BG103796A - Методи и състави за синтез на дълговерижни полиненаситени мастни киселини - Google Patents

Методи и състави за синтез на дълговерижни полиненаситени мастни киселини Download PDF

Info

Publication number
BG103796A
BG103796A BG103796A BG10379699A BG103796A BG 103796 A BG103796 A BG 103796A BG 103796 A BG103796 A BG 103796A BG 10379699 A BG10379699 A BG 10379699A BG 103796 A BG103796 A BG 103796A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
leu
seq
gly
ala
phe
Prior art date
Application number
BG103796A
Other languages
English (en)
Inventor
Deborah Knutzon
Pradip Mukerji
Yung - Sheng HUANG
Jennifer Thurmond
Sunita Chaudhary
Amanda LEONARD
Original Assignee
Calgene Llc
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Calgene Llc, Abbott Laboratories filed Critical Calgene Llc
Publication of BG103796A publication Critical patent/BG103796A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Immunology (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до мастно-киселинна 5-десатураза, способна да катализира превръщането на дихомо- линоленова киселина до арахидонова киселина. Описани са последователностите на нуклеинови киселини, кодиращи 5-десатураза, последователноститена нуклеинови киселини, които се хибридизират с тях, ДНК структура, включваща 5-десатуразен ген, ирекомбинантен гостоприемников микроорганизъм или животно, експресиращо повишени нива на 5-десатураза. Разкрити са методи за ненасищане на мастна киселина при 5 позиция и за продуциране на арахидонова киселина чрез експресия на повишени нива на 5-десатураза. Предложени са мастни киселини и мазнини, които ги съдържат, които са ненаситени чрез 5-десатураза, продуцирана от рекомбинантни гостоприемникови микроорганизми или животни. Изобретението се отнася също и до фармацевтични състави, до състави за бебешки храни или диетични добавки, съдържащи мастни киселини, които са ненаситени чрез 5-десатураза, продуцирана от рекомбинантен гостоприемников микроорганизъм или животно.

Description

Memogu u състави за синтез на дълговерижни полиненаситени мастни киселини
Сродни описания
Настоящата заявка е частично продължение на заявка рее. No. 08/833,610, заявена на 11. Април, 1997.
Въведение
Област на изобретението
Настоящето изобретение се отнася до модулирани нива на ензими и/ или ензимни компоненти, отнасящи се до дълговерижни поли- ненаситени мастни киселини (PUFAs) в микроорганизми или животни.
Ниво на изобретението
ДВе глаВни семейства полиненаситени мастни киселини (PUFAs) са ω3 мастните киселини, представени от ейкосапентаеноената киселина (ЕРА), и об мастните киселини, представени от арахидоновата киселина (ARA). PUFAs са Важни компоненти на плазмената мембрана на клетката, където те могат да бъдат намерени под форма на фосфолипиди. PUFAs са необходими за развитието, по- специално за развитието на i
54/99 фБ
мозъка на подрастващите, и за тъканното формиране и възстановяване. PUFAs служат също и като прекурсори на други молекули, от значение в човешките същества и животните, включително простациклини, ейкозаноиди, левкотриени и простагландини.
Четири главни дълго верижни PUFAs от значение включват докосахексаеноена киселина (DHA) и ЕРА, които първично са установени в различни типове рибено масло, гамалиноленова киселина (GLA), която е установена в семената на много растения, включително вечерната примула (Oenothera biennis), бораго (Borago officinalis) и черно френско грозде (Ribes nigrum) и стеаридонова киселина (SDA), която е установена в морски мазнини и растителни семена. ARA могат да бъдат пречистени от животински тъкани, включително черен дроб и надбъбречна жлеза. GLA, ARA, ЕРА SDA са сами по себе си, или диетични предшевственици на важни дълговерижни мастни киселини, включвани в простагландиновата синтеза, при лечение на сърдечни заболявания, и в развитието на мозъчна тъкан.
Полиненаситените мастни киселини притежават множество фармацевтични и медицински приложения, включително лечение на сърдечни заболявания, рак и артрит.
Съществуват множество източници за производство с цел търговия за DHA, включително различни морски организми, масла, получени от студеноводна морска риба, и фракции на жълтък. За ARA, за производствени нужди могат да бъдат използвани микроорганизми, включително от родовете Mortierella, Entomophthora, Phytium и Porphyridium. Търговски източници на GLA включват вечерна примула, черно френско ашпнбос1пс1ц -оичлр а оПзчз гцрлагцощ ouirq ‘пнвпнвгйо вн кпНЕШнаибаф BHgBtnBwoddg 'ипнашонб nHRdnenvngEmo adgo6 -ou пнвбзраугшо швбчд вб швгои ошабч^ ‘ивш n5[39hnPi0H05[n оншнзбХ^но^зн 9 НПЬВН П£ОШ ой ndXuiv/Ц вдп^вш вн ошапшпдввя в<1ХшуХ5[онои д 9dgo6 шидвшзбдби 99 дн вб азром η aninngEBd oHVBnadgwB^ be пнгИпшивбв вз ан ‘o?Bdog ошв5[ ‘sv+ild mBdntiXSodu ошпоз[ ‘amndXmvXx -кмав вгмавдшодвйдо вшвувнвшзо вн BHBdx вн oguioogenodu шо шзогспбохдоан вдош а вшвнвебчдо η nnUBvAuou aiurqmagoh вн ипвнвизца вннкошзои be кпПндбА^но^ вн ипрдо а впнашзвй пндпдобоузвгс онуашвдобаузои швбудугшо 93 ОШПО5[ ВН ‘ШМ9Е П5[ЗНВиОШЗО5[ЗУ93 ПППНЬОШЕП ПНУ9ШПШ9Вб шо η В5[вш ‘nHgnd шо ош^в^ ашпдпдоб д кпПвХицАуф nHnhndu вб азрогс ошанвдкуодвЕ η вго5[кноц 'вбабо вшвнуо^о шо nvaumadqjMBE швйпуХр^Ацв вб швгого ‘пнпневгм пндпб онувпПаиз -ou η ‘пнпневи аилпрнпшодпж внвбх вн узшпшоаиве ошв^ gnvwanduaH uo(X6odu дчцвш пдв0ивн вб азрои BHBduio кодз шо ошао^ ‘ui^Xdodu кпнвуз^ шо пнзуабшо швбчд вб онбогвпан п^заиги^оно^п ovng ng ошпо^ ‘uiBwodB η зА^д нашвпйиан швип пнпневи ашпндпд ’govXxndga ndu HBudoHEn абчд вб ayow nvn ппПвпбвд nH6odndu rmduuiadu вб 9ψοΐΛΐ ψ)Ηι шкпндпд ошанвдпдоб ndu ппПвАш^Ауф nHBdnvoduiHOipH вн ипрдо во оТпчз пПпнношеп 9umH6odndn Vdfld дьадои nvn внба вн пшвгод вз ошпоц ‘пнпневгм вн анвдвиХуои вг nvn SVJQJ 9ШПНВУ95р ШО 9h9gOU ПУЛ Внба ВН ЗНКУЗбшО BE 9HBgtU3nh9du ондпгнашззр швдзрпгп вб a^pow пПпнношвп пгаш шо пнаьАуои ‘ашпнпнгвгс оТпвг ошд -двшзчз нзузви нанагойашах абйчдш швдв^рашпйи ‘imHauioBd η пншодшр ошву[ ‘sv+fld RH пПпньошвп nH6odnd]j пПчшвшзобан пньпуев0 вип пПпньошеп nH6odndu шо syjfu вн ошодшзбодвпойи ‘вдош шо оипзпдвган ’O2Bdog η абгойв дф 66/К
54/99 фБ животински тъкани съдържат ниски стойности на ARA и са трудни за обработка. Микроорганизми като Porphyridium и Mortierella са трудни за култивиране в търговски мащаб.
Диетичните заместители и фармацевтични форми, съдържащи PUFAs могат да съхранят недостатъците на източника на PUFA. Заместители като капсули рибно масло може да съдържат ниски нива от специално желаната компонента и поради това изискват високи дози. Високите дози водят до усвояване на високи нива нежелани компоненти, включително контаминанти. Неприятните вкусове и аромати на заместителите може да направят такива режими нежелани, и може да инхибират желанието на пациента. Следва да се предприемат грижи при приемането на такива заместители на мастните киселини, тъй като свръхдобавянето може да доведе до подтискане на кръговрата на ендогенната биосинтеза и води до конкуренция с други необходими мастни киселини в различни липидни фракции in vivo , което води до нежелани резултати. Например, ексимос, подложен на диета, богата на Δ3 мастни киселини, има повишена склонност да кърви (US Pat. No. 4 874 603)·
В биосинтезата на PUFA са включени много ензими. Линоленовата киселина (LA, 18:2 Δ9, 12) се получава от олеинова киселина (18:1Δ°) от Δ12- десатураза. GLA (18: Δ6, 9, 12) се получава от линоленова киселина (LA, 18: 2 Δ9, 12) посредством Δ6- десатураза. Получаването на ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) от дихомо- гама- линоленова киселина (DGLA, 20: 3Δ8, 11, 14) се катализира от Δ5- десатураза. Обаче, животните не могат
β.
54/99 ФБ
ненасищат след позиция Δ9 и поради това не могат да превръщат олеиновата киселина (18:1 Δ9) в линоленова киселина (18:2 Δ912). Вероятно, а- линоленовата киселина (ALA, 18:3 ?9, 12, 15) не може да бъде синтезирана от бозайници. Други еукариоти, включително фунги и растения, притежават ензими, които ненасищат при позиция Δ12 и Δ15. Основните полиненаситени мастни киселини от животни поради това са получени диета и/ или от ненасищане и елонгация на линоленова киселина (18: 2 Δ9,12) или а- линоленова киселина (18:3 Δ9,12,15). Ето защо, желателно е получаването на генетичен материал, включен в биосинтезата на PUFA от видове, които естествено продуцират тези мастни киселини и да се експресира изолираният материал в микробна или животинска система, което може да бъде манипулирано да обезпечи продуцирането на търговски количества от една или друга PUFAs. Така, налице е необходимост от десатурази на мастните киселини, гени които ги кодират, и рекомбинантни методи за получаването им.
Релевантни литературни източници
Получаването на гама- линоленова киселина от Δ6десатураза е описано в USPN 5 552 306. ПолучаВане на 8, 11ейкозаденоинова киселина с участието на Mortierella alpina е описано в USPN 5 376 541. Получаването на докозахексаенова киселина с участието на динофлагелати е описано в USPN 5 407 957. Клониране на Δ6- палмитоил- ацил носещият протени десатураза е описано в РСТ публикация WO 96/13591 и USPN 5 614 400. Клонирането на Δ6- десатураза от бораго е описано в
54/99 фБ
РСТ публикация WO 96/13972, ЕР 0550 162 Al, ЕР 0561 569 А2, ЕР 0 644 263 А2, ЕР 0 736 598 А1, и В USPN 5 057 419. Клонирането на Δ12- десатурази от различни организми е описано В РСТ публикация WO 94/11516 и USPN 5 443 974. Клонирането на ?15десатурази от различни организми е описано В РСТ публикация WO 93/11245. Всички публикации и US патенти или заявки, отнесени към настоящата, са включени изцяло в справката.
Общо за изобретението
Предложени са нови състави и методи за получаване на поли- ненаситени дълго верижни мастни киселини или PUFAs. Съставите включват нуклеинови киселини, кодиращи Δ5десатураза и/ или полипептид, притежаващ Δ5- десатуразна активност. Експресия на десатуразния полипептид осигурява относително повишаване на Δ5- ненаситена PUFA, или техни метаболитни родственици, като резултат от изменени концентрации на ензими и субстрати, включени в биосинтезата на PUFA Изобретението намира приложение например, при получаване в голям мащаб на PUFA, съдържаща мазнини, които включват, например, ARA, ЕРА или DHA.
В предпочитан вариант на изпълнение са предложени последователност на нуклеинова киселина, включваща Δ5десатураза, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID NO: 1, полипептид, кодиран от нуклеиновата киселина, и пречистен или изолиран полипептид, показан на фигура ЗА- D (SEQ ID NO: 2), както и изолирана нуклеинова киселина, кодираща полипептида от фигура ЗА- D (SEQ ID NO: 2). Друг вариант на изпълнение на
54/99 ФБ
изобретението е последователност на изолирана нуклеинова киселина, която кодира полипептид, където посоченият полипептид ненасища молекула мастна киселина при петия въглерод от карбоксилния край на молекулата. Нуклеиновата киселина е за предпочитане получена от еукариотична клетка, като клетка от гъба, или гъбна клетка от род Mortierella, или от рода/вида Mortierella alpina. Предпочитана е също и изолирана молекула нуклеинова киселина, включваща последователност, която се деспирализира до нуклеотидната последователност, показана на фигура ЗА- 3D (SEQ ID N0:1), и нуклеинова киселина, която кодира амино киселинна последователност, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:2). В частност, нуклеиновата киселина кодира амино киселинна последователност, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:2), която е подбрана от групата, състояща се от амино киселинни остатъци 30- 38, 41- 44, 171- 175, 203- 212 и 387- 394. В допълнителен вариант на изпълнение, изобретението предлага изолиран или пречистен полипептид, който ненасища молекула мастна киселина при въглерод 5 от карбоксилния край на молекулата. Предложена е също изолирана последователност на нуклеинова киселина, която се хибридизира към нуклеотидната последователност, показана на фигура ЗА-D (SEQ ID N0:1), изолирана последователност нуклеинова киселина, притежаваща най- малко 50% идентичност с тази на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:1).
Настоящето изобретение по- нататък включва структура на нуклеинова киселина, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:1), присъединена към хетероложна нуклеинова
54/99 фБ
киселина; структура на нуклеинова киселина, включваща нуклеокиселинна последователност, показана на фигура 3A-D (SEQ ID N0:1), оперативно свързана към промотор, и структура на нуклеинова киселина, включваща нуклеотидна последователност, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:1), оперативно свързана към промотор, който е функционален в микробна клетка. В предпочитан вариант на изпълнение, микробната клетка е дрождева клетка, и нуклеотидната последователносте получена от гъба, като гъба от рода Mortierella, по- специално гъба от вида Mortierella alpina.
В друг вариант на изпълнение на изобретението, се предлага структура на нуклеинова киселина, която включва нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, съдържащ амино киселинна последователност, която съответства на или е комплементарна на амино киселинна последователност, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID NO: 2), където нуклеотидната последователност е оперативно свързана с промотор, който е функционален в гостоприемникова клетка, и където нуклеотидната последователност кодира полипептид, който ненасища молекула мастна киселина при въглерод 5 от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина. В допълнение, изобретението предлага структура на нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, която кодира функционално активна Δ5десатураза, където десатуразата включва амино киселинна последователност, която съответства на или е комплементарна на всички или на част от амино киселинна последователност, показана на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:2),
ММЙШМ
54/99 фБ
където нуклеотидната последователност е оперативно свързана към промотор, функционален в гостоприемникова клетка.
Изобретението включва гостоприемникова клетка, съдържаща структура на нуклеинова киселина от изобретението. В предпочитан вариант на изпълнение, предложена е рекомбинантна гостоприемникова клетка, която включва най- малко едно копие на ДНК последователност, която кодира функционално активна десатураза на мастна киселина на Mortierella, alpina, която притежава амино киселинна последователност, която е показана на фигура ЗА- D (SEQ ID N0:2), където клетката или родоначалник на клетката е трансформиран с вектор, включващ посочената ДНК последователност, и където ДНК последователността е оперативно свързана към промотор. Гостоприемниковата клетка е както еукариотична, така и прокариотична. Предпочитани еукариотични гостоприемникови клетки са такива, подбрани от групата, състояща се от клетка на бозайник, клетка на насекомо, фунгална клетка и клетка на водорасло. Предпочитани бозайникови клетки включват клетка на птица, фунгалната клетка е такава на дрожди, и клетка на морско водорасло. Предпочитаните прокариотични клетки включват такива, подбрани от групата, състояща се отбактерия, цианобактерия, клетки които съдържат бактериофаг и/или вирус. ДНК последователността на рекомбинантната гостоприемникова клетка за предпочитане съдържа промотор, който е функционален в гостоприемниковата клетка.
54/99 фБ
ГостоприемникоВите клетки от изобретението, които съдържат ДНК последователностите от изобретението, са набогатени на мастни киселини, В отношение 20: 3 за мастните киселини. В предпочитан Вариант на изпълнение, гостоприемникоВите клетки са набогатени до 20: 4 с мастни киселини В сравнение с нетрансформирана гостоприемникоВиа клетка, която не съдържа дадената ДНК последователност, и/ ! или е набогатена до 20: 5 с мастни киселини, В сравнение с нетрансформирана гостоприемникоВа клетка, която не съдържа ф посочената ДНК последователност. В още едно друго предпочитано изпълнение, изобретението предлага рекомбинантна гостоприемникоВа клетка, която съдържа мастна киселина, подбрана от групата, състояща се от дихомоγ- линоленоВа киселина, п-6 ейкосатриеноена киселина, 20: Зп_6 киселина и 20: 3 (8,11,14) киселина.
Настоящето изобретение Включва също метод за получаване на арахидонова киселина В микробиална клетъчна култура, където методът Включва култивиране на микробиалната клетъчна култура, притежаваща множество от Ф микробни клетки, които съдържат една или поВече нуклеинови киселини, кодиращи полипептид, който превръща дихомо- улиноленоВа киселина В арахидонова киселина, където нуклеиновата киселина е оперативно свързана към промотор, В условия при които са експресирани една или поВече нуклеинови j киселини, където арахидоноВата киселина се продуцира В микробната клетъчна култура. В различни предпочитани j Варианти на изпълнение на изобретението, полипептида е ензим, ΐ който ненасища молекулата на мастната киселина при петия
I i
I il
I
54/99 фБ
Въглерод от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина; нуклеиновата киселина е получена от Mortierella sp. И субстрата за дадения полипептид е доставен екзогенно. Микробните клетки, използвани в методите могат да бъдат както еукариотични клетки, така и прокариотични клетки. Предпочитаните еукариотични клетки са такива, подбрани от групата, състояща се от клетка на бозайник, клетка на инсекта, гъбна клетка и клетка на водорасло. Предпочитаните клетки на бозайник включват птича клетка, предпочитаната гъбна клетка е дрождева, и предпочитаната водораслова клетка е клетка на морско водорасло. Предпочитаните прокариотични клетки включват такива, подбрани от групата, състояща се от бактерии, цианобактерии, клетки които съдържат бактериофаг, и/ или вирус. Последователността на нуклеиновата киселина, кодираща полипептида на микробната клетка за предпочитане съдържа промотор, който функционира в гостоприемниковата клетка, и която е незадължително индуктивен промотор, например от компоненти на културалния бульон. Използваните с предпочитание микробиални клетки в методите са дрождеви клетки, като клетките на Saccharomyces.
В друг вариант на изпълнение на изобретението, предложена е рекомбинантна дрождева клетка, която превръща повече от около 5% от 20: 3 мастно киселинния субстрат в 20: 4 мастно киселинен продукт.
Предложена е също мазнина, съдържаща една или повече PUFA. Количеството на тази една или повече PUFAs е приблизително 0.3 - 30% арахидонова киселина (ARA), приблизително 0. 2 - 30% дихомо- у- линоленова киселина (DGLA),
54/99 фБ
u приблизително 0.2- 30% γ- линоленова киселина (GLA). Предпочитана мазнина от изобретението е такава, В която съотношението ARA: DGLA: GLA е приблизително 1.0: 19.0: 30 до 6.0 : 1.0 : 0.2. Друг предпочитан вариант на изпълнение на изобретението е фармацевтичен състав, включващ мастите във фармацевтично приемлив носител. По- нататък е предложен хранителен състав, съдържащ мастите от изобретението. Хранителните състави от изобретението за предпочитане са включени в бозайников гостоприемник парентерално или интернално. Предпочитан състав от изобретението за интернална консумация е формула за подрастващи. В предпочитан вариант на изпълнение, хранителните състави от изобретението са в течна форма или твърда форма.
Настоящето изобретение включва също метод за ненасищане на мастна киселина, където методът включва култивиране на рекомбинантна микробиална клетка от изобретението при условия, подходящи за експресия на полипептид, кодиран от нуклеиновата киселина, където гостоприемниковата клетка по- нататък включва мастно киселинен субстрат от полипептида. В предпочитан вариант на изпълнение, е предложена мастна киселина, ненаситена по метода, включващ масло съдържащо мастната киселина.
Настоящето изобретение е насочено също към пречистен нуклеотид и пептидни последователности, представени на SEQ ID NO: 1- 34. Настоящето изобретение по- нататък е насочено към методи за приложение на последователностите, представени на SEQ ID N0:1 - 34 като сонди за идентифициране
54/99 фБ
на сродни последователности, като компоненти на експресионни системи и като компоненти на системи, приложими за получаване на трансгенна мазнина.
Настоящето изобретение по- нататък е насочено към методи за получаване на изменени биосистеми за дълговерижни полиненаситени мастни киселини чрез култивиране на трансгенни микроби, които кодират трансгенни експресионни продукти, които ненасищат молекула мастна киселина при петия въглерод от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина.
Настоящето изобретение по- нататък е насочено към формули, диетични заместители под формата на течности или твърди Вещества, съдържащи дълговерижните мастни киселини от изобретението. Тези формули и заместители могат да бъдат давани на хора или животни.
формулите и заместителите от изобретението могат по- нататък да Включват най- малкоедин макрохранителен компонент, подбран от групата, състояща се от кокосово масло, канолово масло, моно- и диглицериди, глюкоза, хранителна лактоза, лектродиализирана суроватка, електродиализирано обезмаслено мляко, млечна суроватка, соев протеин и други протеинови хидролизати.
формулите от настоящето изобретение по- нататък може да Включват най- малко един витамин, подбран от групата, състояща се от Витамин A, С, D, Е и В комплекс; и най- малко един минерал, подбран от групата, състояща се от калций, магнезий, цинк, манган, натрий, калий, фосфор, мед, хлорид, йод, селен и желязо.
54/99 ФБ
Настоящето изобретение по- нататък е насочено към метод за лечение на пациенти в състояние, причинено от недостатъчен прием или продуциране на полиненаситени мастни киселини, включващи прилагане на пациентите на диетични заместители от изобретението в количество, достатъчно да повлияе за излекуване на пациента.
Настоящето изобретение по- нататък е насочено към козметични или фармацевтични състави от материала от изобретението.
Настоящето изобретение е насочено също към изолирана нуклеотидна последователност, съдържаща нуклеотидна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 u SEQ ID NO: 27.
Настоящето изобретение е насочено също към изолирана пептидна последователност, включваща пептидна последователност, подбрана от групата, състояща се от: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 u SEQ ID NO: 34.
Настоящето изобретение е насочено още и към трансгенни мазнини във фармацевтично приемливи носители. Настоящето изобретение по- нататък е насочено към хранителни заместители, козметични агенти и формули за подрастващи, съдържащи трансгенни мазнини.
Настоящето изобретение по- нататък е насочено към метод за биосинтеза на изменени дълговерижни полиненаситени
54/99 ФБ мастни киселини, включващ етапите на: култивиране на микроорганизми, притежаващи клетки съдържащи трансген, който кодира трансгенен експресионен продукт, който ненасища молекули мастни киселини при въглерод 5 от карбоксилния край на посочената молекула мастна киселина, където трансгена е оперативно свързан с експресионна контролна последователност, при условия на експресия на трансгена, при които се променя биосинтезата на дълговерижните полиненаситени мастни киселини.
Настоящето изобретение е насочено още към приложението на верига полиненаситена мастна киселина, подбрана от групата, състояща се от ARA, DGLA ЕРА.
Настоящето изобретение по- нататък е насочено към фармацевтични състави, включващи най- малко един хранителен компонент, подбран от групата, състояща се от витамин, минерал, въглехидрат, захар, една амино киселина, сВободна мастна киселина, фосфолипид, антиоксидант и фенолно съединение.
Кратко описание на чертежите фигура 1 показва възможните цикли за синтез на арахидоноВа киселина (20: 4 Δ5, 8, 11, 14) и стеаридоноВа киселина (18: 4 Δ6, 9, 12, 15) от палмитиноВа киселина (С16) от различни организми, Включително Водорасли, Mortierella и хора. Тези PUFAs могат да служат като прекурсори за други молекули, Важни за
54/99 фБ хора и други животни, включително простациклини, левкотриени и простагландини, някои от които са показани.
фигура 2 показва възможните цикли за получаване на
PUFAs в допълнение към ARA, включително ЕРА и DHA, за различни организми.
фигура ЗА- D показва ДНК последователност за Mortierella alpina Δ5- десатураза и предположените амино киселинни последователности.
фигура 4 показва предположените амино киселинни последователности на PCR фрагмента (виж Пример 1).
фигура 5А и 5В показват подреждането на протеиновата последователност на Δ5- десатураза с Δ6- десатураза.
фигура 6А и 6В показват влиянието на избора на субстратното добавяне за индуцирането на превръщане на субстрата за получаване н SC334 съдържащ Δ5- десатуразния ген.
фигура 7А и 7В показват влиянието на индуциращата концентрация върху Δ5- десатуразната експресия в SC334.
фигура 8А и 8В показват влиянието на индукционната температура върху Δ5- десатуразна активност в SC334.
фигура 9А и 9В показват влиянието на щама гостоприемник за превръщането на субстрата за продуциране в щамовете, експресиращи Δ5- десатуразния ген при 15° С.
фигура 10А и 10В показват влиянието на щама гостоприемник за превръщане на субстрата за получаване в щамовете, експресиращи Δ5- десатуразния ген при 30°С.
54/99 фБ фигура 11 показва влиянието на щама гостоприемник, експресиращ холин трансфераза, както и Δ5- десатуразния ген за превръщането на субстрата в продукт.
фигура 12А и 12В показват влиянието на състава на средата и температурата за превръщане на субстрата в продукт в два гостоприемникови щама, експресиращи Δ5 десатуразния ген.
фигура 13 показва подреждането на протеиновата последователност на Ма 29 и прилежащата 253538а.
фигура 14 показва подреждането на протеиновата последователност на Ма 524 и прилежащата 25358а.
Кратко описание на секВенционния листинг
SEQ ID NO: 1 показва ДНК последователност на Mortierella alpina Δ5- десатураза.
SEQ ID NO: 2 показва ДНК последователност на Mortierella alpina Δ5- десатураза.
SEQ ID NO: показва предполагаемата амино киселинна последователност на М. alpina PCR фрагмент (виж Пример 1).
SEQ ID NO: 4- SEQ ID NO: 7 показват предполагаемите амино киселинни последователности на различнАб- десатурази.
SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 показват PCR праймерните последователности за Δ6- десатурази.
SEQ ID NO: 10 показва праймер за обратна транскрибция на тотална РНК.
SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 показват амино киселинни мотиви за десатуразни последователности.
54/99 ФБ
SEQ ID NO: 13 u SEQ ID NO: 14 показват нуклеотидната и амино киселинната последователности на Dictyostelium discoideum десатуразна последователност.
SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 показват нуклеотидната и амино киселинна последователности на Phaeodactylum tricomutum десатуразна последователност.
SEQ ID NO: 17- 20 показват нуклеотида и предполагаемата амино киселинна последователност на Schizochytrium сДНК клон.
SEQ ID NO: 21- 27 показват нуклеотидните последователности за човешки десатурази.
SEQ ID NO: 28- 34 показват пептидните последователности за човешки десатурази.
Подробно описание на изобретението
За по- пълно разбиране на изобретението, са предложени следните определения:
Δ5- десатураза: Δ5- десатуразата е ензим, който въвежда двойна връзка между въглеродите 5 и 6 от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина.
Δ6- десатураза: Δ6- десатураза е ензим, който въвежда двойна връзка между въглероди 6 и 7 от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина.
Δ9- десатураза: Δ9- десатураза е ензим, който въвежда двойна връзка между въглероди 9 и 10 от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина.
54/99 фБ
Δ12- десатураза: Δ12- десатураза е ензим, който въвежда двойна връзка между въглероди 12 и 13 от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина
Мастни киселини: Мастните киселини са клас съединения, съдържащи дълга въглеводородна верига и крайна карбоксилна група. Мастните киселини включват:
Мастни киселини
12:0 лауринова киселина
16:0 палмитинова киселина
16:1 палмитолеинова киселина
18:0 стеаринова киселина
18:1 олеинова киселина Δ9-18:1
18:2 Δ5,9 таксолеинова киселина Δ5,9-18:2
18:2 Δ6,9 6,9-октадекадиенова киселина Δ6,9-18:2
18:2 линоленова киселина Δ9,12- 18:2(LA)
18:3 Δ6,9,12 гама- линоленова киселина Δ6,9,12-18:3 (GLA)
18:3 Δ5,9,12 пиноленова киселина Δ5,912-18:3
18:3 алфа- линоленова киселина Δ9,12,15-18:3 (ALA)
18:4 стеаридонова Δ6,9,12,15- 18:4
54/99 фБ
киселина (SDA)
20:0 арахидиноВа киселина
20:1 ейкосценова киселина
22:0 бехехиноВа киселина
22:1 еруцинова киселина
22:2 докасадиеноВа киселина
20: 4ω6 арахидоноВа киселина Δ5, 8, 11, 14- 20: 4 (ARA)
20:3ω6 соб-ейкосатриенова дихомо- гама линоленоВа Δ8, 11, 14- 20: (DGLA)
20:5ω3 ейкосапентаноена (ТимнодиноВа киселина) Δ5, 8, 11, 14, 17- 20: 5 (ЕРА)
20:3ω3 ω3- ейкосатриеноена Δ11, 16, 17- 20: 3
20:4ω3 ω3- ейкосатетраеноена Δ8, 11, 14, 17- 20: 4
20: ω3 докасапентаеноена Δ7, 10, 13, 16, 19- 22: 5 (co3DPA)
20:6ω3 докохексаеноена (цербоноба киселина) Δ4, 7, 10, 13, 16, 19- 22: 6 (DHA)
24:0 лигноцериноВа киселина
54/99 ФБ
Kamo се имат предвид тези определения, настоящето изобретение е насочено към ноВи ДНК последователности, ДНК структури, предложени са методи и състави, които позволяват модификация на съдържанието на поли- ненаситени мастни киселини на, например, микробни клетки или жиВотни. ГостоприемникоВите клетки са манипулирани така, че да експресират смисловата или антисмислоВа транскрибция на ДНК, кодираща полипепт(иди), които катализират превръщането на DGLA В ARA. Субстратът(ите) за експресираните ензими могат да бъдат продуцирани от гостоприемникоВата клетка или може доставена по екзогенен път. За постигане на експресия, трансформираната ДНК е оперативно свързана с транскрибционно и транслационно иницииране и терминиращи регулаторни участъци, които са функционални В гостоприемникоВите клетки. Структурите, Включващи гена за експресия, може да осигури интеграция в генома на гостоприемникоВата клетка или може автономно да се репликира В гостоприемникоВата клетка. За получаване на ARA, използваните експресионни касети обикновено ВключВат касета, която осигурява Δ5- десатуразна активност, поспециално в гостоприемникоВа клетка, която продуцира или може да приеме DGLA. Продуцирането на ω6- тип ненаситени мастни киселини, като ARA, е предпочитано в гостоприемникоВ микроорганизъм или животно, които са по същество свободни на ALA. Гостоприемника е подбран или получен чрез отстраняване или инхибиране активността на Δ15- или ω3- тип десатураза (Виж фигура 2). Ендогенната десатуразна
54/99 ФБ активност може да бъде повлияна чраз доставяне на експресионна касета за антисмислова Δ15- или ω3- транскрибция, чрез разрушаване, заместване и/ или делеция на всички или на част от чишенния ген, или чрез добавяне на Δ15- или ω3десатуразен инхибитор. Получаването на LA също може да бъде повишено чрез осигуряване на експресионна касета за Δ9 и/или Δ12- десатурази, където техните съответни ензимни активности са лимитиращи.
Микробиално получаване на мастни киселини
Микробиалното получаване на мастни киселини притежава няколко преимущества пред пречистването от природни източници, като риба или растения. Много микроби са известни със значително опростени маслени състави, в сравнение с тези на висшите организми, което прави пречистването на желаните компоненти по- лесно. Микробното получаване не е обект на флуктуации, причинени от външни вариабилности, като времето и снабдяването с храна. Получените по микробиален път мазнини са по същество свободни на контаминанти, дължащи се на замърсявания на околната среда. В допълнение, микробите могат да предложат PUFAs с определени форми, които могат да имат специфични приложения. Например, Spirulina може да осигури PUFAs предимно в първа и трета позиции на триглицеридите; разграждане с панкреатични липази преференциално освобождава мастни киселини от тези позиции. Следвайки инжектирането на триглицериди в хора и животни, получени от Spirulina, тези PUFAs се освобождават от панкреатични липази като свободни мастни киселини и по този
54/99 фБ начин са директно достъпни, например, за развитието на мозъка на подрастващите. В допълнение, получаването на микробиални мазнини може да бъде манипулирано чрез контролиране на условията на култивиране, предимно чраз осигуряване на определени субстрати за микробиално експресирани ензими, или чрез добавяне на съединения, които подтискат нежелани биохимични превръщания. В допълнение към тези преимущества, получаването на мастни киселини от рекомбинантни микроби, способността за изменение профила на природно срещаните микробиални мастни киселини чрез предлагането на нови синтетични цикли в гостоприемника или чрез подтискане на нежелани такива, по този начин повишаване нивата на желаните PUFAs, или техните свързани форми, и понижаванне нивата на нежелани PUFAs.
Получаване на мастни киселини в животни
Получаването на мастни киселини В животни предоставя също някои преимущества. Експресията на десатуразни гени в животни може да продуцира силно повишени нива на желани PUFAs В животински тъкани, правейки възстановяването на тези тъкани по- икономично. Например, когато желаните PUFAs са експресирани в гръдното мляко на животни, методи за изолиране на PUFAs от животинско мляко са добре установени. В допълнение към осигуряване на източник за пречистване на желани PUFAs, животинското мляко може да бъде манипулирано посредством експресия на десатуразни гени, както самостоятелно, така и В комбинация с други човешки гени, за осигуряване на животинските млека с PUFAs състави, по
54/99 ФБ
същество сходни на човешкото мляко по време на различни етапи от развитието на подрастващите. Хуманизирани животински млека могат да служат като формула за подрастващи, когато кърменето е невъзможно или нежелателно, или в случаи назаболяване.
В зависимост от гостоприемниковата клетка, достъпността на субстрата, и желания краен продукт(ти), са важни няколко полипептида, по- специално десатурази. Под “десатураза“ се предполага полипептид, който може да ненасити една или повече мастни киселини за получаване на моно- или поли- ненаситена мастна киселина или техен желан предшевственик. От специален интерес са полипептиди, които могат да катализират превръщането на DGLA за получаване на ARA, което включва ензими, които ненасищат в позиция Δ5. Под “полипептид “ се разбира която и да е верига от амино киселини, независимо от дължината или пост- транслационната модификация, например, гликозилиране или фосорилиране. Съображенията за избора на специфичен полипептид, притежаващ десатуразна активност включват pH оптимума на полипептида, независимо дали полипептида е ограничаващ скоростта ензим или негов компонент, дали използваната десатураза е съществена за синтезата на желана полиненаситенамастна киселина, и/или ко- фактори, изисквани от полипептида. Експресираният полипептид за предпочитане има параметриу конкурентни с биохимичната среда на локализацията му в гостоприемниковата клетка. Например, полипептида може да трябва да се конкурира за субстрата с други ензими в гостоприемниковата клетка. Анализът на Кт и
54/99 фБ специфичната активност на въпросния полипептид поради това се пресмятат при определяне дали даден протеин е подходящ за модифициране получаването на PUFA в дадена гостоприемникова клетка. Използваният полипептид в определена ситуация е такава, която може да функционира в условията, намиращи се в гостоприемниковата клетка, но може да бъде и който и да е полипептид, притежаващ десатуразна активност, която има желаната характеристика така че да може да модифицира съответното получаване на желана PUFA.
За получаване на ARA, използваната ДНК последователност кодира полипептид, притежаващ Δ5десатуразна активност. В определени случаи, той може да бъде куплиран с експресионна касета, която осигурява продуцирането на полипептид с Δ6- десатуразна активност и гостоприемниковата клетка може незадължително да бъде изчерпана на която и да е налична Δ15- десатуразна активност, например чрез осигуряване на транскрибционна касета за получаване на безсмислови последователности спрямо Δ15десатуразния транскрибционен продукт, чрез разрушаване на Δ15- десатуразния ген, или чрез използване на гостоприемникова клетка, която е естествено, или в резултат на мутация, притежава ниска Δ15- десатуразна активност. Инхибирането на нежелани десатуразни цикли също могат да бъде осъществено посредством използването на специфични десатуразни инхибитори, като тези, описани в U.S Patent No. 4 778 630. Изборът на комбинация от използвани касети може да зависи частично от PUFA профила на гостоприемниковата клетка.
54/99 фБ
Там, където Δ5- десатуразна активност на гостоприемниковата клетка е лимитираща, свръхекспресията на ?5- десатураза самостоятелно най- общо би била достатъчна да осигури засилена ARA продукция в присъствието на подходящ субстрат, като DGLA. ARA продукцията може също да бъде повишена чрез осигуряване на експресионни касети за Δ9- или Δ12- десатуразни гени, когато активностите на такива десатурази са лимитиращи. Схема за синтез на арахидонова киселина (20:4 Δ5’8 IL14 ) от палмитинова киселина (С16) е показана на фигура 1. Ключов ензим в този цикъл е Δ5- десатураза, която превръща DH-γ- линоленова киселина (DGLA, ейкосатриеноена киселина) в ARA. Превръщането на а- линоленоВа киселина (ALA) в стеаридонова киселина с Δ6- десатураза също е показано. Получаването на PUFAs в допълнение към ARA, включително ЕРА и DHA е показано на фигура 2.
Източници на поАипептиди, притежаващи десатуразна активност
Източник на полипептиди, притежаващи десатуразна активност и олигонуклеотиди, кодиращи такива полипептиди са организми, които продуцират желана полиненаситена мастна киселина. Като пример, микроорганизми които притежават способност да продуцират ARA могат да бъдат използвани като източник на Δ5- десатуразна активност. Такива микроорганизми включват, например, тези принадлежащи към родовете Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporum, Mucor, Fusarium, Aspergillus,
54/99 ФБ
Rhodotorula, и Entomophthora. В рамките на род Porphyridium, от специален интерес е Porphyridium cruentum. В рамките на род Mortierella, от специален интерес са Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora u Mortierella alpina. В рамките на рода Mucor, от специален интерес са Mucor circinelloides и Mucor javanicus.
ДНК, кодиращи желаните десатурази, могат да бъдат идентифицирани по различни начини. Например, източник на желаната десатураза, например геномна или сДНК библиотеки от Mortierella, се скринират с маркирани ензимно- или химичносинтезирани сонди, които могат да бъдат направени от ДНК, РНК, или неприродно срещани нуклеотиди, или техни смеси. Сондите могат да бъдат ензимно синтезирани от ДНКи от известни десатурази за нормално или редуцирано- строги хибридизационни методи. Олигонуклеотидни сонди могат да бъдат използвани също за скрининг на източниците и могат да се основават на последователности на известни десатурази, включително последователности, съхранени между известни десатурази, или върху пептидни последователности, получени от желланият пречистен протеин. Олигонуклеотидни сонди, основани на амино киселинни последователности, могат да бъдат дегенерирани така че да обхванат дегенерацията на генетичния код, или могат да се окажат в услуга на предпочитаните кодони от източника (организъм). Олигонуклеотиди могат да бъдат използвани също като праймери за PCR от обратно транскрибирана тРНК от известен или очакВан източник; PCR продукта може да бъде сДНК В пълния й размер, или може да бъде използван за ο
54/99 фБ
генериране на сонда за получаване на желаната сДНК с пълната й дължина. Обратно, желаният протеин може да бъде изцяло секвениран и да се осъществи пълна синтеза на ДНК, кодираща този полипептид.
След като веднъж желаната геномна сДНК бъде изолирана, тя може да бъде секвенирана по известни методи. Известно е на специалистите в областта, че такива методи са обект на грешки, така че множественото секвениране на същия участък е рутинно и все още се очаква да доведе до измерими стойности на грешки в получената предположена последователност, по- специално в участъци, притежаващи повтарящи се домени, екстензивна вторична структура, или необичайни състави на базите, като участъци с високо съдържание на GC. Когато възникне несъответствие, може да бъде проведено повторно съгласуване и могат да се използват специални методи. Специалните методи могат да включват изменени условия на съгласуВане чрез използване на: различни температури; различни ензими; протеини, които променят способността на олигонуклеотидите да формират високоорганизирани структури; извенени нуклеотиди като ΙΤΡ или метилиран dGTP; различни състави на гела, например добавяне на формамид; различни праймери , или праймери локализирани на различни разстояния от проблемния участък; или различни матрици като едноверижни ДНКи. Може да бъде използвано и съгласуване на тРНК.
За по- голямата част, някои или всички от кодиращите последователности за полипептида, притежаващ десатуразна активност, е от природен източник. В някои ситуации, обаче, е
54/99 фБ
желателно модифицирането на всички или на част от кодоните, например, за усилване на експресията, чрез използване на предпочитан гостоприемников кодон. Гостоприемниковите предпочитани кодони могат да бъдат определени от кодоните с по- висока честота в протеините, експресирани в най- голямото количество и в частност - желани видове гостоприемници. Така, одиращата последователност за полипептид, притежаващ десатуразна активност могат да бъдат синтезирани изцяло или частично. Всички или част от ДНК също може да бъде синтезирана за отстраняване на която и да е от дестабилизиращите последователности или участъци с вторична структура, които беха били представени в транскрибираната тРНК. Всички или част от ДНК също могат да бъдат синтезирани така че да бъде променен състава на базите да един или друг в желаната гостоприемникова клетка. Методи за синтезиране на последователности и за довеждане на последователностите заедно са добре установени в литературата. In vitro мутагенезис и подбор, сайт- насочена мутагенеза, или други средства могат да бъдат използвани за получаване на мутации на природно срещаните десатуразни гени за получаване на полипептид, притежаващ десатуразна активност in vivo с повече желани физични и кинетични параметри за функциониране на гостоприемниковите клетки, като по- дълга степен на полу- живот или повисока степен на продуциране на желаната полиненаситена мастна киселина.
54/99 ФБ
Десатураза от Mortierella alpina
От специален интерес е Δ5- десатуразата от Moriella alpina, която притежава 446 амино киселини; амино киселинната последователност е показана на фигура 3. Генът, кодиращ Δ5десатураза от Moriella alpina може да бъде експресиран в трансгенни микроорганизми или животни за предизвикване поголяма синтеза на ARA от DGLA. Други ДНКи, които са по същество идентични на Δ5- десатуразната ДНК от Moriella alpina също могат да бъдат използвани. Посредством по същество идентични такива, една зададена амино киселинна последователност или последователност на нуклеинова киселина, проявяваща предпочитание най- малко до 60%, 80%, 90% или 95% хомоложност с амино киселинната
последователност на Δ5- десатуразата от Moriella alpina или последователността на нуклеинова киселина, кодира амино киселинната последователност. За полипептиди, дължината на сравняваните последователности най- общо е най- малко 16 амино киселини, за предпочитане поне 20 амино киселини, или особено се предпочитат 35 амино киселини. За нуклеинови киселини, дължината на сравняваните последователности найобщо е поне 50 нуклеотида, за предпочитане поне 60 нуклеотида, и особено се предпочитат 60 нуклеотида, повече се предпочитат 75 нуклеотида, и най- вече, 110 нуклеотида. Хомоложността обикновено се измерва с помощта на софтуер за секвенционен анализ, например, Sequence Analysis software package of Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), and MacVector
54/99 фБ
(Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Такъв софтуер отбелязва сходни последователности чрез маркиране степените на хомоложност при различни замествания, делеции и други модификации. Консервативни замествания обикновено включват замествания в рамките на следните групи: глицин и аланин; Валин, изолеВцин и леВцин; аспарагиноВа киселина, глутаминоВа киселина, аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Замествания могат да бъдат направени също и на основата на съхранената хидрофобност или хидрофилност (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-1342, 1982), или нна основата на способността да обобщи сходна полипептидна вторична структура (Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45-148, 1978).
Други десатурази
В настоящето изобретение са Включени сходни десатурази от същия или други организми. Такива сродни десатурази Включват Варианти на описаната Δ5- десатураза, срещана в природата В същите или различни ВидоВе на Moriella, както и хомоложни на описаната Δ5- десатураза от друг Вид. Включени са също десатурази които, макар и да не са по същество идентични на Δ5- десатуразата от Moriella alpina, ненасищат молекулата на мастната киселина при петия Въглерод от карбоксилния край на молекулата на мастната киселина. Сродни десатурази могат да бъдат идентифицирани по тяхната способност да функционират по същество така както описаните десатурази; т. е., са все още способни ефективно да превръщат DGLA в ARA. Сродни десатурази могат да бъдат установени също чрез скринг на секВенционните бази данни за
54/99 фБ последователности, хомоложни на описаните десатурази, чрез хибридизиране на сонда, осноВана на описаната десатураза спрямо библиотека, конструирана от организма- източник, или чрез RT- PCR с помощта на тРНК от източника организъм и прайймери, основани на описаната десатураза. Такива десатурази включват тези от хора, Dictyostelium discoideum и Phaeodactylum tricomum.
Участъците от десатуразен полипептид, важни за десатуразната активност може да бъдат определени посредством рутинна мутагенеза, експресия на получените в резултат мутантни полипептиди и определяне на техните активности. Мутантите могат да включват делеции, инсерции и точкови мутации, или комбинации от тях. Типичният функционален анализ започва с делеционна мутагенеза за определяне на N- и С- терминалите граници от протеина, необходим за функциониране, и след това мутантите от вътрешни делеции, инсерции или точкови мутации се правят, за по- нататъшно определяне на участъците, необходими за функциониране. Други техники като касетен мутагенезис или тотална синтеза също могат да бъдат използвани. Делеционния мутагенезис се осъществява, например, чрез използване на екзонуклеази за последователно отстраняване на 5’ или 3’ кодиращите участъци. За такива техники има създадени и китове. След делеция, кодиращият участък се завършва чрез свързани олигонуклеотиди, съдържащи старт или стоп кодони за делетирания кодиращ участък след 5’ или 3’ делеция, съответно. Обратно, олигонуклеотиди кодиращи старт или стоп кодони са инсертирани в кодиращия участък чрез различни методи,
54/99 ФБ
включително сайт- насочена мутагенеза, мутагенна PCR или чрез лигатиране към ДНК, разградена при съществуващи места на рестрикция. Вътрешни делеции могат да бъдат създадени чрез различни методи, Включително използването на съществуващи места на рестрикция в ДНК, с използване на мутагенетични праймери чрез сайт- насочена мутагенеза или мутагенетична PCR. Инсерции са получени чрез методи като линкер- сканираща мутагенеза, сайт- насочена мутагенеза или мутагенетична PCR. Точкови мутации са създадени чрез техники като сайт- насочена мутагенеза или мутагенетична PCR.
Химична мутагенеза може също да бъде използвана за идентифициране на участъците от десатуразен полипептид, важен за активността. Експресира се мутантна структура, и способността на полученият в резултат променен протеин да функционира като десатураза се изпитва. Такъв структурнофункционален анализ може да определи кой от участъците може да бъде делетиран, кои участъци толерират инсерции, и кои точкови мутации позволяват на мутантния протеин да функционира по начин, по същество еднакъв с природната десатураза. Всички такива мутантни протеини и нуклеотидни последователности, които ги кодират са в рамките на обхвата на настоящето изобретение.
Експресия на десатуразни гени
След като веднъж е получена ДНК, кодираща десатуразния полипептид, той се поставя във вектор, способен на репликация в гостоприемникова клетка, или се размножава in vitro
54/99 фБ
посредством техники като PCR или продължителна РСИ.Реплициращи се вектори могат да включват плазмиди, фаги, вируси, козмиди и други. Желаните вектори Включват такива, които за приложими за мутагенезата на желания фаг, или за експресия на желания ген В гостоприемниковата клетка. Техниката на продължителна PCR прави in vitro размножаване на дълги структури, така че модификации на желания ген, като мутагенезис или добавяне на на експресионни сигнали, и размножаване на получените в резултат структури, могат да се появят изцяло in vitro без използването на вектор на репликация или гостоприемникова клетка.
За експресия на десатуразния полипептид, функционално и транслационно иницииращи и терминиращи участъци са оперативно свързани към ДНК, кодираща десатуразния полипептид. Експресия на полипептидния кодиращ участък може да се осъществи in vitro или в гостоприемникова клетка. Транскрибционни и транслационни иницииращи и терминиращи участъци са получени от различни неексклузивни източници, включително ДНК, която ще бъде експресирана, гените, за които е известно или се предполага че са способни на експресия в желаната система, експресионни вектори, химична синтеза, или от ендогенния локус в гостоприемниковата клетка.
Експресия in vitro
In vitro експресия може да бъде осъществена, например, чрез поставяне на кодиращия участък за десатуразния полипептид във вектор на експресия, конструиран за приложение
54/99 фБ
in vitro u добавяне на заешки ретикулоцишен лизат и кофактори; по желание могат да бъдат Включени белязани амино киселини. Такива in vitro вектори на експресия могат да предоставят някои или всички от експресионните сигнали, необходими в използваната система. Тези методи са добре известни на специалистите в областта и компонентите на системата са търговско достъпни. Реакционната смес може след това да бъде изпитана директно за полипептида, например чрез определяне на нейната активност, или синтезираният полипептид може да бъде пречистен и след това изпитан.
Експресия в гостоприемникова клетка
Експресия в гостоприемникова клетка може да бъде осъществена по временен или стабилен начин. Временна експресия може да стане от въведените структури, които съдържат експресионни сигнали, функционални в гостоприемниковата клетка, но които структури не се репликират рядко се интегрират в гостоприемниковата клетка, или когато гостоприемниковата клетка е непролиферираща. Временна експресия може да се осъществи също чрез индуциране на регулаторен промотор, оперативно свързан към желания ген, макар такива индуктивни системи често да проявяват ниско основно ниво на експресия. Стабилна експресия може да бъде достигната чрез въвеждане на структура, която може да интегрира в генома на гостоприемника или автономно да се репликира в гостоприемниковата клетка. Стабилна експресия на желания ген може да бъде избрана посредством използването на селективен маркер, локализиран върху или трансфектиран с
54/99 ФБ
експресионната структура, последвано от подбор за клетки, експресиращи маркера. Когато в резултат на интеграцията се получи стабилна експресия, интеграция на структури може да се получи случайно в рамките на гостоприемниковия геном, или може да бъде насочен чрез използването на структури, съдържащи участъци на хомология с генома на гостоприемника, достатъчна да насочи рекомбинацията в локуса на гостоприемника. Когато структурите са насочени към ендогенен локус, всички или някои от транскрибционните регулаторни участъци могат да бъдат осигурени чрез ендогенния локус.
Когато повишена експресия на десатуразния полипептид в организма, служещ за източник е желана, могат да бъдат използвани няколко метода. Допълнителни гени, кодиращи десатуразния полипептид може да бъде въведен в гостоприемниковия организъм. Експресията от нативния десатуразен локус може също да бъде повишена чрез хомоложна рекомбинация, например чрез инсерция на по- силен промотор в гостоприемниковия геном с оглед повишаване на експресията, чрез отстраняване на дестабилизиращите последователности както от тРНК, така и от кодирания протеин чрез делеция на такава информация от гостоприемниковия геном, или чрез добавяне на стабилизиращи последователности към тРНК (USPN4 910 141).
Когато е желателно експресирането на повече от един различен ген, чрез подходящи регулаторни участъци и методи на експресия, въведените гени могат да бъдат размножени в гостоприемниковата клетка чрез използване на вектори на
54/99 фБ репликация или чрез интегриране в генома на гостоприемника. Когато два или повече гени са експресирани от различни вектори на репликация, желателно е всеки вектор да има различни степени на репликация. Всяка въведена структура, независимо интегрирана или не, следва да притежава различна степен на селекция и трябва да не бъде хомоложна на другите структури за поддържане на стабилна експресия и да предотврати обратен подбор на елементите сред структурите. Разумният избор на регулаторни участъци, подбор на средства и метод на размножаване на въведената структура може експериментално да бъде определен така че всички въведени гени са експресирани в необходимите нива за осигуряване синтезата на желаните продукти.
Като пример, когато гостоприемникоВата клетка е дрождева, предложени са транскрибционни и транслационни участъци, функционални в дрождевата клетка, по- специално от гостоприемникоВите видове. Транскрибционните иницииращи регулаторни участъци могат да бъдат получени, например, от гени, участващи в гликолитичната верига, като алкохол дехидрогенази, глицералдехид- 3- фосфат дехидрогеназа (GPD), фосфоглюкоизомераза, фосфоглицерат киназа и др. или регулаторни гени като кисела фосфатаза, лактаза, металотионеин, глюкоамилаза, и др. Всяка от множеството регулаторни последователности може да бъде използвана в определена ситуация, в зависимост от това се желае конститутивна или индуцирана транскрибция, определена ефективност на промотора в съчетание с избрана отворена четяща рамка, способността за присъединявайе на силен
54/99 ФБ промотор с контроел участък от различен промотор, което позволява индуктивна транскрибция, лесно конструиране и др. От специален интерес са промотори, които се активират В присъствието на галактоза. Галактозо- индуктивни промотори (GALI, GAL7, GAL10) са екстензивно използвани за високо ниво на регулирана експресия на протеин в дрожди (Lue et al., Mol. Cell. Biol. Vol. 7, p. 3446, 1987; Johnston, Microbiol. Rev. Vol. 51, p. 458, 1987). Транскрибцията от GAL промоторите е активирана от протеина GAL4, която свързва към промоторния участък и активира транскрибцията в присъствие на галактоза. В отсъствието на галактоза, антагониста GAL80 се свързва към GAL4 и предотвратява GAL4 от активираща транскрибция. Добавянето на галактоза предотвратява GAL80 от инхибиране на активацията от GAL4.
Установено е, че нуклеотидните последователности, зоабикалящи транслационния инициаторен кодон ATG влияят на експресията на дрождевите клетки. Ако желаният полипептид е напълно експресиран в дрождите, нуклеотидните последователности на екзогенните гени могат да бъдат модифицирани така, че да включват ефективна дрождева транслационна инициираща последователност за получаване на оптимална генна експресия. За експресия в Saccharomices, това може да бъде осъществено чрез сайт- насочена мутагенеза на един неефективно експресиран ген, чрез сливането му вътре в рамката на един ендогенен Saccharomices ген, за предпочитане високо експресивен ген, като лактазния ген.
Терминиращият участък може да бъде получен от 3’ участъка на гена, от който е получен иницииращият участък или
54/99 ФБ om различен ген. Известни са множество терминиращи участъци, които са ефективни в различни гостоприемници от същия и различни родове и видове. Терминиращият участък обикновено е избран повече с оглед на удобството отколкото с оглед на което и да е специално качество. За предпочитане, терминиращият участък е получен от дрождев ген, поспециално Sacckaromyces, Schizosaccharomyces, Candida или Kluyveromyces. Известно е също, че 3’- участъците на два гена на бозайници, γ интерферон и а2 интерферон, функционират в дрожди.
Въвеждане на структури в гостоприемникоВи клетки
Структури, Включващи желаният ген могат да бъдат въведени в гостоприемникова клетка посредством стандартни техники. Тези техники включват трансформация, протопластна фузия, липофекция, трансфекция, трансдукция, конюгация, инфекция, болистик импакт, електропорация, микроинжекция, скрапинг (изстъргване), или който и да е друг метод, който въвежда желаният ген в гостоприемниковата клетка. Методи за трансформация, които са използвани, включват трансформация с литиев ацетат (Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186- 187, 1991). За удобство тук, гостоприемникова клетка, която се манипулира по който и да е от методите с участието на ДНК последователност или структура, ще бъде наричана “трансформирана“ или “рекомбинантна“.
Дадената гостоприемникова клетка ще има най- малко едно копие на експресионната структура и да има два или повече, В зависимост от това дали гена е интегриран в генома,
54/99 фБ амплифициран, или присастВа В един екстрахромозомен елемент, притежаващ множество копия. Когато дадената гастоприемникоВа клетка е дрождева, могат да бъдат използвани четири принципни типа дрождеВи плазмидни Вектори: Интегриращи се В дрожи плазмиди (Yips), Репликиращи се В дрожди плазмиди (Yrps), ДрождеВи центромерни плазмиди (Ycps), и ДрождеВи епизомални плазмиди (Yeps). Yips не притежават дрождеВ източник на репликация и следва да бъде размножаван като интегрирани елементи В дрождеВия геном. Yrps притежават хромозомно получена автономно репликираща се последователност и се размножават В среден брой копия (20 до 40 ), автономно репликиращи се, нестабилно сегрегиращи се плазмиди. Ycps притежават както източник на репликация, така и центромерна последователност и се размножава н малък брой копия (10- 20), автономно репликиращи се, стабилно сегрегиращи се плазмиди. Yeps притежават един източник на репликация от дрождеВия 2 цт плазмид и се размножават В голям брой копия, автономно репликиращи се, нерегулиращо сегрегиращи се плазмиди. Наличието на плазмиди В дрожди може да бъде осигурено чрез провеждане на подбор за маркер Върху плазмида. От специален интерес са дрождеВите Вектори pYES2 (a Yep плазмид, доставен от Invitrgen, предоставящ урацил прототрофен и GAL1 галактозо- индуктивен промотор за експресия ), pRS425- pGl (a Yep плазмид, получен от Dr. Chang, Ass. Professor of Molecular Genetics, Ohio State University, съдържащ конститутибен GDP промотор и осигуряващ леВциноВата прототрофия), и pYX424 (a Yep плазмид, който съдържа конститутибен ТР1 промотор и осигурява леВциноВата
54/99 ФБ
прототрофия; Alber, Т. and Kawasaki, G. (1982). J. Mol. & Appl. Genetics 1: 419).
Трансформираната гостоприемникова клетка може ga бъде идентифицирана чрез подбор за маркер, който се съдържа ВъВ въведената структура. Обратно, отделна маркерна структура може да бъде въведена с желаната структура, тъй като много техники на трансформация въвеждат много ДНК молекули в гостоприемниковата клетка. Обикновено, трансформираните гостоприемници се подбират по тяхната способност да се развиват върху селективна среда. СелектиВната среда може да включва аедин антибиотик или да не съдържа фактор, необходим за растежа на тарнсформирания гостоприемник, като хранителен или растежен фактор. Един въведен маркерен ген, поради това, може да придаде резистентност спрямо антибиотици, или да кодира есенциален растежен фактор или ензим, и да позволи развитието върху селективна среда при експресия в трансформирания гостоприемник. Подбора на трансформирания гостоприемник може да се осъществи, когато бъде открит експресирания маркерен протеин, както директно, така и индиректно. Маркерният протеин може да бъде експресиран самостоятелно или като слят към друг протеин. Маркерния протеин може да бъде установен по неговата ензимна активност; например, β галактозидаза може да превърне субстрата X- gal в оцветен продукт, и луциферазата да превърне луциферина в излъчващ светлина продукт. Маркерният протеин може да бъде установен по неговата способност да произВежда светлина или по модифицираните му характеристики; например зеленият
54/99 фБ
флуоресцентен протеин на Aequorea victoria флуоресцира при осветяване със синя светлина. Могат да бъдат използвани антитела за установяване на маркерния протеин или молекулната щампа върху, например, дадения протеин. Клетките, експресиращи маркерния протеин или щампа могат да бъдат подбрани, например, визуално или чрез техники като FACS или отсяване с помощта на антибиотици. За подбор на дрождеви трансформанти може да бъде използван всеки маркер който функционира. Желателно е да се има предвид резистентността към канамицин и амино гликозид G418, а така също и способността им да се развиват върху среда без урацил, левцин, лизин или триптофан.
?5- десатуразното продуциране на PUFA може да бъде осъществено както в прокариотични, така и в еукариотични гостоприемникови клетки. Прокариотичните клетки са тези от Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, cyanobacteria и др. Еукариотичните клетки включват клетки на бозайница като напр. такива на боаещи животни, птичи клетки като напр. кокоши, и други клетки които могат да бъдат променени чрез генетична манипулация включително инсекти, фунги и клетки на зелени водорасли. Клетките могат да бъдат култивирани или да формират част или цяло от гостоприемников организъм, включително животно. Вируси и бактериофаги също могат да бъдат използвани с клетките за получаване на PUFAs, поспециално за генен трансфер клетъчно бомбардиране и подбор. В предпочитан вариант на изпълнение, гостоприемника е който и да е микроорганизъм или животно, които продуцират DGLA и/или могат да асимилират екзогенно доставяна DGLA, и продуцира големи количества DGLA. Примерите за животински гостоприемници включват мишки, плъхове, зайци, кокошки, фазани, пуйки, говеда, овце, свине, кози, якове и др., които са податливи на генетична манипулация и клонинг за бързо разпространяване на трансгенната експресиираща популация. За животни, ?5- десатуразният трансген може да бъде адаптиран за експресия в мишенни органели, тъкани и телесни течности чрез модифициране на гениите регулаторни участъци. От специален интерес е продуцирането на PUFAs в млякото на животното гостоприемник.
Експресия в дрожди
Примерите на гостоприемникови микроорганизми включват Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis,UAU други дрожди като Candida, Kluyveromyces или други фунги, например, филаментозни фунги като Aspergillus, Neurospora, Penicillium и др. Желани характеристики на гостоприемниковия организъм са, например, това че са генетично добре охарактеризирани, могат да бъдат използвани за високо ниво на експресия на продукта с помощта на ултра- висока плътностна ферментация, и е върху GRAS (обикновено безопасен) лист, доколкото предложеният краен продукт се очаква да бъде усвоим от хора. От специален интерес е използването на дрожди, по- специално хлебни дрожди (S. cerevisiae), като клетка гостоприемник в настоящето изобретение. Щамове от специален интерес са SC334 (Mat а рер4- 3 prbl-1122 игаЗ- 52 1еи23, 112 reg- 501 gall; Gene 83: 57- 64, 1989, Hovland P. et al.), YTC34 (aade2- 101 his3 Δ200- 801 игаЗ- 52; получени от Dr. T. H. Chang,
54/99 фБ
A.v.v. Professor of Molecular Genetics, Ohio State University), YTC41 (a/ a ura3- 52/ura3=52 lys2- 801/lys2- 801 ade2- 101 trpl- Δ1 his?200/ his3 Δ200 leu2 Δ1/ leu2Al; получени om Dr. T. H. Chang, Ass. Professor of Molecular Genetics, Ohio State University), BJ1995 (получен om the Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkerley, CA 94720), INVSC1 (Mat ahiw3Al leu2 trpl- 289 ura3- 52; получен om Invitrgen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) and INVSC2 (Mat Ahis3 Δ200 ura3-167, получени Invitrogen).
Експресия в птичи видове
За получаване на PUFAs в птичи видове и клетки, като пилета, пуйки, фазани и гъски, генният трансфер може да бъде осъществен чрез въвеждане на последователност на нуклеинова киселина, която кодира Δ5- десатураза в клетките, следвайки методите, известни в областта. Ако се желае получаване на трансгенно животно, плурипотентни базални ембрионални клетки следва да бъдат снабдени с вектор, носещ Δ5десатураза, който кодира трансген и да се развие във възрастно животно (USPN 5 162 215; Ono et al. (1996) Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3): 287- 292; WO 9612793; WO 9606160). В повечето случаи, трансгенът може да бъде модифициран така, че да експресира високи нива на десатуразата с оглед повишаване продуцирането на PUFAs. Трансгенът може да бъде модифициран, например, чрез осигуряване на транскрибционни и/или транслационни регулаторни участъци, които функционират в птичи клетки, като промотори, които насочват експресията в определени
54/99 фБ тъкани и части на яйцето, като жълтък. Гениите регулаторни участъци могат да бъдат получени от различни източници, включително вируси на анемия по птиците или на левкоза по птиците или птичи гени като генът на птичи овалбумин.
Експресия В клетки на инсекти
Получаването на PUFAs в клетки на инсекти може да бъде осъществено с помощта на бакуловирусни вектори на експресия, носещи Δ5- десатуразен трансген. Бакуловирусни вектори на експресия могат да бъдат получени от различни търговски източници, като Clontech. Предложени са също и методи за получаване на хибрид и трансгенни щамове водорасли, като морски водорасли, които съдържат и експресират десатуразен трансген. Например, трансгенно морско водорасло може да бъде създадено както е описано в USPN 5426040. Както и другите експресионни системи, описани по- горе, продължителността, обхвата на експресията и активността на десатуразния трансген може да бъдат регулирани чрез нагаждане на полипептидната кодираща последователност с подходящите транскрибционни и транслационни регулаторни участъци, подбрани за специална употреба. От специален интерес са промоторни участъци, които могат да бъдат индуцирани при предварително подбраните условия на растеж. Например, въвеждането на чувствителни на температура и/или отговорни за метаболизма мутации в кодиращите десатуразния трансген последователности, техните регулаторни участъци, и/ или генома на клетки, в които е въведен трансгена, могат да бъдат използвани за тази цел.
54/99 фБ
Експресия в растения
Продуцирането на PUFAs в растения може да бъде осъществено с помощта на различни растителни трансформационни системи, като използването на Agrobacterium tumefaciens, растителни вируси, частична клетъчна трансформация и други подобни, които са описани в свързани с настоящето описание заявки на същия заявител Nos. 08/ 834 033 08/ 956 985 и частични продължения, заявени едновременно с настоящето описание, всички от които са включени в литературата справка.
Трансформираната гостоприемникова клетка се култивира в подходящи условия, адаптирани за желания краен резултат. За гостоприемникови клетки, растящи в култура, условията са обикновено оптиммизирани да продуцират максималния или най- икономичния добив на PUFAs, които се отнасят до избраната десатуразна активност. Условията на средата, които могат да бъдат оптимизирани включват: източник на въглерод, източник на азот, добавка на субстрат, крайна концентрация на добавения субстрат, формиране на добавения субстрат, аеробен или анаеробен растеж, температура на растене, индуциращ агент, индукционна температура, фаза на растеж при индукцията, растежна фаза при събиране, pH, плътност, и поддържане на подбора. Микроорганизми като дрожди, например, се развиват с предпочитание върху селекционна среда, която включвадрождев пептонен бульон (YPD)u минимална среда (съдържа амино киселини, дрождева азотна база и амониев сулфат, и не съдържа компонент за подбор, например урацил). Желателно е,
54/99 фБ субстратите, които се добавят да бъдат предварително разтворени в етанол. Когато е необходимо, експресията на полипептида може да бъде индуцирано, например чрез включванне или добавяне на галактоза за индуциране на експресията от GAL промотора.
Експресия в животни
Експресията в клетки на животно гостоприемник могат по всяка вероятност да бъде осъществена като постоянна или временна. Временната експресия може да бъде осъществена по известни методи, например инфекция или пролиферация, и може да бъде повторена така че да се поддържат желаните експресионни нива на индуцираните структури (виж Ebert, РСТ публикация WO 94/ 05782). Стабилна експресия може да бъде осъществена чрез интеграция на структурата в гостоприемниковия геном, водещо до трансгенно животно. Структурата може да бъде включена, чрез микроинжектирането й в пронуклеуса на оплодено (фертилно) яйце, или чрез трансфекция, ретровирусна инфекция или други техники, посредством което структурата се въвежда в клетъчна линия, която може да формира или да бъде включена във възрастно животно (US Patent No. 4 873 191; US Patent No. 5 530 177; US Patent No. 5 565 362; US Patent No. 5 366 894; Wilmut et al. (1997) Nature 385:810). Рекомбинантните яйца или ембриони се прехвърлят в майка- приемник (US Patent No. 4 873 191; US Patent No. 5 530 177; US Patent No. 5 565 362; US Patent No. 5 366 894; Wilmut et al. (no- горе).
54/99 ФБ
След раждането, трансгенните животни се идентифицират, например, по присъствието на включен маркерен ген, като този за покривен цвят, или чрез PCR или Southern оцветяване от кръв, мляко или тъканна проба за откриване на включената структура, или чрез имунологично или ензимологично изпитване за установяване на очаквания протеин или продуктите, продуцирани от тях (US Patent No. 4 873 191; US Patent No. 5 530 177; US Patent No. 5 565 362; US Patent No. 5 366 894; Wilmut et al. (no- горе). Получените трансгенни животни могат да бъдат напълно трансгенни или могат да бъдат мозаични, притежаващи трансгените само в подсистема на техните клетки. Преимуществото на клонирането на бозайници, осъществено чрез фузия на ядрена клетка с безядрено яйце, последвано от прехвърляне в майка приемник, предлага възможността от силна, щироко- мащабна продукция при получаване на животното “основател “ или клетка, съдържаща въведената структура; преди това, е необходимо трансгена да се съдържа в зародишната линия на животното за размножаване (Wilmut et al. (по- горе)).
Експресията в животно гостоприемник предоставя определени предимства, по- специално когато гостоприемника е домашно животно. За получаване на PUFAs в течност, получена от животното годтоприемник, като мляко, десатуразния трансген може да бъде експресиран в клетки на млечната жлеза на женско животно гостоприемник, и съдържимото на PUFA в гостоприемниковите клетки се променя. Десатуразния трансген може да бъде адаптиран за експресия, така че да се съхрани в клетките на млечната жлеза, или да се секретира в кърмата, за
54/99 фБ формиране на PUFA реакционните продукти, локализирани В млякото (РСТ публикация WO 95/ 24488). Експресията може да бъде насочена за експресия В тъканта на млечната жлеза с помощта на специфични регулаторни последователности, като тези на гоВежди а- лакталбумин, а - казеин, β- казеин, у- казеин, к- казеин, β- лактоглобулин, или суроВатъчен кисел протеин, и може незадължително да Включва един или повече интрони и/ или секреторни сигнални последователности (US Patent No. 5 530 177; Rosen, US Patent No. 5 565 362; Clark et al., US Patent No. 5 366 894; 9 Gamer et al., PCT публикация WO 95/ 23868).
Експресия на десатуразни трансгени, или безсмислени десатуразни транскрибти, адаптирани по този начин могат да бъдат използвани да променят нивата на специфичните PUFAs, или техни производни, намерени В млякото на животните. В допълнение, Δ5- десатуразният трансген може да се експресира както сам по себе си, така и с други трансгени за продуциране на животинско мляко, съдържащо по- Високи пропорции от желаните PUFAs или PUFA съотношения и концентрации, които са сходни на женската (човешка) кърма (Prieto et al., РСТ 9 публикация WO 95/ 24494).
Пречистване на мастни киселини
Мастните киселини, ненаситени В позиция Δ5, могат да бъдат установени В гостоприемникоВия микроорганизъм или животно като свободни мастни киселини или В конюгирани форми като ацилглицероли, фосфолипиди, сулфолипиди или гликолипиди, и могат да бъдат екстрахирани от гостоприемникоВата клетка посредством различни начини,
54/99 ФБ
добре известни на специалистите в областта. Тези начини включват екстракция с органични разтворители, обработка с ултразвук, supercitrical fluid extraction, с използването например на въглероден диоксид, и физични средства като преси и комбинации от тях. От специален интерес е екстракцията с метанол и хлороформ. При желание, водният носител може да бъде подкислен за получаване на протони в отрицателно натоварените частици и по този начин да повиши отделянето на желаните продукти в органичния носител. След екстракция, органичните разтворители могат да бъдат отстранени чрез изпаряване в азотен поток. Когато се изолират в конюгирани форми, продуктите могат да бъдат ензимно или химично разградени за освобождаване на свободните мастни киселини или по- малък комплексен конюгат, и може след това да бъде субект на по- нататъшни манипулации за получаване на желан краен продукт. Желателно е, конюгирани форми на мастни киселини да бъдат разградени калиев хидроксид.
Ако е необходимо по- нататъшно пречистване, могат да бъдат използвани стандартни методи. Такива методи може да включват екстракция, обработка с урея, фракционна кристализация, HPLC, фракционна дестилация, силика гел хроматография, високо скоростно центрофугиране или дестилация, или комбинации от тези техники. Протектиране на реактивните групи, като киселите или алкенилни групи, може да бъде осъществено при всеки един от етапите чрез известни техники, например алкилиране или йодиране. Използваните методи включват метилиране на мастните киселини за получаване на метилните естери. По аналогичен начин,
54/99 ФБ 51 протектиВните групи могат да бъдат отстранени при Всеки един от етапите. По желание, пречистването на фракции, съдържащи ARA, DHA и ЕРА да бъде осъществено чрез обработка с урея и/ или фракционна дестилация.
Приложения на мастните киселини
Има няколко приложения на мастните киселини от настоящето изобретение. Сонди, основани на ДНКи от настоящето изобретение могат да намерят приложение в методите за изолиране на сходни молекули или в методите за откриване на организми, експресиращи десатурази. Когато са използвани като сонди, ДНКи или олигонуклеотиди трябва да бъдат откриваеми. Това обикновено се осъществява чрез прикрепване на маркер или въВ вътрешно място, например чрез включване на модифициран остатък, или при 5’ или 3’ края. Такива маркери могат да бъдат директно открити, могат да бъдат свързани към вторична молекула, която е маркирана, или може да се свърже към една небелязана вторична молекула и към маркирана третична молекула; този процес може да бъде удължен толкова, колкото е Възможно за достигане на задоволително откриваем сигнал без приемливи нива на страничен сигнал. Вторични, третични или мостови системи могат да включват използването на антитела, насочени срещу която и да е друга молекула, включваща маркери или други антитела, или може да включва които и да са молекули, които се свързват една с друга, например биотин- стрептавидин/ авидинова система. Откриваемите маркери обикновено включват радиоактивни изотопи, молекули които химично или
54/99 фБ
ензимно продуцират или променят светлината, ензими които продуцират откриваеми реакционни продукти, магнетични молекули, флуоресцентни молекули или молекули, чиято флуоресцентност или светлинно- емисионни характеристики се променят при свързването. Примери за методи за маркиране могат да бъдат намерени в US Patent 5 011 770. Обратно, свързващите или прицелните молекули могат да бъдат открити пряко чрез измерване температурните промени в разтвора при свързването на сондата към мишената чрез изотермалтна титрационна калориметрия, или чраз покриване на сондата или мишената на повърхността и установяване изменението на разпръскването на светлината от повърхността, получена при свързванета на мишената със сондата, съответно, което може да стане с BIAcore системата.
PUFA, продуцирани чрез рекомбинантни средства намират приложения в широк кръг области. Снабдявания на хора или животни с PUFA в различни форми може да доведе до повишени нива не само на добавените PUFA, но и на техните метаболитни предшевственици. Например, когато присъщия ?5десатуразен цикъл е дисфункционален в даден индивид, лечение с ARA може да води не само до повишени нива на ARA, но така също и на низходящи продукти на ARA като простагландини (виж фигура 1). Комплекс от регулаторни механизми може да бъдат желателни за комбиниране на различни PUFAs, или за добавяне на различни конюгати на PUFA, с оглед предотвратяване, контрол или преодоляване на такива механизми за постигане на желаните нива на специфични PUFA в един индивид.
54/99 фБ
Хранителни състави
Настоящето изобретение ВключВа също и хранителни състави. Такива състави, за целите на настоящето изобретение, включват Всяка храна или препарат за консумация от хора, Включително за чревно или парентерално усвояване, които когато бъдат Възприети от тялото, (а) служат за подхранване или изграждане на тъкани или за снабдяване с енергия и/ или (Ь) за поддържане, възстановяване или поддържане на адекватен хранителен статус или метаболитна функция.
Хранителните състави от настоящето изобретение включват най- малко едно масло или киселина, продуцирани в съответствие с настоящето изобретение и може също да бъде в твърда или течна форма. В допълнение, състава може да включВа едливи макрохранителни Вещества, витамини и минерали В количества, необходими за определени приложения. Количеството на такива инградиенти ще Варира в зависимост от това дали състава е предназначен за използване от нормални, здрави подрастващи, деца или Възрастни, притежаващи специални нужди като тези, съпътстващи определени метаболитни сътояния (напр., метаболитни нарушения).
Примери на макрохранителни вещества, които могат да бъдат добавяни към състава, Включват, но не са ограничени до кокосово масло, соево масло, и моно и диглицериди. Примери на такива въглехидрати включват, но не са ограничени до глюкоза, лактоза за хранителни нужди и хидролизирано нишесте. В допълнение, примери на протеини които могат да бъдат използвани В хранителните състави от изобретението
54/99 ФБ включват, но не са ограничени до соеви протеини, електродиализирана суроватка, електродиализиран млечен каймак, млечна суроватка, или хидролизати на тези протеини.
По отношение на витамините и минералите, към хранителните състави съгласно изобретението може да бъдат включени още: калций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магнезий, манган, желязо, мед, цинк, селен, йод и витамини А, Е, D, С и В комплекса. Могат да бъдат добавени и други такива витамини и минерали.
Компонентите, използвани в хранителните състави от настоящето изобретение са от полу- или напълно пречистен източник. Под полу- или напълно пречистен се разбира материал, който е изготвен чрез пречистване на природен материал или чрез синтеза.
Примери на хранителни вещества от настоящето изобретение включват, но не са ограничени да формули за подрастващи, диетични добавки, и състави за рехидратация. Хранителните състави от специален интерес включват, но не са ограничени до тези, приложими за добавки за ентерално или парентерално приложение при подрастващи, специални формули за подрастващи, добавки за възрастни и добавки за такива с гастроинтестинални затруднения и/ или малабсорбция.
Хранителни състави
Типичните хранителни състави от настоящето изобретение ще съдържат едливи макрохранителни вещества, витамини и минерали в количества, желателни за конкретна употреба. Количествата от такива инградиенти ще варират в
54/99 фБ
I
I зависимост от това дали хранителната формула се предлага за употреба на нормални, здрави индивиди, временно изложени на стрес, или на субекти, притежаващи специални нужди, дължащи се на хронични или остри болестни състояния (напр., метаболитни нарушения). Следва да се знае от специалистите в областта, че използваните компоненти в хранителна формула от настоящето изобретение са от полу- пречистен или пречистен източник. Под полу- пречистен или пречистен се разбира материал, който е изготвен чрез пречистване на природен материал или чрез синтеза. Тези техники са добре известни в областта (виж напр., Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recomended Dietary Allowances, J(Ih Ed., National Academy Press, Washington, D. C., 1989).
В предпочитан вариант, хранителната формула от настоящето изобретение е ентерален хранителен продукт, особено предпочитан хранителен продукт за възрастни или деца. Съответно, в друг аспект от изобретението, се предлага хранителна формула, която е подходяща за хранене на възрастни, които преживели стрес, формулата Включва, в допълнение към PUFA от изобретението макрохранителни вещества, витамини и минерали в количества, предназначени да осигурят дневните харнителни нужди на възрастните.
Макрохранителните компоненти включват едливи масти, въглехидрати и протеини. Примерни едливи масти са кокосово масло, соево масло и моно- и диглицериди и PUFA мазнини от настоящето изобретение. Примерни въглехидрати са глюкоза, лактоза за хранителни нужди и хидролизирано царевично нишесте. Типичен протеинов източник би бил соев протеин,
54/99 ФБ електродиализирана суроватка или електродиализиран млечен каймак или млечна суроватка, или хидролизатите на тези протеини, макар да могат да бъдат използвани и други протеинови източници. Тези макрохранителни вещества биха могли да бъдат добавяни под формата на общоприетите хранителни вещества в количества, еквивалентни на тези в кърмата или на енергийна основа, т. е., на базата на калориите.
Методи за съставяне на течни или ентерални хранителни формули са добре известни в областта и са описани в подробности в примерите.
Ентералните формули могат да бъдат стерилизирани и след това използвани веднага (ready- to- feed (RTF)) и да бъдат съхранявани като концентрирана течност или на прах. Прахът може да бъде приготвен чрез разпръсквателно сушене на ентералната формула, изготвена както е посочено по- горе, и формулата може да бъде реконституирана чрез рехидратиране на концентрата, формите за възрастни и подрастващи са добре известни на специалистите в областта и са търговско достъпни (напр., Similac®, Ensure®, Jevity® and Alimentum® from Ross Products Division, Abbott Laboratories). Маст или киселина от настоящето изобретение може да бъде добавена ком всяка от тези формули в количествата, описани по- горе.
Енергийната плътност на хранителният състав когато е в течна форма, може обикновено да граничи от около 0.6 Kccal 3.0 Kcal за ml. Когато са в твърда или разпратена форма, хранителните добавки могат да се съдържат от 1.2 до повече от 9 Kcal за грам, за предпочитане 3 до 7 Kcal за грам. Найобщо, осмотичността на течният продукт следва да бъде по
54/99 фБ малко от 700 mOsm и повече, за предпочитане по- малко от 660 mOsm.
Хранителната формула обикновено следва да включва витамини и минерали в допълнение към PUFA от изобретението, за подпомагане усвояването на минималното дневно усвояване на тези вещества. В допълнение към изброените по- горе PUFA, би могло да се желае хранителният състав да бъде обогатен с цинк, мед и фолиева киселина в допълнение към антиоксиданти. Счита се, че тези вещества биха осигурили стимулиране на стресираната имунна система и така ще осигури по- нататъшни предимства за индивида. Присъствието на цинк, мед или фолиева киселина е незадължително и не се изисква за постигане на благоприятните ефекти при имунна супресия. По същия начин би могъл да бъде обогатен и фармацевтичен състав със същите тези вещества.
В особено предпочитан вариант, хранителният състав съдържа, в допълнение към антиоксидантната система и PUFA съставката източник на въглехидрат, където най- малко 5% от посоченият въглехидрат е усвояем олигозахарид. В още един особено предпочитан вариант на изпълнение, хранителият състав съдържа допълнително ротеин, таурин и карнитин.
PUFAs, или техните производни, получени по описаният метод може да бъдат използвани като диетични заместители, или добавки, по- специално формули за подрастващи, за пациенти подложени на интравенозно хранене или за предотвратяване или лечение на недохранване. Обикновено, човешката кърма има мастно киселинен профил включващ от около 0.15% до около 0.36% като DHA, от около 0.03% до около 0.13% като ЕРА, от
54/99 фБ около 0.30% go около 0.88% като ARA, от около 0.22% до около 0.67% като DGLA и от около 0.27% до около 1.04% като GLA. В допълнение, докладвано е, че предоминантните триглицериди в кърмата са 1,3- ди- олеоил- 2- палмитоил, с 2- палмитоил глицериди, докладвани като по- добре абсорбирани от 2- олеоил или 2- линеоил глицериди (USPN 4 876 107). Така, мастни киселини като ARA, DGLA, GLA и/или ЕРА получени по изобретението, могат да бъдат използвани за изменение състава на формулите за подрастващи за по- добра репликация на PUFA състава от майчина кърма. По- специално, маслен състав за приложение като фармакологична или хранителна добавка, по- специално заместител на майчина кърма или добавка, за пхредпочитане включва един или повече от ARA DGLA и GLA. Особено се предпочита мастите да включват от около 0.3 до 30% ARA, от около 0.2 до 30% DGLA и от около 0.2 до около 30% GLA.
В допълнение към концентрацията, съотношенията на ARA DGLA и GLA могат да бъдат адаптирани за определена дадена крайна употреба. Когато са изотвени като добавка към кърмата, или заместител в маслен състав, който съдържа два или повече от ARA DGLA и GLA съотношението варира от около 1: 19: 30 до около 6: 1: 0.2, съответно. Например, кърмата на животните може да варира в съотношенията на ARA: DGLA: DGL, граничещи от 1: 19: 30 до 6: 1: 0.2, което включва междинни съотношения, които са за предпочитане около 1: 1: 1, 1: 2: 1, 1: 1: 4. Когато са продуцирани заедно в гостоприемникова клетка, нагласяването на скоростта и процента на превръщане на прекурсорния субстрат като GLA и DGLA в ARA може да бъде използвано за прецизен контрол на PUFA съотношенията.
54/99 ФБ
Например, 5% go 10% степен на превръщане на DGLA В ARA може да бъде използвано за продуциране на ARA в DGLA съотношение от около 1: 19, където степента на превръщане от около 75% до 80% може да бъде използвано за продуциране на ARA в DGLA съотношение от около 6: 1. Поради това, независимо дали в клетъчна културална система или в гостоприемник животно, регулирането на продължителността, обхвата и спецификата на десатуразната експресия както е описано, може да се използва за модифициране нивата на PUFA съотношенията. В зависимост от използваната експресионна система, напр., клетъчна култура или животно, експресиращо мазнини в млякото си, мазнините могат също да бъдат изолирани и рекомбинирани в желаните концентрации и съотношения. Количествата на мазнините, предоставящи тези съотношения на PUFA, може да бъдат определени следвайки стандартни протоколи. PUFAs, или гостоприемниковите клетки, които ги съдържат, могат също да бъдат използвани като добавки на храната на животните за изменение мастно киселинния състав на животинските тъкани или млякото в един повече желан за хората или животните състав.
За диетични добавки, пречистените PUFA или техните производни, могат да бъдат включени в мазнините за готвене, масла или маргарини, формулирани така, че при обичайното използване приемащият би получил желаното количество. PUFA могат да бъдат включени след това във формите за подрастващи, хранителни добавки или други хранителни продукти, и може да намерят приложение като противовъзпалителни или холестерол- понижаващи агенти.
54/99 ФБ фармацевтични състави
Настоящето изобретение обхваща фармацевтичен състав, включващ една или повече от киселините и/или получените в съответствие с описаните методи мазнини. Поспециално, такъв фармацевтичен състав може да включва една или повече от киселините и/ или мазнините, както и стандарт, добре известен, нетоксичен фармацевтично приемлив носител, азжувант или вехикулум като, например, фосфатно буферна сол, вода, етанол, полиоли, растителни мазнини, омокрющ агент или емулсия като емулсия вода/ масло. Състава може да бъде също както в течна, така и в твърда форма. Например, състава може да бъде под формата на таблетка, капсула, усвояема течност или прах, инжекция, или мехлем или крем за локално приложение.
Възможните начини за приложение включват, например, орално, ректално и парентерално. Начинът на прилагане, обаче, зависи от желания ефект. Например, ако състава се използва за лечение на груба, суха или старееща кожа, за лечение на наранена или обгорена кожа, или за лекуване на кожа или коса, поразени от болест, той може да бъде приложен локално.
Дозата на състава за приложение на пациента може да бъде определена от специалиста в областта и зависи от различни фактори като теглото на пациента, възрастта на пациента, имунния статус на пациента и др.
По отношение на формата, състава може да бъде, например, разтвор, дисперсия, суспенсия, емулсия или стерилен прах, който след това се възстановява.
54/99 ФБ
В допълнение, състава от настоящето изобретение може да бъде използван за козметични нужди. Той може да бъде добавен към съществуващи преди това козметични състави, така че направената смес да бъде използвана като самостоятелен състав.
фармацевтичните състави могат да бъдат използвани за въвеждане на PUFA компонента към даден индивид. Подходящите фармацевтични състави могат да включват физиологично приемливи стерилни водни или не- водни разтвори, дисперсии, суспенсии или емулсии и стерилни прахове за възстановяване в стерилни разтвори или дисперсии за инжектиране. Примери за подходящи водни и не- водни носители, разредители, разтворители или вехикулуми включват вода, етанол, полиоли (пропиленгликол, полиетиленгликол, глицерол и др.), подходящи техни смеси, растителни мазнини (като маслинено масло) и инжекционни органични естери като етил олеат. Течливостта може да бъде поддържана, например, чрез поддържане на необходимия размер на частиците в случаи на дисперсии и с използването на повърхностно активни вещества. Би било желателно да бъдат включени изотонични агенти, например захари, натриев хлорид и др. Освен такива инертни разредители, състава може да включва също аджуванти, като омокрящи агенти, емулгиращи и суспендиращи агенти, подсладители, оцветители и ароматизиращи агенти.
Суспенсии, в допълнение към активните вещества, могат да съдържат суспендиращи агенти, като например, етоксилирани изостерилни алкохоли, полиоксиетилен сорбитол и сорбитанови естери, микрокристална целулоза, ^алуминиев
54/99 ФБ
метахидроксид, бентонит, агар- агар и трагакант или смеси от тези вещества, и др.
ТВърди дозиращи форми като таблетки и капсули могат да бъдат изготвени с помощта на техники, добре известни на специалистите в областта. Например, PUFA от изобретенията могат да бъдат таблетирани с обичайните таблетни бази като лактоза, захароза и царевично нишесте 8 комбинация със свързващи вещества като акация, царевично нишесте или желатин, дезинтегриращи агенти като картофено нишесте или алгинова киселина и лубриканти като стеаринова киселина или магнезиев стеарат. Капсули могат да бъдат изготвени чрез включване на тези ексципиенти в желатинова капсула заедно с антиоксидантите и PUFA компонента. Количеството на антиоксидантите и PUFA компонента което следва да бъде включено във фармацевтичната форма следва пасне на изискванията, дискутирани по- горе.
Както се използва в това описание, терминът “лечение “ се отнася както до предотвратяване, така и до редуцциране на инциденти от нежелани явления. Например, лекуването на имунна супресия се отнася както до предотвратяване, така и до редуциране стойността на тази супресия. Терминът “пациент “ и “индивид “ са използвани взаимосвързани и двата се отнасят до живвотно. Терминът “животно “ както е използван в това описание се отнася до всеки топлокръвен бозайник, включително, но без да се ограничава до кучета, хора, маймуни и човекоподобни маймуни. Както е използван в описанието, терминът “около “ се отнася до количество вариращо от посочения интервал или брой с резонно количество, зависещо от
54/99 фБ контекста на употребата. Всеки числов брой или интервал, посочен в описанието следва да се счета, че е модифициран от термина около.
“Доза “ и “сървинг “ се използват взаимозаменяемо и се отнасят до количеството хранителе или фармацевтичен състав, усвоени от пациента при едно приемане и предназначено да достави ефективни количества от антиоксидантите и структурният триглицерид. Както би било очевидно за специалиста в областта, единична доза или сървинг от течният хранителен прах би доставил количеството от антиоксиданти и PUFA, описани по- горе. Количеството на дозата или сървинга следва да е обем, който обикновен Възрастен може да консумира на един прием. Това количество може да Варира широко В зависимост от възрастта, теглото, пола или здравословното състояние на пациента. Обаче, като общо твърдение, единична доза или сървинг от течен хранителен продукт следва да се счита като обхващащ обем от 100 до 600 ml, за предпочитане от 125 до 500 ml и особено предпочитано от 125 до 300 ml.
PUFAs от настоящето изобретение може да бъдат добавяни също към храна дори когато заяместването на диетат не се изисква. Например, състава може да бъде добавен към храна от всеки тип, включително но без да се ограничава до маргарини, модифицирани масла, сирена, мляко, кисело мляко, шоколад, бонбони, снаксове, салатно олио, олио за готвене, масла за готвене, месо, риба и напитки.
54/99 фБ
Фармацевтични приложения
За фармацевтични нужди (за хора и животни), съставите обикновено се прилагат орално, но могат да бъдат прилагани по който и да е начин, при който те могат да бъдат успешно абсорбирани, напр. парентерално (субкутанно, интрамускулно или интравенозно, ректално или вагинално или локално, напр. като кожен мехлем или лосион. PUFAs от настоящето
изобретение могат да бъдат прилагани самостоятелно или в комбинация с фармацевтично приемлив носител или ексципиент. Когато това е възможно, желатиновите капсули са предпочитана форма за орално приложение. Диетичната добавка както е показано по- горе, също може да осигури орален начин на приложение. Ненаситените киселини от настоящето изобретение може да бъдат прилагани в конюгирани форми, или като соли, естери, амиди или лекарствени предшевственици на мастни киселини. Всяка фармацевтично приемлива сол е обхваната от настоящето изобретение; специално предпочитани са натриева, калиева или литиева соли. В обхвата на изобретението са също N- алкилполихидроксаминовите соли, като N- мметил глюкамин, посочено в РСТ публикация WO 96/33155. Предпочитаните естери са етиловите естери. Като твърди соли, PUFA също могат да бъдат включени в таблетната форма. За интравенозно приложение, PUFA или техните производни могат да бъдат включени в търговски форми като Intralipids. Типичният мастно киселинен профил на плазма от възрастен включва 6.64 до 9.46% ARA, 1.45 до 3.11% DGLA, 0.02 до 0.08% GLA. Тези PUFA или техните метаболитни прекурсори, могат да бъдат прилагани както
54/99 ФБ самостоятелно, така и в смеси с други PUFA, за достигане на нормален мастно киселинен профил на пациента. При желание, отделните компоненти на формите могат да бъдат предложени като кит, са единично или многократно приложение. Обичайната доза на отделна мастна киселина е от 0.1 mg до 20 g, или дори 100 g дневно, и е за предпочитане от 10 до 1, 2, 5 или 10 g дневно, както се изисква, или моларни еквивалентни количества от техни производни форми. Парентерални хранителни състави, включващи от около 2 до около 30 тегловни процента мастни киселини, изчислени като триглицериди, са включени в обхвата на настоящето изобретение; предпочита се състав, притежаващ от около 1 до около 25 тегловни процента от тоталния PUFA състав като GLA ( USPN 5 196 198). Други витамини, и по- специално мастноразтворими като витамин A, D, Е и L- карнитин могат да бъдат включени незадължително. При желание могат да бъдат включени консерванти като а- токоферол, обикновено около 0.1% тегловни.
Подходящите фаармацевтични състави могат да включват физиологично приемливи стерилни водни или не- водни разтвори, дисперсии, суспенсии или емулсии и стерилни прахове за възстановяване в стерилни инжекционни разтвори или дисперсии. Примери за подходящи водни и не- водни носители, разредители или вехикулуми включват вода, етанол, полиоли (пропиленглиол, полиетиленгликол, глицерол и др. ), подходящи смеси от тях, растителни масла (като маслинено масло) и инжекционни органични естери като етил олеат. Подходящата течливост може да бъде поддържатна, например, чрез
54/99 ФБ
поддържане на необходимият размер на частиците 6 случая на дисперсии и чрез използване на повърхностно активни вещества. Може да се желае, например включването на изотонични агенти, например захари, натриев хлорид и др. Освен тези инертни разредители, състава може също да включва аджуванти, като омокрящи агенти, емулгиращи и суспендиращи агенти, подсладители, оцветители и ароматизанти.
Сеспунсиите в допълнение към активното вещество, могат да съдържат суспендиращи агенти, като например, етоксилирани изостеарилови алкохоли, полиоксиетилен сорбитол и сорбитанови естери, микрокристална целулоза, алуминиев метахидроксид, бентонит, агар- агар и трагакант, или смеси от тези вещества и др.
Един специално предпочитан фармацевтичен състав съдържа диацетилтартаратни естери на моно- и дигилицериди, разтворени във водна среда или разтворител. Диацетилтартаратните естери на моно- и диглицериди имат HLB стойност от около 9- 12 и са значително повече хидрофилни в сравнение със съществуващите антимикробни липиди, които имат HLB стойности от 2- 4. Такива хидрофилни липиди не могат да бъдат формулирани като водни състави. Както е описано тук, такива липиди могат да бъдат разтворени във водна среда в комбинация с диацетилтартаратни естери на моно- и диглицериди. В съответствие с този вариант, диацетилтартаратните естери на моно- и диглицериди (напр. DATEM- С12: 0) се смилат с други активни антимикробни липиди (напр., 18: 2 и 12: 0 моноглицериди) и се смесват за получаване на хомогенна смес.
54/99 фБ
Хомогенността позволява повишаване на антимикробната активност. Сместа може напълно да бъде диспергирана във вода. Това е невъзможно без добавянето на диацетилтартаратни естери на моно- и диглицериди и предварително смесване с други моноглицериди преди включването им във вода. Водният състав след това може да бъде смесен при стерилни условия с физиологично приемливи разредители, разтворители, буфери или пропеленти, ако е необходимо за формиране на спрей или инхалационно средство.
Настоящето изобретение включва също лечението на различни неразположения с мастни киселини. Добавянето на PUFA от настоящето изобретение може да бъде използвано за лечение на рестенозис след ангиопластия. Симптоми на възпаление, ревматоидни артрити и астма и псориазис могат да бъдат лекувани с PUFA от настоящето изобретение. Събития, показващи че PUFAs могат да бъдат включени в калциевия метаболизъм, предполагат, че PUFAs от настоящето изобретение могат да бъдат използвани в лечението или предотвратяването на остеопорозис и камъни на бъбреците или пикочопроводния тракт.
PUFAs от настоящето изобретение могат да бъдат използвани в лечението на рак. Малигнените клетки е наблюдавано, че имат променен мастно киселинни състав; добавянето на мастни киселини показва, че понижава техния растеж и причинява клетъчна смърт, и да повишава тяхната податливост на хемотерапевтични агенти. GLA е показано че причинява реекспресия в раковите клетки на Е- cadherin клетъчни адхезионни молекули, загуба на които се свързва с агресивен
54/99 ФБ мешастазис. Клинично тестване на интравенозно въвеждане на водноразтВорима сол на GLA у пациенти с рак на панкреаса води до стотистически значимо повишение на тяхното оцеляВане. Добавянето на PUFA може да се използва също за лечение на кахексия, свързана с рак.
PUFA от настоящето изобретение може да бъдат изпозлзвани също за лечение на диабет (USPN 4 826 877; Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Suppl.), 732S- 737S). Изменение на метаболизма на мастните киселини и състава им се наблюдава в диабетични животни. Тези промени се предполага че участват в някои от продължителните компликации, резултат от диабет, Включително ретинопатия, невропатия, нефропатия и нарушения на репродуктивната система. Розовото масло, което съдържа GLA, пе показано че предотвратява и възстановява диабетично увреден нерв.
PUFAs от настоящето изобретение може да бъдат използвани за лечение на екзема, да редуцират кръвното налягане и да подобрят математическите стойности. Дефицит на есенциални мастни киселини предполага, че е присъщо за екземата, и изследванията показват благоприятно влияние върху екземата при лечение с GLA. GLA показват също Влияние за редуциране повишеното кръвно налягане, което се асоциира със стрес, и за подобрение на аритметичните тестове. GLA DGLA е показано, че инхибиат тромбоцитната агрегация, причиняват вазодилатация, ниски холестеролни нива и инхибират пролиферацията на стените на кръвоносните съдове в гладката мускулатура и фиброзната тъкан (Brener et al., Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83- 101, 1976). Въвеждането на GLA или
54/99 ФБ
DGLA, самостоятелно или В комбинация с ЕРА, Води до редуциране или предотвратяване на гастро- интестиналното кървене и други странични ефекти, причинени от не- стероидни противовъзпалителни лекарства (USPN 4 666 701) GLA и DGLA показват също, че предотвратяват или лекуват ендометриозис и пременструален синдром (USPN 4 758 592) и лекуват миалгичен енцефаломиелит и хронична умора след вирусна инфекция (USPN 5 116 871).
По- нататъшни приложения на PUFAs от настоящето изобретение включват употребата при лечение на СПИН, мултиплена склероза, остър респираторен синдром, хипертензия и възпалителни състояния на кожата. PUFAs от изобретението могат да бъдат използвани също за общо укрепване на здравето, а така също и за гериатрични лечения.
Ветеринарни приложения
Следва да се отбележи, че описаните по- горе фармацевтични и хранителни състави могат да бъдат използвани за животни, а така също и за хора, доколкото животните проявяват повечето от същите нужди и състояния като хората. Например, мазнините или киселините от настоящето изобретение може да бъдат използвани като хранителни добавки за животни.
Следните примери са представени с оглед илюстрация, но не и за ограничение.
54/99 ФБ
Примери
Пример 1 Изолиране на ?5- десатуразна нуклеотидна последователност от Mortierella alpina
Пример 2 Експресия на Δ5- десатуразни клонове на М. alpina в хлебни дрожди
Пример 3 Начална оптимизация на условията на култивиране
Пример 4 Разпределяне на PUFAs в дрождеВи липидни фракции
Пример 5 По- нататъшно оптимизиране на културата
Пример 6 Идентифициране на хомоложни на М. alpina Δ5и Δ6- десатурази
Пример 7 Идентифициране на М. alpina Δ5- и Δ6- хомолози В други PUFA- продуциращи организми
Пример 8 Идентифициране на М. Alpina Δ5- и Δ6- хомолози В други PUFA- продуциращи организми
Пример 9 Човешки десатуразни последователности
Пример 10 Хранителни състави
Пример 1
Изолиране на Δ5- десатуразна нуклеотидна последователност от Mortierella alpina
Mortierella alpina продуцира арахидонова киселина (ARA, 20:4) от прекурсор 20:3 чрез Δ5- десатураза. Нуклеотидна последователност, кодираща Δ5- десатураза от Mortierella alpina е получена чрез PCR амплификация с помощта на 1та верига на
54/99 ФБ
сДНК om М. alpina и дегенерира олигонуклеотидни праймери, съответстващи на амино киселинни последователности, съхранени между Δ6- десатурази от Synecocystis и Spirulina .
Процедурата е следната:
Тотална РНК е изолирана от дневна PUFA- продуцираща култура на Mortierella alpina по методиката на Hoge et al. (1982) Experimental Mycology 6: 225- 232. Използвана е РНК за изготвяне на двойно- верижна сДНК с помощта на ламбда- ZipLox система от BRL, следвайки инструкциите на производителя, фракции с различен размер от М. alpina сДНК се окомплектоват поотделно за получаване на библиотеки с различни среднооразмерени инсерти. Библитоката с “пълна дължина“ съдържа приблизително 3 х 106 клонове с със среден по размер инсерт 1. 77 kb. Съгласуваната в своята последователност библиотека съдържа приблизително 6 х 105 клона със среден размер на инсертита 1. 1 kb.
pg тотална РНК се подлага на обратна транскрибция с помощта на BRL Superscript Rtase и праймера Tsyn (5’CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTlTTTTTTT-3?), SEQ ID N0:10. Дегенерирали олигонуклеотиди са конструирани при участъци, съхранени между двете цианобактериални Δ6десатуразни последователности. Използваните специфични праймери са D6DESAT-F3 (SEQ ID N0:8) (5’CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3’) и
D6DESAT-R3 (SEQ ID N0:9) (5’CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTGRTG-3’), където Y=C+T, R=A+G, и О=1+С. Проведена е PCR амплификация в 25 μΐ обем, съдържащ: матрица, получена от 40 ng тотална РНК,
54/99 фБ рМ от всеки праймер, 200 μΜ от всеки дезоксирибонуклеотид трифосфат, 60 тМ Трие- Cl, pH 8.5, 15 тМ (NH4)2SO4, 2 тМ MgCl2. Пробите са подложени на един начален етап на денатурация от 95 градуса (температурата е по Целзий) за 5 минути и след това, докато се добавят 0.2 U от Taq полимераза, се поддържат 72°. PCR термоциклизиращите услоВия са както следва: 94 градуса за 1 мин., 45 градуса за 1.5 мин., 72 градуса за 2 мин. PCR се поддържа за 35 цикъла. PCR, при която се използват посочените праймери върху първата верига на М. alpina сДНК продуцира 550 Ьр реакционен продукт. Сравняването на дедуктиВната амино киселинна последователност от М. alpina PCR фрагмента SEQ ID N0:3 показва участъци на хомология с ?6- десатурази (Виж фигура 5) Обаче, има само около 28% идентичност със сравнявания участък.
Най- дългият сДНК клон, Ма29, е означен pCGN5521 и е напълно секвениран и в двете Вериги. СДНК се съдържа като 1481 Ьр инсерт във Вектора pZLl (Bethesda Research Laboratories) и, тъй като е с първата ATG, съдържа отворена четяща рамка кодираща 446 амино киселини. Четящата рамка съдържа последователността, изведена от PCR фрагмента. Установено е, че последователността на сДНК инсерта съдържа участъци на хомология с Δ6- десатурази (виж фигура 5). Например, установено е, че има три съхранени “хистидинови кутии“ (които се наблюдават в мембранно- свързани десатурази (Okuley et al., (1994) The Plant Cell 6: 147- 158)) последователността на Mortierella при амино киселинни позиции 171- 175р 207- 212 и 387391 (Виж фигура 3). Обаче, установено е, че типичният
54/99 фБ
“НХХНН“ амино киселинен мотиВ за третата хистидинова кутия за десатуразата от Mortierella е QXXHH, SEQ ID N0:11-
12. Изненадващо, амино края на кодирания протеин, показва значителна хомология с цитохром Ь5 протеините. Така, сДНК клона на Mortierella явно представлява фузия между цитохром Ь5 и мастно киселинна десатураза. Доколкото се счита, че цитохром Ь5 функционира като електронен донор за мембранносвързани десатуразни ензими, възможно е N- крайният цитохром Ь5 домен на този десатуразен протеин да е включен в неговата функция. Това може да бъде предимство при експресиране на десатуразата в хетероложни системи за продуциране на PUFA.
Пример 2
Експресия на десатуразни клонове на М. alpina в хлебни дрожди. Дрождева трансформация
Литиево ацетатна трансформация на дрожди е проведена по стандартните протоколи (Methods in Enzymology, Vol. 194, p. 186- 187, 1991). Накратко, дрожди се култивират в YPD при 30° С. Клетките се центрофугират, ресуспендират се в ТЕ, отново се центрофугират и ресуспендират в ТЕ/литиев ацетат. Ресуспендираните дрожди се инкубират при 30° С за 60 минути при разклащане. Добавя се носеща ДНК и дрождите се разпределят в епруветки. Добавя се трансформираща ДНК и епруветките се инкубират за 30 минути при 30°С. Добавя се PEG разтвор (35% (w/v) PEG 4000, 100 тМ литиев ацетат, ТЕ pH 7.5) последвано от 50 мин. инкубация при 30°С. Провежда се пет минутен температурен шок чрез нагряване при 45°С, клетките се утаяват, промиват се с ТЕ, утаяват се отново и се
54/99 фБ ресуспендират в ТЕ. Ресуспендираните клетки тогава се посяват върху селективна среда.
Десатуразна експресия в трансформирани дрожди сДНК клоновете от М. alpina са скринирани за десатуразна активност в хлебни дрожди. Като положителна контрола е използвана ?15- десатураза от канола (получена чрез PCR с помощта на 1та верига сДНК от Brassica napus 212/86 с помощта на праймери върху публикуваната последователност (Arondel et al. Science 258: 1353- 1355 . Δ15- десатуразният ген и генът от сДНК клона Ма29 е инсертиран във вектора за експресия pYES2 (Invitrogen), което довежда до pCGR-2 и pCGR-4, съответно. Плазмидите са трансфектирани в дрождевия щам S. cerevisiae 334 и са експресирани след индукция с галактоза и присъствието на субстрати, което позволява установяване на специфична десатуразна активност. Контролният щам е S. cerevisiae 334, съдържащ непромененият pYES2 вектор. Използваните субстрати, получените продукти и посочената десатуразна актиВност са: DGLA (конверсия до ARA би трябвало да покаже Δ5- десатуразна активност), линоленова киселина (превръщане в GLA би покаказало /16- десатуразна активност; конверсия до ALA би показало Δ15- десатуразна активност), олеинова киселина (един ендогенен субстрат от S. cerevisiae, конверсия до линоленова киселина би показало Δ12- десатуразна активност, която S. cerevisiae няма), или ARA (конверсия до ЕРА би показало ?17- десатуразна активност). Резултатите са представени на Таблица 1 по- долу. Липидните фракции са екстрехирани както
54/99 фБ следва: Културите се развиват за 48- 52 часа при 15°С. Клетките се утаяват чрез центрофугиране, промиват се еднократно със стерилна ddH2O, и отново се утаяват. Утайката се разбърква с метанол; добавя се хлороформ успоредно с тритридеканоин (като вътрешен стандарт). Смесите се инкубират за най- малко един час на стайна температура или при 4° С за едно денонощие. Хлороформеният носител се екстрахира и филтрува през филтър на Whatman с един грам безводен натриев сулфат за отстраняване на частичките и остатъчната вода. Органичните разтворители се изпаряват при 40° С в азотен поток. Екстрахираните липиди след това се превръщат в мастно киселинни метилови естери (FAME) за газ хроматографски анализ (GC) чрез добавяне на 2 ml 0.5 N калиев хидроксид в метанол в затворена епруветка. Пробите се нагряват до 95° С до 100° С за 30 минути и се охлаждат до стайна температура . Добавят се приблизително 2 ml от 14% боров трифлуорид в метанол и нагряването се повтаря. Сле охлаждане на екстрахираната липидна смес, се добавят 2 ml вода и 1 ml хексан за екстракция на FAME за анализ с GC. Процентното превръщане се изчислява чрез разделяне на получения продукт на сумата от (полученият продукт и добавеният субстрат) и след това умножена по 100. За изчисляване на процентното превръщане на олеиновата киселина, когато не е добавен субстрат, тоталното количество получена линоленова киселина се разделя на сумата от (олеинова киселина и продуцирана линоленова киселина), след което се умногава по 100.
54/99 фБ 76
Таблица 1
Десатуразна експресия на М. alpina в хлебни дрожди
Клон Тип ензимна активност % конверсия на субстрата
pCGR-2 Δ6 0 (18:2 до 18:3ω6)
(канола ?15 Δ15 16.3 (18:2 до 18:3ω3)
десатураза) Δ5 2.0 (20:3 до 20:4ω6)
Δ17 2.8 (20:4 до 20:5ω3)
Δ12 1.8 (18:1 до 18:2ω6)
pCGR Δ6 0
(М. alpina Δ15 0
Ма29) Δ5 15.3
Δ17 0.3
Δ12 3.3
Δ15- десатуразният клон показва 16.3% конверсия на субстрата. PCGR-4 клона, експресиращ Ма29 сДНК, превръща 15.3% от20:3 субстрата в 20:4ω6, което показва, че генът кодира Δ5 десатураза. НиВото (неспецифична конверсия на субстрата) е между 0- 3% в дадения случай. Установена също така, субстратно инхибиране на активността с използването на различни концентрации от субстрата. Когато се добавя субстрат до 100 μΜ, процентното превръщане В продукта се сравнява със случая когато субстрата се добавя до 25 μΜ (виж
54/99 ФБ по- долу). В допълнение, чрез вариране на DGLA субстратни концентрации, между около 5 μΜ до около 200 μΜ процентно превръщане на DGLA в ARA граничи от около 5% до 75% с М.
alpina Δ5- десатураза.
Тези данни показват, че десатурази с различни субстратни специфики могат да бъдат експресирани в хетероложна система и да бъдат използвани да продуцират поли- ненаситени дълго верижни мастни киселини.
Таблица 2 представя мастни киселини като процент от тоталните липиди, екстрахирани от дрождевият гостоприемник S. cerevisiae 334 с посоченият плазмид. В хранителната среда не присъства глюкоза. Използвана е афинитетна газ хроматография за разделяне на съответните липиди. Използвана е GC/MS за потвърждаване идентичността на продуктите. Очакваните продукти за В. napus Δ15десатураза, а- линоленова киселина, е установена когато нейният субстрат, линоленова киселина, се добавя екзогенно към индуцираната дрождева култура. Това откритие показва, че дрождевата експресия на десатуразен ген може да продуцира функционален ензим и количества от продукта, които могат да бъдат регистрирани в конкретните условия на култивиране. И двата екзогенно добавени субстрата се възприемат от дрождите, макар и по- малко от по- дълговерижната PUFA, дихомо- у- линоленова киселина (20:3) да е включена в дрождите вместо линоленовата киселина (18:2) когато се добавя също и в свободна форма към индуцираните дрождеви култури. Арахидоновата киселина е открита като нов PUFA в дрожди
54/99 ФБ когато се добавя дихомо- γ- линоленова киселина като субстрат към S. cerevisiae 334 (pCGR- 4). ТоВа идентифицира pCGR-4 (МА29) като Δ5- десатураза от М. alpina. Преди това не е докладвано за изолиране и експресия на Δ5- десатураза от който и да е източник.
Таблица 2
Мастни киселини като процент от тоталните липиди.
екстрахирани от дрожди
Плазм идв дрожди (ензим 18:2 Включен α-18:3 продуци ран γ-18:3 продуци ран 20:3 включен 20:4 продуци ран 18: Г наличен 18:2 продуци ран
pYES2 (контро ла) 66.9 0 0 58.4 0 4 0
pCGR-2 (Δ15) 60.1 5.7 0 50.4 0 0.7 0
pCGR-4 (Δ5) 67 0 0 32.3 5.8 0.8 0
Добавен 100 μΜ субстрат
18:1 е ендогенна мастна киселина в дрожди
Ключ към таблицата:
18:1 = олеинова киселина
18:2 = линоленова киселина а-18:3 = а- линоленова киселина γ-18:3 =γ- линоленова киселина
54/99 ФБ
18:4 = стеаринова киселина
20:3 = дихомо- γ- линоленова киселина
20:4 = арахидонова киселина
Пример 3
Оптимизиране на условията на култивиране
Таблица ЗА показва влиянието на екзогенен субстрат от свободни мастни киселини, концентрацията на усвояване от дрождите и конверсията на мастно киселинния продукт като процент от екстрахираните общите дрождеви липиди. При всички случаи, ниски стойности на екзогенен субстрат (1-10 μΜ) води до слабо приемане на мастно киселинен субстрат и формиране на продукт. Концентрация между 25 и 50 μΜ свободна мастна киселина в растежната и индукционна среда дава най- висок процент формиране на мастно киселинен продукт, докато 100 μΜ концентрация и последващото силно усвояване от дрождите води до понижаване или инхибира десатуразната активност. Обратното инхибиране на високите концентрации от мастно киселинния субстрат са илюстрирани добре, когато степените на процентно превръщане на съответните мастно киселинни субстрати спрямо техните съответни продукти са сравнени в Таблица ЗВ. Във всички случаи, 100 μΜ субстратна концентрация в растежната среда понижава процентното превръщане в продукт. Влиянието на състава на средата е очевидно също, когато в растежната среда за Δ5- десатураза присъства глюкоза, когато процента на субстратното усвояване се понижи до 25 μΜ (Таблица ЗА). Обаче, процентното превръщане с Δ5- десатураза се повишава с
54/99 ФБ
18% и процента на формирания продукт остава същия в присъствието на глюкоза в растежната среда.
Таблица ЗА
Влияние на добавения субстрат на процента включен субстрат и формирания продукт в дрождеви екстракти
Плазмид в дрожди pCGR-2 (Δ15) pCGR-4 (Δ5)
субстрат/ продукт 18:2/а-18:3 20:3/20:4
1 μΜ суб. ND 0.5/1.7
10 μΜ суб. ND 3.3/4
25 μΜ суб. ND 5.1/ 6.1
25 μΜΟ суб. 36.6/7.2 0 9.3/5.40
50 μΜ суб. 53.1/ 6.5 0 ND
100 μΜ суб. 60.1/5.7 0 32.3/5.80
Таблица ЗВ
Влияние на субстратната концентрация в средата върху процентното превръщане на мастно киселинния субстрат в продукт в дрождеви екстракти
54/99 ФБ
Плазмид в дрожди pCGR-2 (Δ15) pCGR-4 (Δ5)
субстрат/ продукт 18:2 ->α-18:3 20:3 ->20:4
1 μΜ суб. ND 77.3
10 μΜ суб. ND 54.8
25 μΜ суб. ND 54.2
25 μΜ? суб. 16.4 36.7
50 μΜ суб. 10.9 0 ND
100 μΜ суб. 8.7 0 15.20
няма глюкоза в средата + дрождево пептонен бюльон (YPD) * 18:1 е ендогенен дрождев липид суб. е субстратна концентрация ND (не направено) i| Таблица 4 показва количеството на мастни киселини, • продуцирано чрез рекомбинантна десатураза от индуцирани дрождеви култури тогава, когато се използват различни количества субстрат от свободни мастни киселини. Теглото на мастните киселини е определено, тъй като общото количество липиди варира драматично при промяна на условията на растеж, = като процента на глюкозата в дрождевата растежна и индукционна среда. За по- добро определяне кога рекомбинантната десатураза би продуцирала повече PUFA ί продукт, се изпитва количеството на отделните мастни
54/99 фБ киселини. Липсата на глюкоза редуцира количеството на арахидоновата киселина, продуцирана от Δ5- десатураза на половина. За Δ5- десатураза количеството на общите дрождеви липиди е понижено почти наполовина в отсъствие на глюкоза.
Таблица 4
Мастна киселина, продуцирана В pg от дрождеви екстракти
Плазмид в дрожди PCGR-4 pCGR-7
(ензим) (Δ5) (Δ12)
Продукт 20:4 18:2*
1 μΜ суб. 8.3 ND
10 μΜ суб. 19.2 ND
25 μΜ суб. 31.2 115.7
25 μΜΟ суб. 16.8 390
няма глюкоза в средата суб. е субстратна концентрация
ND (не е направено) *18:1, субстрата е ендогенен дрождев липид
54/99 ФБ
Пример 4
Разпределяне на PUFAs β дрождеВи липидни фракции
Таблица 5 показва усвояването на свободни мастни киселини и формирането на техни нови продукти в дрождеви липиди както са разпределени в поВечето липидни фракции. Общ липиден екстракт е изготвен както е показано по- горе. Липидният екстракт се разделя върху TLC пластинки, и фракциите се идентифицират чрез сравняване със стандарти. ИВиците се събират чрез изстъргВане, и се добавят Вътрешни стандарти, фракциите след тоВа се осапунВат и метилират както по- горе, и се подлагат на газ хроматография. Газ хроматографът калкулира количеството мастна киселина, сравнено със стандарт. Очевидно е, че субстратите са достъпни ВъВ фосфолипидна форма за десатуразите.
Таблица 5
Разпределение на мастните киселини В различни дрождеВо липидни фракции 6 pg
Фракция мастна киселина фосфолип ид Диглицери д Свободна мастна киселина Триглицер ид Холестеро лов естер
SC(pCGR- 4) субстрат 15.1 1.9 22.9 12.6 3.3
54/99 ФБ
20:3
SC(pCGR- 4) 42.6 0.9 6.8 4.9 0.4
SC = S. cerevisiae (плазмид)
Пример 5 По- нататъшно оптимизиране на културата
Преценяват се растежните и индукционни условия за оптимални активности на десатурази в Saccharomyces cerevisiae. Различните културални условия, които са манипулирани за оптимална активност са: I) индукционна температура, ii) концентрация на ендуктора, iii) продължителност на добавянето на субстрата, iv) концентрация на веществото, v) източник на захари, vi) растежна фаза при индукция. Тези изследвания са проведени с използване на Δ5- десатуразният ген от Mortierella alpina (МА29). В допълнение се определя и ефекта на изменение на гостоприемниковия щам при експресия на Δ5десатуразния ген.
Както е описано по- горе, най- добрата степен на превръщане на субстрата в ARA е наблюдавано при субстратна концентрация от 1 μΜ, обаче, процента на ARA в общите мастни киселини е най- висок при 25 μΜ субстратна концентрация. За определяне дали е необходимо субстрата да бъде модифициран в подходяща форма преди да бъде използван от десатуразата, субстрата се добавя или 15 часа преди
54/99 ФБ индуциране или заедно с добавянето на индуктора (означено като после, на фигура 6А). Както може да се види на фигура 6А, добавянето на субстрата преди индуциране няма значителен ефект върху активността на Δ5- десатураза. фактически, добавянето на субстрат заедно с индуктор е малко по- добро за експресия/ активност на Δ5- десатураза, тъй като ARA нивата в общите мастни киселини е по- високо. Обаче, степента на конверсия на субстрата в продукт е малко по- слаба.
Влиянието на концентрацията на индуктора върху експресията/ активността на Δ5- десатураза от Mortierella е изследвано чрез индуциране на SC334/ pCGR5 с 0.5 или 2% (w/v) галактоза. Както е показано на фигури 7А и 7В, експресията на Δ5- десатураза е по- висока когато е индуцирана с 0.5% галактоза. Нещо повече, степента на конверсия на субстрата до продукт също е по- добро когато S334/ pCGR5 е индуциран с 0.5% галактоза спрямо 2% галактоза.
За определяне влиянието на температурата върху Δ5десатуразната активност, гостоприемников щам SC334, трансформиран с pCGR5 (SC334/pCGR5) се култивира и индуцира при 15° С, 25° С, 30° С и 37° С. Количеството на ARA (20:4п6) продуцирано в SC334/pCGR5 култури, снабдени със субстрат 20:Зпб, е измерено с мастно киселинен анализ, фигура 8А показва количеството на 20:Зп6 и 20:4п6, изразено като процент от общите мастни киселини, фигура 8В показва степента на превръщане на субстрата в продукт. Растежа и индуцирането на SC334/pCGR5 при 25° С, е най- добро за експресия на Δ5- десатураза както е видно от високите нива на
54/99 ФБ арахидонова киселина в общото количество мастни киселини. В допълнение, по- високотата степен на конверсия на субстрата в продукт също става при 25°С. Растежа и индуцирането при 15°С дава по- ниската степен на експресиране на ARA, докато при 37° С дава най- ниската степен на превръщане на субстрата в продукт.
Влиянието на дрождевият щам върху експресирянето на Δ5- десатуразния ген е изследвано в 5 различни гостоприемникови щама: INVSC1, INVSC2, YTC34, YTC41 и SC334, при 15° С и 30° С. При 15° С, SC334 има най- високият процент ARA в общите мастни киселини, което предполага повисока активност на Δ5- десатуразата в SC334. Степента на конверсия на субстрата в продукт, обаче е най- ниска в SC334 и най- висока в INVSC1 (фиг. 9А и В). При 30° С, най- високият процент от продукта (ARA) в общите мастни кщиселини се наблюдава в INVSC2, макар степента на конверсия на субстрата в продукт при INVSC2 да е малко по- ниска от INVSC1 (фиг. 10А и В).
ARA, продукта на Δ5- десатураза, се съхранява във фосфолипидната фракция (Пример 4). Поради това количеството на ARA продуцирано в дрожди е ограничено от количеството, което може да бъде съхранено във фосфолипидната фракция. Ако ARA може също да бъде съхранено в други фракции като триглицеридната фракция, количеството на ARA продуцирано в дрожди би могла да се повиши. За тестване на тази хипотеза, Δ5- десатуразният ген се експресира в дрождев гостоприемников щам DBY746 (получен
54/99 ФБ om Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720). Генотипът на щам DBY746 e Mata, his3-Al, 1еи2-3, leu2112, ura3-32, trpl- 289, gal). Дрождевият щам DBY746 има ендогенен ген за холин трансфераза. Присъствието на този ензим може да позволи на щам DBY746 да превърне излишъка от фосфолипиди в триглицеридна фракция. Резултатите на фиг. 11 показват, че няма повишение на превръщането на субстрата в продукт в сравнение с SC334, който няма ген за холин трансфераза.
За изследване на ефекта на средата върху експресията на
Δ5- десатуразата, pCGR4/ SC334 се култивира в четири различни среди при две различни температури (15° С и 30° С) и в два различни гостоприемникови щама (SC334 и INVSC1). Състава на средата е както следва:
Среда A: тт- Ura, + 2% галактоза + 2% глюкоза.
Среда В: тт- Ura, +20% галактоза + 2% глюкоза + 1М сорбитол (pH 5.8)
Среда С: тт- Ura, +2% галактоза +2% рафиноза
Среда D: тт- Ura, +2% галактоза V2% рафиноза 4-1М сорбитол (pH 5.8) тт = минимална среда
Резултатите показват, че по- високата степен на конверсия на субстрата до продукт при 15°С в SC334 се наблюдава в среда А. Най- високата степен на конверсия изобщо за Δ5- десатураза в INVSC1 е също при 30° С в среда D (фигури 12AU12B).
54/99 фБ
Тези данни показваш, че ДНК кодираща десатураза, която може да превърне DGLA в ARA може да бъде изолирана от Mortierella alpina и може да бъде експресирана в хетероложна система и използвана да продуцира поли- ненаситени дълговерижни мастни киселини. Например, получаването на ARA от предшевственика DGLA чрез експресиране на Δ5- десатураза в дрожди.
Пример 6
Идентифициране на хомоложни за М. alpina 75 и ?6 десатурази
Последователност на нуклеинова киселина, която кодира предполагаема ?5 десатураза се идентифицира посредством TBLASTN търсене на бази данни с NCBI с помощта на амино киселини 100- 446 от Ма29 като въпрос. Срязаната част от Ма29 последователността е използвана за да бъде избегнато отчитането на хомологии, основани на цитохром Ь5 частта в N-края от десатуразата. Дедуктивната амино киселинна последователност от оценка на Dictiostelium discoideum (достъп #С25549) показва значителна хомоложност с Ма29 и по- малка, но все още значителна хомоложност с Ма524. ДНК последователността е представена като SEQ ID NO: 13. Амино киселинната последователност е представена като SEQ ID NO: 14.
54/99 фБ 89
Пример 7
Идентифициране на М. alpina Δ5 и Δ6 хомолози 8 други PUFAпродуциращи организми
За наблюдаване на десатуразите, включени в продуцирането на PUFA, от тотална РНК, изолирана от Pheodactylum tricornutum е конструирана сДНК библиотека. Основаната на плазмидите сДНК библиотека е конструирана в pSPOTl (GIBCO- BRL), следвайки инсструкциите на производителя с помощта на търговско достъпен кит GIBCOBRL). Съгласуват се случайни сДНК клонове и нуклеокиселинни последователности, които кодират предполагаемите ?5 и ?6 десатурази се идентифицират чрез BLAST търсене в базите данни и сравняване с Ма29 и Ма524 последователности.
Идентифициран е един клон от библиотеката на Pheodactylum с хомоложност спрямо Ма29 и Ма 524; тя е наречена 144- 011- В12. ДНК последователността е представена като SEQ ID N0:15. Амино киселинната последователност е преставена като SEQ ID NO: 16.
Пример 8
Идентифициране на М. alpina Δ5 и Δ6 хомолози 8 други PUFAпродуциращи организми
За наблюдаване на десатуразите, включени ва PUFAпродукцията, от тотална РНК, изолирана от видове на Schizochytrium се конструира сДНК. Оснаваната на плазмиди
54/99 ФБ сДНК библиотека е конструирана в pSPORTl (GIBCO- BRL), следвайки инструкциите на производителя с помощта на търговско достъпен кит (GIBCO-BRL). Случайните сДНК клонове се съгласуват и нуклеокиселинните последователности, които кодират предполагаемите Δ5 и Δ6 десатурази се идентифицират чрез BLAST търсене в базите данни и сравняване с последователнотите Ма29 и Ма524.
Идентифициран е един клон от библиотеката на Schizochytrium с хомоложност спрямо Ма29 и Ма524; наречен е 81- 23- С7. Този клон съдържа — 1 kb инсерт. Получена е частична последователност от всеки край на клона с помощта на универсални прави и обратно съгласуващи праймери. ДНК последователността от правият праймер е представена като SEQ ID NO: 17. Пептидната последователност е представена като SEQ ID N0:18. ДНК последователността от обратният праймер е представена като SEQ ID N0:19. Амино киселинната последователност от обратният праймер е представена като SEQ ID NO: 20.
Пример 9
Последователности на гена за човешка десатураза
Последователности на човешкия десатуразен ген, потенциално включени в биосинтезата на дългата верига на полиненаситените мастни киселини, са изолирани на основата на хомологията между човешките сДНК последователности и последователностите на гена на Moftierella alpina. Намерени са трите консервативни “хистидинови кутии“, за които е
54/99 ФБ известно че са съхранени между мембранно- свързани десатурази. Както и някои други мембранно- свързани десатурази, установено е, че крайният мотив НХХНН в хистидиновата кутия е QXXHH. Амино киселинната последователност на предполагаемите човешки десатурази проявяват хомоложност спрямо М. alpina Δ5, Δ6 и Δ12 десатурази.
М. alpina Δ5 десатуразата и Δ6 сДНК последователността са използвани за търсене в LifeSeq базата данни на Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California 94304. Δ5 десатуразната последователност е разделена на фрагменти: 1) амино киселини но. 1- 150; 2) амино киселини но. 151- 300 и 3) амино киселини но. 301- 446. Δ6- десатуразната последователност е разделена на три фрагмента: 1) амино киселини но. 1- 150; 2) амино киселини но. 151- 300 и 3) амино киселини но. 301- 457. Тези полипептидни фрагменти са търсени в базата данни с помощта на алгоритъма “tblastn“. Този алгоритъм включва търсената протеинова последователност в базата данни от нуклеотидни последователности, динамично транслирана във всички шест четящи рамки (от двете вериги).
Полипептидните фрагменти 2 и 3 на М. alpina Δ5 и Δ6 имат хомоложност с последователностите на ClonelD, както е подчертано на Таблица 6. ClonelD представлява отделна последователност от Incyte LifeSeq базата данни. След получаване на данните от “tblastn “, Clone Information се търси при установена липса на ограничение от >=50, скорост на продуциране < = 100 за различните iCldhelD номера. Резултатите от Информацията за Клона Показва информация, Включваща
54/99 ФБ
Clusterld, ClonelD, Library, HitID, Hit Description. Когато е избран, ClusterlD номера показва информацията за клона за Всички клонове, които принадлежат към този ClusterlD. Асемблерната команда сумира Всички от ClonelD, които Включват ClusterlD. Използвани са следните команди за GCG (Genetics Computer Group, University of Wiskonsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705) Асемблер:
Размер на думата: 7
Минимално припокриване: 14
Ограничение: 0.8
Минимална идентичност: 14
Максимален отстъп: 10
Тежест на отстъпа: 8
Дължина на отстъпа: 2
Резултатите от GCG асемблера показват връзките, генерирани на базата на секвенционната информация вътре в ClonelD. Връзка е едно подравняване на ДНК последователностите на базата на хомологията сред тези последователности. Генерирана е нова (консенсусна последователност) на базата на подравнените ДНК последователности в рамките на връзката. Идентифицирана е връзката, съдържаща ClonelD, и се добавят двусмислените места на консенсусната последователност, на базата на подравняването на ClonelD (виж SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:25) за генериране на възможно най- добрата последователност. Процедурата се повтаря за всичките шест ClonelD, изброени
54/99 ФБ на Таблица 6. Това води до получаване на пет еникални връзки. Добавените консенсусни последователности от петте връзки се изпращат в Sequencher софтуерна програма (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan 48 105). Тези консенсусни последователности се сумират. Връзката 2511785 се припокрива с връзка 3506132, и тази нова връзка е наречена 2535 (SEQ ID N0:27). Връзката от Sequencher програмата се копира в Sequencher Analysis софтуерен пакет на GCG.
Всяка връзка се транслира във всичките шест четящи рамки в протеинови последователности. М. alpina Δ5 (Ма29) и Δ6 (Ма524) последователности се сравняват свсеки от транслираните връзки с помощта на търсене FastA (търсене на Pearson and Lipman за сходство между въпросната последователност и група последователности от същия тип (нуклеинова киселина или протеин)). Хомология между тези последоватлености предполага отворените четящи рамки на всяка връзка. Хомологията между М. alpina&5 и Δ6 спрямо 2535 и 3854933 се използва за създаване на финална връзка, наречена 253538а. фигура 13 е FastA съвпадението с крайната връзка 253538а и Ма29, и фигура 14 е FastA съвпадението с крайната връзка 253538а и Ма524. ДНК последователността за различните връзки са представени на SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO: 27. Различните пептидни последователности са показани на SEQ ID NO: 28- SEQ ID NO: 34.
Макар отворената четяща рамка да е генерирана чрез измерване на двете връзки, връзка 2535 показва, че има уникална последователност в началото на тази връзка, която не съвпада
54/99 фБ с Връзка 3854933. Поради тоВа е Възможно тези Връзки да са генерирани от независима десатураза като човешки гени.
Връзката 253538а съдържа отворена четяща рамка, кодираща 432 амино киселини. Тя започва с Gin (CAG) и завършва със стоп кодон (TGA). Връзката 253538а се подравнява и с двете М. alpina Δ5 и Δ6 последователности, което предполага че би могла да бъде както десатураза, така и други известни десатурази, които споделят хомоложност една с друга. Отделните Връзки , изброени на Таблица 6, както и междинната Връзка 2535 и крайната Връзка 253538а могат да бъдат използвани за изолиране на пълните гени за човешки десатурази.
Приложения на човешките десатурази
Тези човешки последователности могат да бъдат експресирани в дрожди и растения с помощта на методиките, описани в предходните примери. За експресия В клетки на бозайници и трансгенни животни, тези гени могат да предоставят супериорно кодонов наклон. Тези човешки последователности могат да бъдат използвани също за идентифициране на сродни десатуразни последователности.
Таблица 6
Сектори на десатуразите
ClonelD от базата данни LifeSeq
Ключова дума
54/99 фБ
151- 300 Δ5 3808675 Мастно киселинна десатураза
301-446 Δ5 354535 Δ6
151- 300 Δ6 3448789 Δ6
151- 300 Δ6 1362863 Δ6
151- 300 Δ6 2394760 Δ6
301- 457 Δ6 3350263 Δ6
Пример 10
Хранителни състави
PUFAs от предишните примери могат да бъдат използвани Вразлични хранителни добавки, форми за подрастващи, заместители на храни и други хранителни разтвори.
1. форми за подрастващи
A. Isomil® соева формула с желязо
Приложение: Като напитка за подрастващи, деца и Възрастни с алергия или чуВстВителност към кравето мляко. Храна за пациенти с нарушения, за които следва да се избягва лактоза: лактазна недостатъчност, лактозна непоносимост и галастоземия.
Характеристики:
СоеВ протеинов изолат за избягване симптомите на алергия или чуВстВителност спрямо протеина на кравето мляко
54/99 ФБ
Свободни на лактоза форми за избягване на свързани с лактозата диарии
Ниска осмотичност (240 mOsm/kg Вода) за редуциране риска от осмотична диария
Двойни въглехидрати (пшеничен сироп или захароза) създадени за повишаване въглехидратната абсорбция и редуциране риска от превишаване абсорбтивния капацитет на увреденото черво
1.8 mg желязо (като феро сулфат) на 100 калории за подпомагане предтвратяването на недостиг на желязо
Препоръчани нива на витамини и минерали
Растителни мазнини за осигуряване препоръчаните нива на есенциални мастни киселини
Млечен цвят, млечна консистенция и приятен аромат
Инградиенти: (PareveT) 85% вода, 4.9% пшеничен сироп, 2.6% захар (захароза), 2.1% соево масло, 1.9% соев протеинов изолат, 1.4% кокосово масло, 0.15% калциев цитрат, 0.11% калциев фосфат трибазичен, калиев цитрат, калиев фосфат монобазичен, калиев хлорид, моно- и ди- глицериди, соев лецитин, карагенан, аскорбинова киселина, L-метионин, магнезиев хлорид, калиев фосфат дибазичен, натриев хлорид, холин хлорид, таурин, железен сулфат, т-инозитол, алфа- токоферил ацетат, цинков сулфат, L- карнитин, ниацинамид, калциев пантотенат, купро сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, рибофлавин, пиридоксин хидрохлорид, фолиева киселина, манганов сулфат, калиев йодид, филоквинон, биотин, натриев селенит, витамин D3 и цианокобаламин.
54/99 ФБ
В. IsomilT DF соева формула за диария
Приложение: Като кратковременно хранене за диетично управляване на диария при подрастващи и възрастни.
Характеристики:
Първа формула за подрастващи да съдържа диетични фибри от соя специфично за управляване на диария
Клинично показано редуциране продължителността на освобождаването, водни изпражнения по време на меки до силни диарии при подрастващи
Храннителен комплект, който да посрещне хранителните нужди на подрастващите
Соев протеинов изолат с добавка на L- метионин посреща или превишава необходимите за подрастващите есенциални амино киселини
Свободна на лактоза формула за избягване на лактозоасоциирана диария
Ниска осмотичност (240 mOsm/kg вода) за редуциране риска от осмотична диария
Двойни въглехидрати (пшеничен сироп и захароза), конструиран за повишаване въглехидратната абсорбция и редуциране риска от превишаване абсорбтивният капацитет на увредените черва.
Достигане или превишаване нивата на витамини и минерали, препоръчвани от Комитета за хранене на Американската Академия по Педиатрия и препоръчвани от Нормите за формули за подрастващи
1.8 mg желязо (като феро сулфат) за 100 калории за подпомогне или предотврати недостига на желязо.
54/99 ФБ
Растителни мазнини, за да доставят препоръчваните нива на есенциални мастни киселини.
Инградиенти: (PareveT) 80% вода, 4.8% пшеничен сироп, 2.5% захар (захароза), 2.1% соево масло, 2.0% соев протеинов изолат, 1.4% кокосово масло, 0.77% соеви фибри, 0.12% калциев цитрат, 0.11% калциев фосфат трибазичен, 0.10% калиев цитрат, калиев фосфат монобазичен, калиев хлорид, моно- и диглицериди, соев лецитин, карагенан, аскорбинова киселина, Lметионин, магнезиев хлорид, калиев фосфат дибазичен, натриев хлорид, холин хлорид, таурин, железен сулфат, т-инозитол, алфатокоферил ацетат, цинков сулфат, L- карнитин, ниацинамид, калциев пантотенат, купро сулфат, Витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, рибофлавин, пиридоксин хидрохлорид, фолиева киселина, манганов сулфат, калиев йодид, филоквинон, биотин, натриев селенит, витамин D3 и цианокобаламин.
С. Isomil® SF свободни от захароза соеви формули с желязо
Приложение: Като напитка за подрастващи, деца и възрастни с алергия или чувствителност към протеина на кравето мляко или непоносимост към захароза. Хранене за пациенти с нарушения, за които захарозата следва да бъде избегната.
Характеристики:
Соев протеинов изолат за избягване на симптомите на алергия или чувствителност към краве мляко
54/99 ФБ
Свободна на лактоза формула за избягване на лактозоасоциирана диария (въглехидратен източник е PolycoseT
Glucose Polymers)
Свободна на захароза за пациент, който е нетолерантен към към захароза
Ниска осмотичност (180 mOsm/kg вода) за редуциране риска от осмотична диария
1.8 mg желязо (като феро сулфат) за 100 калории за подпомогне предотвратяването на недостиг на желязо Препоръчани нива на витамини и минерали
Растителни мазнини, които да предоставят препоръчваните нива на есенциални мастни киселини
Млечно- бял цвят, подобна на млечната консистенция и приятен аромат
Инградиенти: (PareveT) 75% вода, 11.8% хидролизирано пшенично нишесте, 4.1% соев протеинов изолат, 2.8% кокосово масло, 1.0% модифицирано пшенично нишесте, 0.38% калциев фосфот трибазичен, 0.17% калиев цитрат, 0.13% калиев хлорид, моно- и диглицериди, соев лецитин, карагенан, аскорбинова киселина, L-метионин, калциев карбонат, магнезиев хлорид, натриев хлорид, холин хлорид, таурин, железен сулфат, тинозитол, алфа- токоферил ацетат, цинков сулфат, Lкарнитин, ниацинамид, калциев пантотенат, купро сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, рибофлавин, пиридоксин хидрохлорид, фолиева киселина, манганов сулфат, калиев йодид, филоквинон, биотин, натриев селенит, витамин D3 и цианокобаламин.
54/99 фБ
100
D. Isomil® 20 соева формула с желязо за директна консумация, 20 Cal/fl oz.
Приложение: Когато е желателно хранене със соя
Инградиенти: (PareveT) 85% вода, 4.9% пшеничен сироп, 2.6% захар (захароза), 2.1% соево масло, 1.9% соев протеинов изолат, 1.4% кокосово масло, 0.15% калциев цитрат, 0.11% калциев фосфат трибазичен, калиев цитрат, калиев фосфат монобазичен, калиев хлорид, моно- и диглицериди, соев лецитин, карагенан, аскорбинова киселина, L-метионин, магнезиев хлорид, калиев фосфат дибазичен, натриев хлорид, холин хлорид, таурин, железен сулфат, т-инозитол, алфа- токоферил ацетат, цинков сулфат, L- карнитин, ниацинамид, калциев пантотенат, купро сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, рибофлавин, пиридоксин хидрохлорид, фолиева киселина, манганов сулфат, калиев йодид, филоквинон, биотин, натриев селенит, витамин D3 и цианокобаламин.
Е. Similac® формула за подрастващи
Приложение: Когато е необходима формула за подрастващи: ако решението е направено за прекъсване кърменето преди навършване на едногодишна възраст, ако е необходимо допълване към кърменето или като рутинно хранене ако детето не се храни с кърма.
Характеристики:
54/99 фБ
101
Протеин с подходящо качество и количество за добър растеж; температурно денатуриран, който редуцира риска от свързани с млякото чревна кръвозагуба
Мас от смес от растителни мазнини (двойно хомогенизирана), предоставяща есенциалната линоленова киселина, която лесно се абсорбира
Въглехидрат като лактоза в съотношение, еднакво с това на човешкото мляко
Ниско ренално натоварване за минимизиране стреса върху развиващите се органи
Прахове, концентрирани течности и форми за директна консумация.
Инградиенти: (°-D) вода, обезмаслено мляко, лактоза, соево масло, кокосово масло, моно- и диглицериди, соев лецитин, аскорбинова киселина, холин хлорид, таурин, т-инозитол, алфатокоферил ацетат, цинков сулфат, ниацинамид, феро сулфат, калциев пантотенат, купро сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, рибофлавин, пиридоксин хидрохлорид, фолиева киселина, манганов сулфат, филоквинон, биотин, натриев селенит, витамин D3 и цианокобаламин.
F. Similac® NeoCare Premature формула за подрастващи с желязо
Приложение: За специални хранителни нужди на подрастващи след изписване от болницата. Similac NeoCare е хранителна пълна формула, създадена да осигури подрастващите
54/99 ФБ
102
с допълнителни калории, протеин, витамини и минерали, необходими за догонване на растежа и да подсигури развитието.
Характеристики:
Редуцира необходимостта от калории и снабдяването с витамини. Повече калории (22 cal/fl oz) в сравнение стандартните формули (20 Cal/fl oz).
Силно абсорбира мастния филм, със средно верижни триглицериди (МСТ мазнина) за да подпомогне специалните нужди за храносмилането на подрастващите.
По- високи нива на протеин, витамини и минерали за 100 Калории за удължаване на хранителното подсигуряване, започнало в болнични условия.
Повече калций и фосфат за подобряване на костната минерализация.
Инградиенти: ®- D Соли от пшеничен сироп, обезмаслено мляко, лактоза, суроватъчен протеинов концентрат, соево масло, високо- олеиново масло от сафлор (Carthamus tinctorius), фракционирано кокосово масло (средноверижни триглицериди), кокосово масло, калиев цитрат, калциев фосфат трибазичен, калциев карбонат, аскорбинова киселина, магнезиев хлорид, калиев хлорид, натриев хлорид, таурин, феро сулфат, тинозитол, холин хлорид, аскорбил палмитат, L- карнитин, алфатокоферил ацетат, цинков сулфат, ниацинамид, смесени токофероли, натриев цитрат, калциев пантотенат, купри сулфат, тиамин хлорид хидрохлорид, витамин А палмитат, бета каротен, рибофлавин, пиридоксин хидрохлорид, фолиева
54/99 фБ
103 киселина, магнезиев сулфат, филоквинон, биотин, натриев селенит, витамин Д3 и цианокобаламин.
G. Similac Natural Care хуманизирано мляко Fortifier с ниско съдържание на желязо за непосредствена употреба, 24 Cal/fl oz.
Приложение: Създадено да бъде смесвано с майчина кърма или да бъде алтернативна храна за деца с ниско тегло при раждане.
Инградиенти: ®-D Вода, обезмаслено мляко, хидролизирано пшенично нишесте, лактоза, фракционирано кокосово масло (средно верижни триглицериди), суроватъчен протеинов концентрат, земно масло, кокосово масло, калциев фосфат трибазичен, калиев цитрат, магнезиев хлорид, натриев цитрат, калциев карбонат, моно- и диглицериди, соев лецитин, карагенан, холин хлорид, т- инозитол, таурин, ниацинамид, L- карнитин, алфа токоферил ацетат, цинков сулфат, калиев хлорид, калциев пантотенат, феро сулфат, купри сулфат, рибофлавин, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид, биотин, фолиева киселина, манганов сулфат, филоквинон, витамин Д3, натриев селенит и цианокобаламин.
Различни PUFAs от настоящето изобретение могат да бъдат заместени и/или добавени към формулата за подрастващи, описани по- горе и към други формули за подрастващи, известни на специалистите в областта.
54/99 фБ
104
II. формули за хранене
A. Ensure®
Приложение: Ensure е течна храна, създадена първично като орален заместител на храна за използване заедно с или между ястията или, в подходящи количества, за пълно заместване на храненето. Ensure е лактозо- и глутен- свободна, и е подходяща за използване в модифицирани диети, включително холестеролни диети. Макар това да е първично орален заместител, тя може да бъде използвана за хранене със сонда.
Състояния на пацентите:
За пациенти на модифицирана диета
За възрастни пациенти при хранителен риск
За пациенти с нежелана загуба на тегло
За пациенти, възстановяващи се от заболяване или
операция
Инградиенти: ®-D Вода, захар (захароза), малтодекстрин (пшеница), калциев и натриев казеинат, масло от сафлор с високо- олеиново съдържание (Carthamus tinctorius), соев протеинов изолат, соево масло, канолово масло, калиев цитрат, калциев фосфат трибазичен, натриев цитрат, магнезиев хлорид, магнезиев фосфат дибазичен, синтетичен овкусител, натриев хлорид, соев лецитин, холин хлорид, аскорбинова киселина, карагенан, цинков сулфат, феро сулфат, алфа токоферил ацетат, Gellan, ниацинамид, калциев пантотенат, манганов сулфат, купри сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид, рибофлавин, фолиева
54/99 фБ
105 киселина, натриев молибдат, хромен хлорид, биотин, калиев йодид, натриев селенат.
В. ENSURE® BARS
Приложение: ENSURE BARS са пълна, балансирана храна за заместВащо хранене между или едновременно с храненето. Те осигуряват деликатесна, богата на хранителни Вещества алтернатива на останалите снаксове. ENSURE BARS съдържат < 1 g галактоза/ ивица и оцветителят Chokolate Fudge Brownie е свободен на глутен (Меденият Graham Crunch оцветител съдържа глутен).
Състояния на пациентите:
За пациенти, които се нуждаят от допълнителни калории, протеин, витамини и минерали
Специално приложими за хора, които не приемат достатъчно калории и хранителни Вещества
За хора, които не могат да дъвчат и гълат
Да не се използва от хора с кокосова алергия или който и да е друг тип алергия срещу ядки
Инградиенти:
Меден Graham Crunch -Високо фруктозен пшеничен сироп, соеВ протеинов изолат, кафяВа захар, мед, малтодекстрин (пшеница), къдрав ориз (смлян ориз, захар [захароза], сол [натриев хлорид ] и слад), овесени трици, частично хидрогенирани памучни семена и соеВи масла, соеВ полиглицерид, глицерин, суроватъчен протеинов концентрат, полидекстроза, фруктоза, калциев казеинат, какаово брашно, синтетични оВкусители, канола масло, високо олеиново сафлорово масло,
54/99 ФБ
106
обезмаслено сухо мляко, суроватъчна пудра, соеВ лецитин и пшенично масло. Произвежда се в съоръжения за обработка на ядки.
Витамини и минерали:
Калциев фосфат трибазичен, калиев фосфат дибазичен, магнезиев оксид, сол (натриев хлорид), калиев хлорид, аскорбинова киселина, фери ортофосфат, алфа- токоферил ацетат, ниацинамид, цинков оксид, калциев пантотенат, купро глюконат, манганов сулфат, рибофлавин, бета- каротен, пиридоксинов хидрохлорид, тиаминов мононитрат, фолиева киселина, биотин, хромен хлорид, калиев йодид, натриев селенат, натриев молибдат, филоквинон, витамин D3 и цианокобаламин.
Протеин:
Меден Graham Crunch- Протеиновият източник е смес от протеини на соев протеинов изолат и мляко.
Соев протеинов изолат 74%
Млечни протеини 26%
Мазнини:
Меден Graham Crunch- източника на мазнини е смес от частично хидрогенирани памучни семена и соеви зърна, канола, сафлор и царевично масло и соев лецитин.
Частично хидрогенирани памучни масла и масло от соеви
зърна 76%
Канолово масло 8%
Високо олеиново сафлорово масло 8%
Царевично масло 4%
Соев лецитин 4%
54/99 фБ
107
Въглехидрати:
Меден Graham Crunch- Въглехидратният източник е комбинация от високо- фруктозен царевичен сироп, кафява захар, малтодекстрин, мед, къдрав ориз, глицерин, соев полизахарид и овесени трици.
Високо фруктозен царевичен сироп 24%
Кафява захар 21%
Малтодекстрин 12%
Мед 11%
Къдрав ориз 9%
Глицерин 9%
Соев полизахарид 7%
Овесени трици 7%
С. ENSURE® HIGH PROTEIN
Приложение: ENSURE HIGH PROTEIN е концентрирана, високо- протеинова течна храна, създадена за хора с необхимост от повече допълнителни калории, протеин, витамини и минерали и техните диети. Може да бъде използвана като орална хранителна добавка заедно или между храненията, в подходящи количества, като заместител на храненето. ENSURE HIGH PROTEIN и лактозо- и глутеново- свободна, и е подходяща за използване от хора, които се възстановяват от хирургична намеса или фрактури и от пациенти с опасност от провокиране на язви.
54/99 фБ 108
Състояния на пациентите:
За пациенти, които изизскват допълнителни калории, протеин, витамини и минерали, като пациенти, възстановяващи се от хирургична намеса или фрактура, пациенти с опасност от провокиране на язви, и пациенти на ниско- холестеролни диети.
Характеристики:
Ниско съдържание на наситени мазнини
Съдържа 6 g общи мазнини и <5 mg холестерол на един прием
Вкус на крем
Отличен източник на протеин, калций и други есенциални витамини и минерали
За ниско холестеролни диети
Свободна на лактоза, лесно усвоима
Инградиенти:
Vanilla Supreme:
®-D Вода, захар (захароза), малтодекстрин (царевица), калциев и натриев казеинат, високо- олеиново сафлорово масло, соев протеинов изолат, соево масло, канолово масло, калиев цитрат, калциев фосфат трибазичен, натриев цитрат, магнезиев хлорид, магнезиев фосфат дибазичен, синтетичен ароматизант, натриев хлорид, соев лецитин, холин хлорид, аскорбинова киселина, карагенан, цинков сулфат, феро сулфат, алфа токоферил ацетат, Gellan Gum, ниацинамид, калциев пантотенат, манганов сулфат, купри сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид,
54/99 фБ
109
рибофлаВин, фолиева киселина, натриев молибдат, хромен хлорид, биотин, калиев йодид, натриев селенат, витамин D3 и цианокобаламин.
Протеин:
Протеиновият източник е смес от два протеина с висока биологична стойност: казеин и соя.
Натриев и калциев казеинати 85%
Соев протеинов изолат 15%
Мазнини:
Маслото е смес от три мазнини: високо олеинов сафлор, канола и соя.
Високо олеиново сафлорово масло 40%
Канолово масло 30%
Соево масло 30%
Нивото на мазнините в ENSURE HIGH PROTEIN отговаря на изискванията на American Heart Association (АНА). Шестте грама от мазнините в ENSURE HIGH PROTEIN представляват 24% от общите калории, като 2.6% от мазнините са от наситените мастни киселини и 7.9% от полиненаситените мастни киселини. Тези стойности влизат в стойностите съгласно ръководството на АНА от <30% от общите калории за мазнините, < 10% от калориите от ненаситените мастни киселини, и < 10% от общите калории от ненаситени мастни киселини.
Въглехидрати:
ENSURE HIGH PROTEIN съдържа кобинация от малтодекстрин и захароза. Леко сладкият и разнообразен вкус (ванила, шоколад, дива ягода и банан), плюс VARI54/99 ФБ
110
FLAVORSO^Flavor Paes в пекан, череша, ягода, лимон и портокал, помагат да се преодолее еднообразието от аромати и да се подпомогне податливостта на пациента.
Ванила и други нешоколадови овкусители:
Захароза 60%
Малтодекстрин 40%
Шоколад
Захароза 70%
Малтодекстрин 30%
D. ENSURE® LIGHT
Приложение: ENSURE LIGHT е ниско- маслена течна
храна, създадена за използване като орална хранителна добавка към или между храненията. ENSURE LIGHT е лактозо- и глутеново- свободни, и е подходяща за използване в модифицирани диети, включително ниско- холестеролни диети.
Състояния на пациента:
За пациенти с нормално телесно или наднормено тегло, които се нуждаят от добавка, която съдържа най- малко 50% мазнини и 20% по- малко калории в сравнение с ENSURE
За здрави възрастни, които не се хранят правилно и се нуждаят от допълнителна храна
Характеристика:
54/99 фБ
111
Ниско съдържание на мазнини и наситени мазнини
Съдържа 3 g от общата мазнина за едно блюдо и <5 mg холестерол
Богат вкус на крем
Отличен вкус на калций и други есенциални витамини и минерали
За ниско холестеролни диети
Свободен на лактоза, лесно усвоим
Инградиенти:
Френска ванила: ®-D Вода, малтодекстрин (царевица), захар (захароза), калциев казеинат, високо- олеиново сафлорово масло, магнезиев хлорид, натриев цитрат, калиев цитрат, калиев фосфат дибазичен, магнезиев фосфат дибазичен, естествени и изкуствени овкусители, калциев фосфат трибазичен, целулозен гел, холин хлорид, соев лецитин, карагенан, сол (натриев хлорид), аскорбинова киселина, целулозна смола, феро сулфат, алфа- токоферил ацетат, цинков сулфат, ниацинамид, манганов сулфат, калциев пантотенат, купри сулфат, тиамин хлорид хидрохлорид, витамин А палмитат, пиридоксинов хидрохлорид, рибофлавин, хромен хлорид, фолиева киселина, натриев молибдат, биотин, калиев йодид, натриев селенат, филоквинон, витамин D3 и цианокобаламин.
Протеин:
Протеиновият източник е калциев казеинат
Калциев казеинат 100%
54/99 фБ
112
Мазнини:
Източника на мазнини е смес от дВе масла: високоолеиново сафлорово и канола.
Високо олеиново сафлорово масло
Канолово масло
70%
30%
Нивото на мазнините в ENSURE LIGHT отговаря на това в ръководството на American Heart Association (АНА). Трите грама мазнини в ENSURE LIGHT представляват 13.5% от общите калории, като 1.4% от мазнините са от наситени мастни киселини и 2.6% от полиненаситени мастни киселини. Тези стойности влизат в рамките на ръководството АНА от 30% общи калории за мазнини, < 10% от калориите за наситени мастни киселини, и 10% от общите калории за полиненаситени мастни киселини.
Въглехидрати:
ENSURE LIGHT съдържа комбинация от малтодекстрин и захароза. Шоколадовият вкус се дължи и на царевичен сироп. Средно сладният вкус и разнообразният вкус (Френска ванила, шоколадов суприм, ягодов свирл (водовъртеж?) плюс VARIFLAVORST Flavor Paes в пекан, череша, ягода, лимон и портокал, помагат до се избегне умората от вкуса и оплакванията на пациентите.
Ванила и други нешоколадови овкусители
Захароза 51%
Малтодекстрин 49%
Шоколад
54/99 фБ
113
Захароза
Царевичен сироп
Малтодексшрин
47.0%
26.5%
26.5%
Витамини и минерали
Един 8-fl- oz прием на ENSURE LIGHT предоставя най малко 25% от RDIs за 24 ключови витамина и минерала.
Кофеин
Шоколадовият вкус се дължи на 2.1 mg кофеин/ 8 fl oz.
Е. ENSURE PLUS®
Приложение: ENSURE PLUS е високо калорична, с ниско съдържание на остатъци течна храна за използване в случаите, когато са необходими допълнително количество калории и хранителни вещества, но в нормална концентрация протеин. Създадена е по начало като орална хранителна добавка за използване заедно или между храненията, или в подходяще количества, като заместваща храна. ENSURE PLUS е свободна на лактоза и глутен. Макар това да е орална хранителна добавка, тя може да бъде използвана за хранене със сонда.
Състояния на пациента:
За пациенти, нуждаещи се от допълнително количество калории и хранителни вещества, но нормални концентрации протеин, в ограничен обем
За пациенти, които трябва да достигнат или да поддържат здравословно тегло
54/99 ФБ
114
Характеристики
Вкус на крем
Добър източник на есенциални витамини и минерали
Инградиенти:
Ванила: ®-D Вода, пшеничен сироп, малтокестрин (пшеница), пшенично масло, натриев и калциев казеинати, захар (захароза), соев протеинов изолат, магнезиев хлорид, калиев цитрат, калциев фосфат трибазичен, соев лецитин, природни и синтетични овкусители, натриев цитрат, калиев хлорид, холин хлорид, аскорбинова киселина, карагенан, цинков сулфат, феро сулфат, алфа- токоферил ацетат, ниацинамид, калциев пантотенат, манганов сулфат, купри сулфат, тиамин хлориден хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид, рибофлавин, витамин А палмитат, фолиева киселина, биотин, хромен хлорид, натриев молибдат, калиев йодид, натриев селенит, филоквинон, цианокобаламин и витамин D3.
Протеин
Протеиновият източник е смес от два протеина с висока биологична стойност: казеин и соя.
Натриев и калциев казеинати 84%
Соев протеинов изолат 16%
Мазнини
Източника на мазнини е пшенично масло
Пшенично масло 100%
Въглехидрати
ENSURE PLUS съдържа комбинация от малтодекстрин и захароза. Леко сладкият вкус и
54/99 фБ
115 разнообразието то вкусове (ванила, шоколад, ягода, кафе, пекан и яйце), плюс VARI- FLAVORS® Flavor Paes в пекан, череша, ягода, лимон и портокал, помагат да се избегне омръзването на вкуса и отстъпчивостта на циентите.
Вкус на ванила, ягода, маслен пекан и кафе
пшеничен сироп 39%
малтодекстрин 38%
захароза 23%
Шоколадов и яйчен вкус
Пшеничен сироп 36%
Малтодекстрин 34%
Захароза 30%
Витамини и минерали
Еднократно приемане на 8-fl-oz от ENSURE PLUS
предоставя най- малко 15% RDIs за 25 ключови витамини и минерали
Кофеин
Шоколадовият вкус се дължи на 3.1 mg кофеин/ 8 fl oz. Кафееният вкус се дължи на следи от кофеин.
F. ENSURE PLUS® HN
Използване: ENSURE PLUS HN е пълноценна високо калорична, c високо съдържание на азот течна храна, създадена за хора с остра нужда от много калории и протеин или ограничен обемен толеранс. Тя може да бъде използвана като орална добавка или общо хранително укрепване със сонда. ENSURE PLUS HN е свободен на глюкоза и глутен.
54/99 ФБ
116
Състояния на пациента:
За пациенти с повишени калорийни и протеинови нужди, като такива след операция или нараняване
За пациенти с лимитиран обемен толеранс и ранно засищане
Характеристики
За допълващо и общо подхранване
За орално хранен или хранене със сонда
1.5 CaVmL
Голямо количество азот
Калорийна стойност
Инградиенти
Ванила: °-D Вода, Малтодекстрин (пшеница), натриев и калциев казеинати, пшенично масло, захар (захароза), соев протеинов изолат, магнезиев хлорид, калиев цитрат, калциев фосфат трибазичен, соев лецитин, природни и изкуствени овкусители, натриев цитрат, холин хлорид, аскорбинова киселина, таурин, L- карнитин, цинков сулфат, феро сулфат, алфа- токоферил ацетат, ниацинамид, карагенан, калциев пантотенат, манганов сулфат, купри сулфат, тиамин хлорид хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид, рибофлавин, витамин А палмитат, фолиева киселина, биотин, хромен хлорид, натриев молибдат, калиев йодид, натриев селенит, филоквинон, цианокобаламин и витамин D3.
G. ENSURE® POWDER
54/99 ФБ
117
Приложение: ENSURE POWDER (възстановен с вода) е течна храна с ниско съдържание на остатъци, създадена първично като орална хранителна добавка за използване заедно с или между храненията. ENSURE POWDER е свободна на глутен и лактоза и е подходяща за използване в модифицирани диети, включително ниско холестеролни диети.
Състояния на пациента:
За пациенти на модифицирана диета
За възрастни пациенти с рисково хранене
За пациенти, възстановяващи се от заболяване/ операция
За пациенти, които се нуждаят от диета с ниско съдържание на остатъци
Характеристики:
Удобен, лесно смесваем
Ниско съдържимо на наситена мазнина
Съдържа 9 g тотални мазнини и < mg холестерол за един прием
Високо съдържимо на витомини и минерали
За ниско холестеролни диети
Свободен на лактоза, лесно усвоим
Инградиенти: ®-D Пшеничен сироп, малтодекстрин (пшеница), захар (захароза), пшенично масло, натриев и калциев казеинат, соев протеинов изолат, синтетичен овкусител, калиев цитрат, магнезиев хлорид, натриев цитрат, калциев фосфат трибазичен, калиев хлорид, соев лецитин, аскорбинова киселина,
54/99 ФБ
118 холин хлорид, цинков сулфат, феро сулфат, алфа- токоферил ацетат, ниацинамид, калциев пантотенат, манганов сулфат, тиамин хлорид хидрохлорид, купри сулфат, пиридоксин хидрохлорид, рибофлавин, витамин А палмитат, фолиева киселина, биотин, натриев молибдат, хромен хлорид, калиев йодид, натриев селенат, филоквинон, витамин D3 и цианокобаламин.
Протеин
Протеиновият източник е смес от два протеина с висока биологична стойност: казеин и соя.
Натриев и калциев казеинати 84%
Соев протеинов изолат 16%
Мазнини
Източник на мазнини е пшеничното масло.
Пшенично масло 100%
Въглехидрати
ENSURE POWDER съдържа комбинация от пшеничен сироп, малтодекстрин и захароза. Умерената сладост на ENSURE POWDER, плюс VARI- FLAVORS1 Flavor Paes в пекан, череша, ягода, лимон и портокал, дават възможност да се предотврати омръзването на вкуса.
Ванила:
Пшеничен сироп 35%
Малтодекстрин 35%
Захароза 30%
Н. ENSURE® PUDDING
Приложение: ENSURE PUDDING е хранителна добавка, предоставяща балансирано хранене във форма, различна от
54/99 фБ
119 течната за използване заедно с или между храненията.
Подходяща е за модифицирани диети (напр. мека, без примеси, или изцяло течна) или за хора със затруднено преглъщане.
ENSURE PUDDING е свободна на глутен.
Състояния на пациента:
За пациенти на модифицирана диета (напр. мека, без примеси или напълно течна)
За пациенти със затруднено преглъщане
Характеристики:
Кремообразен, добър вкус
Добър източник на есенциални витамини и минерали. Не се нуждае от хладилник
Свободен на глутен
Хранителен профил за 5 oz: Калории 250, Протеин
10.9%, Общи мазнини 34.9%, Въглехидрати 54.2%
Инградиенти:
Ванила: ®-D обезмаслено мляко, вода, захар (захароза), частично хидрогенирано соево масло, модифицирано хранително нишесте, магнезиев сулфат, натриев сеароил лактилат, натриев фосфат дибазичен, синтетичен овкусител, аскорбинова киселина, цинков сулфат, феро сулфат, алфа- токоферил ацетат, холи хлорид, ниацинамид, манганов сулфат, калциев пантотенат, FD&C Yellow # 5, Калиев цитрат, купри сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид, рибофлавин, FD&C Yellow # 6, фолиева киселина, биотин, филоквинон, витамин D3 и цианкобаламин.
54/99 фБ
120
Протеин
Протеиновият източник е обезмаслено мляко
Обезмаслено мляко 100%
Мазнини
Източник на мазнини е хидрогенирано соево масло.
Хидрогенирано соево масло 100%
Въглехидрати
ENSURE PUDDING съдържа комбинация от захароза и модифицирано хранително нишесте. Умерената сладост и разнообразие във вкуса (ванила, шоколад и тапиока) помагат да се избегне омръзването на вкуса. Продукта съдържа 9.2 грама лактоза за грам за един прием.
Ванила и други нешоколадови овкусители
Захароза 56%
Лактоза 27%
Модифицирано хранително нишесте 17%
Шоколад
Захароза 58%
Лактоза 26%
Модифицирано хранително нишесте
16%
I. ENSURE® WITH FIBER
Приложение: ENSURE WITH FIBER е фиброзна, пълноценна течна храна, създадена за хора, за които е благоприятно приемането на диетични влакна и хранителни
54/99 ФБ
121 вещества. ENSURE WITH FIBER е подходяща за хора, които не изискват диета с нисък остатък. Тя може да бъде приемана орално или със сонда, и може да бъде използвана като хранителна добавка за регулиране на диетата, или в подходящи количества, като заместител на храната. ENSURE WITH FIBER е свободна на лактоза и глутен, и е подходяща за използване в модифицирани диети, включително ниско холестеролни диети.
Състояния на пациентите
За пациенти, за които е благоприятно повишено съдържание на диетични влакна и хранителни вещества.
Характеристики
Нова формула с ниско съдържание на наситени мазнини, високо съдържание на витамини и минерали
Съдържа 6 g тотални мазнини и < 5 mg холестерол за един прием
Вкус на крем
Добър източник на влакнини
Отличен източник на есенциални витамини и минерали За ниско холестеролни диети
Свободни на лактоза и глутен
Инградиенти:
Ванила: ®-D вода, малтодекстрин (пшеница), захар (захароза), натрий и калциев казеинат, влакнини от дъб, високоолеиново сафлорово масло, канола масло, соев протеинов изолат, пшенично масло, соеви влакна, калциев фосфат трибазичен, магнезиев хлорид, калиев цитрат, целулозен гел, соев лецитин,
54/99 ФБ
122 калиев фосфат дибазичен, натриев цитрат, естествени и синтетични овкусители, холин хлорид, магнезиев фосфат, аскорбинова киселина, целулозна смола, калиев хлорид, карагенан, феро сулфат, алфа- токоферил ацетат, цинков сулфат, ниацинамид, манганов сулфат, калциев пантотенат, купри сулфат, витамин А палмитат, тиамин хлорид хидрохлорид, пиридоксин хидрохлорид, рибофлавин, фолиева киселина, хромен хлорид, биотин, натриев молибдат, калиев йодид, натриев селенат, филоквинон, витамин D3 и цианокобаламин.
Протеин
Протеиновият източник е смес от два протеина с висока биологична стойност - казеин и соя.
Натриев и калциев казеинати 80%
Соев протеинов изолат 20%
Мазнини
Източника на мазнини е смес от три масла: високо олеинов!' сафлорово, канолово и пшенично.
Високо олеиново сафлорово масло 40%
Канолово масло 40%
Пшенично масло 20%
Нивото на мазнините в ENSURE WITH FIBER отговаря на изискванията на American Heart Association (АНА). Шестте грама мазнините са от наситени мастни киселини и 6.7% от полиненаситени мастни киселини. Тези стойности са в рамките на ръководството на АНА за 30% общи калории от мазнините, < 10% от калориите от наситените мастни киселини, и 10% от общите калории от полиненаситени мастни киселини.
54/99 ФБ
123
Въглехидрати
ENSURE WITH FIBER съдържа комбинация от малтодекстрин и захароза. Умерената сладост и разнообразие на Вкуса (ванила, шоколад и мален пекан) плюс VARI-FLAVORST Flavor Paes В пекану череша, ягода, лимон и портокал, дават Възможност да се преодолее омръзналия Вкус.
Ванила и други нешоколадови вкусове
Малтодекстрин 66%
Захароза 25%
Влакнини от дъб 7%
СоеВи Влакна 2%
Шоколад
Малтодекстрин 55%
Захароза 36%
Влакнини от дъб 7%
СоеВи Влакна 2%
Влакна
Влакнестата смес, използвана В ENSURE WITH FIBER се
състои от дъбоВи Влакна и соеВ полизахарид. Тази смес Води до приблизително 4 грама от общите диетични Влакна за 8-fl-oz. Съотношението на неразтворими спрямо разтворими Влакна е 95:5.
Различните хранителни добавки, описани по- горе и известни на специалистите В областта, могат да бъдат заместени и/или допълнени с PUFAs от настоящето изобретение.
54/99 фБ
124
J. Хранителен продукт Охерад
Охера е ниско- въглехидратен хранителен продукт за вътрешен прием, създаден за диетичното хранене на пациенти с или в риск за СПИН. Той притежава уникална комбинация от инградиенти, включващи патентована маслена смес, съдържаща ейкосапентаеноена киселина (ЕРА от рибено масло), gлиноленова киселина (GLA от масло на бораго) и повишени нива на антиоксиданти.
Разпределение на калориите:
Калорийната плътност е висока при 1.5 Cal/mL (355 Cal/8 fl oz), за минимизиране на обема, необходим да посрещне енергийните нужди.
Разпределението на калориите в Охера е показано на Таблица 7.
Таблица 7
За 8 fl oz За литър % от cal
Калории 355 1500 —
Мазнини (g) 22.2 93.7 55.2
Въглехидрати (g) 25 105.5 28. 1
Протеин (g) 14.8 62.5 16.7
Вода (g) 186 785 —
Мазнини:
Охера съдържа 22.2 g мазнини за 8-fl-oz прием (93. 7 g/L).
Източника на мазнини е маслена смес от 31.8% канолово масло, 25% средно- верижни триглицериди (MCTs), 20% масло от
54/99 фБ
125
бораго, 20% рибено масло и 3.2% соев лецитин. Типичният мастно- киселинен профил на Охера е показан на Таблица 8.
Охера предоставя балансирано количество полиненаситени, мононенаситени и наситени мастни киселини, както е показано на Таблица 10.
Средно- верижни триглицериди (MCTs) -25% от маслената смес - подпомагат изпразването на стомаха, тъй като те се абсорбират от интестиналния тракт без емулгиране от жлъчните киселини.
Различните мастно киселинни компоненти на хранителния продукт Охера д може да бъдат заместени и/или допълнени с PUFAs от настоящето изобретение.
Таблица 8. Типичен мастнокиселинен профил
% Общи мастни киселини g/8 fl oz* g/L*
КапроиноВа (6:0) 0.2 0.04 0. 18
Каприлова (8:0) 14.69 3. 1 13.07
КаприноВа (10:0) 11. 06 2.33 9. 87
Палмитинова (16: θ) 5. 59 1. 18 1. 98
Палмитолеинова (16:п- 7) 1.82 0. 38 1.62
Стеаринова (18:0) 1. 84 0. 39 1. 64
Олеинова (18:1п-9) 24.44 5. 16 21.75
Аиноленова(18:2п- 6) 16. 28 3.44 14. 49
а-Линоленоба (18:3п- 3) 3.47 0.73 3.09
g-АиноленоВа (18:3п-6) 4.82 1.02 4. 29
54/99 фБ
126
Ейкосапентаеноен а киселина (20:5п3) 5. 11 1.08 4. 55
п-3докосапешпаеноена (22: 5п-3) 0.55 0.12 0. 49
Докосахексаеноена (22:6п-3) 2.27 0.48 2.02
Други 7. 55 1. 52 6.72
Мастни киселини, равни приблизително на 95% от общите мазнини
Таблица 9. Мастен профил на Охера
% от общите калории от мазнините 55.2
Полиненаситени мастни киселини 31. 44g/L
Мононенаситени мастни киселини 25. 53 g/ L
Наситени мастни киселини 32. 38g/L
п-6 до п-3 съотношение 1.75:1
Холестерол 9. 49 mg/ 8 fl oz 40. 1 mg/ L
Въглехидрати:
Въглехидратното съдържимо е 25.0 g за 8- fl/ oz на прием (105. 5g/L)
Източниците на въглехидрати са 45% малтодекстрин (въглехидратен комплекс ) и 55% захароза (обикновена захар), които лесно се усвояват и абсорбират.
54/99 ФБ
127
Високо масленото и ниско- Въглехидратно съдържимо на Охера е създадено да минимизира продуцирането на въглероден двуокис (СО2). Високите нива на СО2 могат да усложнят отделянето му в зависими пациенти. Ниското ниво на въглехидратите могат да бъдат полезни също за онези пациенти, които са разбили стрес- индуцирана хиперглицемия.
Охера е свободна на лактоза
Диетичният въглехидрат, амино киселините от протеин и глицеролното съдържимо на мастите може да бъде превърнато в глюкоза в тялото. Посредством този процес се посреща необходимостта от въглехидрати на глюкозо- зависими тъкани (като централната нервна система и червените кръвни клетки). Обаче, диета свободна на въглехидрати може да доведе до кетолиза, свръхкатализа на тъканния протеин и загуба на течност и електролити. Тези ефекти могат да бъдат предотвратени чрез ежедневно инжектиране на 50 до 100 g усвоими въглехидрати при адекватен прием на калории. Въглехидратното ниво в Охера е също достатъчно да минимизира глюконеогенезата, ако са посрещнати енергийните нужди.
Протеин:
Охера съдържа 14. 8 g протеин за 8- fl- oz прием (62. 5 g/L).
Съотношението калории/ азот (150:1) отговаря на нуждите на стресираните пациенти.
Охера осигурява достатъчно протеин за анаболизма и поддържане на постна телесна маса без респираторни проблеми. Високите стойности на приемания протеин се
54/99 ФБ
128 отнасят go пациенти с респираторна недостатъчност. Макар протеина да има слабо влияние върху продукцията на СО2, високо протеинова диета ще повиши вентилацията.
Източници на протеин за Охера са 86.8% натриев казеинат и
13. 2% калциев казеинат.
Всички публикации патентни описания в настоящата заявка са показтелни за нивото на познания на специалиста в областта, за когото е предназначено изобретението. Всички ф публикации и патентни описания са включени в литературната справка в същия обхват, както ако всяка отделна публикация или патентно описание е била специфично и индивидуално посочено като включено в справката.
Очевидно за специалиста в областта е, че настоящето изобретение, така както понастоящем е напълно описано, може да претърпи много изменения и модификации, без да се отдалечава от духа и обхвата на приложените претенции.
ahMaia
СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ
129 (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ: KNUTZON, DEBORAH
MURKERJI, PRADIP
HUANG, YUNG-SHENG
THURMOND, JENNIFER
CHAUDHARY, SUNLTA
LEONARD, AMANDA (ц)ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: МЕТОДИ И СЪСТАВИ ЗА СИНТЕЗ НА ДЪЛГОВЕРИЖНИ ПОЛИНЕНАСИТЕНИ МАСТНИ КИСЕЛИНИ (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 34 (iv> АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:
(A) АДРЕСАТ: LIMBACH & LIMBACH LLP (B) УЛИЦА; 2001 FERRY BUILDING (C) ГРАД: SAN FRANCISCO (D) UJAT: CALIFORNIA (E) ДЪРЖАВА: USA (F) ZIP: 94111 (v) КОМПЮТЪРНО ЧИТАЕМА ФОРМА:
(A) МЕДИУМ ТИП: Hoppy disk (B) КОМПЮТЪР: IBM PC compatible (C) ОПЕРАЦИОННА: PC-DOS/MS-DOS _ (D) СОфТУЕР: Patentin Release #1.0, Version#130 (vi) ДАННИ ЗА ЗАЯВКАТА;
(A) ЗАЯВИТЕЛСКИ НОМЕР:
(B) ДАТА НАПОДАВАНЕ:
(C) КЛАСИФИКАЦИЯ:
(vm> ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРЕДСТАВИТЕЛЯ/ ΑΓΕΗΊΆ:
(А) ИМЕ: MICHAEL R. WARD (В> РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 3»,651 (С) РЕфЕРЕНТЕН НОМЕР; CGAB-110 (1х)ИНфОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ:
(A) ТЕЛЕфОН: (415) 433-4-150 (B) ФАКС: (415) 433-8716 (C) ТЕЛЕКС; N/A (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:1;
(1)СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:
(A) ДЪЛЖИНА: 1483 двойки бази (B) ТИП: нуклеиноВа-киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна
ПО
130 (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1:
GCTTCCTCCA GTTGATCCTC CATTTCGCCA CCTGGATTCT TTACGACCGT TAAGCAAGAT 60
GGGAACGGAG CAAGGAAAAACCTTCACCTG GGAAGAGCTG GCGGCCCATA ACACCAAGGA 120
CGACCTAGTC TTGGCCATCC GCGGCAGGGT GTACGATGTC ACAAAGTTCT TGAGCCGCCA 180
TCCTGGTGGA GTGGACACTGTCCTGCTCGG AGGTGGGGGA GATGTTACTC CGGTCTTTGA 240
GATGTATCAC GCGTTTGGGG CTGCAGATGC CATTATGAAG AAGTACTATGTCGGTACACT 300
GGTGTGGAAT GAGGTGGGGA TGTTCCGGGA GGCAACGGTG ТТССАСАААА CCATCAAGAC 360
GAGAGTCGAG GGCTACTTTA CGGATCGGAA CATTGATCCC AAGAATAGAC CAGAGATCTG 420
GGGAGGATAC GCTCTTATCT TTGGATCCTTGATCGCTTCC TACTACGCGC AGCTCTTTGT 480
GCCTTTCGTT GTCGAACGCA CATGGCTTCA GGTGGTGTTT GCAATCATCA TGGGATTTGC 540
GTGGGGAGAA GTCGGACTGA ACCCTCTTCA-TGATGGGTCT CACTTTTCAG TGACCCACAA 600
CCCCACTGTC TGGAAGATTC TGGGAGCCAC GCACGACTTT TTCAACGGAG CATCGTACCT 660
GGTGTGGATGТАССААСАТА TGCTGGGCGA TCACGCCTAC ACCAACATTG CTGGAGCAGA 720
TCGCGACGTG TCGACGTCTG AGCCCGATGT TCGTCGTATC AAGCCCAACC AAAAGTGGTT 780
TGTCAACCAG ATCAACCAGC ACATGTTTGT TCCTTTCCTG TACGGACTGC TGGCGTTCAA 840
GGTGCGCATT CAGGACATCA ACAITTTGTACTTTGTCAAG ACCAATGACG CTATTCGTGT 900
14А
CAATCCCATC TCGACATGGC ACACTGTGAT GTTCTGGGGC
GGCAAGGCTT TCTTTGTCTG 960
GTATCGCCTG ATTGTTCCCC TGCAGTATCT GCCCCTGGGC
AAGGTGCTGC TCTTGTTGAC 1020
GGTCGCGGAC ATGGTGTCGT CTTACTGGCT GGCGCTGACC
TTCCAGGCGA ACCACGTTGT 108Q
TGAGGAAGTT CAGTGGCCGT TGCCTGACGA GAACGGGATC
ATCCAAAAGGACTGGGCAGC 1140
TATGCAGGTC GAGACTACGC AGGATTACGC ACACGATTCG
CACCTCTGGACCAGCATCAC 120Q
TGGCAGCTTG AACTACCAGG CTGTGCACCA TCTGITCCCC
AAGGTGTCGC AGCACCATTA 1260
TCCCGATATT CTGGCCATCA TCAAGAACAC CTGCAGCGAG
TACAAGGTTC CATACCTTGT 1320
CAAGGATACG TTTTGGCAAG CATTTGCTTC ACATITGGAG
CACTTGCGTGTTCTTGGACT 1380
CCGTCCCAAG GAAGAGTAGA AGAAAAAAAG CGCCGAATGA
AGTATTGGCC CCTTTTTCTC 1440
CAAGAATGGC AAAAGGAGAT CAAGTGGACA TTCTCTATGA AGA 1483 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3ASEQ ID NO;2:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 446 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ 1D N0:2:
Met Gly Thr Asp Gin Gly Lys Thr Phe Thr Trp Glu Glu Leu Ala Ala
5 1015
His Asn Thr Lys Asp Asp Leu Leu Leu Ala lie Arg Gly Arg Vai Tyr 20 2530
Asp Vai Thr Lys Phe Leu Ser Arg His Pro Gly Gly Vai Asp Thr Leu 55 4045
131
Suwniftrttfri
132
Leu Leu Gly Ala Gly Arg Asp Vai Thr Pro Vai Phe Glu Met Tyr His 50 5560
Ala Phe Gly Ala Ala Asp Ala lie Met Lys Lys Tyr Tyr Vai Gly Thr 65 70 7580
Leu Vai Ser Asn Glu Leu Pro lie Phe Pro Glu Pro Thr Vai Phe His 85 9095
Lys Thr lie Lys Thr Arg Vai Glu Gly Tyr Phe Thr Asp Arg Asn lie 100 105110
Asp Pro Lys Asn Arg Pro Glu lie Trp Gly Arg Tyr Ala Leu lie Phe 115 120125
Gly Ser Leu lie Ala Ser Tyr Tyr Ala Gin Leu Phe Vai Pro Phe Vai 130 135140
Vai Glu Arg Thr Trp Leu Gin Vai Vai Phe Ala He lie Met Gly Phe
145 150 155160
Ala Cys Ala Gin Vai Gly Leu Asn Pro Leu His Asp Ala Ser His Phe 165 170175
Ser Vai Thr His Asn Pro Thr Vai Trp Lys He Leu Gly Ala Thr His 180 185190
Asp Phe Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Vai Trp Met Tyr Gin His Met 195 200205
Leu Gly His His Pro Tyr Thr Asn He Ala Gly Ala Asp Pro Asp Vai 210 215220
Ser Thr Ser Glu Pro Asp Vai Arg Arg lie Lys Pro Asn Gin Lys Trp 225 230 235-240
Phe Vai Asn His He Asn Gin His Met Phe Vai Pro Phe Leu Tyr Gly 245 250255
Leu Leu Ala Phe Lys Vai Arg lie Gin Asp He Asn He Leu Tyr Phe 260 265270
Vai Lys Thr Asn Asp Ala He Arg Vai Asn Pro He Ser Thr Trp His 275 280285
Thr Vai Met Phe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Vai Trp Tyr Arg Leu 290 295300 lie Vai Pro Leu Gin Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Vai Leu Leu Leu Phe 305 310 315320.
Thr Vai Ala Asp Met Vai Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gin
133
325 330335
Ala Asn His Vai Vai Glu Glu VaLGIn Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn 340 345350
Gly lie Be Gin Lys Asp Trp Ala Ala Met Gin Vai GluThr Thr Gin 355 360365
Asp Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser He Thr Gly Ser Leu 370 375380
Asa Tyr Gin Ala Vai His His Leu Phe Pro Asn Vai Ser Gia His His
385 390 395400
Tyr Pro Asp Be Leu Ala He lie Lys Asn Thr Cys Ser Glu TyrLys
405 410415
Vai Pro Tyr Leu Vai Ly& Asp Thr Phe Trp Gin Ala Phe Ala Ser His 420 425430
Leu Glu His Leu Arg Vai Leu Gly Leu Arg Pro Lys Glu Glu
435 440445 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3ASEQIDNO:3:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 186 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелеваншна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NQ:3:
Leu His His Thr Tyr Thr Asn lie Ala Gly Ala Asp Pro Asp Vai Ser
5 1015
Thr Ser Glu Pro Asp Vai Arg Arg lie Lys Pro Asn Gin Lys Trp Phe
253H
Vai Asn His lie Asn Gin His Met Phe Vai Pro Phe Leu Tyr Gly Leu 35 4045
Leu Ala Phe Lys Vai Arg lie Gin Asp lie Asn lie Leu Tyr Phe Vai 50 5560
Lys Thr Asn Asp Ala lie Arg Vai Asn Pro lie Ser Thr Trp His Thr
70 7580
Vai Met Phe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Vai Trp. Tyr Arg Leu lie
-EV*
134
9095
Val Pro Leu Gin Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe Thr 100 105110
Val Ala. Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gln.Ala 115 120125
Asn Tyr Val Vat Glu Glu Val Gin Trp Pro Leu Pro Asp GluAsn Gly 130 135140 lie lie Gin Lys Asp Trp Ala Ala Met Gin Val Glu Thr Thr Gln Asp 145 150 155160
Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser He Thr Gly Ser Leu Asn
165 170175
Tyr Gin Xaa Val His His Leu Phe Pro His
180185 (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO;4:
(i> ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 457 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (») ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4:
Met Ala Ala Ala Pro Ser Val Arg Thr Phe Thr Arg Ala Glu Val Leu Q 1 5 1015
Asn Ala Glu Ala Leu Asn Glu Gly Lys Lys Asp Ala Glu Ala Pro Phe 20 2530.
Leu Met He He Asp Asn Lys Val Tyr Asp Val Arg Glu Phe Val Pro 35 4045
Asp His Pro Gly Gly Ser Val He Leu Thr His Val Gly Lys Asp Gly 50 5560
Thr Asp Val Phe Asp Thr Phe His Pro Glu Ala Ala Trp Glu Thr Leu
70 7580
Ala Asn Phe Tyr Val Gly Asp lie Asp Glu Ser Asp Arg Asp He Lys
9Q95
Asn Asp Asp Phe Ala Ala Glu Val Arg Lys Leu Arg Thr Leu Phe Gin t3zt
135
100 105110
Ser Leu Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser LysAla Tyr Tyr Ala Phe Lys Vai 115 120125
Ser Phe Asn Leu Cys- lie Trp Gly Leu Ser Thr Vai lie Vai Ala Lys
130 135140
Trp Gly Gin Thr Ser Thr Leu Ala Asn Val Leu Ser Ala Ala Leu Leu
145 150 155160
Gly Leu Phe Trp Gin Gin Cys Gly Trp Leu Ala HisAsp Phe LeuHis 165 170175
His Gin Vai Phe Gin Asp Arg Phe Trp Gly Asp Leu Phe Gly Ala Phe 180 185190
Leu Gly Gly Vai Cys Gin Gly Phe Ser Ser Ser Trp Trp Lys Asp Lys 195 200205
His Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Vai His Vai Glu Asp Pro Asp 210 215220 lie Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met 225 230 235240
Phe Ser Asp Vai Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg-Phe 245 250255
Met Vai Leu Asn Gin Thr Trp Phe Tyr Phe Pro lie Leu Ser Phe Ala 260 265270
Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gin Ser lie Leu Phe Vai Leu Pro Asn Gly 275 280285
Gin Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Vai Pro lie Ser Leu Vai Glu 290 295300
Gin Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe 305 310 315320
Leu Phe lie Lys Asp Pro Vai Asn Met Leu Vai Tyr Phe Leu Vai Ser 325 330335
Gin Ala Vai Cys Gly Asn Leu Leu Ala He Vai Phe Ser Leu Asn His 340 345350
Asn Gly Met Pro Vai He Ser Lys- Glu Glu Ala Vai Asp Met Asp Phe 355 360365
Phe Thr Lys Gin lie lie Thr Gly Arg Asp Vai His Pro Gly Leu Phe
370 375 380
136
Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gin lie Glu His His Leu
385 390 395400
Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys lie Gin Pro Ala Val 405 410415
Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Asn Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met 420 425430
He Glu Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys 435 440445
Ala Ala Ser Lys Met Gly Lys Ala Gin
450455 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ГО N0:5:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 446 амино киселини (B) ТИП: amino acid (C) ВЕРИЖОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO;5:
Met Ala Ala Gin lie Lys Lys Tyr He Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn
5 1015
His Asp Lys Pro Gly Asp Leu Trp lie Ser lie Gin Gly Lys Ala Tyr
Asp Val Ser Asp Trp Val Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu 35 4045
Lys Ser Leu Ala Gly Gin Glu Val Thr Asp Ala Phe Val Ala Phe His 50 5560
Pro Ala Ser Thr Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr 65 70 7580
Leu Lys Asp Tyr Ser Val Ser Glu Val Ser Lys Val Tyr Arg Lys Leu 85 9095
Val Phe Glu Phe Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His lie 100 105110
Met Phe Ala Thr Leu Cys Phe He Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val
137
115 120125
Tyr Gly Vai Leu Phe Cys Glu Gly Vai Leu Vai His Leu Phe Ser Gly 130 135140
Cys Leu Met Gly Phe Leu Trp He Gin Ser Gly Trp lie Gly His Asp 145 150 155160
Ala Gly His Tyr Met Vai Vai Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys Phe Met 165 170175
Gly He Phe Ala Ala Asn Cys Leu Ser Gly lie Ser lie Gly Trp Trp
180 185190
Lys Trp Asn His Asn Ala His His lie Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr 195 200205
Asp Pro Asp Leu Gin Tyr He Pro Phe Leu Vai Vai Ser Ser Lys Phe 210 215220
Phe Gly Ser Leu Thr Ser His Phe Tyr Glu Lys Arg Leu Thr Phe Asp 225 230 235240
Ser Leu Ser Arg Phe Phe Vai Ser Tyr Gin His Trp Thr Phe Tyr Pro 245 250255 lie Met Cys Ala Ala Arg Leu Asn Met Tyr Vai Gin Ser Leu He Met 260 265270
Leu Leu Thr Lys Arg Asn Vai Ser Tyr Arg Ala Gin Glu Leu Leu Gly 275 280285
Cys Leu Vai Phe Ser He Trp Tyr Pro Leu Leu Vai Ser Cys Leu Pro 290 295300
Asn Trp Gly Glu Arg He Met Phe Vai lie Ala Ser Leu Ser Vai Thr 305 310 315320
Gly Met Gin Gin Vai Gin Phe Ser Leu Asn His Phe Ser Ser Ser Vai 325 330335
Tyr Vai Gly Lys Pro Lys Gly Asn Asn Trp Phe Glu Lys Gin Thr Asp 340 345350
Gly Thr Leu Asp He Ser Cys Pro Pro Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 360365
Gly Leu Gin Phe Gin He Glu His His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg 370 375380
Cys Asn Leu Arg Lys lie Ser Pro Tyr Vai He Glu Leu Cys Lys Lys
385 390 395400
137
138
His Asn Leu Pro Tyr Asn Tyr Ala Ser Phe Ser Lys Ala Asn Glu Met
405 410415
Thr Leu Arg Thr Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gin Ala Arg Asp lie Thr 420 425430
Lys Pro Leu Pro Lys Asn Leu Val Trp Glu Ala Leu His Thr
435 440445 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID N0:6:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 359 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (й)МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6:
Met Leu Thr Ala Glu Arg He Lys Phe Thr Gin Lys Arg Gly Phe Arg
5 1015
Arg Val Leu Asn Gin Arg Val Asp Ala Tyr Phe Ala Glu His Gly Leu 20 2530
Thr Gin Arg Asp Asn Pro Ser Met Tyr Leu Lys Thr Leu lie He Val 35 4045
Leu Trp Leu Phe Ser Ala Trp Ala Phe Val Leu Phe Ala Pro Val He 50 5560
Phe Pro Val Arg Leu Leu Gly Cys Met Val Leu Ala lie Ala Leu Ala 65 70 7580
Ala Phe Ser Phe Asn Val Gly His Asp Ala Asn His Asn Ala Tyr Ser 85 9095
Ser Asn Pro His lie Asn Arg Val Leu Gly Met Thr Tyr Asp Phe Val 100 105110
Gly Leu Ser Ser Phe Leu Trp Arg Tyr Arg His Asn Tyr Leu His His 115 120125
Thr Tyr Thr Asn lie Leu Gly His Asp Val Glu He His Gly Asp Gly 130 135140
Ala Val Arg Met Ser Pro Glu Gin Glu His Val Gly He Tyr Arg Phe 145 150 155160
1.3«
139
Gin Gin Phe Tyr lie Trp Gly Leu Tyr Leu Phe lie Pro Phe Tyr Trp 165 170175
Phe Leu Tyr Asp Vai Tyr Leu Vai Leu Asn Lys Gly Lys Tyr His Asp 180 185190
His Lys He Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly 195 200205
He Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Vai Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu 210 215220
Gly Phe Ser lie Pro Glu Vai Leu lie Gly Ala Ser Vai Thr Tyr Met
225 230 235240
Thr Tyr Gly Пе Vai Vai Cys Thr He Phe Met Leu Ala His Vai Leu 245 250255
Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly Glu Ser Gly Ala He Asp 260 265270
Asp Glu Trp Ala lie Cys Gin He Arg Thr Thr Ala Asn Phe Ala Thr 275 280285
Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe Cys Gly Gly Leu Asn His Gin Vai 290 295300
Thr His His Leu Phe Pro Asn lie Cys His lie His Tyr Pro Gin Leu
305 310 315320
Glu Asn He lie Lys Asp Vai Cys Gin Glu Phe Gly Vai Glu Tyr Lys 325 330335
Vai Tyr Pro Thr Phe Lys Ala Ala lie Ala Ser Asn Tyr Arg Trp Leu 340 345350
Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser
355 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID N0:7:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 365 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелеВантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (Й)МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7:
17Q
140
Met Thr Ser Thr Thr Ser Lys Val Thr Phe Gly Lys Ser lie Gly Phe
5 1015
Arg Lys Glu Leu Asn Arg Arg Val Asn Ala Tyr Leu Glu Ala Glu Asn 20 2530 lie Ser Pro Arg Asp Asn Pro Pro Met Tyr Leu Lys Thr Ala lie lie
4045
Leu Ala Trp Val Val Ser Ala Trp Thr Phe Val Val Phe Gly Pro Asp 50 5560
Val Leu Trp Met Lys Leu Leu Gly Cys He Val Leu Gly Phe Gly Val 65 70 7580
Ser Ala Val Gly Phe Asn He Ser His Asp Gly Asn His Gly Gly Tyr 85 9095
Ser Lys Tyr Gin Trp Val Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Thr His Asp Ala 100 105110 lie Gly Val Ser Ser Tyr Leu Trp Lys Phe Arg His Asn Val Leu His 115 120125
His Thr Tyr Thr Asn lie Leu Gly His Asp Val Glu lie His Gly Asp 130 135140
Glu Leu Val Arg Met Ser Pro Ser Met Glu Tyr Arg Trp Tyr His Arg 145 150 155160
Tyr Gin His Trp Phe lie Trp Phe Val Tyr Pro Phe lie Pro Tyr Tyr 165 170175
Trp Ser He Ala Asp Val Gin Thr Met Leu Phe Lys Arg Gin Tyr His 180 185190
Asp His Glu lie Pro Ser Pro Thr Trp Val Asp He Ala Thr Leu Leu 195 200205
Ala Phe Lys Ala Phe Gly Val Ala Val Phe Leu lie lie Pro He Ala 210 215220
Val Gly Tyr Ser Pro Leu Glu Ala Val lie Gly Ala Ser He Val Tyr
225 230 235'240
Met Thr His Gly Leu Val Ala Cys Val Val Phe Met Leu Ala His Val 245 250255
He Glu Pro Ala Glu Phe Leu Asp Pro Asp Asn Leu His He Asp Asp 260 265270
1ДЛ
141
Glu Trp Ala lie Ala Gin Vai Lys Thr Thr Vai Asp Phe Ala Pro Asn
275 280 285
Asn Thr lie lie Asn Trp Tyr Vai Gly Gly Leu Asn Tyr Gin Thr Vai 290 295300
His His Leu Phe Pro His lie Cys His lie His Tyr Pro Lys lie Ala
305 310 315320
Pro He Leu Ala Glu Vai Cys Glu Glu Phe Gly Vai Asn Tyr Ala Vai 325 330335
His Gin Thr Phe Phe Gly Ala Leu Ala Ala Asn Tyr Ser Trp Leu Lys 340 345350
Lys Met Ser He Asn Pro Glu Thr Lys Ala lie Glu Gin
355 360365 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID N0:8:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 32 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (A) ОПИСАНИЕ: /desc = синтетичен олиаонуклеотид (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:
(ЛуИМЕ/ КЛЮЧ: misc_feature (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 21 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : /номер- 1 /забележка = N= инозин или цитозин (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:
(A) ИМЕ/ КЛЮЧ: misc_feature (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 27 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : /номер= 2 /забележка = N= инозин или цитозин (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:8: CUACUACUAC UACAYCAYAC NTAYACNAAY АТ 32 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 9:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(А) ДЪЛЖИНА: 27 двойки бази
Т4Т
142 (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеиноВи киселини (А) ОПИСАНИЕ: /desc = синтетичен олигонуклеотид (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:
(A) ИМЕ/ КЛЮЧ: misc feature (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 13 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : /номер= 1 /забележка= N= инозин или цитозин (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:
(A) ИМЕ/ КЛЮЧ: misc_feature (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 19 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : /номер= 2 /забележка= N= инозин или цитозин (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:9: CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 27 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID ΝΟΠΟ:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 32 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:10: CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC ТТТТТПТТТ ТТПТ 35 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:11:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 5 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ IDNOdl:
His Хаа Хаа His His
147
143
5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 12:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 5 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарца (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (хД ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:12:
Gin Хаа Хаа His His
5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 13:
(i> ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 746 нуклеинови киселини (B) (В) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: нуклеинова киселина (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13:
CGTATGTCAC ТССАТТССАА ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACACATTTACGCTC 60
САСТССТСТА TGGTATTTAC АСАСТСАААТ ATCGTACTCA
AGATTGGGAA GCTTTTGTAA 120
AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC
AAATTTCGAT AAGGCCGCTT 180
ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT
ССТТССАСТС CGTTATCATA 240
GCTTTACAGA TTTAATTTGT ТАТТТССТСА TTGCTG А АТТ
CGTCTTTGGT TGGTATCTCA 300
СААТТААТТТ CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA
ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA 360
GACCAGATGA АССАТСТСАА ATCAATGAAG ATTGGGCAAT
ССТТСААСТТ ААААСТАСТС 420
AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG
TGGTTCTTTA AATCATCAAG 480
TTGTTCATCA ТТТАТТСССА TCA ATTGCTC AAGATTTCTA
СССАСААСТТ GTACCAATTG 540
TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA САТААСАТТА СТТАССАСАТ ТАААССАААС TTCACTGAAG 600
1/П
144
CTATTATGTC ACACATTAAT ТАССПТАСА AAATGGGTAA
TGATCCAGAT TATGTTAAAA 660
AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA
AAACCAATTA TTTACTTTTG 720
ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 746 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 14:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 227 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелеваншна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:14
Tyr Vai Thr Pro Phe Gin Thr Arg Ser Trp Tyr His Lys Tyr Gin
5 1015
His lie Tyr Ala Pro Leu Leu Tyr Gly lie Tyr Thr Leu Lys Tyr
2530
Arg Thr Gin Asp Trp Glu Ala Phe Vai Lys Asp Gly Lys Asn Gly
4045
Ala lie Arg Vai Ser Vai Ala Thr Asn Phe Asp Lys Ala Ala Tyr
5560
Vai He Gly Lys Leu Ser Phe Vai Phe Phe Arg Phe lie Leu Pro
7075
Leu Arg Tyr His Ser Phe Thr Asp Leu lie Cys Tyr Phe Leu He
8590
Ala Glu Phe Vai Phe Gly Trp Tyr Leu Thr He Asn Phe Gin Vai
100105 ft Ser His Vai Ala Glu Asp Leu Lys Phe Phe Ala Thr Pro Glu Arg
110 115120
Pro Asp Glu Pro Ser Gin lie Asn Glu Asp Trp Ala lie Leu Gin
125 130135
Leu Lys Thr Thr Gin Asp Tyr Gly His Gly Ser Leu Leu Cys Thr
140 145150
Phe Phe Ser Gly Ser Leu Asn His Gin Vai Vai His His Leu Phe
155 160165
Pro Ser lie Ala Gin Asp Phe Tyr Pro Gin Leu Vai Pro lie Vai
170 175180
Lys Glu Vai Cys Lys Glu His Asn He Thr Tyr His lie Lys Pro
185 190195
Asn Phe Thr Glu Ala lie Met Ser His lie Asn Tyr Leu Tyr Lys
200 205210
Met Gly Asn Asp Pro Asp Tyr Vai Lys Lys Pro Leu Ala Ser Lys
215 220225
Asp Asp Xaa гдл
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 15:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(C) ДЪЛЖИНА: 494 нуклеинови киселини (D) (В) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: нуклеинова киселина
(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:
TTTTGGAAGG NTCCA AGTTN ACCACGGANT NGGCAAGTTN ACGGGGCGGAAANCGGTTTT 60
CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC
AGTACCAAGT CGACCACCAC 120
ТТАТТССССА GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC
ACGCACTGGT CGAATCGTTC 180
TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG
TGGAGGGGAC CATGGAAGTC 240
TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG
ATTTTGTACG CGACGGACCC 300
GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC
АСАТСТАСАС АСАСТСАСТС 360
ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT
GGACCTTGTTTGACTGGTTG 42Q
GGGATAGGGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CGNCCCCGGG
AATTCTGTGA CCGGTACCTG 480
GCCCGCGTNA AAGT 494 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 16:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 87 амино киселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug (xi} ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:16:
Phe Trp Lys Xaa Pro Ser Xaa Pro Arg Xaa Xaa Gin Val Xaa Gly 1 5 10 15
Ala Glu Xaa Gly Phe Pro Pro Lys Pro Phe Val Asp Trp Phe Cys
25 30
Gly Gly Phe Gin Tyr Gin Vai Asp His His Leu Phe Pro Ser Leu
40 45
Pro Arg His Asn Leu Ala Lys Thr His Ala Leu Vai Glu Ser Phe
55 60
Cys Lys Glu Trp Gly Vai Gin Tyr His Glu Ala Asp Leu Vai Asp
7075
Gly Thr Met Glu Vai Leu His His Leu Gly Ser Vai Ala Gly Glu
7075
Phe Vai Vai Asp Phe Vai Arg Asp Gly Pro Ala Met
8085
146 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 17:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(E) ДЪЛЖИНА: 520 нуклеинови киселини (F) (В) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: нуклеинова киселина (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 17:
GGATGGAGTT CGTCTGGATC GCTGTGCGCT ACGCGACGTG
GTTTAAGCGT CATGGGTGCG 60
CTTGGGTACA CGCCGGGGCA GTCGTTGGGC ATGTACTTGT
GCGCCTTTGG TCTCGGCTGC 120
ATTTACATTT TTCTGCAGTT CGCCGTAAGT CACACCCATT
TGCCCGTGAG CAACCCGGAG 180
GATCAGCTGC ATTGGCTCGA GTACGCGCGG ACCACACTGT
GAACATCAGC ACCAAGTCGT 240
GGTTTGTCAC ATGGTGGATG TCGAACCTCA ACTTTCAGAT
CGAGCACCAC CTTTTCCCCA 300
CGGCGCCCCA GTTCCGTTTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT
CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC 360
ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT
CTCCACCACC TTTGCCAACC 420
TCTACTCCGT CGGCCAITCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA
CTAGCCTCTT TTCCTAGACC 480
TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC 520 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 18:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 153 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелевантна
147 (D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:18:
Met Glu-Phe Val Trp lie Ala Val Arg Tyr Ala Thr Trp Phe Lys
5 1015
Arg His Gly Cys Ala Trp Val His Ala Gly Ala Val Val Gly His
2530
Val Leu Val Arg Leu Trp Ser Arg Leu His Leu His Phe Ser Ala
4045
Val Arg Arg Lys Ser His Pro Phe Ala Arg Glu Gin Pro Gly Gly
5560
Ser Ala Ala Leu Ala Arg Val Arg Ala Asp His Thr Val Asn He
7075
Ser Thr Lys Ser Trp Phe Val Thr Trp Trp Met Ser Asn Leu Asn
8590
Phe Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Thr Ala Pro Gin Phe Arg
100105
Phe Lys Glu He Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu Phe Lys Arg His
110 115120
Gly Leu Pro Tyr Tyr Asp Met Pro Tyr Thr Ser Ala Val Ser Thr
125 130135
Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly Asp Ala
140 145150
Lys Arg Asp (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 19:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(G) ДЪЛЖИНА: 429 нуклеинови киселини (Η) (В) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖИОСТ: нерелевантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: нуклеинова киселина (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:19:
ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG
GAAGGCTACT TTG АССССТС 60
GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC TTTCCTTTTG 120
GCTGATGGGT CAGTCTTCAC CCCTCGCGCT CGCTCTCGGC ATTGTCGTCA GCGGCATCTC 180
147
TCAGGGTCGC TGCGGCTGGG TAATGCATGA GATGGGCCAT
GGGTGGTTCA CTGGTGTCAT 240
TTGGCTTGAC GACCGGTTGT GCGAGTTCTT TTACGGCGTT
GGTTGTGGCA TGAGCGGTCA 300
TTACTGGAAA AACCAGCACA GCAAACACCA CGCAGCGCCA
AACCGGCTCG AGCACGATGT 360
AGATCTCAAC ACCTTGCCAT TGGTGGCCTT CAACGAGCGC
GTCGTGCGCA AGGTCCGACC 420
148 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 20:
(i> ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 125 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: нерелеВантна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарца (и) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug (Й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 20:
Arg Vai Arg Pro Arg Vai Arg Arg Glu Gin Leu lie Lys Glu Gly
5 1015
Tyr Phe Asp Pro Ser Leu Pro His Met Thr Tyr Arg Vai Vai Glu
2530 lie Vai Vai Leu Phe Vai Leu Ser Phe Trp Leu Met Gly Gin Ser
4045
Ser Pro Leu Ala Leu Ala Leu Gly He Vai Vai Ser Gly He Ser
5560
Gin Gly Arg Cys Gly Trp Vai Met His Glu Met Gly His Gly Ser
7075
Phe Thr Gly Vai lie Trp Leu Asp Asp Arg Leu Cys Glu Phe Phe
7075
Tyr Gly Vai Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gin
8590
His Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Vai
100105
Asp Leu Asn Thr Leu Pro Leu Vai Ala Phe Asn Glu Arg Vai Vai
110 115120
Arg Lys Vai Arg Pro
125.
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 21:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 1219 дВойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна tzt« ким
149 (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig 2692004) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 21:
GCACGCCGAC CGGCGCCGGG AGATCCTGGC AAAGTATCCA
GAGATAAAGT CCTTGATGAA 60
ACCTGATCCC AATTTGATAT GGATTATAAT TATGATGGTT
CTCACCCAGT TGGGTGCATT 120
TTACATAGTA AAAGACTTGG ACTGGAAATG GGTCATATTT
GGGGCCTATG CGTTTGGCAG 180
Ф TTGCATTAAC CACTCAATGA CTCTGGCTAT TCATGAGATT
GCCCACAATG CTGCCTTTGG 240
CAACTGCAAA GCAATGTGGA ATCGCTGGTT TGGAATGTTT
GCTAATCTTC CTATTGGGAT 300
TCCATATTCA ATTTCCTTTA AGAGGTATCA CATGGATCAT
CATCGGTACC TTGGAGCTGA 360
TGGCGTCGAT GTAGATATTC CTACCGATTT TGAGGGCTGG
TTCTTCTGTA CCGCTTTCAG 420
AAAGTTTATA TGGGTTATTC TTCAGCCTCT CTTTTATGCC
TTTCGACCTC TGTTCATCAA 480
CCCCAAACCA ATTACGTATC TGGAAGTTAT CAATACCGTG
GCACAGGTCA CTTTTGACAT 540
Ф
TTTAATTTAT TACTTTTTGG GAATTAAATC CTTAGTCTAC
ATGTTGGCAG CATCTTTACT 600
TGGCCTGGGT TTGCACCCAA TTTCTGGACA TTTTATAGCT
GAGCATTACA TGTTCTTAAA 660
GGGTCATGAA ACTTACTCAT ATTATGGGCC TCTGAATTTA
CTTACCTTCA ATGTGGGTTA 720
TCATAATGAA CATCATGATT TCCCCAACAT TCCTGGAAAA
AGTCTTCCAC TGGTGAGGAA 780
AATAGCAGCT GAATACTATG ACAACCTCCC TCACTACAAT
TCCTGGATAA AAGTACTGTA 840
TGATTTTGTG ATGGATGATA CAATAAGTCC CTACTCA AG A
ATGAAGAGGC ACCAAAAAGG 900
44Q
150
AGAGATGGTG CTGGAGTAAA TATCATTAGT GCCAAAGGGA
TTCTTCTCCA AAACTTTAGA 960
TGATAAAATG GAATTTTTGC ATTATTAAAC TTGAGACCAG
TGATGCTCAG AAGCTCCCCT 1020
GGCACAATTT CAGAGTAAGA GCTCGGTGAT ACCAAGAAGT
GAATCTGGCT TTTAAACAGT 1080
CAGCCTGACT CTGTACTGCT CAGTTTCACT CACAGGAAAC
TTGTGACTTG TGTATTATCG 1140
TCATTGAGGA TGTTTCACTC ATGTCTGTCA TTTTATAAGC
ATATCATTTAAAAAGCTTCT 1200
AAAAAGCTATITCGCCAGG 1219 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 22:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 655 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig 2153526) (»> ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 22:
ТТАССТТСТА CGTCCGCTTC ТТССТСАСТТ ATGTGCCACT
ATTGGGGCTG AAAGCTTCCT 60
GGGCCTTTTC TTCATAGTCA GGTTCCTGGA AAGCAACTGG
TTTGTGTGGG TGACACAGAT 120
GAACCATATT CCCATGCACA TTGATCATGA CCGGAACATG
GACTGGGTTT CCACCCAGCT 180
CCAGGCCACA TGCAATGTCC ACAAGTCTGC CTTCAATGAC
TGGTTCAGTG GACACCTCAA 240
CTTCCAGATTGAGCACCATC ГГГП СССАС GATGCCTCGA
САСААТТАСС АСААAGTGGC 300
TCCCCTGGTG CAGTCCTTGT GTGCCAAGCA TGGCATAGAG
TACCAGTCCA AGCCCCTGCT 360
151П te
151
GTCAGCCTTC GCCGACATCA TCCACTCACT AAAGGAGTCA
GGGCAGCTCTGGCTAGATGC 420
CTATCTTCAC CAATAACAAC AGCCACCCTG CCCAGTCTGG
AAGAAGAGGA GGAAGACTCT 480
GGAGCCAAGG CAGAGGGGAG CTTGAGGGAC AATGCCACTA
TAGTTTAATA CTCAGAGGGG 540
GTTGGGTTTG GGGACATAAA GCCTCTGACT CAAACTCCTC
CCTTTTATCTTCTAGCCACA 600
GTTCTAAGAC CCAAAGTGGG GGGTGGACAC AGAAGTCCCT
AGGAGGGAAG G AGCT 655 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 23:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 304 двойки бази (B) ТИП: нуклеиноВа киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig
3506132) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 23:
GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA
CGGCCTTTGT CCTTGCTACC 60
TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCA ACAT GATTATGGCC
ACCTGTCTGT CTACAGAAAA 120
CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC
ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC 180
AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC
CTAACATCTT CCACAAGGAT 240
CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT
GGCAGCCCAT CGAGTACGGC 300
AAGA 304 (2> ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 24:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(А) ДЪЛЖИНА: 918 двойки бази
1AT
152 (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижца (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig 3854933) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO. 24:
CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG CCCAGCGCTC AGGGTGCGAG 6Q
GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG TACAACATCA GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT 120
CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG
ATGCCACGGA TCCCTTTGTG 180
GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA
ACTCTCTCCT GATTGGAGAA 240
CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA
AAGAGCTGAC AGATGAGTTC 300
CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA
AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360
CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG
CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC 420
TTTGGGACGT CCTTTTTGCC CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC
TGCTCAGTGC AGTTCAGGCC 480
CAGGCTGGCT GGCTGCAGCA TGACTTTGGG CACCTGTCGG TCTTCAGCAC CTCAAAGTGG 540
AACCATCTGC TACATCATTT TGTGATTGGC CACCTGAAGG
GGGCCCCCGC CAGTTGGTGG 600
AACCACATGC ACTTCCAGCA CCATGCCAAG CCCA ACTGCT
TCCGCAAAGA CCCAGACATC 660
A ACATGCATC CCTTCTTCTT TGCCTTGGGG AAGATCCTCT
CTGTGGAGCT TGGGAAACAG 720
AAGAAAAAAT ATATGCCGTA CAACCACCAG CACARATACT TCTTCCTAAT TGGGCCCCCA 780
GCCTTGCTGC CTCTCTACTT CCAGTGGTAT АТПТСТАТТ TTGTTATCCA GCGAAAGAAG 840
1^9
153
TGGGTGGACT TGGCCTGGAT CAGCAAACAG GAATACGATG
AAGCCGGGCT TCCATTGTCC 900
ACCGCAAATG CTTCTAAA 918 (2>ИНфОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 25:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 1686 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселица (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig 2511785) (Й) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 25:
GCCACTTAAA GGGTGCCTCT GCCAACTGGT GGAATCATCG
CCACTTCCAG CACCACGCCA 60
AGCCTAACAT CTTCCACAAG GATCCCGATG TGAACATGCT
GCACGTGTTTGTTCTGGGCG 120
AATGGCAGCC CATCGAGTAC GGCAAGAAGA AGCTGAAATA
CCTGCCCTACAATCACCAGC 180
ACGAATACTT CTTCCTGATT GGGCCGCCGC TGCTCATCCC
CATGTATTTC CAGTACCAGA 240
TCATCATGAC CATGATCGTC CATAAGAACT GGGTGGACCT
GGCCTGGGCC GTCAGCTACT 300
ACATCCGGTT CTTCATCACC TACATCCCTT TCTACGGCAT
CCTGGGAGCC CTCCTTTTCC 360
TCAACTTCAT CAGGTTCCTG GAGAGCCACT GGTTTGTGTG
GGTCACACAGATGAATCACA 420
TCGTCATGGA GATTGACCAG GAGGCCTACC GTGACTGGTT
CAGTAGCCAG CTGACAGCCA 480
CCTGCAACGT GGAGCAGTCC TTCTTCAACG ACTGGTTCAG
TGGACACCTT AACTTCCAGA 540
TTGAGCACCA CCTCTTCCCC ACCATGCCCC GGCACAACTT
ACACAAGATC GCCCCGCTGG 6Q0
1A3
154
TGAAGTCTCT ATGTGCCAAG CATGGCATTG AATACCAGGA
GAAGCCGCTA CTGAGGGCCC 660
TGCTGGACAT CATCAGGTCC CTGAAGAAGT CTGGGAAGCT
GTGGCTGGAG GCCTACGTTC 720
ACAAATGAAG CCACAGCCCC CGGGACACCG TGGGGAAGGG
GTGCAGGTGG GGTGATGGCC 780
AGAGGAATGA TGGGCTTTTG TTCTGAGGGG TGTCCGAGAG
GCTGGTGTAT GGACTGGTCA 840
CGGACCCCAT GTTGGATCTT TCTCCCTTTC TCCTCTCCTT
TTTCTCTTCA CATCTCCCCC 900
ATAGCACCCT GCCCTCATGG GACCTGCCCT CCCTCAGCCG
TCAGCCATCA GCCATGGCCC 960
TCCCAGTGCC TCCTAGCCCC TTCTTCCAAG GAGCAGAGAG
GTGGCCACCG GGGGTGGCTC 1020
TGTCCTACCT CCACTCTCTG CCCCTAAAGA TGGGAGGAGA
CCAGCGGTCC ATGGGTCTGG 1080
CCTGTGAGTC TCCCCTTGCA GCCTGGTCAC TAGGCATCAC
CCCCGCTTTG GTTCTTCAGA 1140
TGCTCTTGGG GTTCATAGGG GCAGGTCCTA GTCGGGCAGG
GCCGCTGACC CTCCCGGCCT 1200
GGCTTCACTC TCCCTGACGG CTGCCATTGG TCCACCCTTT
CATAGAGAGG CCTGCTTTGT 1260
TACAAAGCTC GGGTCTCCCT CCTGCAGCTC GGTTAAGTAC
CCGAGGCCTC TCTTAAGATG 1320
TCCAGGGCCC CAGGCCCGCG GGCACAGCCA GCCCAAACCT
TGGGCCCTGG AAGAGTCCTC 1380
CACCCCATCA CTAGAGTGCT CTGACCCTGG GCTTTCACGG
GGCGCATTCC ACCGGCTCCC 1440
CAACTTGAGC CTGTGACCTT GGGACCAAAG GGGGAGTCCC
TCGTCTCTTG TGACTCAGCA 1500
GAGGCAGTGG CCACGTTCAG GGAGGGGCCG GCTGGCCTGG
AGGCTCAGCC CACCCTCCAG 1560
СТПТССТСА GGGTGTCCTG AGGTCCAAGA TTCTGGAGCA
ATCTGACCCT TCTCCAAAGG 1620
K4
155
CTCTGTTATC AGCTGGGCAG TGCCAGCCAA TCCCTGGCCA
TTTGGCCCCA GGGGACGTGG 1680
GCCCTG 1686 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 26:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 1843 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig 2535) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 26:
GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA
CGGCCTTTGT CCTTGCTACC 60
TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC
ACCTGTCTGT CTACAGAAAA 120
CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC
ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC 180
AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC
CTAACATCTT CCACAAGGAT 240
CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT
GGCAGCCCAT CGAGTACGGC 300
AAG AAGAAGC TGAAATACCT GCCCTACAAT CACCAGCACG
AATACTTCTT CCTGATTGGG360
CCGCCGCTGC TCATCCCCAT GTATTTCCAG TACCAGATCA
TCATGACCATGATCGTCCAT 420
AAGAACTGGG TGGACCTGGC CTGGGCCGTC AGCTACTACA
TCCGGTTCTT CATCACCTAC 480
ATCCCTTTCT ACGGCATCCT GGGAGCCCTC СТПТССТСА
ACTTCATCAG GTTCCTGGAG 540
AGCCACTGGT TTGTGTGGGT CACACAGATG AATCACATCG
TCATGGAGAT TGACCAGGAG 600
GCCTACCGTG ACTGGTTCAG TAGCCAGCTG ACAGCCACCT
GCAACGTGGA GCAGTCCTTC 660
156
TTCAACGACT GGTTCAGTGG ACACCTTAAC TTCCAGATTG
AGCACCACCT CTTCCCCACC 720
ATGCCCCGGC ACAACTTACA CAAGATCGCC CCGCTGGTGA
AGTCTCTATG TGCCAAGCAT 780
GGCATTGAAT ACCAGGAGAA GCCGCTACTG AGGGCCCTGC
TGGACATCAT CAGGTCCCTG 840
AAGAAGTCTG GGAAGCTGTG GCTGGACGCC TACCTTCACA
AATGAAGCCA CAGCCGCCGG 900
GACACCGTGG GGAAGGGGTG CAGGTGGGGT GATGGCCAGA
GGAATGATGG GCTTTTGTTC 960
TGAGGGGTGT CCGAGAGGCT GGTGTATGCA CTGCTCACGG
ACCCCATGTTGGATCTTTCT 1020
CCCTTTCTCC ТСТССТПТТ CTCTTCACAT CTCCCCCATA
GCACCCTGCC CTCATGGGAC 1080
CTGCCCTCCC TCAGCCGTCA GCCATCAGCC ATGGCCCTCC
CAGTGCCTCC TAGCCCCTTC 1140
TTCCAAGGAG CAGAGAGGTG GCCACCGGGG GTGGCTCTGT
CCTACCTCCA CTCTCTGCCC 1200
CTAAAGATGG GAGGAGACCA GCGGTCCATG GGTCTGGCCT
GTGAGTCTCC CCTTGCAGCC 1260
TGGTCACTAG GCATCACCCC CGCTTTGGTT CTTCAGATGC
TCTTGGGGTT CATAGGGGCA 1320
GGTCCTAGTC GGGCAGGGCC CCTGACCCTC CCGGCCTGGC
TTCACTCTCG CTGACGGCTG 1380
CCATTGGTCC ACCCTTTCAT AGAGAGGCCT GCTTTGTTAC
AAAGCTCGGG TCTCCCTCCT 1440
GCAGCTCGGT TAAGTACCCG AGGCCTCTCT TAAGATGTCC
AGGGCCCCAG GCCCGCGGGC 1500
ACAGCCAGCC CAAACCTTGG GCCCTGGAAG AGTCCTCCAC
CCCATCACTAGAGTGCTCTG 1560
ACCCTGGGCT TTCACGGGCC CCATTCCACC GCCTCCCCAA
CTTGAGCCTG TGAGCTTGGG 1620
ACCAAAGGGG GAGTCCCTCG TCTCTTGTGA CTCAGCAGAG
GCAGTGGCCA CGTTCAGGGA 168Q
ISA
157
GGGGCCGGCT GGCCTGGAGG CTCAGCCCAC CCTCCAGCTT
TTCCTCAGGG TGTCCTGAGG 1740
TCCAAGATTC TGGAGCAATC TGACCCTTCT CCAAAGGCTC
TGTTATCAGC TGGGCAGTGC 1800
CAGCCAATCC CTGGCCATTT GGCCCCAGGG GACGTGGGCC CTG
1843 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ Π>ΝΟ: 27:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 2257 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: други нуклеинови киселини (Edited Contig 253538а) (s) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:27:
CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG
CCCAGCGCTG AGGGTGCGAG 60
GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG ТАСААСАТСА
GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT 120
CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG
ATGCCACGGA TCCCTTTGTG 180
GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA
АСТСТСТССТ GATTGGAGAA 240
CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA
AAGAGCTGAC AGATGAGTTC 300
CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA
AGGCCAACCA TGTCTTCTTC 360
CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG
CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC 420
TTTGGGACGT CCTTTTTGCC СТТССТССТС TGTGCGGTGC
TGCTCAGTGC AGTTCAGCAG 480
GCCCAAGCTG GATGGCTGCA ACATGAITAT GGCCACCTGT
CTGTCTACAG AAAACCCAAG 540
TV7
158
TGGAACCACC TTGTCCACAA ATTCGTCATT GGCCACTTAA
AGGGTGGCTC TGCCAACTGG 600
TGGAATCATC GCCACTTCCA GCACCACGCC AAGCCTAACA
TCTTCCACAA GGATCCCGAT 660
GTGAACATGC TGCACGTGTT TGTTCTGGGC GAATGGCAGC
CCATCGAGTA CGGCAAGAAG 720
AAGCTGAAAT ACCTGCCCTA CAATCACCAG CACGAATACT
TCTTCCTGAT TGGGCCGCGG 780
CTGCTCATCC CCATGTATTT CCAGTACCAG ATCATCATGA
CGATGATGGT GCATAAGAAC 840
TGGGTGGACC TGGCCTGGGC CGTCAGCTAC TACATCCGGT
TCTTCATGAG CTAGATCCCT 900
TTCTACGGCA TCCTGGGAGC CCTCCTTTTC CTCAACTTCA
TCAGGTTGCT GGAGAGGCAG 960
TGGTTTGTGT GGGTCACACA GATGAATCAC ATCGTCATGG
AGATTGACCAGGAGGCCTAC 1020
CGTGACTGGT TCAGTAGCCA GCTGACAGCC ACCTGCAACG
TGGAGGAGTCCTTGTTCAAC 1080
GACTGGTTCA GTGGACACCT TAACTTCCAG ATTGAGCACC
ACCTCTTCCC CACCATGCCC 1140
CGGCACAACT TACACAAGAT CGCCCCGCTG GTGAAGTCTC
TATGTGGGAA GCATGGGATT 1200
GAATACCAGG AGAAGCCGCT ACTGAGGGCC CTGCTGGACA
TGATCAGGTC CCTGAAGAAG 1260
TCTGGGAAGC TGTGGCTGGA CGCCTACCTT CACAAATGAA
GGCAGAGCCC CGGGGAGACC 1320
GTGGGGAAGG GGTGCAGGTG GGGTGATGGC CAGAGGAATG
ATGGGCTTTT GTTGTGAGGG 1380
GTGTCCGAGA GGCTGGTGTA TGCACTGCTC ACGGACCCCA
TGTTGGATCTTTCTCCCTTT 144Q
CTCCTCTCCT ТПТСТСТТС ACATCTCCCC CATAGCACCC
TGGGCTCATG GGAGCTGCGG 1500
TCCCTCAGCC GTCAGCCATC AGCCATGGCC CTCCCAGTGC
GTCCTAGGGC CTTGTTCCAA 1560 тч«
159
GGAGCAGAGA GGTGGCCACC GGGGGTGGCT CTGTCCTACC TCCACTCTCT GGCCCTAAAG 1620
ATGGGAGGAG ACCAGCGGTC CATGGGTCTG GCCTGTGAGT CTCCCCTTGC AGCCTGGTCA 1680
CTAGGCATCA CCCCCGCTTT GGTTCTTCAG ATGCTCTTGG
GGTTCATAGG GGCAGGTCCT 1740
AGTCGGGCAG GGCCCCTGAC CCTCCCGGCC TGGCTTCACT
CTCCCTGACGGCTGCCATTG 1800
GTCCACCCTT TCATAGAGAG GCCTGCTTTG TTACAAAGCT CGGGTCTCCC TGCTGCAGCT 1860
CGGTTAAGTA CCCGAGGCCT CTCTTAAGAT GTCCAGGGCC CCAGGCCCGC GGGCACAGCC 1920
AGCCCAAACC TTGGGCCCTG GAAGAGTCCT CCACCCCATC
AGTAGAGTGG TCTGACCCTG 1980
GGCTTTCACG GGCCCCATTC CACCGCCTCC CCAACTTGAG CCTGTGAGGT TGGGACGAAA 204Q
GGGGGAGTCC CTCGTCTCTT GTGACTCAGC AGAGGCAGTG GCCACGTTCA GGGAGGGGGG 2100
GGCTGGCCTG GAGGCTCAGC CCACCCTCCA GCTTTTCCTC
AGGGTGTCCT GAGGTCGAAG 2160
ATTCTGGAGC AATCTGACCC TTCTCCA AAG GCTCTGTTAT
CAGCTGGGCA GTGGGAGCCA 2220
ATCCCTGGCC ATTTGGCCCC AGGGGACGTG GGCCCTG
2257 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 28:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 411 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна.
(ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation of Contig 2692004) (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 28:
His Ala Asp Arg Arg Arg Glu He Leu Ala Lys Tyr Pro Glu lie 1 5 10 15 t^Q
160
Lys Ser Leu Met Lys Pro Asp Pro Asn Leu De Trp He lie He
25 30
Met Met Val Leu Thr Gin Leu Gly Ala Phe Tyr He Val Lys Asp
40 45
Leu Asp Trp Lys Trp Val He Phe Gly Ala Tyr Ala Phe Gly Ser
5560.
Cys lie Asn His Ser Met Thr Leu Ala He His Glu He Ala His
7075
Asn Ala Ala Phe Gly Asn Cys Lys Ala Met Trp Asn Arg Trp Phe
8590
Gly Met Phe Ala Asn Leu Pro He Gly He Pro Tyr Ser He Ser
100105
Phe Lys Arg Tyr His Met Asp His His Arg Tyr Leu Gly Ala Asp
110 115120..
Gly Val Asp Val Asp He Pro Thr Asp Phe Glu Gly Trp Phe Phe
125 130135
Cys Thr Ala Phe Arg Lys Phe He Trp Val He Leu Gin Pro Leu
140 145150
Phe Tyr Ala Phe Arg Pro Leu Phe He Asn Pro Lys Pro He Thr
155 160165,
Tyr Leu Glu Val lie Asn Thr Val Ala Gin Val Thr Phe Asp lie
170 175180
Leu lie Tyr Tyr Phe Leu Gly lie Lys Ser Leu Val Tyr Met Leu
185 190195
Ala Ala Ser Leu Leu Gly Leu Gly Leu His Pro lie Ser Gly His
200 205210
Phe lie Ala Glu His Tyr Met Phe Leu Lys Gly His Glu Thr Tyr
215 220225
Ser Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Leu Leu Thr Phe Asn Val Gly Tyr
230 235240
His Asn Glu His His Asp Phe Pro Asn He Pro Gly Lys Ser Leu
245 250255
Pro Leu Val Arg Lys lie Ala Ala Glu Tyr Tyr Asp Asn Leu Pro
260 265270.
His Tyr Asn Ser Trp He Lys Val Leu Tyr Asp Phe Val Met Asp
275 280285,
Asp Thr lie Ser Pro Tyr Ser Arg Met Lys Arg His Gin Lys Gly
290 295300
Glu Met Val Leu Glu Xaa He Ser Leu Val Pro Lys Gly Phe Phe
305 310315
Ser Lys Thr Leu Asp Asp Lys Met Glu Phe Leu His Tyr Xaa Thr
320 325330
Xaa Asp Gin Xaa Cys Ser Glu Ala Pro Leu Ala Gin Phe Gin Ser
335 340345.
Lys Ser Ser Val lie Pro Arg Ser Glu Ser Gly Phe Xaa Thr Val
350 355360.
Ser Leu Thr Leu Tyr Cys Ser Val Ser Leu Thr Gly Asn Leu Xaa
365 370375,
Leu Val Tyr Tyr Arg His Xaa Gly Cys Phe Thr His Val Cys His
380 385390
Phe He Ser He Ser Phe Lys Lys Leu LeuCys Ser Tyr Phe Ala
400 405410
1АЛ
161
Arg (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 29:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 218 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation of Contig 2153526) (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 29:
Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Leu Pro His Leu Cys Ala Thr lie Gly 15 1015
Ala Glu Ser Phe Leu Gly Leu Phe Phe lie Val Arg Phe Leu Glu
2530
Ser Asn Trp Phe Val Trp Val Thr Gin Met Asn His He Pro Met
4045
His He Asp His Asp Arg Asn Met Asp Trp Val Ser Thr Gin Leu
5560
Gin Ala Thr Cys Asn Val His Lys Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe
7075
Ser Gly His Leu Asn Phe Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Thr
8590
Met Pro Arg His Asn Tyr His Lys Val Ala Pro Leu Val Gin Ser
100105
Leu Cys Ala Lys His Gly He Glu Tyr Gin Ser Lys Pro Leu Leu
110 115120
Ser Ala Phe Ala Asp He He His Ser Leu Lys Glu Ser Gly Gin
125 130135
Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Gin Xaa Gin Gin Pro Pro Cys
140 145150
Pro Val Trp Lys Lys Arg Arg Lys Thr Leu Glu Pro Arg Gin Arg
155 160165
Gly Ala Xaa Gly Thr Met Pro Leu Xaa Phe Asn Thr Gin Arg Gly
170 175180
Leu Gly Leu Gly Thr Xaa Ser Leu Xaa Leu Lys Leu Leu Pro Phe
185 190195
He Phe Xaa Pro Gin Phe Xaa Asp Pro Lys Trp Gly Val Asp Thr
200 205210
Glu Val Pro Arg Arg Glu Gly Ala
215 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 30:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(А) ДЪЛЖИНА: 71 амино киселини
1A1
(В) ТИП: амино киселина (G) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation Contig3506132) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 30:
Val Phe Tyr Phe Gly Asn Gly Trp lie Pro Thr Leu lie Thr Ala
5 1015
Phe Val Leu Ala Thr Ser Gin- Ala Gin Ala Gly Trp Leu Gin His
2530
Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys Trp Asn His
4045
Leu Val His Lys Phe Val lie Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala
5560
Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gin His His Ala Lys-Pro Asn
7075
Leu Gly Glu Trp Gin Pro He Glu-Tyr Gly Lys Xaa
8085
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 31:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 306 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation Contig 3854933) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 31:
Gin Gly Pro Thr Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Val Ala Gin 1 5 1015
Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu Val lie Asp Arg Lys Val 20 2530
Tyr Asn lie Ser Glu Phe Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg
4045
Val lie Ser His Tyr Ala Gly Gin Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val
55 60
Ala Phe His He Asn Lys Gly Leu Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser
70 75
Leu Leu He Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gin Pro Ser Phe Glu Pro
85 90
Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala
100 105
163
Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Val Phe Phe
110 115 120
Leu Leu Tyr Leu Leu His lie Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp
125 130 135
Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu
140 145150
Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gin Ala Gin Ala Gly Trp Leu
155 160165
Gin His Asp Phe Gly His Leu Ser Val Phe Ser Thr Ser Lys Trp
170 175180
Asn His Leu Leu His His Phe Val lie Gly His Leu Lys Gly Ala
185 190195
Pro Ala Ser Trp Trp Asn His Met His Phe Gin His His Ala Lys
200 205210.
Pro Asn Cys Phe Arg Lys Asp Pro Asp lie Asn Met His Pro Phe
215' 220225
Phe Phe Ala Leu Gly Lys He Leu Ser Val Glu Leu Gly Lys Gin
230 235240
Lys Lys Lys Tyr Met Pro Tyr Asn His Gin His Xaa Tyr Phe Phe
245 250'255
Leu He Gly Pro Pro Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Phe Gin Trp Tyr
260 265270 lie Phe Tyr Phe Val He Gin Arg Lys Lys Trp Val Asp Leu Ala
275 280285
Trp lie Ser Lys Gin Glu Tyr Asp Glu Ala Gly Leu Pro Leu Ser
290 29530Q
Thr Ala Asn Ala Ser Lys
305 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 32:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 566 амино киселини (B) ТИП: амино киселина.
(C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation of Contig 2511785) (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ ID ΝΛ 35:
His Leu Lys Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe 1 5 1015
Gin His His Ala Lys Pro Asn lie Phe His Lys Asp Pro Asp Val 20 2530
Asn Met Leu His Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gin Pro lie Glu 35 4045
Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gin His
5560
Glu Tyr Phe Phe Leu lie Gly Pro Pro Leu Leu lie Pro Met Tyr
1АЯ
Phe Gin Tyr Gin lie lie Met Thr Met lie Val His Lys Asn Trp
85 90
Val Asp Leu Ala Trp Ala Val Ser Tyr Tyr He Arg Phe Phe lie
100 105
Thr Tyr lie Pro Phe Tyr Gly lie Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu 110 115120
Asn Phe He Arg Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr 125 130135
Gin Met Asn His He Val Met Glu lie Asp Gin Glu Ala Tyr Arg 140 145150
Asp Trp Phe Ser Ser Gin Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gin
155 160165
Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly HisLeu Asn Phe Gin lie
170 175180
Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu His Lys 185 190195 lie Ala Pro Leu Val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly He Glu
200 205210
Tyr Gin Glu Lys Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp He He Arg 215 220225
Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His
230 235240
Lys Xaa Ser His Ser Pro Arg Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg 245 250255
Trp Gly Asp Gly: Gin Arg Asn Asp Gly Leu Leu Phe Xaa Gly Val 260 265270
Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp 275 280285
Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His
290 295300
Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gin Pro 305 310315
Ser Ala Met Ala Leu Pro Val Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gin Gly 320 325330
Ala Glu Arg Trp Pro Pro Gly Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser 335 340345
Leu Pro Leu Lys Met Gly Gly Asp Gin Arg Ser Met Gly Leu.Ala
350 355360
Cys Glu Ser Pro Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly He Thr Pro Aja 365 370375
Leu Val Leu Gin Met Leu Leu Gly Phe He Gly Ala Gly Pro Ser
380 385390
Arg Ala Gly Pro Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu Hist Ser Pro Xaa 400 405410
Arg Leu Pro Leu Val His Pro Phe lie Glu Arg Pro Ala Leu Leu 415 420425
Gin Ser Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly 430 435440
Leu Ser Xaa Asp Val Gin Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser 445 450455
Pro Asn Leu Gly Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His-Xaa Ser
165
460 465470
Ala Leu Thr Leu Gly -Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro
475 480485
Thr Xaa Ala Cys Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Vai Pro Arg Leu
490 495500
Leu Xaa Leu Ser Arg Gly Ser Gly His Vai Gin Gly Gly Ala Gly
505 510515
Trp Pro Gly Gly Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gin Gly Vai
520 525530
Leu Arg Ser Lys lie Leu Glu Gin Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala
535 540545
Leu Leu Ser Ala Gly Gin Cys Gin Pro lie Pro Gly His Leu Aja
550 555560
Pro Gly Asp Vai Gly Pro Xaa
565 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 33:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 619 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна.
(ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation of Contig 2535) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 35:
Vai Phe Tyr Phe Gly Asn Gly Trp lie Pro Thr Leu He Thr Ala
5 1015
Phe Vai Leu Ala Thr Ser Gin Ala Gin Ala Gly Trp Leu Gin His 20 2530
Asp Tyr Gly His Leu Ser Vai Tyr Arg Lys Pro Lys Trp Asn His 35 4045
Leu Vai His Lys Phe Vai lie Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala 50 5560
Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gin His His Ala Lys Pro Asn 65 7075 lie Phe His Lys Asp Pro Asp Vai Asn Met Leu His Vai Phe Vai
8590
Leu Gly Glu Trp Gin Pro lie Glu Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys 95 100105
Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gin His Glu Tyr Phe Phe Leu lie Gly
110 115- 120
Pro Pro Leu Leu lie Pro Met Tyr Phe Gin Tyr Gin lie He Met
125 130 135
Thr Met lie Vai His Lys Asn Trp Vai Asp Leu Ala Trp Ala Vai
140 145 150
Ser Tyr Tyr He Arg Phe Phe lie Thr Tyr He Pro Phe Tyr Gly
166
155 160165 lie Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu Asn Phe He Arg Phe Leu Glu 170 175180
Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr Gin Met Asn His He Val Met 185 190195
Glu lie Asp Gin Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Phe Ser Ser Gin Leu 200 205210
Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gin Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe 215 220225
Ser Gly His Leu Asn Phe Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Thr 230 235240
Met Pro Arg His Asn Leu His Lys lie Ala Pro Leu Val Lys Ser 245 250255
Leu Cys Ala Lys His Gly lie Glu Tyr Gin Glu Lys Pro Leu Leu 260 265270
Arg Ala Leu Leu Asp He lie Arg Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys
275 280285
Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys Xaa Ser His Ser Pro Arg 290 295300
Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly Gin Arg Asn 305 310315
Asp Gly Leu Leu Phe Xaa Gly Val Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala 320 325330
Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser 335 340345
Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp 350 355360
Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gin Pro Ser Ala Met Ala Leu Pro Val 365 370375
Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gin Gly Ala Glu Arg Trp Pro Pro Gly
380 385390
Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys Met Gly Gly 400 405410
Asp Gin Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro Leu Ala Ala 415 420425
Trp Ser Leu Gly He Thr Pro Ala Leu Val Leu Gin Met Leu Leu
430 435440
Gly Phe lie Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro Leu Thr Leu 445 450455
Pro Ala Trp Leu His Ser Pro Xaa Arg Leu Pro Leu Val His Pro 460 465470
Phe He Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gin Ser Ser Gly Leu Pro Pro 475 480485
Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser Xaa Asp Val Gin Gly 490 495500
Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Lys 505 510515
Ser Pro Pro Pro His His Xaa Ser Ala Leu Thr Leu Gly Phe His
520 525530
Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro Thr Xaa Ala Cys Asp Leu Gly 535 540545
Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu Leu Xaa Leu Ser Arg Gly Ser
TA6
550 555 560
Gly His Vai Gin Gly Gly Ala Gly Trp Pro Gly Gly Ser Ala His
565 570 575
Pro Pro Ala Phe Pro Gin Gly Vai Leu Arg Ser Lys Ile Leu Glu
580 585 590
Gin Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala Gly Gin Cys 595 600 605
Gin Pro He Pro Gly His Leu Ala Pro Gly Asp Vai Gly Pro Xaa 610 615 620
167 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: SEQ ID NO: 34:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 757 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноВерижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: амино киселина (Translation of Contig 253538а) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 34:
Gin Gly Pro Thr Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Vai Ala Gin
5 1015
Arg Ser Gly Cys Glu Glu Arg Trp Leu Vai Ile Asp Arg Lys Vai
2530
Tyr Asn Ile Ser Glu Phe Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg
4045
Vai Ile Ser His Tyr Ala Gly Gin Asp Ala Thr Asp Pro Phe Vai
5560
Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu Vai Lys Lys Tyr Met Asn Ser
7075
Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gin Pro Ser Phe Glu Pro
8590
Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala
100105
Thr Vai Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Vai Phe Phe
110 115120
Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp
125 130135
Leu Thr Leu Trp Vai Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu
140 145150
Cys Ala Vai Leu Leu Ser Ala Vai Gin Gin Ala Gin Ala Gly Trp
155 160165
Leu Gin His Asp Tyr Gly His Leu Ser Vai Tyr Arg Lys Pro Lys
170 175180
Trp Asn His Leu Vai His Lys Phe Vai Ile Gly His Leu Lys Gly
185 190195
167
168
Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gin His His Ala
200 205 210
Lys Pro Asn lie Phe His Lys Asp Pro Asp Vai Asn Met Leu His
215 220 225
Vai Phe Vai Leu Gly Glu Trp Gin Pro lie Glu Tyr Gly Lys Lys
230 235240
Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gin His Glu Tyr Phe Phe
245 250255
Leu lie Gly Pro Pro Leu Leu He Pro Met Tyr Phe Gin Tyr Gin
260 265270
He lie Met Thr Met lie Vai His Lys Asn Trp Vai Asp Leu Ala
275 280285
Trp Ala Vai Ser Tyr Tyr lie Arg Phe Phe He Thr Tyr He Pro
290 295300
Phe Tyr Gly lie Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu Asn Phe lie Arg
305 310315
Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Vai Trp Vai Thr Gin Met Asn His
320 325330
He Vai Met Glu lie Asp Gin Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Phe Ser
335 340345
Ser Gin Leu Thr Ala Thr Cys Asn Vai Glu Gin Ser Phe Phe Asn
350 355360
Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gin lie Glu His His Leu
365 370375
Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu His Lys He Ala Pro Leu
380 385390
Vai Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly He Glu Tyr Gin Glu Lys
400 405410
Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp lie He Arg Ser Leu Lys Lys
415 420425
Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys Xaa Ser His
430 435440
Ser Pro Arg Asp Thr Vai Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly
445 450455
Gin Arg Asn Asp Gly Leu Leu Phe Xaa Gly Vai Ser Glu Arg Leu
460 465470
Vai Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe
475 480485
Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro
490 495500
Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gin Pro Ser Ala Met Ala
505 510515
Leu Pro Vai Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gin Gly Ala Glu Arg Trp
520 525530
Pro Pro Gly Vai Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys
535 540545
Met Gly Gly Asp Gin Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro
550 555560
Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly He Thr Pro Ala Leu Vai Leu Gin
565 570575
Met Leu Leu Gly Phe He Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro
580 585-590
1АЯ
169
Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu His Ser Pro Xaa Arg Leu Pro Leu
595 600 605
Val His Pro Phe lie Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gin Ser Ser Gly
610 615 620
Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser Xaa Asp
625 630635
Val Gin Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser Pro Asn Leu Gly
640 645650
Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His Xaa Ser Ala Leu Thr Leu
655 660665
Gly Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro Thr Xaa Ala Cys
670 675680
Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu Leu Xaa Leu Ser
685 690695
Arg Gly Ser Gly His Val Gin Gly Gly Ala Gly Trp Pro Gly Gly
700 705710
Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gin Gly Val Leu Arg Ser Lys
715 720725
He Leu Glu Gin Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala
730 735740
Gly Gin Cys Gin Pro lie Pro Gly His Leu Ala Pro Gly Asp Val
745 750755
Gly Pro Xaa

Claims (88)

  1. Претенции
    1. Изолирана нуклеинова киселина, включваща: нуклеотидна последователност, посочена на SEQ ID NO: 1
  2. 2. Полипептид, кодиран от посочената в претенция 1 нуклеинова киселина
  3. 3. Пречистен или изолиран полипептид, включващ амино киселинна^последователност^ посочена на SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща полипептид от SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Изолирана нуклеинова киселина, включваща: нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, конто ненасища молекулата на мастната киселина при въглерод 5 от карбоксилни» край на посочената молекула мастна киселина.
  6. 6. Изолирана нуклеинова киселина съгласно претенция 5, където посочената нуклеотидна последователност е получена от еукариотична клетка.
  7. 7. Изолирана нуклеинова киселина съгласно претенция 6, където посочената еукариотична клетка е от гъби.
  8. 8. Изолирана нуклеинова киселина съгласно претенция 7, където посочената клетка от гъби е от род Mortierella.
  9. 9. Изолирана нуклеинова киселина съгласно претенция 8, където посочената клетка от Mortierella е от вида Mortierella alpina.
  10. 10. Изолирана нуклеинова киселина съгласно претенция 5, където посочената нуклеотидна последователност
    17П
    171 се ренатурира go нуклеотидната последователност, посочена на
    SEQIDNO: 1.
  11. 11. Нуклеинова киселина съгласно претенция 10, където посочената нуклеотидна последователност кодира амино киселинната последователност, посочена HaSEQ ID NO:
    2.
  12. 12. Нуклеинова киселина от претенция 11, където посочената амино киселинна последователност, посочена на SEQ ID NO: 2 е подбрана от групата, състояща се от амино киселинни остатъци 30- 38,41-44,171-175, 203- 212 и 387- 394.
  13. 13. Изолиран или пречистен полипептид, който ненасища молекулата мастна киселина при въглерод 5 от карбоксилния край на посочената молекула мастна киселина,
  14. 14. Изолирана нуклеинова киселина, включваща: нуклеотидна последователност, която е по същество идентична на последователност от най- малко 50 нуклеотида в SEQ ГО-NO: 1.
  15. 15. Изолирана последователност на нуклеинова киселина, притежаваща най- малко около 50% идентичност със SEQIDNQ: 1.
  16. 16. Структура на нуклеинова киселина^ включваща: нуклеотидна последователност^ посочена на SEQ ID NO: 1, присъединена към хетероложна нуклеинова киселина.
  17. 17. Структура на нуклеинова киселина, която включва:
    нуклеотидна последователност, посочена на SEQ ID NO: 1, оперативно свързана е промотор.
  18. 18. Структура на нуклеинова киселина от претенция 17, където посоченият промотор е функционален в микробната клетва.
    171
    172
  19. 19. Структура на нуклеинова киселина от претенция 18, където посочената микробна клетка е дрождева клетка.
  20. 20. Структура на нуклеиновата киселина съгласно претенция 17, където посочената нуклеотидна последователност е получена от гъба.
  21. 21. Нуклеинова киселина съгласно претенция 19, където посочената гъба е от род Mortierella.
  22. 22. Нуклеинова киселина съгласно претенция 20, където посочената гъба е от вида Mortierella alpina.
  23. 23. Структура на нуклеинова киселина, включваща^ нуклеотидна последователност, която кодира полипептид^ съдържащ амино киселинна последователност, съответстваща на или камплементарна на амино киселинна последователност^ посочена на SEQ ID NO: 2, където посочената нуклеотидна последователност е оперативно сВързана към промотор, който е функционален в гостоприемникова клетка, където посочената нуклеотидна последователност кодира полипептид, който ненасища молекула мастна киселина при въглерод 5 от карбоксилния край на молекулата мастна киселина.
  24. 24. Структура на нуклеинова киселина, която съдържа:
    нуклеотидна последователност, която кодира функционално активна Δ5- десатураза, която десатураза притежава амино киселинна последователност, която съответства на или е комплементарна на всички от или на част от амино киселинна последователност, посочена на SEQ ID NO: 2, където посочената нуклеотидна последователност е оперативно свързана към промотор, функционален в гостоприемникова клетка.
    17Т
    ΜΜΜΜ··Μ·
    173
  25. 25. Рекомбинантна дрождева клетка, включваща структура на нуклеинова киселина съгласно претенция 23 или претенция 24.
  26. 26. Рекомбинантна дрождева клетка съгласно претенция 25, където посочената дрождева клетка е клетка на Saccharomyces.
  27. 27. Гостоприемникова клетка, включваща:
    поне едно копие на нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, който превръща дихомо- у- линоленовата киселина в арахидонова киселина, където посочената микробна клетка или нейн предшевственик е трансформиран с вектор, съдържащ посочената нуклеотидна последователност, и където посочената нуклеотидна последователност е оперативно свързана към промотор, който е функционален в дадената гостоприемникова клетка.
  28. 28. Микробна клетка, съгласно претенция 27, където посочената клетка е гостоприемникова клетка, подбрана от групата, състояща се от клетки на гъби или на водорасли.
  29. 29. Микробна клетка съгласно претенция 28, където посочената гъбна клетка е дрождева клетка и където водорасловата клетка е от морско водорасло.
  30. 30. Микробна клетка съгласно претенция 27, където посочената клетка е обогатена до 20: 3 мастни киселини в сравнение с гостоприемниковата клетка, която е лишена от посочената нуклеотидна последователност.
  31. 31. Микробна клетка съгласно претенция 27, където клетката е обогатена до 20: 4 или ω- 3 20: 4 мастни киселини в сравнение с гостоприемникова клетка, която е лишена от дадената ДНК последователност.
    174
  32. 32. Микробна клетка, съгласно претенция 27, където посочената клетка е обогатена до 20: 5 мастни киселини 6 сравнение с гостоприемниковата клетка, която е лишена от посочената ДНК последователност.
  33. 33. Микробна клетка съгласно претенция 27, където посочената клетка има изменено количество от 20: 3 (8, 11, 14) мастни киселини в сравнение с нетрансформирана микробна клетка.
  34. 34. Метод за продуциране на арахидонова киселина в микробна клетъчна култура, който метод включва:
    култивиране на мекробна клетъчна култура, която притежава множество от микробни клетки, където посочените микробни клетки или техни предшевственици са трансформирани с вектор, включващ една или повече нуклеинови киселини, които притежават нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, който превръща дихомо- γлиноленова киселина до арахидонова киселина, където посочените една или повече нуклеинови киселини са оперативно свързани към промотор, при условия, при които се експресира посочената една или повече нуклеинови киселини и арахидоновата киселина е продуцирана в посочената микробна клетъчна култура.
  35. 35. Метод съгласно претенция 34, където посоченият полипептид е ензим, който ненасища молекула мастна киселина при въглерод 5 от карбоксилния край на молекулата на посочената мастна киселина.
  36. 36. Метод съгласно претенция 34, където посочената нуклеотидна последователност е получена от вид Mortierella.
  37. 37. Метод съгласно претенция 34, където посочената дихомо- γ- линоленова киселина е доставена екзогенно .
    174
    175
  38. 38. Метод съгласно претенция 34, където посочените микробни клетки са дрождеви клетки.
  39. 39. Метод съгласно претенция 38, където посочените дрождеВи клетки са клетки от Вида Saccharomices.
  40. 40. Метод съгласно претенция 34, където посочените услоВия са индуцируеми.
  41. 41. Рекомбинантна дрождеВа клетка, която превръща повече от около 5% от 20: 3 мастна киселина до 20: 4 мастна киселина.
  42. 42. Сонда нуклеинова киселина, която включва: нуклеотидна последователност, както е представена от SEQ ID NO: 1.
  43. 43. ГостоприемникоВа клетка, съдържаща: структура на нуклеинова киселина съгласно Претенция 23 или претенция 24.
  44. 44. ГостоприемникоВа клетка, съдържаща:
    вектор, който Включва нуклеинова киселина, която кодира мастно киселинна десатураза, получена от Mortierella alpina, където посочената мастно киселинна десатураза включва амино киселинна последователност, представена от SEQ ID NO: 2, където посочената нуклеинова киселина е оперативно свързана с промотор.
  45. 45. Гостоприемникова клетка съгласно претенция 44, където посочената гостоприемникова клетка е еукариотична клетка.
  46. 46. Гостоприемникова клетка съгласно претенция 45, където посочената еукариотична клетка е подбрана от групата, включваща клетка на бозайник, растителна клетка, гъбна клетка и клетка на водорасло.
    17S
    176
  47. 47. Гостоприемникова клетка съгласно претенция 45, където посочената гостоприемникова клетка съдържа дихомогама- линоленова киселина.
  48. 48. Гостоприемникова клетка съгласно претенция 45, където посочената гостоприемникова клетка съдържа ЕРА.
  49. 49. Гостоприемникова клетка съгласно претенция 44, където посоченият промотор е доставен екзогенно.
  50. 50. Метод за ненасищане на дихомо- у- линоленова киселина, който включва:
    култивиране на рекомбинантна микробна клетка съгласно претенция 37, при условия, подходящи за експресия на полипептид, кодиран от посочената нуклеинова киселина, където посочената гостоприемникова клетка по- нататък включва мастно киселинен субстрат от посочения полипептид.
  51. 51. Мастна киселина, ненаситена по метод съгласно претенция 50.
  52. 52. Мазнина, съдържаща мастна киселина съгласно претенция 51.
  53. 53. Метод за получаване на изменена дълговерижна полиненаситена мастна киселина, като биосинтезата включва етапите на:
    култивиране на микроорганизъм, който съдържа трансген, който кодира трансгенен експресионен продукт, който ненасища мастно киселинна молекула при въглерод 5 от карбоксилния край на посочената мостно киселинна молекула, където посоченият мастно киселинен трансген е оперативно асоцииран с експресионна контролна последователност, при условия на експресия на посоченият трансген и при който се променя биосинтезата на дълговерижната пполиненаситена мастна киселина в дадената клетка.
    17 А
    177
  54. 54. Метод за получаване на изменена дълговерижна полиненаситена мастна киселина, биосинтезата на която вкючва етапите:
    култивиране на микроорганизъм, притежаващ клетки съдържащи тренсген, получен от гъба или водорасло, който кодира трансгенен експресионен продукт, който ненасища молекула мастна киселина при въглерод 5 от карбоксилния край на посочената молекула мастнакиселина, където посоченият трансген е оперативно свързан с експресионна контролна последователност при условия, където посочените един или повече трансгени се експресират, и при което биосинтезата на дълговерижната полиненаситена мастна киселина в посочените клетки се променя.
  55. 55. Метод съгласно претенции 53 или 54, където посочената дълговерижна полиненаситена мастна киселина е подбрана от групата, състояща се от ARA, DGLA и ЕРА.
  56. 56. Микробиално масло или негова фракция, продуциран съгласно метода от претенции 53 или 54.
  57. 57. Метод за лечение или предотвратяване на недохранване, включващ въвеждане на посоченото микробиално масло от претенция 56 на пациент, нуждаещ се от такова лечение или предотвратяване в количество, достатъчно да предизвика това лечение или предотвратяване.
  58. 58. фармацевтичен състав, включващ посоченото микробиално масло или негова фракция от претенция 56 и фармацевтично приемлив носител.
  59. 59. фармацевтичен състав съгласно претенция 58, който е в твърда или течна форма.
    177
    178
  60. 60. фармацевтичен състав съгласно претенция 59, където посоченият фармацевтичен състав е в капсулна или таблетна форма.
  61. 61. фармацевтичен състав съгласно претенция 58, съдържащ още най- малко един хранителен компонент, подбран от групата, състояща се от витамин, минерал, въглехидрат, захар, амино киселина , свободна мастна киселина, фосфолипид, антиоксидант и фенолно вещество.
  62. 62. Хранителна формула, включваща посоченото микробиално масло или негова фракция от претенция 56.
  63. 63. Хранителна формула от претенция 62, където посочената хранителна формула е подбрана от групата, състояща се от формула за подрастващи, диетична добавка и диетичен заместител.
  64. 64. Хранителна формула от претенция 63, където посочената формула за подрастващи, диетична добавка или диетичен заместител са твърда или течна форма.
  65. 65. формула за подрастващи, включваща посоченото микробиално масло или негова фракция съгласно претенция 56.
  66. 66. формула за подрастващи съгласно претенция 65, включващ още най- малко една макрохранителн компонента, подбрана от групата, състояща се от кокосово масло, соево масло, канолово масло, моно- и диглицериди, глюкоза, лактоза за хранене, електродиализирана суроватка, електродиализиран млечен каймак, млечна суроватка, соев протеин и други протеинови хидролизати.
  67. 67. формула за подрастващи съгласно претенция 66, включВаща още най- малко един витамин, подбран от групата, състояща се от витамин A, С, D, Е и В комплекс; и най- малко един минерал, подбран от групата, състояща се от калций,
    178
    179 магнезий, цинк, манган, натрий, калий, фосфор, мед, хлор, йод, селен и желязо.
  68. 68. Диетична добавка, включваща посоченото микробиално маело или негова фракция съгласно претенция 56.
  69. 69. Диетична добавка от претенция 68, включваща още най- малко една макрохранителна компонента, подбрана от кокосово маело, соево масло, канелово маело, моно- и диглицериди, лактоза за хранене, електродиализирана суроватка, електродиализиран млечен каймак, млечна еуроватка, соев протеин и други протеинови хидролизати.
  70. 70. Диетична добавка от претенция 69, включваща още най- малко един витамин, подбран от групата, състояща ее от витамините A, С, D, Е и В комплекс; и най- малко един минерал, подбран от групата, състояща ее от калций, магнезий, цинк, манган, натрий, калий, фосфор, мед, хлор, йод, селен и желязо.
  71. 71. Диетична добавка съгласно претенция 68 или претенция 70, където посочената добавка се въвежда на човек или животно.
  72. 72. Диетичен заместител, включващ посоченото микробно маело или негова фракция съгласно претенция 56.
  73. 73. Диетичен заместител съгласно ретенция 72, включващ още най- малко един макрохранителен компонент, подбран от групата, еъетояща ее от кокосово маело, соево маело, канолово маело, моно- и диглицериди, глюкоза, лактоза за хранене, електродиализирана еуроватка, електродиализиран млечен каймак, млечна еуроватка, соев протеин и други протеинови хидролизати.
  74. 74. Диетичен заместител съгласно претенция 73, включващ още най- малко един витамин, подбран от групата,
    170
    180 състояща се от витамини A, С, D, Е и В комплекс; и най- малко един минерал, подбран от групата, еъетояща ее от калций, магнезий, цинк, манган, натрий, калий, фоефор, мед, хлор, йод, еелен и желязо.
  75. 75. Диетичен заместител еъглаено претенция 72 или претенция 74, където посоченият диетичен заместител се въвежда на човек или животно.
  76. 76. Метод за лечение на пациент в съетояние, причинено от недостатъчно приемане или продукция на полиненаситени мастни киселини, включващ въвеждане на посочения пациент на посоченият диетичен заместител от претенция 72 или посочената диетична добавка, съгласно претенция 68 в количество, достатъчно да доведе до посоченото излекуване.
  77. 77. Метод еъглаено претенция 72, където посоченият диетичен заместител или посочената диетична добавка се въвежда ентерално или парентерално.
  78. 78. Козметичен състав, включващ посоченото микробиално масло или негова фракция съгласно претенция 56.
  79. 79. Козметичен състав еъглаено претенция 78, който ее прилага локално.
  80. 80. фармацевтичен състав съгласно претенция 58, където посоченият фармацевтичен състав се въвежда на човек или животно.
  81. 81. Животинска храна, включваща посоченото микробиално маело или негова фракция съгласно претенция 56.
  82. 82. Метод еъглаено претенция 54, където посочената гъба е от вида Mortierella.
  83. 83. Метод съгласно претенция 82, където посочената гъба е Mortierella alpina.
    1ЯП
    181
  84. 84. Изолирана нуклеотидна последователност, подбрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:13 и SEQ ID NO: 15.
  85. 85. Изолирана нуклеотидна последователност от групата, състояща се от групата, състояща се от SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 19.
  86. 86. Изолирана нуклеотидна последователност, включваща нуклеотидна последоватленост, подбрана от групата, състояща се от групата, състояща се от : SEQ ID NO:
    φ 13; SEQ ID N0:15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO:
    21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26 u SEQ ID NO: 27.
  87. 87. Изолирана пептидна последоватленост, включваща пептидна последоватленост, подбрана от групата, състояща се от: SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33 u SEQ ID NO: 34.
  88. 88. Пречистени полипептиди, продуцирани от нуклеотидните последователности от претенции 84- 86.
BG103796A 1997-04-11 1999-10-11 Методи и състави за синтез на дълговерижни полиненаситени мастни киселини BG103796A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/833,610 US5972664A (en) 1997-04-11 1997-04-11 Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
PCT/US1998/007422 WO1998046765A1 (en) 1997-04-11 1998-04-10 Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG103796A true BG103796A (bg) 2000-05-31

Family

ID=25264859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG103796A BG103796A (bg) 1997-04-11 1999-10-11 Методи и състави за синтез на дълговерижни полиненаситени мастни киселини

Country Status (24)

Country Link
US (2) US5972664A (bg)
EP (1) EP1007691B1 (bg)
JP (1) JP4453881B2 (bg)
KR (2) KR20010006258A (bg)
CN (1) CN1253587A (bg)
AT (1) ATE277188T1 (bg)
AU (1) AU720725B2 (bg)
BG (1) BG103796A (bg)
BR (1) BR9809083A (bg)
CA (1) CA2286263A1 (bg)
DE (1) DE69826494T2 (bg)
DK (1) DK1007691T3 (bg)
ES (1) ES2229491T3 (bg)
HU (1) HUP0001295A3 (bg)
IL (1) IL132149A0 (bg)
IN (1) IN1998KO00639A (bg)
NO (1) NO994924L (bg)
NZ (1) NZ337458A (bg)
PL (1) PL336067A1 (bg)
PT (1) PT1007691E (bg)
SI (1) SI1007691T1 (bg)
SK (1) SK139799A3 (bg)
TR (1) TR199902466T2 (bg)
WO (1) WO1998046765A1 (bg)

Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6483008B1 (en) * 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5968809A (en) * 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
CA2315297A1 (en) * 1997-12-23 1999-07-08 University Of Bristol Desaturase
US20030152983A1 (en) * 1997-12-23 2003-08-14 University Of Bristol Desaturase
CA2329159A1 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Bruce Kelder Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products
US6459018B1 (en) 1998-06-12 2002-10-01 Monsanto Technology Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US6677145B2 (en) * 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
WO2000020603A1 (en) * 1998-10-05 2000-04-13 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
WO2000020602A2 (en) * 1998-10-05 2000-04-13 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
US6140081A (en) * 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
WO2001004636A1 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 Ohio University Mammalian cells expressing desaturases and elongases
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
IL150414A0 (en) 2000-02-09 2002-12-01 Basf Ag Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acid
PT1322752E (pt) * 2000-09-28 2010-05-06 Bioriginal Food & Science Corp Fad4, fad5, fad5-2 e fad6, novos membros da família de dessaturases de ácidos gordos e susas utilizações
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
BR0205508A (pt) * 2001-01-25 2005-05-03 Abbott Lab Genes para dessaturase e usos dos mesmos
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
DE50312241D1 (de) * 2002-01-30 2010-01-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter f
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
JP4515904B2 (ja) 2002-05-22 2010-08-04 モンサント テクノロジー エルエルシー 真菌からの脂肪酸不飽和化酵素
BR0317304A (pt) 2002-12-19 2005-11-08 Univ Bristol Processo para a produção de compostos, sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácidos, construção gênica, vetor, e, organismo
US20040172682A1 (en) * 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
US8084074B2 (en) * 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
BRPI0407138A (pt) 2003-02-27 2006-01-10 Basf Plant Science Gmbh Sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo transgênico não humano, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeo, ou um ácido graxo poliinsaturado ou uma fração dos mesmos, composições de óleo, de lipìdeos, ou de ácido graxo, e, uso do óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou de composições de óleo, de lipìdeos ou de ácido graxo
ES2421138T3 (es) 2003-03-31 2013-08-29 University Of Bristol Nuevas aciltransferasas vegetales específicas para ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga
BRPI0409209A (pt) 2003-04-08 2006-03-28 Basf Plant Science Gmbh seqüência de ácido nucleico isolado, construto de gene, vetor, organismo não-humano transgênico, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou uma fração dos mesmos, composição de óleo, de lipìdeo ou de ácido graxo, e, uso de óleo, de lipìdeos ou de ácidos graxos ou de composição de óleo, de lipìdeo ou de ácido graxo
US7238482B2 (en) * 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) * 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
EP2166069B2 (de) 2003-08-01 2024-01-24 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
ES2323644T3 (es) * 2003-08-21 2009-07-22 Monsanto Technology Llc Desaturasas de acidos grasos procedentes de primula.
WO2005047480A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
EP2868749B1 (en) 2004-01-20 2017-10-04 Monsanto Technology LLC Chimeric promoters for use in plants
WO2005083053A2 (de) 2004-02-27 2005-09-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen
JP4567047B2 (ja) 2004-02-27 2010-10-20 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法
ES2541537T3 (es) 2004-04-16 2015-07-21 Monsanto Technology, Llc Expresión de desaturasas de ácido graso en maíz
BR122019013214B1 (pt) 2004-04-22 2022-04-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polinucleotídeo isolado, vetor, célula recombinante, método para produzir uma célula recombinante, método para produzir um ou mais ácido graxo(s) poliinsaturado de cadeia longa, método para produzir uma semente transgênica, método para produzir óleo, método para produzir uma semente oleaginosa, extrato da semente transgênica, composição compreendendo o referido extrato, ração e uso da referida célula recombinante ou extrato
US7807849B2 (en) 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
US20050266051A1 (en) * 2004-05-27 2005-12-01 The Procter & Gamble Company Pet food compositions and methods
PT1766023E (pt) * 2004-06-04 2010-12-09 Fluxome Sciences As Células metabolicamente manipuladas para a produção de ácidos gordos poliinsaturados
WO2006012326A1 (en) 2004-06-25 2006-02-02 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
CA2598792A1 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
EP1885862B1 (en) 2005-05-23 2015-07-29 Arcadia Biosciences Inc. Safflower with elevated gamma-linolenic acid
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
CA2625855C (en) 2005-11-23 2016-04-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7723574B2 (en) 2005-11-24 2010-05-25 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of Δ5-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
EP1991047B1 (en) 2006-03-01 2012-09-26 Pioneer Hi-Bred International Inc. Compositions related to the quantitative trait locus 6 (qtl6) in maize and methods of use
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
US7943823B2 (en) * 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
EP2027275A2 (en) 2006-05-16 2009-02-25 Monsanto Technology, LLC Use of non-agrobacterium bacterial species for plant transformation
US7678560B2 (en) 2006-05-17 2010-03-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ 5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7695950B2 (en) * 2006-05-17 2010-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
BRPI0714390B1 (pt) * 2006-07-19 2018-05-15 Monsanto Technology Llc Polinucleotídeo, construção de dna, célula hospedeira fúngica ou bacteriana, processo para produção de alimento ou de produto alimentício e composição para alimento ou produto alimentício
WO2008022963A2 (en) 2006-08-24 2008-02-28 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
WO2008025068A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
ES2531391T3 (es) 2006-10-06 2015-03-13 Basf Plant Science Gmbh Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos
PL2390339T3 (pl) 2006-10-23 2013-12-31 Du Pont Delta-8 desaturazy i ich zastosowanie w wytwarzaniu polinienasyconych kwasów tłuszczowych
WO2008100545A2 (en) 2007-02-12 2008-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of arachidonic acid in oilseed plants
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
EP3290520B1 (en) 2007-03-09 2021-07-14 Monsanto Technology LLC Preparation and use of plant embryo explants for transformation
US8188338B2 (en) 2007-04-10 2012-05-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7794701B2 (en) 2007-04-16 2010-09-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8957280B2 (en) 2007-05-03 2015-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
CA2695112A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongases and processes for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP2222856A2 (en) 2007-12-14 2010-09-01 BASF Plant Science GmbH Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
CN102016049B (zh) 2008-04-07 2013-08-21 孟山都技术公司 植物调控元件及其应用
EP2271223A2 (de) * 2008-04-25 2011-01-12 BASF Plant Science GmbH Pflanzensamenöl
WO2009133145A1 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Basf Plant Science Gmbh Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US8168858B2 (en) * 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2664668A1 (en) 2008-06-27 2013-11-20 Sapphire Energy, Inc. Induction of flocculation in photosynthetic organisms
EP2318533A2 (en) 2008-07-01 2011-05-11 BASF Plant Science GmbH Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
WO2010023202A2 (en) 2008-08-26 2010-03-04 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
BRPI0913714A2 (pt) 2008-09-19 2020-10-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company polipeptídeo mutante que possui atividade de a5 dessaturase, molécula de ácido nucleico isolada, célula hospedeira microbiana e métodos de produção de ácido araquidônico e de ácido eicosapentaenoico
CA2743880C (en) 2008-11-18 2020-08-18 James Robertson Petrie Recombinant cells comprising exogenous a5 elongase and methods for producing docosapentaenoic acid
AU2009326129B2 (en) 2008-12-12 2016-05-12 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US8060617B2 (en) * 2008-12-19 2011-11-15 Cisco Technology, Inc. Reserving network resources during scheduling of meeting event
WO2010099431A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Monsanto Technology Llc Hydroponic apparatus and methods of use
AU2010247438B2 (en) 2009-05-13 2015-01-29 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
WO2011050271A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
BR122021001271B1 (pt) 2010-01-14 2022-02-08 Monsanto Technology Llc Molécula de dna compreendendo elementos reguladores de plantas
WO2011161093A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses therof in fatty acid production
KR20130138760A (ko) 2010-08-26 2013-12-19 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 고농도의 에이코사펜타엔산 생성을 위한 재조합 미생물 숙주 세포
US8658413B2 (en) 2010-08-26 2014-02-25 E I Du Pont De Nemours And Company Mutant HPGG motif and HDASH motif delta-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
AR082784A1 (es) 2010-08-30 2013-01-09 Agrigenetics Inc Potenciador viral baciliforme de caña de azucar (scbv) y su uso en la genomica funcional de plantas
BR112013015247B1 (pt) 2010-12-17 2021-11-23 Monsanto Technology Llc Método para melhorar a competência de células de milho para transformação mediada por bactérias
HUE035893T2 (en) 2011-03-25 2018-05-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and their applications
ES2669918T3 (es) 2011-05-13 2018-05-29 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos
AU2013202941B2 (en) 2012-02-29 2015-06-25 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (SCBV) enhancer and its use in plant functional genomics
CA2869738C (en) 2012-04-12 2022-04-05 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
US9663793B2 (en) 2012-04-20 2017-05-30 Monsanto Technology, Llc Plant regulatory elements and uses thereof
MY187101A (en) 2012-06-15 2021-08-31 Commw Scient Ind Res Org Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
CA3062365C (en) 2012-12-19 2022-03-29 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
ES2769898T3 (es) 2013-03-14 2020-06-29 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores en plantas y usos de los mismos
NZ711986A (en) 2013-03-14 2020-08-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
LT3101138T (lt) * 2013-12-04 2021-07-26 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Mikrobinis aliejus, mikrobinio aliejaus gamybos būdas, koncentruotas mikrobinis aliejus, ir koncentruoto mikrobinio aliejaus gamybos būdas
UA122768C2 (uk) 2013-12-18 2021-01-06 Коммонвелз Сайнтіфік Енд Індастріал Рисерч Организейшн Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти
AU2015281791A1 (en) 2014-06-27 2017-01-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
MX2017003660A (es) * 2014-09-30 2017-06-26 Nestec Sa Composicion nutricional que se usa para promover la maduracion y/o reparacion del intestino y/o del higado.
US11519011B2 (en) 2015-03-26 2022-12-06 The Texas A&M University System Conversion of lignin into bioplastics and lipid fuels
EP3341483B1 (en) 2015-08-28 2019-12-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
US11732269B2 (en) 2015-10-02 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Recombinant maize B chromosome sequence and uses thereof
NZ745763A (en) 2016-03-11 2022-08-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CR20180607A (es) 2016-05-24 2019-03-26 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y sus usos
EP3475427A4 (en) 2016-06-28 2019-11-06 Monsanto Technology LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN GENOME MODIFICATION OF PLANTS
CA3029271A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
EP3737747A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 The Texas A&M University System Increasing plant bioproduct yield
AR125216A1 (es) 2021-03-26 2023-06-28 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Producción de polirribonucleótidos circulares en un sistema eucariota
TW202305130A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 原核系統中環狀多核糖核苷酸之產生
EP4314281A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system
AU2022375817A1 (en) 2021-11-01 2024-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023141540A2 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof
WO2024091091A1 (ko) * 2022-10-28 2024-05-02 올케어플러스 주식회사 동물용 영양식 조성물 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3649295A (en) * 1970-06-01 1972-03-14 American Home Prod Humanized fat compositions and infant formulas thereof
US4058594A (en) * 1974-04-25 1977-11-15 John Williams Immuno-suppressive agents
EP0092076B1 (fr) * 1982-04-16 1986-12-17 Societe Des Produits Nestle S.A. Composition lipidique destinée à l'alimentation orale, entérale ou parentérale
US4670285A (en) * 1982-08-06 1987-06-02 The University Of Toronto Innovations Foundation Infant formula
GB8317248D0 (en) * 1983-06-24 1983-07-27 Wyeth John & Brother Ltd Fat compositions
US4526902A (en) * 1983-10-24 1985-07-02 Century Laboratories, Inc. Combined fatty acid composition for treatment or prophylaxis of thrombo-embolic conditions
US4920098A (en) * 1986-09-17 1990-04-24 Baxter International Inc. Nutritional support or therapy for individuals at risk or under treatment for atherosclerotic vascular, cardiovascular, and/or thrombotic diseases
US4843095A (en) * 1987-08-07 1989-06-27 Century Laboratories, Inc. Free fatty acids for treatment or propyhlaxis of rheumatoid arthritis arthritis
US5057419A (en) * 1988-09-22 1991-10-15 Rutgers University Genetically engineered plasmid and organisms for the production of specialized oils
US5407957A (en) * 1990-02-13 1995-04-18 Martek Corporation Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates
US5512482A (en) * 1990-04-26 1996-04-30 Calgene, Inc. Plant thioesterases
CA2083259C (en) * 1990-05-25 2007-05-15 William D. Hitz Nucleotide sequence of soybean stearoyl-acp desaturase gene
ZA92452B (en) * 1991-01-24 1992-10-28 Martek Corp Microbial oil mixtures and uses thereof
US5658767A (en) 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
JPH0591886A (ja) * 1991-09-30 1993-04-16 Suntory Ltd ８，１１−エイコサジエン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
PH31293A (en) * 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US5614393A (en) * 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
JPH0614667A (ja) * 1992-03-13 1994-01-25 Lubrizol Corp:The デサチュラーゼを使用しての植物油の改変
JP3818540B2 (ja) 1992-11-17 2006-09-06 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来のミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼおよび関連酵素の遺伝子
CA2150133A1 (en) * 1993-02-05 1994-08-18 Vincent Jean-Marie Armel Arondel Altered linolenic and linoleic acid content in plants
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US5654402A (en) * 1994-10-26 1997-08-05 Michigan State University Methods and compositions relating to plant Δ6 palmitoyl-acyl carrier protein desaturase

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998046765A1 (en) 1998-10-22
US6589767B1 (en) 2003-07-08
PT1007691E (pt) 2005-02-28
JP2001523092A (ja) 2001-11-20
AU7114898A (en) 1998-11-11
HUP0001295A3 (en) 2003-10-28
DE69826494D1 (de) 2004-10-28
BR9809083A (pt) 2000-08-01
IL132149A0 (en) 2001-03-19
PL336067A1 (en) 2000-06-05
DE69826494T2 (de) 2006-03-09
IN1998KO00639A (bg) 2005-03-18
MX9909327A (es) 2000-04-30
AU720725B2 (en) 2000-06-08
EP1007691B1 (en) 2004-09-22
SK139799A3 (en) 2000-05-16
TR199902466T2 (xx) 2000-07-21
KR20010006258A (ko) 2001-01-26
ATE277188T1 (de) 2004-10-15
HUP0001295A1 (en) 2000-07-28
NO994924D0 (no) 1999-10-08
KR20010006255A (ko) 2001-01-26
EP1007691A1 (en) 2000-06-14
NZ337458A (en) 2000-07-28
CA2286263A1 (en) 1998-10-22
ES2229491T3 (es) 2005-04-16
NO994924L (no) 1999-11-30
DK1007691T3 (da) 2004-12-20
JP4453881B2 (ja) 2010-04-21
CN1253587A (zh) 2000-05-17
SI1007691T1 (en) 2005-02-28
US5972664A (en) 1999-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4453881B2 (ja) 長鎖多不飽和脂肪酸の合成のための方法および組成物
JP4355368B2 (ja) 長鎖多不飽和脂肪酸の合成のための方法および組成物
ES2403154T3 (es) Métodos y composiciones para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en plantas
MXPA99009329A (en) Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids
WO1998046765A9 (en) Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids
JP4959903B2 (ja) エロンガーゼ遺伝子およびその用途
US6432684B1 (en) Human desaturase gene and uses thereof
WO1998046763A9 (en) Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids
US6428990B1 (en) Human desaturase gene and uses thereof
WO1998046764A9 (en) Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
WO2000020603A1 (en) Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
CZ358299A3 (cs) Izolovaná nukleová kyselina
CZ358399A3 (cs) Způsoby a kompozice pro syntézu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhými řetězci
MXPA99009327A (es) Metodos y composiciones para la sintesis de acidos grasos poli-insaturados de cadena larga
CZ358499A3 (cs) Způsoby a kompozice pro syntézu poly-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem v rostlinách
MXPA99009328A (es) Métodos y composiciones para la síntesis deácidos grasos poli-insaturados de cadena larga en plantas