ES2258816T3 - Procedimiento y composicion para la sintesis de acidos grasos polisaturados de cadena larga. - Google Patents

Procedimiento y composicion para la sintesis de acidos grasos polisaturados de cadena larga.

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ES2258816T3 ES98915430T ES98915430T ES2258816T3 ES 2258816 T3 ES2258816 T3 ES 2258816T3 ES 98915430 T ES98915430 T ES 98915430T ES 98915430 T ES98915430 T ES 98915430T ES 2258816 T3 ES2258816 T3 ES 2258816T3
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Abstract

La invención se refiere a desaturasa de ácidos grasos capaz de catalizar la conversión de ácido oleico a ácido linoleico, de ácido linoleico a ácido gama-linoleico o de alfa-linoleico a ácido estearidónico. La invención se refiere también a las secuencias de ácido nucleico que codifica las desaturasas, las secuencias del ácido nucleico con que se híbrida a estas primeras secuencias, las construcciones de ADN que comprenden un gen de desaturasa y un microorganismo o un animal anfitrión que experimenta el aumento de niveles de desaturasa. La invención se refiere también a otros procedimientos de desaturación de un ácido graso y la producción de un ácido graso desaturado mediante la expresión del aumento de niveles de desaturasa. La invención se refiere también a los ácidos grasos y los aceites contenidos en tales ácidos que han sido desaturados mediante un producto de desaturasa por la recombinación de microorganismos o animales anfitriones. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas, las fórmulas infantiles o de complemento alimentario que contienen los ácidos grasos que han sido desaturados por un producto de desaturasa mediante la recombinación de microorganismos o animales anfitriones.

Description

Procedimiento y composición para la síntesis de ácidos grasos polisaturados de cadena larga.
Solicitud relacionada
Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Número de Serie 08/834.655 presentada el 11 de abril de 1997.
Introducción Campo de la invención
Esta invención se refiere a la modulación de niveles de enzimas y/o componentes de enzimas relacionados con la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) en un microorganismo o animal.
Antecedentes
Los ácidos grasos \omega3, ejemplificados por el ácido eicosapentaenoico (EPA), y los ácidos grasos \omega6, ejemplificados por el ácido araquidónico (ARA) son dos familias principales de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de las células, en donde pueden hallarse en formas tales como los fosfolípidos. Los PUFA son necesarios para un correcto desarrollo, particularmente en el cerebro en desarrollo de los niños, y para la formación y reparación de tejidos. Los PUFA también sirven como precursores de otras moléculas importantes en los seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, los eicosanoides, los leucotrienos, y las prostaglandinas. Los cuatro PUFA de cadena larga principales incluyen el ácido docosahexaenoico (DHA) y el EPA, los cuales se hallan primordialmente en diferentes tipos de aceites de pescado, el ácido gamma-linolénico (GLA), el cual se halla en las semillas de un cierto número de plantas, incluyendo la onagra (Oenothera biennis), la borraja (Borago officinalis) y el grosellero negro (Ribes nigrum), y el ácido estearidónico (SDA), el cual se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas. Tanto el GLA como otro importante PUFA de cadena larga, el ácido araquidónico (ARA), se hallan en los hongos filamentosos. El ARA puede purificarse a partir de tejidos animales, incluyendo el hígado y la glándula adrenal. El GLA, el ARA, el EPA y el SDA son ellos mismos ácidos grasos de cadena larga importantes, o son precursores en la dieta de ácidos grasos de cadena larga importantes, implicados en la síntesis de prostaglandinas, en el tratamiento de enfermedades cardíacas, y en el desarrollo del tejido cerebral.
Para el DHA, existen un cierto número de fuentes para su producción comercial, incluyendo una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos a partir de peces marinos de aguas frías, y fracciones de la yema del huevo. Para el ARA, pueden usarse microorganismos, incluyendo el género Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium, para su producción comercial. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen la onagra, el grosellero negro, y la borraja. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como los animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes pueden por tanto requerir una purificación extensa para separar uno o más PUFA deseados, o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFA. Las fuentes naturales están sometidas también a fluctuaciones incontrolables en su disponibilidad. Las reservas de peces pueden experimentar variaciones naturales o pueden agotarse por sobrepesca. Los aceites de peces tienen gustos y olores desagradables, los cuales pueden ser imposibles de separar económicamente del producto deseado, y pueden hacer tales productos inaceptables como suplementos nutricionales. Los aceites animales, y particularmente los aceites de peces, pueden acumular contaminantes medioambientales. El tiempo y las enfermedades pueden causar fluctuaciones en los rendimientos de ambas fuentes, peces y plantas. La tierra cultivable disponible para la producción de cultivos alternativos productores de aceite está sometida a la competición procedente de la continua expansión de las poblaciones humanas y de la creciente necesidad asociada a la producción de alimentos en las tierras arables restantes. Los cultivos que sí producen PUFA, tales como la borraja, no han sido adaptados al crecimiento comercial y pueden no comportarse bien en monocultivo. El crecimiento de tales cultivos es por tanto económicamente no competitivo cuando pueden cultivarse cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella también es cara. Los tejidos animales naturales contienen cantidades bajas de ARA y son difíciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difíciles de cultivar a escala comercial.
Los suplementos dietarios y las formulaciones farmacéuticas que contienen PUFA pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA. Los suplementos tales como las cápsulas de aceite de pescado pueden contener niveles bajos del componente concreto deseado y, por tanto, requerir dosis elevadas. Las dosis elevadas pueden dar lugar a la ingestión de niveles elevados de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Los sabores y olores desagradables de los suplementos pueden hacer indeseables tales regímenes, y pueden inhibir su cumplimiento por parte del paciente. Debe tenerse cuidado al proporcionar suplementos de ácidos grasos, puesto que la sobreadición puede dar lugar a la supresión de las vías biosintéticas endógenas y conducir a una competición con otros ácidos grasos necesarios en varias fracciones de lípidos in vivo, conduciendo a resultados no deseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta elevada en ácidos grasos \omega3 tienen una tendencia incrementada a sangrar (Patente estadounidense nº 4.874.603).
Un cierto número de enzimas están implicados en la biosíntesis de los PUFA. El ácido linoleico (LA; 18:2 \Delta9, 12) se produce a partir del ácido oleico (18:1 \Delta9) mediante una \Delta12-desaturasa. El GLA (18:3 \Delta6, 9, 12) se produce a partir del ácido linoleico (LA, 18:2 \Delta9, 12) mediante una \Delta6-desaturasa. La producción del ARA (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) a partir del ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA; 20:3 \Delta8, 11, 14) está catalizada por una \Delta5-desaturasa. Sin embargo, ciertos animales no pueden desaturar más allá de la posición \Delta9 y por tanto no pueden convertir el ácido oleico (18:1 \Delta9) en ácido linoleico (18:2 \Delta9, 12). De igual forma, el ácido \alpha-linolénico (ALA, 18:3 \Delta9, 12, 15) no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariotas, incluyendo los hongos y las plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones \Delta12 y \Delta15. Por tanto, los principales ácidos grasos poliinsaturados de los animales se derivan de la dieta y/o de la desaturación y elongación del ácido linoleico (18:2 \Delta9, 12) o del ácido \alpha-linolénico (18:3 \Delta9, 12, 15). Por tanto, tiene interés obtener material genético implicado en la biosíntesis de los PUFA a partir de especies que producen naturalmente estos ácidos grasos, y expresar el material aislado en un sistema microbiano o animal que pueda manipularse para proporcionar la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA. Por tanto, hay una necesidad de desaturasas de ácidos grasos, de genes que las codifican, y de procedimientos recombinantes para producirlas. Existe una necesidad adicional de aceites que contengan proporciones relativas mayores de, y/o enriquecidos en, PUFA específicos. También existe una necesidad de procedimientos económicos fiables para producir PUFA específicos.
Literatura relevante
La producción de ácido gamma-linolénico mediante una \Delta6-desaturasa se describe en la USPN 5.552.306. La producción de ácido 8,11-eicosadienoico usando Mortierella alpina se describe en la USPN 5.376.541. La producción de ácido docosahexaenoico por parte de dinoflagelados se describe en la USPN 5.407.957. La clonación de una \Delta6-desaturasa de proteína portadora de palmitoilacilo se describe en la publicación del PCT WO-96/13.591 y en la USPN 5.614.400. La clonación de una \Delta6-desaturasa procedente de borraja se describe en la publicación del PCT WO-96/21.022. La clonación de \Delta9-desaturasas se describe en las solicitudes de patentes publicadas del PCT WO-91/13.972, EP-0.550.162-A1, EP-0.561.569-A2, EP-0.644.263.A2, y EP-0.736.598-A1, y en la USPN 5.057.419. La clonación de \Delta12-desaturasas procedentes de varios organismos se describe en la publicación del PCT WO-94/11.516 y en la USPN 5.443.974. La clonación de \Delta15-desaturasas procedentes de varios organismos se describe en la publicación del PCT WO-93/11.245. Todas las publicaciones y patentes o solicitudes estadounidenses mencionadas en la presente se incorporan en su totalidad por referencia en la presente.
Descripción resumida de la invención
Se proporcionan nuevos polipéptidos, ácidos nucleicos, construcciones de ácidos nucleicos, células huéspedes y procedimientos para la preparación de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados. Éstos incluyen ácidos nucleicos que codifican una \Delta6- y \Delta12-desaturasa y polipéptidos que tienen actividad \Delta6- y/o \Delta12-desaturasa. Los procedimientos implican el cultivo de un microorganismo o animal huésped que expresan un gen o genes introducidos que codifican al menos una desaturasa, particularmente una \Delta6- o \Delta12-desaturasa. La regulación de la expresión del polipéptido o polipéptidos de desaturasa proporciona un incremento relativo en los PUFA desaturados deseados como resultado de unas concentraciones alteradas de los enzimas y sustratos implicados en la biosíntesis de los PUFA. Esta invención tiene utilidad, por ejemplo, en la producción a gran escala de GLA y SDA.
Por tanto, en una aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado o aislado que es capaz de desaturar una molécula de ácido graso en los carbonos 6 ó 12 a partir del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2 o los 399 aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 4.
Preferiblemente, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de SEC. Nº ID.: 2 o la secuencia de 399 aminoácidos de SEC. Nº ID.: 4. Más preferiblemente, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de SEC. Nº ID.: 2 o la secuencia de 399 aminoácidos de SEC. Nº ID.: 4.
Preferiblemente, dicho polipéptido que tiene al menos un 60%, al menos un 80%, o al menos un 90% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de SEC. Nº ID.: 2, incluye un motivo de aminoácidos seleccionado de entre el grupo consistente en los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. Nº ID.: 2. Más preferiblemente, dicho polipéptido comprende los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. Nº ID.: 2. Incluso más preferiblemente, dicho polipéptido comprende la SEC. Nº ID.: 2.
En otro aspecto la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de la invención. En una realización preferida, el ácido nucleico aislado se deriva de un hongo, tal como un hongo del género Mortierella. Más preferido es un hongo de la especie Mortierella alpina. Preferiblemente, el polipéptido de la invención es un polipéptido eucariota o se deriva de un polipéptido eucariota, en donde un polipéptido eucariótico preferido se deriva de un hongo.
Preferiblemente, el ácido nucleico aislado de la invención se híbrida con la Figura 3A-E (SEC. Nº ID.: 1) o Figura 5A-D (SEC. Nº ID.: 3). Preferiblemente, el ácido nucleico aislado tiene una secuencia nucleotídica con al menos aproximadamente el 50% de homología con la Figuras 3A-E (SEC. Nº ID.: 1) o Figura 5A-D (SEC. Nº ID.: 3). Más preferiblemente, el ácido nucleico aislado comprende la SEC. Nº ID.: 1 ó SEC. Nº ID.: 3.
También se proporciona mediante la presente invención una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de la invención unido operativamente a un promotor. En otra realización, la invención proporciona una célula huésped transformada con la construcción de la invención. La célula huésped es eucariótica o procariótica. Las células huéspedes eucariotas preferidas son aquéllas seleccionadas de entre el grupo consistente en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de hongo, y una célula de alga. Las células de mamífero preferidas incluyen una célula de ave, una célula de hongo preferida incluye una célula de levadura, y una célula de alga preferida es una célula de alga marina. Las células procariotas preferidas incluyen aquéllas seleccionadas de entre el grupo consistente en una bacteria, una cianobacteria, células que contienen un bacteriófago, y/o un virus. El promotor es preferiblemente inducible. En una realización más preferida, la célula microbiana es una célula de hongo del género Mortierella, siendo un hongo más preferido de la especie Mortierella alpina.
Otra célula huésped recombinante preferida es una célula tal como una célula de levadura, tal como una célula de Saccharomyces.
Preferiblemente, la célula huésped de la invención es una célula microbiana recombinante que comprende al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una desaturasa de ácido graso funcionalmente activo de Morteriella alpina que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se ilustra en la Figura 3A-E (SEC. Nº ID.: 2), en donde la célula o una célula parental se transformaron con un vector que comprendía dicha secuencia de ADN, y en donde la secuencia de ADN está operativamente unida a una secuencia de control de la expresión. En una realización preferida, la célula es una célula microbiana que está enriquecida en ácidos grasos 18:2, particularmente cuando la célula microbiana procede de un género seleccionado de entre el grupo consistente en una célula procariota y una célula eucariota. En otra realización preferida, la célula microbiana según la invención incluye una secuencia de control de la expresión que es endógena para la célula microbiana.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de GLA en una célula huésped, en donde el procedimiento comprende: hacer crecer un cultivo de células huéspedes de la invención que producen una \Delta6-desaturasa en presencia de ácido linoleico, en condiciones en las que dicho ácido se convierte en ácido gamma linoleico mediante la expresión del polipéptido de dicha desaturasa; y recuperar el ácido graso ácido gamma linoleico del cultivo. Preferiblemente, el ácido o ácidos nucleicos que codifican la \Delta6-desaturasa se derivan de Morteriella alpina; el sustrato para el polipéptido se aporta exógenamente; las células huéspedes son células microbianas; las células microbianas son células de levadura, tales como células de Saccharomyces; y las condiciones de crecimiento son inducibles.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción del ácido graso ácido linoleico, procedimiento que comprende: hacer crecer un cultivo de células huéspedes de la invención que producen una \Delta12-desaturasa en presencia de ácido oléico, en condiciones en las que dicho ácido se convierte en ácido linoleico mediante la expresión del polipéptido de dicha desaturasa; y recuperar el ácido graso ácido linoleico del cultivo. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una célula huésped microbiana de la invención para la producción de un ácido graso.
Preferiblemente, los procedimientos de la invención comprenden además formular el ácido graso en un producto seleccionado de entre: composición farmacéutica que comprende el aceite en un portador farmacéuticamente aceptable; una composición nutricional comprende el aceite; y una fórmula para bebés. Las composiciones nutricionales preferiblemente se administran a un huésped mamífero parenteral o internamente. En una realización preferida, las composiciones nutricionales están en una forma líquida o en una forma sólida, y pueden formularse en o como un suplemento dietético, y el aceite se proporciona en forma encapsulada. El aceite puede estar libre de componentes particulares de otros aceites, y puede derivarse a partir de una célula microbiana, tal como una célula de levadura.
Por tanto, el procedimiento de la invención preferiblemente comprende además formular el ácido graso en fórmulas nutricionales o fórmulas para bebés, suplementos dietéticos o suplementos dietéticos en forma de un líquido o sólido que contiene los ácidos grasos de cadena larga descritos en la presente. Estas formulas y suplementos pueden administrarse a un humano o a un animal.
Las fórmulas y suplementos de la invención pueden comprender además al menos un macronutriente seleccionado del grupo consistente en aceite de coco, aceite de soja, aceite de colza, mono- y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de leche, proteína de soja, y otros hidrolizados de proteína.
Las fórmulas de la presente invención pueden comprender además al menos una vitamina seleccionada del grupo consistente en las Vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
Un paciente que tiene una condición causada por una ingesta o producción insuficiente de ácidos grasos poliinsaturados puede tratarse mediante la administración al paciente de un sustituto dietario, obtenido de acuerdo con los procedimientos de la invención, en una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento del paciente.
Los procedimientos de la presente invención pueden comprender además formular el ácido graso en cosméticos y composiciones farmacéuticas.
Por tanto, los aceites transgénicos en portadores farmacéuticamente aceptables, los suplementos nutricionales, los agentes cosméticos, y las fórmulas infantiles que contienen aceites transgénicos pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención.
Las composiciones farmacéuticas que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención pueden comprender al menos un nutriente seleccionado de entre el grupo consistente en una vitamina, un mineral, una carbohidrato, un azúcar, un aminoácido, un ácido graso libre, un fosfolípido, un antioxidante, y un compuesto fenólico.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra las posibles vías para la síntesis del ácido araquidónico (20:4 \Delta5, 8, 11, 14) y el ácido estearidónico (18:4 \Delta6, 9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (C_{16}) en una variedad de organismos, incluyendo las algas, Mortierella y humanos.
Estos PUFA pueden servir como precursores de otras moléculas importantes para los humanos y otros animales, incluyendo las prostaciclinas, los leucotrienos, y las prostaglandinas, algunas de las cuales se muestran.
La Figura 2 muestra las posibles vías para la producción de PUFA además del ARA, incluyendo el EPA y el DHA, compiladas, una vez más, a partir de una variedad de organismos.
La Figura 3A-E muestra la secuencia de ADN de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida:
Figura 3A-E (SEC. Nº ID. 1, ADNc de la \Delta6-desaturasa)
Figura 3A-E (SEC. Nº ID. 2, aminoácidos de la \Delta6-desaturasa)
La Figura 4 muestra un alineamiento de una porción de la secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa de Morteriella alpina con otras secuencias relacionadas.
La Figura 5A-D muestra la secuencia de ADN de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminoácidos deducida:
Figura 5A-D (SEC. Nº ID. 3, ADNc de la \Delta12-desaturasa)
Figura 5A-D (SEC. Nº ID. 4, aminoácidos de la \Delta12-desaturasa)
Las Figuras 6A y 6B muestran el efecto de diferentes construcciones de expresión sobre la expresión de GLA en levadura.
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto de la cepa del huésped sobre la producción de GLA.
Las Figuras 8A y 8B muestran el efecto de la temperatura sobre la producción de GLA en la cepa SC334 de Saccharomyces cerevisiae.
La Figura 9 muestra los alineamientos de la secuencia de proteína de Ma 29 y contig 253538a.
La Figura 10 muestra los alineamientos de la secuencia de proteína de Ma 524 y contig 253538a.
Breve descripción de los listados de secuencias
La SEC. Nº ID. 1 muestra una secuencia de ADN de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina.
La SEC. Nº ID. 2 muestra una secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina.
La SEC. Nº ID. 3 muestra una secuencia de ADN de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina.
La SEC. Nº ID. 4 muestra una secuencia de aminoácidos de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina.
Las SEC. Nº ID. 5-11 muestran varias secuencias de desaturasas.
Las SEC. Nº ID. 13-18 muestran varias secuencias de cebadores de la PCR.
Las SEC. Nº ID. 19 y SEC. Nº ID. 20 muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una desaturasa de Dictyostelium discoideum.
Las SEC. Nº ID. 21 y SEC. Nº ID. 22 muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una desaturasa de Phaeodactylum tricornutum.
Las SEC. Nº ID. 23-26 muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducida de un clon de ADNc de Schizochytrium.
Las SEC. Nº ID. 27-33 muestran las secuencias de nucleótidos de desaturasas humanas.
Las SEC. Nº ID. 34-SEC. Nº ID. 40 muestran las secuencias peptídicas de desaturasas humanas.
Descripción de las realizaciones preferidas
Con objeto de asegurar una completa comprensión de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones:
\Delta5-Desaturasa: la \Delta5-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta6-Desaturasa: la \Delta6-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta9-Desaturasa: la \Delta9-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
\Delta12-Desaturasa: la \Delta12-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 a partir del extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
Ácido graso: los ácidos grasos son una clase de compuestos que contienen una cadena hidrocarbonada larga y un grupo carboxilato terminal. Los ácidos grasos incluyen los siguientes:
Ácidos grasos
12:0 ácido láurico
16:0 ácido palmítico
16:1 ácido palmitoleico
18:0 ácido esteárico
18:1 ácido oleico \Delta9-18:1
18:2 \Delta5,9 ácido taxoleico \Delta5, 9-18:2
18:2 \Delta6,9 ácido 6,9-octadecadienoico \Delta6, 9-18:2
18:2 ácido linoleico \Delta9,12-18:2 (LA)
18:3 \Delta6,9,12 ácido gamma-linolénico \Delta6,9,12-18:3 (GLA)
18:3 \Delta5,9,12 ácido pinolénico \Delta5,9,12-18:3
18:3 ácido alfa-linolénico \Delta6,9,12-18:3 (ALA)
18:4 ácido estearidónico \Delta6,9,12,15-18:4 (SDA)
20:0 ácido araquidónico
20:1 ácido eicosenoico
22:0 ácido behénico
22:1 ácido erúcico
22:2 ácido docosadienoico
20:4 \omega6 ácido araquidónico \Delta5,8,11,14-20:4 (ARA)
20:3 \omega6 \omega6-eicosatrienoico (dihomo-gamma-linolénico) \Delta8,11,14-20:3 (DGLA)
(Continuación)
Ácidos grasos
20:5 \omega3 eicosapentanoico (ácido timnodónico) \Delta5,8,11,14,17-20:5 (EPA)
20:3 \omega3 \omega3-eicosatrienoico \Delta11,16,17-20:3
20:4 \omega3 \omega3-eicosatetraenoico \Delta8,11,14,17-20:4
22:5 \omega3 docosapentaenoico \Delta7,10,13,16,19-22:5 (\omega3DPA)
22:6 \omega3 docosahexaenoico (ácido cervónico) \Delta4,7,10,13,16,19-22:6 (DHA)
24:0 ácido lignocérico
Tomando en consideración estas definiciones, la presente invención se dirige a nuevas secuencias de ADN, construcciones de ADN, y procedimientos. Pueden obtenerse composiciones de acuerdo con los procedimientos de la invención. Las secuencias de ADN, los procedimientos de construcción, y las composiciones permiten la modificación del contenido en ácido graso de cadena larga poliinsaturado de, por ejemplo, células microbianas o animales. Las células huéspedes se manipulan para expresar un transcrito con sentido o antisentido de un ADN que codifica un polipéptido o polipéptidos, los cuales catalizan la desaturación de un ácido graso. El sustrato o sustratos para el enzima expresado pueden ser producidos por la célula huésped o pueden suministrarse exógenamente. Para conseguir la expresión, el ADN transformado está operativamente asociado con regiones de iniciación de la transcripción o de la traducción y de terminación que son funcionales en la célula huésped. Las construcciones que comprenden el gen a ser expresado pueden proporcionar los medios para su integración en el genoma de la célula huésped, o pueden replicarse autónomamente en la célula huésped. Para la producción de ácido linoleico (LA), los casetes de expresión generalmente usados incluyen un casete que proporciona actividad \Delta12-desaturasa, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar ácido oleico (patente estadounidente nº 5.443.974). La producción de LA puede incrementarse proporcionando un casete de expresión para una \Delta9-desaturasa cuando la actividad enzimática es limitante. Para la producción de ALA, los casetes de expresión usados generalmente incluyen un casete que proporciona una actividad \Delta15- u \omega3-desaturasa, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar LA. Para la producción de GLA o SDA, el casete de expresión usado generalmente incluye un casete que proporciona la actividad \Delta6-desaturasa, particularmente en una célula huésped que produce o puede captar respectivamente LA o ALA. La producción de ácidos grasos insaturados del tipo \omega6, tales como el LA o GLA, está favorecida en un microorganismo huésped o animal que es incapaz de producir ALA. La producción de ALA del huésped puede suprimirse, reducirse y/o inhibirse mediante la inhibición de la actividad de una desaturasa del tipo \Delta15- u \omega3-desaturasa (ver Figura 2). Esto puede conseguirse mediante selección estándar, proporcionando un casete de expresión para un transcrito antisentido de \Delta15- u \omega3, o alterando un gen diana de \Delta15- u \omega3-desaturasa a través de la inserción, supresión, sustitución de la totalidad o parte del gen diana, o añadiendo un inhibidor de la \Delta15- u \omega3-desaturasa. De forma similar, la producción de LA o ALA está favorecida en un microorganismo o animal que tenga actividad \Delta6-desaturasa proporcionando un casete de expresión para un transcrito antisentido de \Delta, o alterando un gen de la \Delta6-desaturasa, o mediante el uso de un inhibidor de la \Delta6-desaturasa.
Producción microbiana de ácidos grasos
La producción microbiana de ácidos grasos tiene varias ventajas respecto a la purificación a partir de fuentes naturales tales como los peces o plantas. Se conocen muchos microbios con composiciones de aceites enormemente simplificadas en comparación con aquéllas de organismos superiores, haciendo más fácil la purificación de los componentes deseados. La producción microbiana no está sujeta a fluctuaciones causadas por variables externas tales como el tiempo y el aporte de nutrientes. El aceite producido microbianamente está sustancialmente libre de contaminación por parte de contaminantes medioambientales. Adicionalmente, los microbios pueden proporcionar PUFA en formas particulares que pueden tener usos específicos. Por ejemplo, Spirullina puede proporcionar PUFA predominantemente en las posiciones primera y tercera de los triglicéridos; la digestión mediante lipasas pancreáticas preferentemente libera ácidos grasos en estas posiciones. A continuación de la ingestión humana o animal de triglicéridos derivados de Spirullina, estos PUFA son liberados por las lipasas pancreáticas como ácidos grasos libres y, por tanto, están directamente disponibles para, por ejemplo, el desarrollo cerebral de los niños. Adicionalmente, la producción de aceites microbiana puede manipularse mediante el control de las condiciones de cultivo, notablemente mediante el suministro de sustratos particulares para enzimas expresados microbianamente, o mediante la adición de compuestos que suprimen vías bioquímicas no deseadas. Además de estas ventajas, la producción de ácidos grasos a partir de microbios recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perfil de ácidos grasos que ocurre de forma natural mediante la aportación de nuevas vías sintéticas en el huésped, o mediante la supresión de vías no deseadas, incrementando de ese modo los niveles de PUFA deseados, o formas conjugadas de los mismos, y disminuyendo los niveles de PUFA no deseados.
Producción de ácidos grasos en animales
La producción de ácidos grasos en animales también presenta varias ventajas. La expresión de genes de desaturasas en animales puede producir niveles enormemente incrementados de PUFA deseados en tejidos animales, haciendo la recuperación a partir de estos tejidos más económica. Por ejemplo, cuando los PUFA deseados se expresan en la leche materna de animales, los procedimientos para aislar PUFA a partir de la leche del animal están bien establecidos. Además de proporcionar una fuente para la purificación de los PUFA deseados, la leche materna de animales puede manipularse a través de la expresión de genes de desaturasas, bien sólos o en combinación con otros genes humanos, para proporcionar leches de animales con una composición de PUFA sustancialmente similar a la leche materna humana durante las diferentes etapas de desarrollo infantil. Las leches de animales humanizadas pueden servir como fórmulas para bebés cuando la lactancia humana es imposible o no deseada, o en los casos de malnutrición o enfermedad.
Dependiendo de la célula huésped, la disponibilidad de sustrato, y del producto o productos finales deseados, son de interés varios polipéptidos, particularmente desaturasas. Por "desaturasa" se pretende indicar un polipéptido que puede desaturar uno o más ácidos grasos para producir un ácido graso mono- o poliinsaturado de interés, o un precursor del mismo. Son particularmente interesantes los polipéptidos que pueden catalizar la conversión de ácido esteárico a ácido oleico, de ácido oleico a LA, de LA a ALA, de LA a GLA, o de ALA a SDA, lo cual incluye enzimas que desaturan en las posiciones \Delta9, \Delta12, (\omega6), \Delta15, (\omega3) o \Delta6. Por "polipéptido" se quiere indicar cualquier cadena de aminoácidos, con independencia de la longitud o modificación posterior a la traducción, por ejemplo, glicosilación o fosforilación. Las consideraciones para escoger un polipéptido específico que tenga actividad desaturasa incluyen el pH óptimo del polipéptido, si el polipéptido o un componente del mismo es un enzima limitante de la velocidad, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un ácido graso poliinsaturado deseado, y/o los cofactores requeridos por el polipéptido. El polipéptido expresado preferiblemente tiene parámetros compatibles con el entorno bioquímico de su lugar en la célula huésped. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el sustrato con otros enzimas en la célula huésped. Los análisis de la K_{m} y de la actividad específica del polipéptido en cuestión se consideran, por tanto, a la hora de determinar la conveniencia de un determinado polipéptido para modificar la producción de PUFA en una célula huésped determinada. El polipéptido usado en una situación particular es uno que puede funcionar en las condiciones presentes en la célula huésped deseada, pero, por otra parte, puede ser cualquier polipéptido que tenga actividad desaturasa que tenga las características deseadas de ser capaz de modificar la producción relativa de un PUFA deseado.
Para la producción de ácido linoleico a partir de ácido oleico, la secuencia de ADN usada codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta12-desaturasa. Para la producción de GLA a partir de ácido linoleico, la secuencia de ADN usada codifica un polipéptido que tiene actividad \Delta6-desaturasa. En casos concretos, la expresión de la \Delta6-desaturasa puede acoplarse con la expresión de la actividad \Delta12-desaturasa, y la célula huésped puede vaciarse opcionalmente de cualquier actividad \Delta15-desaturasa presente, por ejemplo, proporcionando un casete de transcripción para la producción de secuencias antisentido contra el producto de la transcripción de la \Delta15-desaturasa, mediante la alteración del gen de la \Delta15-desaturasa, o usando un célula huésped que tiene de forma natural, o ha sido mutada para tener, una actividad \Delta15-desaturasa baja. La inhibición de las vías de desaturasas no deseadas puede conseguirse también a través del uso de inhibidores de desaturasas específicos, tales como aquéllos descritos en la patente estadounidense nº 4.778.630. También, una célula huésped para la expresión de la \Delta6-desaturasa puede tener, o haberse mutado para tener, una elevada actividad \Delta12-desaturasa. La elección de la combinación de casetes usados depende en parte del perfil de PUFA y/o del perfil de desaturasa de la célula huésped. Cuando la célula huésped expresa la actividad \Delta12-desaturasa y carece o está vacía de actividad \Delta15-desaturasa, la sobreexpresión de la \Delta6-desaturasa sola es generalmente suficiente para proporcionar o potenciar la producción de GLA. Cuando la célula huésped expresa la actividad \Delta9-desaturasa, la expresión de una \Delta12- y una \Delta6-desaturasa puede proporcionar una producción potenciada de GLA. Cuando la actividad \Delta9-desaturasa está ausente o limitada, puede usarse un casete de expresión de para una \Delta9-desaturasa puede proporcionar una producción potenciada de GLA. En la Figura 2 se muestra un esquema para la síntesis de ácido araquidónico (20:4 \Delta^{5,8,11,14}) a partir de ácido esteárico (18:0). Un enzima clave en esta vía es una \Delta6-desaturasa que convierte el ácido linoleico en ácido \gamma-linolénico. También se muestra la conversión de ácido \alpha-linolénico (ALA) en ácido estearidónico por parte de una \Delta6-desaturasa.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad desaturasa
Los organismos tienen actividad desaturasa y oligonucleótidos que codifican tales polipéptidos son organismos que producen un ácido graso poli-insaturado deseado. Como un ejemplo, los microorganismos que tienen la capacidad de producir GLA o ARA pueden usarse como una fuente de actividad \Delta6- o \Delta12-desaturasa. Tales microorganismos incluyen, por ejemplo, aquéllos que pertenecen al género Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, y Entomophthora. Dentro del género Porphyridium, es de especial interés Porphyridium cruentum. Dentro del género Mortierella, es de especial interés Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora, y Mortierella alpina. Dentro del género Mucor, es de especial interés Mucor circinelloides y Mucor javanicus.
Los ADN que codifican las desaturasas deseadas pueden identificarse de diversas formas. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo, las bibliotecas genómicas o de ADNc de Mortierella, se examinan con sondas sintetizadas enzimática o químicamente, las cuales pueden construirse a partir de ADN, ARN, o de nucleótidos que no ocurren de forma natural, o mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse enzimáticamente a partir de ADN de desaturasas conocidas para procedimientos de hibridación con rigurosidad normal o reducida. Las sondas de oligonucleótidos pueden usarse también para examinar fuentes, y pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre las desaturasas conocidas, o en secuencias de péptidos obtenidas a partir de la proteína deseada purificada. Las sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos pueden hacerse degenerar para abarcar la degeneración del código genético, o pueden predisponerse en favor de los codones preferidos del organismo fuente. Los oligonucleótidos pueden usarse también como cebadores para PCR a partir de ARNm transcrito a la inversa procedente de una fuente conocida o sospechosa; el producto de la PCR puede ser el ADNc de longitud completa o puede usarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. Alternativamente, puede secuenciarse completamente una proteína deseada y realizarse la síntesis total de un ADN que codifica ese polipéptido.
Una vez se ha aislado el ADN genómico o ADNc deseado, éste puede secuenciarse mediante procedimientos conocidos. Se sabe en la técnica que tales procedimientos están sujetos a errores, de tal forma que la múltiple secuenciación de la misma región es práctica rutinaria y todavía se espera que conduzca a frecuencias de errores medibles en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, extensa estructura secundaria, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un contenido elevado en bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede realizarse el secuenciado de nuevo y pueden emplearse procedimientos especiales. Tales procedimientos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación mediante el uso de: temperaturas diferentes; enzimas diferentes; proteínas que alteran la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; composiciones de gel diferentes, por ejemplo, añadiendo formamida; cebadores diferentes o cebadores ubicados a diferentes distancias de la región problema; o plantillas diferentes tales como ADN de hebra única. También puede emplearse la secuenciación del ARNm.
En la mayor parte de los casos, parte o toda la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad desaturasa procede de una fuente natural. No obstante, en algunas situaciones, es deseable modificar toda o una porción de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresión, mediante el empleo de codones preferidos del huésped. Los codones preferidos del huésped pueden determinarse a partir de los codones con la frecuencia más elevada en las proteínas expresadas en la cantidad más elevada en una especie de huésped concreta de interés. De ese modo, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad desaturasa puede sintetizarse completamente o en parte. Pueden sintetizarse también la totalidad o porciones del ADN para suprimir cualesquiera secuencias o regiones de estructura secundaria desestabilizantes que estarían presentes en el ARNm transcrito. Pueden sintetizarse también la totalidad o porciones del ADN para alterar la composición de bases a una más preferible en la célula huésped deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y agrupar las secuencias juntas están bien establecidos en la literatura. Pueden emplearse la mutagénesis in vitro y la selección, la mutagénesis dirigida a un sitio, u otros medios, para obtener mutaciones de genes de desaturasas que ocurren de forma natural, para producir un polipéptido que tenga actividad desaturasa in vivo con parámetros cinéticos y físicos más deseables para su función en la célula huésped, tales como una vida media más larga o una velocidad de producción más elevada de un ácido graso poliinsaturado
deseado.
Desaturasa de Mortierella alpina
Es de particular interés la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina, la cual tiene 457 aminoácidos y un peso molecular predicho de 51,8 kD; la secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 3. El gen que codifica la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina puede expresarse en microorganismos transgénicos o animales para efectuar una síntesis mayor de GLA a partir de ALA. También pueden usarse otros ADN que son sustancialmente idénticos al ADN de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos al polipéptido de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina. Por sustancialmente idéntico se quiere indicar una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que presentan, en orden de preferencia creciente, al menos un 60%, 80%, 90% ó 95% de homología con la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina. Para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación es de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos, o más preferiblemente 35 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación es generalmente de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente al menos 60 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 75 nucleótidos, y los más preferiblemente, 110 nucleótidos. La homología se mide típicamente usando un programa de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas de Análisis de Secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Tales programas emparejan secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a varias sustituciones, supresiones y otras modificaciones. Las sustituciones conservadores típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones pueden hacerse también en base a la hidrofobicidad o hidrofilicidad conservada (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)), o en base a la capacidad de asumir una estructura secundaria de polipéptido parecida (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148 (1978)).
Es también de particular interés la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina, cuyas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se muestran en la Figura 5. El gen que codifica la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina puede expresarse en microorganismos transgénicos o animales para efectuar una síntesis mayor de LA a partir de ácido oleico. También pueden usarse otros ADN que son sustancialmente idénticos al ADN de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina, o que codifican polipéptidos que son sustancialmente idénticos al polipéptido de la \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina.
Otras desaturasas
Abarcadas por la presente invención, están las desaturasas relacionadas procedentes del mismo u otros organismos, tal como se define en las reivindicaciones. Tales desaturasas relacionadas incluyen variantes de la \Delta6- o \Delta12-desaturasa descritas, que ocurren de forma natural en la misma o diferentes especies de Mortierella, así como los homólogos de la \Delta6- o \Delta12-desaturasa descrita procedentes de otras especies. También se incluyen desaturasas que, aunque no son sustancialmente idénticas a la \Delta6- o \Delta12-desaturasa de Mortierella alpina, desaturan una molécula de ácido graso respectivamente en el carbono 6 ó 12, respecto el extremo carboxilo de una molécula de ácido graso, o en el carbono 12 ó 6, respecto el carbón metílico terminal en una molécula de ácido graso de 18 carbonos. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse por su capacidad para funcionar sustancialmente del mismo modo que las desaturasas descritas; es decir, que son capaces todavía de convertir efectivamente el LA en GLA, el ALA en SDA, o el ácido oleico en LA. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse también mediante la búsqueda de secuencias homólogas a la desaturasa descrita en bases de datos de secuencias, mediante la hibridación de una sonda basada en la desaturasa descrita con una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o mediante la RT-PCR usando ARNm procedente del organismo fuente y cebadores basados en la desaturasa descrita. Tales desaturasas incluyen aquéllas procedentes de humanos, Dictyostelium discoideum y Phaeodactylum tricornutum.
Las regiones de un polipéptido de desaturasa importantes para la actividad desaturasa pueden determinarse a través de la mutagénesis de rutina, la expresión de los polipéptidos mutantes resultantes, y la determinación de sus actividades. Los mutantes pueden incluir supresiones, inserciones, y mutaciones en un punto, o combinaciones de las mismas. Un análisis de función típico empieza con la mutagénesis de supresión para determinar los límites N- y C-terminales de la proteína necesaria para la función, y a continuación se hacen supresiones, inserciones o mutaciones en un punto para determinar además otras regiones necesarias para la función. También pueden usarse otras técnicas tales como la mutagénesis en casete o la síntesis total. La mutagénesis de supresión se consigue, por ejemplo, usando exonucleasas para suprimir secuencialmente las regiones codificantes 5' y 3'. Hay equipos disponibles para tales técnicas. Después de la supresión, la región codificante se completa mediante la ligación de oligonucleótidos, que contienen respectivamente codones de inicio o detención, a la región codificante suprimida después de la supresión 5' ó 3'. Alternativamente, los oligonucleótidos que contienen codones de inicio o detención se insertan en la región codificante mediante una variedad de procedimientos que incluyen la mutagénesis dirigida a un sitio, la PCR mutagénica, o mediante ligación en ADN digerido en sitios de restricción existentes. Las supresiones internas pueden hacerse de forma similar a través de un variedad de procedimientos, incluyendo el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de cebadores mutagénicos a través de la mutagénesis dirigida o la PCR mutagénica. Las inserciones se hacen a través de procedimientos tales como la mutagénesis de barrido con engarce, la mutagénesis dirigida a un sitio, o la PCR mutagénica. Las mutaciones en un punto se hacen a través de técnicas tales como la mutagénesis dirigida a un sitio o la PCR mutagénica.
También puede usarse la mutagénesis química para identificar regiones de un polipéptido desaturasa que son importantes para su actividad. Se expresa una construcción mutada, y se analiza la capacidad de la proteína alterada resultante para funcionar como una desaturasa. Tal análisis estructura-función puede determinar qué regiones pueden suprimirse, qué regiones toleran inserciones, y que mutaciones en punto permiten que la proteína mutante funcione sustancialmente de la misma forma que la desaturasa nativa. La totalidad de tales proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que las codifican se hallan dentro del ámbito de la presente invención.
Expresión de genes de desaturasas
Una vez se ha obtenido el ADN que codifica un polipéptido desaturasa, es coloca en un vector capaz de replicación en una célula huésped, o se propaga in vitro por medio de técnicas tales como la PCR o la PCR larga. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos, y similares. Los vectores deseables incluyen aquéllos útiles para la mutagénesis del gen de interés o para la expresión del gen de interés en las células huéspedes. La técnica de la PCR larga ha hecho posible la propagación de construcciones grandes, de forma que las modificaciones del gen de interés, tales como la mutagénesis o la adición de señales de expresión, y la propagación de las construcciones resultantes puedan efectuarse in vitro sin el uso de un vector de replicación o una célula huésped.
Para la expresión de una polipéptido desaturasa, se unen regiones funcionales de iniciación y terminación de la transcripción y traducción al ADN que codifica el polipéptido desaturasa. La expresión de la región que codifica el polipéptido puede tener lugar in vitro o en una célula huésped. Las regiones de iniciación o terminación de la transcripción o traducción se derivan de una variedad de especies no exclusivas. incluyendo el ADN a expresar, genes conocidos o sospechosos de ser capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o a de un locus endógeno en una célula huésped.
Expresión in vitro
La expresión in vitro puede conseguirse, por ejemplo, colocando la región codificante del polipéptido desaturasa en un vector de expresión diseñado para su uso in vitro, y añadiendo lisado de reticulocito de conejo y cofactores; si se desea pueden incorporarse aminoácidos aislados. Tales vectores de expresión in vitro pueden proporcionar algunas o todas las señales de expresión necesarias en el sistema usado. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente. La mezcla de reacción puede ensayarse entonces directamente en busca del polipéptido, por ejemplo, determinando su actividad, o el polipéptido sintetizado puede purificarse y ensayarse a continuación.
Expresión en una célula huésped
La expresión en una célula huésped puede conseguirse de forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, construcciones que sin embargo no se replican y raramente se integran en la célula huésped, o en donde la célula huésped no se está proliferando. La expresión transitoria puede conseguirse también induciendo la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de interés, aunque tales sistemas inducible frecuentemente exhiben un nivel de expresión basal bajo. La expresión estable puede conseguirse mediante la introducción de una construcción que puede integrarse en el genoma del huésped o que se replica autónomamente en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse a través del uso de un marcador seleccionable ubicado en o transfectado con la construcción de expresión, seguida por la selección de células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable es el resultado de la integración, la integración de las construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma huésped, o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones con homología suficiente con el genoma huésped como para apuntar la recombinación al locus del huésped. Cuando las construcciones se apuntan hacia un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y traducción pueden se proporcionas por el locus endógeno.
Cuando se desea la expresión incrementada del polipéptido desaturasa en el organismo fuente, pueden emplearse varios procedimientos. Pueden introducirse en el organismo huésped genes adicionales que codifiquen el polipéptido desaturasa. La expresión a partir del locus de la desaturasa nativo puede incrementarse también a través de la recombinación homóloga, por ejemplo, insertando un promotor más fuerte en el genoma huésped para causar una expresión incrementada, suprimiendo secuencias desestabilizadoras bien del ARNm o de la proteína codificada mediante la supresión de esa información del genoma del huésped, o añadiendo secuencias estabilizadoras al ARNm (USPN 4.910.141).
Cuando es deseable expresar más de un gen diferente, las regiones reguladoras apropiadas y los procedimientos de expresión introducidos en genes pueden propagarse en la célula huésped a través del uso de vectores de replicación o mediante integración en el genoma huésped. Cuando dos o más genes se expresan a partir de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un medio de replicación diferente. Cada construcción introducida, esté integrada o no, debería tener medios de selección diferentes y debería carecer de homología con las otras construcciones para mantener la expresión estable e impedir la reordenación de elementos entre construcciones. Las elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección, y procedimientos de propagación de la construcción introducida pueden determinarse experimentalmente, de forma que todos los genes introducidos se expresen con los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.
Como un ejemplo, cuando la célula huésped es una levadura, se proporcionan regiones de transcripción y traducción que son funcionales en células de levadura, particularmente procedentes de las especies huésped. Las regiones reguladoras del inicio de la transcripción pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de genes en la vía glicolítica, tales como el de la deshidrogenasa de alcohol, la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato (GDP), la fosfoglucoisomerasa, la quinasa de fosfoglicerato, etc, o de genes regulables tales como el de la fosfatasa ácida, el de la lactasa, el de la metalotioneína, el de la glucoamilasa, etc. En una situación concreta, puede usarse una cualquiera de un cierto número de secuencias reguladoras, dependiendo de si se desea la transcripción constitutiva o inducida, de la eficiencia concreta del promotor conjuntamente con la pauta de lectura abierta de interés, la capacidad para unir un promotor fuerte con una región de control procedente de un promotor diferente que permite la transcripción inducible, la facilidad de construcción, y similares. Son de particular interés los promotores que se activan en presencia de galactosa. Los promotores inducible con galactosa (GAL1, GAL7, y GAL10) se han usado ampliamente para la expresión con elevados niveles y regulada en levaduras (Lue et al., Mol. Cell Biol. 7:3446 (1987); Johnson, Microbiol. Rev. 51:458 (1987), La transcripción a partir de los promotores GAL es activada por la proteína GAL4, la cual se une a la región promotora y activa la transcripción cuando la galactosa está presente. En ausencia de galactosa, el antagonista GAL80 se une al GAL4 e impide que el GAL4 active la transcripción. La adición de galactosa impide que el GAL80 inhiba la activación de la GAL4.
Se ha hallado que las secuencias de nucleótidos que roden el codon ATG de iniciación de la transcripción afectan la expresión en células de levadura. Si el polipéptido deseado se expresa pobremente en levadura, las secuencias de nucleótidos de genes exógenos pueden modificarse para incluir una secuencia de iniciación de la traducción en levadura eficiente para obtener una expresión óptima del gen. Para la expresión en Saccharomyces, esto puede hacerse mediante la mutagénesis dirigida a un sitio de un gen expresado ineficientemente, fusionándolo en pauta con un gen endógeno de Saccharomyces, preferiblemente un gen muy expresado, tal como el gen de la lactasa.
La región de terminación puede derivarse de la región 3' del gen a partir del cual se obtuvo la región de iniciación o a partir de un gen diferente. Se conocen un gran número de regiones de terminación y se ha hallado que son satisfactorias en una variedad de huéspedes del mismo y diferentes géneros y especies. La región de terminación usualmente se selecciona más por una cuestión de conveniencia que a causa de una propiedad concreta. Preferiblemente, la región de terminación se deriva de un gen de levadura, particularmente de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida o Kluyveromyces. Se sabe también que las regiones 3' de dos genes de mamíferos, del \gamma-interferón y \alpha2-interferón, funcionan en levaduras.
Introducción de construcciones en células huéspedes
Las construcciones que comprenden el gen de interés pueden introducirse en una célula huésped mediante técnicas estándares. Estas técnicas incluyen la transformación, la fusión con protoplastos, la lipofección, la transfección, la transducción, la conjugación, la infección, el impacto con bolas (bolistic impact), la electroporación, la microinyección, el raspado, o cualquier otro procedimiento que introduzca el gen de interés dentro de la célula huésped. Los procedimientos de transformación que se usan incluyen la transformación con acetato de litio (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)). Por conveniencia, una célula huésped que ha sido manipulada mediante cualquier procedimiento para captar una secuencia o construcción de ADN se denominará en ésta como "transformada" o "recombinante".
El huésped sujeto tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más, dependiendo de si el gen está integrado en el genoma, amplificado, o si está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples números de copias. Cuando el huésped sujeto es una levadura, pueden usarse cuatro tipos principales de vectores plasmídicos para lavaduras: los plásmidos de integración en levadura (YIp), los plásmidos de replicación en levadura (YRp), los plásmidos del centrómero de levadura (YCp), y los plásmidos episomales de levadura (YEp). Los YIp carecen de un origen de replicación de levadura y deben propagarse como elementos integrados en el genoma de levadura. Los YRp tienen una secuencia de replicación autónoma derivada del cromosoma y se propagan como plásmidos que se segregan de forma inestable, replicándose autónomamente, con un número de copias medio (20 a 40). Los YCp tienen tanto una región de origen de la replicación como una secuencia de centrómero, y se propagan como plásmidos que se segregan establemente, se replican autónomamente, con un número de copias bajo (10 a 20). Los YEp tienen un origen de replicación procedente del plásmido de 2 \mum y se propagan como plásmidos que se segregan irregularmente, replicándose autónomamente, con un número de copias elevado. La presencia de los plásmidos en las levaduras puede asegurarse manteniendo la selección para un marcador en el plásmido. Son de particular interés los vectores de levadura pYES2 (un plásmido YEp disponible de Invitrogen, confiere prototrofía para el uracilo y un promotor inducible con galactosa, GAL1, para la expresión), pRS425-pG1 (un plásmido YEp obtenido del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Genética Molecular, Ohio State University, que contiene un promotor GDP constitutivo y confiere prototrofía para la leucina), y el pYX424 (un plásmido YEp que tiene un promotor TP1 constitutivo y confiere prototrofía para la leucina; Alber, T. y Kawasaki, G., J. Mol. & Appl. Genetics 1:419 (1982)).
La células huésped transformada puede identificarse mediante la selección para un marcador contenido en la construcción introducida. Alternativamente, puede introducirse una construcción marcadora separada con la construcción deseada, puesto que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en las células huésped. Típicamente, las células transformadas se seleccionan por su capacidad para crecer en un medio selectivo. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento de los huéspedes no transformados, tal como un nutriente o un factor de crecimiento. Por consiguiente, un gen marcador introducido puede conferir resistencia al antibiótico, o codifica un factor de crecimiento o enzima esencial, y permitir el crecimiento en medio selectivo cuando se expresa en el huésped transformado. La selección de un huésped transformado puede ocurrir también cuando la proteína marcadora expresada puede detectarse, bien directa o indirectamente. La proteína marcadora puede expresarse sola o como una fusión con otra proteína. La proteína marcadora puede detectarse mediante su actividad enzimática; por ejemplo, la \beta-galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina en un producto emisor de luz. La proteína marcadora puede detectarse por sus características productoras de luz o modificantes; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una marca molecular sobre, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o la etiqueta pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o mediante técnicas tales como el FACS o el cribado usando anticuerpos. Para la selección de transformantes de levadura, puede usarse cualquier marcador que funcione en levaduras. Deseablemente, son de interés la resistencia a la kanamicina y al aminoglicósido G418, así como la capacidad de crecer en medio que carece de uracilo, leucina, lisina o triptófano.
Es de particular interés la producción de PUFA mediada por \Delta6- o \Delta12-desaturasa en células huésped procariotas y eucariotas. Las células procariotas de interés incluyen Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, cianbocaterias, y similares. Las células eucariotas incluyen las células de mamíferos, tales como aquéllas procedentes de animales lactantes, de células de aves como los pollos, y otras células susceptibles de manipulación genética, incluyendo las células de insectos, hongos y algas. Las células pueden cultivarse o formarse como una parte o totalidad de un organismo huésped, incluyendo un animal. Los virus y los bacteriófagos pueden usarse también con las células en la producción de PUFA, particularmente para la transferencia de genes, marcaje celular, y selección. En una realización preferida, el huésped es cualquier microorganismo o animal que produce y/o puede asimilar sustrato o sustratos suministrados exógenamente para la \Delta6- y/o \Delta12-desaturasa, y preferiblemente produce grandes cantidades de uno o más de los sustratos. Los ejemplos de tales animales huéspedes incluyen los ratones, las ratas, los conejos, los pollos, la codorniz, los pavos, los bovinos, las ovejas, los cerdos, las cabras, los yak, etc., los cuales son susceptibles de manipulación genética y clonación para la expansión rápida de la población que expresa el transgén. Para los animales, el(los) transgén(es) de desaturasa puede adaptarse para su expresión en orgánulos, tejidos, y fluidos corporales deseados, a través de la modificación de las regiones reguladoras del gen. Es de especial interés la producción de PUFA en la leche de lactancia del animal huésped.
Expresión en levadura
Los ejemplos de microorganismos huéspedes incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, u otros tipos de levaduras tales como Candida, Kluyveromyces, u otros hongos, por ejemplo, hongos filamentosos tales como Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. Las características deseables de un microorganismo huésped son, por ejemplo, que esté bien caracterizado genéticamente, que pueda usarse para niveles elevados de expresión del producto usando fermentación a densidad ultra-alta, y que esté en la lista GRAS (generalmente reconocido como seguro) puesto que el producto final propuesto está destinado a ingestión por parte de humanos. Es de particular interés el uso de una levadura, más particularmente de la levadura de panadería (S. cerevisiae), como una célula huésped en la presente invención. Las cepas de particular interés son SC334 (Mat \alpha pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gall; Hovland et al., Gene 83:57-64 (1989)), YTC34 (\alpha-ade2-101 his3\Delta200 lys2-801 ura3-52; obtenida del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Genética Molecular, Ohio State University), YTC41 (\alpha/a ura3-52/ura3-52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trp1-\Delta1/trp1-\Delta1 his3\Delta200/his3\Delta200 leu2\Delta1/leu2\Delta1; obtenida del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Genética Molecular, Ohio State University), BJ1995 (obtenida del Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720), INVSC1 (Mat \alpha hiw3\Delta1 leu2 trp1-289 ura3-52; obtenida de Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) e INVSC2 (Mat \alpha his3\Delta200 ura3-167; obtenida de Invitrogen).
Expresión en especies de aves
Para producir PUFA en especies y células de aves, tales como pollos, pavos, codornices y patos, la transferencia del gen puede realizarse introduciendo una secuencia de ácido nucleico que codifica una \Delta6- y/o \Delta12-desaturasa en las células siguiendo procedimientos conocidos en la técnica. Si se desea un animal transgénico, pueden proporcionarse células madres pluripotentes de embriones con un vector portador de un transgén que codifica la \Delta5-desaturasa, y desarrollarlas hasta un animal adulto (USPN 5.162.215; Ono et al. Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3):287-292 (1996); WO-96/12.793; WO-96/06.160). En la mayoría de los casos, el transgén se modificará para expresar niveles elevados de la desaturasa con objeto de incrementar la producción de PUFA. El transgén puede modificarse, por ejemplo, proporcionando regiones reguladoras de la transcripción y/o traducción que funcionan en células de aves, tales como promotores que dirigen la expresión en tejidos concretos y partes del huevo tales como la yema. Las regiones reguladoras del gen pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo los virus de la anemia de los pollos o de la leucosis aviar, o genes de aves tales como el gen de la ovoalbúmina del pollo.
Expresión en células de insectos
La producción de PUFA en células de insectos puede realizarse usando vectores de expresión de baculovirus que alberguen uno o más transgenes de desaturasa. Los vectores de expresión de baculovirus están disponibles a partir de varias fuentes comerciales tales como Clonetech. También se proporcionan procedimientos para producir cepas transgénicas e híbridas de algas, tales como las algas marinas, que contienen y expresan un transgén de desaturasa. Por ejemplo, pueden prepararse algas marinas transgénicas tal como se describe en la USPN 5.426.040. Al igual que con los otros sistemas de expresión descritos más arriba, el momento, la extensión de la expresión, y la actividad del transgén de desaturasa pueden regularse ajustando la secuencia codificante del polipéptido con las regiones reguladoras de la transcripción y traducción apropiadas seleccionadas para un uso particular. Son de especial interés las regiones promotoras que pueden inducirse bajo condiciones de crecimiento preseleccionadas. Por ejemplo, puede usarse para este propósito la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura y/o que responden a metabolitos en las secuencias codificantes del transgén de desaturasa, sus regiones reguladoras, y/o el genoma de las células en las que se introduce el transgén.
La célula huésped transformada se cultiva en condiciones apropiadas adaptadas para un resultado final deseado. Para células huéspedes hechas crecer en cultivo, las condiciones están típicamente optimizadas para producir el rendimiento mayor o más económico de PUFA, el cual se relaciona con la actividad desaturasa seleccionada. Las condiciones de medio que pueden optimizarse incluyen: la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno, la adición de sustrato, la concentración final de sustrato añadido, la forma del sustrato añadido, el crecimiento aeróbico o anaeróbico, la temperatura de crecimiento, el agente inductor, la temperatura de inducción, la fase de crecimiento en el momento de la inducción, la fase de crecimiento en el momento de la recolección, el pH, la densidad, y el mantenimiento de la selección. Por ejemplo, los microorganismos tales como las levaduras preferiblemente se cultivan usando el medio seleccionado de interés, el cual incluye caldo de peptona de levadura (YPB) y medio mínimo (contiene aminoácidos, bases nitrogenadas de levadura, y sulfato amónico, y carece de un componente para la selección, por ejemplo, uracilo). Deseablemente, los sustratos a añadir se disuelven primero en etanol. Cuando fuera necesario, puede inducirse la expresión del polipéptido de interés, por ejemplo, incluyendo o añadiendo galactosa para inducir la expresión a partir de un promotor GAL.
Expresión en plantas
La producción de PUFA en plantas puede realizarse usando varios sistemas de transformación en plantas tales como el uso de Agrobacterium tumefaciens, de virus de plantas, de la transformación de células con partículas, y similares, los cuales se descubren en las solicitudes del solicitante relacionadas Solicitudes Estadounidenses con Números de Serie 08/834.033 y 08/956.985, y las solicitudes de continuación en parte registradas simultáneamente con esta solicitud, la totalidad de las cuales se incorporan en esta por referencia.
Expresión en un animal
La expresión en células de un huésped animal puede conseguirse igualmente de manera estable o transitoria. La expresión transitoria puede conseguirse mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, la infección o lipofección, y puede repetirse con objeto de mantener los niveles de expresión deseados de la construcción introducida (ver, Ebert, publicación del PCT WO-94/05.782). La expresión estable puede conseguirse a través de la integración de una construcción en el genoma del huésped, que resulta en un animal transgénico. La construcción puede introducirse, por ejemplo, mediante microinyección de la construcción en el pronúcleo de un huevo fertilizado, o mediante transfección, infección retroviral, u otras técnicas mediante las cuales se introduce la construcción en una línea celular que puede formar o incorporarse en un animal adulto (patente estadounidense nº 4.873.191; patente estadounidense nº 5.530.177; patente estadounidense nº 5.565.362; patente estadounidense nº 5.366.894; Wilmut et al., Nature 385:810 (1997)). Los huevos o embriones recombinantes se transfieren a una madre sustituta (patente estadounidense nº 4.873.191; patente estadounidense nº 5.530.177; patente estadounidense nº 5.565.362; patente estadounidense nº 5.366.894; Wilmut et al. (ver más arriba)).
Después del nacimiento, se identifican los animales transgénicos, por ejemplo, mediante la presencia de un gen marcador introducido, tal como para el color de la cubierta, o mediante PCR o transferencia Southern a partir de una muestra de sangre, leche o tejido, para detectar la construcción introducida, o mediante un ensayo inmunológico o enzimológico para detectar la proteína expresada o los productos producidos a partir de la misma (patente estadounidense nº 4.873.191; patente estadounidense nº 5.530.177; patente estadounidense nº 5.565.362; patente estadounidense nº 5.366.894; Wilmut et al. (ver más arriba)). Los animales transgénicos resultantes pueden ser completamente transgénico o pueden ser mosaicos, teniendo los transgenes sólo en un subconjunto de sus células. El advenimiento de la clonación de mamíferos, conseguida fusionando una célula nucleada con un huevo enucleado, segunda por la transferencia a una madre sustituta, presenta la posibilidad de producción rápida y a gran escala a partir de la obtención de un animal o célula "fundador" que comprenda la construcción introducida; antes de esto, era necesario que el transgén estuviera presente en al línea germinal del animal para su propagación (Wilmut et al. (ver más arriba)).
La expresión en un animal huésped presenta ciertas eficiencias, particularmente cuando el huésped es un animal doméstico. Para la producción de PUFA en un fluido fácilmente obtenible a partir del animal huésped, tal como la leche, el transgén de la desaturasa puede expresarse en células de mamífero procedentes de un huésped hembra, y alterarse el contenido de las células huéspedes. El transgén de la desaturasa puede adaptarse para su expresión de forma que ésta esté retenida en las células de mamífero, o sea secretada hacia la leche, para localizar en la leche los productos de reacción PUFA (publicación del PCT WO-95/24.488). La expresión puede dirigirse para su expresión en tejido mamario usando secuencias reguladoras específicas, tales como las de la \alpha-lactoalbúmina bovina, \alpha-caseína, \beta-caseína, \gamma-caseína, \kappa-caseína, \beta-lactoglobulina, o proteína ácida del suero, y puede incluir opcionalmente uno o más intrones y/o secuencias de señales secretoras (patente estadounidense nº 5.530.177; Rosen, patente estadounidense nº 5.565.362; Clark et al., patente estadounidense nº 5.366.894; Garner et al., publicación del PCT WO-95/23.868). La expresión de transgenes de desaturasa, o transcritos de desaturasa antisentido, adaptada de esta manera, puede usarse para alterar los niveles de PUFA específicos, o derivados de los mismos, hallados en la leche de los animales. Adicionalmente, los transgenes de desaturasa pueden expresarse bien por sí mismo o con otros transgenes, con objeto de producir una leche de animal que contenga proporciones más elevadas de los PUFA deseados, o proporciones de PUFA y concentraciones que se parezcan a la leche mamaria humana (Prieto et al., publicación del PCT WO-95/24.494).
Purificación de los ácidos grasos
Los ácidos grasos desaturados pueden hallarse en el microorganismo o animal huésped como ácidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glicolípidos, y pueden extraerse a partir de la célula huésped a través de una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la extracción con solventes orgánicos, la sonicación, la extracción con fluidos supercrítica usando por ejemplo dióxido de carbono, y medios físicos tales como las prensas, o las combinaciones de los mismos. Es de particular interés la extracción con metanol y cloroformo. Cuando sea deseable, la capa acuosa puede acidificarse para protonar los grupos cargados negativamente e incrementar de ese modo el reparto de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los solventes orgánicos pueden suprimirse mediante evaporación bajo una corriente de nitrógeno. Cuando se aislan en formas conjugadas, los productos pueden descomponerse enzimática o químicamente para liberar el ácido graso libre o un conjugado menos complejo de interés, y pueden someterse a continuación a manipulaciones adicionales para producir un producto final deseado. Deseablemente, las formas conjugadas de los ácidos grasos se descomponen con hidróxido potásico.
Si es necesaria la purificación adicional, pueden emplearse procedimientos estándares. Tales procedimientos pueden incluir la extracción, el tratamiento con urea, la cristalización fraccionaria, la HPLC, la destilación fraccionaria, la cromatografía sobre gel de sílice, la centrifugación a alta velocidad, o la destilación, o combinaciones de estas técnicas. La protección de los grupos reactivos, tales como los grupos ácidos o alquenilos, puede hacerse en cualquier paso a través de técnicas conocidas, por ejemplo, alquilación o yodación. Los procedimientos usados incluyen la metilación de los ácidos grasos para producir metilésteres. Similarmente, los grupos protectores pueden retirarse en cualquier paso. Deseablemente, la purificación de fracciones que contienen ARA, DHA y EPA puede conseguirse mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccionaria.
Usos de los ácidos grasos
Los ácidos grasos objeto de la invención hallan muchas aplicaciones. Las sondas basadas en los ADN de la invención pueden hallar uso en procedimientos para aislar moléculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los ADN u oligonucleótidos deben ser detectables. Esto se consigue usualmente uniendo una marca bien en un sitio interno, por ejemplo a través de la incorporación de un residuo modificado, o en los extremos 5' ó 3'. Tales marcas deben ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que está marcada detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no marcada y a una molécula terciaria marcada detectablemente; este proceso puede extenderse tan lejos como sea práctico para conseguir una señal detectable satisfactoriamente sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciario, o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u otros anticuerpos, o pueden implicar cualesquiera moléculas que se unan entre ellas, por ejemplo, un sistema biotina-estreptoavidina/avidina. Las marcas detectables típicamente incluyen los isótopos radiactivos, las moléculas que química o enzimáticamente producen o alteran la luz, los enzimas que producen productos de reacción detectables, las moléculas magnéticas, las moléculas fluorescentes o moléculas cuya fluorescencia o características de emisión de luz cambian a partir de la unión. Pueden hallarse ejemplos de procedimientos de marcado en la USPN 5.011.770. Alternativamente, la unión de moléculas diana puede detectarse directamente midiendo el cambio en el calor de solución, a partir de la unión de la sonda a la diana, a través de la calorimetría de valoración isotérmica, o recubriendo una superficie con la sonda o diana y detectando el cambio en la dispersión de la luz a partir de la superficie producido por la unión de la diana o sonda, respectivamente, tal como puede hacerse con el sistema BIAcore.
Los PUFA producidos mediante medios recombinantes hallan aplicaciones en una amplia variedad de áreas. El suplemento de humanos o animales con PUFA en varias formas puede resultar en niveles incrementados, no sólo de los PUFA añadidos, sino también de su progenie metabólica.
Composiciones nutricionales
La composiciones nutricionales que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención para los propósitos de la presente invención incluyen cualquier alimento o preparación para consumo humano, incluyendo para consumo entérico o parenteral, el cual, cuando se toma en el cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o aportar energía, y/o (b) mantener, restablecer, o apoyar el estado nutricional o función metabólica adecuados.
La composición nutricional que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención comprende al menos un aceite o ácido producido de acuerdo con la presente invención, y puede estar en una forma sólida o líquida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de tales ingredientes variará dependiendo de si la composición se destina a un uso con criaturas sana, normales, o niños o adultos que tengan necesidades especializadas tales como aquéllas que acompañan ciertas condiciones metabólicas (por ejemplo, alteraciones metabólicas).
Los ejemplos de macronutrientes que pueden añadirse a la composición incluyen, pero no se limitan a, las grasas comestibles, los carbohidratos y las proteínas. Los ejemplos de tales grasas comestibles incluyen, pero no se limitan a, el aceite de coco, el aceite de soja, y los mono- y diglicéridos. Los ejemplos de tales carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, la glucosa, la lactosa comestible, y el almidón hidrolizado. Adicionalmente, los ejemplos de proteínas que pueden utilizarse en la composición nutricional incluyen, pero no se limitan a, las proteínas de la soja, el suero electrodializado, la leche desnatada eletrodializada, el suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas.
Con respecto a las vitaminas y minerales, pueden añadirse los siguientes a las composiciones nutricionales: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo, y las Vitaminas A, E, D, C, y el complejo de B. También pueden añadirse otras vitaminas y minerales parecidos.
Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales será de origen semi-purificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se entiende un material que ha sido preparado mediante purificación de un material natural o por síntesis.
Los ejemplos de composiciones nutricionales que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las fórmulas para bebés, los suplementos dietéticos, y las composiciones para rehidratación. Las composiciones nutricionales de particular interés incluyen, pero no se limitan a, aquéllas utilizadas para el suplemento entérico o parenteral para bebés, las fórmulas para bebés para especialista, los suplementos para los ancianos, y los suplementos para aquéllos con dificultades gastrointestinales y/o malabsorción.
Composiciones nutricionales
Una composición nutricional típica que puede obtenerse según los procedimientos de la invención contendrá macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en las cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de tales ingredientes variarán dependiendo de si la formulación está destinada a un uso con individuos sanos, normales, temporalmente expuestos a estrés, o a sujetos que tienen necesidades especiales debido a a ciertos estados morbosos crónicos o agudos (por ejemplo, alteraciones metabólicas). Las personas formadas en la técnica entenderán que los componentes utilizados en una formulación nutricional que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son de origen semi-purificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se quiere indicar un material que se ha preparado mediante la purificación de un material natural o mediante síntesis. Estas técnicas son bien conocidas en técnica (Ver, por ejemplo, Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10ª edición, National Academy Press, Washington, D.C., 1989).
Preferiblemente, la formulación nutricional que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención es un producto nutricional enteral; más preferiblemente un producto de nutricional enteral de adultos o niños. En consecuencia, la formulación nutricional es apropiada para alimentar adultos o niños que están experimentando estrés. La fórmula comprende, además de los PUFA de la invención; macronutrientes, vitaminas y minerales en cantidades diseñadas para proporcionar los requisitos nutricionales diarios de los adultos.
Los componentes macronutricionales incluyen las grasas comestibles, los carbohidratos y las proteínas. Son ejemplos de grasas comestibles el aceite de coco, el aceite de soja, y los mono- y diglicéridos, y los aceites de PUFA producidos por esta invención. Son ejemplos de carbohidratos la glucosa, la lactosa comestible, y el almidón hidrolizado de maíz. Unas fuentes típicas de proteína son: la proteína de soja, el suero electrodializado o la leche desnatada electrodializada o el suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas, aunque también hay disponibles otras fuentes de proteínas y pueden usarse. Estos macronutrientes se añadirán en forma de compuestos nutricionales comúnmente aceptados en cantidad equivalente a las presentes en la leche humana o en base a la energía, es decir, en base a las calorías.
Los procedimientos para formular fórmulas nutricionales líquidas y enterales son bien conocidos en la técnica, y se describen en detalle en los ejemplos.
La fórmula enteral puede esterizilarse y usarse subsiguientemente de forma lista-para-alimentar (RTF) o almacenarse en un líquido concentrado o en un polvo. El polvo puede prepararse mediante secado por atomización de la fórmula enteral preparada tal como se ha indicado más arriba, y reconstituirse la fórmula mediante rehidratación del concentrado. Las fórmulas nutricionales para adultos y bebés son bien conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente (por ejemplo, Similac®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® procedentes de la Ross Products División, Abbot Laboratories). Un aceite o ácido que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención puede añadirse a cualquiera de estas fórmulas en las cantidades descritas más arriba.
La densidad de energía de las composiciones nutricionales cuando están en forma líquida, puede oscilar típicamente desde aproximadamente 0,6 kcal hasta 3,0 kcal por ml. Cuando está en forma sólida o pulverizada, el suplemento nutricional puede contener desde aproximadamente 1,2 hasta más de 9 kcal por g, preferiblemente de 3 a 7 kcal por g. En general, la osmolalidad de un producto líquido debería ser inferior a 700 mOsm y más preferiblemente inferior a 660 mOsm.
La fórmula nutricional típicamente incluirá vitaminas y minerales, además de los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención, con objeto de ayudar a la ingestión individual de los requerimientos diarios de estas sustancias. Además de los PUFA listados más arriba, puede ser deseable suplir la composición nutricional con zinc, cobre, y ácido fólico además de antioxidantes. Se cree que estas sustancias también proporcionarán un impulso al sistema inmune estresado, y de esté modo proporcionarán beneficios adicionales al individuo. La presencia de zinc, cobre, o ácido fólico es opcional y no se requiere con objeto de ganar los efectos beneficiosos sobre la supresión inmune. De igual forma, una composición farmacéutica se puede suplir también con estas mismas sustancias.
La fórmula nutricional puede contener, además del sistema antioxidante y del componente PUFA, una fuente de carbohidratos, en donde al menos el 5% de dicho carbohidrato es un oligosacárido no digerible. Preferiblemente, la composición nutricional contiene adicionalmente proteína, taurina y carnitina.
Los PUFA, o derivados de los mismos, preparados mediante el procedimiento descubierto pueden usarse como sustitutos o suplementos dietéticos, particularmente en las fórmulas para niños, para pacientes que experimentan alimentación intravenosa o para prevenir o tratar la malnutrición. Típicamente, la leche para lactancia humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente el 0,15% hasta aproximadamente el 0,36% como DHA, desde aproximadamente el 0,03% hasta aproximadamente el 0,13% como EPA, desde aproximadamente el 0,30% hasta aproximadamente el 0,88% como ARA, desde aproximadamente el 0,22% hasta aproximadamente el 0,67% como DGLA, y desde aproximadamente el 0,27% hasta aproximadamente el 1,04% como GLA. Adicionalmente, se ha descrito que el triglicérido predominante en la leche humana es el 1,3-di-oleoil-2-palmitoil, informándose que los 2-palmitoil glicéridos son mejor absorbidos que los 2-oleoil o 2-lineoil glicéridos (USPN 4.876.107). Por tanto, los ácidos grasos tales como el ARA, DGLA, GLA y/o EPA producidos por la invención pueden usarse para alterar la composición de la fórmula para bebés para replicar mejor la composición en PUFA de la leche para lactancia humana. En particular, una composición de aceite para uso en un suplemento farmacológico o alimentario, particularmente un sustituto o suplemento de la leche para lactancia, preferiblemente comprenderá uno o más de ARA, DGLA o GLA. Más preferiblemente, el aceite comprenderá desde aproximadamente un 0,3 hasta un 30% de ARA, desde aproximadamente un 0,2 hasta un 30% de DGLA, y desde aproximadamente un 0,2 hasta aproximadamente un 30% de GLA.
Además de la concentración, las proporciones de ARA, DGLA y GLA pueden adaptarse para un determinado uso final. Cuando se formula como un suplemento o sustituto de leche para lactancia, una composición de aceite que contenga dos o más de ARA, DGLA y GLA se proporcionará respectivamente en una proporción de desde 1:19:30 hasta aproximadamente 6:1:0,2. Por ejemplo, la leche para lactancia de animales puede variar en proporciones de ARA:DGLA:DGL que oscilan desde 1:19:30 hasta 6:1:0,2, las cuales incluyen proporciones intermedias que preferiblemente son 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntos en una célula huésped, el ajuste de la proporción y porcentaje de conversión de un sustrato precursor, tal como GLA y DGLA a ARA, puede usarse para controlar con precisión las proporciones de PUFA. Por ejemplo, un 5% a 10% de velocidad de conversión de DLGA a ARA puede usarse para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que una velocidad de conversión de aproximadamente el 75% a 80% puede usarse para producir una proporción de ARA respecto DGLA de aproximadamente 6:1. Por tanto, sea en un sistema de cultivo de células o en un animal huésped, la regulación del momento, extensión y especificidad de la expresión de la desaturasa tal como se describe, puede usarse para modular los niveles y proporciones de PUFA. Dependiendo del sistema de expresión usado, por ejemplo, un cultivo de células o un animal que expresa aceite o aceites en su leche, los aceite también pueden aislarse y combinarse de nuevo en las concentraciones y proporciones deseadas. La cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFA pueden determinarse siguiendo protocolos estándares. Los PUFA, o las células huéspedes que los contienen, pueden usarse también como suplementos alimentarios para animal para alterar la composición en ácidos grasos de un tejido o la leche del animal hacia una más deseable para consumo humano o animal.
Para el suplemento dietético, los PUFA purificados, o los derivados de los mismos, pueden incorporarse en los aceites, grasas o margarinas de cocción, formulados de tal forma que el receptor recibiría la cantidad deseada con un uso normal. Los PUFA también pueden incorporarse en fórmulas para niños, suplementos nutricionales u otros productos alimentarios, y puede hallar un uso como agentes antiinflamatorios o reductores del colesterol.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención comprenden uno o más de los ácidos y/o aceites resultantes de acuerdo con los procedimientos descritos en ésta. Más específicamente, una composición farmacéutica puede comprender uno o más de los ácidos y/o aceites, así como un portador estándar, bien conocido, no tóxico, y farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o vehículo, tal como, por ejemplo, la solución salina tamponada con fosfato, el agua, el etanol, los polioles, los aceites vegetales, un agente humectativo, o una emulsión tal como una emulsión agua/aceite. La composición puede estar en una forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de una tableta, cápsula, líquido o polvo ingerible, inyectable, pomada tópica o crema.
Las posibles rutas de administración incluyen, por ejemplo, la oral, la rectal y la parenteral. La ruta de administración dependerá, por supuesto, del efecto deseado. Por ejemplo, si la composición se está utilizando para tratar una piel rugosa, seca o envejecida, para tratar piel lesionada o quemada, o para tratar piel o cabello afectados por una enfermedad o condición, tal vez se aplicaría tópicamente.
La dosificación de la composición a administrar al paciente puede ser determinada por alguien con formación ordinaria en la técnica, y depende de varios factores, tales como el peso del paciente, la edad del paciente, el estado inmune del paciente, etc.
En relación a la forma, la composición puede ser, por ejemplo, una solución, una dispersión, una suspensión, una emulsión, o un polvo estéril que se reconstituye a continuación.
Adicionalmente, la composición que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención puede utilizarse con propósitos cosméticos. Puede añadirse a composiciones cosméticas pre-existentes, de modo que se forme una mezcla, o puede usarse como una composición sola.
Las composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para administrar el componente PUFA a un individuo. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, y polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones estériles para su ingestión. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos apropiados incluyen el agua, el etanol, los polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como el etiloleato. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido, en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico y similares. Aparate de tales diluyentes inertes, la composición puede incluir también adyuvantes, tales como agentes humectativos, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, de condimento y fragancias.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, como por ejemplo, los alcoholes isostearilos etoxilados, el los ésteres de sorbitol y sorbitán con polioxietileno, la celulosa microcristalina, el metahidróxido de aluminio, la bentonita, el agar-agar, y el tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares.
Las formas de dosificación sólidas, tales como las tabletas y cápsulas, pueden prepararse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención pueden formularse en tabletas con bases de tabletas convencionales, tales como la lactosa, la sacarosa, y el almidón de maíz, en combinación con unidores tales como acacia, almidón de maíz, o gelatina, agentes desintegradores tales como el almidón de patata o el ácido algínico, y un lubricante tal como el ácido esteárico o el estearato magnésico. Las cápsulas pueden prepararse incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con los antioxidantes y el componente PUFA. La cantidad de los antioxidantes y del componente PUFA que debería incorporarse en la formulación farmacéutica debería hallarse dentro de las directrices discutidas más arriba.
Tal como se usa en esta solicitud, el término "tratar" se refiere, bien a prevenir, o a reducir la incidencia del acontecimiento no deseado. Por ejemplo, tratar la supresión inmune se refiere a prevenir la ocurrencia de esta supresión o a reducir la cantidad de tal supresión. Los términos "paciente" e "individuo" se usan de forma intercambiable, y ambos de refieren a un animal. El término "animal", tal como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier mamífero de sangre caliente, incluyendo, pero no limitándose a, los perros, humanos, monos y simios. Tal como se usa en la solicitud, el término "aproximadamente" se refiere a una cantidad que varía respecto el rango o número indicado en una cantidad razonable dependiendo del contexto de uso. Cualquier número o rango numérico especificado en la especificación debería considerarse que está modificado por el término "aproximadamente".
"Dosis" y "servicio" se usan de forma intercambiable, y se refieren a la cantidad de composición nutricional o farmacéutica ingerida por el paciente en una composición única y diseñada para proporcionar cantidades efectivas de los antioxidantes y el triglicérido estructurado. Como será fácilmente evidente a los especialistas en la técnica, una única dosis o servicio del polvo nutricional líquido debería proporcionar la cantidad de antioxidantes y PUFA discutida más arriba. La cantidad de la dosis o servicio debería tener un volumen tal que un adulto típico lo pueda consumir de una vez. Esta cantidad puede variar ampliamente dependiendo de la edad, peso, sexo o condición médica del paciente. No obstante, como pauta general, un servicio o dosis única de un producto nutricional líquido debería considerarse que abarca desde 100 hasta 600 ml, más preferiblemente desde 125 hasta 500 ml, y lo más preferiblemente desde 125 hasta 300 ml.
Los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención también pueden añadirse a los alimentos, incluso cuando no se requieren suplementos de la dieta. Por ejemplo, la composición puede añadirse a alimentos de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitándose a, margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogures, chocolate, golosinas, tentempiés, aceites para ensaladas, aceites de cocción, grasas de cocción, pescados y bebidas.
Aplicaciones farmacéuticas
Para un uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones se administran generalmente de forma oral, pero pueden administrarse por cualquier ruta por la que puede ser exitosamente absorbida, por ejemplo, parenteralmente (es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosamente), rectalmente o vaginalmente o tópicamente, por ejemplo, como una pomada o loción para la piel. Los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invención pueden administrarse solos o en combinación con otro portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando están disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma de administración oral preferida. El suplemento dietético, tal como se ha establecido más arriba, puede proporcionar también una ruta oral de administración. Los ácidos insaturados pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o prodrogas de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable está contemplada, son especialmente preferidas las sales de sodio, potasio o litio. También se contemplan las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como la N-metilglucamina, halladas en la publicación del PCT WO-96/33.155. Los ésteres preferidos son los etilésteres. Como sales sólidas, los PUFA pueden administrarse también en forma de tableta. Para la administración intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralipids. El perfil típico de ácidos grasos en adultos normales comprende del 6,64 al 9,46% de ARA, del 1,45 al 3,11% de DGLA, y del 0,02 al 0,08% de GLA. Estos PUFA o sus precursores metabólicos pueden administrarse, bien sólos o en mezclas con otros PUFA, para conseguir un perfil de ácidos grasos normal en un paciente. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones pueden proporcionarse individualmente en forma de equipo, para uso único o múltiple. Una dosificación típica para un ácido graso particular va desde 0,1 mg hasta 20 g, o incluso 100 g, diarios, y preferiblemente es de 10 mg hasta 1, 2, 5 ó 10 g diarios según se requiera, o cantidades molares equivalentes de formas derivadas del mismo. Se contemplan las composiciones de nutrición parenteral que comprenden desde aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 30 por ciento en peso de ácidos grasos, calculados como triglicéridos; la preferida es una composición que tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente el 25 por ciento de la composición de PUFA total como GLA (USPN 5.196.198). Opcionalmente pueden añadirse otras vitaminas, y particularmente vitaminas solubles en grasas, tales como las vitaminas A, D, E y la L-carnitina. Cuando se desee, puede añadirse un conservante tal como el \alpha-tocoferol, típicamente a aproximadamente el 0,1% en peso.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas, dispersiones, suspensiones o emulsiones estériles y fisiológicamente aceptables, o polvos estériles para su reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos acuosos y no acuosos incluyen el agua, el etanol, los polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables tales como el etiloleato. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula, en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. También puede ser deseable la inclusión de agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, y similares. Aparte de tales diluyentes inertes, la composición puede incluir también adyuvantes, tales como agentes humectativos, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, de condimento y fragancias.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, como por ejemplo, los alcoholes de isostearilo etoxilados, el polioxietilen sorbitol y los ésteres de sorbitán, la celulosa microcristalina, el metahidróxido de aluminio, la bentonita, el agar-agar, y el tragacanto, o mezclas de estas sustancias y las
similares.
Una composición farmacéutica especialmente preferida contiene ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos disueltos en un medio acuoso o solvente. Los ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos tienen un valor de HLB de aproximadamente 9-12, y son significativamente más hidrofílicos que los lípidos antimicrobianos existentes, que tienen valores de HLB de 2-4. Esos lípidos hidrofílicos existentes no pueden formularse en soluciones acuosas. Tal como se descubre en ésta, esos lípidos pueden solubilizarse ahora en medio acuoso en combinación con ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos. De acuerdo con esto, los ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos (por ejemplo, DATEM-C12:0) se funden con otros lípidos antimicrobianos activos (por ejemplo, monoglicéridos de 18:2 y 12:0) y se mezclan para obtener una mezcla homogénea. La homogeneidad permite una actividad antimicrobiana incrementada. La mezcla puede dispersarse completamente en agua. Esto no es posible sin la adición de ésteres del ácido diacetiltartárico con mono- y diglicéridos, y mezclando previamente con otros monoglicéridos antes de su introducción en agua. Las composición acuosa puede mezclarse a continuación en condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propulsores, tal como puede requerirse para formar un aerosol o inhalante, fisiológicamente aceptables.
Numerosos trastornos pueden tratarse con los ácidos grasos que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invención. El suplemento con los PUFA que pueden obtenerse usando los procedimientos de la presente invención puede usarse para tratar la reestenosis posterior a la angioplastia. Los síntomas de inflamación, de la artritis reumatoide, y del asma y psoriasis pueden tratarse con los PUFA. La evidencia indica que los PUFA pueden estar implicados en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento o prevención de la osteoporosis y de los cálculos renales o urinarios.
Los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento del cáncer. Se ha observado que las células malignas tienen una composición de ácidos grasos alterada; se ha observado que la adición de ácidos grasos retrasa su crecimiento y causa la muerte celular, y para incrementar su susceptibilidad a los agentes quimioterapéuticos. Se ha mostrado que el GLA causa la expresión de nuevo en células cancerosas de las moléculas de adhesión celular E-cadherinas, la pérdida de las cuales está asociada con las metástasis agresivas. El ensayo clínico de la administración intravenosa de sales de litio de GLA solubles en agua a pacientes con cáncer de páncreas produjo incrementos estadísticamente significativos en su supervivencia. El suplemento con PUFA puede ser útil también para tratar la caquexia asociada con el cáncer.
Los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invención se han usado también para tratar la diabetes (USPN 4.826.877; Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. 57 (supl): 732S-737S). Se ha demostrado el metabolismo y composición alterados de ácidos grasos en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones están implicadas en alguna de las complicaciones a largo plazo resultantes de la diabetes, incluyendo la retinopatía, la neuropatía, la nefropatía, y el daño del sistema reproductor. Se ha mostrado que el aceite de onagra, el cual contiene GLA, previene e invierte la lesión diabética del nervio.
Los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invención se han usado para tratar eczemas, reducir la presión sanguínea, y mejorar las notas en matemáticas. Se ha sugerido que la deficiencia en ácidos grasos esenciales está implicada en el eczema, y hay estudios que han mostrado efectos beneficiosos sobre el eczema a partir del tratamiento con GLA. Se ha observado también que el GLA reduce los incrementos en la presión sanguínea asociados con el estrés, y que mejora los resultados en los exámenes de aritmética. Se ha mostrado que GLA y DGLA inhiben la agregación de las plaquetas, causan vasodilatación, disminuyen los niveles de colesterol, e inhiben la proliferación del tejido fibroso y muscular liso de las paredes de los vasos (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. 83:85-101 (1976)). La administración de GLA o DGLA, solos o en combinación con EPA, se ha mostrado que reduce o previene el sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios causados por fármacos antiinflamatorios no esteroideos (USPN 4.666.701). También se ha mostrado que el GLA y DGLA previenen o tratan la endometriosis y el síndrome pre-menstrual (USPN 4.758.592), y que tratan la encefalomielitis miálgica y la fatiga crónica después de las infecciones virales (USPN 5.116.871).
Los usos adicionales de los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de esta invención incluyen su uso en el tratamiento del SIDA, de la esclerosis múltiple, del síndrome respiratorio agudo, de la hipertensión, y de los desarreglos de la piel. Los PUFA pueden usarse también en fórmulas para la salud en general así como para tratamientos geriátricos.
Aplicaciones veterinarias
Debería destacarse que las composiciones farmacéuticas y nutricionales antes descritas pueden utilizarse en relación con animales, así como con humanos, puesto que los animales experimentan las mismas necesidades y condiciones que los humanos. Por ejemplo, el aceite o ácidos que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invención pueden utilizarse como suplementos de alimentación animal.
Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustración y no de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1 Construcción de una biblioteca de ADNc a partir de Mortierella alpina.
Ejemplo 2 Aislamiento de una secuencia nucleotídica de \Delta6-desaturasa a partir de Mortierella alpina
Ejemplo 3 Identificación de homólogos de la \Delta6-desaturasa Mortierella alpina
Ejemplo 4 Aislamiento de una secuencia nucleotídica de \Delta12-desaturasa a partir de Mortierella alpina
Ejemplo 5 Expresión de los clones de desaturasa de M. alpina en levadura de panadería
Ejemplo 6 Optimización inicial de las condiciones de cultivo
Ejemplo 7 Distribución de los PUFA en las fracciones lipídicas de levadura
Ejemplo 8 Optimización adicional del cultivo y coexpresión de las desaturasas \Delta6 y \Delta12
Ejemplo 9 Identificación de homólogos con las desaturasas \Delta5 y \Delta6 de M. alpina
Ejemplo 10 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA
Ejemplo 11 Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA
Ejemplo 12 Secuencias de genes de desaturasas humanas
Ejemplo 13 Composiciones nutricionales 
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Ejemplo 1
Construcción de una biblioteca de ADNc a partir de Morterilla alpina
El ARN total se aisló a partir de un cultivo de 3 días de edad de Morteriella alpina que producía PUFA usando el protocolo de Hoge et al., Experimental Mycology, 6:225-232 (1982). El ARN se usó para preparar un ADNc de doble hebra usando el sistema de BLR lambda-ZipLox siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empaquetaron por separado fracciones de varios tamaños de ADNc de M. alpina para obtener bibliotecas con diferentes insertos de tamaño promediado. Una biblioteca de "longitud completa" contiene aproximadamente 3 x 10^{6} clones con una tamaño promedio de inserto de 1,77 kb. La biblioteca "del tipo secuenciación" contiene aproximadamente 6 x 10^{5} clones con un tamaño promedio del inserto de 1,1 kb.
Ejemplo 2
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta6-desaturasa a partir de Mortierella alpina
Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico a partir de un clon parcial de ADNc, Ma524, que codificaba una \Delta6-desaturasa de ácidos grasos de Mortierella alpina mediante la secuenciación aleatoria de clones procedentes de la biblioteca del tipo secuenciación de ADNc de M. alpina descrita en el Ejemplo 1. Los plásmidos que contenían el ADNc se cortaron como sigue.
Se combinaron 5 \mul de fagos con 100 \mul de E. coli DH10B(ZIP) crecida en ECBL más 10 mg/ml de kanamicina, 0,2% de maltosa, y Mg_{2}SO_{4} 10 mM, y se incubaron a 37\degC durante 15 minutos. Se añadieron 0,9 ml de SOC e inmediatamente se sembraron 100 \mul de bacteria en cada una de las 10 placas de ECLB + 50 \mug Pen. No se necesitó ningún tiempo de 45 minutos de recuperación. Las colonias se recogieron en medio ECBL + 50 \mug Pen para cultivos de una noche a ser usados para preparar reservas en glicerol y ADN de miniprep. Una alícuota del cultivo para el miniprep se almacenó como reserva en glicerol. El sembrado de ECLB + 50 \mug Pen/ml resultó en más colonias y en una mayor proporción de colonias conteniendo insertos que el sembrado sobre 100 mug/ml Pen.
Se tomaron colonias aleatoriamente y el ADN plasmídico se purificó usando equipos miniprep de Qiagen. La secuencia de ADN se obtuvo partir del extremo 5' del inserto de ADNc y se comparó con la base de datos no redundante del National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando el algoritmo BLASTX. El Ma524 se identificó como una desaturasa putativa basándose en homología de secuencia de ADN con desaturasas previamente identificadas.
Se aisló un clon de ADNc de longitud completa a partir de la biblioteca de tamaño completo de M. alpina y se denominó pCGN5532. El ADNc está contenido como un inserto de 1617 p.b. en el vector pZL1 (BRL) y, empezando con el primer ATG, contiene una pauta de lectura abierta que codifica 457 aminoácidos. Las tres "cajas de histidina" que se sabe están conservadas entre desaturasas unidas a membrana (Okuley et al., The Plan Cell 6:147-158 (1994)) se halló que estaban presentes en las posiciones de aminoácidos 172-176, 209-213, y 395-399 (ver Figura 3). Al igual que con otras \Delta6-desaturasa unidas a membrana, se halló que el motivo final HXXHH de la caja de histidina era QXXHH. Se halló que la secuencia de Ma524 presentaba una homología significativa con una porción de un cósmido de Caenorhabditis elegans, WO6D2.4, una proteína de fusión citocromo 5/desaturasa del girasol, y las \Delta6-desaturasas de Synechocystis y Spirulina. Además, se observó que Ma524 tenía homología con la secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa de borraja (Publicación del PCT WO 96/21022). Por tanto, Ma524 parece codificar una \Delta6-desaturasa que está relacionada con las \Delta6-desaturasa de borraja y de algas. Las secuencias peptídicas se muestran como SEC. Nº ID.: 5 - SEC. Nº ID.: 11.
Se halló que el extremo amino-terminal de la proteína codificada mostraba una homología significativa con las proteínas del citocromo b5. El clon de ADNc de Mortierella parece representar una proteína de fusión entre un citocromo b5 y una desaturasa de ácido graso. Puesto que se cree que el citocromo b5 funciona como un donante de electrones para enzimas desaturasa unidos a membrana, es posible que el dominio N-terminal citocromo b5 de esta proteína desaturasa esté implicado en su función. Esto puede ser una ventaja cuando se expresa la desaturasa en sistemas heterólogos para la producción de PUFA. Sin embargo, debería destacarse que, aunque se halló que las secuencias de aminoácidos de la Ma524 y de la \Delta6 de borraja contenían regiones con homología, se vio que las composiciones en bases de los ADNc eran significativamente diferentes. Por ejemplo, se observó que el ADNc de borraja tenía una composición global de 60% A/T, con algunas regiones excediendo del 70%, mientras que se observó que el Ma524 tiene un promedio del 44% de A/T de composición de base, sin regiones que excedieron del 60%. Esto puede tener implicaciones para expresar el ADNc en microorganismos o animales que favorecen diferentes composiciones de bases. Se sabe que puede ocurrir la pobre expresión de los genes recombinantes cuando el huésped prefiere una composición de bases diferente de la del gen introducido. Los mecanismos para tal pobre expresión incluyen una estabilidad disminuida, sitios de ayuste crípticos, y/o la traducibilidad del ARNm y similares.
Ejemplo 3
Identificación de \Delta6-desaturasas homólogas de la \Delta6-desaturasa de Mortierella alpina
Se identificaron las secuencias de ácido nucleico que codifican \Delta-6-desaturasa putativas a través de una búsqueda BLASTX de las bases de datos de "Margas de Secuencia Expresadas" ("EST") a través del NCBI usando la secuencia de aminoácidos del Ma524. Diversas secuencias mostraron homología significativa. En particular, la secuencia de aminoácidos deducida de dos secuencias de Arabidopsis thaliana, (números de acceso F13728 y T42806) mostró homología con dos regiones diferentes de la secuencia de aminoácidos deducida del Ma524. Se diseñaron los siguientes cebadores de la PCR: ATTS4723-FOR (complementario de F13728) 5' CUACU ACUAC UAGGA GTCCT CTACG GTGTT TTG (SEC. Nº ID.: 13) y T42806-REV (complementario de T42806) 5' CAUCA UCAUC AUATG ATGCT CAAGC TGAAA CTG (SEC. Nº ID.:14). Se transcribieron a la inversa cinco \mug de ARN total, aislado a partir de silicuas en desarrollo de Arabidopsis thaliana, usando el superscript RTase del BRL y el cebador TSyn (5'-CCAAG CTTCT GCAGG AGCTC TTTTT TTTTT TTTTT-3') y se muestra como SEC. Nº ID.:12. La PCR se llevó a cabo en un volumen de 50 \mul que contenía: plantilla derivada del 25 ng de ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 \muM de cada desoxiribonucleótido trifosfato, Tris-HCl 60 mM, pH 8,5, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgCl_{2} 2 mM, 0,2 U de polimerasa Taq. Las condiciones de los termociclos fueron como sigue: 94 grados durante 30 segundos, 50 grados durante 30 segundos, 72 grados durante 30 segundos. La PCR se continuó durante 35 ciclos seguidos por una extensión adicional a 72 grados durante 7 minutos. La PCR resultó en un fragmento de aproximadamente \sim750 pares de bases, el cual se subclonó, denominó 12-5, y se secuenció. Cada extremo de este fragmento se formó para corresponder a la EST de Arabidopsis a partir de la cual se habían diseñado los cebadores. La secuencia de aminoácidos putativa de 12-5 se comparó con la de Ma524, y EST de humano (W28140), ratón (W53753), y C. elegans (R05219) (ver Figura 4). Los patrones de homología con la \Delta6-desaturasa de Morteriella indican que estas secuencias representan polipéptidos de desaturasa putativos. En base a esta estrategia experimental, es probable que puedan clonarse genes de longitud completa usando sondas basadas en las secuencias EST. A continuación de la clonación, los genes pueden colocarse en vectores de expresión, expresarse en células huéspedes, y su actividad específica \Delta6-, u otras actividad desaturasa, puede determinarse como se describe más abajo.
Ejemplo 4
Aislamiento de una secuencia de nucleótidos de \Delta12-desaturasa a partir de Mortierella alpina
En base a los ácidos grasos que acumula, parecía probable que Mortierella alpina tuviera un tipo de desaturasas \omega6. La \omega6-desaturasa es responsable de la producción del ácido linoleico (18:2) a partir del ácido oleico (18:1). El ácido linoleico (18:2) es sustrato para una \Delta6-desaturasa. Este experimento se diseñó para determinar si Mortierella alpina tiene un polipéptido \Delta12-desaturasa, y, si lo tiene, para identificar la secuencia nucleotídica correspondiente.
Se secuenció una colonia aleatoria procedente de la biblioteca del tipo secuenciación de M. alpina, Ma648, y se identificó como una desaturasa putativa en base a la homología de la secuencia de ADN con desaturasas previamente identificadas, tal como se describió para Ma524 (ver Ejemplo 2). La secuencia de nucleótidos se muestra en SEC. Nº ID.: 13. La secuencia peptídica se muestra en SEC. Nº ID.: 4. La secuencia de aminoácidos deducida desde el extremo 5' del ADNc de Ma648 muestra una homología significativa con la \omega6-desaturasa (\Delta12) microsomal (código de acceso #L43921) así como con la oleato-12-hidroxilasa del ricino (código de acceso #U22378). Además, se observó homología cuando se comparaba con una variedad de otras secuencias de desaturasas \omega6 (\Delta12) y \omega3 (\Delta15) de ácidos grasos.
Ejemplo 5
Expresión de los clones de \Delta5-desaturasa de M. alpina en levadura de panadería Transformación de la levadura
La transformación de las levaduras con acetato de litio se realizó de acuerdo con protocolos estándares (Methods in Enzymology 194:186-187 (1991)). En resumen, se cultivaron las levaduras en YPD a 30ºC. Se recolectaron las células mediante centrifugación, se resuspendieron en TE, se recolectaron de nuevo mediante centrifugación, y se resuspendieron en TE que contenía acetato de litio 100 mM, se recolectaron de nuevo mediante centrifugación, y se resuspendieron en TE/acetato de litio. Las levaduras resuspendidas se incubaron a 30ºC durante 60 minutos con agitación. Se añadió el ADN portador, y se alicuotaron las levaduras en tubos. Se añadió el ADN transformante, y se incubaron los tubos durante 30 minutos a 30ºC. Se añadió una solución de PEG, PEG 400 (35% p/p), acetato de litio 100 mM, TE pH 7,5) seguida por una incubación de 50 minutos a 30ºC. Se realizó un choque térmico de 5 minutos a 42ºC, se precipitaron las células, se lavaron con TE, se precipitaron de nuevo, y se resuspendieron en TE. A continuación, las células resuspendidas se sembraron sobre medio selectivo.
Expresión de la desaturasa en levaduras transformadas
Los clones de ADNc de Mortierella alpina se examinaron en busca de actividad desaturasa en levadura de panadería. Como control positivo se usó una \Delta15-desaturasa de colza (obtenida mediante PCR usando la primera hebra del ADNc procedente de semillas Cultivar 212/86 de Brassica napus usando cebadores basados en la secuencia publicada (Arondel et al., Science 258:1353-1355)). El gen de la \Delta15-desaturasa y el gen procedente del clon mA29 de ADNc se insertaron en el vector de expresión pYES2 (Invitrogen), resultando respectivamente en los plásmidos pCGR-2 y pCGR-4. Estos plásmidos se transfectaron en la cepa 334 de la levadura S. cerevisiae y se expresaron después de la inducción con galactosa y en presencia de sustratos que permitían la detección de la actividad desaturasa específica. La cepa control fue la cepa 334 de S. cerevisiae que contenía el vector pYES2 inalterado. Los sustratos usados, los productos producidos, y las actividad desaturasa indicada fueron: el DGLA (la conversión a ARA indicaría actividad \Delta5-desaturasa), el ácido linolénico (la conversión a GLA indicaría actividad \Delta6-desaturasa; la conversión a ALA indicaría actividad \Delta15-desaturasa), el ácido oleico (un sustrato endógeno sintetizado por S. cerevisiae, la conversión a ácido linolénico indicaría actividad \Delta12-desaturasa; de la cual carece S. cerevisiae), o el ARA (la conversión a EPA indicaría actividad \Delta17-desaturasa). Los resultados se proporcionan más abajo en la Tabla 1. Las fracciones lipídicas se extrajeron como sigue.
Los cultivos se dejaron crecer durante 48-52 horas a 15ºC. Las células se precipitaron mediante centrifugación, se lavaron una vez con ddH_{2}O estéril, y se precipitaron de nuevo. Los precipitados se agitaron con metanol; se añadió cloroformo junto con tritridecanoína (como estándar interno). Las mezclas se incubaron durante al menos una hora a temperatura ambiente o a 4ºC durante la noche. Se extrajo la capa de cloroformo y se filtró a través de un filtro Whatman con un gramo de sulfato sódico anhidro para suprimir las partículas y el agua residual. Los solventes orgánicos se evaporaron a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos extraídos se derivatizaron a continuación a metilésteres de ácidos grasos (FAME) para su análisis mediante cromatografía de gases (GC) mediante la adición de 2 ml de hidróxido potásico 0,5 N en metanol en un tubo cerrado. Las muestras se calentaron hasta los 95ºC a 100ºC durante 30 minutos y se enfriaron hasta temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 2 ml de trifluoruro de boro al 14% en metanol y se repitió el calentamiento. Después de enfriada la mezcla de lípidos extraída, se añadieron 2 ml de agua y 1 ml de hexano a los FAME extraídos para su análisis mediante GC. El porcentaje de conversión se calculó dividiendo el producto producido por la suma de (el producto producido y el sustrato añadido) y se multiplicó a continuación por 100. Para calcular el porcentaje de conversión del ácido oleico, puesto que no se añadió ningún sustrato, el ácido linolénico producido se dividió por la suma de (ácido oleico y ácido linolénico producidos), y se multiplicó a continuación por 100. En la Tabla 1 siguiente se proporcionan los resultados de la actividad
desaturasa.
TABLA 1
Expresión de la desaturasa de M. alpina en levadura de panadería
Clon Tipo de actividad enzimática % De conversión de sustrato
pCGR-2
(\Delta15 desaturasa de colza) \Delta6 0 (18:2 a 18:3\omega6)
\Delta15 16,3 (18:2 a 18:3\omega3)
\Delta5 2,0 (20:3 a 20:4\omega6)
\Delta7 2,0 (20:3 a 20:4\omega6)
\Delta12 2,0 (20:3 a 20:4\omega6)
pCGR-5
(Ma524 de M. alpina) \Delta6 6,0
\Delta15 0
\Delta5 2,1
\Delta7 0
\Delta12 3,3
pCGR-7
(Ma648 de M. alpina) \Delta6 0
\Delta15 3,8
\Delta5 2,2
\Delta7 0
\Delta12 63,4
El clon control de la \Delta15-desaturasa exhibió un 16,3% de conversión del sustrato. El clon pCGR-5 que expresaba el ADNc del Ma524 mostró un 6& de conversión del sustrato a GLA, indicando que el gen codifica una \Delta6-desaturasa. El clon pCGR-7, que expresaba el ADNc del Ma648, convirtió el 63,4% de la conversión del sustrato a LA, indicando que el gen codifica una \Delta12-desaturasa. El valor de fondo (conversión no específica de sustrato) estuvo entre 0-3% en estos casos. También hallamos inhibición de la actividad por sustrato usando diferentes concentraciones del sustrato. Cuando el sustrato se añadía a 100 \muM, el porcentaje de conversión a producto disminuía en comparación a cuando el sustrato se añadía a 25 \muM (ver más abajo). Adicionalmente, variando las concentraciones de sustrato entre 5 \muM y 200 \muM, se halló que las velocidades de conversión oscilaban entre aproximadamente el 5% hasta aproximadamente más del 75%. Estos datos muestran que pueden expresarse desaturasas con diferentes especificidades de sustrato en un sistema heterólogo, y usarse para producir ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados.
La Tabla 2 representa los ácidos grasos de interés como porcentaje del lípido total extraído de la levadura huésped S. cerevisiae S334 con el plásmido indicado. No había glucosa presente en el medio de cultivo. Se usó la cromatografía de gas de afinidad para separar los respectivos lípidos. Se empleó GC/MS para verificar la identidad del producto o de los productos. El producto esperado para la \Delta15-desaturasa de B. napus, el ácido \alpha-linolénico, se detectó cuando su sustrato, el ácido linolénico, se añadía exógenamente al cultivo de levaduras inducido. Este hallazgo demuestra que la expresión en levadura de un gen de desaturasa puede producir un enzima funcional y cantidades detectables del producto en las condiciones de cultivo actuales. Ambos sustratos añadidos exógenamente fueron captados por la levadura, aunque se incorporó algo menos del PUFA de cadena más larga, ácido dihomo-\gamma-linolénico (20:3), que del ácido linolénico (18:2) cuando cualquiera de ellos se añadía en forma libre a los cultivos de levaduras inducidos. El ácido \gamma-linolénico se detectó cuando el ácido linoleico estaba presente durante la inducción y expresión de S. cerevisiae 334 (pCGR-5). La presencia de este PUFA demuestra la actividad \Delta6-desaturasa de pCGR-5 (MAS524). El ácido linoleico identificado en los lípidos extraídos de la expresión de S. cerevisiae 334 (pCGR-7) clasifica el ADNc de Ma648 procedente de M. alpina. como la \Delta12-desaturasa.
TABLA 2 Ácidos grasos como porcentaje de los lípidos totales extraídos de levadura
Plásmido en 18:2 \alpha-18:3 \gamma-18:3 20:3 20:4 18:1* 18:2
las levaduras incorporado producido producido producido producido producido producido
pYES2 66,9 0 0 58,4 0 4 0
(control)
pCGR-2 60,1 5,7 0 50,4 0 0,7 0
(\Delta15)
pCGR-5 62,4 0 4,0 49,9 0 2,4 0
(\Delta6)
pCGR-7 65,6 0 0 45,7 0 7,1 12,2
(\Delta12)
Añadido sustrato 100 \muM
*18:1 es un ácido graso endógeno en levaduras
Claves para las Tablas
18:1 = ácido oleico
18:2 = ácido linolénico
\alpha-18:3 = ácido \alpha-linolénico
\gamma-18:3 = ácido \gamma-linolénico
18:4 = ácido estearidónico
20:3 = ácido dihomo-\gamma-linolénico
20:4 = ácido araquidónico
Ejemplo 6
Optimización de las condiciones de cultivo
La Tabla 3A muestra el efecto de la concentración de sustrato de ácido graso sobre la captación y conversión en levadura a producto de ácido graso como un porcentaje del lípido total de levadura extraído. En todos los casos, las cantidades pequeñas de sustrato exógeno (1-10 \muM) resultaron en una baja captación de ácido graso sustrato y formación de producto. Una concentración de ácido graso libre en el medio de cultivo e inducción entre 25 y 50 \muM rindió el porcentaje más elevado de producto de ácido graso formado, mientras que una concentración de 100 \muM y una captación subsiguiente más elevada en levadura parecía disminuir o inhibir la actividad desaturasa. La cantidad de ácido graso sustrato para levaduras que expresaban la \Delta12-desaturasa fue similar bajo las mismas condiciones de cultivo, puesto que el sustrato, ácido oleico, es un ácido graso endógeno de levadura. El uso de ácido \alpha-linolénico como un sustrato adicional para el pCGR-5 (\Delta6) produjo el resultado esperado, ácido estearidónico (Tabla 3A). La retroinhibición por la concentración elevada de ácido graso sustrato se ilustró claramente cuando se compararon en la Tabla 3B las velocidades de porcentaje de conversión de los respectivos ácidos graso sustrato en sus respectivos productos. En todos los casos, la concentración de sustrato 100 \muM en el medio de cultivo disminuyó el porcentaje de conversión en producto. La captación de \alpha-linolénico fue comparable a la de otros PUFA añadidos en forma libre, mientras que el porcentaje de conversión de \Delta6-desaturasa, 3,8-17,5%, al ácido estearidónico producto fue el más bajo para todos los sustratos examinados (Tabla 3B). El efecto del medio, tal como el YPD (medio rico) en comparación con el medio mínimo con glucosa sobre la velocidad de conversión de la \Delta12-desaturasa fue dramático. No sólo calló la velocidad de conversión del ácido oleico en ácido linoleico (Tabla 3B), sino que el porcentaje de ácido linoleico formado también disminuyó en un 11% cuando se usó medio rico para el crecimiento e inducción de la expresión de la \Delta12-desaturasa de levadura (Tabla 3A). El efecto de la composición del medio fue también evidente cuando la glucosa estaba presente en el medio de cultivo para la \Delta6-desaturasa, puesto que el porcentaje de captación de sustrato disminuyó a 25 \muM (Tabla 3A). Sin embargo, la velocidad de conversión permaneció la misma y el porcentaje de producto formado disminuyó para la \Delta6-desaturasa en presencia de glucosa.
\newpage
TABLA 3A
Efecto del sustrato añadido sobre el porcentaje de sustrato incorporado y producto formado en los
extracto de levaduras
Plásmido en las levaduras pCGR-2 pCGR-5 pCGR-5 pCGR-7
(\Delta15) (\Delta6) (\Delta6) (\Delta12)
sustrato/producto 18:2/\alpha-18:3 18:2/\gamma-18:3 \alpha-18:3/18:4 18:1*/18:2
1 \muM sub. N.D. 0,9/0,7 N.D. N.D.
10 \muM sub. N.D. 4,2/2,4 10,4/2,2 N.D.
25 \muM sub. N.D. 11/3,7 18,2/2,7 N.D.
25 \muM \lozenge sub. 36,6/7,2 25,1/10,3 N.D. 6,6/15,80
\lozenge \lozenge
50 \muM sub. 53,1/6,5 N.D. N.D. 10,8/13*
\lozenge
100 \muM sub. 60,1/5,7 62,4/4 47,7/1,9 10/24,8
\lozenge \lozenge \lozenge \lozenge 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3B
Efecto de la concentración de sustrato en el medio sobre el porcentaje de conversión
del sustrato de ácido graso a producto en los extracto de levaduras
Plásmido en las levaduras pCGR-2 pCGR-5 pCGR-5 pCGR-7
(\Delta15) (\Delta6) (\Delta6) (\Delta12)
sustrato/producto 18:2/\alpha-18:3 18:2/\gamma-18:3 \alpha-18:3/18:4 18:1*/18:2
1 \muM sub. N.D. 43,8 N.D. N.D.
10 \muM sub. N.D. 36,4 17,5 N.D.
25 \muM sub. N.D. 25,2 12,9 N.D.
25 \muM \lozenge sub. 16,40 29,10 N.D. 70,50
50 \muM sub. 10,90 N.D. N.D. 54,6*
100 \muM sub. 8,70 60 3,8 71,3
\lozenge \hskip0.7cm sin glucosa en el medio
+ \hskip0.7cm caldo de peptona de levadura (YPD)
*18:1 \hskip0.1cm es un lípido de levadura endógeno
sub. \hskip0.3cm es la concentración de sustrato
N.R. \hskip0.2cm no se ha realizado
La Tabla 4 muestra la cantidad de ácido graso producido por una desaturasa recombinante a partir de cultivos de levaduras inducidos cuando se usaron diferentes cantidades sustrato de ácido graso libre. Se determinó el peso de ácido graso puesto que la cantidad total de lípido varió dramáticamente cuando se cambiaron las condiciones de cultivo, tales como la presencia de glucosa en el medio de cultivo e inducción de levaduras. Para determinar mejor las condiciones en las que la desaturasa recombinante produciría el máximo de producto PUFA, se examinó la cantidad de ácidos grasos individuales. La ausencia de glucosa redujo a la mitad la cantidad de ácido linoleico producido por la \Delta12-desaturasa. Para la \Delta12-desaturasa, la cantidad de lípidos de levadura totales disminuyó en casi la mitad en ausencia de glucosa. De igual opuesta, la presencia de glucosa en el medio de cultivo de levadura para la \Delta12-desaturasa disminuye el ácido \gamma-linolénico producido en casi la mitad, mientras que la cantidad total de lípido de levadura producido no fue alterada por la presencia/ausencia de glucosa. Esto apunta a un posible rol para la glucosa como modulador de la actividad \Delta6-desaturasa.
TABLA 4
Ácido graso producido en \mug a partir de los extracto de levaduras
Plásmido en las levaduras (enzima) pCGR-4 (\Delta5) pCGR-5 (\Delta6) pCGR-7 (\Delta12)
producto \gamma-18:3 18:4 18:2*
1 \muM sub. 1,9 N.R. N.R.
10 \muM sub. 5,3 4,4 N.R.
25 \muM sub. 10,3 8,7 115,7
25 \muM \lozenge sub. 29,6 N.R. 39,0
\lozenge \hskip0.8cm sin glucosa en el medio
sub. \hskip0.4cm es la concentración de sustrato
*18:1, \hskip0.1cm el sustrato, es un lípido de levadura endógeno
N.R. \hskip0.3cm no se ha realizado 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
Distribución de los PUFA en las fracciones lipídicas de levaduras
La Tabla 5 ilustra la captación de ácidos grasos libres y sus nuevos productos formados en los lípidos de levaduras tal como están distribuidos en las principales fracciones lipídicas. Se preparó un extracto lipídico total como se describió más arriba. El extracto lipídico se separó sobre placas de TLC, y las fracciones se identificaron mediante comparación con estándares. Las bandas se recogieron rascando, y se añadieron estándares internos. A continuación, se saponificaron las fracciones y se metilaron como más arriba, y se sometieron a cromatografía en gas. La cromatografía en gas calculó la cantidad de ácido graso por comparación con un estándar. La fracción lipídica contenía la cantidad más elevada de PUFAs sustrato y producto para la actividad \Delta6-desaturasa. Parecería que los sustratos son accesibles en la forma de fosfolípido a las desaturasas.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5
Distribución de ácidos grasos en varias fracciones lipídicas de levadura en \mug
Fracción del ácido graso Fosfolípido Diglicérido Ácido graso libre Triglicérido Éster de colesterol
SC 166,2 6,2 15 18,2 15,6
(pCGR-4)
sustrato
20:3
SC 61,7 1,6 4,2 5,9 1,2
(pCGR-4)
producto
20:4
SC = (plásmido) S. cerevisiae 
\newpage
Ejemplo 8
Optimización adicional del cultivo y coexpresión de las desaturasas \Delta6 y \Delta12
Este experimento se diseñó para evaluar las condiciones de crecimiento e inducción para las actividades óptimas de las desaturasas en Saccharomyces cerevisiae. Se desarrolló una cepa de Saccharomyces cerevisiae (SC334) capaz de producir ácido \gamma-linolénico (GLA), para verificar la posibilidad de producción de PUFA en levadura. Los genes para la \Delta6 y \Delta12-desaturasas de M. alpina se coexpresaron en SC334. La expresión de la D12-desaturasa convirtió ácido oleico (presente en levaduras) a ácido linoleico. El ácido linoleico fue usado como sustrato por la \Delta12-desaturasa para producir GLA. La cantidad de GLA producido osciló entre 5-8% del total de ácidos grasos producidos en cultivos de SC334, y la velocidad de conversión del ácido linoleico a ácido \gamma-linolénico osciló entre del 30% al 50%. Se optimizó la temperatura de inducción, y también se determinó el efecto de cambiar la cepa del huésped sobre la expresión de los genes de la \Delta6 y \Delta12-desaturasas (respectivamente, MA524 y MA648).
Construcción del plásmido
La clonación del pCGR5 así como del pCGR7 se ha discutido más arriba. Para construir pCGR9a y pCGR9b, se amplificaron los genes de la \Delta6 y \Delta12-desaturasa usando el siguiente conjunto de cebadores. Los pRDS1 y 3 tenían un sitio Xhol y los cebadores pRDS2 y 4 tenían un sitio Xbal (indicado en negritas).
I. Cebadores para la amplificación de la \Delta6-desaturasa
a.
pRDS1 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCT GCT GCT CCC AGT GTG AGG
b.
pRDS2 AAC TGA TCT AGA TTA CTG CGC CTT ACC CAT CTT GGA GGC
II. Cebadores para la amplificación de la \Delta12-desaturasa
a.
pRDS3 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCA CCT CCC AAC ACT ATC GAT
b.
pRDS4 AAC TGA TCT AGA TTA CTT CTT GAA AAA GAC CAC GTC TCC
Las construcciones pCGR5 y pCGR7 se usaron como ADN de plantilla para la amplificación respectivamente de los genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas. Los productos amplificados se digirieron Xbal y Xho para crear "extremos pegajosos"- La \Delta6-desaturasa amplificado por PCR con extremos Xhol-Xbal se clonó en el pCGR7, que también se había cortado con Xho-l-Xbal. Este procedimiento colocó la \Delta6-desaturasa detrás de la \Delta12-desaturasa, bajo el control de un promotor GAL1. Esta construcción se denominó pCGR9a. De forma similar, para construir el pCGR9b, la \Delta12-desaturasa con extremos XhoI-XbaI se clonó en los sitios XhoI-XbaI del pCGR5. En el pCGR9b la \Delta12-desaturasa estaba detrás del gen de la \Delta6-desaturasa, lejos del promotor GAL.
Para construir el pCGR10, el vector pRS425, que contiene el promotor constitutivo de la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato (GAL), se digirió con BamHl, y pCGR5 se digirió con BamHl-Xhol para liberar el gen de la \Delta6-desaturasa. Este fragmento de \Delta6-desaturasa y el pRS425 cortado con BamHl se llenaron usando la polimerasa Klenow para crear extremos romos, y se ligaron, resultando en pCGR10a y pCGR10b que contenían el gen de la \Delta6-desaturase respectivamente en la orientación con sentido y antisentido. Para construir el pCGR11 y el pCGR12, los genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas se aislaron respectivamente del pCGR5 y pCGR7, usando una doble digestión con EcoRl-XhoI. Los fragmentos EcoRl-Xhol de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas se clonaron en el vector pYX242 digerido con EcoRl-Xhol. El vector pYX242 tiene el promotor TPl (un gen housekeeping de levadura), que permite la expresión constitutiva.
Transformación y expresión de levadura
Se introdujeron diferentes combinaciones de pCGR5, pCGR7, pCGR9a, pCGR9b, pCGR10a, pCGR11 y pCGR12 en varias cepas huéspedes Saccharomyces cerevisiae. La transformación se hizo usando el PEG/LiAc (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)). Los transformantes se seleccionaron sembrando sobre medio sintético que carecía del aminoácido apropiado. El pCGR5, pCGR7, pCGR9a y pCGR9b se pueden seleccionar sobre medio que carezca de uracilo. Las construcciones pCGR10, pCGR11 y pCGR12 pueden seleccionarse sobre medio que carece de leucina. El crecimiento de los cultivos y el análisis de los ácidos grasos se realizaron como en el Ejemplo 3 anterior.
Producción de GLA
La producción de GLA requiere la expresión de dos enzimas (las 6 y 12-desaturasas), las cuales están ausentes en levadura. Para expresar estos enzimas en niveles óptimos, se introjeron en varias cepas huéspedes las siguientes construcciones o combinaciones de construcciones:
1) pCGR9a/SC334
2) pCGR9b/SC334
3) pCGR10a y pCGR7/SC334
4) pCGR11 y pCGR7/SC334
5) pCGR12 y pCGR5/SC334
6) pCGR10a y pCGR7/DBY746
7) pCGR10a y pCGR7/DBY746
La construcción pCGR9a tiene ambos genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas bajo el control de un promotor GAL inducible. Las células huéspedes SC334 transformadas con esta construcción no muestran ninguna acumulación de GLA en los ácidos grasos totales (Figuras 6A y B, carril 1). Sin embargo, cuando los genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas eran controlados individualmente por el promotor GAL, las construcciones de control eran capaces de expresar las \Delta6 y \Delta12-desaturasas, tal como se evidenció mediante la conversión de sus respectivos sustratos en productos. El gen de la \Delta12-desaturasa en pCRG9a se expresó, tal como se evidencia por la conversión de 18:1n-9 en 18:2n-6 en pCGR9a/SC334, mientras que el gen de la \Delta6-desaturasa no se expresaba/era activo, porque el 18:2n-6 no estaba siendo convertido en 18:3n-6 (Figuras 6A y B, carril 1).
La construcción pCGR9b también tiene ambos genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas bajo el control de un promotor GAL, pero en un orden inverso en comparación con el pCGR9a. En este caso, se observó muy poco GLA (<1%) en los cultivos de pCGR9b/SC33. La expresión de \Delta12 fue también muy baja, tal como se evidenció por el bajo porcentaje de 18:2 en los ácidos grasos totales (Figuras 6A y B, carril 1).
Para ensayar si la expresión de ambos enzimas bajo el control de promotores independientes incrementaría la producción de GLA, se clonó el gen de la \Delta6-desaturasa en el vector pRS425. La construcción del pCGR10a tiene la \Delta6-desaturasa en la orientación correcta, bajo el control del promotor GPD constitutivo. El pCGR10b tiene el gen de la \Delta6-desaturasa en la orientación inversa, y sirve como control negativo. Las células pCGR10a/SC334 produjeron niveles de GLA significativamente más elevados (5% del total de ácidos grasos, Figura 6, carril 3), en comparación con pCGR9a. Ambos genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas se expresaron a un nivel elevado porque la conversión de 18:1\rightarrow18:2 fue del 65%, mientras que la conversión 18:2\rightarrow18:3 (\Delta6-desaturasa) fue del 30% (Figura 6, carril 3). Tal como se esperaba, el control negativo pCGR10b/SC334 no mostró ningún GLA.
Para optimizar adicionalmente la producción de GLA, se introdujeron los genes de las \Delta6 y \Delta12 en el vector PYX242, creándose respectivamente el pCGR11 y pCGR12. El vector PYX242 permite la expresión constitutiva por parte del promotor TP1 (Alber, T. y Kawasaki, G., J. Mol. & Appl. Genetics, 1:419 (1982)). La introducción de pCGR11 y pCGR7 en SC334 resultó en aproximadamente un 8% de GLA en los ácidos grasos totales de SC334. La tasa de conversión de 18:1\rightarrow18:2 y 18:2.\rightarrow18:3 fue respectivamente de aproximadamente el 50% y 44% (Figuras 6A y B, carril 4). La presencia del pCGR12 y pCGR5 en SC334 resultó en un 6,6% de GLA en los ácidos grasos totales, con una tasa de conversión de aproximadamente el 50% para ambos, el 18:1 a 18:2 y el 18:2 a 18:3, respectivamente (Figuras 6A y B, carril 5). Por tanto, aunque la cantidad de GLA en los ácidos grasos totales fue mayor en la combinación de construcciones pCGR11/pCGR7, las tasas de conversión de sustrato a producto fueron mejores para la combinación pCGR12/pCGR5.
Para determinar si el cambio de la cepa huésped incrementaría la producción de GLA, se introdujeron pCGR10a y pCGR7 en la cepas huéspedes BJ1995 y DBY746 (obtenidas del Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, California, 94720. El genotipo de la cepa DBY746 es Mat\alpha, his3-D1, leu2-3, leu2-112, ura3-32, trp1-289, gal). Los resultados se muestran en la Figura 7. Cambiar la cepa huésped a BJ1995 no mejoró la producción de GLA, puesto que la cantidad de GLA fue sólo del 1,31% del total de ácidos grasos, y la tasa de conversión de 18:1\rightarrow18:2 fue aproximadamente del 17% en BJ1995. No se observó GLA en DBY746 y la conversión 18:1\rightarrow18:2 fue muy baja (<1% en control) sugiriendo que un cofactor requerido para la expresión de la \Delta12-desaturas puede estar ausente en DB746 (Figura 7, carril 2).
Para determinar el efecto de la temperatura sobre la producción de GLA, los cultivos de SC334 que contenían el pCGR10a y pCGR7/SC334 se hicieron crecer a 15\degC y 30\degC. Se hallaron niveles más elevados de GLA en los cultivos hechos crecer e inducidos a 15\degC que en los cultivos hechos crecer e inducidos a 30\degC (4,23% vs. 1,68%). Esto se debió a una tasa de conversión inferior del 18:2\rightarrow18:3 en cultivos a 30\degC (11,6% vs. 29% en 15\degC), a pesar de una mayor conversión de 18:1\rightarrow18:2 (65% vs. 60% a 30\degC (Figura 8). Estos resultados sugieren que la \Delta12 y la \Delta6 pueden tener temperaturas de expresión óptimas diferentes.
De los diversos parámetros examinados en este estudio, la temperatura de crecimiento, la cepa huésped de levadura, y los componentes del medio tuvieron el impacto más significativo sobre la expresión de la desaturasa, mientras que el momento de la adición del sustrato y la concentración de inductor no afectaron significativamente la expresión de la desaturasa.
Estos datos muestran que pueden aislarse, a partir Mortierella alpina, dos ADN que codifican desaturasas que pueden convertir LA en GLA o ácido oleico en LA, y que pueden expresarse, bien individualmente o en combinación, en un sistema heterólogo y usarse para producir ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados. Se ilustra la producción de GLA a partir de ácido oleico mediante la expresión de las \Delta12- y \Delta6-desaturasas en levadura.
Ejemplo 9
Identificación de homólogos con las desaturasas \Delta5 y \Delta6 de M. alpina
Se identificó una secuencia de ácido nucleico que codifica una \Delta5-desaturasa putativa a través de una búsqueda con TBLASTN de las bases de datos EST a través del NCBI usando los aminoácidos 100-446 de Ma29 como pregunta. Se usó la porción truncada de la secuencia Ma29 para evitar seleccionar homologías basadas en la porción del citocromo b5 en el extremo N-terminal de la desaturasa. La secuencia de aminoácidos deducida de una EST procedente de Dictyostelium discoideum (código de acceso #C25549) muestra una homología muy significativa con la Ma29 y una menor homología, pero aún significativa, con Ma524. La secuencia de ADN se presenta como SEC. Nº ID. 19. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC. Nº ID. 20.
Ejemplo 10
Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA
Para buscar desaturasas implicada en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de ADNc a partir del ARN total aislado de Phaeodactylum tricornutum. Se construyó un plásmido basado en la biblioteca de ADNc en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un equipo disponible comercialmente (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identificaron secuencias de ácidos nucleicos que codifican desaturasas \Delta5 y \Delta6 putativas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y de la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
Se identificó un clon procedente de la biblioteca de Phaeodactylum tricornutum con homología por Ma29 y Ma524; se denominó 144-011-B12. La secuencia de ADN se presenta como SEC. Nº ID. 21. La secuencia de aminoácidos se presenta como SEC. Nº ID. 22.
Ejemplo 11
Identificación de homólogos de \Delta5 y \Delta6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA
Para buscar desaturasas implicada en la producción de PUFA, se construyó una biblioteca de ADNc a partir del ARN total aislado de especies de Schizochytrium. Se construyó un plásmido basado en la biblioteca de ADNc en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un equipo disponible comercialmente (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identificaron secuencias de ácidos nucleicos que codifican desaturasas \Delta5 y \Delta6 putativas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos y de la comparación con las secuencias de Ma29 y Ma524.
Se identificó un clon procedente de la biblioteca de Schizochytrium con homología por Ma29 y Ma524; se denominó 81-23-C7. Este clon contiene un inserto de \sim1 kb. Se obtuvo la secuencia parcial a partir de cada extremo del clon usando los cebadores de secuenciación hacia adelante y hacia atrás universales. La secuencia de ADN procedente del primer cebador hacia adelante se presenta como SEC. Nº ID. 23. La secuencia peptídica se presenta como SEC. Nº ID. 24. La secuencia de ADN procedente del primer cebador hacia atrás se presenta como SEC. Nº ID. 25. La secuencia de aminoácidos procedente del cebador hacia atrás se presenta como SEC. Nº ID. 26.
Ejemplo 12
Secuencias de desaturasas humanas
Las secuencias de genes de desaturasas humanas potencialmente implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga se aislaron en base a la homología entre las secuencias de ADNc humanas y la secuencias del gen de la desaturasa de Mortierella alpina. Se hallaron tres "cajas de histidina" conservadas que se sabe que están conservadas entre las desaturasas unidas a membrana. Al igual que con algunas otras desaturasas unidas a membrana, se halló que el motivo de caja de histidina HXXHH final era QQXHH. La secuencia de aminoácidos de las desaturasas humanas putativas exhibió homología con las desaturasas \Delta5, \Delta6, \Delta9 y \Delta12 de M. alpina.
Las secuencias de ADNc de la \Delta5-desaturasa y \Delta6-desaturasa de M. alpina se usaron para buscar la base de datos LifeSeq de Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California, 94304. La secuencia de la \Delta5-desaturasa se dividió en fragmentos; 1) aminoácidos nº 1-150, 2) aminoácidos 151-300, y 3) aminoácidos 301-446. La secuencia de \Delta6-desaturasa se dividió en tres fragmentos; 1) aminoácidos nº 1-150, 2) aminoácidos 151-300, y 3) aminoácidos 301-457. Estos fragmentos polipeptídicos se buscaron en la base de datos usando el algoritmo "tblastn". Este algoritmo compara una secuencia pregunta de proteína contra una base de datos de secuencias de nucleótidos dinámicamente traducida en la totalidad de las seis pautas de lectura (ambas hebras).
\newpage
Los fragmentos polipeptídicos 2 y 3 de la \Delta5 y \Delta6 de M. alpina tienen homologías con las secuencias con CloneID tal como se esboza en la Tabla 6. El CloneID representa una secuencia individual procedente de la base de datos LifeSeq de Incyte. Una vez se hubieron revisados los resultados del "tblastn", se buscó la Información del Clone con los ajustes por defecto de Rigurosidad >= 50 (Stringency), y Puntuación del Producto <= 100 (Productscore) para diferentes números de CloneID. Los Resultados de Información del Clon mostraron la información, incluyendo el ClusterID, CloneID, Biblioteca, HitID, Descripción del Acierto (Hit Description). Cuando se selecciona, el número del ClusterID muestra la información de clon para todos los clones que pertenecen a ese ClusterID. La instrucción "Asemble" agrupa la totalidad de los CloneID que comprende el ClusterID. Se usaron los siguientes ajustes por defecto para el Assembly del GCG (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Bioctechnology Center, Madison, Wisconsin 53705):
Tamaño de palabra 7
Solapamiento mínimo 14
Rigurosidad 0,8
Identidad mínima 14
Hueco máximo 10
Peso del hueco 8
Peso de la longitud 2
Los resultados del Assembly del GCG mostraron los "contig" generados en base a la información de secuencia dentro del CloneID. Un "contig" es un alineamiento de secuencias de ADN basado en áreas de homología entre estas secuencias. Se generó una nueva secuencia (secuencia consenso) en base a las secuencias de ADN alineadas dentro del contig. Se identificó el contig que contiene el CloneID, y los sitios ambiguos de la secuencia consenso se editaron en base al alineamiento del CloneID (ver SEC. Nº ID. 21 - SEC. Nº ID. 25) para generar la mejor secuencia posible. El procedimiento se repitió para la totalidad de los seis CloneID listados en la Tabla 6. Esto produjo cinco contig únicos. Las secuencias consensos editadas de los cinco contig se importaron en el programa informático Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan 48105). Estas secuencias consenso se ensamblaron. El contig 2511785 se solapa con el contig 3506132, y este nuevo contig se denominó 2535 (SEC. Nº ID. 27). Los contig del programa Sequencher se copiaron en el paquete informático Sequence Analysis del
GCG.
Cada contig se tradujo en la totalidad de las seis pautas de lectura en secuencias proteicas. Se compararon las secuencias \Delta5 (MA29) y \Delta6 (MA524) se M. alpina con cada uno de los contig traducidos usando la búsqueda FastA (una búsqueda según Pearson y Lipman de similitudes entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína)). La homología entre estas secuencias sugiere las pautas de lectura abierta de cada contig. La homología entre la \Delta5 y \Delta6 de M. alpina con los contig 2535 y 3854933 se utilizó para crear el contig final denominado 253538a. La Figura 13 es el emparejamiento FastA del contig final 253538a y el MA29, y la Figura 14 es el emparejamiento del contig final 253538a y el MA524. Las secuencias de ADN de los varios contig se presentan en las SEC. Nº ID. 27 - SEC. Nº ID. 33. Las varias secuencias peptídicas se muestran en las SEC. Nº ID. 34 - SEC. Nº ID. 40.
Aunque la pauta de lectura abierta se generó mezclando los dos contig, el contig 2535 muestra que hay una única secuencia al inicio de este contig que no se empareja con el contig 3854933. Por tanto, es posible que estos contig se generaran a partir de genes humanos independientes parecidos a desaturasas.
El contig 253538a contiene una pauta de lectura abierta que codifica 432 aminoácidos. Empieza con Gln (CAG) y termina con el codón de paro (TGA). El contig 253538a se alinea con ambas secuencias, \Delta5 y \Delta6, de M. alpina, sugiriendo que puede ser cualquiera de ambas desaturasas, así como con otras desaturasas conocidas que comparten homología entre ellas. Los contig individuales listados en la Tabla 6, así como el contig 2535 intermedio y el contig 253538 final, pueden utilizarse para aislar los genes completos para las desaturasas humanas.
Usos de las desaturasas humanas
Estas secuencias humanas pueden expresarse en levaduras y plantas utilizando los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes. Para la expresión en células de mamíferos y en animales transgénicos, estos genes pueden proporcionar un sesgo del codón superior.
Además, estas secuencias humanas pueden usarse también para identificar secuencias de desaturasas relacionadas.
TABLA 6
Secciones de ID del clon en la base Palabra clave
las desaturasas de datos LifeSeq
151-300 \Delta5 3808675 Desaturasa de ácido graso
301-446 \Delta5 354535 \Delta6
151-300 \Delta6 3448789 \Delta6
151-300 \Delta6 1362863 \Delta6
151-300 \Delta6 2394760 \Delta6
301-457 \Delta6 3350263 \Delta6
Ejemplo 13
Formulaciones para bebés A. Fórmula de Soja Isomil® con hierro
Uso: como bebida para bebés, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Un alimento para pacientes con desórdenes para los que debería evitarse la lactosa: deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.
Características
\bullet Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de la alergia o sensibilidad a las proteína de la leche de vaca.
\bullet Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa.
\bullet Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
\bullet Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para potenciar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad absortiva del intestino dañado.
\bullet 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 calorías, para ayudar a prevenir la deficiencia en hierro.
\bullet Niveles recomendados de vitaminas y minerales.
\bullet Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
\bullet Color blanco-leche, consistencia parecida a la de la leche, y aroma agradable.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato cálcico, 0,11% de fosfato cálcico tribásico, citrato potásico, fosfato potásico monobásico, cloruro potásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro magnésico, fosfato potásico dibásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
B. Fórmula de soja Isomil® DF para la diarrea
Uso: como un alimento durante breve tiempo para la gestión dietética de la diarrea en bebés y niños que empiezan a andar.
Características
\bullet Primera fórmula para bebés que contiene fibra dietética añadida procedente de la fibra de soja específicamente para la gestión de la diarrea.
\bullet Se ha mostrado clínicamente que reduce la duración de las deposiciones blandas, acuosas, durante la diarrea suave a grave en bebés.
\bullet Nutricionalmente completa para cubrir las necesidades nutricionales del bebé.
\bullet El aislado de proteína de soja con L-metionina añadida cumple o supera los requisitos del bebé para todos los aminoácidos esenciales.
\bullet Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa.
\bullet Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
\bullet Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para potenciar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad absortiva del intestino dañado.
\bullet Cumple o supera los niveles de vitaminas y minerales recomendados por el Comité sobre Nutrición de la American Academy of Pediatrics y los requeridos por la Infant Formula Act.
\bullet 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 calorías, para ayudar a prevenir la deficiencia en hierro.
\bullet Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 86% de agua, 4,8% de jarabe de maíz, 2,5% de azúcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 2,0% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,77% de fibra de soja, 0,12% de citrato cálcico, 0,11% de fosfato cálcico tribásico, 0,10% de citrato potásico, cloruro potásico, fosfato potásico monobásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, cloruro magnésico, ácido ascórbico, L-metionina, fosfato potásico dibásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
C. Fórmula de soja libre de sacarosa Isomil® SF con hierro
Uso: como bebida para bebés, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca, o una intolerancia a la sacarosa. Un alimento para pacientes con desórdenes para los que debería evitarse la lactosa y sacarosa.
Características
\bullet Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de la alergia o sensibilidad a las proteína de la leche de vaca.
\bullet Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa (la fuente de carbohidratos son los polímeros de glucosa Polycose®).
\bullet Libre de sacarosa para los pacientes que no pueden tolerar la sacarosa.
\bullet Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.
\bullet 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 calorías, para ayudar a prevenir la deficiencia en hierro.
\bullet Niveles recomendados de vitaminas y minerales.
\bullet Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales.
\bullet Color blanco-leche, consistencia parecida a la de la leche, y aroma agradable.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 75% de agua, 11,8% de almidón de maíz hidrolizado, 4,1% de aceite de soja, 4,1% de aislado de proteína de soja, 2,8% de aceite de coco, 1,0% de almidón de maíz modificado, 0,38% de fosfato cálcico tribásico, 0,17% de citrato potásico, 0,13% de cloruro potásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato cálcico, cloruro sódico, cloruro de colina, carragenato, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
D. Fórmula de soja Isomil® 20 con hierro, lista para tomar, 20 calorías/onza líquida
Uso: cuando se desea una alimentación con soja.
Ingredientes: (Pareve, (OU)) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maíz, 2,6% de azúcar (sacarosa), 2,1%de aceite de soja, 1,9% de aislado de proteína de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato cálcico, 0,11% de fosfato cálcico tribásico, citrato potásico, fosfato potásico monobásico, cloruro potásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro magnésico, fosfato potásico dibásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
E. Fórmula para bebés Similac®
Uso: Cuando se necesita una fórmula para bebés: si se ha tomado la decisión de interrumpir la lactancia materna antes de 1 año de edad, si se necesita un suplemento para la lactancia materna, o como alimentación rutinaria si no se ha adoptado la lactancia materna.
Características
\bullet Proteína con la cualidad y cantidad apropiada para un buen crecimiento; desnaturalizada con calor, lo cual reduce el riesgo de pérdida de sangre entérica asociada con la leche.
\bullet Grasa procedente de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizada), proporcionando el ácido linolénico esencial que es fácilmente absorbido.
\bullet Carbohidratos en forma de lactosa en proporción similar a la de la leche humana.
\bullet Carga de soluto renal baja para minimizar el estrés en los órganos en desarrollo.
\bullet En formas de polvo, líquido concentrado y lista para tomar.
Ingredientes: ((OU)-D) Agua, leche descremada, lactosa, aceite de soja, aceite de coco, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, carragenato, cloruro de colina, taurina, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato ferroso, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
F. Fórmula para bebés prematuros Similac® NeoCare con hierro
Uso: Para las especiales necesidades nutricionales de los bebés prematuros después de su alta hospitalaria. Similac NeoCare es una fórmula nutricionalmente completa desarrollada para proporcionar a los bebés prematuros con las calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras necesarios para promocionar la recuperación del retraso en el crecimiento y apoyar su desarrollo.
Características
\bullet Reduce la necesidad de suplemento calórico y de vitaminas. Más calorías (22 calorías/onza fluida) que las fórmulas para embarazos estándares (20 calorías/onza fluida).
\bullet Mezcla de grasas altamente absorbida, con triglicéridos de cadena media (aceite MCT) para ayudar a cubrir las especiales necesidades digestivas de los bebés prematuros.
\bullet Mayores niveles de proteínas, vitaminas y minerales por 100 calorías para prolongar el apoyo nutricional iniciado en el hospital.
\bullet Más calcio y fósforo para una mineralización ósea mejorada.
Ingredientes: (OU)-D Sólidos de jarabe de maíz, leche descremada, concentrado de proteína de soja, aceite de soja, aceite alto en oleico de alazor, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), aceite de coco, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, carbonato cálcico, ácido ascórbico, cloruro magnésico, cloruro potásico, cloruro sódico, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, ascorbil palmitato, L-carnitina, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, tocoferoles mezclados, citrato sódico, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, beta-caroteno, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
G. Vigorizante de la leche humana bajo en hierro Similac Natural Care, listo para tomar, 24 calorías/onza fluida
Uso: Diseñado para ser mezclado con la leche humana o para ser tomado de forma alternativa con la leche humana, para bebés con bajo peso al nacer.
Ingredientes: (OU)-D Agua, leche descremada, hidrolizado de almidón de maíz, lactosa, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), concentrado de proteína de suero, aceite de soja, aceite de coco, fosfato cálcico tribásico, citrato potásico, cloruro de magnesio, citrato sódico, ácido ascórbico, carbonato cálcico, mono- y diglicéridos, lecitina de soja, carragenato, cloruro de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferil, sulfato de zinc, cloruro potásico, pantotenato cálcico, sulfato ferroso, sulfato cúprico, riboflavina, vitamina A, palmitato, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, biotina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, vitamina D_{3}, selenito sódico y cianocobalamina.
Varios PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de esta invención pueden sustituirse en y/o añadirse a las fórmulas para bebés descritas más arriba y a otras fórmulas para bebés conocidas por los especialistas en la técnica.
II. Formulaciones nutricionales A. Ensure®
Uso: ENSURE es un alimento líquida bajo en residuos diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral a ser usado con o entre comidas o, en las cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE carece de lactosa y gluten, y es apropiado para su uso en dietas modificadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol. Aunque es principalmente un suplemento oral, puede ser alimentado por tubo.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con dietas modificadas.
\bullet Para pacientes ancianos con riesgo de nutrición.
\bullet Para pacientes con pérdida de peso involuntaria.
\bullet Para pacientes que se recuperan de una operación o enfermedad.
\bullet Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.
Ingredientes
(OU)-D. Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y sodio, aceite alto en oleico de alazor, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, citrato sódico, cloruro magnésico, fosfato magnésico dibásico, aroma artificial, cloruro sódico, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, goma Gellan, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato sódico, cloruro de cromo, yoduro potásico, selenato sódico.
B. Ensure® bars
Uso: Las ENSURE BARS son una nutrición completa y equilibrada para uso como suplemento entre o con las comidas. Proporcionan una alternativa deliciosa y rica en nutrientes a otros tentempiés. Las barritas ENSURE BARS contienen < 1 g de lactosa/barrita, y el sabor Chocolate Fudge Brownie carece de gluten (El sabor a Honey Graham Crunch contiene gluten).
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que necesitan calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras.
\bullet Especialmente útil para gente que no toman bastantes calorías y nutrientes.
\bullet Para gente que tiene la capacidad de mascar y tragar.
\bullet No debe ser usada por nadie con alergia al cacahuete o cualquier otro tipo de alergia a las nueces.
Ingredientes
Honey Graham Crunch - Jarabe de maíz alto en fructosa, aislado de proteína de soja, azúcar moreno, miel, maltodextrina (maíz), arroz crujiente (arroz molido, azúcar [sacarosa], sal [cloruro sódico], y malta), salvado de avena, aceites de soja y de semillas de algodón parcialmente hidrogenados, glicerina, concentrado de proteína del suero, polidextrosa, fructosa, caseinato cálcico, polvo de coco, aromas artificiales, aceite de colza, aceite alto en oleico de alazor, leche en polvo descremada, polvo de suero, lecitina de soja, y aceite de maíz. Manufacturado en una instalación que procesa nueces.
Vitaminas y minerales
Fosfato cálcico tribásico, fosfato potásico dibásico, óxido de magnesio, sal (cloruro sódico), cloruro potásico, ácido ascórbico, ortofosfato férrico, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, óxido de zinc, pantotenato cálcico, gluconato de cobre, sulfato de manganeso, riboflavina, beta-caroteno, hidrocloruro de piridoxina, mononitrato de tiamina, ácido fólico, biotina, cloruro crómico, yoduro potásico, selenato de sodio, molibdato de sodio, filoquinona, vitamina D_{3}, y cianocobalamina.
Proteína
Honey Graham Crunch - La fuente de proteínas es una mezcla de aislado de proteína de soja y proteínas de la leche.
Aislado de proteína de soja 74%
Proteínas de la leche 26%
Grasas
Honey Graham Crunch - La fuente de grasas en una mezcla de aceites de soja y semillas de algodón parcialmente hidrogenados, de colza, alto en oleico de alazor, y de maíz, y de lecitina de soja.
Aceites de soja y semillas de algodón parcialmente hidrogenados 76%
Aceite de colza 8%
Aceite alto en oleico de alazor 8%
Aceite de maíz 4%
Lecitina de soja 4%
Carbohidratos
Honey Graham Crunch - La fuente de carbohidratos es una combinación de jarabe de maíz alto en fructosa, azúcar moreno, maltodextrina, miel, arroz crujiente, glicerina, polisacáridos de soja, y salvado de avena.
Jarabe de maíz alto en fructosa 24%
Azúcar moreno 21%
Maltodextrina 12%
Miel 11%
Arroz crujiente 9%
Glicerina 9%
Polisacáridos de soja 7%
Salvado de avena 7%
C. Ensure® High Protein
Uso: ENSURE HIGH PROTEIN es un alimento líquido, concentrado, alto en proteínas, diseñado para gente que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Puede usarse como un suplemento nutricional oral con o entre comidas o, en las cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE HIGH PROTEIN carece de lactosa y gluten, y es apropiado para su uso por parte de gente recuperándose de cirugía general, o de fracturas de cadera, y por parte de pacientes con riesgo de padecer úlceras por presión.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que requieren calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales, tales como los pacientes que se recuperan de cirugía general, o de fracturas de cadera, pacientes con riesgo de padecer úlceras por presión, y pacientes con dietas bajas en colesterol.
Características
\bullet Bajo en grasas saturadas.
\bullet Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por servicio.
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Excelente fuente de proteínas, calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa, fácilmente digerible.
Ingredientes
Vanilla Supreme: -(OU)-D. Agua, azúcar (sacarosa), maltodextrina (maíz), caseinatos de calcio y sodio, aceite alto en oleico de alazor, aislado de proteína de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, citrato sódico, cloruro magnésico, fosfato magnésico dibásico, aroma artificial, cloruro sódico, lecitina de soja, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, goma Gellan, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, molibdato sódico, cloruro de cromo, biotina, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3}, y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas con elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 85%
Aislado de proteína de soja 15% 
\vskip1.000000\baselineskip
Grasas
La fuente de grasas en una mezcla de tres aceites: alto en oleico de alazor, de colza, y de soja.
Aceite alto en oleico de alazor 40%
Aceite de colza 30%
Aceite de soja 30%
El nivel de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN representan el 24% de las calorías totales, siendo el 2,6% de las grasas saturadas y procediendo el 7,9% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las líneas maestras de la AHA, que \leq30% de las calorías totales procedan de la grasa, que <10% de las calorías procedan de ácidos grasos saturados, y que \leq10% de las calorías totales procedan de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE HIGH PROTEIN contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores ("Vanille Supreme", "Chocolate Royal", "Wild Cherry", y "Banana"), más lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Sacarosa 60%
Maltodextrina 40% 
\vskip1.000000\baselineskip
Chocolate
Sacarosa 70%
Maltodextrina 30% 
\newpage
D. Ensure® light
Uso: ENSURE LIGHT es un alimento líquido bajo en grasas diseñado para su uso como suplemento nutricional oral con o entre comidas. ENSURE LIGHT carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para su uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con peso normal o sobrepeso que necesitan una nutrición extra en un suplemento que contiene un 50% menos de grasa y un 20% menos de calorías que ENSURE.
\bullet Para adultos sanos que no comen correctamente y necesitan nutrición extra.
Características
\bullet Bajo en grasas saturadas.
\bullet Contiene 3 g de grasa total por servicio y < 5 mg de colesterol.
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa, fácilmente digerible.
Ingredientes
Vanilla French: -(OU)-D. Agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinato de calcio, aceite alto en oleico de alazor, aceite de colza, cloruro magnésico, citrato sódico, citrato potásico, fosfato potásico dibásico, fosfato magnésico dibásico, aromas naturales y artificiales, fosfato cálcico tribásico, gel de celulosa, cloruro de colina, lecitina de soja, carragenato, sal (cloruro sódico), ácido ascórbico, goma de celulosa, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato sódico, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3}, y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es el caseinato cálcico.
Caseinato cálcico 100%
Grasas
La fuente de grasas en una mezcla de dos aceites: alto en oleico de alazor y de colza.
Aceite alto en oleico de alazor 70%
Aceite de colza 30%
El nivel de grasa en ENSURE LIGHT cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 3 gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan el 13,5% de las calorías totales, procediendo el 1,4% de las grasas de ácidos grasos saturados y el 2,6% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las líneas maestras de la AHA: \leq30% de las calorías totales proceden de la grasa, <10% de las calorías proceden de ácidos grasos saturados, y \leq10% de las calorías totales proceden de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE LIGHT contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El sabor a chocolate contiene también jarabe de maíz. La dulzura moderada y la variedad de sabores ("French Vanilla", "Chocolate Supreme", "Strawberry Swirl"), junto con lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Sacarosa 51%
Maltodextrina 49% 
\vskip1.000000\baselineskip
Chocolate
Sacarosa 47,0%
Jarabe de maíz 26,5%
Maltodextrina 26,5%
Vitaminas y minerales
Un servicio de 8 onzas fluidas de ENSURE LIGHT proporciona al menos el 25% de las Dosis Diarias Recomendadas para 24 vitaminas y minerales claves.
Cafeína
El sabor a chocolate contiene 2,1 mg de cafeína/8 onzas fluidas.
E. Ensure plus®
Uso: ENSURE PLUS es un alimento líquido alto en calorías y bajo en residuos, para uso cuando se necesitan calorías y nutrientes extras pero una concentración normal de proteínas. Está diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral a usar con o entre comidas, o, en cantidades apropiadas, como sustituto de las comidas. ENSURE PLUS carece de lactosa y de gluten. Aunque es principalmente un suplemento nutricional oral, puede suministrarse mediante tubo.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que requieren calorías y nutrientes extras, pero una concentración normal de proteína, en un volumen limitado.
\bullet Para pacientes que necesitan ganar o mantener un peso saludable.
Características
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales.
Ingredientes
Vainilla: (OU)-D. Agua, jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), aceite de maíz, caseinatos cálcico y sódico, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro magnésico, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, lecitina de soja, aromas naturales y artificiales, citrato sódico, cloruro potásico, cloruro de colina, ácido ascórbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato sódico, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D_{3}.
Proteínas
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas de elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 84%
Aislado de proteína de soja 16%
Grasas
La fuente de grasas es el aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidratos
ENSURE PLUS contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, café, manteca de pacana, y yema), más lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Sabores a vainilla, fresa, manteca de pacana, y café
Jarabe de maíz 39%
Maltodextrina 38%
Sacarosa 23%
Sabores a chocolate y yema
Jarabe de maíz 36%
Maltodextrina 34%
Sacarosa 30%
Vitaminas y minerales
Un servicio de 8 onzas fluidas de ENSURE PLUS proporciona al menos el 15% de las Dosis Diarias Recomendadas para 25 vitaminas y minerales claves.
Cafeína
El sabor a chocolate contiene 3,1 mg de cafeína/8 onzas fluidas. El sabor a café contiene una cantidad traza de cafeína.
F. Ensure plus® HN
Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento líquido nutricionalmente completo, alto en calorías y alto en nitrógeno, diseñado para gente con necesidades más elevadas de calorías y proteínas o con tolerancia de volumen limitada. Puede usarse para suplemento oral o para apoyo nutricional total mediante tubo. ENSURE PLUS NH carece de lactosa y de gluten.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con necesidades incrementadas de calorías y proteínas, tales como después de cirugía o una lesión.
\bullet Para pacientes con una tolerancia de volumen limitada y saciedad temprana.
Características
\bullet Para nutricional suplementaria o total.
\bullet Para alimentación oral o mediante tubo.
\bullet 1,5 calorías/ml.
\bullet Alto en nitrógeno.
\bullet Calóricamente denso.
\newpage
Ingredientes
Vainilla: (OU)-D. Agua, maltodextrina (maíz), caseinatos cálcico y sódico, aceite de maíz, azúcar (sacarosa), aislado de proteína de soja, cloruro magnésico, citrato potásico, fosfato cálcico tribásico, lecitina de soja, aromas naturales y artificiales, citrato sódico, cloruro de colina, ácido ascórbico, taurina, L-carnitina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, sulfato cúprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, ácido fólico, molibdato sódico, yoduro potásico, selenito sódico, filoquinona, cianocobalamina y vitamina D_{3}.
G. Ensure® powder
Uso: ENSURE POWDER (reconstituido con agua) es un alimento líquido bajo en residuos diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral a usar con o entre comidas. ENSURE POWDER carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para uso en dietas modificadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con dietas modificadas.
\bullet Para pacientes ancianos con riesgo nutricional.
\bullet Para pacientes que están recuperándose de enfermedad/intervenciones quirúrgicas.
\bullet Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.
Características
\bullet Apropiado, fácil de mezclar.
\bullet Bajo en grasas saturadas.
\bullet Contiene 9 g de grasa total y <5 mg de colesterol por servicio.
\bullet Alto en vitaminas y minerales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa, fácilmente digerible.
Ingredientes: (OU)-D. Jarabe de maíz, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), aceite de maíz, caseinatos cálcico y sódico, aislado de proteína de soja, aroma artificial, citrato potásico, cloruro magnésico, citrato sódico, fosfato cálcico tribásico, cloruro potásico, lecitina de soja, ácido ascórbico, cloruro de colina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato de manganeso, cloruro hidrocloruro de tiamina, sulfato cúprico, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, palmitato de vitamina A, ácido fólico, biotina, molibdato sódico, cloruro de cromo, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas de elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 84%
Aislado de proteína de soja 16%
Grasas
La fuente de grasas es el aceite de maíz.
Aceite de maíz 100%
Carbohidratos
ENSURE POWDER contiene una combinación de jarabe de maíz, maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada de ENSURE POWDER, más los lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla
Jarabe de maíz 35%
Maltodextrina 35%
Sacarosa 30%
H. Ensure® pudding Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes con dietas de consistencia modificada (por ejemplo, blandas, en forma de purés, o completamente líquidas).
\bullet Para pacientes con dificultades para tragar.
Características
\bullet Rico y cremoso, buen sabor.
\bullet Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. De forma conveniente no necesita refrigeración.
\bullet Carece de gluten.
Perfil nutritivo cada 5 onzas: 250 Calorías, 10,9% de proteínas, 34,9% de grasas totales, 54,2% de carbohidratos.
Ingredientes
Vainilla: (OU)-D. Leche descremada, agua, azúcar (sacarosa), aceite de soja parcialmente hidrogenado, almidón para alimentos modificado, sulfato magnésico, esteraoil lactilato sódico, fosfato sódico dibásico, aroma artificial, ácido ascórbico, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, cloruro de colina, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato cálcico, FD&C Amarillo #5, citrato potásico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, FD&C Amarillo #6, ácido fólico, biotina, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteínas
La fuente de proteínas es la leche descremada.
Leche descremada 100%
Grasas
La fuente de grasas es el aceite de soja hidrogenado.
Aceite de soja hidrogenado 100%
Carbohidratos
ENSURE PUDDING contiene una combinación de sacarosa y almidón alimentario modificado. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, dulce de azúcar terciado con mantequilla, y tapioca) ayudan a prevenir la fatiga del sabor. El producto contiene 9,2 gramos de lactosa por servicio.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Sacarosa 56%
Lactosa 27%
Almidón alimentario modificado 17%
Chocolate
Sacarosa 58%
Lactosa 26%
Almidón alimentario modificado 16%
I. Ensure® con fibra
Uso: ENSURE CON FIBRA es una alimento líquido que contiene fibra, nutricionalmente completo, diseñado para gente que puede beneficiarse de fibra y nutrientes incrementados en la dieta. ENSURE CON FIBRA es apropiado para personas que no requieren una dieta pobre en residuos. Puede alimentarse oralmente o mediante tubo, y puede usarse como un suplemento nutricional para una dieta regular, o, en cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE CON FIBRA carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para su uso en dietas modificadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol.
Condiciones del paciente
\bullet Para pacientes que pueden beneficiarse de fibras y nutrientes incrementados en la dieta.
Características
\bullet Nueva fórmula avanzada baja en grasas saturadas, más alta en vitaminas y minerales.
\bullet Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por servicio.
\bullet Sabor rico, cremoso.
\bullet Buena fuente de fibra.
\bullet Fuente excelente de vitaminas y minerales esenciales.
\bullet Para dietas bajas en colesterol.
\bullet Carece de lactosa y gluten.
Ingredientes
Vainilla: (OU)-D. Agua, maltodextrina (maíz), azúcar (sacarosa), caseinatos cálcico y sódico, fibra de avena, aceite alto en oleico de alazor, aceite de colza, aislado de proteína de soja, aceite de maíz, fibra de soja, fosfato cálcico tribásico, cloruro magnésico, citrato potásico, gel de celulosa, lecitina de soja, fosfato potásico dibásico, citrato sódico, aromas naturales y artificiales, cloruro de colina, fosfato magnésico, ácido ascórbico, goma de celulosa, cloruro potásico, carragenato, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, ácido fólico, biotina, cloruro de cromo, biotina, molibdato sódico, yoduro potásico, selenato sódico, filoquinona, vitamina D_{3} y cianocobalamina.
Proteína
La fuente de proteínas es una mezcla de dos proteínas de elevado valor biológico: la caseína y la soja.
Caseinatos sódico y cálcico 80%
Aislado de proteína de soja 20%
Grasas
La fuente de grasas es una mezcla de tres aceites: alto en oleico de alazor, de colza, y de maíz.
Aceite alto en oleico de alazor 40%
Aceite de colza 40%
Aceite de maíz 20%
El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE CON FIBRA representan el 22% de las calorías totales, procediendo el 2,01% de las grasas de ácidos grasos saturados y el 6,7% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las líneas maestras de la AHA, de que \leq30% de las calorías totales procedan de la grasa, <10% de las calorías procedan de ácidos grasos saturados, y \leq10% de las calorías totales procedan de ácidos grasos poliinsaturados.
Carbohidratos
ENSURE CON FIBRA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, y manteca de pacana), más los lotes de sabores VARI-FLAVORS® en pacana, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate
Maltodextrina 66%
Sacarosa 25%
Fibra de avena 7%
Fibra de soja 2%
Chocolate
Maltodextrina 55%
Sacarosa 36%
Fibra de avena 7%
Fibra de soja 2%
Fibra
La mezcla de fibras usada en ENSURE CON FIBRA consiste en fibra de avena y polisacáridos de soja. Esta mezcla resulta en aproximadamente 4 gramos de fibra dietética total por lata de 8 onzas fluidas. La proporción de fibra insoluble respecto la soluble es 95:5.
Los varios suplementos nutricionales descritos más arriba y conocidos por otros con formación en la técnica pueden sustituirse y/o suplementarse con los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de esta invención.
J. Producto nutricional Oxepa^{TM}
Oxepa es un producto nutricional enteral, calóricamente denso, bajo en carbohidratos, diseñado para la gestión dietética de pacientes con, o con riesgo de padecer ARDS. Tiene una combinación única de ingredientes, incluyendo una mezcla de aceites patentada que contiene ácido eicosapentaenoico (EPA procedente del aceite de pescado), ácido \gamma-linolénico (GLA procedente del aceite de borraja), y niveles elevados de antioxidantes.
Distribución calórica
\bullet La densidad calórica es elevada, de 1,5 calorías/ml (355 calorías/8 onzas fluidas), para minimizar el volumen requerido para cubrir las necesidades energéticas.
\bullet La distribución de calorías en Oxepa se muestra en la Tabla 7.
TABLA 7
Distribución calórica de Oxepa
por 8 onzas fluidas por litro % de calorías
Calorías 355 1500 - - -
Grasas (g) 22,2 93,7 55,2
Carbohidratos (g) 25 105,5 28,1
Proteínas (g) 14,8 62,5 16,7
Agua (g) 186 785 - - -
Grasas
\bullet Oxepa contiene 22,2 g de grasa por servicio de 8 onzas fluidas (93,7 g/l).
\bullet La fuente de grasas es una mezcla de aceites, con el 38,1% de aceites de colza, el 25% de triglicéridos de cadena media (MCT), el 20% de aceite de borraja, el 20% de aceite de pescado, y el 3,2% de lecitina de soja. El perfil típico de ácidos grasos de Oxepa se muestra en la Tabla 8.
\bullet Oxepa proporciona una cantidad equilibrada de ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados, y saturados, tal como se muestra en la Tabla 10.
\bullet Los triglicéridos de cadena media (MCT) - - - 25% de la mezcla de grasas - - - ayudan al vaciado gástrico porque son absorbidos por el tracto intestinal sin emulsión por parte de los ácidos biliares.
Los varios ácidos grasos componentes del producto nutricional Oxepa^{TM} pueden sustituirse y/o suplementarse con los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8
Perfil típico de ácidos grasos
% del total de ácidos grasos g/8 onzas fluidas* g/l*
Caproico (6:0) 0,2 0,04 0,18
Caprílico (8:0) 14,69 3,1 13,07
Cáprico (10:0) 11,06 2,33 9,87
Palmítico (16:0) 5,59 1,18 4,98
Palmitoleico (16:1n-7) 1,82 0,38 1,62
Esteárico (18:0) 1,84 0,39 1,64
Oleico (18:1n-9) 24,44 5,16 21,75
Linoleico (18:2n-6) 16,28 3,44 14,49
\alpha-linolénico (18:3n-3) 3,47 0,73 3,09
\gamma-linolénico (18:3n-6) 4,82 1,02 4,29
Eicosapentaenoico (20:5n-3) 5,11 1,08 4,55
n-3 Docosapentaenoico (22:5-n3) 0,55 0,12 0,49
Docosahexaenoico (22:6n-3) 2,27 0,48 2,02
Otros 7,55 1,52 6,72
*Los ácidos grasos igualan aproximadamente el 95% de las grasas totales.
TABLA 9
Perfil de grasas de Oxepa
% de las calorías proveniente de las grasas 55,2
Ácidos grasos poliinsaturados 31,44 g/l
Ácidos grasos monoinsaturados 25,53 g/l
TABLA 9 (continuación)
Perfil de grasas de Oxepa
Ácidos grasos saturados 32,38 g/l
Proporción n-6 respecto n-3 1,75:1
Colesterol 9,49 mg/8 onzas fluidas ó 40,1 mg/l
Carbohidratos
\bullet El contenido en carbohidratos es de 25,0 g por cada servicio de 8 onzas fluidas (105,5 g/l).
\bullet Las fuentes de carbohidratos son: 45% de maltodextrina (un carbohidrato completo) y 55% de sacarosa (un azúcar sencillo), ambos de los cuales se digieren y absorben fácilmente.
\bullet El elevado contenido en grasas y bajo en carbohidratos de Oxepa está diseñado para minimizar la producción de dióxido de carbono (CO_{2}). Los niveles elevados de CO_{2} pueden complicar la ablactación en pacientes dependientes del ventilador. Los niveles bajos de carbohidratos pueden ser útiles también para aquellos pacientes que han desarrollado hiperglicemia inducida por estrés.
\bullet Oxepa carece de lactosa.
Los carbohidrato dietéticos, los aminoácidos procedentes de proteínas, y el grupo glicerol de las grasas pueden convertirse en glucosa en el cuerpo. A través de este proceso, se satisfacen los requisitos de carbohidratos de los tejidos dependientes de glucosa (tales como el sistema nervioso central y los hematíes). Sin embargo, una dieta carente de carbohidratos puede conducir a cetosis, catabolismo excesivo de las proteínas de los tejidos, y pérdida de fluido y electrólitos. Estos efectos pueden prevenirse mediante la ingestión diaria de 50 a 100 g de carbohidratos digeribles, si la ingesta de calorías es la adecuada. En nivel de carbohidratos en Oxepa es también suficiente para minimizar la gluconeogénesis, si se satisfacen las necesidades energéticas.
Proteínas
\bullet Oxepa contiene 14,8 g de proteína por cada servicio de 8 onzas fluidas (62,5 g/l).
\bullet La proporción de calorías totales/nitrógeno (150:1) satisface las necesidades de los pacientes estresados.
\bullet Oxepa proporciona proteína suficiente para promover el anabolismo y el mantenimiento de una masa de cuerpo magro sin precipitar los problemas respiratorios. Las ingestas elevadas de proteínas son una preocupación en pacientes con insuficiencia respiratoria. Aunque la proteína tiene poco efecto en la producción de CO_{2}, una dieta elevada en proteínas incrementara el estímulo ventilatorio.
\bullet Las fuentes de proteínas en Oxepa son: 86,8% de caseinato sódico y 13,2% de caseinato cálcico.
\bullet Tal como se demuestra en la Tabla 11, el perfil de aminoácidos del sistema de proteínas en Oxepa satisface o supera el estándar para un conjunto de proteínas de alta calidad establecido por la National Academy of Sciences.
\bullet Oxepa carece de gluten.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta solicitud son indicativas del nivel de capacitación de aquellos especialistas en la técnica a los que corresponde esta invención.
Ahora que se ha descrito completamente la invención, será evidente para alguien con la formación ordinaria en la técnica que pueden hacérsele muchos cambios y modificaciones sin apartarse del ámbito de las reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: KNUTZON, DEBORAH
\hskip3,9cm
MURKERJI, PRADIP 
\hskip3,9cm
HUANG, YUNG-SHENG 
\hskip3,9cm
THURMOND, JENNIFER 
\hskip3,9cm
CHAUDHARY, SUNITA 
\hskip3,9cm
LEONARD, AMANDA 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS DE CADENA LARGA.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: LIMBACH AND LIMBACH LLP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: 2001 FERRY BUILDING
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: SAN FRANCISCO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CALIFORNIA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
(ZIP): 94111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Word de Microsoft
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: WARD, MICHAEL R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.651
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA: CGAB-210
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415) 433-4150
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (415) 433-8716
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: N/D
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1617 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 457 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1488 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 399 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 252 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 8:
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 131 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 9:
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 87 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 143 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAUCAUCAUC AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACCAACTCG AGAAAATGGC TGCTGCTCCC AGTGTGAGG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACTGATCTA GATTACTGCG CCTTACCCAT CTTGGAGGC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACCAACTCG AGAAAATGGC ACCTCCCAAC ACTATCGAT 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACTGATCTA GATTACTTCT TGAAAAAGAC CACGTCTCC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 746 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 19
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 227 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 20
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 494 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 21
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 87 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 22
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 520 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 23
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 153 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 24
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 25
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 420 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 25
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 125 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: no es relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 26
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1219 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2692004)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 27
\vskip1.000000\baselineskip
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 28
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 655 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2153526)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 28
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 29
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 304 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 3506132)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 29
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 30
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 918 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 3854933)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 30
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 31
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1686 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 2511785)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 31
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 32
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1843 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig 2535)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 32
100
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 33
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2257 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (Contig Editado 253538a)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 33
40
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 411 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 2692004)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 34
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
43
430 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 35
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 218 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 2153526)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 35
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 36
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 3506132)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 36
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 37
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 306 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 3854933)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 37
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 565 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 2511785)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 38
\vskip1.000000\baselineskip
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 39
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 619 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 2535)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 39
\vskip1.000000\baselineskip
49
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 757 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (traducción de Contig 253538a)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 40
51
52
53

Claims (22)

1. Polipéptido purificado o aislado que es capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 6 ó 12 a partir del extremo carboxilo de dicho ácido graso, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2 o la secuencia de 399 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 4.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2.
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de homología con la secuencia de 399 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 4.
4. Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia de 457 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 2.
5. Polipéptido según la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia de 399 aminoácidos de la SEC. Nº ID. 4.
6. Polipéptido según la reivindicación 1, 2 ó 4, en donde dicho polipéptido comprende un motivo de aminoácidos seleccionado de entre el grupo consistente en los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. Nº ID. 2.
7. Polipéptido según la reivindicación 6, en donde dicho polipéptido comprende los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. Nº ID. 2.
8. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6 ó 7 que comprende la SEC. Nº ID. 2.
9. Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 9 que comprende la SEC. Nº ID. 1 o la SEC. Nº ID. 3.
11. Construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 9 ó 10 unido operativamente a un promotor.
12. Célula huésped transformada con la construcción de la reivindicación 11.
13. Célula huésped según la reivindicación 12, la cual es una célula huésped microbiana.
14. Célula huésped según la reivindicación 13 que es una célula de levadura.
15. Procedimiento para la producción del ácido graso gamma-linolénico, cuyo procedimiento comprende:
hacer crecer un cultivo de células huéspedes de las reivindicaciones 12, 13 ó 14, cuyas células producen una delta-6 desaturasa en presencia de ácido linoleico, en condiciones en las que dicho ácido graso se convierte en ácido gamma linolénico mediante la expresión del polipéptido de dicha desaturasa; y
recuperar el ácido graso ácido gamma-linolénico del cultivo.
16. Procedimiento para la producción del ácido graso ácido linoleico, cuyo procedimiento comprende:
hacer crecer un cultivo de células huéspedes de las reivindicaciones 12, 13 ó 14, cuyas células producen una delta-12 desaturasa, en presencia de ácido oleico, en condiciones en las que dicho ácido se convierte en ácido linoleico mediante la expresión del polipéptido de dicha desaturasa; y
recuperar el ácido graso ácido linoleico del cultivo.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, el cual además comprende la formulación del ácido graso en un producto seleccionado del grupo:
una composición farmacéutica que comprende dicho aceite y un portador farmacéuticamente aceptable;
una fórmula nutricional;
una fórmula para bebés;
un suplemento dietético;
un sustituto dietético;
un cosmético; y
un alimento para animales.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en donde dicha fórmula para bebés, suplemento dietético, o sustituto dietético está en forma de un líquido o un sólido.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, en donde la fórmula nutricional, la fórmula para bebés, el suplemento dietético, o el sustituto dietético contienen al menos un macronutriente seleccionado del grupo consistente en: aceite de coco, aceite de soja, aceite de colza, mono- y diglicéridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, proteína de soja, y otros hidrolizados de proteínas.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en donde dicha fórmula nutricional, fórmula para bebés, suplemento dietético, o sustituto dietético contiene al menos una vitamina seleccionada del grupo consistente en: vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en: calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fósforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro.
21. Utilización de una célula huésped microbiana de la reivindicación 13, 14 ó 15 para la producción de un ácido graso.
22. Utilización según la reivindicación 21 para la producción de un producto que comprende dicho ácido graso, seleccionándose dicho producto del grupo:
una composición farmacéutica que comprende dicho aceite y un portador farmacéuticamente aceptable;
una fórmula nutricional;
una fórmula para bebés;
un suplemento dietético;
un sustituto dietético;
un cosmético; y
un alimento para animales.
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