswerte Vektoren umfassen jene, die für Mutagenese des Gens von Interesse oder für Expression des Gens von Interesse in Wirtszellen nützlich sind. Das Verfahren der langen PCR hat In-vitro-Vermehrung großer Konstrukte möglich gemacht, sodass Modifikationen des Gens von Interesse, wie Mutagenese oder Zusatz von Expressionssignalen, und Vermehrung der resultierenden Konstrukte vollständig in vitro und ohne Einsatz eines Replikationsvektors oder einer Wirtszelle auftreten können.
Zur Expression eines Desaturase-Polypeptids werden funktionelle Transkriptions- und Translationsinitiations- und -terminationsregionen operabel an die DNA gebunden, die für das Desaturase-Polypeptid kodiert. Expression der Polypeptid-kodierenden Region kann in vitro oder in einer Wirtszelle stattfinden. Transkriptions- und Translationsinitiations- und -terminationsregionen sind von einer Vielzahl nicht-exklusiver Quellen, umfassend die zu exprimierende DNA, Gene, die bekannt dafür sind oder von denen angenommen wird, dass sie zur Expression im erwünschten System fähig sind, Expressionsvektoren und chemische Synthese, oder von einem endogenen Locus in einer Wirtszelle abgeleitet.
Expression in vitro
In-vitro-Expression kann beispielsweise durch Platzieren der für das Desaturase-Polypeptid kodierenden Region in einen Expressionsvektor, der für In-vitro-Anwendungen vorgesehen ist, und durch Zusatz von Kaninchen-Retikulozyten-Lysat und Co-Faktoren erfolgen; markierte Aminosäuren können, sofern erwünscht, inkorporiert werden. Solche In-vitro-Expressionsvektoren können manche oder alle der in dem eingesetzten System notwendigen Expressionssignale bereitstellen. Diese Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, und die Komponenten des Systems sind im Handel erhältlich. Das Reaktionsgemisch kann dann direkt auf das Polypeptid getestet werden, beispielsweise durch Bestimmen seiner Aktivität, oder das synthetisierte Polypeptid kann gereinigt und dann getestet werden.
Expression in einer Wirtszelle
Expression in einer Wirtszelle kann auf vorübergehende oder dauerhafte Weise erfolgen. Vorübergehende Expression kann durch eingeführte Konstrukte auftreten, die in der Wirtszelle funktionelle Expressionssignale enthalten, die sich jedoch nicht replizieren und sich selten in die Wirtszelle integrieren, oder wo die Wirtszelle sich nicht vermehrt. Vorübergehende Expression kann auch durch Induzieren der Aktivität eines regulierbaren Promotors erfolgen, der operabel an das Gen von Interesse gebunden ist, obwohl solche induzierbaren Systeme häufig ein niedriges Expressions-Grundniveau aufweisen. Dauerhafte Expression kann durch Einführen eines Konstrukts erreicht werden, das sich in das Wirtsgenom integrieren kann oder sich autonom in der Wirtszelle repliziert. Dauerhafte Expression des Gens von Interesse kann durch den Einsatz eines selektierbaren Markers, der an einem Expressionskonstrukt platziert ist oder damit transfiziert ist, ausgewählt werden, woraufhin die Auswahl für die den Marker exprimierenden Zellen erfolgt. Resultiert dauerhafte Expression aus der Integration, so kann eine Integration von Konstrukten zufällig innerhalb des Wirtsgenoms auftreten oder kann durch den Einsatz von Konstrukten, die Homologie-Regionen mit dem Wirtsgenom enthalten, die ausreichend sind, um die Rekombination mit dem Wirtslocus zu erreichen, gerichtet sein. Sind Konstrukte auf einen endogenen Locus gerichtet, so können alle oder Teile der Transkriptions- und Translationsregulator-Regionen durch den endogenen Locus bereitgestellt werden.
Ist erhöhte Expression des Desaturase-Polypeptids im Quellenorganismus erwünscht, so können mehrere Verfahren eingesetzt werden. Zusätzliche Gene, die für das Desaturase-Polypeptid kodieren, können in den Wirtsorganismus eingeführt werden. Expression vom nativen Desaturase-Locus kann auch durch homologe Rekombination erhöht werden, beispielsweise durch Einführen eines stärkeren Promotors in das Wirstgenom, um erhöhte Expression auszulösen, durch Entfernen destabilisierender Sequenzen entweder aus der mRNA oder dem kodierten Protein durch Deletieren dieser Information vom Wirtsgenom oder durch Zusetzen stabilisierender Sequenzen zur mRNA (US-Patent Nr. 4.910.141).
Ist es wünschenswert, mehr als ein unterschiedliches Gen, geeignete Regulatorregionen zu exprimieren und Expressionsverfahren anzuwenden, können eingeführte Gene in den Wirtszellen über den Einsatz von Replikationsvektoren oder durch Integration in das Wirtsgenom vermehrt werden. Werden zwei oder mehr Gene aus getrennten Replikationsvektoren exprimiert, so ist es wünschenswert, dass jeder Vektor ein unterschiedliches Replikationsmittel aufweist. Jedes eingeführte Konstrukt, unabhängig davon, ob es integriert ist oder nicht, sollte ein unterschiedliches Selektionsmittel und gegenüber den anderen Konstrukten keine Homologie aufweisen, um dauerhafte Expression aufrechtzuerhalten und eine Neuordnung der Elemente unter den Konstrukten zu vermeiden. Vernünftige Entscheidungen für Regulationsregionen, Selektionsmittel und Vermehrungsverfahren für die eingeführten Konstrukte können experimentell bestimmt werden, sodass alle eingeführten Gene mit den notwendigen Niveaus exprimiert werden, um für Synthese der erwünschten Produkte zu sorgen.
Ist beispielsweise die Wirtszelle eine Hefe, so werden Transkriptions- und Translationsregionen, die in Hefezellen funktionell sind, bereitgestellt, insbesondere von den Wirtsspezies. Die Transkriptionsinitiations-Regulatorregionen können beispielsweise von Genen am Glycolyseweg, wie Alkoholdehydrogenase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD), Phosphoglucoisomerase, Phosphoglyceratkinase usw., oder regulierbaren Genen wie saure Phosphatase, Lactase, Metallothionein, Glucoamylase usw., erhalten werden. Jede beliebige von zahlreichen Regulatorsequenzen kann in einer bestimmten Situation eingesetzt werden, je nachdem, ob konstituive oder induzierte Transkription erwünscht ist, je nach der bestimmten Wirksamkeit des Promotors in Verbindung mit dem offenen Leseraster von Interesse, der Fähigkeit, einen starken Promotor mit einer Kontrollregion von einem anderen Promotor zu verbinden, was induzierbare Transkription, einfache Konstruktion und dergleichen ermöglicht. Von besonderem Interesse sind Promotoren, die in Gegenwart von Galactose aktiviert werden. Galactose-induzierbare Promotoren (GAL1, GAL7 und GAL10) wurden aufgrund ihrer regulierten Expression auf hohem Niveau von Protein in Hefe weitläufig eingesetzt (Lue et al., Mol. Cell. Biol. 7, 3.446 (1987); Johnston, Microbiol. Rev. 51, 458 (1987)). Transkription aus den GAL-Promotoren wird durch das GAL4-Protein aktiviert, das die Promtorregion bindet und Transkription aktiviert, wenn Galactose vorhanden ist. In Abwesenheit von Galactose bindet sich der Antagonist GAL80 an GAL4 und verhindert, dass GAL4 Transkription aktiviert. Der Zusatz von Galactose verhindert, dass GAL80 die Aktivierung durch GAL4 hemmt.
Es wurde herausgefunden, dass Nucleotidsequenzen, die das Translationsinitiationscodon ATG umgeben, Expression in Hefezellen beeinflussen. Wird das erwünschte Polypeptid in Hefe nur schwach exprimiert, können die Nucleotidsequenzen von exogenen Genen modifiziert werden, um eine wirksame Hefe-Translationsinitiations sequenz zu enthalten, um optimale Genexpression zu erreichen. Zur Expression von Saccharomyces kann dies über ortsgerichtete Mutagenese eines nicht wirksam exprimierten Gens durch Fusionieren dieses Gens im Raster an ein endogenes Saccharomyces-Gen, vorzugsweise ein hoch exprimiertes Gen wie das Lactasegen, erfolgen.
Die Terminationsregion kann von der 3'-Region des Gens, von dem die Initiationsregion erhalten wurde, oder von einem anderen Gen abgeleitet werden. Eine große Anzahl an Terminationsregionen sind dafür bekannt, dass sie in einer Vielzahl von Wirten derselben und unterschiedlicher Genera und Spezies zufrieden stellend sind. Die Terminationsregion wird üblicherweise eher nach praktischen Kriterien ausgewählt als nach dem Kriterium einer bestimmten Eigenschaft. Vorzugsweise ist die Terminationsregion von einem Hefegen abgeleitet, insbesondere von Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida oder Kluyveromyces. Die 3'-Regionen von zwei Säugetiergenen, γ-Interferon und α2-Interferon, sind auch dafür bekannt, in Hefe zu funktionieren.
EINFÜHREN VON KONSTRUKTEN IN WIRTSZELLEN
Konstrukte, die das Gen von Interesse umfassen, können in eine Wirtszelle mittels Standardverfahren eingeführt werden. Diese Verfahren umfassen Transformation, Protopiastenfusion, Lipofektion, Transfektion, Transduktion, Konjugation, Infektion, holistischen Einfluss, Elektroporation, Mikroinjektion, Abschaben oder jegliche anderen Verfahren, die das Gen von Interesse in die Wirtszelle einfügen. Verfahren zur Transformation, die eingesetzt werden, umfassen Lithiumacetat-Transformation (Methods in Enzymolog 194, 186–187 (1991)). Aus praktischen Gründen werden Wirtszellen, die durch ein beliebiges Verfahren manipuliert wurden, um eine DNA-Sequenz oder -Konstrukt aufzunehmen, hierin als "transformiert" oder "rekombinant" bezeichnet.
Der Versuchswirt weist zumindest eine Kopie des Expressionskonstrukts auf und kann zwei oder mehr amplifiziert haben, je nachdem, ob das Gen in das Genom integriert ist, oder er ist auf einem extrachromosomalen Element vorhanden, das zahlreiche Kopiennummern aufweist. Ist der Versuchswirt eine Hefe, so können vier Haupttypen von Hefe-Plasmidvektoren eingesetzt werden: integrative Hefeplasmide (YIp), replikative Hefeplasmide (YRp), Hefecentromer-Plasmide (YCp) und episomale Hefeplasmide (YEp). YIp weisen keinen Hefereplikationsstartpunkt auf und müssen als integrierte Elemente im Hefegenom repliziert werden. YRp weisen eine chromosomal abgeleitete, autonom replizierende Sequenz auf und werden mit mittlerer Kopienzahl (20 bis 40) als autonom replizierende, instabil segregierende Plasmide vermehrt. YCp weisen sowohl einen Replikationsstartpunkt und eine Centromer-Sequenz auf und vermehren sich mit niedriger Kopienzahl (10–20) als autonom replizierende, stabil segregierende Plasmide. YEp haben einen Replikationsstartpunkt vom Hefe-2-μm-Plasmid und werden mit hoher Kopienzahl als autonom replizierende, unregelmäßig segregierende Plasmide vermehrt. Die Gegenwart der Plasmide in Hefe kann durch Aufrechterhalten von Selektion für einen Marker am Plasmid sichergestellt werden. Von besonderem Interesse sind die Hefevektoren pYES2 (ein YEp-Plasmid, das bei Invitrogen erhältlich ist und Uracilprototrophie und einen GAL1-Galactose-induzierbaren Promotor zur Expression verleiht), pRS425-pG1 (ein YEp-Plasmid, das bei Dr. T. H. Chang, Ass. Professor für Molecular Genetics, Ohio State University, erhalten wurde, einen konstitutiven GPD-Promotor enthält und Leucinprototrophie verleiht) und pYX424 (ein YEp-Plasmid mit einem konstitutiven TP1-Promtor, das Leucinprototrophie verleiht; T. Alber und G. Kawasaki, J. Mol. & Appl. Genetics 1, 419 (1982)).
Die transformierte Wirtszelle kann durch Selektion aufgrund eines Markers, der am eingeführten Konstrukt enthalten ist, identifziert werden. Alternativ dazu kann ein getrenntes Markerkonstrukt mit dem erwünschten Konstrukt eingeführt werden, so wie zahlreiche Transformationsverfahren zahlreiche DNA-Moleküle in Wirtszellen einfügen. Typischerweise werden transformierte Wirte aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, auf einem selektiven Medium zu wachsen. Selektive Medien können ein Anti biotikum inkorporieren oder einen Faktor nicht aufweisen, der zum Wachstum des nicht transformierten Wirtes notwendig ist, wie beispielsweise einen Nährsubstanz- oder Wachstumsfaktor. Ein eingeführtes Markierungsgen kann daher antibiotische Resistenz verleihen oder für einen essentiellen Wachstumsfaktor oder ein essentielles Enzym kodieren und das Wachstum an einem selektiven Medium ermöglichen, wenn es im transformierten Wirt exprimiert wird. Die Selektion eines transformierten Wirtes kann auch eintreten, wenn das exprimierte Markerprotein direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. Das Markerprotein kann alleine oder als eine Fusion mit einem anderen Protein exprimiert werden. Das Markerprotein kann durch seine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden; beispielsweise kann β-Galactosidase das Substrat X-gal zu einem färbigen Produkt umsetzen, und Luciferase kann Luciferin zu einem lichtemittierenden Produkt umsetzen. Das Markerprotein kann durch seine lichtproduzierenden oder -modifizierenden Charakteristika nachgewiesen werden; beispielsweise fluoresziert das grüne Fluoreszenz-Protein von Aequorea victoria, wenn es mit blauem Licht angestrahlt wird. Antikörper können eingesetzt werden, um das Markerprotein oder eine Molekulmarkierung beispielsweise an einem Protein von Interesse nachzuweisen. Zellen, die das Markerprotein oder die Markierung exprimieren, können beispielsweise visuell oder durch Verfahren wie FACS oder durch die Panning-Technik mittels Antikörper ausgewählt werden. Für die Auswahl von Hefetransformanten kann jeder beliebige Marker, der in Hefe funktioniert, eingesetzt werden. Wünschenswerterweise ist die Resistenz gegenüber Kanamycin und Aminoglycosid G418 von Interesse, sowie die Fähigkeit, in einem Medium ohne Uracil, Leucin, Lysin oder Tryptophan zu wachsen.
Die Δ5-Desaturase-vermittelte Produktion von PUFA kann entweder in prokaryotischen oder in eukaryotischen Wirtszellen erfolgen. Prokaryotische Zellen von Interesse umfassen Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Cyanobacteria und dergleichen. Eukaryotische Zellen umfassen Säugetierzellen wie jene von laktierenden Tieren, Vogelzellen wie von Hühnern und andere Zellen, die für genetische Manipulation zugänglich sind, umfassend Insekten-, Pilz- und Algenzellen. Die Zellen können als Teil oder als Ganzes eines Wirtsorganismus, umfassend ein Tier, kultiviert oder gebildet werden. Viren und Bakteriophagen können auch mit den Zellen für die Produktion von PUFA eingesetzt werden, insbesondere für Gentransfer, Zell-Targeting und Selektion. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirt jeder beliebige Mikroorganismus oder jedes beliebige Tier, der/das DGLA produziert und/oder exogen zugeführte DGLA assimilieren kann und vorzugsweise große Mengen an DGLA produziert. Beispiele für Wirtstiere umfassen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hühner, Wachteln, Puten, Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Yaks usw., die für genetische Manipulation und Klonieren zur raschen Ausdehnung der Transgen exprimierenden Population zugänglich sind. Bei Tieren kann ein Δ5-Desaturase-Transgen an Expression in Ziel-Organellen, -Geweben und -Körperflüssigkeiten durch Modifikation der Gen-Regulatorregionen angepasst werden. Besonderes Interesse wird der Produktion von PUFA in der Brustmilch des Wirtstieres beigemessen.
Expression in Hefe
Beispiele für Wirtsmikroorganismen umfassen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis oder andere Hefearten wie Candida, Kluyveromyces oder andere Pilze wie beispielsweise Fadenpilze wie Aspergillus, Neurospora, Penicillium usw. Wünschenswerte Eigenschaften eines Wirtsmikroorganismus sind beispielsweise, dass sie genetisch gut charakterisiert sind, dass sie zu hochgradiger Expression des Produkts mittels Fermentation mit ultra-hoher Dichte eingesetzt werden können und dass sie GRAS-Status haben (GRAS = generally recognized as safe), da das vorgeschlagene Endprodukt für die Einnahme durch Menschen entwickelt wird. Von besonderem Interesse ist der Einsatz einer Hefe, spezifischer der Bäckerhefe (S. cerevisiae), als ein Zellwirt in der vorliegenden Erfindung. Stämme von besonderem Interesse sind SC334 (Mat α pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gal1; Gene 83, 57–64 (1989), Hovland P. et al.), YTC34 (α ade2-101 his3Δ200 lys2-801 ura3-52; erhalten von Dr. T. H. Chang, Ass. Professor für Molecular Genetics, Ohio State University), YTC41 (a/α ura3-52/ura3=52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trpl-Δ1/trpl-Δ1 his3Δ200/his3Δ200 leu2ΔI/leu2ΔI; erhalten von Dr. T. H. Chang, Ass. Professor für Molecular Genetics, Ohio State University), BJ1995 (erhalten bei Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720), INVSC1 (Mat α hiw3Δ1 leu2 trpl-289 ura3-52; erhalten von Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) und INVSC2 (Mat α his3Δ200 ura3-167; erhalten von Invitrogen).
Expression in Vogelspezies
Zur Produktion von PUFA in Vogelspezies und -zellen, wie Hühnern, Puten, Wachteln und Enten, kann Gentransfer durch Einführen einer Nucleinsäuresequenz, die für eine Δ5-Desaturase kodiert, in die Zellen nach auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren durchgeführt werden. Ist ein transgenes Tier erwünscht, können pluripotente Stammzellen von Embryonen mit einem Vektor ausgestattet werden, der ein für Δ5-Desaturase kodierendes Transgen trägt, und zu erwachsenen Tieren entwickelt werden (US-Patent Nr. 5.162.215; Ono et al., Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3), 287–292 (1996); WO 9.612.793; WO 9.606.160). In den meisten Fällen wird das Transgen modifiziert, um hohe Konzentrationen an Desaturase zu exprimieren, um die Produktion von PUFA zu fördern. Das Transgen kann beispielsweise durch Bereitstellen von Transkriptions- und/oder Translationsregulatorregionen, die in Vogelzellen funktionieren, modifiziert werden, wie beispielsweise Promotoren, die die Expression in bestimmten Geweben und Teilen des Eis wie im Eidotter regeln. Die Genregulatorregionen können aus verschiedenen Quellen gewonnen werden, umfassend Hühneranämie oder Vogelleukoseviren oder Vogelgene wie ein Hühnerovalbumingen.
Expression in Insektenzellen
Produktion von PUFA in Insektenzellen können unter Einsatz von Baculovirus-Expressionsvektoren, die ein Δ5-Desaturase-Transgen enthalten, durchgeführt werden. Baculovirus-Expressionsvektoren sind bei mehreren Handelsquellen wie Clonetech erhältlich. Verfahren zur Produktion von hybriden und transgenen Stämmen von Algen, wie Meeresalgen, die ein Desaturase-Transgen enthalten und exprimieren, werden ebenfalls bereitgestellt. Beispielsweise können transgene Meeresalgen wie in US-Patent Nr. 5.426.040 beschrieben hergestellt werden. Wie bei den anderen, zuvor beschriebenen Expressionssystemen können Zeitpunkt, Ausmaß an Expression und Aktivität des Desaturase-Transgens durch Anpassen der für das Polypeptid kodierenden Sequenz an die geeigneten Transkriptions- und Translations-Regulatorregionen, die für einen bestimmten Einsatz ausgewählt werden, geregelt werden. Von besonderem Interesse sind Promtorregionen, die unter vorbestimmten Wachstumsbedingungen induziert werden können. Beispielsweise kann das Einführen von temperaturempfindlichen und/oder metabolit-gesteuerten Mutationen in die für Desaturase-Transgen kodierenden Sequenzen, ihrer Regulatorregionen und/oder das Genom der Zellen, in die das Transgen eingeführt wird, zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Expression in Pflanzen
Produktion von PUFA in Pflanzen kann unter Einsatz verschiedener Pflanzen-Transformationssysteme wie dem Einsatz von Agrobacterium tumefaciens, Pflanzenviren, Teilchenzelltransformation und dergleichen, die in den mit dieser Anmeldung verwandten US-Anmeldungen mit der Serien-Nr. 08/834.033 und 08/956.985 und den Continuation-in-Part-Anmeldungen, die gleichzeitig mit dieser Anmeldung eingereicht wurden, offenbart sind, die alle hierbei durch Verweis hierin aufgenommen sind, durchgeführt werden.
Die transformierte Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen, die an das erwünschte Endprodukt angepasst sind, gezüchtet. Bei Wirtszellen, die in Kultur gezüchtet wurden, sind die Bedingungen typischerweise optimiert, um die größte oder wirtschaftlichste Ausbeute an PUFA zu produzieren, die auf die ausgewählte Desaturase-Aktivität Bezug nehmen. Wachstumsmedien-Bedingungen, die optimiert werden können, umfassen: Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Zusatz von Substrat, Endkonzentration des zugesetzten Substrats, Form des zugesetzten Substrats, aerobes oder anaerobes Wachstum, Wachstumstemperaturen, Induktionsmittel, Induktion stemperatur, Wachstumsphase bei der Induktion, Wachstumsphase bei der Ernte, pH, Dichte und Erhaltung der Auswahl. Mirkoorganismen wie Hefe beispielsweise werden vorzugsweise unter Einsatz ausgewählter Medien von Interesse gezüchtet, die Hefe-Pepton-Nährlösung (YPD = yeast peptone broth) und Minimalmedien (die Aminosäuren, Hefe-Stickstoffbase und Ammoniumsulfat enthalten und eine Selektionskomponente, z. B. Uracil, nicht enthalten) umfassen. Wünschenswerterweise werden zuzusetzende Substrate zuerst in Ethanol gelöst. Sofern notwendig kann die Expression des Polypeptids von Interesse induziert werden, beispielsweise durch Einbinden oder Zusetzen von Galactose, um die Expression von einem GAL-Promotors zu induzieren.
Expression in einem Tier
Expression in Zellen eines Wirtstiers kann wahlweise auf vorübergehende oder dauerhafte Weise erfolgen. Vorübergehende Expression kann mittels bekannter Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Infektion oder Lipofektion, und kann wiederholt werden, um die gewünschten Expressionskonzentrationen des eingeführten Konstrukts aufrechtzuerhalten (siehe Ebert, PCT-Veröffentlichung WO 94/05.782). Dauerhafte Expression kann über Integration eines Konstrukts in das Wirtsgenom erfolgen, woraus ein transgenes Tier resultiert. Das Konstrukt kann beispielsweise durch Mikroinjektion des Konstrukts in die Vorkerne eines befruchteten Eis oder durch Transfektion, retrovirale Infektion oder andere Verfahren eingeführt werden, wobei das Konstrukt in eine Zelllinie eingeführt wird, die von einem erwachsenen Tier stammen oder in ein solches erwachsenes Tier inkorporiert werden kann (US-Patent Nr. 4.873.191; US-Patent Nr. 5.530.177; US-Patent Nr. 5.565.362; US-Patent Nr. 5.366.894; Wilmut et al., Nature 385, 810 (1997)). Die rekombinanten Eier oder Embryonen werden in eine Leihmutter übertragen (US-Patent Nr. 4.873.191; US-Patent Nr. 5.530.177; US-Patent Nr. 5.565.362; US-Patent Nr. 5.366.894; Wilmut et al., s.o.).
Nach der Geburt werden transgene Tiere beispielsweise durch die Gegenwart eines eingeführten Markierungsgens, wie eines für Hüllfarbe, oder durch PCR oder Southern-Blotting aus einer Blut-, Milch- oder Gewebsprobe, um die eingeführten Konstrukte nachzuweisen, oder durch einen immunologischen oder enzymologischen Test, um das exprimierte Protein oder die daraus produzierten Produkte nachzuweisen, identifiziert (US-Patent Nr. 4.873.191; US-Patent Nr. 5.530.177; US-Patent Nr. 5.565.362; US-Patent Nr. 5.366.894; Wilmut et al., s.o.). Die resultierenden transgenen Tiere können völlig transgen sein oder sog. Mosaike sein, die die Transgene nur in einer Teilmenge ihrer Zellen aufweisen. Das Aufkommen von Säugetierklonieren, das über Fusionieren einer kernhaltigen Zelle mit einem entkernten Ei erfolgt, gefolgt vom Transfer in eine Leihmutter, stellt eine Möglichkeit für rasche Massenproduktion durch Erhalten eines "Stamm"-Tieres oder einer "Stamm-"Zelle dar, die das eingeführte Konstrukt umfasst; davor war es für die Vermehrung notwendig, dass das Transgen in der Keimbahn des Tiers vorhanden war (Wilmut et al., s.o.).
Expression in einem Wirtstier stellt eine bestimmte Wirksamkeit dar, insbesondere wenn der Wirt ein Haustier ist. Zur Produktion von PUFA in einer für das Wirtstier leicht erreichbaren Flüssigkeit wie Milch kann das Desaturase-Transgen in Säugetierzellen von einem weiblichen Wirt exprimiert werden, und der PUFA-Gehalt der Wirtszellen kann verändert werden. Das Desaturase-Transgen kann zur Expression angepasst werden, sodass es in den Säugetierzellen zurückgehalten wird oder in die Milch sekretiert wird, um die PUFA-Reaktionsprodukte zu bilden, die der Milch zugeordnet werden (PCT-Veröffentlichung WO 95/24.488). Expression kann auf die Expression in Säugetiergewebe unter Einsatz spezifischer Regulatorsequenzen, wie jene von Rinder-α-Lactalbumin, α-Casein, β-Casein, γ-Casein, κ-Casein, β-Lactoglobulin oder saures Molkeprotein, gerichtet sein und kann gegebenenfalls ein oder mehrere Introns und/oder Sekretionssignalsequenzen umfassen (US-Patent Nr. 5.530.177; Rosen, US-Patent Nr. 5.565.362; Clark et al., US-Patent Nr. 5.366.894; Garner et al., PCT-Veröffentlichung WO 95/23.868). Expression von Desaturase-Transgenen oder Antisense-Desaturase-Transkripten, die auf diese Weise ange passt wurden, kann eingesetzt werden, um die Konzentrationen an spezifischen PUFA oder Derivaten davon, die in Tiermilch gefunden werden, zu verändern. Weiters kann das Δ5-Desaturase-Transgen entweder durch sich selbst oder durch andere Transgene exprimiert werden, um Tiermilch herzustellen, die höhere Anteile an erwünschten PUFA oder PUFA-Verhältnissen und -Konzentrationen enthalten, die menschlicher Muttermilch ähnlich sind (Prieto et al., PCT-Veröffentlichung WO 95/24.494).
REINIGUNG VON FETTSÄUREN
Die in der Δ5-Position desaturierten Fettsäuren können im Wirtsmikroorganismus oder -tier als freie Fettsäuren oder in konjugierten Formen wie Acylglycerolen, Phospholipiden, Sulfolipiden oder Glykolipiden gebildet werden und können aus der Wirtszelle durch zahlreiche Mittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, extrahiert werden. Solche Mittel können Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Beschallung, überkritische Flüssigkeitsextraktion unter Einsatz von beispielsweise Kohlendioxid und physikalische Mittel wie Pressen oder Kombinationen daraus umfassen. Von besonderem Interesse ist die Extraktion mit Methanol und Chloroform. Sofern wünschenswert können die wässrigen Schichten angesäuert werden, um negativ geladene Gruppierungen zu Protonieren und dadurch die Verteilung erwünschter Produkte in der organischen Schicht zu erhöhen. Nach der Extraktion können die organischen Lösungsmittel durch Verdampfen unter einem Stickstoffstrom entfernt werden. Sind sie in konjugierter Form isoliert, so können die Produkte enzymatisch oder chemisch gespalten werden, um die freie Fettsäure oder ein weniger komplexes Konjugat von Interesse freizusetzen, und können anschließend weiteren Manipulationen unterzogen werden, um ein erwünschtes Endprodukt herzustellen. Wünschenswerterweise werden konjugierte Formen von Fettsäuren mit Kaliumhydroxid gespalten.
Ist weitere Reinigung notwendig, können Standardverfahren eingesetzt werden. Solche Verfahren können Extraktion, Behandlung mit Harnstoff, fraktionierte Kristallisa tion, HPLC, fraktionierte Destillation, Kieselgel-Chromatographie, Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation oder -Destillation oder Kombinationen dieser Verfahren einschließen. Der Schutz von reaktiven Gruppen wie die Säure- oder Alkenylgruppen, kann in jedem einzelnen Schritt durch bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Alkylierung oder Iodierung. Eingesetzte Verfahren umfassen Methylierung der Fettsäuren, um Methylester herzustellen. Dem ähnlich können Schutzgruppen im Laufe eines jeden Schritts der Verfahren entfernt werden. Wünschenswerterweise kann die Reinigung von Fraktionen, die ARA, DHA und EPA enthalten, durch Behandlung mit Harnstoff und/oder fraktionierter Destillation erfolgen.
VERWENDUNG VON FETTSÄUREN
Es gibt mehrere Einsatzbereiche für Fettsäuren, die durch die vorliegende Erfindung produziert werden. Sonden, die auf den DNA der vorliegenden Erfindung basieren, können in Verfahren zum Isolieren verwandter Moleküle oder in Verfahren zur Detektion von Organismen, die Desaturasen exprimieren, Einsatz finden. Werden sie als Sonden verwendet, müssen die DNA oder Oligonucleotide detektierbar sein. Dies erfolgt üblicherweise durch Anbinden einer Markierung entweder an einer inneren Seite, beispielsweise über Einbindung eines modifizierten Rests, oder am 5'- oder 3'-Terminus. Solche Markierungen können direkt nachweisbar sein, können sich an ein Sekundärmolekül binden, das nachweisbar markiert ist, oder können sich an ein nicht markiertes Sekundärmolekül und an ein nachweisbar markiertes Tertiärmolekül binden; dieses Verfahren kann so lange ausgedehnt werden, solange ein zufrieden stellend nachweisbares Signal praktisch erlangt werden kann, ohne nicht annehmbare Pegel an Hintergrundsignalen akzeptieren zu müssen. Sekundär-, Tertiär- oder Überbrückungssysteme können den Einsatz von Antikörpern einschließen, die gegen jedes andere Molekül, umfassend Markierungen oder andere Antikörper, gerichtet sind, oder können jegliche Moleküle einbinden, die sich aneinander binden, beispielsweise ein Biotin-Streptavidin/Avidin-System. Nachweisbare Markierungen enthalten typischerweise radioaktive Isotope, Moleküle, die chemisch oder enzymatisch Licht produzieren oder verändern, Enzyme, die nachweisbare Reaktionsprodukte produzieren, magnetische Moleküle, fluoreszierende Moleküle oder Moleküle, deren Fluoreszenz oder lichtemittierende Eigenschaften sich beim Binden verändern. Beispiele für Markierungsverfahren können in dem US-Patent Nr. 5.011.770 gefunden werden. Alternativ dazu kann das Binden von Zielmolekülen durch Messen der Veränderung der Lösungswärme beim Binden der Sonde an das Target über isothermische Titrations-Kalorimetrie oder durch Beschichten der Sonde oder des Targets an einer Oberfläche und Nachweisen der Veränderung der Lichtstreuung von der Oberfläche ausgehend, die durch Binden des Targets bzw. der Sonde entsteht, wie es mit dem BIAcore-System erfolgen kann, direkt nachgewiesen werden.
PUFA, die durch rekombinante Mittel produziert wurden, finden Einsatz in einem sehr weiten und vielfältigen Bereich. Das Zuführen von PUFA bei Menschen oder Tieren in verschiedenen Formen kann zu erhöhten Konzentrationen nicht nur an den zugesetzten PUFA, sondern auch an deren Stoffwechselprodukten führen. Ist beispielsweise der inhärente Δ5-Desaturase-Weg in einem Lebewesen funktionsgestört, so kann eine Behandlung mit ARA nicht nur zu erhöhten Konzentrationen an ARA führen, sondern auch zu Stromabprodukten von ARA wie Prostaglandinen (siehe 1). Komplexe Regulatormechanismen können es wünschenswert machen, verschiedene PUFA zu kombinieren oder verschiedene Konjugate von PUFA zuzusetzen, um solche(n) Mechanismen vorzubeugen, zu kontrollieren oder zu überwinden, um die erwünschten Konzentrationen spezifischer PUFA in einem Lebewesen zu erreichen.
NAHRUNGSMITTELZUSAMMENSETZUNGEN
Verfahren der vorliegenden Erfindung können Nahrungsmittelzusammensetzungen bereitstellen. Solche Zusammensetzungen umfassen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung jegliche Nahrung oder Präparate zur Einnahme durch Menschen, umfassend zur intestinalen oder parenteralen Einnahme, die, sofern sie in den Körper aufgenommen werden, (a) dazu dienen, zu ernähren oder Gewebe aufzubauen oder Energie zu liefern und/oder (b) einen adäquaten Ernährungszustand oder eine adäquate Stoffwechselfunktion aufrechtzuerhalten, wiederherzustellen oder zu unterstützen.
Die Nahrungsmittelzusammensetzungen umfassen zumindest ein Öl oder eine Säure, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurden und entweder in fester oder flüssiger Form vorliegen können. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung genießbare Makronährstoffe, Vitamine und Mineralstoffe in für eine bestimmte Verwendung erwünschten Mengen enthalten. Die Menge solcher Inhaltstoffe kann variieren, je nachdem ob die Zusammensetzung für den Einsatz bei normalen, gesunden Säuglingen, Kindern oder Erwachsenen gedacht ist, die besondere Bedürfnisse haben, wie jene z. B., die mit bestimmten Stoffwechselzuständen (z. B. Stoffwechselstörungen) einhergehen.
Beispiele für Makronährstoffe, die der Zusammensetzung zugesetzt werden können, umfassen genießbare Fette, Kohlenhydrate und Proteine, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele für solche genießbaren Fette umfassen Kokosnussöl, Sojaöl und Mono- und Diglyceride, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele für solche Kohlenhydrate umfassen Glucose, essbare Lactose und hydrolysierte Stärke, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Weiters umfassen Beispiele für Proteine, die in Nahrungsmittelzusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden können, Sojaproteine, elektrodialysierte Molke, elektrodialysierte Magermilch, Milchmolke oder die Hydrolysate dieser Proteine, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Hinsichtlich der Vitamine und Mineralstoffe kann Folgendes der Nahrungsmittelzusammensetzung der vorliegenden Erfindung zugesetzt werden: Calcium, Phosphor, Kalium, Natrium, Chlorid, Magnesium, Mangan, Eisen, Kupfer, Zink, Selen, Iod und Vitamin A, E, D, C sowie Vitamin-B-Komplex. Andere solche Vitamine und Mineralstoffe können auch zugesetzt werden.
Die in den Nahrungsmittelzusammensetzungen eingesetzten Komponenten sind halbgereinigten oder gereinigten Ursprungs. Unter "halbgereinigt" oder "gereinigt" wird ein Material verstanden, das durch Reinigung eines natürlichen Materials oder durch Synthese gewonnen wurde.
Beispiele für Nahrungsmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen Kindernahrung, Nahrungsmittelergänzungen und Rehydratisierungszusammensetzungen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Nahrungsmittelzusammensetzungen von besonderem Interesse umfassen jene, die für intestinale oder parenterale Verabreichung bei Säuglingen eingesetzt werden, spezielle Säuglingsformulierungen, Nahrungszusätze für ältere Personen und Nahrungszusätze für Personen, die unter Magen-Darm-Problemen und/oder schlechter Nahrungsmittelaufnahme leiden, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Nahrungsmittelzusammensetzungen
Eine typische Nahrungsmittelzusammensetzung, die durch die Erfindung produziert wird, enthält genießbare Makronährstoffe, Vitamine und Mineralstoffe in für eine bestimmte Verwendung erwünschten Mengen. Die Mengen solcher Inhaltstoffe variieren je nachdem, ob die Formulierung für normale, gesunde Personen, die kurzfristig Stress ausgesetzt sind, gedacht sind oder für Personen, die aufgrund von bestimmen chronischen oder akuten Erkrankungszuständen (z. B. Stoffwechselstörungen) spezielle Bedürfnisse zeigen. Fachleuten wird verständlich sein, dass die für die Nahrungsmittelzusammensetzung eingesetzten Komponenten halbgereinigten oder gereinigten Ursprungs sind. Unter halbgereinigtem oder gereinigtem Ursprung wird verstanden, dass ein Material durch Reinigung eines natürlichen Materials oder durch Synthese gewonnen wurde. Diese Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe z. B. Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10. Ausgabe, National Academy Press, Washington, D. C. (1989)).
Die Nahrungsmittelformulierung kann ein enterales Nahrungsmittelprodukt, noch bevorzugter ein enterales Nahrungsmittelprodukt für Erwachsene oder Kinder, sein. Die Formulierung kann zusätzlich zu den PUFA der Erfindung Makronährstoffe, Vitamine und Mineralstoffe in solchen Mengen umfassen, dass der tägliche Nahrungsmittelbedarf von Erwachsenen abgedeckt ist.
Die Makronährstoff-Komponenten umfassen genießbare Fette, Kohlenhydrate und Proteine. Beispielhafte genießbare Fette sind Kokosnussöl, Sojaöl und Mono- und Diglyceride sowie die durch die Erfindung produzierten PUFA-Öle. Beispielhafte Kohlenhydrate sind Glucose, essbare Lactose und hydrolysierte Maisstärke. Eine typische Proteinquelle wäre Sojaprotein, elektrodialysierte Molke oder elektrodialysierte Magermilch oder Milchmolke oder die Hydrolysate dieser Proteine, obwohl andere Proteinquellen auch verfügbar sind und eingesetzt werden können. Diese Makronährstoffe würden in Form von herkömmlich akzeptierten Nahrungsmittelverbindungen in Mengen zugesetzt werden, die jenen Mengen in menschlicher Milch entsprechen, oder in Mengen, die einer Energiegrundlage entsprechen, d. h. bezogen auf eine Kalorienbasis berechnet werden.
Verfahren zum Formulieren von flüssigen und enteralen Nahrungsmittelformulierungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden in den Beispielen ausführlich beschrieben.
Die enteralen Formulierungen können sterilisiert und anschließend auf einer zur Verabreichung fertigen Basis eingesetzt oder in konzentrierter Flüssigkeit oder einem Pulver gelagert werden. Das Pulver kann durch Sprühtrocknen der wie oben beschrieben hergestellten enteralen Formulierung hergestellt werden, und die Formulierung kann durch Rehydrieren des Konzentrats wieder in ihre ursprüngliche Form gebracht werden. Nahrungsmittelformulierungen für Erwachsene und Säuglinge sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und im Handel erhältlich (z. B. Similac^®, Ensure^®, Jevity^® und Alimentum^® von Ross Products Division, Abbott Laboratories). Ein Öl oder eine Säure der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebigen dieser Formulierungen in den nachstehend beschriebenen Mengen zugesetzt werden.
Die Energiedichte der Nahrungsmittelzusammensetzung in flüssiger Form kann typischerweise im Bereich von etwa 0,6 kcal bis 3,0 kcal pro ml liegen. In fester Form oder Pulverform kann der Nahrungsmittelzusatz von etwa 1,2 bis mehr als 9 kcal pro g, vorzugsweise 3 bis 7 kcal pro g, enthalten. Im Allgemeinen sollte die Osmolalität eines flüssigen Produkts bei weniger als 700 mOsm, und noch bevorzugter bei weniger als 660 mOsm, liegen.
Die Nahrungsmittelformulierung würde typischerweise Vitamine und Mineralstoffe zusätzlich zu den PUFA der Erfindung enthalten, um der Person zu helfen, die täglich erforderlichen Mindestmengen dieser Substanzen aufzunehmen. Zusätzlich zu den oben angeführten PUFA kann es auch wünschenswert sein, die Nahrungsmittelzusammensetzung mit Zink, Kupfer und Folsäure zusätzlich zu den Antioxidantien zu ergänzen. Es wird angenommen, dass diese Substanzen auch für eine Stärkung des beanspruchten Immunsystems sorgen und somit der einnehmenden Person weitere Vorteile bringt. Die Gegenwart von Zink, Kupfer oder Folsäure ist optional und nicht erforderlich, um die günstigen Wirkungen auf die Immunsuppression zu erlangen. So kann auch eine pharmazeutische Zusammensetzung mit eben diesen Substanzen ergänzt werden.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform enthält das Nahrungsmittel zusätzlich zu dem Antioxidans-System und der PUFA-Komponente eine Kohlenhydratquelle, worin zumindest 5 Gew.-% des Kohlenhydrats ein unverdauliches Oligosaccharid ist. In wiederum einer noch bevorzugteren Ausführungsform enthält die Nahrungsmittelzusammensetzung zusätzlich Protein, Taurin und Carnitin.
Die PUFA oder Derivate davon, die durch das offenbarte Verfahren hergestellt wurden, können als Nahrungsmittelersatzstoffe oder Nahrungsmittelergänzungen, insbesondere in Säuglingsformulierungen, für Patienten, die intravenös ernährt werden, oder zur Vorkehrung oder Behandlung von Unterernährung eingesetzt werden. Typischerweise hat menschliche Muttermilch ein Fettsäureprofil, das etwa 0,15% bis etwa 0,36% als DHA, etwa 0,03% bis etwa 0,13% als EPA, etwa 0,30% bis etwa 0,88% als ARA, etwa 0,22% bis etwa 0,67% als DGLA und etwa 0,27% bis etwa 1,04% als GLA umfasst. Zusätzlich dazu wurde herausgefunden, dass das dominierende Triglycerid in menschlicher Milch das 1,3-Dioleoyl-2-palmitoyl ist, wobei 2-Palmitoylglyceride bekanntlich besser absorbiert werden als 2-Oleoyl- oder 2-Lineoylglyceride (US-Patent Nr. 4.876.107). So können Fettsäuren wie ARA, DGLA, GLA und/oder EPA, die durch die Erfindung produziert wurden, eingesetzt werden, um die Zusammensetzung von Säuglingsformulierungen zu verändern, um die PUFA-Zusammensetzung menschlicher Muttermilch besser zu replizieren. Insbesondere umfasst eine Ölzusammensetzung für den Einsatz in pharmakologischen oder Nahrungsmittelergänzungen, insbesondere als Muttermilchersatz oder -ergänzung, vorzugsweise eine oder mehr von ARA, DGLA und GLA. Noch bevorzugter umfasst das Öl etwa 0,3 bis 30% ARA, etwa 0,2 bis 30% DGLA und etwa 0,2 bis etwa 30% GLA.
Zusätzlich zur Konzentration können auch die Verhältnisse von ARA, DGLA und GLA an eine bestimmte letztendliche Verwendung angepasst werden. Wird sie als eine Muttermilchergänzung oder ein Muttermilchersatz formuliert, so wird eine Ölzusammensetzung, die zwei oder mehr von ARA, DGLA und GLA enthält, in einem Verhältnis von etwa 1 : 19 : 30 bis etwa 6 : 1 : 0,2 bereitgestellt. Die Muttermilch von Tieren kann beispielsweise hinsichtlich der Verhältnisse von ARA : DGLA : DGL im Bereich von 1 : 19 : 30 bis 6 : 1 : 0,2 variieren, was Zwischenverhältnisse einschließt, die sich vorzugsweise auf 1 : 1 : 1, 1 : 2 : 1, 1 : 1 : 4 belaufen. Werden sie gemeinsam in einer Wirtszelle produziert, so kann das Einstellen der Geschwindigkeit und des Prozentsatzes der Umsetzung eines Vorläufersubstrats wie GLA und DGLA zu ARA eingesetzt werden, um die PUFA-Verhältnisse genau zu steuern. Beispielsweise kann eine Umsetzungsgeschwindigkeit von 5% bis 10% von DGLA zu ARA eingesetzt werden, um ein ARA : DGLA-Verhältnis von etwa 1 : 19 zu erhalten, während eine Umsetzungsgeschwindigkeit von etwa 75% bis 80% eingesetzt werden kann, um ein ARA : DGLA-Verhältnis von etwa 6 : 1 zu erhalten. Daher können, unabhängig davon, ob es sich um einen Zellkultursystem oder ein Wirtstier handelt, das Regulieren des Zeitpunkts, Ausmaß und Spezifität von Desaturase-Expression wie beschrieben ein gesetzt werden, um die PUFA-Konzentrationen und -Verhältnisse zu verändern. Je nach eingesetztem Expressionssystem, z. B. eine Zellkultur oder ein Wirtstier, das Öl(e) in seiner Milch exprimiert, können die Öle auch in den erwünschten Konzentrationen und Verhältnissen isoliert und rekombiniert werden. Die Mengen an Ölen, die diese Verhältnisse an PUFA bereitstellen, können gemäß Standardvorschriften bestimmt werden. PUFA oder Wirtszellen, die diese enthalten, können auch als Tierfuttermittelergänzungen eingesetzt werden, um die Zusammensetzung eines Tiergewebes oder von Milchfettsäure so zu verändern, dass sie für den Konsum durch Menschen oder Tiere eine erwünschte Form aufweisen.
Für Nahrungsmittelergänzungen können die gereinigten PUFA oder Derivate davon in Kochöle, Fette oder Margarine eingebunden werden, die so formuliert sind, dass bei normaler Verwendung der Verbraucher die erwünschte Menge zu sich nimmt. Die PUFA können auch in Säuglingsformulierungen, Nahrungsmittelzusätze oder andere Nahrungsmittelprodukte eingebunden werden und können Einsatz als entzündungshemmende oder Cholesterin-senkende Mittel finden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere der Säuren und/oder resultierenden Öle umfassen, können gemäß den hierin beschriebenen Verfahren produziert werden. Insbesondere kann solch eine pharmazeutische Zusammensetzung eine oder mehrere der Säuren und/oder Öle sowie einen herkömmlichen, bekannten, nicht toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein Adjuvans oder Hilfsmittel wie beispielsweise Phosphat-gepufferte Salzlösung, Wasser, Ethanol, Polyole, Pflanzenöle, ein Benetzungsmittel oder eine Emulsion wie eine Wasser/Öl-Emulsion umfassen. Die Zusammensetzung kann entweder in flüssiger oder fester Form vorliegen. Beispielsweise kann die Zusammensetzung in Form einer Tablette, einer Kapsel, einer einnehmbaren Flüssigkeit oder eines einnehmbaren Pulvers, injizierbar, einer topischen Salbe oder Creme vorliegen.
Verabreichungsmöglichkeiten umfassen beispielsweise orale, rektale und parenterale Verabreichung. Der Weg der Verabreichung hängt natürlich von der erwünschten Wirkung ab. Wird die Zusammensetzung beispielsweise eingesetzt, um rauhe, trockene oder alternde Haut zu behandeln, um verletzte oder verbrannte Haut zu behandeln oder um Haut oder Haar zu behandeln, die/das durch eine Erkrankung oder einen Krankheitszustand beeinträchtigt ist, so kann sie möglicherweise topisch eingesetzt werden.
Die Dosierung der dem Patienten zu verabreichenden Zusammensetzung kann durch einen Fachmann bestimmt werden und hängt von verschiedenen Faktoren wie Gewicht des Patienten, Alter des Patienten, Zustand des Immunsystems des Patienten usw. ab.
Hinsichtlich der Form kann die Zusammensetzung beispielsweise eine Lösung, eine Dispersion, eine Suspension, eine Emulsion oder ein steriles Pulver sein, das dann wieder hergestellt wird.
Zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung für kosmetische Zwecke eingesetzt werden. Sie kann bereits existierenden kosmetischen Zusammensetzungen zugesetzt werden, sodass ein Gemisch gebildet wird, oder sie kann als selbständige Zusammensetzung zum Einsatz kommen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können eingesetzt werden, um die PUFA-Komponente einer Person zu verabreichen. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können physiologisch annehmbare, sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen und sterile Pulver zur Aufbereitung zu sterilen Lösungen oder Dispersionen zur Einnahme umfassen. Beispiele für geeignete wässrige und nicht wässrige Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Hilfsmittel umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin und dergleichen), geeignete Gemische davon, Pflanzenöle (wie Olivenöl) und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Geeignete Fließfähig keit kann beispielsweise durch Aufrechterhalten der erwünschten Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch Einsatz von Tensiden aufrechterhalten werden. Auch kann es wünschenswert sein, isotonische Mittel einzuschließen, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Hilfsmittel wie Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, Süßstoffe, Geschmacks- und Geruchsmittel einschließen.
Suspensionen können, zusätzlich zu den aktiven Verbindungen, Suspensionsmittel wie beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Substanzen und dergleichen enthalten.
Feste Dosierungsformen wie Tabletten und Kapseln können mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können PUFA der Erfindung mit herkömmlichen Tablettengrundsubstanzen wie Lactose, Saccharose und Maisstärke in Kombination mit Bindemittel wie Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine, Auflösungsmittel wie Kartoffelstärke oder Alginsäure und ein Gleitmittel wie Stearinsäure oder Magnesiumstearat zu Tabletten geformt werden. Kapseln können durch Einbinden dieser Arzneimittelträger in eine Gelatinekapsel zusammen mit den Antioxidantien und den PUFA-Komponenten hergestellt werden. Die Menge an Antioxidantien und PUFA-Komponenten, die in die pharmazeutische Formulierungen eingebunden werden sollten, sollte auf die zuvor erläuterten Richtlinien abgestimmt werden.
In dieser Anmeldung bezieht sich der Begriff "Behandeln" auf die Vorkehrung oder die Minderung des Auftretens unerwünschter Symptome. Beispielsweise bezieht sich das Behandeln von Immunsuppression entweder auf das Unterbinden des Auftretens dieser Suppression oder auf das Reduzieren des Ausmaßes solcher Suppression. Die Bezeichnungen "Patient" und "Person" werden als Synonyme verwendet und beziehen sich beide auf ein Tier. Die Bezeichnung "Tier", wie sie in dieser An meldung eingesetzt wird, bezieht sich auf jedes warmblütige Säugetier, umfassend Hunde, Menschen, Affen und Menschenaffen, jedoch nicht darauf beschränkt. Die Bezeichnung "etwa", wie sie in dieser Anmeldung eingesetzt wird, bezieht sich auf eine Menge, die in Bezug auf den genannten Bereich oder der genannten Anzahl um, je nach Zusammenhang und Einsatzbereich, eine annehmbare Menge variieren kann. Jede zahlenmäßige Angabe einer Anzahl oder eines Bereichs, die in dieser Spezifikation spezifiziert ist, ist als Wert zu verstehen, den es durch das Adverb "etwa" zu modifizieren gilt.
"Dosis" und "Portion" werden als Synonyme eingesetzt und beziehen sich auf die Menge der Nahrungsmittelzusammensetzung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, die durch den Patienten in einer einzelnen Sitzung eingenommen wird und darauf abzielt, die wirksame Mengen der Antioxidantien und des strukturierten Triglycerids zuzuführen. Für Fachleute wird es offensichtlich sein, dass eine einzelne Dosis oder Portion des flüssigen Nahrungsmittelpulvers die zuvor erläuterte Menge an Antioxidantien und PUFA zuführen sollte. Die Menge der Dosis oder Portion sollte ein Volumen aufweisen, das ein typischer Erwachsener mit einmaliger Einnahme zu sich nehmen kann. Diese Menge kann je nach Alter, Gewicht, Geschlecht oder medizinischer Verfassung des Patienten stark variieren. Als allgemeinen Richtwert sollte eine einzelne Portion oder Dosis eines flüssigen Nahrungsmittelprodukts ein Volumen von 100 bis 600 ml, noch bevorzugter von 125 bis 500 ml, und am meisten bevorzugt von 125 bis 300 ml, umfassen.
Die PUFA können auch Nahrungsmitteln zugesetzt werden, sogar wenn eine Ergänzung der Ernährung nicht erforderlich ist. Beispielsweise kann die Zusammensetzung Nahrungsmitteln jeder Art zugesetzt werden, umfassend Margarine, modifizierte Butter, Käsesorten, Milch, Joghurt, Schokolade, Süßigkeiten, Snacks, Salatöle, Kochöle, Kochfette, Fleischsorten, Fische und Getränke.
Pharmazeutische Anwendungen
Zur pharmazeutischen Verwendung (bei Menschen oder Tieren) werden die Zusammensetzungen im Allgemeinen oral verabreicht, können jedoch auch über jeden anderen Weg verabreicht werden, über den sie gut aufgenommen werden können, so z. B. parenteral (d. h. subkutan, intramuskulär oder intravenös), rektal oder vaginal oder topisch, beispielsweise als eine Hautsalbe oder -lotion. Die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung produzierten PUFA können alleine oder in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger verabreicht werden. Sofern sie erhältlich sind, werden Gelatinekapseln zur oralen Verabreichung bevorzugt. Nahrungsmittelergänzungen, wie zuvor erläutert, können auch oral verabreicht werden. Die ungesättigten Säuren der vorliegenden Erfindung können in konjugierten Formen oder als Salze, Ester, Amide oder Prodrugs der Fettsäuren verabreicht werden. Bevorzugte, pharmazeutisch annehmbare Salze sind Natrium-, Kalium- oder Lithiumsalze. Auch eingebunden sind die N-Alkylpolyhydroxaminsalze, wie N-Methylglucamin, zu finden in der PCT-Veröffentlichung WO 96/33.155. Die bevorzugten Ester sind Ethylester. Als feste Salze können die PUFA auch in Tablettenform verabreicht werden. Zur intravenösen Verabreichung können die PUFA oder Derivate davon in handelsübliche Formulierungen wie Arten von Intralipid eingebunden werden. Das typische, normale Plasma-Fettsäurenprofil bei Erwachsenen umfasst 6,64 bis 9,46% ARA, 1,45 bis 3,11% DGLA und 0,02 bis 0,08% GLA. Diese PUFA oder deren Stoffwechselvorläufer können entweder alleine oder in Gemischen mit anderen PUFA verabreicht werden, um ein normales Fettsäureprofil beim Patienten zu erlangen. Sofern erwünscht können die einzelnen Komponenten der Formulierungen in Sets einzeln bereitgestellt werden, und zwar für einfachen oder mehrfachen Einsatz. Eine typische Dosierung einer bestimmten Fettsäure liegt im Bereich von 0,1 mg bis 20 g, oder sogar 100 g, täglich und liegt vorzugsweise, je nach Bedarf, im Bereich von 10 mg bis 1, 2, 5, oder 10 g täglich, oder im Bereich molarer äquivalenter Mengen von Derivatformen davon. Parenterale Nahrungsmittelzusammensetzungen, die durch die Verfahren der Erfindung produziert wurden, können etwa 2 bis etwa 30 Gew.-% Fettsäuren, die als Triglyceride berechnet werden, um fassen; bevorzugt ist eine Zusammensetzung mit etwa 1 bis etwa 25 Gew.-% der gesamten PUFA-Zusammensetzung als GLA (US-Patent Nr. 5.196.198). Andere Vitamine, und insbesondere fettlösliche Vitamine wie Vitamin A, D, E und L-Carnitin, können gegebenenfalls eingebunden werden. Sofern erwünscht kann ein Konservierungsmittel wie α-Tocopherol zugesetzt werden, typischerweise mit etwa 0,1 Gew.-%.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können physiologisch annehmbare, sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen und sterile Pulver zur Aufbereitung zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen umfassen. Beispiele für geeignete wässrige und nicht wässrige Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Hilfsmittel umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin und dergleichen), geeignete Gemische davon, Pflanzenöle (wie Olivenöl) und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Geeignete Fließfähigkeit kann beispielsweise durch Aufrechterhalten der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersionen und durch Einsatz von Tensiden aufrechterhalten werden. Auch kann es wünschenswert sein, isotonische Mittel einzubinden, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Hilfsmittel wie Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, Süßstoffe, Geschmacks- und Geruchsmittel einschließen.
Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspensionsmittel, wie beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Substanzen und dergleichen enthalten.
Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung enthält Diacetyl-Weinsäureester von Mono- und Diglyceriden, die in einem wässrigen Medium oder einem wässrigen Lösungsmittel gelöst sind. Diacetyl-Weinsäureester von Mono- und Diglyceriden haben einen HLB-Wert von etwa 9–12 und sind signifikant stärker hy drophil als existierende antimikrobielle Lipide, die HLB-Werte von 2–4 aufweisen. Diese existierenden hydrophoben Lipide können nicht zu wässrigen Zusammensetzungen formuliert werden. Wie hierin offenbart können diese Lipide nun in Kombination mit Diacetyl-Weinsäureester von Mono- und Diglyceriden in einem wässrigen Medium löslich gemacht werden. Gemäß dieser Ausführungsform werden Diacetyl-Weinsäureester von Mono- und Diglyceriden (z. B. DATEM-C12:0) mit anderen aktiven antimikrobiellen Lipiden (z. B. 18:2- und 12:0-Monoglyceriden) geschmolzen und vermischt, um ein homogenes Gemisch zu erhalten. Homogenität ermöglicht erhöhte antimikrobielle Aktivität. Das Gemisch kann in Wasser völlig dispergiert werden. Dies ist ohne Zusatz von Diacetyl-Weinsäureestern von Mono- und Diglyceriden und das Vorvermischen mit anderen Monoglyceriden, bevor es ins Wasser eingeführt wird, nicht möglich. Die wässrige Zusammensetzung kann dann unter sterilen Bedingungen mit physiologisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Puffern oder Treibmitteln gemischt werden, was erforderlich sein kann, um ein Spray oder ein Inhalationsmittel zu bilden.
Ergänzungen mit PUFA, die unter Einsatz der Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert wurden, können eingesetzt werden, um Restenose nach Angioplastie zu behandeln. Symptome von Entzündungen, Gelenkrheumatismus, Asthma und Psoriasis können mit den PUFA der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Nachweise zeigen auf, dass PUFA in den Calciumstoffwechsel eingebunden sein können, was darauf schließen lässt, dass PUFA der vorliegenden Erfindung zur Behandlung oder Prävention von Osteoporose und von Nieren- oder Harnwegssteinen eingesetzt werden können.
Die PUFA können zur Krebsbehandlung eingesetzt werden. Es wurde gezeigt, dass bösartige Zellen veränderte Fettsäurezusammensetzungen haben; auch wurde nachgewiesen, dass der Zusatz von Fettsäuren eine Verlangsamung des Wachstums dieser Zellen und sogar den Zelltod verursachte und dass er die Empfänglichkeit für chemotherapeutische Mittel steigerte. Für GLA wurde gezeigt, dass sie an Krebszellen die Reexpression der E-Cadherin-Zelladhäsionsmoleküle, auslöst, deren Verlust in Verbindung mit aggressiver Metastase steht. Klinische Tests intravenöser Verabreichung des wasserlöslichen Lithiumsalzes von GLA an Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs produzierte statistisch signifikante Steigerung der Überlebenschancen dieser Patienten. PUFA-Ergänzung kann auch für die Behandlung von Kachexie in Verbindung mit Krebs nützlich sein.
Die PUFA können auch eingesetzt werden, um Diabetes zu behandeln (US-Patent Nr. 4.826.877); Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. 57 (Ergänzung), 732–737). Bei diabetischen Tieren wurde veränderter Fettsäuremetabolismus und veränderte Fettsäurenzusammensetzung nachgewiesen. Es wird angenommen, dass diese Veränderungen in manche der längerfristigen Komplikationen eingebunden sind, die im Zusammenhang mit Diabetes stehen, umfassend Retinopathie, Neuropathie, Nephropathie und Schäden am Fortpflanzungssystem. Für das Öl der Nachtkerze, das GLA enthält, wurde gezeigt, dass es durch Diabetes provozierten Nervenschäden vorbeugt und diese auch behebt.
Die PUFA können eingesetzt werden, um Ekzeme zu behandeln, Blutdruck herabzusetzen und Ergebnisse bei Rechenaufgaben zu verbessern. Essentieller Fettsäuremange) scheint in die Ekzembildung eingebunden zu sein, und Studien zeigten positive Auswirkungen auf Ekzeme durch die Behandlung mit GLA. Für GLA wurde auch gezeigt, dass sie erhöhten Blutdruck, der in Verbindung mit Stress steht, reduziert und die Leistung bei Rechentests verbessert. Für GLA und DGLA wurde auch festgestellt, dass sie Blättchen-Aggregation hemmt, gefäßerweiternd wirkt, den Cholesterinspiegel senkt und die Vermehrung von glatten Muskeln und Fasergewebe an der Gefäßwand unterbindet (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. 83, 85–101 (1976)). Die Verabreichung von GLA oder DGLA, alleine oder in Kombination mit EPA, erwies sich als förderlich für die Reduktion oder Prävention von gastrointestinalen Blutungen und anderen Nebenwirkungen, die durch nichtsteroide, entzündungshemmende Arzneimittel verursacht werden (US-Patent Nr. 4.666.701). GLA und DGLA erwiesen sich auch als förderlich für die Prävention oder Behandlung von Endometriose und Menstruationsbeschwerden (US-Patent Nr. 4.758.592) und für die Behandlung von myalgischer Enzephalomyelitis und chronischer Müdigkeit nach Virusinfektionen (US-Patent Nr. 5.116.871).
Weitere Einsatzmöglichkeiten für die gemäß den Verfahren dieser Erfindung hergestellten PUFA umfassen den Einsatz bei der Behandlung von AIDS, multipler Sklerose, akutem Atemwegsyndrom, Bluthochdruck und Entzündungs-Hauterkrankungen. Die PUFA können auch in Formulierungen für allgemeine Gesundheitsmittel sowie zur geriatrischen Behandlung eingesetzt werden.
Anwendungen in der Tiermedizin
Es gilt anzumerken, dass die zuvor beschriebenen, pharmazeutischen Zusammensetzung und Nahrungsmittelzusammensetzungen bei Tieren sowie bei Menschen eingesetzt werden können, da Tiere zahlreiche ähnliche Bedürfnisse und Gesundheitszustände wie Menschen haben und erleben. Beispielsweise können die Öle oder Säuren der vorliegenden Erfindung in Tierfuttermittelzusätzen eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung dargebracht und nicht als Einschränkung zu verstehen.
Beispiele

Beispiel 1 Isolieren einer Δ5-Desaturase-Nucleotidsequenz von Mortierella alpina
Beispiel 2 Expression von M.-alpina-Δ5-Desaturase-Klonen in Bäckerhefe
Beispiel 3 Anfängliche Optimierung von Kulturbedingungen
Beispiel 4 Verteilung von PUFA in Hefelipidfraktionen
Beispiel 5 Weitere Kulturoptimierung
Beispiel 6 Identifikation von Homologen zu M.-alpina-Δ5- und -Δ6-Desaturasen
Beispiel 7 Identifikation von M.-alpina-Δ5- und -Δ6-Homologen in anderen PUFA-produzierenden Organismen
Beispiel 8 Identifikation von M.-alpina-Δ5- und -Δ6-Homologen in anderen PUFA-produzierenden Organismen
Beispiel 9 Menschliche Desaturase-Sequenzen
Beispiel 10 Nahrungsmittelzusammensetzungen

Beispiel 1
Isolieren einer Δ5-Desaturase-Nucleotidsequenz von Mortierella alpina
Mortierella alpina produziert Arachidonsäure (ARA, 20:4) vom Vorläufer 20:3 durch eine Δ5-Desaturase. Eine Nucleotidsequenz, die für die Δ5-Desaturase von Mortierel-la alpina kodiert, wurde durch PCR-Amplifikation unter Einsatz von M.-alpina-Erststrang-cDNA und degenerierten Oligonucleotid-Primern, die Aminosäuresequenzen entsprechen, die zwischen Δ6-Desaturasen von Synechocystis und Spirulina konserviert sind, erhalten. Das eingesetzte Verfahren wurde wie folgt durchgeführt:
Gesamt-RNA wurde aus einer 3 Tage alten, PUFA-produzierenden Kultur von Mortierella alpina unter Einsatz der Arbeitsvorschrift von Hoge et al., Experimental Mycology 6, 225–232 (1982), isoliert. Die RNA wurde eingesetzt, um doppelsträngige cDNA unter Verwendung des lambda-ZipLox-Systems von BRL gemäß den Anleitungen des Herstellers herzustellen. Mehrere Größenfraktionen der M.-alpina-cDNA wurden getrennt gepackt, um Bibliotheken mit unterschiedlichen mittelgroßen Inserts zu erhalten. Die "Volllängen"-Bibliothek enthält etwa 3 × 10⁶ Klone mit einer mittleren Insertgröße von 1,77 kb. Die Bibliothek mit "Sequenzierungsreinheit" enthält etwa 6 × 10⁵ Klone mit einer mittleren Insertgröße von 1,1 kb.
5 μg von Gesamt-RNA wurden unter Verwendung von BRL-Superscript-RTase und dem Primer TSyn (5'-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3'), Seq.-ID Nr. 10, revers transkribiert. Degenerierte Oligonucleotide wurden auf Regionen abgestimmt, die zwischen den zwei cyanobakteriellen Δ6-Desaturasesequenzen konserviert sind. Die eingesetzten, spezifischen Primer waren D6DESAT-F3 (Seq.-ID Nr. 8) (5'-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3') und D6DESAT-R3 (Seq.-ID Nr. 9) (5'-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3'), worin Y = C + T, R = A + G und O = I + C ist. PCR-Amplifikation wurde in einem 25-μl-Volumen durchgeführt, das Folgendes enthielt: Matrize, abgeleitet von 40 ng Gesamt-RNA, 2 pM von jedem Primer, 200 μM von jedem Desoxyribonucleotid-triphosphat, 60 mM Tris-Cl, pH 8,5, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂. Proben wurden einem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 95 Grad (alle Temperaturen in °C) 5 Minuten lang unterzogen und dann bei 72 Grad gehalten, während 0,2 U Taq-Polymerase zugesetzt wurden. PCR-Temperaturwechselbedingungen waren wie folgt festgelegt: 94 Grad 1 min lang, 45 Grad 1,5 min lang, 72 Grad 2 min lang. PCR wurde 35 Zyklen lang fortgesetzt. PCR unter Verwendung dieser Primer an der M.-alpina-Erststrang-cDNA produzierte ein 550-bp-Reaktionsprodukt. Ein Vergleich mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des M.-alpina-PCR-Fragments Seq.-ID Nr. 3 zeigte die Homologieregionen mit Δ6-Desaturasen auf (siehe 5). Es wurde jedoch nur eine etwa 28%ige Identität mit der Vergleichsregion festgestellt.
Das PCR-Produkt wurde als eine Sonde eingesetzt, um entsprechende cDNA-Klone aus einer M.-alpina-Bibliothek zu isolieren. Der längste cDNA-Klon, Ma29, wurde als pCGN5521 bezeichnet und war an beiden Strängen zur Gänze sequenziert. Die cDNA ist als ein 1481-bp-Insert im Vektor pZL1 enthalten (Bethesda Research Laboratories) und enthält, beginnend mit dem ersten ATG, einen offenen Leseraster, der für 446 Aminosäuren kodiert. Der Leseraster enthält die vom PCR-Fragment abgelei tete Sequenz. Für die Sequenz des cDNA-Inserts wurde festgestellt, dass sie Homologie-Regionen mit Δ6-Desaturasen enthält (siehe 5). Die Gegenwart von drei konservierten "Histidin-Boxen" beispielsweise (die in Membran-gebundenen Desaturasen beobachtet wurden (Okuley et al., The Plant Cell 6, 147–158 (1994))) in der Mortierella-Sequenz an Aminosäurepositionen 171–175, 207–212 und 387–391 wurde nachgewiesen (siehe 3). Das typische "HXXHH"-Aminosäuremotiv für die dritten Histidin-Box für die Mortierella-Desaturase wurde also als QXXHH, Seq.-ID Nr. 11–12, festgestellt. Überraschenderweise zeigte der Amino-Terminus des kodierten Proteins signifikante Homologie mit Cytochrom-b5-Proteinen. So scheint der Mortierella-cDNA-Klon eine Fusion zwischen einem Cytochrom-b5 und einer Fettsäure-Desaturase darzustellen. Da von Cytochrom-b5 angenommen wird, dass es als der Elektronenspender für Membran-gebundene Desaturase-Enzyme funktioniert, ist es möglich, dass die N-terminale Cytochrom-b5-Domäne dieses Desaturase-Proteins in seine Funktion eingebunden ist. Dies kann von Vorteil sein, wenn die Desaturase in heterologen Systemen zur PUFA-Produktion exprimiert wird.
Beispiel 2
Expression von M.-alpina-Desaturaseklonen in Bäckerhefe Hefetransformation
Lithiumacetat-Transformation von Hefe wurde gemäß den Standardvorschriften durchgeführt (Methods in Enzymology 194, 186–187 (1991)). Kurz beschrieben wurde Hefe in YPD bei 30°C gezüchtet. Zellen wurden zentrifugiert, in TE resuspendiert, neuerlich zentrifugiert, in TE, das 100 mM Lithiumacetat enthielt, resuspendiert, wiederum zentrifugiert und in TE/Lithiumacetat resuspendiert. Die resuspendierte Hefe wurde bei 30°C 60 Minuten lang unter Schütteln inkubiert. Träger-DNA wurde zugesetzt, und die Hefe wurde in Röhrchen gleichmäßig aufgeteilt. Transformierende DNA wurde zugesetzt, und die Röhrchen wurden 30 Minuten lang bei 30°C inkubiert. PEG-Lösung (35% (Gew./Vol.) PEG 4000, 100 mM Lithiumacetat, TE pH 7,5) wurde zugesetzt, wonach eine 50-minütige Inkubation bei 30°C folgte. Ein 5- minütiger Hitzeschock bei 42°C wurde durchgeführt, die Zellen wurden pelletiert, mit TE gewaschen, wiederum pelletiert und in TE resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden dann auf selektiven Medien ausplattiert.
Desaturase-Expression in transformierter Hefe
Die cDNA-Klone von Mortierella alpina wurde auf Desaturase-Aktivität in Bäckerhefe gescreent. Eine Canola-Δ15-Desaturase (erhalten durch PCR unter Verwendung Erststrang-cDNA von Samen der Sorte Brassica napus 212/86 unter Einsatz von Primern, die auf der veröffentlichten Sequenz basieren (Arondel et al., Science 258, 1353–1355)) wurde als eine positive Kontrolle eingesetzt. Das Δ15-Desaturasegen und das Gen vom cDNA-Klon Ma29 wurden in den Expressionsvektor pYES2 (Invitrogen) eingeführt, was die Plasmide pCGR-2 bzw. pCGR-4 ergab. Diese Plasmide wurden in S.-cerevisiae-Hefestamm 334 transfiziert und nach Induktion mit Galactose und in Gegenwart von Substraten exprimiert, die die Detektion spezifischer Desastuaase-Aktivität ermöglichten. Der Kontrollstamm war S.-cerevisiae-Stamm 334, der den nicht veränderten pYES2-Vektor enthielt. Die eingesetzten Substrate, die produzierten Produkte und die angegebene Desaturase-Aktivität waren: DGLA (Umsetzung zu ARA würde Δ5-Desaturase-Aktivität angeben), Linolensäure (Umsetzung zu GLA würde Δ6-Desaturase-Aktivität angeben; Umsetzung zu ALA würde Δ15-Desaturase-Aktivität angeben), Oleinsäure (ein endogenes Substrat, hergestellt durch S. cerevisiae, Umsetzung zu Linolensäure würde Δ12-Desaturase-Aktivität angeben, die S. cerevisiae fehlt), oder ARA (Umsetzung zu EP würde Δ17-Desaturase-Aktivität angeben). Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Die Lipidfraktionen wurden wie folgt extrahiert: Die Kulturen wurden 48–52 Stunden bei 15°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren pelletiert, einmal im sterilem ddH₂O gewaschen und wieder pelletiert. Die Pellets wurden mit Methanol gerührt; Chloroform wurde zusammen mit Tritridecanoin (als innerer Standard) zugesetzt. Die Gemische wurden zumindest eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Chloroformphase wurde extrahiert und durch ein Whatman-Filter mit einem Gramm wasserfreiem Natriumsulfat filtriert, um Partikel und verbleibendes Wasser zu entfernen. Die organischen Lösungsmittel wurden bei 40° unter einem Stickstoffstrom abgedampft. Die extrahierten Lipide wurden dann zur Gaschromatographie-Analyse (GC) durch Zusetzen von 2 ml von 0,5 N Kaliumhydroxid in Methanol zu einer geschlossenen Röhrchen zu Fettsäuremethylestern (FAME) derivatisiert. Die Proben wurden auf 95°C bis 100°C 30 Minuten lang erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Etwa 2 ml von 14%igem Bortrifluorid in Methanol wurden zugesetzt, und das Erhitzen wurde wiederholt. Nachdem das extrahierte Lipidgemisch abgekühlt worden war, wurden 2 ml Wasser und 1 ml Hexan zugesetzt, um die FAME zur Analyse durch GC zu extrahieren. Die prozentuelle Umsetzung wurde durch Dividieren des produzierten Produkts durch die Summe von (produziertem Produkt und zugesetztem Substrat] und durch anschließendes Multiplizieren mit 100 errechnet. Zur Berechnung der prozentuellen Oleinsäure-Umsetzung wurde die gesamte produzierte Linolensäure durch die Summe von [produzierter Oleinsäure und Linolensäure] dividiert und anschließend mit 100 multipliziert, da kein Substrat zugesetzt wurde.
Tabelle 1 M.-alpina-Desaturase-Expression in Bäckerhefe
Der Δ15-Desaturase-Kontrollklon wies 16,3% Umsetzung des Substrats auf. Der pCGR-4-Klon, der die Ma29-cDNA exprimierte, setzte 15,3% des 20:3-Substrats zu 20:4ω6 um, was darauf hinweist, dass das Gen für eine Δ5-Desaturase kodiert. Der Hintergrund (nicht spezifische Umsetzung des Substrats) lag zwischen 0–3% in diesen Fällen. Durch Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Substrats fanden die Erfinder auch Substratinhibition der Aktivität. Wurde Substrat auf 100 μM zugesetzt, so fiel die prozentuelle Umsetzung zum Produkt im Vergleich dazu, wenn Substrat auf 25 μM zugesetzt wurde (siehe unten). Weiters lag die prozentuelle Umsetzung von DGLA zu ARA durch Variieren der DGLA-Substratskonzentrationen, zwischen etwa 5 μM und etwa 200 μM, im Bereich von etwa 5% bis 75% mit der M.-alpina-Δ5-Desaturase.
Diese Daten zeigen, dass Desaturasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten in einem heterologen System exprimiert und eingesetzt werden können, um mehrfach ungesättigte, langkettige Fettsäuren herzustellen.
Tabelle 2 zeigt Fettsäuren von Interesse als Prozentsatz des gesamten, aus dem Hefewirt S. cerevisiae 334 mit dem angegebenen Plasmid extrahierten Lipids. Im Nährmedium war keine Glucose vorhanden. Affinitäts-Gaschromatographie wurde eingesetzt, um die jeweiligen Lipide zu trennen. GC/MS wurde verwendet, um die Identität des Produkts/der Produkte zu verifizieren. Das erwartete Produkt für die B.-napus-Δ15-Desaturase, α-Linolensäure, wurde nachgewiesen, wenn sein Substrat, Linolensäure, der induzierten Hefekultur exogen zugesetzt wurde. Diese Erkenntnis zeigt, dass Hefe-Expression eines Desaturasegens funktionelle Enzyme und nachweisbare Mengen des Produkts unter den gängigen Wachstumsbedingungen produzieren kann. Beide exogen zugesetzten Substrate wurden von der Hefe aufgenommen, obwohl geringfügig weniger von der langkettigen PUFA, Dihomo-γ-Linolensäure (20:3), in Hefe aufgenommen wurde als Linolensäure (18:2), wenn beide den induzierten Hefekulturen in freier Form zugesetzt wurden. Arachidonsäure wurde als eine neue PUFA in Hefe nachgewiesen, wenn Dihomo-γ-linolensäure als das Substrat zu S. cerevisiae 334 (pCGR-4) zugesetzt wurde. Dies identifiziert pCGR-4 (Ma29) als die Δ5-Desaturase von M. alpina. Davor wurde keine Isolierung und Expression einer Δ5-Desaturase von jeglicher Quelle festgestellt.
Beispiel 3
Optimierung von Kulturbedingungen
Tabelle 3A zeigt die Wirkung von Substratskonzentration exogener freier Fettsäuren auf die Hefeaufnahme und die Umsetzung zu Fettsäureprodukten als einen Prozentsatz des gesamten extrahierten Hefelipids. In allen Fällen führten geringe Mengen an exogenem Substrat (1–10 μM) zu geringer Aufnahme an Fettsäuresubstrat und Produktbildung. Eine Konzentration an freier Fettsäure im Wachstums- und Induktionsmedium zwischen 25 und 50 μM brachte den höchsten Prozentsatz an gebildetem Fettsäureprodukt, während eine Konzentration von 100 μM und die darauf folgende hohe Aufnahme in Hefe die Desaturase-Aktivität zu reduzieren oder zu hemmen schienen. Die Feedback-Hemmung von hoher Fettsäuren-Substratskonzentration wurde durch Vergleich der prozentuellen Umsetzungsraten der jeweiligen Fettsäuresubstrate mit ihren jeweiligen Produkten in Tabelle 3B gut veranschaulicht. In allen Fällen senkten 100 μM Substratskonzentration im Wachstumsmedium die prozentuelle Umsetzung zum Produkt. Die Wirkung der Mediumszusammensetzung zeigte sich auch eindeutig, als Glucose im Wachstumsmedium für die Δ5-Desaturase vorhanden war, da der Prozentsatz der Substrats-Aufnahme bei 25 μM zurückging (Tabelle 3A). In Gegenwart von Glucose im Wachstumsmedium stieg jedoch die prozentuelle Umsetzung durch Δ5-Desaturase um 18%, und der Prozentsatz des gebildeten Produkts blieb derselbe. Tabelle 3A Wirkung des zugesetzten Substrats auf den Prozentsatz des inkorporierten Substrats und des gebildeten Produkts in Hefeextrakten
Tabelle 3B Wirkung der Substratskonzentration im Medium auf die prozentuelle Umsetzung von Fettsäuresubstrat zum Produkt in Hefeextrakten

♢: keine Glucose im Medium
sub.: Substratskonzentration
NE: nicht erfolgt

Tabelle 4 zeigt die Menge an Fettsäure, die durch eine rekombinante Desaturase von induzierten Hefekulturen produziert wurde, wenn unterschiedliche Mengen an freiem Fettsäuresubstrat eingesetzt wurden. Das Gewicht der Fettsäure wurde bestimmt, da die Gesamtmenge an Lipid drastisch variierte, wenn die Wachstumsbedingungen verändert wurden, wie beispielsweise die Gegenwart von Glucose im Hefe-Wachstums- und -Induktionsmedium. Um die Bedingungen besser zu bestimmen, bei denen die rekombinante Desaturase die größte Menge an PUFA-Produkt produzieren würde, wurde die Menge der einzelnen Fettsäuren untersucht. Die Abwesenheit von Glucose reduzierte die Menge an durch Δ5-Desaturase produzierter Arachidonsäure um die Hälfte. Im Fall von Δ5-Desaturase wurde die Menge des Gesamthefelipids bei Abwesenheit von Glucose um beinahe die Hälfte reduziert. Tabelle 4 Produzierte Fettsäure in μg aus Hefeextrakten

Beispiel 4
Verteilung von PUFA in Hefelipidfraktionen
Tabelle 5 illustriert die Aufnahme von freien Fettsäuren und deren neue Produkte, die in Hefelipiden gebildet werden, wie sie in den Hauptlipidfraktionen verteilt sind.
Ein gesamter Lipidextrakt wurde wie oben beschrieben hergestellt. Der Lipidextrakt wurde auf DC-Platten getrennt, und die Fraktionen wurden durch den Vergleich mit Standards identifiziert. Die Banden wurden durch Abschaben gesammelt, und innere Standards wurden zugesetzt. Die Fraktionen wurden dann wie oben verseift und methyliert und Gaschromatographie unterzogen. Der Gaschromatograph berechnete die Menge an Fettsäure durch Vergleich mit einem Standard. Es würde scheinen, dass die Substrate in der Phospholipidform für die Desaturasen zugänglich sind. Tabelle 5 Fettsäurenverteilung in verschiedenen Hefelipidfraktionen in μg

SC: S. cerevisiae (Plasmid)

Beispiel 5
Weitere Kulturoptimierung
Die Wachstums- und Induktionsbedingungen für optimale Aktivitäten von Desaturasen in Saccharomyces cerevisiae wurden bewertet. Verschiedene Kulturbedingungen, die für optimale Aktivität manipuliert wurden, waren: i) Induktionstemperatur, ii) Induktorkonzentration, iii) Zeitpunkt der Substratszugabe, iv) Substanzkonzentration, v) Zuckerquelle, vi) Wachstumsphase bei Induktion. Diese Studien wurden unter Einsatz des Δ5-Desaturasegens von Mortierella alpina (MA 29) durchgeführt. Weiters wurde auch die Wirkung der Veränderung des Wirtsstammes auf die Expression des Δ5-Desaturasegens bestimmt.
Wie zuvor beschrieben wurde die beste Umsetzungsrate des Substrats zu ARA bei einer Substratskonzentration von 1 μM beobachtet, wobei jedoch der Prozentsatz von ARA in den gesamten Fettsäuren bei 25 μM Substratskonzentration am höchsten war. Um zu bestimmen, ob das Substrat zu einer leicht verfügbaren Form modifiziert werden musste, bevor es durch die Desaturase verwendet werden konnte, wurde das Substrat entweder 15 Stunden vor Induktion oder gleichzeitig mit dem In duktorzusatz zugesetzt (in 6A als "danach" angegeben). Wie aus 6A ersichtlich ist, hatte der Zusatz von Substrat vor der Induktion keine signifikante Wirkung auf die Aktivität von Δ5-Desaturase. Tatsächlich war der Zusatz von Substrat zusammen mit dem Induktor geringfügig besser für Expression/Aktivität von Δ5-Desaturase, da die ARA-Konzentrationen in den gesamten Fettsäuren höher waren. Die Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt war jedoch leicht niedriger.
Die Wirkung der Induktorkonzentration auf Expression/Aktivität von Mortierella-Δ5-Desaturase wurde durch Induzieren von SC334/pCGR5 mit 0,5 oder 2% (Gew./Vol.) Galactose untersucht. Wie in den 7A und 7B gezeigt war die Expression von Δ5-Desaturase höher, wenn sie mit 0,5% Galactose induziert wurde. Weiters war die Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt auch besser, wenn SC334/pCGR5 mit 0,5% Galactose im Vergleich zu 2% Galactose induziert wurde.
Um die Wirkung der Temperatur auf Δ5-Desaturase-Aktivität zu bestimmen, wurde der SC334-Wirtsstamm, transformiert mit pCGR5 (SC334/pCGR5), gezüchtet und bei 15°C, 25°C, 30°C und 37°C induziert. Die Menge an ARA (20:4n6), die in SC334/pCGR5-Kulturen hergestellt wurde, ergänzt mit Substrat 20:3n6, wurde durch Fettsäureanalyse gemessen. 8A zeigt die Menge an 20:3n6 und 20:4n6, dargestellt als Prozentsatz der gesamten Fettsäuren. 8B zeigt die Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt. Wachstum und Induktion von SC334/pCGRS bei 25°C war das beste für die Expression von Δ5-Desaturase, nachgewiesen durch die höchsten Konzentrationen an Arachidonsäure in den gesamten Fettsäuren. Darüber hinaus trat auch die höchste Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt bei 25°C zu Tage.
Wachstum und Induktion bei 15°C ergaben die geringste Expression von ARA, wobei bei 37°C die Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt am geringsten war.
Die Wirkung von Hefestämmen auf die Expression des Δ5-Desaturasegens wurde an 5 verschiedenen Hefestämmen untersucht; INVSC1, INVSC2, YTC34, YTC41 und SC334 bei 15°C und bei 30°C. Bei 15°C hatte SC334 den höchsten Prozentsatz an ARA in den gesamten Fettsäuren, was auf eine höhere Aktivität von Δ5-Desaturase in SC334 schließen lässt. Die Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt war jedoch bei SC334 die niedrigste und bei INVSC1 die höchste (9A und B). Bei 30°C wurde der höchste Prozentsatz an Produkt (ARA) in den gesamten Fettsäuren für INVSC2 beobachtet, obwohl die Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt bei INVSC2 leicht niedriger war als bei INVSC1 (10A und B).
ARA, das Produkt von Δ5-Desaturase, wurde in der Phospholipid-Fraktion gespeichert (Beispiel 4). Daher ist die Menge der in Hefe produzierten ARA durch die Menge eingeschränkt, die in der Phospholipidfraktion gespeichert werden kann. Könnte ARA auch in anderen Fraktion wie der Triglyceridfraktion gespeichert werden, so könnte die Menge an in Hefe produzierter ARA gesteigert werden. Um diese Hypothese zu testen, wurde das Δ5-Desaturasegen im Hefe-Wirtsstamm DBY746 (erhalten bei Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720) exprimiert. Der Genotyp von Stamm DBY746 ist Mata, his3-Δ1, leu2-3, leu2-112, ura3-32, trp1-289, gal. Der DBY746-Hefestamm hat ein endogenes Gen für Cholintransferase. Die Gegenwart dieses Enzyms kann dem DBY746-Stamm die Fähigkeit verleihen, überschüssige Phospholipide zu Triglycerid-Fraktionen umzusetzen. Die Resultate in 11 zeigen keinen Anstieg in der Umsetzung von Substrat zu Produkt im Vergleich zu SC334, das das Gen für Cholintransferase nicht aufweist.
Um die Wirkung des Mediums auf die Expression von Δ5-Desaturase zu untersuchen, wurde pCGR4/SC334 in vier verschiedenen Medien bei zwei unterschiedlichen Temperaturen (15°C und 30°C) und in zwei verschiedenen Wirtsstämmen (SC334 und INVSC1) gezüchtet. Die Zusammensetzung der Medien war wie folgt:
Medium A: mm-Ura, + 2% Galactose + 2% Glucose
Medium B: mm-Ura, + 20% Galactose + 2% Glucose + 1 M Sorbit (pH 5,8)
Medium C: mm-Ura, + 2% Galactose + 2% Raffinose
Medium D: mm-Ura, + 2% Galactose + 2% Raffinose + 1 M Sorbit (pH 5,8)
mm = Minimalmedium
Die Ergebnisse zeigen, dass die höchste Umsetzungsrate von Substrat zu Produkt bei 15°C in SC334 in Medium A beobachtet wurde. Die höchste Umsetzungsrate insgesamt von Δ5-Desaturase in SC334 wurde bei 30°C in Medium D festgestellt. Die höchste Umsetzungsrate von Δ5-Desaturase in INVSC1 wurde auch bei 30°C in Medium D verzeichnet (die 12A und 12B).
Diese Daten zeigen, dass eine DNA, die für eine Desaturase kodiert, die DGLA zu ARA umsetzen kann, von Mortierella alpina isoliert, in einem heterologen System exprimiert werden kann und eingesetzt werden kann, um mehrfach ungesättigte, langkettige Fettsäuren zu produzieren. Als Beispiel dargestellt ist die Herstellung von ARA aus dem Vorläufer DGLA durch Expression einer Δ5-Desaturase in Hefe.
Beispiel 6
Identifikation von Homologen zu M.-alpina-Δ5- und -Δ6-Desaturasen
Eine Nucleinsäuresequenz, die für eine mutmaßliche Δ5-Desaturase kodiert, wurde durch eine TBLASTN-Suche aus den EST-Datenbanken des NCBI unter Einsatz von Aminosäuren 100–446 von Ma29 als Datenbankabfrage identifiziert. Der trunkierte Abschnitt der Ma29-Sequenz wurde eingesetzt, um die Aufnahme von Homologien, basierend auf dem Cytochrom-b5-Abschnitt am N-Terminus der Desaturase, zu vermeiden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz aus einer EST (= expressed sequence tag) von Dictyostelium discoideum (Zugang Nr. C25549) zeigt sehr signifikante Homologie zu Ma29 und weniger, jedoch immer noch signifikante Homologie zu Ma524. Die DNA-Sequenz ist als Seq.-ID Nr. 13 dargestellt. Die Aminosäuresequenz ist als Seq.-ID Nr. 14 dargestellt.
Beispiel 7
Identifikation von M.-alpina-Δ5- und -Δ6-Homologen in anderen PUFA-produzierenden Organismen
Um nach Desaturasen zu suchen, die in die PUFA-Produktion eingebunden sind, wurde eine cDNA-Bibliothek aus Gesamt-RNA, die von Phaeodactylum tricornutum isoliert worden war, konstruiert. Eine Plasmid-basierte cDNA-Bibliothek wurde in pSPORT1 (GIBCO-BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Sets (GIBCO-BRL) konstruiert. Zufällige cDNA-Klone wurden sequenziert, und Nucleinsäuresequenzen, die für mutmaßliche Δ5- und Δ6-Desaturasen kodieren, wurden durch BLAST-Suche der Datenbanken und durch Vergleich mit Ma29- und Ma524-Sequenzen identifiziert.
Ein Klon wurde aus der Phaeodactylum-Bibliothek mit Homologie zu Ma29 und Ma524 identifiziert; er wird 144-011-B12 genannt. Die DNA-Sequenz ist als Seq.-ID Nr. 15 dargestellt. Die Aminosäuresequenz ist als Seq.-ID Nr. 16 dargestellt.
Beispiel 8
Identifikation von M.-alpina-Δ5- und -Δ6-Homologen in anderen PUFA-produzierenden Organismen
Um nach Desaturasen zu suchen, die in die PUFA-Produktion eingebunden sind, wurde eine cDNA-Bibliothek aus Gesamt-RNA, die von Schizochytrium-Spezies isoliert wurden war, konstruiert. Eine Plasmid-basierte cDNA-Bibliothek wurde in pSPORT1 (GIBCO-BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Sets (GIBCO-BRL) konstruiert. Zufällige cDNA-Klone wurden sequenziert, und Nucleinsäuresequenzen, die für mutmaßliche Δ5- und Δ6-Desaturasen kodieren, wurden durch BLAST-Suche der Datenbanken und durch Vergleich mit Ma29- und Ma524-Sequenzen identifiziert.
Ein Klon wurde aus der Schizochytrium-Bibliothek mit Homologie zu Ma29 und Ma524 identifiziert; er wird 81-23-C7 genannt. Dieser Klon enthält ein ~1 kb großes Insert. Eine Teilsequenz wurde aus jedem Ende des Klons unter Verwendung der Vorwärts- und Rückwerts-Sequenzierungs-Primer erhalten. Die DNA-Sequenz des Vorwärts-Primers ist als Seq.-ID Nr. 17 dargestellt. Die Peptidsequenz ist als Seq.-ID Nr. 18 dargestellt. Die DNA-Sequenz des Rückwärts-Primers ist als Seq.-ID Nr. 19 dargestellt. Die Aminosäuresequenz ist als Seq.-ID Nr. 20 dargestellt.
Beispiel 9
Menschliche Desaturase-Gensequenzen
Menschliche Desaturase-Gensequenzen, die möglicherweise in die Biosynthese von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren eingebunden sind, wurden auf Grundlage von Homologie zwischen den menschlichen cDNA-Sequenzen und Mortierella-alpina-Desaturase-Gensequenzen isoliert. Die drei konservierten "Histidin-Boxen", die bekannt dafür sind, unter Membran-gebundenen Desaturasen konser viert zu sein, wurden gefunden. Wie auch bei manchen anderen Membran-gebundenen Desaturasen wurde das endgültige HXXHH-Histidin-Box-Motiv als QXXHH gefunden. Die Aminosäuresequenz der mutmaßlichen menschlichen Desaturasen wiesen Homologie zu M.-alpina-Δ5-, -Δ6-, -Δ9- und -Δ12-Desaturasen auf.
Die M.-alpina-Δ5-Desaturase- und -Δ6-Desaturase-cDNA-Sequenzen wurden verwendet, um in der LifeSeq-Datenbank von Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Kalifornien 94304, zu suchen. Die Δ5-Desaturase-Sequenz wurde in Fragmente geteilt; 1) Aminosäuren Nr. 1–150, 2) Aminosäuren Nr. 151–300 und 3) Aminosäuren Nr. 301–446. Die Δ6-Desaturase-Sequenz wurde in drei Fragmente geteilt; 1) Aminosäuren Nr. 1–150, 2) Aminosäuren Nr. 151–300 und 3) Aminosäuren Nr. 301–457. Diese Polypeptidfragmente wurden unter Verwendung des "tblastn"-Algorithmus gegen die Datenbank gesucht. Dieser Algorithmus vergleicht eine abgefragte Proteinsequenz mit einer Nucleotidsequenz-Datenbank, die in allen sechs Leserastern (beide Stränge) dynamisch translatiert ist.
Die Polypeptidfragmente 2 und 3 von M.-alpina-Δ5 und -Δ6 weisen Homologien mit den Klon-ID-Sequenzen, wie in Tabelle 6 beschrieben, auf. Die Klon-ID stellt eine individuelle Sequenz aus der Incyte-LifeSeq-Datenbank dar. Nachdem die "tblastn"-Resultate durchgeschaut worden waren, wurde Klon-Information mit den Standardeinstellungen von Stringenz von ≥ 50 und Produkttreffer ≤ 100 für unterschiedliche Klon-ID-Nummern gesucht. Die Klon-Informations-Ergebnisse zeigten die Informationen, die Cluster-ID, Klon-ID, Bibliothek, Treffer-ID, Treffer-Beschreibung umfassen. Sofern sie ausgewählt wurde, zeigte die Cluster-ID-Nummer die Klon-Information aller Klone auf, die zu dieser Cluster-ID gehörten. Der Anordnungssbefehl ordnete die gesamte Klon-ID an, die die Cluster-ID umfasst. Die folgenden Standardeinstellungen wurden für die GCG-Anordnung (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705) eingesetzt:

Wortgröße: 7

Minimale Überlappung: 14

Stringenz: 0,8

Minimale Identität: 14

Maximaler Spalt: 10

Spaltgewicht: 8

Längengewicht: 2
GCG-Anordnungs-Ergebnisse zeigten die Contigs, die auf Grundlage der Sequenzinformation innerhalb der Klon-ID hergestellt wurden. Ein Contig ist eine Angleichung von DNA-Sequenzen auf der Grundlage von Homologiegebieten unter diesen Sequenzen. Eine neue Sequenz (Consensus-Sequenz) wurde auf Grundlage der angeglichenen DNA-Sequenzen innerhalb eines Contigs hergestellt. Das die Klon-ID enthaltende Contig wurde identifiziert, und die zweideutigen Stellen der Consensus-Sequenz wurden auf Grundlage der Angleichung der Klon-IDs bearbeitet (siehe Seq.-ID Nr. 21 – Seq.-ID Nr. 25), um die bestmögliche Sequenz herzustellen. Das Verfahren wurde für alle sechs Klon-IDs, die in Tabelle 6 aufgelistet sind, wiederholt. Dies ergab fünf einzigartige Contigs. Die bearbeiteten Consensus-Sequenzen der 5 Contigs wurden in das Sequencher-Softwareprogramm importiert (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan 48105). Diese Consensus-Sequenzen wurden angeordnet. Das Contig 2.511.785 überlappt Contig 3.506.132, und dieses neue Contig wurde 2535 (Seq.-ID Nr. 27) genannt. Die Contigs vom Segencher-Programm wurden in das Sequenzanalyse-Software-Paket von GCG kopiert.
Jedes Contig wurde in alle sechs Leserastern in Proteinsequenzen translatiert. Die M.-alpina-Δ5-(MA29-) und -Δ6-(MA254-) Sequenzen wurden mit jedem der translatierten Contigs unter Einsatz der FastA-Suche verglichen (eine Suche nach Pearson und Lipman nach Ähnlichkeiten zwischen einer Abfragesequenz und einer Gruppe von Sequenzen desselben Typs (Nucleinsäure oder Protein)). Homologie unter diesen Sequenzen lässt auf die offenen Leseraster jedes Contigs schließen. Die Homologie unter den M.-alpina-Δ5- und -Δ6 zu Contigs 2.535 und 3.854.933 wurde einge setzt, um das End-Contig mit der Bezeichnung 253.538a zu schaffen. 13 ist die FastA-Übereinstimmung des End-Contigs 253.538a mit MA29, und 14 ist die FastA-Übereinstimmung des End-Contigs 253.538a mit MA254. Die DNA-Sequenzen für die verschiedenen Contigs sind in Seq.-ID Nr. 21 – Seq.-ID Nr. 27 dargestellt. Die verschiedenen Peptid-Sequenzen sind in Seq.-ID Nr. 28 – Seq.-ID Nr. 34 dargestellt.
Obwohl der offene Leserahmen durch Fusionieren der zwei Contigs hergestellt wurde, zeigt das Contig 2.535, dass es eine einzige Sequenz am Anfang dieses Contigs gibt, die mit dem Contig 3.854.933 nicht übereinstimmt. Daher ist es möglich, dass diese Contigs aus unabhängiger Desaturase wie menschlichen Genen hergestellt wurden.
Das Contig 253.538a enthält einen offenen Leserahmen, der für 432 Aminosäuren kodiert. Er beginnt mit Gln (CAG) und endet mit dem Stopcodon (TGA). Das Contig 253.538a richtet sowohl mit M.-alpina-Δ5- als auch -Δ6-Sequenzen aus, was darauf schließen lässt, dass es eine dieser Desaturasen sein könnte sowie auch andere Desaturasen, die miteinander Homologie teilen. Die einzelnen in Tabelle 6 aufgelisteten Contigs sowie das Zwischenprodukt-Contig 2.535 und das End-Contig 253.538a können eingesetzt werden, um die kompletten Gene für menschliche Desaturasen zu isolieren.
Verwendung menschlicher Desaturasen
Diese menschlichen Sequenzen können in Hefe oder Pflanzen exprimiert werden, die die in den vorangehenden Beispielen beschriebenen Verfahren verwenden. Zur Expression in Säugetierzellen und transgenen Tieren können diese Gene höhere Codon-Präferenz bereitstellen. Diese menschlichen Sequenzen können auch eingesetzt werden, um verwandte Desaturase-Sequenzen zu identifizieren.
Tabelle 6
Beispiel 10
Nahrungsmittelzusammensetzungen
Die PUFA der vorangehenden Beispiele können in verschiedenen Nahrungsmittelergänzungen, Kindernahrung, Nahrungsmittelersatzmittel und anderen Nahrungsmittellösungen verwendet werden.
I. FORMULIERUNGEN FÜR SÄUGLINGE
A. Isomil^®-Sojaformulierung mit Eisen
Verwendung: Als Getränk für Säuglinge, Kinder und Erwachsene mit einer Allergie oder Hypersensibilität für Kuhmilch. Ein Nahrungsmittel für Patienten mit Erkrankungen, bei denen die Aufnahme von Lactose vermieden werden sollte: Lactasemangel, Lactoseunverträglichkeit und Galaktosämie.
Eigenschaften

– Sojaproteinisolat, um Symptome der Kuhmilchprotein-Allergie oder -Sensibilität zu vermeiden.
– Lactose-freie Formulierung, um Lactose-verbundene Diarrhöe zu vermeiden.
– Geringe Osmolalität (240 mOsm/kg Wasser), um Risiken osmotischer Diarrhöe zu verringern.
– Doppelkohlenhydrate (Maissirup und Saccharose), dafür bestimmt, die Aufnahme von Kohlenhydraten zu steigern und das Risiko des Übersteigens der Aufnahmefähigkeit der geschädigten Gedärme zu reduzieren.
– 1,8 mg Eisen (als Eisen(II)-sulfat) pro 100 Kalorien, um Eisenmangel vorzubeugen.
– Empfohlene Mengen an Vitaminen und Mineralstoffen.
– Pflanzenöle, um für empfohlene Konzentrationen an essentiellen Fettsäuren zu sorgen.
– Milchweiße Farbe, milchartige Konsistenz und angenehmes Aroma.

Inhaltstoffe: (Pareve^TM) 85% Wasser, 4,9% Maissirup, 2,6% Zucker (Saccharose), 2,1% Sojaöl, 1,9% Sojaproteinisolat, 1,4% Kokosnussöl, 0,15% Calciumcitrat, 0,11% dreibasisches Calciumphosphat, Kaliumcitrat, monobasisches Kaliumphosphat, Kaliumchlorid, Mono- und Diglyceride, Sojalecithin, Carrageenan, Ascorbinsäure, L-Methionin, Magnesiumchlorid, zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Taurin, Eisen(II)-sulfat, m-Inositol, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, L-Carnitin, Niacinamid, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Riboflavin, Pyridoxinhydrochlorid, Folsäure, Mangansulfat, Kaliumiodid, Phyllochinon, Biotin, Natriumselenit, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
B. Isomil^®-DF-Sojaformulierung für Diarrhöe
Verwendung: Als kurzfristiges Nahrungsmittel zur Regulierung der Nahrungsaufnahme bei Säuglingen und Kleinkindern mit Diarrhöe.
Eigenschaften

– Die erste Kindernahrung, die zugesetzte Ballaststoffe aus Soja-Ballaststoffen speziell zur Behandlung von Diarrhöe enthält.
– Klinisch erwiesene Verkürzung der Ausscheidung von weichem, wässrigem Stuhlgang bei leichter bis schwerer Diarrhöe bei Säuglingen.
– Kompletter Nährwert, der den Nahrungsmittelbedarf von Säuglingen abdeckt.
– Isoliertes Sojaprotein mit zugesetztem L-Methionin, das den Bedarf eines Säuglings an allen essentiellen Aminosäuren abdeckt oder sogar übersteigt.
– Lactose-freie Formulierung, um Lactose-verbundene Diarrhöe zu vermeiden.
– Geringe Osmolalität (240 mOsm/kg Wasser), um das Risiko osmotischer Diarrhöe zu reduzieren.
– Doppelkohlenhydrate (Maissirup und Saccharose), dafür bestimmt, die Aufnahme von Kohlenhydraten zu steigern und das Risiko des Übersteigens der Aufnahmefähigkeit der geschädigten Gedärme zu reduzieren.
– Deckt die vom Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics empfohlenen und durch den Infant Formula Act erforderlichen Konzentrationen an Vitaminen und Mineralstoffen ab oder übersteigt sie sogar.
– 1,8 mg Eisen (als Eisen(II)-sulfat) pro 100 Kalorien, um Eisenmangel vorzubeugen.
– Pflanzenöle, um für empfohlene Konzentrationen an essentiellen Fettsäuren zu sorgen.

Inhaltstoffe: (Pareve^TM) 86% Wasser, 4,8% Maissirup, 2,5% Zucker (Saccharose), 2,1% Sojaöl, 2,0% Sojaproteinisolat, 1,4% Kokosnussöl, 0,77% Sojaballaststoff, 0,12 Calciumcitrat, 0,11% dreibasisches Calciumphosphat, 0,10% Kaliumcitrat, Kaliumchlorid, monobasisches Kaliumphosphat, Mono- und Diglyceride, Sojalecithin, Carrageenan, Magnesiumchlorid, Ascorbinsäure, L-Methionin, zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Taurin, Eisen(II)-sulfat, m-Inositol, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, L-Carnitin, Niacinamid, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Riboflavin, Pyridoxinhydrochlorid, Folsäure, Mangansulfat, Kaliumiodid, Phyllochinon, Biotin, Natriumselenit, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
C. Saccharose-freie Isomil^®-SF-Sojaformulierung mit Eisen
Verwendung: Als ein Getränk für Säuglinge, Kinder und Erwachsene mit einer Allergie oder Hypersensibilität gegenüber Kuhmilchprotein oder einer Unverträglichkeit von Saccharose. Ein Nahrungsmittel für Patienten mit Erkrankungen, bei denen die Aufnahme von Lactose und Saccharose vermieden werden sollte.
Eigenschaften

– Isolierteres Sojaprotein, um Symptome der Kuhmilchprotein-Allergie oder Hypersensibilität zu vermeiden.
– Lactose-freie Formulierung, um Lactose-verbundene Diarrhöe zu vermeiden (Kohlenhydratquelle sind Polycose^® Glucose-Polymere).
– Saccharose-frei für Patienten, die keine Saccharose vertragen.
– Geringe Osmolalität (180 mOsm/kg Wasser), um das Risiko osmotischer Diarrhöe zu reduzieren.
– 1,8 mg Eisen (als Eisen(II)-sulfat) pro 100 Kalorien, um Eisenmangel zu verhindern.
– Empfohlene Konzentrationen an Vitaminen und Mineralstoffen.
– Pflanzenöle, um für empfohlene Konzentrationen an essentiellen Fettsäuren zu sorgen.
– Milchweiße Farbe, milchartige Konsistenz und angenehmes Aroma.

Inhaltstoffe: (Pareve^TM) 75% Wasser, 11,8% hydrolysierte Maisstärke, 4,1% Sojaöl, 4,1% Sojaproteinisolat, 2,8% Kokosnussöl, 1,0% modifizierte Maisstärke, 0,38% dreibasisches Calciumphosphat, 0,17% Kaliumcitrat, 0,13% Kaliumchlorid, Mono- und Diglyceride, Sojalecithin, Magnesiumchlorid, Ascorbinsäure, L-Methionin, Kaliumcarbonat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Carrageenan, Taurin, Eisen(II)-sulfat, m-Inositol, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, L-Carnitin, Niacinamid, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Riboflavin, Pyridoxinhydrochlorid, Folsäure, Mangansulfat, Kaliumiodid, Phyllochinon, Biotin, Natriumselenit, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
D. Isomil^®-20-Sojaformulierung mit Eisen, fertig zur Verabreichung, 20 cal/fl oz
Verwendung: wenn ein Ernährung auf Sojabasis erwünscht ist Inhaltstoffe: (Pareve^TM) 85% Wasser, 4,9% Maissirup, 2,6% Zucker (Saccharose), 2,1% Sojaöl, 1,9% Sojaproteinisolat, 1,4% Kokosnussöl, 0,15% Calciumcitrat, 0,11% dreibasisches Calciumphosphat, Kaliumcitrat, monobasisches Kaliumphosphat, Kaliumchlorid, Mono- und Diglyceride, Sojalecithin, Carrageenan, Ascorbinsäure, L-Methionin, Magnesiumchlorid, zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Taurin, Eisen(II)-sulfat, m-Inositol, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, L-Carnitin, Niacinamid, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Riboflavin, Pyridoxinhydrochlorid, Folsäure, Mangansulfat, Kaliumiodid, Phyllochinon, Biotin, Natriumselenit, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
E. Similac^®-Säuglingsnahrung
Verwendung: Sofern Bedarf an einer Säuglingsnahrung besteht: wenn die Entscheidung getroffen wird, das Füttern mit Muttermilch vor Ende des ersten Lebensjahres abzusetzen, wenn eine Ergänzung zur Muttermilchernährung erforderlich ist oder als permanente Säuglingsnahrung, sofern der Säugling überhaupt nicht gestillt wird.
Eigenschaften

– Protein von geeigneter Qualität und Quantität für ein gesundes Wachstum; Hitze-denaturiert, wodurch das Risiko von Milch-verbundenem, intestinalem Blutverlust reduziert wird.
– Fett aus einer Mischung aus Pflanzenölen (doppelt homogenisiert), das essentielle Linolensäure bereitstellt, die leicht aufgenommen wird.
– Kohlenhydrat als Lactose in einem ähnlichen Verhältnis wie in der menschlichen Muttermilch.
– Geringe Gelöststoff-Belastung der Nieren, um die Belastung auf sich entwickelnde Organe zu minimieren.
– In Form von Pulver, konzentrierter Flüssigkeit und fertig zur Verabreichung.

Inhaltstoffe: (⊙-D) Wasser, fettfreie Milch, Lactose, Sojaöl, Kokosnussöl, Mono- und Diglyceride, Sojalecithin, Ascorbinsäure, Carrageenan, Cholinchlorid, Taurin, m-Inositol, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, Niacinamid, Eisen(II)-sulfat, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Riboflavin, Pyridoxinhydrochlorid, Folsäure, Mangansulfat, Phyllochinon, Biotin, Natriumselenit, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
F. Similac^®-NeoCare-Formulierung mit Eisen für Frühgeborene
Verwendung: Für besondere Ernährungsbedürfnisse von Frühgeborenen nach der Entlassung aus dem Krankenhaus. Similac-NeoCare ist eine umfassende Nah rungsmittelformulierung, die entwickelt wurde, um frühgeborene Säuglinge mit zusätzlichen Kalorien, Proteinen, Vitaminen und Mineralstoffen zu versorgen, die notwendig sind, um den Wachstumsrückstand aufzuholen und die Entwicklung des Säuglings zu fördern.
Eigenschaften

– Reduziert den Bedarf an Kalorien- und Vitaminergänzungsnahrung. Enthält mehr Kalorien (22 cal/fl oz. ) als Standardformulierungen (20 cal/fl oz.).
– Stark absorbierte Fettmischung mit mittelkettigen Triglyceriden (MCT-Öl), um die besonderen Verdauungsbedürfnisse von Frühgeborenen abzudecken.
– Höherer Anteil an Protein, Vitaminen und Mineralstoffen pro 100 Kalorien, um die unterstützende Zusatzernährung, die im Krankenhaus aufgenommen wurde, fortzuführen.
– Mehr Calcium und Phosphor für verbesserte Knochenmineralisation.

Inhaltstoffe: (⊙-D) Maissirupfeststoffe, fettfreie Milch, Lactose, Molkeproteinkonzentrat, Sojaöl, Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, fraktioniertes Kokosnussöl (mittelkettige Triglyceride), Kokosnussöl, Kaliumcitrat, dreibasisches Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Ascorbinsäure, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Taurin, Eisen(II)-sulfat, m-Inositol, Cholinchlorid, Ascorbylpalmitat, L-Carnitin, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, Niacinamid, gemischte Tocopherole, Natriumcitrat, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Thiaminchloridhydrochlorid, Vitamin-A-Palmitat, Beta-Carotin, Riboflavin, Pyridoxinhydrochlorid, Folsäure, Mangansulfat, Phyllochinon, Biotin, Natriumselenit, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
G. Natürliches Similac-Produkt mit niedrigem Eisengehalt-Stärkungsmittel für menschliche Muttermilch, fertig zur Verabreichung, 24 cal/fl oz
Verwendung: Bestimmt dafür, mit menschlicher Muttermilch vermischt zu werden oder abwechselnd mit menschlicher Milch Säuglingen mit geringem Geburtsgewicht gefüttert zu werden.
Inhaltstoffe: ⊙-D Wasser, fettfreie Milch, hydrolysierte Maisstärke, Lactose, fraktioniertes Kokosnussöl (mittelkettige Triglyceride), Molkeproteinkonzentrat, Sojaöl, Kokosnussöl, dreibasisches Calciumphosphat, Kaliumcitrat, Magnesiumchlorid, Natriumcitrat, Ascorbinsäure, Calciumcarbonat, Mono- und Diglyceride, Sojalecithin, Carrageenan, Cholinchlorid, m-Inositol, Taurin, Niacinamid, L-Carnitin, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, Kaliumchlorid, Calciumpantothenat, Eisen(II)-sulfat, Kupfer(II)-sulfat, Riboflavin, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Pyri doxinhydrochlorid, Biotin, Folsäure, Mangansulfat, Phyllochinon, Vitamin D₃, Natriumselenit und Cyanocobalamin.
Verschiedene PUFA dieser Erfindung können substituiert und/oder der zuvor beschriebenen Säuglingsnahrung sowie anderer Säuglingsnahrung, die Fachleuten bekannt ist, zugesetzt werden.
II. NAHRUNGSMITTELFORMULIERUNGEN
A. ENSURE^®
Verwendung: ENSURE ist ein flüssiges Nahrungsmittel mit geringem Reststoffanteil, das vordergründig dafür bestimmt ist, als oral zu verabreichende Nahrungsmittelergänzung zu dienen, die bei oder zwischen Mahlzeiten oder, in geeigneten Mengen, als Ersatzmahlzeit eingenommen wird. ENSURE ist Lactose- und Gluten-frei und ist geeignet, in modifizierte Ernährungspläne, Diäten mit niedriger Cholesterineinnahme eingeschlossen, eingebunden zu werden. Obwohl es erstrangig eine orale Ergänzungsformulierung ist, kann es auch über Infusionen verabreicht werden.
Patientenverfassung

– Für Patienten mit speziell abgestimmten Ernährungsplänen
– Für ältere Patienten mit mangelhafter Ernährung
– Für Patienten mit unerwünschtem Gewichtsverlust
– Für Patienten, die nach einer Krankheit oder einem operativen Eingriff rekonvaleszent sind
– Für Patienten, die eine Ernährung mit geringem Reststoffanteil benötigen

Inhaltstoffe
⊙-D Wasser, Zucker (Saccharose), Maltodextrin (Mais), Calcium- und Natriumcaseinate, Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, Sojaproteinisolat, Sojaöl, Canolaöl, Kaliumcitrat, dreibasisches Calciumphosphat, Natriumcitrat, Magnesiumchlorid, zweibasisches Magnesiumphosphat, künstliches Aroma, Natriumchlorid, Sojalecithin, Cholinchlorid, Ascorbinsäure, Carrageenan, Zinksulfat, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Gellan-Gummi, Niacinamid, Calciumpantothenat, Mangansulfat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, Folsäure, Natriummolybdat, Chromchlorid, Biotin, Kaliumiodid, Natriumselenat.
B. ENSURE^®-BARS
Verwendung: ENSURE-BARS (ENSURE-Riegel) sind vollständige, ausgeglichene Nahrungsmittel zur zusätzlichen Einnahme zwischen oder bei den Mahlzeiten. Sie stellen eine köstliche, nährstoffreiche Alternative zu anderen Snacks dar. ENSURE-Riegel enthalten < 1 g Lactose/Riegel, und die Geschmacksrichtung "Chocolate Fudge Brownie" ist glutenfrei. (Die Geschmacksrichtung "Honey Graham Crunch" (Knusper-Honig-Graham) enthält Gluten.)
Patientenverfassung

– Für Patienten, die zusätzliche Kalorien, Protein, Vitamine und Mineralstoffe benötigen.
– Besonders nützlich für Personen, die nicht genug Kalorien und Nährstoffe zu sich nehmen.
– Für Personen, die in der Lage sind, zu kauen und zu schlucken.
– Nicht zu verwenden bei Patienten mit Erdnussallergie oder einer anderen Art von Allergie gegen Nüsse.

Inhaltstoffe
"Honey Graham Crunch" – Maissirup mit hohem Fructosegehalt, Sojaproteinisolat, brauner Zucker, Honig, Maltodextrin (Mais), Knusperreis (gemahlener Reis, Zucker [Saccharose], Salz [Natriumchlorid] und Malz), Haferkleie, teilweise gehärtete Baumwollsamen- und Sojaöle, Sojapolysaccharid, Glycerin, Molkeproteinkonzentrat, Polydextrose, Fructose, Calciumcaseinat, Kakaopulver, künstliche Aromen, Canolaöl, Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, fettfreie Trockenmilch, Molkepulver, Sojalecithin und Maisöl. Hergestellt in einer Vorrichtung, die Nüsse verarbeitet.
Vitamine und Mineralstoffe
Dreibasisches Calciumphosphat, zweibasisches Kaliumphosphat, Magnesiumoxid, Salz (Natriumchlorid), Kaliumchlorid, Ascorbinsäure, Eisen(III)-orthophosphat, Alpha-Tocopherylacetat, Niacinamid, Zinkoxid, Calciumpantothenat, Kupfergluconat, Mangansulfat, Riboflavin, Beta-Carotin, Pyridoxinhydrochlorid, Thiaminmononitrat, Folsäure, Biotin, Chromchlorid, Kaliumiodid, Natriumselenat, Natriummolybdat, Phyllochinon, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
Protein
"Honey Graham Crunch" – Die Proteinquelle ist eine Mischung aus Sojaproteinisolat und Milchproteinen.

Sojaproteinisolat 74%

Milchproteine 26%
Fett
"Honey Graham Crunch" – Die Fettquelle ist eine Mischung aus teilweise gehärteten Baumwollsamen- und Sojabohnenölen, Canola-, Saflor- (mit hohem Oleinsäuregehalt) und Maisölen und Sojalecithin.

Teilweise gehärtete Baumwollsamen- und Sojabohnenöl 76%

Canolaöl 8%

Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt 8%

Maisöl 4%

Sojalecithin 4%
Kohlenhydrat
"Honey Graham Crunch" – Die Kohlenhydratquelle ist eine Kombination aus Maissirup mit hohem Fructosegehalt, braunem Zucker, Maltodextrin, Honig, Knusperreis, Glycerin, Sojapolysaccharid und Haferkleie.

Maissirup mit hohem Fructosegehalt 24%

Brauner Zucker 21%

Maltodextrin 12%

Honig 11%

Knusperreis 9%

Glycerin 9%

Sojapolysaccharid 7%

Haferkleie 7%
C. ENSURE^® HIGH PROTEIN
Verwendung: ENSURE HIGH PROTEIN ist ein konzentriertes, flüssiges Nahrungsmittel mit hohem Proteingehalt für Personen, die zusätzliche Kalorien, Protein, Vit amine und Mineralstoffe in ihren Ernährungsplänen benötigen. Es kann als ein oral einzunehmender Nahrungsmittelzusatz mit oder zwischen den Mahlzeiten eingenommen werden oder, in geeigneten Mengen, als eine Ersatzmahlzeit eingenommen werden. ENSURE HIGH PROTEIN ist Lactose- und Gluten-frei und ist für Personen geeignet, die sich von allgemeinen operativen Eingriffen oder Hüftfrakturen erholen, sowie für Patienten, die Gefahr laufen, Druckgeschwüre zu bekommen.
Patientenverfassung

– Für Patienten, die zusätzliche Kalorien, Protein, Vitamine und Mineralstoffe benötigen, wie Patienten, die sich von allgemeinen operativen Eingriffen oder Hüftfrakturen erholen, Patienten, die Gefahr laufen, Druckgeschwüre zu entwickeln, und Patienten mit Ernährungsplänen mit niedrigem Cholesteringehalt.

Eigenschaften

– Geringer Gehalt an gesättigten Fetten
– Enthält 6 g Gesamtfett und < 5 mg Cholesterin pro Portion
– Reichhaltiger, cremiger Geschmack
– Ausgezeichnete Quelle für Protein, Calcium und andere essentielle Vitamin und Mineralstoffe
– Geeignet für Ernährungspläne mit geringem Cholesterin-Gehalt
– Lactose-frei, leicht verdaulich

Inhaltstoffe
"Vanilla Supreme": ⊙-D Wasser, Zucker (Saccharose), Maltodextrin (Mais), Calcium- und Natriumcaseinate, Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, Sojaproteinisolat, Sojaöl, Canolaöl, Kaliumcitrat, dreibasisches Calciumphosphat, Natriumcitrat, Magnesiumchlorid, zweibasisches Magnesiumphosphat, künstliche Aromen, Natriumchlorid, Sojalecithin, Cholinchlorid, Ascorbinsäure, Carrageenan, Zinksulfat, Ei sen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Gellan-Gummi, Niacinamid, Calciumpantothenat, Mangansulfat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlo rid, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, Folsäure, Natriummolybdat, Chromchlorid, Biotin, Kaliumiodid, Natriumselenat, Phyllochinon, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
Protein
Die Proteinquelle ist eine Mischung aus zwei Proteinen mit hochbiologischem Wert: Casein und Soja.

Natrium- und Calciumcaseinate 85%

Sojaproteinisolat 15%
Fett
Die Fettquelle ist eine Mischung aus drei Ölen: Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, Canolaöl und Sojaöl.

Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt 40%

Canolaöl 30%

Sojaöl 30%
Die Fettkonzentration in ENSURE HIGH PROTEIN steht in Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Heart Association (AHA). Die 6 Gramm Fett in ENSURE HIGH PROTEIN stellen 24% der Gesamtkalorien dar, wobei 2,6% des Fetts von gesättigten Fettsäuren und 7,9% von mehrfach ungesättigten Fettsäuren stammen. Diese Werte liegen innerhalb des Bereichs der AHA-Richtlinien, worin ≤ 30% der Gesamtkalorien von Fett, ≤ 10% der Kalorien von ungesättigten Fettsäuren und ≤ 10% der Gesamtkalorien von mehrfach ungesättigten Fettsäuren stammen.
Kohlenhydrat
ENSURE HIGH PROTEIN enthält eine Kombination aus Maltodextrin und Saccharose. Die milde Süße und die zahlreichen Geschmacksrichtungen (Vanille Supreme, Schokolade Royal, Wildbeere und Banane) und VARI-FLAVORSO^® Flavor Pacs in Pekannuss, Kirsche, Erdbeere, Zitrone und Orange helfen, eine Geschmacksvielfalt bereitzustellen, derer der Patient nicht so rasch überdrüssig wird, wodurch er die Formulierung lieber zu sich nimmt. Vanille und andere Geschmacksrichtungen außer Schokolade

Saccharose 60%

Maltodextrin 40%

Schokolade

Saccharose 70%

Maltodextrin 30%
D. ENSURE^® LIGHT
Verwendung: ENSURE LIEHT ist ein flüssiges Nahrungsmittel mit geringem Fettanteil, bestimmt für die Verwendung als oral zu verabreichende Nahrungsmittelergänzung bei oder zwischen den Mahlzeiten. ENSURE LIEHT ist lactose- und glutenfrei und ist für die Verwendung in speziell abgestimmten Ernährungsplänen, umfassend Diäten mit geringem Cholesteringehalt, geeignet.
Patientenverfassung

– Für normalgewichtige oder übergewichtige Patienten, die zusätzliche Ernährung über eine Ergänzung benötigen, die 50% weniger Fett und 20% weniger Kalorien als ENSURE enthält.
– Für gesunde Erwachsene, die nicht korrekt essen und zusätzliche Ernährung benötigen.

Eigenschaften

– Geringer Gehalt an Fett und ungesättigtem Fett
– Enthält 3 g Gesamtfett pro Portion und < 5 mg Cholesterin
– Reichhaltiger, cremiger Geschmack
– Ausgezeichnete Quelle für Calcium und andere essentielle Vitamine und Mineralstoffe
– Für Diäten mit geringem Cholesteringehalt geeignet
– Lactose-frei und leicht verdaulich

Inhaltstoffe
"French Vanilla": ⊙-D Wasser, Maltodextrin (Mais), Zucker (Saccharose), Calciumcaseinat, Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, Canolaöl, Magnesiumchlorid, Natriumcitrat, Kaliumcitrat, zweibasisches Kaliumphosphat, zweibasisches Magnesiumphosphat, natürliche und künstliche Aromen, dreibasisches Calciumphosphat, Cellulosegel, Cholinchlorid, Sojalecithin, Carrageenan, Salz (Natriumchlorid), Ascorbinsäure, Cellulosegummi, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, Niacinamid, Mangansulfat, Calciumpantothenat, Kupfer(II)-sulfat, Thiaminchloridhydrochlorid, Vitamin-A-Palmitat, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, Chromchlorid, Folsäure, Natriummolybdat, Biotin, Kaliumiodid, Natriumselenat, Phyllochinon, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
Protein
Die Proteinquelle ist Calciumcaseinat.

Calciumcaseinat 100%
Fett
Die Fettquelle ist eine Mischung aus zwei Ölen: Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt und Canolaöl.

Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt 70%

Canolaöl 30%
Die Fettkonzentration in ENSURE LIGHT entspricht den Richtlinien der American Heart Association (AHA). Die 3 Gramm Fett in ENSURE LIGHT stellen 13,5% der Gesamtkalorien dar, wobei 1,4% des Fetts aus gesättigten Fettsäuren und 2,6% aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren stammen. Diese Werte liegen innerhalb des Bereichs laut AHA-Richtlinien, worin ≤ 30% der Gesamtkalorien von Fett stammen, < 10% der Kalorien von gesättigten Fettsäuren und ≤ 10% der Gesamtkalorien von mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Kohlenhydrat
ENSURE LIGHT enthält eine Kombination aus Maltodextrin und Saccharose. Die Sorte mit Schokoladengeschmack enthält zusätzlich Maissirup. Die milde Süße und die zahlreichen Geschmacksrichtungen (French Vanilla, Chocolate Supreme, Strawberry Swirl) und VARI-FLAVORS^® Flavor Pacs in Pekannuss, Kirsche, Erdbeere, Zitrone und Orange helfen, eine Geschmacksvielfalt bereitzustellen, derer der Patient nicht so rasch überdrüssig wird, wodurch er die Formulierung lieber zu sich nimmt. Vanille und andere Geschmacksrichtungen außer Schokolade

Saccharose 51%

Maltodextrin 49%

Schokolade

Saccharose 47,0%

Maissirup 26,5%

Maltodextrin 26,5%
Vitamine und Mineralstoffe
Eine 8-fl-oz.-Portion von ENSURE LIGHT stellt zumindest 25% der RDI für 24 zentrale Vitamine und Mineralstoffe bereit.
Koffein
Der Schokoladegeschmack enthält 2,1 mg Koffein/8 fl oz.
E. ENSURE PLUS^®
Verwendung: ENSURE PLUS ist ein flüssiges Nahrungsmittel mit hohem Kaloriengehalt und geringen Reststoffen, das verwendet wird, wenn zusätzliche Kalorien und Nährstoffe, jedoch mit normalen Proteinkonzentrationen, benötigt werden. Es ist erstrangig als eine oral zu verabreichende Nahrungsmittelergänzung gedacht, die bei oder zwischen Mahlzeiten oder, in geeigneten Mengen, als Ersatzmahlzeit eingenommen wird. ENSURE PLUS ist lactose- und glutenfrei. Obwohl es in erster Linie eine oral zu verabreichende Nahrungsmittelergänzung ist, kann es auch per Infusion verabreicht werden.
Patientenverfassung

– Für Patienten, die zusätzliche Kalorien- und Nährstoffzufuhr, jedoch mit normaler Proteinkonzentration, in geringen Volumen benötigen.
– Für Patienten, die ein gesundes Gewicht erreichen oder aufrechterhalten müssen.

Eigenschaften

– Reichhaltiger, cremiger Geschmack
– Gute Quelle für essentielle Vitamine und Mineralstoffe

Inhaltstoffe
Vanille-Geschmack: ⊙-D Wasser, Maissirup, Maltodextrin (Mais), Maisöl, Natrium- und Calciumcaseinate, Zucker (Saccharose), Sojaproteinisolat, Magnesiumchlorid, Kaliumcitrat, dreibasisches Calciumphosphat, Sojalecithin, natürliche und künstliche Aromen, Natriumcitrat, Kaliumchlorid, Cholinchlorid, Ascorbinsäure, Carrageenan, Zinksulfat, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Niacinamid, Calciumpantothenat, Mangansulfat, Kupfer(II)-sulfat, Thiaminchloridhydrochlorid, Vitamin-A-Palmitat, Folsäure, Biotin, Chromchlorid, Natriummolybdat, Kaliumiodid, Natriumselenit, Phyllochinon, Cyanocobalamin und Vitamin D₃.
Protein
Die Proteinquelle ist eine Mischung aus zwei Proteinen mit hohem biologischen Wert: Casein und Soja.

Natrium- und Calciumcaseinate 84%

Sojaproteinisolat 16%
Fett
Die Fettquelle ist Maisöl.

Maisöl 100%
Kohlenhydrat
ENSURE PLUS enthält eine Kombination aus Maltodextrin und Saccharose. Die milde Süße und die zahlreichen Geschmacksrichtungen (Vanille, Schokolade, Erdbeere, Kaffee, Butter-Pekannuss und Eierflip) und VARI-FLAVORS^® Flavor Pacs in Pekannuss, Kirsche, Erdbeere, Zitrone und Orange helfen, eine Geschmacksvielfalt bereitzustellen, derer der Patient nicht so rasch überdrüssig wird, wodurch er die Formulierung lieber zu sich nimmt. Vanille-, Erdbeer-, Butter-Pekannuss- und Kaffee-Geschmacksrichtungen

Maissirup 39%

Maltodextrin 38%

Saccharose 23%

Schokolade- und Eierflip-Geschmacksrichtung

Maissirup 36%

Maltodextrin 34%

Saccharose 30%
Vitamine und Mineralstoffe
Eine 8-fl-oz.-Portion von ENSURE PLUS stellt zumindest 15% der RDI von 25 zentralen Vitaminen und Mineralstoffen bereit.
Koffein
Die Geschmacksrichtung Schokolade enthält 3,1 mg Koffein/8 fl oz. Die Geschmacksrichtung Kaffee enthält eine Spurenmenge an Koffein.
F. ENSURE PLUS^® HN
Verwendung: ENSURE PLUS HN ist ein flüssiges Nahrungsmittel, das ernährungstechnisch vollwertig ist und einen hohen Kalorien- und hohen Stickstoffgehalt aufweist. ENSURE PLUS HN ist für Personen mit hohem Bedarf an Kalorien und Proteinen oder eingeschränkter Volumenverträglichkeit bei der Nahrungsmittelaufnahme bestimmt. Es kann oral als Nahrungsmittelergänzung oder als Ersatzmahlzeit per Infusion verabreicht werden. ENSURE PLUS HN ist lactose- und glutenfrei.
Patientenverfassung

– Für Patienten mit erhöhtem Kalorien- und Proteinbedarf, wie beispielsweise nach operativen Eingriffen oder Verletzungen.
– Für Patienten mit eingeschränkter Volumenverträglichkeit und Patienten, bei denen das Sättigungsgefühl rasch eintritt.

Eigenschaften

– Als Nahrungsmittelergänzung oder gänzlicher Nahrungsmittelersatz
– Zur oralen oder intravenösen Verabreichung
– 1,5 CaVml
– Hoher Stickstoffgehalt
– Hoher Kaloriengehalt

Inhaltstoffe
Vanlle-Geschmack: ⊙-D Wasser, Maltodexirin (Mais), Natrium- und Caiciumca seinate, Maisöl, Zucker (Saccharose), Sojaproteinisolat, Magnesiumchlorid, Kaliumcitrat, dreibasisches Calciumphosphat, Sojalecithin, natürliche und künstliche Aromen, Natriumcitrat, Cholinchlorid, Ascorbinsäure, Taurin, L-Carnitin, Zinksulfat, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Niacinamid, Carrageenan, Calciumpantothenat, Mangansulfat, Kupfer(II)-sulfat, Thiaminchloridhydrochlorid, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, Vitamin-A-Palmitat, Folsäure, Biotin, Chromchlorid, Natriummolybdat, Kaliumiodid, Natriumselenit, Phyllochinon, Cyanocobalamin und Vitamin D₃.
G. ENSURE^® POWDER
Verwendung: ENSURE POWDER (wird in Wasser gelöst) ist ein flüssiges Nahrungsmittel mit geringem Reststoffgehalt, das in erster Linie als oral zu verabreichende Nahrungsmittelergänzung gedacht ist, die bei oder zwischen Mahlzeiten verabreicht wird. ENSURE POWDER ist lactose- und glutenfrei und ist für die Verwendung in speziell abgestimmten Ernährungsplänen, umfassend Diäten mit geringem Cholesteringehalt, geeignet.
Patientenverfassung

– Für Patienten mit speziell abgestimmten Ernährungsplänen
– Für ältere Patienten mit Ernährungsproblemen
– Für rekonvaleszente Patienten nach einer Krankheit oder einem operativen Eingriff.
– Für Patienten, die einen Ernährungsplan mit geringem Reststoffgehalt benötigen.

Eigenschaften

– Angenehm und leicht zu mischen
– Geringer Gehalt an gesättigten Fetten
– Enthält 9 g Gesamtfett und < 5 mg Cholesterin pro Portion
– Hoher Vitamin- und Mineralstoffgehalt
– Für Ernährungspläne mit geringem Cholesteringehalt
– Lactose-frei und leicht verdaulich

Inhaltstoffe
⊙-D Maissirup, Maltodextrin (Mais), Zucker (Saccharose), Maisöl, Natrium- und Calciumcaseinate, Sojaproteinisolat, künstliches Aroma, Kaliumcitrat, Magnesiumchlorid, Natriumcitrat, dreibasisches Calciumphosphat, Kaliumchlorid, Sojalecithin, Ascorbinsäure, Cholinchlorid, Zinksulfat, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Niacinamid, Calciumpantothenat, Mangansulfat, Thiaminchloridhydrochlorid, Kupfer(II)-sulfat, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, Vitamin-A-Palmitat, Folsäure, Biotin, Natriummolybdat, Chromchlorid, Kaliumiodid, Natriumselenat, Phyllochinon, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
Protein
Die Proteinquelle ist eine Mischung aus zwei Proteinen mit hohem biologischen Wert: Casein und Soja.

Natrium- und Calciumcaseinate 84%

Sojaproteinisolat 16%
Fett
Die Fettquelle ist Maisöl.

Maisöl 100%
Kohlenhydrat
ENSURE POWDER enthält eine Kombination aus Maissirup, Maltodextrin und Sac charose. Die milde Süße von ENSURE POWDER und VARI-FLAVORS^® Flavor Pacs in Pekannuss, Kirsche, Erdbeere, Zitrone und Orange helfen, eine Geschmacksvielfalt bereitzustellen, derer der Patient nicht so rasch überdrüssig wird, wodurch er die Formulierung lieber zu sich nimmt. Vanille-Geschmack

Maissirup 35%

Maltodextrin 35%

Saccharose 30%
H. ENSURE^® PUDDING
Verwendung: ENSURE PUDDING ist eine nährstoffreiche Ergänzung, die für eine ausgeglichene Ernährung in nicht flüssiger Form sorgt und bei oder zwischen den Mahlzeiten einzunehmen ist. ENSURE PUDDING ist für Ernährungspläne mit veränderter Konsistenz der Nahrungsmittel geeignet (z. B. weiche, pürierte oder völlig flüssige Ernährung), oder auch für Personen, die Schluckbeschwerden haben. ENSURE PUDDING ist glutenfrei.
Patientenverfassung

– Für Patienten, die Ernährungspläne mit veränderter Nahrungsmittelkonsistenz (z. B. weiche, pürierte oder völlig flüssige Ernährung) einzuhalten haben.
– Für Patienten mit Schluckbeschwerden.

Eigenschaften

– Reichhaltiger und cremiger, guter Geschmack.
– Gute Quelle für essentielle Vitamine und Mineralien
– Praktisch: muss nicht gekühlt gelagert werden
– glutenfrei

Nährstoffprofil für 5 oz: 250 Kalorien, 10,9% Protein, 34,9% Gesamtfett, 54,2% Kohlenhydrat.
Inhaltstoffe
Vanille-Geschmack: ⊙-D fettfreie Milch, Wasser, Zucker (Saccharose), teilweise gehärtetes Sojabohnenöl, modifizierte Speisestärke, Magnesiumsulfat, Natriumstearoyl, Lactylat, zweibasisches Natriumphosphat, künstliches Aroma, Ascorbinsäure, Zinksulfat, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Cholinchlorid, Niacinamid, Mangansulfat, Calciumpantothenat, FD & C-Gelb Nr. 5, Kaliumcitrat, Kupfer(II)-sulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, FD & C-Gelb Nr. 6, Folsäure, Biotin, Phyllochinon, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
Protein
Die Proteinquelle ist fettfreie Milch.

Fettfreie Milch 100%
Fett
Die Fettquelle ist gehärtetes Sojabohnenöl.

Gehärtetes Sojabohnenöl 100%
Kohlenhydrat
ENSURE PUDDING enthält eine Kombination aus Saccharose und modifizierter Speisestärke. Die milde Süße und die zahlreichen Geschmacksrichtungen (Vanille, Schokolade, Karamel und Maniok) helfen, dass der Patient der Formulierung nicht so rasch überdrüssig wird. Das Produkt enthält 9,2 Gramm Lactose pro Portion. Vanille und andere Geschmacksrichtung außer Schokolade

Saccharose 56%

Lactose 27%

Modifizierte Speisestärke 17%

Schokoladegeschmack

Saccharose 58%

Lactose 26%

Modifizierte Speisestärke 16%
I. ENSURE^® WITH FIBER
Verwendung: ENSURE WITH FIBER (mit Ballaststoffen) ist ein ballaststoffhältiges, ernährungstechnisch vollwertiges Nahrungsmittel, das für Personen bestimmt ist, die von erhöhter Ballaststoff- und Nährstoffzufuhr profitieren können. ENSURE WITH FIBER ist geeignet für Personen, die keine Diät mit geringem Reststoffgehalt benötigen. Es kann oral oder intravenös verabreicht werden und kann als Nahrungsmittelergänzung zu normaler Ernährung oder aber, in geeigneten Mengen, als Ersatzmahlzeit dienen. ENSURE WITH FIBER ist lactose- und glutenfrei und ist zur Verwendung bei speziell abgestimmten Ernährungsplänen, umfassend Diäten mit gerin gem Cholesteringehalt, geeignet.
Patientenverfassung

– Für Patienten, die von erhöhter Ballaststoff- und Nährstoffzufuhr profitieren können.

Eigenschaften

– Neue, bessere Formulierung mit geringem Gehalt an gesättigten Fetten und höherem Gehalt an Vitaminen und Mineralstoffen.
– Enthält insgesamt 6 g Fett und < 5 mg Cholesterin pro Portion
– Reichhaltiger, cremiger Geschmack
– Gute Ballaststoffquelle
– Ausgezeichnete Quelle für essentielle Vitamine und Mineralstoffe
– Geeignet für Diäten mit geringem Cholesteringehalt
– Lactose- und glutenfrei

Inhaltstoffe
Vanille-Geschmack: ⊙-D Wasser, Maltodextrin (Mais), Zucker (Saccharose), Natrium- und Calciumcaseinate, Haferkleie, Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, Cano-laöl, Sojaproteinisolat, Maisöl, Sojaballaststoffe, dreibasisches Calciumphosphat, Magnesiumchlorid, Kaliumcitrat, Cellulosegel, Sojalecithin, zweibasisches Kaliumphosphat, Natriumcitrat, natürliche und künstliche Aromen, Cholinchlorid, Magnesiumphosphat, Ascorbinsäure, Cellulosegummi, Kaliumchlorid, Carrageenan, Eisen(II)-sulfat, Alpha-Tocopherylacetat, Zinksulfat, Vitamin-A-Palmitat, Thiaminchloridhydrochlorid, Pyridoxinhydrochlorid, Riboflavin, Folsäure, Chromchlorid, Biotin, Natriummolybdat, Kaliumiodid, Natriumselenat, Phyllochinon, Vitamin D₃ und Cyanocobalamin.
Protein
Die Proteinquelle ist eine Mischung aus zwei Proteinen mit hohem biologischem Wert: Casein und Soja.

Natrium- und Calciumcaseinat 80%

Sojaproteinisolat 20%
Fett
Die Fettquelle ist eine Mischung aus drei Ölen: Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt, Canolaöl und Maisöl.

Safloröl mit hohem Oleinsäuregehalt 40%

Canolaöl 40%

Maisöl 20%
Die Fettkonzentration in ENSURE WITH FIBER steht in Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Heart Association (AHA). Die 6 Gramm Fett in ENSURE WITH FIBER stellen 22% der Gesamtkalorien dar, wobei 2,01% des Fetts von gesättigten Fettsäuren und 6,7% von mehrfach ungesättigten Fettsäuren stammen. Diese Werte liegen innerhalb des Bereichs der AHA-Richtlinien, worin ≤ 30% der Gesamtkalorien von Fett, < 10% der Kalorien von ungesättigten Fettsäuren und ≤ 10% der Gesamtkalorien von mehrfach ungesättigten Fettsäuren stammen.
Kohlenhydrat
ENSURE WITH FIBER enthält eine Kombination aus Maltodextrin und Saccharose. Die milde Süße und die zahlreichen Geschmacksrichtungen (Vanille, Schokolade, Butter-Pekannuss) und VARI-FLAVORS^® Flavor Pacs in Pekannuss, Kirsche, Erd beere, Zitrone und Orange helfen, dass der Patient der Formulierung nicht so rasch überdrüssig wird und er sie lieber zu sich nimmt. Vanille und andere Geschmacksrichtung außer Schokolade

Maltodextrin 66%

Saccharose 25%

Haferkleie 7%

Sojaballaststoff 2%

Schokolade

Maltodextrin 55%

Saccharose 36%

Haferkleie 7%

Sojaballaststoff 2%
Ballaststoffe
Die in ENSURE WITH FIBER verwendete Ballaststoff-Mischung besteht aus Haferballaststoff und Sojapolysaccharid. Diese Mischung resultiert in etwa 4 Gramm Gesamtballaststoff pro 8-fl-oz.-Portion. Das Verhältnis von unlöslichen zu löslichen Ballaststoffen ist 95 : 5.
Die zuvor beschriebenen, unterschiedlichen Nahrungsmittelergänzungen, die Fach leuten des Gebiets der Erfindung bekannt sind, können mit den PUFA dieser Erfindung substituiert und/oder ergänzt werden.
J. Oxepa^TM-Nahrungsmittel
Oxepa ist ein kalorienhältiges intestinales Nahrungsmittel mit geringem Kohlenhydratgehalt, das für die Regulierung des Nahrungsmittelhaushalts eines Patienten bestimmt ist, der an ARDS leidet oder Gefahr läuft, daran zu erkranken. Es hat eine einzigartige Kombination an Inhaltstoffen, umfassend ein patentiertes Ölgemisch, das Eicosapentaenylsäure (EPA von Fischöl), γ-Linolensäure (GLA von Boretschöl) und erhöhte Antioxidantienkonzentrationen enthält.
Kalorienverteilung

– Die Kaloriendichte ist mit 1,5 cal/ml (355 cal/8 fl oz.) hoch, um das Volumen gering zu erhalten, das erforderlich ist, um den Energiebedarf abzudecken.
– Die Kalorienverteilung in Oxepa ist in Tabelle 7 ersichtlich.

Fett

– Oxepa enthält 22,2 g Fett pro 8-fl-oz.-Portion (93,7 g/l).
– Die Fettquelle ist eine Ölmischung aus 31,8% Canolaöl, 25% mittelkettigen Triglcyeriden (MCT), 20% Boretschöl, 20% Fischöl und 3,2% Sojalecithin. Das typische Fettsäureprofil von Oxepa ist in Tabelle 8 gezeigt.
– Oxepa stellt eine ausgeglichene Menge an mehrfach ungesättigten, einfach ungesättigten und gesättigten Fettsäuren bereit, wie in Tabelle 10 dargestellt ist.
– Mittelkettige Triglyceride (MCT) – 25% der Fettmischung – unterstützt Magenentleerung, da sie vom Darmtrakt absorbiert werden, ohne durch Gallensäuren emulgiert zu werden.

Die einzelnen Fettsäurekomponenten des Oxepa^TM-Nahrungsmittels können mit den PUFA dieser Erfindung substituiert und/oder ergänzt werden.
Kohlenhydrat

– Der Kohlenhydratgehalt beläuft sich auf 25,0 g pro 8-fl-oz.-Portion (105,5 g/l).
– Die Kohlehydratquellen sind zu 45% Maltodextrin (ein komplexes Kohlenhydrat) und aus 55% Saccharose (ein einfacher Zucker), wobei beide leicht verdaulich und zu absorbieren sind.
– Der hohe Fett- und niedrige Kohlenhydratgehalt von Oxepa zielt darauf ab, die Kohlendioxid- (CO₂-) Produktion zu minimieren. Hohe CO₂-Konzentrationen können die Entwöhnung bei Beatmungsgerät-abhängigen Patienten erschweren. Die geringe Kohlenhydrat-Konzentration kann auch für jene Patienten nützlich sein, die stressbedingte Hyperglykämie entwickelt haben.
– Oxepa ist lactosefrei.

Kohlenhydrate der Nahrung, die Aminosäuren von Protein und die Glyceringruppierungen von Fetten können im Körper zu Glucose umgesetzt werden. Durch diesen Prozess werden die Kohlenhydrat-Anforderungen von Glucose-abhängigen Geweben (wie das zentrale Nervensystem und die roten Blutkörperchen) erfüllt. Eine Diät, die frei von Kohlenhydraten ist, kann jedoch zu Ketose, zu übermäßigem Katabolismus von Gewebsproteinen und zu Verlust von Flüssigkeit und Elektrolyten führen.
Diesen Auswirkungen kann durch tägliche Einnahme von 50 bis 100 g verdaulicher Kohlenhydrate vorgebeugt werden, sofern die Kalorienaufnahme auch angemessen ist. Die Kohlenhydratkonzentration in Oxepa ist auch ausreichend, um Gluconeogenese zu minimieren, sofern der Energiebedarf gedeckt ist.
Protein

– Oxepa enthält 14,8 g Protein pro 8-fl-oz.-Portion (62,5 g/l).
– Das gesamte Kalorie/Stickstoff-Verhältnis (150 : 1) deckt den Bedarf eines gestressten Patienten.
– Oxepa stellt ausreichend Protein bereit, um Anabolismus und das Aufrechterhalten von magerer Körpermasse zu fördern, ohne Atemprobleme zu provozieren. Hohe Proteinaufnahme ist für Patienten mit Atemnot problematisch. Obwohl Protein nur geringe Auswirkung auf die CO₂-Produktion hat, erhöht eine Protein-reiche Diät den Atemantrieb.
– Proteinquellen von Oxepa sind zu 86.8% Natriumcaseinat und zu 13,2% Calciumcaseinat.

Alle in dieser Spezifikation erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind ein Hinweis auf die Fachkenntnis jener Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet.
Da die Erfindung nun in all ihren Details ausführlich beschrieben wurde, wird es für Fachleute selbstverständlich sein, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen an dieser Erfindung vorgenommen werden können, ohne dadurch von der grundliegenden Idee oder vom Schutzumfang der beiliegenden Patentansprüche abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes oder isoliertes Polypeptid mit Δ5-Desaturase-Aktivität, wobei das Polypeptid zur Desaturierung eines Fettsäuremoleküls am 5. Kohlenstoff vom Carboxylende der Fettsäure fähig ist und das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest 60% Homologie zur 446-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest 80% Homologie zur 446-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest 90% Homologie zur 446-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Gereinigtes oder isoliertes Polypeptid mit Δ5-Desaturaseaktivität, wobei das Polypeptid eine Deletionsmutante von Seq.-ID Nr. 2 ist und zur Desaturierung eines Fettsäuremoleküls am 5. Kohlenstoff vom Carboxylende der Fettsäure fähig ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, worin das Polypeptid ein Aminosäuremotiv umfasst, das aus der aus den Resten 30–38, 41–44, 171–175, 203–212 und 387–394 von Seq.-ID Nr. 2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polypeptid nach Anspruch 5, worin das Polypeptid die Reste 30–38, 41–44, 171–175, 203–212 und 387–394 von Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das die Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 8, welche die Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Nucleinsäurekonstrukt, umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 8 oder 9, die an eine heterologe Nucleinsäure gebunden ist.
Nucleinsäurekonstrukt, umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 10, die operabel an einen Promotor gebunden ist.
Rekombinante Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 10 oder 11 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12, die eine Mikrobenwirtszelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine Hefezelle ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14, die im Vergleich zu einer Zelle, die nicht mit dem Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 10 oder 11 transformiert ist, mit 20:3-, 20:4- oder ω-3-20:4-Fettsäuren angereichert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Arachidonfettsäure, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Gegenwart einer Dihomo-γ-linolensäure unter Bedingungen, unter denen die Säure durch Expression eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Arachidonsäure übergeführt wird; Gewinnen der Arachidonfettsäure aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Gegenwart einer Dihomo-γ-linolensäure unter Bedingungen, unter denen das Polypeptid nach ei nem der Ansprüche 1 bis 7 gebildet wird, was zur Biosynthese einer langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäure führt; und Gewinnen der Fettsäure aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Fettsäure aus der aus ARA, DGLA und EPA bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, das außerdem die Formulierung der Fettsäure zu einem Produkt umfasst, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassende pharmazeutische Zusammensetzung; Nahrungsmittelformulierung; Kindernahrung; Nahrungsmittelergänzung; Nahrungsmittelersatz; Kosmetikum; und Tierfutter.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Nahrungsmittelformulierung, die Kindernahrung, die Nahrungsmittelergänzung oder der Nahrungsmittelersatz zumindest einen Makronährstoff umfasst, der aus der aus Kokosnussöl, Sojaöl, Canolaöl, Mono- und Diglyceriden, Glucose, essbarer Lactose, elektrodialysierter Molke, elektrodialysierter Magermilch, Molke, Sojaprotein und anderen Proteinhydrolysaten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Nahrungsmittelformulierung, die Kindernahrung, die Nahrungsmittelergänzung oder der Nahrungsmittelersatz zumindest ein Vitamin, das aus der aus Vitamin A, C, D, E und Vitamin-B-Komplexen bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und zumindest ein Mineral, das aus der aus Calcium, Magne sium, Zink, Mangan, Natrium, Kalium, Phosphor, Kupfer, Chlorid, Iod, Selen und Eisen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, umfassen.
Verwendung einer Mikrobenwirtszelle nach Anspruch 13 oder 14 zur Herstellung einer Fettsäure.
Verwendung nach Anspruch 22 zur Herstellung eines Produkts, das die Fettsäure umfasst, wobei das Produkt aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassende pharmazeutische Zusammensetzung; Nahrungsmittelformulierung; Kindernahrung; Nahrungsmittelergänzung; Nahrungsmittelersatz; Kosmetikum; und Tierfutter.